Phân lập, tuyển chọn & nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của Một số chủng vi sinh vật..

hực vật khác. Bên cạnh các nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường như cháy rừng, khai thác rừng bừa bãi, chảy dầu, các nhà máy điện hạt nhân, dò rỉ phóng xạ. ... thì một nguyên nhân hết sức to lớn trong việc gây ô nhiễm môi trường chính là rác thải mà trong đó rác thải hữu cơ chiếm thành phần chủ yếu. Rác thải hữu cơ có khả năng phân huỷ, chuyển hoá thành các dạng khác nhau. Sau một thời gian chuyển đổi, các chất hữu cơ từ các vùng sản xuất nông nghiệp tại các vùng nông thôn lại quay về làm ô nhiễm không chỉ thành phố mà còn làm ô nhiễm các vùng nông thôn lân cận thành phố. Chính vì nó có khả năng phát tán nhanh chóng, gây ô nhiễm trong diện rộng nên nếu không được thu gom và xử lý triệt để thì rác thải hữu cơ sẽ gây hậu quả rất nghiêm trọng. Trong lượng rác thải hữu cơ thu gom được, các chất ligno-xenluloza lại chiếm một lượng hết sức lớn. Đối với động vật và con người, các chất ligno-xenluloza này thường không có mấy giá trị dinh dưỡng. Trong các phế phẩm nông nghiệp, phần không được sử dụng chiếm đến 50% tổng sinh khối. Khối lượng này được thu gom và thải vào thiên nhiên, vừa gây lãng phí lại vừa gây ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, để có thể giải quyết được vấn đề ô nhiễm do rác hữu cơ gây nên, chúng ta vấp phải một vấn đề phức tạp là làm cách nào để có thể tăng khả năng thu gom và xử lý rác thải nhanh chóng nhằm đẩy nhanh vòng tuần hoàn của rác, không để tồn đọng và gây ô nhiễm môi trường trong khi lượng rác thải của chúng ta ngày càng tăng lên mà các cơ sở xử lý lại có hạn. Hiện nay có rất nhiều phương pháp xử lý rác như phương pháp đốt, phương pháp chôn lấp thành những bãi chứa.... Tuy nhiên, các phương pháp này đều không mang lại những hiệu quả cao do lãng phí diện tích chôn lấp, thời gian xử lý dài gây ô nhiễm thứ cấp.... Trong khi đó, phương pháp xử lý rác bằng công nghệ vi sinh vật tỏ ra có nhiều ưu điểm nhất cả về hiệu quả kinh tế lẫn kỹ thuật, tạo ra sản phẩm phân bón hữu cơ dùng cho sản xuất nông nghiệp. Mặc dù vậy, việc phân huỷ rác dựa trên các vi sinh vật tự nhiên có sẵn trong đống rác ủ còn gặp nhiều hạn chế như thời gian phân huỷ quá lâu, quá trình phân huỷ chưa triệt để.... Do đó, chúng ta cần tuyển chọn những chủng vi sinh vật thích hợp bổ sung vào bên cạnh những vi sinh vật có sẵn để có thể giúp cho quá trình xử lý đạt kết quả tốt hơn. Với mong muốn có thể tham gia vào quá trình phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân huỷ rác thải cao phù hợp với điều kiện Việt Nam dù bằng phần đóng góp hết sức nhỏ bé của mình, tôi đã thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của một số chủng vi sinh vật nhằm ứng dụng xử lý phế thải ligno-xenluloza” II. Tổng quan 2.1. Sơ lược tình hình và thành phần của rác thải sinh hoạt ở Việt Nam 2.1.1. Sơ lược tình hình rác thải ở Việt Nam Rác thải từ sinh hoạt của con người, rác thải nông nghiệp và rác thải công nghiệp chiếm thành phần chủ yếu trong khối lượng rác thải thu gom được trên thế giới . ở Việt Nam, tuy sản lượng công nghiệp ít và các đô thị chưa phải là lớn cho nên rác thải công nghiệp cũng như rác thải sinh hoạt ở những nơi tập trung dân cư còn ít so với