Phân lập và chọn môi trường nhân sinh khối ba loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae (etsch) Sorok, Beauveria bassiana (Bals) Vuill và Paecilomyces spp. Trên nhóm rau ăn lá ở đồng bằng sông cửu long,

C CÂY TRỒNG ________________ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG PHÂN LẬP VÀ CHỌN MÔI TRƯỜNG NHÂN SINH KHỐI BA LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok (Ma), Beauveria bassiana (Bals.) Vuill (Bb) VÀ Paecilomyces spp. (Pae) TRÊN NHÓM RAU ĂN LÁ Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Chủ nhiệm đề tài: Thành viên tham gia: Lê Hữu Phước Võ Thị Hướng Dương Lê Hòa Lợi LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn PGS. Trần Văn Hai và Ks. Trịnh Thị Lan – Khoa Nông Nghiệp – Đại hoc Cần Thơ đã hướng dẫn và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cô Võ Thị Hướng Dương – Khoa Nông Nghiệp và TNTN – Đại học AN Giang đã sát cánh cùng tôi trong suốt quá trình làm đề tài này. Cô Nguyễn Thị Diệu Hương, Phòng Thí Nghiệp NEDO – Bộ môn BVTV (hợp tác với Chính Phủ Nhật Bản) đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi thực hiện đề tài này. Cùng các bạn sinh viên Nông học, Trồng trọt, Bảo vệ thực vật Khóa 31 đã giúp đở tôi ghi nhận, đo đếm các chỉ tiêu. i TÓM LƯỢC Nhằm mục đích thu thập, phân lập và định danh 3 loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp. ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long để nghiên cứu chọn ra dòng nấm tốt phục vụ cho việc nghiên cứu chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh, đề tài: “Phân lập và chọn môi trường nhân sinh khối ba loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok, Beauveria bassiana (Bals.) Vuill và Paecilomyces spp. trên nhóm rau ăn lá ở Đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện. Kết quả đã thu thập được tổng cộng 288 dòng nấm từ 6 tỉnh An Giang, Tiền Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Sóc Trăng, và Hậu Giang, bao gồm 3 loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp. Trong đó, quá trình phân lập, tách ròng và định danh (trong môi trường PDA) đã thu được 51 dòng. Thí nghiệm trên sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design) và 5 lần lặp lại và 52 nghiệm thức (51 dòng nấm và 1 đối chứng), đã chọn ra 10 dòng nấm có hiệu quả tốt nhất M2-AG, M5-AG, M1-CT, M3-VL, M1-ST, B2-AG, B2-TG, B1 –VL, P2-AG và P3- TG. Môi trường SDAY3 là môi trường cho mật số bào tử (bào tử.ml-1) cao nhất trong 4 loại môi trường lỏng (không chứa agar) CDA, CAM, SDAY1 và SDAY3. Chín ngày sau khi lắc (NSKL) là thời điểm tối ưu đối với nấm Metarhizium anisoplia. Trong khi đó, sáu đến chín NSKL, mật số bào tử được tạo ra cao nhất đối với nấm Beauveria bassiana và 6 NSKL đối với nấm Paecilomyces spp. ii MỤC LỤC Trang CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU ............................................................................................1 A. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.....................................................2 I. MỤC TIÊU ...........................................................................................................2 II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU................................................................................2 B. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU.....................................................2 I. ĐỐI TƯỢNG ........................................................................................................2 II. PHẠM VI NGHIÊN CỨU ..................................................................................2 C. CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................2 I. CƠ SỞ LÝ LUẬN.................................................................................................2 1. Phân loại ................................................................................................................2 2. Sự phân bố .............................................................................................................3 3. Đặc điểm hình thái, sinh học và khả năng gây hại ..................................................4 3.1. Metarhizium anisopliae .................................................................................4 3.2. Beauveria bassiana .......................................................................................4 3.3. Paecilomyces spp. .........................................................................................5 4. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa ....................................................................................6 4.1. Metarhizium anisopliae .................................................................................6 4.2. Beauveria bassiana .......................................................................................6 4.3. Paecilomyces spp. .........................................................................................6 5. Khả năng sinh độc tố diệt côn trùng và các sản phẩm trao đổi chất .........................7 5.1. Metarhizium anisopliae .................................................................................7 5.2. Beauveria bassiana .......................................................................................7 5.3. Paecilomyces spp. .........................................................................................8 6. Cơ chế tác động của nấm lên côn trùng ..................................................................8 6.1. Metarhizium anisopliae .................................................................................8 6.2. Beauveria bassiana .......................................................................................8 6.3 Paecilomyces spp. ..........................................................................................8 7. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự phát triển của bào tử nấm...............9 7.1. Metarhizium anisopliae .................................................................................9 7.2. Beauveria bassiana .......................................................................................9 7.3. Paecilomyces spp. .........................................................................................9 8. Ảnh hưởng của một số môi trường nhân sinh khối lên các loài nấm ký sinh côn trùng....................................................................................................................9 II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................................11 1. Phương tiện thí nghiệm ........................................................................................11 2. Phương pháp thí nghiệm ......................................................................................11 2.1. Thu thập mẫu côn trùng bị nhiễm nấm và phân lập 3 loài nấm ký sinh côn trùng Beauveria bassiana (Bals.) Vuill, Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Paecilomyces spp. ở 6 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Hậu Giang và Tiền Giang ..............................................................................11 2.2. Phân lập, tách ròng, định danh và tồn trữ các mẫu nấm thu được trong môi trường PDA (Potato Destrose Agar)..................................................................12 2.3. Thử nghiệm hoạt lực sinh học của các mẫu nấm thu thập được trên sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm .......................................................................13 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng lên sự hình thành và phát triển bào tử của các loại nấm xanh Metarhizium anisopliae (Ma), nấm iii trắng Beauveria bassiana (Bb), nấm tím Paecilomyces spp. (Pae) trong môi trường lỏng. .............................................................................................................14 2.4.1. Nguồn nấm............................................................................................14 2.4.2. Bố trí thí nghiệm....................................................................................14 2. 4.3. Chỉ tiêu đánh giá...................................................................................16 2.4.4. Thống kê: Tổng hợp số liệu và phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC.................................................................................................................16 CHƯƠNG II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................17 I. Thu thập mẫu côn trùng bị nhiễm nấm và phân lập 3 loài nấm ký sinh côn trùng Beauveria bassiana (Bals.) Vuill, Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Paecilomyces spp. ở 6 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Hậu Giang và Tiền Giang...............................................................................17 II. Phân lập, định danh và tồn trữ các mẫu nấm thu được trong môi trường PDA (Potato Destrose Agar).............................................................................................18 III. Thử nghiệm hoạt lực sinh học của các mẫu nấm thu thập được trên sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm .......................................................................20 IV. Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng lên sự hình thành và phát triển bào tử của các dòng nấm Metarhizium anisopliae, nấm Beauveria bassiana và nấm Paecilomyces spp. trong 4 môi trường dinh dưỡng (môi trường lỏng) ........................................................................................................................23 1. Khả năng sinh bào tử của nấm Metarhizium anisopliae M2-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng ............................................................................................23 2. Khả năng sinh bào tử của nấm Metarhizium anisopliae M5-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng ............................................................................................24 3. Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M1 - CT trên 4 loại môi trường dinh dưỡng......................................................................................25 4. Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M3 - VL trên 4 loại môi trường dinh dưỡng......................................................................................26 5. Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M1-ST trên 4 loại môi trường dinh dưỡng......................................................................................26 6. Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B2-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng ............................................................................................27 7. Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B2-TG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng ............................................................................................28 8. Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B1–VL trên 4 loại môi trường dinh dưỡng ............................................................................................29 9. Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp. Pae2 - AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng ............................................................................................30 10. Khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp. Pae3 - TG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng ............................................................................................30 CHƯƠNG III. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................34 I. Kết luận................................................................................................................34 II. Kiến nghị ............................................................................................................34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ CHƯƠNG iv DANH SÁCH BẢNG Bảng Tựa Bảng Trang 1 Thành phần các nguyên vật liệu dùng để nuôi sâu ăn tạp 13 2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 15 3 Tỷ lệ khoáng chất của các loại môi trường lỏng 16 4 Số mẫu sâu hại bị nhiễm nấm ký sinh thu thập được ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long, tháng 8-9 năm 2008. 17 5 Danh sách các dòng nấm phân lập được trong môi trường PDA tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Cần Thơ, tháng 9- 11 năm 2008. 18 6 Hiệu lực (%) của các dòng nấm đối với sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm, bộ môn BVTV, ĐHCT, tháng 12 năm 2008. 21 7 Danh sách mười dòng nấm có hiệu quả cao được chọn qua thí nghiệm trong phòng, được trữ đông để tiếp tục các thí nghiệm sau. 23 8 Số lượng bào tử của nấm M2-AG ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày sau khi lắc. 23 9 Số lượng bào tử của nấm M5-AG ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày sau khi lắc. 24 10 Số lượng bào tử của nấm M1-CT ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày sau khi lắc. 25 11 Số lượng bào tử của nấm M3-VL ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày sau khi lắc. 26 12 Số lượng bào tử của nấm M1-ST ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày sau khi lắc. 26 13 Số lượng bào tử của nấm B2-AG ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày sau khi lắc. 27 14 Số lượng bào tử của nấm B2-TG ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày sau khi lắc. 28 15 Số lượng bào tử của nấm B1 –VL ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày sau khi lắc. 29 16 Số lượng bào tử của nấm Pae2 - AG ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày sau khi lắc. 30 17 Số lượng bào tử của nấm Pae3 - TG ở thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày sau khi lắc. 30 v DANH SÁCH HÌNH Hình Tựa Hình Trang 1 Nuôi cấy nấm theo phương pháp Slide Culture 12 2 Thu thập nấm Metarhizium anisopliae 32 3 Thu thập nấm Beauveria bassiana 32 4 Thu Thập nấm Paecilomyces spp. 32 5 Màu sắc tơ nấm trong môi trường nhân tạo PDA 33 6 Thực hiện tiêu bản, đếm mật số bào tử nấm trong phòng thí nghiệm 33 7 Sâu ăn tạp bị nhiễm nấm trong phòng thí nghiệm 33 8 Nấm sau khi lắc trong các môi trường dinh dưỡng 33 1 CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU Phòng trừ sâu hại là một trong những khó khăn lớn nhất trong nghề trồng rau và là mối quan tâm lo lắng hàng đầu của nông dân. Biện pháp phòng trừ của nông dân chủ yếu dựa vào việc phun thuốc hóa học là chính mà rất ít biết đến các biện pháp khác. Nông dân đã sử dụng tới hơn 30 loại thuốc trừ sâu trên rau, trong đó có nhiều loại đã bị cấm sử dụng (Nguyễn Quí Hùng và ctv.,1999). Sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fabricius), sâu ăn đọt cải (Hellula undalis Fabricius và Crocidolomia binotalis Zeller), sâu tơ (Plutela xylostella), rầy phấn trắng (Bemiscia tabaci), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) và bọ nhảy (Phyllostreta striolata) là những đối tượng gây hại quan trọng và phổ biến nhất trên nhóm rau ăn lá tại Đồng bằng sông Cửu Long (Trần Thị Ba, 1999). Sự phát triển tính kháng thuốc của sâu hại cũng như ảnh hưởng của thuốc hóa học lên sức khỏe con người và môi trường đã tạo áp lực mạnh cho sự phát triển của các tác nhân sinh học trong phòng trừ tổng hợp côn trùng gây hại. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu ở các nước trên thế giới như Úc, Brazil, Mỹ, Pháp, Colombia, Venezuela đã cho thấy việc sử dụng các loại nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ tổng hợp các loài sâu gây hại một cách hợp lý đã mang lại hiệu quả khá cao (Burges H. D., 1998; Butt T. M and Copping L., 2000). Ở Châu Á, tại Malaysia, đã nghiên cứu nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ mối đất đạt hiệu quả 64,57% sau 14 ngày. Tại Philippines, đã nghiên cứu sử dụng nấm Metarhizium anisopliae để diệt rầy nâu hại lúa, hiệu lực đạt 60% sau 10 ngày. Tại Úc, năm 1991 Milner đã nghiên cứu nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ bọ hung hại mía đạt hiệu quả 68%. Tại Nhật Bản, năm 1988 một số nhà khoa học đã sử dụng nấm Beauveria bassiana để phòng trừ dòi hại rễ củ cải đạt hiệu quả trên 70% sau 10 ngày. Tại Trung Quốc, Am và Wu đã sử dụng dòng nấm Paecilomyces spp. và Beauveria bassiana để phòng trừ sâu róm thông qua đông đạt hiệu quả cao. Ở trong nước, đã có một số nghiên cứu của Viện Bảo vệ thực vật phân lập được các dòng nấm ký sinh trên rầy nâu hại lúa, châu chấu hại bắp, sâu đo xanh hại đay, bọ hại dừa, sùng đất hại đậu phộng và sử dụng đạt được hiệu quả rất cao. Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long cũng sử dụng các dòng nấm trên rầy nâu đạt hiệu quả rất tốt, hơn 67% sau 10 ngày. Tuy nhiên, việc sử dụng các dòng nấm này trong quá trình quản lý và phòng trừ tổng hợp còn hạn chế do các dòng nấm giảm dần độc tính qua một thời gian sử dụng. Ngoài ra, việc thu thập, phân lập và thử nghiệm các dòng nấm có khả năng diệt sâu cao là yêu cầu thường xuyên và cấp thiết. Từ đó, đưa đến yêu cầu cần phải tiến hành nghiên cứu bổ sung thêm các chất khoáng dinh dưỡng để tăng cường khả năng tạo mật số bào tử trên môi trường giống cấp 1 (nấm nguồn) là việc làm rất quan trọng, tiến tới nghiên cứu môi trường sản xuất chế phẩm sinh học có chất lượng tốt phục vụ cho việc thử nghiệm và đưa ra ứng dụng đạt hiệu quả cao hơn. Đề tài: “Phân lập và chọn môi trường nhân sinh khối ba loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok, Beauveria bassiana (Bals.) Vuill và Paecilomyces spp. trên nhóm rau ăn lá ở Đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện đáp ứng các yêu cầu trên. 2 A. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU I. MỤC TIÊU 1. Phân lập được ba loài nấm ký sinh chuyên biệt từ 6 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long và bước đầu chọn ra những dòng nấm có hiệu quả trong phòng thí nghiệm qua thử nghiệm hiệu quả đối với sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fab.). 2. Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng thích hợp để nhân nhanh sinh khối 3 loại nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp., làm cơ sở cho việc nghiên cứu, sản xuất chế phẩm phòng trừ sâu hại. II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1. Thu thập các loài nấm ký sinh côn trùng trên các loài rau ăn lá như sâu ăn tạp, sâu ăn đọt cải, sâu xanh da láng, sâu tơ, bọ nhảy, rầy mềm,… tại những vùng sản xuất rau có diện tích tương đối lớn. Phân lập và tách ròng các dòng nấm này trên đĩa pêtri (invitro) trong môi trường PDA (Potato Destrose Agar). 2. Khảo sát hiệu lực của các dòng nấm đã phân lập được đối với sâu ăn tạp (Spodoptera litura) trong điều kiện phòng thí nghiệm. 3. Khảo sát ảnh hưởng của bốn loại môi trường dinh dưỡng CDA, CAM, SDAY1, SDAY3 lên sự hình thành và phát triển bào tử của 3 loài nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, và Paecilomyces spp. B. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU I. ĐỐI TƯỢNG Phân lập, định danh và ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng CAM, CDA, SDAY1 và SDAY3 đối với 3 loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp. được thu thập và phân lập ở 6 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long trong điều kiện invitro. II. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Phân lập các dòng nấm nấm ký sinh côn trùng trên rau thu thập từ 6 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long: An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang, Tiền Giang và Sóc Trăng. Bố trí thí nghiệm về hiệu quả của các dòng nấm đã phân lập được đối với sâu ăn tạp trong phòng thí nghiệm và ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng lên sự hình thành và phát triển của bào tử các dòng nấm này. C. CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. CƠ SỞ LÝ LUẬN 1. Phân loại Theo hệ thống phân loại nấm của Ainsworth, G. C. (1996), ba loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp. đã được phân loại như sau: Nấm Metarhizium anisopliae thuộc ngành phụ lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, giống. Một số tác giả khác lại cho rằng nấm Metarhizium anisopliae thuộc ngành phụ lớp nấm túi Asscomycotia, lớp Pletomyces và giống Metarhizium. Tuy nhiên, phân loại theo Ainsworth được nhiều tác giả chấp nhận hơn cả. 3 Nấm Beauveria bassiana thuộc ngành phụ lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, giống Beauveria. Theo Macleod, H. L (1954), loài Beauveria bassiana là loài điển hình trong chi nấm bạch cương Beauveria Nấm Paecilomyces spp. có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 31 loài và phân bố trên diện rộng trong đó có thể kể đến là Paecilomyces farinosus, Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces amoeneroseus, Paecilomyces javanicus, Paecilomyces tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces lilacinus (Dilip K. Arora, P. D. Bridge, Deepak Bhatnagar, 2004). 