Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện Gen mã hóa Enzyme invertase nhằm tăn trữ lượng Sucrose ở cây mía

ÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE) NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ QUỲNH LIÊN Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng có ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả Lưu Thị Cư Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quỳnh Liên, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Trần Bình, TS. Chu Hoàng Hà, KS. Đỗ Tiến Phát Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, là những ngƣời đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành luận văn. Trong thời gian thực tập nghiên cứu tôi cũng đã nhận đƣợc sự hỗ trợ nhiệt tình và những ý kiến đóng góp bổ ích của các cô chú, các anh chị, các bạn trong Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh- KTNN và khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên đã hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng vô cùng cảm ơn những tình cảm tốt đẹp của những ngƣời thân trong gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn dành cho tôi, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu. Thái Nguyên, ngày 25 tháng 09 năm 2009 Học viên Lưu Thị Cư Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 1.1. VAI TRÒ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA ................................ 3 1.1.1. Sơ lƣợc về cây mía ............................................................................................. 3 1.1.2. Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam ................................................................ 4 1.2. SINH TỔNG HỢP SUCROSE ........................................................................... 5 1.3. VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO .............................................. 8 1.5. ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP RNAi (RNA INTERFERENCE) .................................................................................... 10 1.5.1. Nguồn gốc RNAi .............................................................................................. 10 1.5.2. Cơ chế gây bất hoạt gen .................................................................................. 10 1.6. KỸ THUẬT GATEWAY ® ............................................................................... 12 1.7. NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA ........... 14 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 16 2.1. NGUYÊN LIỆU................................................................................................... 16 2.1.1. Nguyên liệu thực vật ........................................................................................ 16 2.1.2. Các chủng plasmid và enzyme ....................................................................... 16 2.1.3. Hóa chất khác .................................................................................................... 16 2.1.3. Các thiết bị máy móc ....................................................................................... 17 2.2. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................................. 17 2.2.1. Thiết kế mồi....................................................................................................... 17 2.2.2. Tách RNA tổng số ............................................................................................ 18 2.2.3. RT-PCR .............................................................................................................. 