các nước phát triển, nhưng do sự quản lý về môi trường còn nhiều thiếu sót, ý thức giữ gìn môi trường của mỗi người dân chưa cao nên vấn đề môi trường nói chung và vấn đề rác thải nói riêng là vấn đề hết sức nan giải ở Việt Nam, đặc biệt ở các thành phố lớn. Hàng ngày, các thành phố lớn ở Việt Nam thải ra khoảng 9100 m3 rác nhưng chỉ thu gom được khoảng 40 – 50%. Chỉ tính ba thành phố lớn ở Việt Nam, lượng rác thải hàng ngày thu gom được là rất lớn. Mỗi ngày Hải Phòng thải ra 270 tấn rác, Hà Nội khoảng 1000 tấn, Thành phố Hồ Chí Minh khoảng 4000 tấn. Đó chỉ là số liệu trên giấy tờ mà các công ty vệ sinh đô thị thu gom được. Còn số lượng rác thực tế mà người dân thải bỏ thì lớn gấp nhiều lần như thế. [15,16] Quá trình đô thị hoá nhanh chóng trong khi hệ thống cơ sở hạ tầng chưa phát triển tương ứng sẽ làm tăng thêm các khó khăn hiện nay về tình hình ô nhiễm môi trường. Cùng với quá trình đô thị hoá thì mức sống của người dân cũng được nâng lên và kéo theo đó là lượng rác thải ngày càng lớn.Lượng rác trung bình ở thành phố Hồ Chí Minh tăng khoảng 20% hằng năm trong khi lượng rác ở các thành phố lớn trên thế giới chỉ tăng trung bình dưới 7%.Tuy nhiên lượng rác xử lý vẫn chưa được bao nhiêu so với các nước trên thế giới. Mặc dù nước ta đã quan tâm đến vấn đề này song còn nhiều hạn chế. Rác thải công nghiệp là những thành phần không thể tham gia vào quá trình tạo nên sản phẩm hoặc bán thành phẩm phải loại bỏ khỏi các dây chuyền sản xuất. Rác thải sinh hoạt là những thành phần được loại bỏ từ các gia đình khu công cộng hay các chợ, siêu thị... Trong tất cả các loại rác kể trên thì rác thải sinh hoạt là loại chất thải phức tạp hơn cả. Trước hết thành phần của rác thải sinh hoạt hết sức đa dạng, trong thành phần của chúng các hợp chất hữu cơ mà trước hết là xenluloza và lignin chiếm tỷ lệ cao nhất, thông thường là 40 – 50%, có nhiều trường hợp chiếm đến 70 – 80%.... Bên cạnh đó do ý thức của đại bộ phận dân chúng còn yếu, sự quản lý và các biện pháp xử lý vẫn chưa đạt được hiệu quả như mong muốn, đòi hỏi phải phù hợp với mức sống và tập tục của cộng đồng. Ngoài ra mong muốn tận dụng rác thải sinh hoạt để tạo ra các sản phẩm có ích cho xã hội cũng là một yếu tố quan trọng khiến cho việc xử lý rác thải sinh hoạt còn gặp nhiều vấn đề nan giải [2, 12, 14]. Là một nước nông nghiệp nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên rác thải sinh hoạt của Việt Nam có những đặc điểm riêng về thành phần và tính chất. Độ ẩm trong rác thay đổi theo mùa trong năm - độ ẩm trung bình vào mùa khô từ 40 – 45% và vào mùa mưa từ 50 – 80%, lượng rác mỗi ngày tăng lên một cách nhanh chóng. Do đó việc nghiên cứu, tuyển chọn ra những chủng vi sinh vật có những khả năng phân giải xenluloza mạnh, có thể áp dụng vào công nghệ xử lý rác bằng vi sinh vật ở Việt Nam là rất cần thiết và cần được quan tâm hơn. 2.1.2. Thành phần của các rác thải sinh hoạt ở Việt Nam Khác với rác thải công nghiệp, rác thải sinh hoạt là một tập hợp không đồng nhất. Sự không đồng nhất thể hiện ngay ở sự đầu vào của nguyên liệu ban đầu dùng cho sinh hoạt và thương mại. Sự không đồng nhất này tạo ra một số đặc tính rất khác biệt trong thành phần của rác thải sinh hoạt. Thành phần cơ học Đặc điểm rõ thấy nhất ở rác đô thị của Việt Nam là thành phần các chất hữu cơ có trong đó. Số lượng này thường chiếm rất cao, khoảng 55 – 65%. Trong thành phần rác thải đô thị, các cấu tử phi hữu cơ (kim loại, rác xây dựng...) chỉ chiếm khoảng 11 – 15%, phần còn lại là các cấu tử khác.