2. Sự phân bố Nấm Metarhizium anisopliae được tìm thấy trên khắp các châu lục với hơn 200 loài côn trùng khác nhau như rầy lá, rầy mềm, bọ xít đen và rất nhiều loài sâu hại khác. Sau khi xâm nhiễm, chúng hình thành trên bề mặt côn trùng một lớp phấn màu xanh vàng đến màu xanh đậm, trên mạng sợi nấm chằng chịt màu trắng (Ferron L. K, 1978). Nấm Metarhizium anisopliae là nấm hại côn trùng, xuất hiện phổ biến trong tự nhiên, có thể phân lập từ xác côn trùng chết hay được phân lập từ trong đất. Ở những nơi không có côn trùng, người ta cũng phân lập được Metarhizium anisopliae ngay cả trong điều kiện thời tiết rất khắc nghiệt (như ở Đức), trên những khu đất ở rừng sâu khi bị đốt cháy, cả trong những chất thải hữu cơ (chuẩn bị ô nhiễm) hoặc trong trầm tích ở sông chứa đất đầm lầy trồng những loại cây đước, hoặc trong tổ của một số loài chim và cả trong rễ của cây dâu tây cũng có thể phân lập được nấm Metarhizium anisopliae (Phạm Thị Thùy, 2004). Nấm Beauveria bassiana phân bố rộng rãi trên khắp thế giới, được tìm thấy trên và trong đất cũng như ký sinh trên rất nhiều loài côn trùng hại bông, khoai tây, lúa mì, đậu và ngô ở Mỹ (Alaoui Abdelaziz và Elmeziane Abdellatif, 2008). Nấm Beauveria bassiana (hay còn gọi là nấm bạch cương) là loại nấm hại côn trùng phân bố trên khắp thế giới, xuất hiện phổ biến trong tự nhiên, có thể phân lập dễ dàng từ xác côn trùng chết hay được phân lập từ trong đất (James R. Fuxa và Yoshinori Tanada. 1993.). Nấm Paecilomyces spp. có rất nhiều loài, có phổ ký sinh côn trùng rất rộng, cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Nấm Paecilomyces spp. dễ dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa thực vật. Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên. Một số loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như: - Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết côn trùng - Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất - Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, côn trùng. - Paecilomyces lilacinus phân lập từ xác bã hữu cơ, đôi khi ở côn trùng chết, rừng cao su (Crop Protection Compennium, 2002). 4 3. Đặc điểm hình thái, sinh học và khả năng gây hại 3.1. Metarhizium anisopliae Nấm Metarhizium anisopliae có dạng sợi phân nhánh, có vách ngăn ngang, đường kính 3 – 4 µm (Trần Thị Thanh, 2004). Sợi nấm phát triển trên bề mặt côn trùng có màu từ trắng đến hồng, cuống sinh bào tử ngắn mọc tỏa tròn trên đám sợi nấm dày đặc. Bào tử trần hình que có kích thước 3,5 x 6,4 x 7,2 µm, màu từ lục xám đến ôliu - lục, bào tử xếp thành chuỗi khá chặt chẽ và nhìn bằng mắt thường có thể thấy bào tử được tạo ra trên bề mặt cơ thể côn trùng một lớp phấn khá rõ màu xanh lục. Sợi nấm khi phát triển bên trong côn trùng có chiều rộng khoảng 3 - 4 µm, dài khoảng 20 µm, chia thành nhiều tế bào ngắn, trong tế bào có thể thấy rõ nhiều giọt mỡ (Phạm Thị Thùy, 2004). Nấm Metarhizium anisopliae có bào tử dạng hình trụ, hình hạt đậu, khuẩn lạc có màu xanh, thỉnh thoảng có màu tối hoặc màu hồng vỏ quế. Loài Metarhizium anisopliae có 2 dạng bào tử nhỏ và lớn, dạng bào tử nhỏ Metarhizium anisopliae var có kích thước bào tử 3,5 - 5,0 x 2,5 - 4,5 µm, dạng bào tử lớn là Metarhizium anisopliae var. major có kích thước bào tử 10,0 - 14,0 µm . Để phân biệt 2 loài trên, Tsai. K. và ctv., (2006) đã nghiên cứu đặc tính huyết thanh khác nhau của 2 loài này và xác định rằng loài Metarhizium anisopliae là chủng gây bệnh mạnh nhất trên côn trùng thuộc bộ cánh cứng Coleoptera. Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và tìm thấy có khoảng 204 loài côn trùng thuộc họ Elaridae và Curculionidae dễ bị nhiễm bệnh bởi nấm Metarhizium anisopliae (Phạm Thị Thùy, 2004). Nấm Metarhizium anisopliae là loài nấm ký sinh rất rộng trên các đối tượng gây hại nông lâm nghiệp trên khắp thế giới như bộ cánh cứng, cánh đều, cánh nửa cứng, cánh vẩy,… Cho đến nay các nhà khoa học trên thế giới vẫn chưa xác định được một loại vi nấm nào có hiệu lực cao và phổ tác dụng rộng rãi như chủng M. anisopliae. Tại Úc năm 1995, Richard Miller đã tách được vài trăm dòng nấm Metarhizium anisopliae từ một nhóm côn trùng sống trong đất dưới gốc mía. Trong số 95 chủng thử nghiệm trực tiếp, tác giả chỉ chọn được hai chủng có khả năng diệt sâu là Lepidota frenchi và L. consobrina hại rễ mía và một chủng diệt sâu Antitrogus parvulus với LD50 là 1 - 5 x 104 bào tử.g-1. Henel đã chọn từ 22 chủng vi nấm, chỉ có 1 chủng Metarhizium anisopliae là phù hợp cho phương pháp phòng trừ sinh học đối với loài mối Masutiesrmes exitiosus (Hill K. L, 1999, trích dẫn bởi Phạm Thị Thùy, 2004). Nhiều loài nấm trong chi Metarhizium có khả năng diệt côn trùng thuộc họ Elalerdae và Curculionidae thuộc bộ cánh cứng Coleoptera, ấu trùng muỗi Aedes aegypti, Anopheles setphensi, Clexpipiens thuộc bộ hai cánh Diptera, bọ xít đen hại lúa mì Scotiphora coarctata thuộc bộ cánh nửa cứng Hemiptera, châu chấu sống lưng vàng Patanga sucincta, châu chấu mía Heiroglyphus tonkinensis thuộc bộ cánh thẳng Orthopterra, mối hại đất Masutitermes extiosus thuộc bộ cánh bằng Isoptera. 3.2. Beauveria bassiana Nấm có sợi từ màu trắng đến màu kem có pha một ít màu đỏ, da cam, đôi khi pha một ít màu lục, có thể tiết vào môi trường sắc tố màu vàng, màu đỏ nhạt hoặc màu xanh da trời. Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn ngang, có chiều dài khoảng 3 - 5mm phát triển dày đặc trên môi trường, về sau xuất hiện chi chít các cuống sinh bào tử. 5 Đặc điểm của loại nấm này là có sợi xốp, cuống bào tử trần đứng riêng rẽ hay tụ lại thành từng đám, không phân nhánh hoặc phân nhánh, hình ống hoặc hình bình với chiều dài không đều nhau. Trên cuống có những nhánh nhỏ mang bào tử trần (Phạm Thị Thùy, 2004). Nấm Beauveria bassiana sinh ra những bào tử trần đơn bào (chỉ gồm một tế bào) không màu, trong suốt, không vách ngăn từ hình cầu (đường kính 1 – 4 µm) đến hình trứng (kích thước 1,5 - 5,5 µm). Bào tử trần mọc trong vòng xoắn, phát sinh từ sợi sinh dưỡng mọc thành từng đám, có cuống phình ra. Tế bào sinh bào tử trần có cuống dạng hình cầu hoặc elip, hình thoi trụ, hình cổ chai. Cuống tế bào sinh bào tử trần có hình ziczag nhưng là mấu dạng răng nhỏ phát sinh bởi sự kéo dài của gốc ghép (Phạm Thị Thùy, 2004). Nấm Beauveria bassiana xâm nhiễm nhiều loài côn trùng gây hại cho nông nghiệp thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera, bộ cánh cứng Coleoptera, bộ cánh màng Hymenoptera, và cả bộ cánh nửa cứng Hemiptera, bộ hai cánh Diptera (Yoshinori Tanada và Harry K. Kaya, 1993). Clark G. H và ctv., (1986) cho biết có thể sử dụng nấm Beauveria bassiana để diệt muỗi. 3.3. Paecilomyces spp. Khuẩn lạc của nấm Paecilomyces spp. có thể là dạng thảm nhung, dạng bó sợi, màu trắng, hồng nhạt hoặc tím (nên thường được gọi là nấm tím), nâu vàng và nâu xám, thỉnh thoảng có màu lục nhạt. Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, mức độ phân nhánh của nấm Paecilomyces spp. thường lớn hơn nấm mốc xanh Penicillium, gốc cuống dạng bình phình to, phía trên nhỏ và uốn cong. Cuống bình thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều. Bào tử phân sinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Trần Văn Mão, 2002). Julio J. D và ctv. (2004) đã chứng minh rằng rất ít hoặc không có bào tử nấm được tạo nên ở các nhiệt độ 12, 16, và 30oC. Ánh sáng cũng rất cần thiết cho quá trình sinh bào tử của nấm Paecilomyces spp. Nếu thiếu ánh sáng thì nấm Paecilomyces spp. sẽ không tạo nhiều bào tử. Các nhà khoa học cũng cho biết rằng nấm Paecilomyces spp. khi tấn công vào cơ thể côn trùng nếu gặp những điều kiện không thích hợp về nhiệt độ và ẩm độ, ánh sáng thì nấm sẽ tạo nên những thể chịu đựng (resistant structures) để đối phó lại với môi trường (Penland, 1982). Nấm Paecilomyces spp. gây bệnh cho các loài côn trùng thuộc bộ cánh vẩy thường gây ra dịch bệnh trên ruộng đậu. Nấm Paecilomyces spp. còn được sử dụng để diệt sâu đo Trichoplusia ni, sâu xanh Spodoptera frugiperda, sâu ăn tạp Spodoptera litura (Yoshinori Tanada và Harry K. Kaya, 1993). Nấm Paecilomyces spp. có hiệu quả cao đối với việc phòng trị sâu do có độc tố gọi là Mycotoxin. Ở Ấn Độ, các nhà khoa học đã chứng minh được nếu sử dụng nấm Paecilomyces spp. với nồng độ 108 bào tử.ml-1 chủng vào sâu non, sâu non sẽ chết sau 6-8 ngày. Khi chết xác sâu sẽ bị khô lại, sau đó nấm sẽ phát triển và cơ thể của sâu sẽ bị bao phủ bởi lớp nấm màu xanh (Vimala Devi, P.S. 1994). Ngoài ra, người ta còn sử dụng nấm Paecilomyces spp. để phòng trừ sâu hại bông, ngài đêm vân lệch, sâu cuốn lá lúa, sâu đục thân bắp (Trần Văn Mão, 2002), 6 4. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 4.1. Metarhizium anisopliae Nấm Metarhizium anisopliae không thể sinh trưởng tốt trên nền cơ chất không có kitin, chúng sống được ở nhiệt độ thấp 80C, có biên độ về độ ẩm rộng, ở nơi tích lũy nhiều CO2 và thiếu O2 chúng có thể sống tới 445 ngày. Ở nhiệt độ dưới 100C và trên 450C thì nấm thường không hình thành bào tử. Nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là từ 25 - 300C và sẽ bị chết ở 49 - 550C, nhiệt độ cho nấm phát triển tốt nhất là 250C. pH thích hợp là 6,0 và có thể dao động trong khoảng 3,3 - 8,5. Nấm Metarhizium anisopliae có khả năng phân giải tinh bột, xenlulose và kitin (lông và da côn trùng). Nấm Metarhizium anisopliae có thể đồng hóa nhiều nguồn thức ăn carbon khác nhau. Chúng phát triển tốt trên môi trường có chứa glucose hay lipid. Muốn tạo thành bào tử, nấm Metarhizium anisopliae đòi hỏi phải có ẩm độ không khí khá cao. Sản phẩm trao đổi chất có thể làm tê liệt ấu trùng của sâu loài Galleria, Mellonela và Bombyx mori. Trong dịch nuôi cấy người ta đã tách được dung dịch toxin và xác định bản chất hóa học của chúng là peptid vòng destruxin A, B, C và D (Phạm Thị Thù._.y, 2004). 4.2. Beauveria bassiana Nấm Beauveria bassiana cũng khó sinh trưởng tốt trên nền cơ chất không có kitin. Nấm Beauveria bassiana được phân lập từ đất hoặc trên xác chết côn trùng, chúng phát triển trên môi trường PDB (Potato Dextrose Broth - Nước luộc khoai tây detroza) ở nhiệt độ 25-300C với pH = 5-7. Ở nhiệt độ dưới 100C và trên 450C thì nấm thường không hình thành bào tử. Nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là từ 25 - 300C và bị chết ở 49 - 550C, nhiệt độ cho nấm phát triển tốt nhất là 22- 250C. pH thích hợp là 6 và có thể dao động trong khoảng 3 - 8,5. Nấm Beauveria bassiana có khả năng phân giải tinh bột, xeluloza và kitin (lông và da côn trùng). Chase A. R và ctv., sử dụng môi trường chứa nguồn tinh bột tự nhiên (bột yến mạch) để phân lập nấm Beauveria bassiana. Nấm Beauveria bassiana có thể đồng hóa nhiều nguồn thức ăn carbon khác nhau. Chúng phát triển tốt trên môi trường có thể chứa glucose hay lipid. Muốn tạo thành bào tử, nấm Beauveria bassiana đòi hỏi phải có ẩm độ không khí cao, tuy nhiên ẩm độ dưới 50% vẫn kích thích nấm sinh bào tử (Gottwald. G. L, H. L Tedders, 1982). 4.3. Paecilomyces spp. Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces spp. cần nhiều dưỡng chất, nếu thiếu chất dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với côn trùng (Trần Văn Mão, 2002). Nhiệt độ và ẩm độ cũng ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển của bào tử nấm Paecilomyces spp., Khi nuôi nấm Paecilomyces farinosus ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau cho thấy nhiệt độ 150C có lợi cho sự hình thành bào tử hơn là nhiệt độ 240C. Khi nuôi nấm Paecilomyces papillata, nhiệt độ thích hợp nhất là 24 - 260C, nhưng ở nhiệt độ 180C tỷ lệ ký sinh cao hơn 18% so với nhiệt độ 250C. Nguyên nhân có thể là do dưới nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình dị hóa, làm tăng quá trình đồng hóa, từ đó làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần Văn Mão, 2002). 