18 2.2.4. Tách dòng và xác định trình tự gen ............................................................... 19 2.2.5. Thiết kế vector tái tổ hợp INV-RNAi ........................................................... 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.2.6. Tái sinh mía thông qua mô sẹo ...................................................................... 21 2.2.7. Thử nghiệm chuyển gen gus-intron vào cây mía ....................................... 22 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: ...................................................................................... 2 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 24 3.1. THIẾT KẾ MỒI ................................................................................................... 24 3.2. TÁCH RNA TỔNG SỐ ...................................................................................... 25 3.3. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE ............ 27 3.4. TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN ............................. 28 3.4.1. Tạo plasmid tái tổ hợp INV-pENTR ............................................................ 28 3.4.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 ............................................................................................ 28 3.4.3. Chọn lọc plasmide tái tổ hợp INV_pENTR bằng PCR ............................. 29 3.4.4. Kết quả xác định trình tự nucleotit ................................................................ 31 3.5. THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP INV-RNAi ........................................... 31 3.5.1. Tạo vector tái tổ hợp INV_RNAi bằng kỹ thuật Gateway ....................... 31 3.5.2. Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli ........................... 32 3.6. BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG VI KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1. .......................................... 34 3.7. TÁI SINH VÀ BƢỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA ................... 35 3.7.1. Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo ..................................................... 35 3.7.3. Chọn lọc mô sẹo và tái sinh cây chuyển gen ............................................... 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine (Benzyladeninpurin) bp Cặp base cDNA Complementary DNA = DNA bổ sung đƣợc tổng hợp bằng khuôn mRNA cs Cộng sự DEPC Diethyl pyrocarbonat DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP deoxynucleosit triphotphat (deoxynucleoside triphosphate) EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtBr đEtBrEthiium bromide E.coli Escherichia coli gus β-glucuronidase IBA Indole-3-Butyric Acid kb kilo base LB Luria and Bertani MS Môi trƣờng nuôi cấy theo Murashige và Skoog NAA Naphthalene Acetic Acid OD Giá trị mật độ quang (optical density) PCR Polymerase Chaine Reaction = Phản ứng chuỗi Polymerase RNA Ribonucleic Acid RNase Ribonuclease RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR SDS Sodium dodecylsulfat TAE Tris-acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus DNA (polymerase) 2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng trong thí nghiệm ................................................. 16 Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bƣớc................................... 18 Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ............................................................ 19 Bảng 2.4. Các môi trƣờng tái sinh cây mía ............................................................. 