[5] Bảng 1: Thành phần rác sinh hoạt ở Hải Phòng, Hà Nội, TP Hồ Chí Minh Thành phần rác (%) Hải Phòng Hà Nội TP Hồ Chí Minh Lá cây, vỏ hoaquả, xác thực vật 50,70 50,72 62,64 Giấy 2,28 2,72 0,59 Vải vụn, củi gỗ 2,27 6,27 4,25 Nhựa, cao su, da 2,02 0,71 0,46 Vỏ ốc, xương 3,68 1,06 0,50 Thuỷ tinh 0,72 0,31 0,20 Rác xây dựng 8,45 7,43 16,04 Kim loại 0,14 1,02 0,27 Tạp chất khó phân giải 23,9 30,21 15,27 Chúng ta nhận thấy rằng thành phần rác thải hữu cơ chiếm một tỷ lệ lớn trong rác thải sinh hoạt của Việt Nam. So với các nước phát triển trên thế giới thì tỷ lệ rác hữu cơ của nước ta khá cao.[5] Bảng 2. Thành phần rác sinh hoạt của một số nước phát triển trên thế giới (1990) Thành phần (%) Nhật Pháp Mỹ Giấy 12,1 30,0 30-40 Thực phẩm 8,1 34,0 9,4 Vải 5,1 2,0 2,0 Gỗ, cỏ 1,9 4,0 0,5 Chất dẻo 19,8 4,0 7,0 Cao su 1,4 10,0 0,5 Kim loại 20,0 7,0 6,5 Thuỷ tinh 22,7 13,0 7,9 Những thứ khác 3,2 13,0 3,2 2.1.2.2. Thành phần hoá học Trong các cấu tử hữu cơ của rác sinh hoạt, thành phần hoá học của chúng chủ yếu là: C, H, O, N, S và các chất tro.[14] Thành phần này rất quan trọng trong việc nghiên cứu xử lý, tái sinh chúng cũng như trong việc đánh giá các tác động đến môi trường nếu không được xử lý.[5] Ta nhận thấy rằng tuỳ thuộc vào các chất khác nhau mà thành phần các cấu tử hữu cơ có trong các chất dao động thay đổi trong khoảng rộng. Kết quả này được minh hoạ qua bảng 3 dưới đây. Bảng 3: Thành phần hoá học của các cấu tử hữu cơ trong rác thải sinh hoạt. Các chất Thành phần (%) C H O N S Tro Thực phẩm 48,0 6,4 37,6 2,6 0,4 5,0 Giấy 43,5 6,0 44,0 0,3 0.2 6,0 Caton 44,0 5,9 44,6 0,3 0,2 5,0 Vải 55,0 6,6 31,2 1,6 0,15 - Cao su 78,0 10,0 - 2,0 - 10,0 Nhìn qua bảng số liệu chúng ta nhận thấy rằng thành phần của rác thải hữu cơ hết sức phức tạp. Nếu rác thải đô thị phân huỷ tự do trong môi trường tự nhiên thì môi trường, môi sinh và đặc biệt là các nguồn nước sẽ bị ô nhiễm một cách ghê gớm. Có rất nhiều biện pháp để xử lý lượng rác khổng lồ được tạo ra mỗi ngày ví dụ như thiêu đốt, chôn lấp... nhưng bằng cách này hay cách khác, chính những phương pháp xử lý này lại có thể gây ra ô nhiễm cho môi trường trong tương lai. Chính vì vậy, phương pháp xử lý rác bằng vi sinh vật là sự lựa chọn tối ưu nhất. Nếu chúng ta kiểm soát được quá trình xử lý rác thải đô thị tạo ra nguồn phân hữu cơ thì đây chính là nguồn dinh dưỡng lớn, vừa tạo ra được sự cân bằng về sinh thái, lại vừa tránh được nguy cơ gây ô nhiễm môi trường. 2.2. Các phương pháp xử lý rác bằng vi sinh vật 2.2.1. Bản chất của phương pháp Bản chất của quá trình xử lý rác nhờ vi sinh vật chính là quá trình phân huỷ rác của các vi sinh vật có sẵn trong rác cũng như các vi sinh vật được bổ sung vào. Nhờ có các vi sinh vật này mà rác được phân huỷ thành các thành phần nhỏ hơn, tạo ra sinh khối các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật và các loại khí như CO2, CH4...