7 Gần đây Stathers, T. E., D. Moore và C. Prior (2004) đã cho công bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. và xác định nấm Paecilomyces spp. thích hợp ở nhiệt độ 280C và ẩm độ thích hợp trong phạm vi 80-90% (Phạm Thị Thùy, 2004). Độ ẩm cao sẽ rất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, tuy nhiên độ ẩm thấp sẽ có lợi cho duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm Paecilomyces spp. có khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm độ từ 0 - 34% hơn là khi ẩm độ 75% (Trần Văn Mão, 2002). Nấm côn trùng nói chung rất cần ánh sáng cho sự phát triển và nấm Paecilomyces spp. cũng không ngoại lệ. Vì vậy ánh sáng là nhân tố không thể thiếu trong sự hình thành bào tử của nấm Paecilomyces spp. (Trần Văn Mão, 2002). 5. Khả năng sinh độc tố diệt côn trùng và các sản phẩm trao đổi chất 5.1. Metarhizium anisopliae Độc tố của nấm M. anisopliae gồm một số ngoại độc tố có tên là Destruxin A, B, C hay D. Các ngoại độc tố đó là các sản phẩm thứ cấp vòng peptit, L-prolyu, L- leucine, anhydride và Desmethyl Destruxin B. Cấu trúc cơ bản của chúng gồm 5 aminoacid và α-hytroxy acid. Destruxin gây chán ăn và gây độc cho côn trùng khi chúng hấp thu vào da, một số Destruxin gây tê liệt côn trùng (Amiri, B. L và ctv., 1999; Dumas, C. K và ctv., 1996). Một số Destruxin khác ức chế miễn dịch rất mạnh mẽ (Cerenius, L và ctv., 1990). Các sản phẩm thứ cấp đó thường được tích lũy vào cuối giai đoạn sinh trưởng của nấm, khi các nguồn thức ăn và năng lượng cạn kiệt (Phạm Thị Thùy, 2004). Theo Suziki, K. Kawakami và ctv., (1998): Destruxin A có công thức nguyên là: C29H47 N5O7, có điểm sôi là 188 0C Destruxin B có công thức nguyên là: C30H51O7N5, có điểm sôi là 2340C. Gần đây, Alexandr Jegorov, Petr Sedmera, Vladimr Havlek and Vladimr Mat'ha (1998) đã ly trích thành công được độc tố có tên là Destruxin Ed1, một Cyclopeptide từ nấm này. Năm 1969, Hamill, R. L. đã xác định được độc tố diệt côn trùng của nấm bạch cương Beauveria bassiana và đặt tên cho độc tố này là Beauvericin. Dombrink Kurtzman M.A. (2003) đã xác định bản chất của độc tố sinh ra trong quá trình trao đổi chất là vòng peptit có sắc tố màu vàng là tenelin và basianin, những sắc tố này có thể là do hydroxylat progesteron và những phần nhỏ tách ra từ testosteron (C19H28O2) sinh ra. 5.2. Beauveria bassiana Độc tố của nấm Beauveria bassiana là Beuvericin. Về mặt hoá học, Beuvericin có danh pháp là xyclo (N-metyl L-phenylalanin-D-α-hydroxy- izovaleryl) 3. Đó là một loại depxipeptid vòng, có điểm sôi khoảng 93-940C. Từ 1 lít môi trường nuôi cấy nấm bạch cương Beauveria bassiana các nhà khoa học Trung Quốc ở trường Đại học tổng hợp Nam Khai (Thiên Tân) đã tách ra được 1,5 g độc tố Beauvericin và từ 1 kg môi trường đặc các tác giả đã chiết tách ra được 3,8 g Beauvericin (Phạm Thị Thùy, 2004). 8 Thành phần của môi trường sẽ gây ảnh hưởng đến sự sản sinh độc tố của nấm Beauveria bassiana. Theo Fang W, Bidochka MJ. (2006), sự hiện diện của đường fructose trong môi trường nuôi cấy sẽ làm gia tăng đáng kể độc tố Beauvericin của nấm Beauveria bassiana. Theo Bidochka M. J và J. J. Khachatourians (2001) thì sản phẩm của nấm Beauveria bassiana là 2 axit hữu cơ, đó là axit oxalic và axit citric, khi nuôi cấy trên môi trường có chứa kitin. Các tác giả đã chứng minh được chính hai axit trên đã tham gia vào trong quá trình hòa tan protein biểu bì của côn trùng (Phạm Thị Thuỳ, 2004). 5.3. Paecilomyces spp. Độc tố của nấm Paecilomyces là Paecilotoxin, cấu trúc cực kỳ phức tạp, có pháp danh hóa học là (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[2-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[2-[2-(3- arbamoylpropylcarbamoyl)propan-2-ylcarbamoyl] propan-2-ylcarbamoyl]-3-methyl butyl] carbamoyl] -3-methyl-butyl]carbamoyl]propan-2-ylcarbamoyl]-2-hydroxy-3- methyl-butyl] carbamoyl]-5-hydroxy-3-methyl-7-oxo-nonyl]-4-methyl-1-[(E,4S)-4- methylhex - 2 - enoyl] pyrrolidine - 2 - carboxamide (Nevalainen Helena, 1977). 6. Cơ chế tác động của nấm lên côn trùng 6.1. Metarhizium anisopliae Khi bào tử nấm Metarhizium anisopliae bám trên bề mặt côn trùng sẽ nảy mầm tạo thành ống mầm xuyên qua biểu bì bên ngoài. Bào tử bám chặt vào da và tấn công theo cơ chế bám dính không chuyên biệt thông qua tính kỵ nước của vách tế bào (Bocias, H. I; Bandan, A. R., 1988; 1991). Khi tiếp xúc với da côn trùng và với điều kiện thích hợp bào tử sẽ mọc mầm có thể tạo ra các cấu trúc xâm nhiễm như tạo ra các ống mầm, túi ngoại bào hoặc túi áp suất, từ đó xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp chitin. Sự xâm nhập của nấm vào trong biểu bì thường là do sự phối hợp của enzyme và cơ chế cơ học. Nấm tiết ra các loại men làm mềm lớp vỏ chitin và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc mầm, qua lổ thủng đó mầm của bào tử nấm xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng. Các enzyme đó là exoproteases, endoproteases, esterases, lipases, chitinases và chitobiases (Leger St. và ctv., 1996; Butt và ctv., 1998). 6.2. Beauveria bassiana Những bào tử nấm Beauveria bassiana thường bay trong không khí khi dính vào côn trùng, gặp điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm và mọc thành sợi nấm đâm xuyên qua vỏ kitin. Chúng phát triển ngay trong cơ thể côn trùng cho đến khi xuất hiện các tế bào nấm đầu tiên (có dạng chuỗi ngắn như nấm men), côn trùng đã phải huy động hết các tế bào bạch huyết (lympho-cyte) để chống đỡ nhưng nấm bạch cương đã sử dụng những vũ khí hóa học rất lợi hại là độc tố Beauvericin, proteaza và một số chất khác làm cho tế bào bạch huyết của tằm không chống đỡ nổi nên lần lượt bị huỷ diệt. Khi độc tố nấm đã tiêu diệt hết các tế bào bạch huyết cũng là lúc côn trùng bị chết, cơ thể côn trùng bị cứng lại là do các sợi nấm đan xen lại với nhau; bào tử của nấm bạch cương đã được sử dụng một cách có hiệu quả để phòng trừ nhiều loại côn trùng hại cây trồng (Phạm Thị Thùy, 2004). 6.3 Paecilomyces spp. Côn trùng khi bị nấm Paecilomyces spp. tấn công thì ở chỗ bào tử bám vào sẽ sản sinh ra enzyme phân hủy vỏ chitin của côn trùng. Nấm sẽ phát triển bên trong thân của sâu non tạo nên một vệt đen không có hình thù nhất định. Côn trùng chết đi thường có màu trắng, đôi khi màu tím nhạt, thân hơi cứng lại (Phạm Thị Thùy, 2004). 9 7. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự phát triển của bào tử nấm Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho nấm sinh trưởng và phát triển, nếu môi trường không tốt nấm mọc yếu hoặc không mọc. 7.1. Metarhizium anisopliae Trong quá trình nảy mầm để hình thành bào tử, nấm M. anisopliae cần các nguồn C, N. Sự phát triển của nấm phụ thuộc vào các chất ức chế khác nhau. Môi trường thích hợp nhất cho nấm M. anisopliae là môi trường có chứa kitin làm nguồn cacbon, nếu bổ sung thêm chất kitin và glucoza thì trong quá trình nuôi cấy nấm M. anisopliae sẽ thu được số lượng bào tử cao, bởi vì thành phần kitin trong môi trường nuôi cấy là rất cần thiết đối với các loại nấm, nó giúp cho sự phát triển và hình thành bào tử đính (Conidiospore) và bào tử trần (Blastospore). Ngoài nguồn nitơ vô cơ ra, nấm M. anisopliae còn sử dụng tốt nguồn hữu cơ như protein, pepton, các axit amim trong đó có axit glutamic là axit thích hợp cho nấm phát triển. Các nguyên tố vi lượng như C++, Zn++ có tác dụng kích thích cho sự phát triển của nấm (Leger St, et al., 1996). 7.2. Beauveria bassiana Nấm Beauveria bassiana khi nảy mầm cần rất nhiều chất dinh dưỡng, nếu để trong nước cất thì chúng nảy mầm rất ít hoặc nảy mầm rất chậm. Nấm bạch cương nảy mầm tốt trong môi trường có đường mía và peptone (Trần Văn Mão, 2002). Cũng như nấm Metarhizium anisopliae, nấm Beauveria bassiana cần các nguồn C, kitin và glucoza. Trong các loại đường nói chung, đường glucoza luôn là nguồn carbon khá tốt cho các loài nấm. Nấm Beauveria bassiana sử dụng glucoza trong đường đơn khá tốt, nhưng xyloza lại rất kém; trong đường đôi chúng sử dụng đường mía và đường maltoza khá tốt nhưng đường lactoza lại rất kém; trong đường đa chúng sử dụng tinh bột rất tốt, nhưng đường đơn lại rất kém; đối với xenluloza hầu như chúng không sử dụng. Trong axit chúng sử dụng axit hữu cơ (lactic) rất kém, nhưng glycerin (3 cacbon và 6 cacbon) lại rất tốt (Trần Văn Mão, 2002). Không những yêu cầu về nguồn cacbon, nấm Beauveria bassiana còn yêu cầu nitơ hữu cơ và vô cơ, trong nitơ vô cơ nấm Beauveria bassiana sử dụng tốt NO3- tốt hơn là NH4+. P là nhân tố quan trọng làm tăng sản lượng nấm bạch cương, trong giai đoạn sinh trưởng hàng loạt sợi nấm, Beauveria bassiana rất cần C, N, nhưng đến khi sợi nấm đứt ra thì nhu cầu C, N giảm dần, nhu cầu đối với P tăng lên (Trần Văn Mão, 2002). 7.3. Paecilomyces spp. Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces spp. cần nhiều dưỡng chất, nếu thiếu chất dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với côn trùng. Liang, K. (1981) đã cho biết nấm Paecilomyces tenuipes khi thiếu nguồn nitơ động vật tính gây bệnh giảm xuống rõ rệt (Hill, K. L, 1999, trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). 