21 Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của cặp mồi 3’INV và 5’INV .......................................................................................................... 25 Bảng 3.2. Mã số các trình tự đoạn gen Invertase ở mía trên ngân hàng gen NCBI ................................................................................................... 25 Bảng 3.3. Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh ở giống mía ROC10 in vitro trên các môi trƣờng thử nghiệm M1 - M4. .......................................... 36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1: Chu trình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia của các enzyme chính ............................................................................................... 6 Hình 1.2. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi................................................................ 11 Hình 1.3. Sơ đồ mô tả kỹ thuật Gateway ................................................................ 13 Hình 3.1. Kết quả điện di RNA tổng số tách từ lá và bẹ thân non của 2 giống mía ROC1 và ROC10 trên gel agarose 1% ............................... 26 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 0,8% ................ 27 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid với cặp mồi M13 (For/Rev) nhằm kiểm tra sự có mặt của đoạn Invertase trong vector pENTR/D ....................................................................................... 30 Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen Invertase phân lập đƣợc với trình tự Invertase trong ngân hàng gen có mã số AY302083 .................................................................................................. 31 Hình 3.5. Mô hình cấu trúc chuyển gen INV_RNAi ........................................... 32 Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid INV_RNAi tổ hợp với HindIII và XbaI ......................................................................................... 34 Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR plasmid INV-RNAi trong A.tumefaciens với cặp mồi đặc hiệu 5’INV và 3’INV ....................... 35 Hình 3.8. Quy trình tái sinh mía ROC10 in vitro từ mô sẹo ................................ 37 Hình 3.9. Biến nạp gen gus-intron vào cây mía ROC10 in vitro thông qua trung gian A.tumefaciens ................................................................. 39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Đƣờng là một nhu cầu cần thiết trong đời sống con ngƣời. Theo thống kê, nhu cầu tiêu thụ đƣờng trên thế giới trung bình tính theo đầu ngƣời là 35 kg/1 ngƣời/1 năm. Tại Việt Nam, năm 1994 là 8 kg/1 ngƣời/1 năm, hiện nay là 15 kg/1 ngƣời/1 năm và dự kiến nhu cầu về đƣờng còn tiếp tục tăng nữa. Tại các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới nhƣ Việt Nam, 75% sản lƣợng đƣờng đƣợc sản xuất từ cây mía. Mía là một trong số ít loài thực vật tích trữ chủ yếu đƣờng sucrose (α-D-glucopyranosyl-1, 2-D-fructofuranose), nguồn nguyên liệu ban đầu để sản xuất đƣờng. Do đó, ở Việt Nam mía trở thành một cây công nghiệp trọng yếu và là cây xóa đói giảm nghèo của chính phủ. Tuy nhiên, các giống mía của Việt Nam có năng suất đƣờng chỉ đạt mức trung bình của thế giới. Việc nhập các giống mía cao sản của thế giới kết hợp với phƣơng pháp lai tạo truyền thống chƣa thực sự có hiệu quả trong việc tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao lại phù hợp với điều kiện thổ nhƣỡng khí hậu của nƣớc ta. Chọn tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao bằng công nghệ sinh học có tiềm năng giảm giá thành đƣờng mà không cần tăng diện tích trồng mía và thúc đẩy sự phát triển nền công nghiệp mía đƣờng tại Việt Nam. Sinh tổng hợp sucrose là một quá trình phức hợp, trong đó enzyme Invertase đƣợc xem nhƣ là một chiếc chìa khóa điều chỉnh sự tích lũy lƣợng sucrose trong cây mía. Nó có vai trò phân hủy sucrose trong tế bào. Vì vậy, muốn tăng trữ lƣợng sucrose trong cây mía thì phải ức chế đƣợc sự biểu hiện của gen mã hóa Invertase. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi (RNA-interference) hiện nay đã trở thành một biện pháp công nghệ hữu hiệu có thể ức chế hoàn toàn biểu hiện của gen ở động vật, thực vật và cả vi sinh vật [31]. Ở thực vật, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 RNAi có thể đƣợc thực hiện bằng cách chuyển gen có cấu trúc biểu hiện sự phiên mã cao RNA sense, anti-sense hoặc RNA kẹp tóc bổ sung chính nó mà chứa trình tự tƣơng đồng với gen đích. Với mục tiêu nghiên cứu chọn tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao, chúng tôi chọn đề tài “Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hóa enzyme Invertase (β-fructofuranosidase) nhằm tăng trữ lượng sucrose ở cây mía”. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU: Ức chế biểu hiện của Invertase dạng hòa tan nhằm tăng trữ lƣợng sucrose ở cây mía. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 1. Phân lập đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase ở cây mía in vitro ROC1 2. Thiết kế đƣợc vector ức chế biểu hiện gen mã hóa Invertase (β- fructofuranosidase) ở cây mía. 3. Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở cây mía phục vụ cho mục đích chuyển gen tiếp theo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. VAI TRÕ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA 1.1.1. Sơ lƣợc về cây mía Mía (Saccharum L.) thuộc chi mía (Saccharum), họ hòa thảo (Poaceae), bộ lúa (Poales), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae). Chúng là những cây có thân to, mập, chia đốt cao từ 2 - 6 m. Các loại thực vật trong chi này đa số là các loại cỏ sống lâu năm bao gồm khoảng 6 - 37 loài tùy theo hệ thống phân loại, sống chủ yếu ở khu vực nhiệt đới và ôn đới trên thế giới [2]. Cây mía chứa hàm lƣợng đƣờng rất cao chiếm khoảng 46% khối lƣợng khô, trong đó sucrose chiếm tới 80%. Chính vì thế, mía trở thành một trong những cây công nghiệp quan trọng của ngành công nghiệp sản xuất đƣờng. Ngoài ra, cây mía còn chứa các chất đạm (protein), chất bột (carbohydrate), chất béo (lipid), các chất khoáng và các vitamin… vì thế mía còn có tác dụng thanh nhiệt, giải khát, trợ giúp tiêu hóa, cung cấp năng lƣợng và các chất dinh dƣỡng cần thiết cho cơ thể. Theo Đông y, mía là "vị thuốc" dùng để chữa một số bệnh nhƣ ho khan, đại tiện táo, tiểu tiện bất lợi, đau dạ dày, an thai… Mía còn là loại cây có tác dụng bảo vệ đất rất tốt, đặc biệt là chống xói mòn đất cho các vùng đồi trung du. Hơn nữa, mía là cây rễ chùm và phát triển mạnh trong tầng đất từ 0 - 60 cm (1 ha mía tốt có thể cho 13 - 15 tấn rễ sau thu hoạch), đây là nguồn chất hữu cơ quý làm tăng độ phì của đất. Phần bã mía chứa nhiều cellulose có thể dùng làm nguyên liệu đốt lò, hoặc làm bột giấy, bìa các tông, ép thành ván dùng trong kiến trúc... Sản phẩm cặn bã còn lại sau khi chế biến đƣờng (bùn lọc) có thể sử dụng để sản xuất nhựa, xêrin, làm sơn, xi đánh giầy... phế phẩm còn lại dùng làm phân bón rất tốt. Trong tƣơng lai bã mía còn có thể nguồn nguyên liệu làm bột giấy, làm sợi thay thế Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 các loại cây rừng bị giảm đi. Khi mà nguồn nhiên liệu lỏng ngày càng cạn kiệt nhƣ hiện nay, một số nƣớc phát triển trên thế giới nhƣ Mỹ, Brazil, Ấn Độ… đã bắt đầu sử dụng nhiên liệu sinh học từ cây mía để bổ sung và thay thế. Nhƣ vậy, cây mía có vai trò rất quan trọng trong đời sống kinh tế của con ngƣời. 1.1.2. Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam Hiện nay có khoảng 200 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới trồng và sản xuất mía đƣờng, sản lƣợng trung bình đạt khoảng 13.246 triệu tấn (gấp 6 lần so với củ cải đƣờng). Ở Việt Nam, mía là cây trồng chủ đạo trong ngành công nghiệp đƣờng của cả nƣớc. Dự kiến niên vụ 2009-2010 diện tích mía nguyên liệu cả nƣớc sẽ vào khoảng 290.000 ha, tăng 19.400 ha so với vụ trƣớc, trong đó diện tích vùng mía nguyên liệu tập trung của các nhà máy là 221.816 ha với năng suất mía bình quân đạt 55 tấn/ha và sản lƣợng đạt 16 triệu tấn. Cây mía góp phần xóa đói giảm nghèo ở vùng trung du, miền núi ở nhiều tỉnh nƣớc ta nhƣ: Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Phú Yên, Bình Định, Quảng Ngãi [3]... Nhà nƣớc đã hỗ trợ một phần đầu tƣ phát triển cơ sở hạ tầng giao thông, thủy lợi cho vùng trồng mía tập trung, nghiên cứu chuyển giao khoa học kỹ thuật và công nghệ nhằm nâng cao năng suất, chất lƣợng, hiệu quả sản xuất mía đƣờng [1]. Quá trình đô thị hóa, công nghiệp hóa ngày một gia tăng cùng với sự biến đổi môi trƣờng khí hậu nên diện tích đất trồng trọt có xu hƣớng ngày một thu hẹp. Hơn nữa, ở nƣớc ta hiện nay có tới trên 60% các giống mía là những giống cũ nhƣ: ROC1, ROC10, F156, F127… hoặc các dạng lai ghép nội chi phức tạp. Các giống này có đặc điểm dễ canh tác, thích nghi rộng với nhiều vùng sinh thái của Việt Nam, nhƣng trữ lƣợng đƣờng rất thấp. Còn lại các giống mía nhập nội tuy có trữ lƣợng đƣờng cao song không phù hợp với khí hậu Việt Nam nên năng suất thấp. Chính vì thế, Quyết định số 26/2007/QĐ- Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 TTg của Phó thủ tƣớng Nguyễn Sinh Hùng “Quy hoạch phát triển mía đƣờng đến năm 2010 và định hƣớng đến năm 2020” đƣợc phê duyệt đã đƣa quan điểm rõ ràng là: đồng thời với việc nhập khẩu giống mía có năng suất, trữ đƣờng cao đƣợc đánh giá tốt phù hợp với Việt Nam thì phải xây dựng hệ thống viện nghiên cứu và các trung tâm giống mía đủ điều kiện trang thiết bị và năng lực cán bộ để chủ động sản xuất giống tốt, có năng suất, trữ lƣợng đƣờng cao của Việt Nam, đáp ứng yêu cầu sản xuất [1]. 1.2. SINH TỔNG HỢP SUCROSE Trong lục lạp của mía có enzyme photphoenolpyruvat-cacboxilase hoạt động rất mạnh. Sản phẩm đầu tiên của quang hợp ở mía là các axit oxaloaxetic, malic, aspartic đều gồm có bốn nguyên tử cacbon trong phân tử, do đó mía đƣợc gọi là thực vật C4 [5]. Chu trình C4 (hay cơ chế Hatch-Slack) là cơ chế có sự chuyên hoá trong việc thực hiện chức năng quang hợp của cây C4: một loại lục lạp chuyên trách cố định CO2, còn một loại lục lạp chuyên khử CO2 thành các chất hữu cơ cho cây. Vì vậy mà hoạt động quang hợp của cây C4 có hiệu quả hơn các nhóm thực vật khác và thƣờng cho năng suất sinh học rất cao. Sucrose là một disaccharide của glucose (α-D-glucopyranoside) và fructose (β-D-fructofuranosyl), có công thức phân tử C12H22O11. Đây là sản phẩm chính của quá trình quang hợp, có vai trò bổ sung năng lƣợng cho quá trình sinh trƣởng phát triển của thực vật cũng nhƣ các sinh vật sống khác. Trong cơ thể động vật, sucrose là nguyên liệu tổng hợp glucogen, khi thừa sẽ chuyển sang dạng mỡ dự trữ. Sucrose tích lũy phần lớn ở các mô của thực vật, giúp cho thực vật có khả năng thích nghi tốt hơn với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng nhƣ: hạn, lạnh, mặn và cƣờng độ ánh sáng mạnh... [7, 12, 17, 23, 26, 30]. Nó đƣợc tích trữ chủ yếu ở cây mía, củ cải đƣờng và có ở Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 trong nhiều loại cây khác nhƣ dứa, chuối, mơ, mận, dƣa hấu, táo, cà rốt… đây là nguồn nguyên liệu tự nhiên, rất dễ trồng với số lƣợng lớn và giá rẻ. Sucrose rất dễ hòa tan trong nƣớc, khi bị thủy phân tạo thành glucose và fructose. Sinh tổng hợp sucrose là một chu trình phức tạp diễn ra ở cytosol (tế bào chất) trong lá của cây trồng với sự tham gia của nhiều enzyme khác nhau, trong đó một số enzyme chính (key enzyme) có ảnh hƣởng lớn tới lƣợng sucrose đƣợc tổng hợp. Các enzyme này xúc tác cho các dạng phản ứng: (1) Tổng hợp sucrose nhƣ sucrose 6-phosphatephosphatase (SPS) hoặc sucrosesynthase (SS) (2) Thủy phân sucrose nhƣ β-fructofuranosidase (Invertase) (3) Vận chuyển các hexose tới tế bào chất và chuyển hóa lại thành sucrose nhƣ pyrophosphate fructose 6-phosphat 1 phosphostransferase (PFP) [6]. Hình 1.1: Chu trình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia của các enzyme chính SUCROSE 6’-P FRUCTOSE GLUCOSE 6-P ATP FRUCTOSE 1.6-P2 GLUCOSE 1-P UDP-GLUCOSE UTP SUCROSE FRUCTOSE 6-P GLUCOSE ADP UDP UDP ADP ATP PPi Pi Pi Invertase SPS SS Pi PFP Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 Thay đổi hoạt tính các enzyme này thƣờng dẫn tới những biến đổi lớn trong lƣợng sucrose tích lũy trong tế bào thực vật [6, 10, 11, 15, 31, 35]. Các enzyme liên quan tới chu trình sinh tổng hợp sucrose ở thực vật đã đƣợc nghiên cứu trên nhiều đối tƣợng gồm cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm [10, 15, 31]. Trong đó, SPS (sucrose 6-phosphatephosphatase) đƣợc coi là enzyme chính của chu trình sinh tổng hợp sucrose ở thực vật, nó xúc tác quá trình hình thành sucrose 6-phosphate, cơ chất cho phản ứng tổng hợp các phân tử sucrose [7, 16]. SPS là enzyme có hoạt tính tỉ lệ thuận với sucrose trong các mô dự trữ của khoai tây, ngô, cải bó xôi [30]. Ở ngô, hoạt tính SPS tỉ lệ thuận với tốc độ tổng hợp và vận chuyển sucrose [16]. Cây cà chua chuyển gen tăng cƣờng biểu hiện SPS thì lƣợng sucrose tăng còn lƣợng tinh bột giảm trong quá trình quang hợp [33]. Tƣơng tự, cây bông mang gen SPS của rau bi-na (spinacia oleracea) cũng có tốc độ tổng hợp sucrose cao hơn so với đối chứng [13]. Ngƣợc lại, khi làm bất hoạt SPS, các dòng cây khoai tây chuyển gen sẽ giảm trữ lƣợng sucrose [10]. Gen mã hóa cho SPS đã đƣợc phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau và cho tới nay ngân hàng gen NCBI đã có thông tin về vài trăm trình tự SPS của các loài thực vật hai lá mầm nhƣ khoai tây, thuốc lá, rau bi-na, củ cải đƣờng; cây một lá mầm nhƣ lúa, ngô, mía và cả tảo lam [9, 10, 13, 14, 21, 27, 31, 33]. Liên quan chặt chẽ với SPS trong chu trình sinh tổng hợp sucrose là enzyme thủy phân sucrose - Invertase (β- fructofuranosidase). Khi hoạt tính của Invertase cao thì lƣợng đƣờng tích lũy trong các mô tế bào giảm và ngƣợc lại. Hoạt tính của enzyme pyrophosphate fructose 6-phosphotransferase (PFP) cũng tỉ lệ nghịch với lƣợng sucrose trong tế bào thực vật [11]. PFP xúc tác chuyển hóa fructose 6-phosphate thành fructose 1,6-biphosphate. Do vậy, nếu hoạt tính của PFP giảm, lƣợng cơ chất cho phản ứng tổng hợp sucrose sẽ tăng, dẫn tới lƣợng sucrose cũng tăng tƣơng ứng. Ảnh hƣởng này đã đƣợc chứng minh trên các dòng mía có mang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 cấu trúc antisense làm bất hoạt PFP. Lƣợng sucrose trên các cây mía chuyển gen còn non tăng khoảng 50%. Tuy nhiên, khi phân tích trên các cây