8. Ảnh hưởng của một số môi trường nhân sinh khối lên các loài nấm ký sinh côn trùng Nấm Metarhizium anisopliae phát triển chậm trên môi trường không có pepton (ví dụ như môi trường PDA, Czapek – Dox), thích hợp trên môi trường có pepton cụ 10 thể trên môi trường Sabouraud nấm phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ 250C sau 7 - 10 ngày nuôi cấy thì khuẩn lạc có đường kính 4 - 6cm. Loài nấm Metarhizium anisopliae có hai loài dạng bào tử nhỏ và lớn, dạng bào tử nhỏ Metarhizium anisopliae var. anisopliae có kích thước 3,5 - 5,0 x 2,5 - 4,5mm, dạng bào tử lớn là Metarhizium anisopliae var. major có kích thước bào tử 10,0 - 14,0mm (Stathers, T. E, 2004). Các loại nấm bất toàn như nấm bạch cương, nấm lục cương khi nảy mầm lại cần chất dinh dưỡng, nếu để trong nước cất thì chúng nảy mầm rất ít hoặc nảy mầm rất chậm. Nấm bạch cương nảy mầm rất tốt trong môi trường có đường mía và peptone, nấm lục cương lại nảy mầm tốt trong môi trường có peptone, dấm dầu, nước chiết rau cải, nước phân bón lót (Phạm Thị Thùy, 2004). Tamura, K. và ctv., (2008) đã tiến hành nuôi cấy nấm M. anisopliae cũng đã tách được những độc tố trên từ môi trường Czapek – Dox có chứa 0,5% pepton. Từ 1 lít dung dịch nuôi cấy người ta có thể thu nhận được 13 - 15mg độc tố Destruxin A và B, dịch lọc được xử lý bằng than hoạt tính rồi được phản hấp thụ bằng N – butanol, sau đó được tách bằng benzen và được làm sạch trên cột nhôm oxit trung tính. Môi trường nuôi cấy là yêu tố quan trọng cho nấm sinh trưởng và phát triển, nếu môi trường không tốt, nấm mọc yếu hoặc không mọc. Nấm bạch cương Beauveria bassiana khi nảy mầm cần rất nhiều chất dinh dưỡng, nếu để trong nước cất thì chúng nảy mầm rất ít hoặc nảy mầm rất chậm. Nấm bạch cương nảy mầm tốt trong môi trường có đường mía và peptone Ngoài ra, nấm còn cần nguồn C, N. Nếu bổ sung thêm chất kitin và glucoza thì trong quá trình nuôi cấy, nấm Beauveria bassiana sẽ thu được số lượng bào tử cao, bởi vì thành phần kitin trong môi trường nuôi cấy là rất cần thiết đối với các loài nấm (Trần Văn Mão, 2002). Trong các loại đường nói chung, đường glucoza luôn là nguồn carbon khá tốt cho các loài nấm. Nấm Beauveria bassiana sử dụng glucoza trong đường đơn khá tốt, nhưng xyloza lại rất kém. Trong đường đôi chúng sử dụng đường mía và đường maltoza khá tốt nhưng đường lactoza lại rất kém. Trong đường đa, chúng sử dụng tinh bột rất tốt, nhưng đường cục lại rất kém; đối với xenluloza hầu như chúng không lợi dụng. Trong axit chúng lợi dụng axit hữu cơ (lactic) rất kém, nhưng lợi dụng glycerin (3 cacbon và 6 cacbon) lại rất. Không những yêu cầu về nguồn cacbon, nấm Beauveria bassiana còn yêu cầu nitơ hữu cơ và vô cơ, trong nitơ vô cơ nấm Beauveria bassiana sử dụng tốt NO3_ tốt hơn là NH4+. P là nhân tố quan trọng làm tăng sản lượng nấm bạch cương, trong giai đoạn sinh trưởng hàng loạt sợi nấm, Beauveria bassiana rất cần C, N, nhưng đến khi sợi nấm đứt ra thì nhu cầu C, N giảm dần, nhu cầu đối với P tăng lên (Trần Văn Mão, 2002). Nấm Paecilomyces spp. là một loài nấm ký sinh côn trùng thuộc ngành phụ lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, có đặc tính sử dụng các loại chất dinh dưỡng tương tự như nấm xanh hay nấm lục cương, nếu được bổ dung pepton và yeast extract thì phát triển rất tốt trên môi trường lỏng (Trần Văn Mão, 2002). 11 II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Phương tiện thí nghiệm 1.1. Vật liệu, dụng cụ và thiết bị - Các dòng nấm diệt côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Paecilomyces spp. được phân lập từ các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. - Đĩa pêtri, Beaker, bình tam giác, nước cất, cồn 70%, cồn 99%. - Gòn không thấm, gòn thấm, giấy thấm, giấy kissme, kẹp inox, cọ lông, kéo, keo dán, bút lông, bọc nylon,... - Chai thủy tinh, hóa chất để nấu môi trường nuôi cấy nấm. - Kính hiển vi chụp ảnh, lame đếm hiệu Thoma (Nhật sản xuất), micropipette, cân điện tử. - Tủ cấy, tủ úm, nồi khử trùng áp suất (autoclave), micropipet, lò viba, đũa cấy,... 1.2. Hóa chất Các loại hóa chất cung cấp nguồn dinh dưỡng thêm vào môi trường: NaNO3, KH2PO4, MgSO4.7H2O, MgSO4, KCl, FeSO4.7H2O, Na2HPO4, NH4NO3, Glucose, Pepton, Yeast extract... 2. Phương pháp thí nghiệm 2.1. Thu thập mẫu côn trùng bị nhiễm nấm và phân lập 3 loài nấm ký sinh côn trùng Beauveria bassiana (Bals.) Vuill, Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Paecilomyces spp. ở 6 tỉnh: An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Hậu Giang và Tiền Giang. - Thời gian thu mẫu: tháng 08 – 11/2008, có thể thu vào mọi thời điểm trong ngày nhưng tốt nhất là vào buổi sáng sớm hay chiều mát vì lúc đó ẩm độ cao, sợi nấm mọc trương nước, khả năng sinh trưởng mạnh, thu về phân lập sẽ dễ hơn. Lịch thu mẫu theo từng địa phương, đi hết tỉnh này đến tỉnh khác, nếu các lần đi thu mẫu không đủ sâu bị nhiễm nấm thì có thể đi bổ sung vào những ngày khác. Nói chung, thời gian lấy mẫu không quan trọng bằng địa điểm phân lập các isolates và khả năng phát triển của nguồn nấm. - Chọn điểm thu thập những mẫu sâu hại: ở mỗi tỉnh chọn 1 huyện nơi có diện tích trồng rau tập trung. Mỗi huyện chọn 4 xã để thu mẫu. Mỗi ruộng rau thu ít nhất 4 mẫu cho mỗi loại nấm. 4 mẫu/ruộng x 3 loại nấm x 4 xã x 6 tỉnh = 288 mẫu. - Cách lấy mẫu sâu nhiễm nấm: Dùng kẹp inox đặt các mẫu sâu nhiễm nấm ngoài tự nhiên (quan sát được bằng mắt thường) vào trong tuýp có sẵn bông gòn thấm ướt để tạo ẩm độ, ghi nhãn nơi thu thập. - Nhận biết mẫu sâu bị nhiễm nấm ngoài tự nhiên: Quan sát bằng mắt thường, nhận diện hình thái bên ngoài nấm trên cơ thể côn trùng: + Nấm Metarhizium anisopilae: có màu lục hoặc xanh lục (là nấm lục cương). Sợi nấm phát triển trên bề mặt côn trùng ban đầu màu trắng sau chuyển sang màu xanh nhạt. Trên bề mặt cơ thể côn trùng có một lớp phấn khá rõ màu xanh lục, các sợi nấm khá mịn (hình 2). 12 + Nấm Beauveria bassiana (nấm bạch cương): đặc điểm của loại nấm này là sợi nấm mọc xốp, trông như những sợi nấm trắng mịn mọc xốp bao phủ bề mặt côn trùng (hình 3). + Nấm Paecilomyces: các sợi nấm mọc mịn bao phủ côn trùng, ban đầu có màu tím rất nhạt sau đó sợi nấm chuyển sang màu tím nhạt (hình 4). Sâu bị nhiễm nấm có tơ nấm xuất hiện trên cơ thể. Bị nhiễm vi khuẩn không có tơ nấm và thường nhũn nước, có mùi rất hôi. Sâu bị nhiễm virus thường nứt bụng hoặc khi chết treo ngược cành cây. Sâu bị chết do thuốc sâu cũng không có tơ nấm trên thân hoặc màu sắc, hình dạng nấm không đặc trưng. 2.2 Phân lập, tách ròng, định danh và tồn trữ các mẫu nấm thu được trong môi trường PDA (Potato Destrose Agar) - Phương pháp phân lập: Mẫu thu về được trữ trong đĩa pêtri có lót giấy thấm và bông gòn ẩm để tạo ẩm độ cho nấm phát triển, quan sát thấy tơ nấm xuất hiện tiến hành nuôi cấy nấm trong môi trường PDA. Nuôi cấy theo phương pháp Slide culture (Harris J. L, 1986) để quan sát bào tử và cành bào đài. Tiến hành theo các bước sau: - Chuẩn bị một miếng môi trường Agar đặt trên dĩa petri, có diện tích 5 mm2, cao 2 mm. - Đặt miếng môi trường Agar trên lam, trong dĩa petri có để giấy thấm nước tạo ẩm độ. - Cấy một ít bào tử nấm vào miếng Agar. Sau đó dùng lame đậy lên trên miếng Agar. - Ủ dĩa Petri với nhiệt độ 250C trong 3 – 5 ngày. Sau đó chuyển lame trên miếng Agar đặt lên một lam mới và đem quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, quan sát nhận diện, mô tả và chụp hình dạng bào tử, cành bào đài của các dòng nấm này. - Tiến hành định danh theo hệ thống phân loại của H. L. Barnett and Barry, B. Hunter (1998) và G. C. Ainsworth (1971) sau khi đã có dạng bào tử và cành bào đài của các dòng nấm. - Các mẫu nấm một phần nhân nuôi ra làm thí nghiệm, phần còn lại mang đi trữ nguồn trong các tuýp Glycerol 10% ở điều kiện -800C đã thanh trùng (D. Smith, 2002). Quan sát, ghi nhận một số đặc điểm sinh học trong quá trình phân lập để bước đầu ghi nhận những dòng nấm sinh trưởng mạnh, dễ nhân sinh khối như màu sắc, hình dạng, đặc điểm của bào tử, khuẩn lạc trên đĩa petri. Hình 1. Nuôi cấy nấm theo phương pháp Slide Culture (Harris, J. L, 1986) 13 2.3. Thử nghiệm hoạt lực sinh học của các mẫu nấm thu thập được trên sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm Nuôi nhân sâu ăn tạp trong phòng thí nghiệm: nuôi sâu ăn tạp đến tuổi 2, chọn sâu đồng cở để làm thí nghiệm. - Nguồn sâu ăn tạp được thu thập từ ngoài đồng đem về nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm bằng thức ăn nhân tạo nấu sẵn. - Khi ở giai đoạn nhộng, chọn ra những nhộng đực và nhộng cái khỏe cho vào bọc giấy (mỗi bọc giấy một cặp nhộng). - Sau khi nhộng vũ hoá, thường xuyên cho bướm uống nước đường glucose 10% . - Sau khi thấy những ổ trứng xuất hiện (3 - 4 ổ trứng), kiểm tra bướm để thu bướm sạch. Cách thực hiện như sau: + Cho cả cặp bướm bố mẹ vào cối nghiền có sẵn nước cất (khoảng 1 ml). + Dùng ống nhỏ giọt hút lấy một phần mẫu nghiền trong cối nghiền ở trên và nhỏ lên lam, đậy lame rồi đem quan sát dưới kính hiển vi phản pha. + Khi quan sát mẫu nghiền, nếu không thấy sự hiện diện của virus NPV, protozoa hoặc mật số vi khuẩn rất thấp thì có thể sử dụng ổ trứng của cặp bướm bố mẹ đó. - Thu những ổ trứng sạch cho vào dung dịch Formaline 10%, ngâm trong thời gian 25 phút để khử bỏ những vi sinh vật bám bên ngoài vỏ trứng. Sau đó vớt ổ trứng ra và rửa lại bằng nước cất. - Cho ổ trứng vào hộp nhựa có sẵn thức ăn chờ trứng nở. - Sau khi trứng đã nở, thu ấu trùng sâu non và tiếp tục nuôi bằng thức ăn nhân tạo cho đến khi ấu trùng đạt tuổi 2 thì tiến hành thí nghiệm. - Ấu trùng sâu ăn tạp được nuôi liên tục trong điều kiện phòng thí nghiệm để thực hiện thí nghiệm. Bảng 1. Thành phần các nguyên vật liệu dùng để nuôi sâu ăn tạp (Nguyễn Thị Ngọc Tuyền, 2003). Chuẩn bị huyền phù dung dịch nấm Sử dụng các dòng nấm được phân lập và tách ròng từ các mẫu sâu bị ký sinh ngoài tự nhiên, cấy nguồn nấm sang môi trường PDA khoảng 7-10 ngày cho sợi nấm phát triển và sinh một lượng bào tử nhất định. Sau đó tiến hành cạo nấm thu lấy bào tử, đếm mật số bào tử và pha loãng huyền phù bào tử đến mật số 108 bào tử.ml-1. STT Thành phần Số lượng 1 Bột đậu nành 50g 2 Bột mì 50g 3 Men bia 9g 4 Ascorbic acid (500mg/viên) 5v 5 Methyl-p-benzoate 2g 6 Chloramphenicol 50mg 7 L-cystein 20mg 8 Agar 2g 9 Lá cù nèo 200g 10 Nước cất 300ml 14 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 52 nghiệm thức (51 dòng nấm và 1 đối chứng), 5 lần lặp lại, mỗi lặp lại là 20 cá thể sâu đồng cở. Nghiệm thức đối chứng sử dụng nước cất thanh trùng. Mỗi cá thể sâu nuôi riêng trong các cốc nhỏ có nắp đậy để tránh bị nhiễm sang các con sâu khác. Mỗi cốc nhựa nhỏ có đường kính khoảng 5 cm x cao 6 cm, dưới đáy cốc có lót giấy thấm để dễ vệ sinh. Chủng vào mỗi cốc 20µl dung dịch huyền phù bào tử nấm và cho thức ăn nhân tạo vào, đậy cốc lại tránh lây nhiễm. Lấy chỉ tiêu Ghi nhận số sâu chết sau 4, 6, 8, 10 ngày sau khi xử lý đối với cả 3 loại nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp. Mỗi lần lấy chỉ tiêu đều đo nhiệt độ và ẩm độ. Tính độ hữu hiệu (%) bằng công thức Abbott (Trần Văn Hai, 1998). Số liệu được phân tích thống kê với phần mềm MSTATC. Độ hữu hiệu (%) = 100. C TC - (Công thứ Abbott) C: (%) sâu còn sống ở nghiệm thức đối chứng. T: (%) sâu còn sống ở nghiệm thức có xử lý nấm. 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng lên sự hình thành và phát triển bào tử của 3 loại nấm Metarhizium anisopliae, nấm Beauveria bassiana và nấm Paecilomyces spp. trong môi trường lỏng. 2.4.1. Nguồn nấm Sử dụng 10 dòng nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp. đã được phân lập và thử độ hữu hiệu trên sâu ăn tạp trong phòng thí nghiệm. Cấy nguồn nấm vào đĩa petri có chứa 10 ml môi trường cơ bản PDA đối với cả 3 loại nấm từ 10 đến 14 ngày cho nấm phát triển và sinh ra một số lượng bào tử nhất định. Sau đó, cho 10ml nước cất vào mỗi đĩa dùng lame cạo nhẹ vào mặt môi trường để thu lấy bào tử và đếm mật số bào tử ban đầu. 2.4.2. Bố trí thí nghiệm Bố trí thí nghiệm theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức tương ứng với 4 loại môi trường CDA, CAM, SDAY1, SDAY3 và 5 lần lặp lại. Mỗi đơn vị thí nghiệm tương ứng với 1 bình tam giác 400ml (chứa 100ml môi trường thử nghiệm như trong hình 7). Các bình tam giác chứa môi trường này đã được thanh trùng bằng autoclave ở 1210C trong 30 phút. Ở mỗi bình tam giác, chủng 1ml huyền phù bào tử nấm có mật số 107 bào tử.ml-1. Các đơn vị thí nghiệm (bình chứa môi trường) được đặt trên máy lắc tốc độ 120 vòng.phút-1 ở nhiệt độ và ánh sáng phòng thí nghiệm. 