trƣởng thành, tổng lƣợng sucrose tăng, nhƣng chƣa đáng kể so với đối chứng [11]. Những nghiên cứu trên đã chứng tỏ đƣợc vai trò quan trọng của các enzyme SPS, PFP, Invetase trong việc tổng hợp và tích lũy sucrose ở thực vật. 1.3. VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO Theo thuyết vận chuyển đƣờng (hay thuyết Turgeon), đƣờng sucrose đƣợc tổng hợp ở tế bào chất của các tế bào thịt lá trong quang hợp sẽ đƣợc vận chuyển ra không bào, sau đó nhờ hệ thống cấu trúc liên kết giữa các tế bào (sợi liên bào và cầu sinh chất hay plasmodesmata) nó sẽ đƣợc chuyển từ tế bào này sang tế bào khác và nhờ ống dẫn phloem mà sucrose đi tới khắp các cơ quan của thực vật bằng con đƣờng khuyếch tán. Các phân tử nhỏ sucrose trong ống dẫn phloem sẽ đƣợc polyme hóa thành những phân tử đƣờng lớn và phức tạp hơn, lúc này các phân tử đƣờng đƣợc đẩy ra xa khỏi lá đến những phần khác của cây, nơi mà nó đƣợc sử dụng hay tích trữ lại, và do kích thƣớc của nó quá lớn nên nó không thể chuyển ngƣợc trở về lá. Chính cơ chế khuếch tán này đã tạo nên sự vận chuyển liên tục sucrose từ các cơ quan quang hợp (source tissue) tới các cơ quan dự trữ (sink tissue). Bên cạnh đó, sucrose còn đƣợc vận chuyển và tích trữ tại không bào làm nguyên liệu cho chu trình sinh tổng hợp tinh bột. Ngoài lƣợng sucrose đƣợc vận chuyển liên tục, một phần sucrose sẽ đƣợc phân hủy nhằm cung cấp năng lƣợng cho quá trình sinh trƣởng và phát triển, đồng thời tái tạo các cơ chất khác. 1.4. ENZYME INVERTASE (β-FRUCTOFURANOSIDASE) Invertase (β-fructofuranosidase) đƣợc mã hóa bởi 5 - 10 đồng phân tùy thuộc từng loài thực vật khác nhau. Cây mô hình Arabidopsis thaliana có 5 đồng phân Invertase, trong khi ở cà chua hiện nay đã phân lập đƣợc 8 đồng phân. Hiện nay, trên ngân hàng gen đã có trình tự EST (Expressed Sequenced Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 Tags) của enzyme Invertase phân lập từ một số giống mía [35]. Invertase trung tính (có trong tế bào chất) đã đƣợc tinh sạch từ thân mía trƣởng thành. Tuy nhiên trình tự gen mã hóa cho dạng enzyme này vẫn chƣa đƣợc công bố trên GenBank. Invertase có mặt ở hầu hết các mô thực vật tích trữ đƣờng và tồn tại ở nhiều dạng khác nhau: dạng hoà tan (soluble acid Invertase) có nhiều trong không bào (dịch tế bào); dạng liên kết với màng (cell wall Invertase) có trong thành tế bào; dạng độc lập (neutral Invertase) có chủ yếu trong hạt. Nó là một enzyme xúc tác quá trình thủy phân sucrose trong không bào thành hai đƣờng đơn là glucose (Aldohexose) và fructose (Ketohexose) [6]. Vì thế, mức độ biểu hiện của nó có nhiều ảnh hƣởng lên sự sinh trƣởng phát triển của thực vật [6]. Cụ thể, khi Invertase có hoạt tính cao nó sẽ làm giảm một lƣợng sucrose đáng kể trong thân cây mía. Nghiên cứu cho thấy những dòng mía có sản lƣợng đƣờng cao thƣờng là các dòng có hoạt tính Invertase thấp và ngƣợc lại [35]. Tƣơng tự, một số dòng cà chua ngọt có tích lũy nhiều đƣờng là do hoạt tính của Invertase thấp. Invertase có hoạt tính cao trong không bào của tế bào thuốc lá và đậu tƣơng cũng đã làm giảm lƣợng sucrose trong các cơ quan này [6]. Bất hoạt Invertase làm tăng tỉ lệ tích trữ sucrose trong cây cà chua chuyển gen ở lá và quả, đồng thời cũng làm thay đổi tỉ lệ đƣờng đơn (hexose) trong các dòng cây này [18, 24]. Lá của các dòng khoai tây biểu hiện gen mã hóa Invertase phân lập từ nấm men tích trữ chủ yếu glucose và fructose hơn là sucrose. Hơn nữa, những dòng này hình thành ít củ và nhỏ hơn các dòng đối chứng, nhƣng chứa nhiều đƣờng hơn là tinh bột. Điều này chứng tỏ rằng Invertase có liên quan chặt chẽ tới hàm lƣợng và vận chuyển của sucrose ở thực vật. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Nhƣ vậy, Invertase đƣợc xem nhƣ là một chiếc chìa khoá điều chỉnh sự tích lũy sucrose dự trữ trong thực vật. Do đó, ức chế biểu hiện của Invertase có thể tăng tích lũy sucrose trong cây mía. 1.5. ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP RNAi (RNA INTERFERENCE) 1.5.1. Nguồn gốc RNAi RNAi là một cơ chế căn bản để kiểm soát chuỗi thông tin di truyền hay cách vô hiệu hoá hoạt động của các gen xác định do hai nhà khoa học Andrew Z. Fire và Craig C. Mello khám phá ra và công bố trên tạp chí Nature vào ngày 19/12/1998 [4]. Andrew Fire và Craig Mello đã nghiên cứu cơ chế điều khiển biểu hiện gen ở giun tròn (Caenorhabditis elegans) và cho rằng khi mRNA “chiều dịch mã” và “chiều đối mã” gặp nhau thì chúng sẽ kết hợp lại thành những mRNA sợi kép. Hai ông đã kiểm chứng lại giả thuyết của mình bằng cách tiêm các phân tử mRNA sợi kép chứa các mật mã di truyền quy định nhiều protein khác của giun tròn. Kết quả đều thu đƣợc protein đƣợc mã hóa bởi các gen đó không đƣợc tổng hợp. Qua đó Fire và Mello đã rút ra đƣợc kết luận rằng có thể RNA dạng chuỗi kép đã làm các gen bị bất hoạt. Công trình đƣợc công bố và đƣợc trao giải Nobel Y học năm 2006. 1.5.2. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi (RNA interference) đƣợc coi nhƣ một phƣơng thức miễn dịch tự nhiên giúp sinh vật chống lại sự xâm nhập của virus RNA bằng cách phân huỷ các trình tự nucleotide tƣơng đồng của chúng [8]. Nó làm trung gian kháng lại cả acid nucleic ngoại bào và nội bào, cũng nhƣ điều khiển sự biểu hiện gen mã hóa protein. Nó đƣợc thực hiện khi có sự xuất hiện của phân tử RNA mạch kép trong cơ thể sinh vật gây nên ức chế sự biểu hiện gen của một loại trình tự đặc hiệu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Hình 1.2. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi Hình 1.2 cho thấy, Cơ chế RNAi đƣợc bắt đầu bằng việc phân cắt phân tử RNA chuỗi kép (dsRNA) bởi enzyme Dicer - một trong những enzyme thuộc họ RNase III, tạo thành các phân tử RNA ức chế nhỏ (siRNA) có kích thƣớc khoảng 21 - 26 nucleotide [4]. Các siRNA này đƣợc giải xoắn và một mạch gắn kết với một phức hợp protein một cách chọn lọc gọi là phức hợp cảm ứng sự bất hoạt RNA (RISC – RNA Induced Silencing Complex). Argonaute (protein Argonaute) trong RISC có chứa RNase-H hoạt động nhƣ một endonuclease sẽ tách siRNA thành những chuỗi RNA đơn, trong đó chỉ có một chuỗi đơn RNA có đầu 5’ có lực bắt cặp base (base pairing) nhỏ nhất đƣợc chọn để tiếp tục đi vào phức hệ RISC. Sau đó, RISC sẽ thu nhận các phân tử phiên mã mRNA nội sinh của tế bào có trình tự tƣơng đồng với trình tự của chuỗi siRNA đang có mặt trong phức hệ bằng cách bắt cặp với các base theo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 nguyên tắc bổ sung. Khi đã đƣợc nhận diện các mRNA nhanh chóng bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi xoắn kép siRNA-mRNA và bị tiêu hủy bởi các RNA nuclease (Helicase) có trong RISC. Sợi RNA bị phân cắt, tiếp tục hình thành các siRNA. Quá trình tiếp diễn liên tục nhƣ vậy sẽ phân hủy các bản mã sao hình thành, kết quả là ức chế biểu hiện của gen mong muốn [4]. Cơ chế can thiệp RNAi đem lại những ứng dụng vô cùng to lớn và đang là công cụ nghiên cứu hữu ích trong nhiều ngành sinh học, nông nghiệp và y dƣợc học. Nó đƣợc biết đến nhƣ một kỹ thuật sinh học hiện đại có hiệu quả trong việc chuyển gen phòng chống bệnh do virus, vi khuẩn, hay làm tăng cƣờng, ức chế một tính trạng mong muốn nào đó ở sinh vật. Phƣơng pháp này đã đƣợc ứng dụng thành công để thay đổi thành phần chất béo t._.