10 dòng nấm x 4 môi trường x 5 lặp lại = 200 đơn vị thí nghiệm. 15 Bảng 2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm AI1 CI2 DI1 CIII1 BIII3 BIII2 DIV1 BI3 AIII4 AIII9 DIV2 BIII4 CI3 DI2 CI1 DV5 AII9 DI3 DIV3 AI10 BV6 DV3 AII4 BIII1 DV7 DV4 BV7 CIV4 DV2 BV8 AIII5 DIV5 AV2 BI7 BI1 DI4 AII1 AV8 DIV4 AII8 DIV6 BIII5 AI2 DI6 AV3 BII4 BIV8 BV5 DV6 BIV7 CIV8 BI8 BII3 AIV4 BII2 AIV3 DI5 BIV6 AI3 AIII8 CIV5 AIV7 CI4 DIII1 BV4 AI9 CII10 BI2 BII10 BI6 CI5 CI6 DI7 CIV7 CII9 AV4 BV2 AIV2 AIII6 BIII6 BIII7 AIII7 DIII2 CII3 AI8 CII2 CIV6 BV3 BIV5 CIII8 CIII5 BIII8 CII1 BI9 BII9 AII3 CV2 BI5 DV1 CV1 CIII4 AIII10 AI7 BII1 AIII3 BIV4 DIII3 BIV3 CII8 DV8 CIV9 CV3 AV1 DII10 BI4 AV7 AIV6 AII2 AIV8 DIV10 AII6 DI8 CI7 DV10 AII7 CV5 BV10 AV6 BIII9 CII6 CIII3 AI4 CIII2 DII9 DIV9 BIII10 DI9 BIV2 DV9 CIII7 CV4 AIV10 CIII9 AII10 AV5 BI10 DIV7 CII7 DII8 AIV5 DII3 CV6 CIV10 BII5 DII7 CIII10 BII6 AIV1 BV9 AI5 DII4 DII5 CI8 CV7 DIII9 AIII1 CI9 DII6 BIV1 CV8 DIII4 CIV3 AIII2 BIV9 CIII6 DII2 DIII6 DIV8 DIII5 BII8 AV9 AI6 BV1 AII5 DI10 BII7 DIII7 CIV1 DIII8 CII5 CV10 DII1 AIV9 DIII10 CI10 BIV10 CII4 CV9 CIV2 AV10 A: Môi trường CDA C: Môi trường SDAY1 B: Môi trường CAM D: Môi trường SDAY3 I, II, III, IV, V: Năm lần lặp lại 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10: mười dòng nấm chọn ra từ thí nghiệm trong phòng 16 Bảng 3. Tỷ lệ khoáng chất của các loại môi trường lỏng Môi trường Khoáng chất CDA (Czapek - Dox) CAM (Complete Media) SDAY1 (Sabouraud dextrose Yeast) SDAY3 (Sabouraud dextrose Yeast) có thêm khoáng chất NaNO3 2g - - 2g KH2PO4 1g 0,4g - 1g MgSO4.7H2O 0,5g - - 0,5g MgSO4 - 1g - - KCl 0,5g 1g - - FeSO4.7H2O 0,01g - - - Na2HPO4 - 1.4g - - NH4NO3 - 0,7g - - Glucose 30g 10g 40g 40g Pepton 2g - 10g 10g Yeast extract - 5g 2g 2g Nước cất 1000ml 1000ml 1000ml 1000ml pH 6,5 – 7,2 6,5 – 7,2 6,5 – 7,2 6,5 – 7,2 2. 4.3. Chỉ tiêu đánh giá Số lượng bào tử quan sát và đếm được vào các thời điểm: 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày sau khi lắc cho cho tất cả các dòng nấm thí nghiệm. Ở mỗi thời điểm, tiến hành pha loãng dung dịch huyền phù bào tử nấm trong mỗi bình môi trường. Đếm mật số bào tử.ml-1 cho từng nghiệm thức. Số liệu mật số bào tử.ml-1 được đổi sang logarit thập phân. 2.4.4. Thống kê: Tổng hợp số liệu và phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC. 17 CHƯƠNG 2. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN I. Thu thập mẫu côn trùng bị nhiễm 3 loài nấm ký sinh côn trùng Beauveria bassiana (Bals.) Vuill, Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Paecilomyces spp. ở 6 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Hậu Giang và Tiền Giang. Qua quá trình đi thu thập các mẫu côn trùng bị nhiễm vi nấm ngoài tự nhiên trên đồng ruộng, chúng tôi nhận định rằng côn trùng bị nhiễm các loài nấm ký sinh khi chúng hiện diện với mật số cao, gây thành dịch và ít sử dụng thuốc bảo vệ thực vật. Hai trăm tám mươi tám dòng nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp. được thu thập từ những ruộng sản xuất rau của nông dân hoặc vườn rau gia đình tại 6 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Hậu Giang và Tiền Giang (Bảng 4). Các dòng nấm chủ yếu thu thập trên các đối tượng như gây hại như: sâu ăn tạp (Spodoptera litura), sâu ăn đọt (Crocidolomia binotalis), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua), rầy phấn trắng (Aleurodicus dispersus), sâu tơ (Plutella xylostella), sâu đục trái đậu nành (Etiella zinckenella), rầy mềm (Brevicoryne brassacicae) và bọ nhảy (Phyllotetra striolata). Bảng 4. Số mẫu sâu hại bị nhiễm nấm ký sinh thu thập được ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, tháng 8-9 năm 2008. STT Phường, Xã Quận, Huyện Tỉnh Số mẫu Nhiệt độ / ẩm độ trung bình 1 Kiến An Chợ Mới An Giang 12 29,40C / 70,4% 2 Long Điền A Chợ Mới An Giang 12 30,40C / 68,5% 3 Bình Phước Xuân Chợ Mới An Giang 10 31,10C / 62,5% 4 Mỹ Hiệp Chợ Mới An Giang 12 26,40C / 62,6% 5 Long Tuyền Bình Thủy Cần Thơ 16 30,60C / 70% 6 Long Hòa Bình Thủy Cần Thơ 12 25,80C / 75% 7 Bình Thủy Bình Thủy Cần Thơ 18 31,30C / 69,7% 8 An Thới Bình Thủy Cần Thơ 12 29,90C / 61% 9 Mỹ Hòa Bình Minh Vĩnh Long 14 32,20C / 70% 10 Đông Bình Bình Minh Vĩnh Long 12 28,50C / 66% 11 Đông Thạnh Bình Minh Vĩnh Long 12 30,40C / 69,8% 12 Đông Thành Bình Minh Vĩnh Long 12 27,60C / 71% 13 Tân Phú Long Mỹ Hậu Giang 12 29,9 0C / 70,1% 14 Vĩnh Thuận Đông Long Mỹ Hậu Giang 12 30,80C / 69% 15 Thuận Hòa Long Mỹ Hậu Giang 12 25,90C / 74,8% 16 Thuân Hưng Long Mỹ Hậu Giang 12 32,10C / 69,8% 17 Lai Hòa Vĩnh Châu Sóc Trăng 12 27,60C / 70,3% 18 Vĩnh Tân Vĩnh Châu Sóc Trăng 9 30,40C / 69,6% 19 Vĩnh Phước Vĩnh Châu Sóc Trăng 12 29,60C / 71,2% 20 Vĩnh Hiệp Vĩnh Châu Sóc Trăng 8 30,50C / 74% 21 Phú Kiết Chợ Gạo Tiền Giang 12 31,60C / 74,4% 22 Hòa Tịnh Chợ Gạo Tiền Giang 12 30,00C / 70,1% 23 Mỹ Tịnh An Chợ Gạo Tiền Giang 12 29,60C / 69,7% 24 Trung Hòa Chợ Gạo Tiền Giang 9 29,70C / 70,8% Tổng cộng 288 18 Các dòng nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana dễ tìm, thường xuyên hiện diện với tỷ lệ trên sâu chết cao hơn so với các dòng nấm Paecilomyces spp. Ngoài ra, nấm Paecilomyces spp. tồn tại ngoài tự nhiên đôi khi không có màu đặc trưng (tơ nấm màu tím) như giai đoạn đầu ký sinh trên sâu có màu trắng, sau đó chuyển dần sang hồng nhạt, giai đoạn sau nấm thoái hóa sẽ có màu nâu đen nhạt. II. Phân lập, định danh và tồn trữ các mẫu nấm thu được trong môi trường PDA (Potato Destrose Agar) Các dòng nấm sau khi thu thập được ngoài đồng (trữ trong các tuýp đã chuẩn bị sẵn, dán nhãn và ghi nơi thu thập, thời gian thu thập) được mang về phòng thí nghiệm để phân lập (hình 5) trong các đĩa petri với môi trường nấm chuẩn là PDA (hình 4 và hình 5). Kết quả phân lập được 51 dòng nấm (Bảng 5), cụ thể như sau: - Nấm Metarhizium anisopliae (20 dòng): 5 dòng tại An Giang (M1-AG, M2- AG, M3-AG, M4-AG, M5-AG), 4 dòng tại Cần Thơ (M1-CT, M2-CT, M3-CT, M4-CT), 3 dòng tại Vĩnh Long (M1-VL, M2-VL, M3-VL), 3 dòng tại Hậu Giang (M1-HG, M2- HG, M3-HG), 3 dòng tại Sóc Trăng (M1-ST, M2-ST, M3-ST) và 2 dòng tại Tiền Giang (M1-TG, M2-TG). - Nấm Beauveria bassiana (17 dòng): 4 dòng tại An Giang (B1-AG, B2-AG, B3-AG, B4-AG), 3 dòng tại Cần Thơ (B1-CT, B2-CT, B3-CT), 3 dòng tại Vĩnh L._.Paecilomyces spp. từ 69,2% (P3-TG) - 69,5% (P2-AG). Môi trường SDAY3 cho mật số bào tử (bào tử.ml-1) cao với nhiều dòng nấm nhất, được chọn để nhân sinh khối trong việc quy trình xuất chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh sau này. Chín ngày sau khi lắc là thời điểm tối ưu đối với nấm Metarhizium anisoplia; trong khi đó, 6 đến 9 ngày, mật số bào tử được tạo ra cao nhất đối với nấm Beauveria bassiana và nấm Paecilomyces spp. đạt mật số bào tử cao nhất vào 6 ngày. II. Kiến nghị Thử hiệu lực của các ba loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Paecilomyces spp. trên một số đối tượng sâu hại khác trong phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng. Cần nghiên cứu để xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh có hiệu quả cao và ổn định, phục vụ cho sản xuất và giảm ô nhiễm môi trường. Tiếp tục nghiên cứu, định danh đến loài đối với nấm Paecilomyces spp. vì tiềm năng phòng trừ sâu hại của nấm ký sinh côn trùng này bước đầu có hiệu quả tốt. I PHỤ CHƯƠNG Phụ chương 1. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M2-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 2 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 17.349 17.349 5.783 0.0000 Sai số 16 0.356 0.022 Tổng cộng 17.705 CV = 9.12% Phụ chương 2. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M2-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 4 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 37.882 12.627 106.560 0.0000 Sai số 16 1.896 0.119 Tổng cộng 19 39.778 CV = 12.34% Phụ chương 3. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M2-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 6 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 44.670 14.890 283.616 0.0000 Sai số 16 0.840 0.053 Tổng cộng 19 45.510 CV = 6.04% Phụ chương 4. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng Metarhizium anisopliae M2-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 9 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 129.505 43.168 388.031 0.0000 Sai số 16 1.780 0.111 Tổng cộng 19 131.285 CV = 4.69% Phụ chương 5. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M2-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 12 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 39.254 13.085 99.882 0.0000 Sai số 16 2.096 0.131 Tổng cộng 19 41.350 CV = 8.93% II Phụ chương 6. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M2-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 14 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 15.788 5.263 32.840 0.0000 Sai số 16 2.564 0.160 Tổng cộng 19 18.352 CV = 11.84% Phụ chương 7. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M5 - AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 2 NSKL M5 Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 5.509 1.836 31.939 0.0000 Sai số 16 0.920 0.058 Tổng cộng 19 6.429 CV = 14.49% Phụ chương 8. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M5 - AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 4 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 7.218 2.406 16.855 0.0000 Sai số 16 2.284 0.143 Tổng cộng 19 9.502 CV = 18.25% Phụ chương 9. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M5 - AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 6 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 10.797 3.599 30.501 0.0000 Sai số 16 1.888 0.118 Tổng cộng 19 12.685 CV = 12.20% Phụ chương 10. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M5 - AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 9 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 14.790 4.930 11.843 0.0000 Sai số 16 6.660 0.416 Tổng cộng 19 21.449 CV= 14.68% III Phụ chương 11. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M5 - AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 12 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 7.110 2.370 15.825 0.0000 Sai số 16 2.396 0.150 Tổng cộng 19 9.505 CV= 10.79% Phụ chương 12. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M5 - AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 14 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 11.969 3.990 31.919 0.0000 Sai số 16 2.000 0.125 Tổng cộng 19 13.969 CV= 15.08% Phụ chương 13. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M1 – CT trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 2 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 0.620 0.207 3.347 0.045 Sai số 16 0.988 0.062 Tổng cộng 19 1.608 CV= 18.27% Phụ chương 14. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M1 – CT trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 4 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 1.738 0.579 8.103 0.0017 Sai số 16 1.144 0.072 Tổng cộng 19 2.882 CV= 15.11% Phụ chương 15. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M1 – CT trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 6 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 7.412 2.471 17.277 0.0000 Sai số 16 2.288 0.143 Tổng cộng 19 9.700 CV= 14.01% IV Phụ chương 16. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M1 – CT trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 9 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 21.238 7.079 55.743 0.0000 Sai số 16 2.032 0.127 Tổng cộng 19 23.270 CV= 8.80% Phụ chương 17. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M1 – CT trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 12 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 2.606 0.869 5.979 0.0062 Sai số 16 2.324 0.145 Tổng cộng 19 4.930 CV= 11.89% Phụ chương 18. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M1 – CT trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 14 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 1.042 0.347 1.599 0.2289 Sai số 16 3.476 0.217 Tổng cộng 19 4.518 CV= 16.71% Phụ chương 19. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M3 - VL trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 2 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 1.882 0.627 6.047 0.0059 Sai số 16 1.660 0.104 Tổng cộng 19 3.542 CV= 17.22% Phụ chương 20. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M3 - VL trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 4 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 10.229 3.410 44.866 0.0000 Sai số 16 1.216 0.076 Tổng cộng 19 11.445 CV= 9.72% V Phụ chương 21. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M3 - VL trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 6 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 16.294 5.431 38.316 0.0000 Sai số 16 2.268 0.142 Tổng cộng 19 18.562 CV= 11.66% Phụ chương 22. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M3 - VL trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 9 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 35.962 11.987 88.795 0.0000 Sai số 16 2.160 0.135 Tổng cộng 19 38.122 CV= 7.61% Phụ chương 23. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M3 - VL trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 12 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 3.538 1.179 19.574 0.0000 Sai số 16 0.964 0.060 Tổng cộng 19 4.502 CV= 6.95% Phụ chương 24. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M3 - VL trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 14 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 9.394 3.131 36.096 0.0000 Sai số 16 1.388 0.087 Tổng cộng 19 10.782 CV= 9.92% Phụ chương 25. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M1 - ST trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 2 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 0.620 0.207 3.347 0.0456 Sai số 16 0.988 0.062 Tổng cộng 19 1.608 CV = 18.27% VI Phụ chương 26. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M1 - ST trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 4 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 1.738 0.579 8.103 0.001 Sai số 16 1.144 0.072 Tổng cộng 19 2.882 CV= 15.11% Phụ chương 27. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M1 - ST trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 6 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 7.412 2.471 17.277 0.0000 Sai số 16 2.288 0.143 Tổng cộng 19 9.700 CV= 14.01% Phụ chương 28. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M1 - ST trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 9 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 21.238 7.079 55.743 0.0000 Sai số 16 2.032 0.127 Tổng cộng 19 23.270 CV= 8.80% Phụ chương 29. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M1 - ST trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 12 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 2.606 0.869 5.979 0.0062 Sai số 16 2.324 0.145 Tổng cộng 19 4.930 CV = 11.89% Phụ chương 30. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Metarhizium anisopliae M1 - ST trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 14 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 1.042 0.347 1.599 0.2289 Sai số 16 3.476 0.217 Tổng cộng 19 4.518 CV= 16.71% VII Phụ chương 31. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B2-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 2 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 5.225 1.742 24.025 0.0000 Sai số 16 1.160 0.073 Tổng cộng 19 6.385 CV = 26.53% Phụ chương 32. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B2-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 4 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 21.768 7.256 110.357 0.0000 Sai số 16 1.052 0.066 Tổng cộng 19 22.820 CV = 12.21% Phụ chương 33. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B2-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 6 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 109.482 36.494 22.809 0.0000 Sai số 16 25.600 1.600 Tổng cộng 19 135.082 CV = 7.99% Phụ chương 34. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B2-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 9 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 34.896 11.632 16.731 0.0000 Sai số 16 11.124 0.695 Tổng cộng 19 46.020 CV = 15.73% Phụ chương 35. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B2-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 12 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 4.746 1.582 8.217 0.0015 Sai số 16 3.080 0.192 Tổng cộng 19 7.826 CV = 11.81% VIII Phụ chương 36. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B2-AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 14 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 4.952 1.651 12.771 0.0002 Sai số 16 2.068 0.129 Tổng cộng 19 7.020 CV = 12.40% Phụ chương 37. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B2-TG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 2 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 3.457 1.152 67.794 0.0000 Sai số 16 0.272 0.017 Tổng cộng 19 3.729 CV = 23.49% Phụ chương 38. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B2-TG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 4 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 1.510 0.503 11.062 0.0004 Sai số 16 0.728 0.046 Tổng cộng 19 2.238 CV = 19.22% Phụ chương 39. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B2-TG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 6 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 12.710 4.237 41.333 0.0000 Sai số 16 1.640 0.103 Tổng cộng 19 14.350 CV = 13.62% Phụ chương 40. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B2-TG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 9 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 19.449 6.483 29.402 0.0000 Sai số 16 3.528 0.220 Tổng cộng 19 22.977 CV = 12.61% IX Phụ chương 41. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B2-TG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 12 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 6.874 2.291 24.570 0.0000 Sai số 16 1.492 0.093 Tổng cộng 19 8.366 CV = 12.29% Phụ chương 42. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B2-TG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 14 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 6.077 2.026 18.845 0.0000 Sai số 16 1.720 0.108 Tổng cộng 19 7.797 CV = 14.41% Phụ chương 43. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B1-VL trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 2 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 0.217 0.072 5.577 0.0082 Sai số 16 0.208 0.013 Tổng cộng 19 0.426 CV= 24.52% Phụ chương 44. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B1-VL trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 4 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 12.708 4.236 74.973 0.0000 Sai số 16 0.904 0.057 Tổng cộng 19 13.612 CV = 13.35% Phụ chương 45. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B1-VL trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 6 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 18.028 6.009 105.427 0.0000 Sai số 16 0.912 0.057 Tổng cộng 19 18.940 CV = 11.94% X Phụ chương 46. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B1-VL trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 9 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 30.758 10.253 42.497 0.0000 Sai số 16 3.860 0.241 Tổng cộng 19 34.618 CV = 16.24% Phụ chương 47. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B1-VL trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 12 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 40.918 13.639 75.251 0.0000 Sai số 16 2.900 0.181 Tổng cộng 19 43.818 CV = 16.31% Phụ chương 48. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Beauveria bassiana B1-VL trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 14 Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 30.973 10.324 58.745 0.0000 Sai số 16 2.812 0.176 Tổng cộng 19 33.785 CV = 19.36% Phụ chương 49. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp. Pae2 - AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 2 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 14.921 4.974 55.729 0.0000 Sai số 16 1.428 0.089 Tổng cộng 19 16.349 CV = 14.90% Phụ chương 50. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp. Pae2 - AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 4 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 57.060 19.020 206.739 0.0000 Sai số 16 1.472 0.092 Tổng cộng 19 58.532 CV = 8.62% XI Phụ chương 51. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp. Pae2 - AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 6 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 101.682 33.894 184.708 0.0000 Sai số 16 2.936 0.184 Tổng cộng 19 104.618 CV = 6.90% Phụ chương 52. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp. Pae2 - AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 9 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 29.468 9.823 45.528 0.0000 Sai số 16 3.452 0.216 Tổng cộng 19 32.920 CV = 12.22% Phụ chương 53. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp. Pae2 - AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 12 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 49.590 16.530 104.125 0.0000 Sai số 16 2.540 0.159 Tổng cộng 19 52.130 CV = 11.37% Phụ chương 54. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp. Pae2 - AG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 14 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 9.910 3.303 33.199 0.0000 Sai số 16 1.592 0.099 Tổng cộng 19 11.502 CV = 11.39% Phụ chương 55. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp. Pae3 - TG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 2 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 39.573 13.191 93.554 0.0000 Sai số 16 2.256 0.141 Tổng cộng 19 41.829 CV = 15.05% XII Phụ chương 56. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp. Pae3 - TG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 4 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 51.838 17.279 146.434 0.0000 Sai số 16 1.888 0.118 Tổng cộng 19 53.726 CV = 11.13% Phụ chương 57. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp. Pae3 - TG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 6 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 80.874 26.958 102.502 0.0000 Sai số 16 4.208 0.263 Tổng cộng 19 85.082 CV = 12.73% Phụ chương 58. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp. Pae3 - TG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 9 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 45.553 15.184 62.552 0.0000 Sai số 16 3.884 0.243 Tổng cộng 19 49.437 CV = 18.08% Phụ chương 59. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp. Pae3 - TG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 12 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 11.714 3.905 37.545 0.0000 Sai số 16 1.664 0.104 Tổng cộng 19 13.378 CV = 21.36% Phụ chương 60. Phân tích ANOVA về khả năng sinh bào tử của dòng nấm Paecilomyces spp. Pae3 - TG trên 4 loại môi trường dinh dưỡng vào thời điểm 14 NSKL Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F-tính Xác xuất Nghiệm thức 3 7.974 2.658 31.177 0.0000 Sai số 16 1.364 0.085 Tổng cộng 19 9.338 CV = 24.85% 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ainsworth, G. C. 1996. “The Fungi: An Advanced Treatise”. The Fungal Cell 1 (3): 153-170. Alaoui Abdelaziz và Elmeziane Abdellatif. 2008. Occurrence and distribution of Beauveria and Metarhizium in Moroccan soil. 41st Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology and 9th International Conference on Bacillus thuringiensis [On-line]. University of Warwick, Coventry, United Kingdom. Available from: www.ent.iastate.edu/sip/2008/.../Program%20FINAL%20short.pdf [Accessed 15.7.2008] Alexandr Jegorov, Petr Sedmera, Vladimr Havlek and Vladimr Mat'ha. 1998. Destruxin Ed1 a cyclopeptide from the fungus Metarhizium anisopliae [On-line]. Phytochemistry Volume 49, Issue 6, 20 November 1998, Pages 1815-1817. Available from: 623&_user=10&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view =c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=ba7c5 3739ff019a8c2d2092e5299f450 [Accessed 15.7.2008] Amiri, B. L. Ibrahim and T. M. Butt. 1999. “Antifeedent properties of destruxins and their potential use with the entomogenous Metarhizium anisopliae for improved control of crucifer pests”. Biocontrol Science and Technology 9: 487-498. Arora, K. P. D. Bridge, Deepak Bhatnagar. 2004. “Fungal biotechnology in agricultural,food, and environmental applications” . Annals of Microbiology 54 (2): 245-246. Bidochka, M. J., G. G. Khachatourians. 2001. “The implication of metabolic acids produced by Beauveria bassiana in pathogenesis of the migratory grasshopper, Melanoplus sanguinipes”. Journal of Invertebrate Pathology 58 (1): 106-117. Bocias, H. I, A. R. Bandan. 1991. “The Effects of Entomopathogenic Fungus Metarhizium anisopliae on Cellular Defence System of Metarhizium anisopliae on Cellular Defence System of Metarhizium anisopliae”. J. Agric. Sci. Technol. (2008) 10: 135-146. Burges, H. D. 1998. “Formualation of mycoinsecticides”. Formulation of Microbial Biopesticides 124 (2000):143-156. Butt, T. M, L. Ibrahim, B.V. Ball and S. J. Clark. 1998. “Variation in gene expression patterns as the insect pathogen Metarhizium anisopliae adapts to different host cuticles or nutrient deprivation in vitro”. Microbiology 151 (2005): 361-371. Butt, T. M. and L. Copping. 2000. “Fungal biological control agents”. Pesticides Outlook 11 (2000): 186-191. Cerenius, L., P. O. Thornqvist, A. Vey. M. W, Johansson and K. Soderhall. 1990. “The effects of the fungal toxin destruxin E on isolated grayfish haemocytes”. Journal of Insect Physiology 6 (1992): 785-789. Chase, A. R, L. S. Orborne and V. M, Ferguson. 1996. “Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium”. Brazilian Journal of Microbiology 69: 285-292. Clark, G. H; W. De La Rosa, F. L. Lopez, P. Liedo. 2002. “Beauveria bassiana as a Pathogen of the Mexican Fruit Fly (Diptera: Tephritidae) Under Laboratory Conditions”. Journal of Economic Entomology 95(1):36-43. Crop Protection Compennium. 2002. CD of CAB International. 36 Dombrink Kurtzman, M. A. 2003. “Fumonisin and Beauvericin Induce Apoptosis in Turkey Peripheral Blood Lymphocytes”. Mycopathologia 156 (4): 357-364. Dilip, K. Arora, P. D. Bridge, Deepak Bhatnagar. 2004. “Nematophagous fungi in the biological control of nematodes”. Handbook of Applied Mycology, Humans, Animals and Insects 2 (2): 707-733. Dumas, C., K. Matha, V. Quiot. J. M and A. Vey (1996), “Effect of destruxins, cyclic depsipeptic mycotoxins”, On: Calcium balance and phosphorylation of intracellular proreins in lepidopteran cell lines, Comparative Biochemistry and Physiology 114c, pp. 213-219. Edelstein, J. D., R. E. Lecuona and E. V. Trumper. 2004. “Selection of culture media and in vitro assessment of temperature-dependent development Paecilomyces spp. Neotropical Entomol” 33(6): 737-742. Fang, W, Bidochka M. J. 2006. “Expression of genes involved in germination, conidiogenesis and pathogenesis in Metarhizium anisopliae using quantitative real-time RT-PCR. Mycol Res 110( 10): 65-71. Ferron, L. K. 1978. “Biological control of insects pests by entomogenous fungi”. Annual Review of Entomology 23 (2003): 409-442. Gottwald, G. J; Tedders, H. L. 1982. “The potential for enhanced fungicide resistance in Beauveria bassiana through strain discovery and artificial selection”. Journal of Invertebrate Pathology 81 (2): 86-93. Hamill, R. L. 1969. “Diversity in Beauvericin and Enniatins H, I, and MK1688 by Fusarium oxysporum isolated from potato”. International Journal of Food Microbiology 122 (3): 296-301. Harris, J. L. 1986. Modified method for fungal slide culture. Journal Clinical Microbiology. 24(3): 460–461. Hill, K. L. 1999. “Effects of virulence, sporulation, and temperature on Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana laboratory transmission in Coptotermes formosanus”. Liang, K. 1981. “Effect of several stress factors on the susceptibility of the predatory insect, Chrysoperla carnea (Neuroptera: Chrysopidae), to the fungal pathogen Beauveria bassiana”. J. Invertebr. Pathol 54: 79–84. James, R. Fuxa and Yoshinori Tanada. 1993. Epizootiology of insect diseases [online book]. Wiley-Interscience. Available from: q=Yoshinori+Tanada+Beauveria+bassiana&sourcebl&ots=XveYEiVgKl&sig=u vt8kdDeTA7EQJ24M8p98WAe2iw&hl=vi&ei=Lnt0StyGBY-kQWu [Accessed 15.7.2008] Jing Feng, Xingyong Yang, Yongjun Zhang, and Yan Pei. 2004. “Cloning of Beauveria bassiana Chitinase Gene Bbchit1 and Its Application To Improve Fungal Strain Virulence”. Applied And Environmental Microbiology, 71 (1): 363-370. Leger St., R. J., L. Joshi, Bidochka M. J., and D. W Roberts. 1996. “Characterization of chitinases from Metarhizium anisopliae, M. falvoviride and Beauveria bassiana, and ultrastructural localization of chitinase production during invasion of insect cuticle”. Apply Environment Microbiol. 62 (2): 907-912. 37 Macleod, H. L. 1954. “Beauveria bassiana as a pathogen of scolytus multistriatus. Annals of the Entomological Society of America” 52 (1): 109-111. Nevalainen Helena. 1977. “Testing the nematophagous biological control strain Paecilomyces lilacinus 251 for Paecilotoxin production”. FEMS microbiology letters 227 (2007): 107-111. Nguyễn Quí Hùng, Nguyễn Văn Uyên, Lã Phạm Lân, Trần Thanh Tùng, Mai Nguyễn Trân Lan Phương, Nguyễn Mạnh Chinh, Ngô Quang Vinh, Nguyễn Thiện Huy, Nguyễn Thị Hòa, Trần Ngọc Hoài, Nguyễn Thị Hiêu. 1999. Nghiên cứu xây dựng quy trình phòng trừ tổng hợp sâu bệnh hại trên một số loại rau trồng ở Thành phố Hồ Chí Minh. Viện Khoa học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam. Trang 1-37. Nguyễn Thị Ngọc Tuyền. 2003. Nghiên cứu công thức thức ăn nhân tạo cho sâu ăn tạp Spodoptera litura. Luận văn tốt nghiệp đại học. Khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng. Đại học Cần Thơ. Phạm Thị Thùy. 2004. Công nghệ sinh học trong Bảo vệ thực vật. Hà Nội: Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. Phạm Văn Kim, 2000. Giáo trình vi sinh học đại cương. KNN - ĐHCT. Stathers, T. E., D. Moore, and C. Prior. 2004. “The effect of different temperatures on the viability of Metarhizium flavoviride conidia stored in vegetable and mineral oils”. Journal of Invertebrate Pathology 62:111-115. Suziki, K. Kawakami, Alexandr Jegorov, Petr Sedmera, Vladimr Havl and Vladimr Mat'ha. 1998. “Destruxin Ed1 a cyclopeptide from the fungus Metarhizium anisoplia”. Phytochemistry 49 (6): 1815-1817. Tamura, K., Chengshu Wang, Zhibing Duan, J. Raymond, and St. Leger. 2008. “MOS1 Osmosensor of Metarhizium anisopliae Is Required for Adaptation to Insect Host Hemolymph”. Eukaryotic Cell 7 (2): 302-309. Trần Thị Ba. 1999. Sử dụng màng phủ nông nghiệp trong canh tác rau màu ở ĐBSCL. Kỷ yếu hội nghị Khoa học Công nghệ và Môi trường khu vực Đồng bằng sông Cửu Long lần thứ 16 tại Cần Thơ. Ngày17-18/9/1999. Trần Thị Thanh, 2000. Công nghệ vi sinh. Hà Nội: Nhà xuất bản Giáo dục. Trần Văn Hai. 2000. Giáo trình hóa Bảo vệ thực vật. Khoa Nông Nghiệp, Đại học Cần Thơ. Trần Văn Mão, 2002. Sử dụng côn trùng và vi sinh vật có ích. Tập II. Hà Nội: Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Tsai, K. et al,. 2006. “Mutants and isolates of Metarhizium anisopliae are diverse in their relationships between conidial pigmentation and stress tolerance”. Journal of Invertebrate Pathology 93 (3): 170-182. Vimala Devi, P.S., 1994. “Conidia production of the entomopathogenic fungus, Paecilomyces and its evalution of the effect of the Spodoptera litura (Fab.)” in Ricinus communis J, Invert 63: 144-145. 31 Hình 2. Thu thập nấm Metarhizium anisopliae Hình 3. Thu thập nấm Beauveria bassiana Hình 4. Thu Thập nấm Paecilomyces spp. 32 a: Metarhizium anisopliae b: Beauveria bassiana c: Paecilomyces spp. Hình 5. Màu sắc tơ nấm trong môi trường nhân tạo PDA a. Metarhizium anisopliae b. Beauveria bassiana c. Paecilomyces spp. Hình 7. Sâu ăn tạp bị nhiễm nấm trong phòng thí nghiệm Hình 8. Nấm sau khi lắc trong các môi trường dinh dưỡng (môi trưởng lỏng) a. Thực hiện tiêu bản trên lame b. Đếm mật số bào tử trên kính hiển vi Hình 6. Thực hiện tiêu bản, đếm mật số bào tử nấm trong phòng thí nghiệm a a b b c c a b 6 ._.