[4] Các quá trình chuyển hoá này có thể xảy ra trong điều kiện yếm khí hoặc hiếu khí. - Quá trình ủ hiếu khí là quá trình phân giải các chất hữu cơ nhờ sự có mặt của oxy tạo ra sản phẩm cuối cùng là CO2, NH3, nước, nhiệt và sinh khối vi sinh vật. - Quá trình ủ yếm khí là quá trình phân giải các chất hữu cơ vi sinh vật nhưng không có oxy sản phẩm cuối cùng là CH4, CO2, NH3 một lượng nhỏ các loại khí khác, axit hữu cơ và sinh khối vi sinh vật. Trong quá trình ủ rác sẽ diễn ra một loạt các quá trình chuyển hoá khác nhau. Các quá trình này có thể theo những hướng có lợi, cũng như hướng không có lợi. Do đó phải làm sao kiểm soát được quá trình xử lý, hạn chế những mặt có hại cho quá trình xử lý, phát huy tối đa những mặt tích cực với mục tiêu đặt ra là: Làm ổn định thành phần rác thải sau quá trình xử lý: Chất thải hữu cơ khi được đưa vào môi trường sẽ còn được chuyển hoá liên tục, vì thế nó chưa ổn định. Quá trình lên men sẽ ổn định chúng bằng phản ứng sinh hoá. Sản phẩm cuối cùng của quá trình này sẽ được ổn định khi chúng ta sử dụng chúng. Tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh: Trong rác thải thường chứa nhiều vi sinh vật gây bệnh. Trong quá trình ủ rác thì các vi sinh vật này sẽ bị tiêu diệt ở các nhiệt độ khác nhau.[6] E.coli hầu hết chết ở 55oC trong 1 giờ, 60oC trong 15-20 phút Shigella sp. chết ở 55oC trong 1 giờ Các vi sinh vật gây bệnh thường bị tiêu diệt ở trong khoảng nhiệt độ từ 45-60oC trong khoảng thời gian ngắn Cải tạo chất lượng dinh dưỡng của rác thải: Nhờ có các vi sinh vật mà các chất dinh dưỡng thường tồn tại ở dạng hữu cơ đã được chuyển hoá thành các chất vô cơ và rất thích hợp cho cây trồng. Sau khi lên men, các chất dinh dưỡng này được chuyển hoá thành NO3 hay P2O5 là những chất có tác dụng làm tăng dinh dưỡng của đất có lợi cho cây trồng. Cây trồng không thể sử dụng nitơ ở dạng hữu cơ mà chỉ có thể sử dụng ở dạng vô cơ.[5] Tuy nhiên việc ủ rác cũng có nhiều hạn chế . Do các vi sinh vật cần có rất nhiều thời gian để phân huỷ đống ủ cho nên việc ủ rác thường kéo dài, kéo theo một loạt những vấn đề về kinh tế xã hội. Ngoài ra các đống ủ nếu không được kiểm soát kỹ thì chính chúng sẽ trở thành nguồn gây ô nhiễm ra môi trường xung quanh. 2.2.2. Các phương pháp xử lý rác bằng công nghệ vi sinh vật Có rất nhiều phương pháp khác nhau để xử lý rác thải sinh hoạt có chứa xenluloza và các chất hữu cơ khác. Người ta thường tóm tắt chúng vào các nhóm sau: Phương pháp sản xuất khí sinh học từ rác (Biogas) Phương pháp chôn lấp rác (landfill) Phương pháp ủ rác (composting) Tuỳ theo điều kiện kinh tế, xã hội và thành phần tính chất của rác mà người ta áp dụng phương pháp này hay phương pháp kia cho phù hợp để có thể tận dụng hết các ưu điểm của từng phương pháp [6,10,11]. 2.2.2.1. Phương pháp sản xuất khí sinh học (Biogas) Cơ sở của phương pháp này là nhờ sự hoạt động của các vi sinh vật mà các hợp chất khó tan (xenluloza, lignin, hemixenluloza, tinh bột và các hợp chất phân tử khác) được chuyển hoá thành các chất dễ tan. Sau đó lại được chuyển hoá thành các chất khí trong đó chủ yếu là metan (chiếm tuyệt đại đa số >64%). Ưu điểm của phương pháp này là ta có thể thu được một loạt khí có thể cháy được và cho nhiệt lượng cao, không gây ô nhiễm môi trường, sử dụng cho nhiều mục đích. Chất thải sau lên men được chuyển hoá thành phân hữu cơ có chất lượng dinh dưỡng cao. Tuy nhiên phương pháp này có một số nhược điểm: Khó lấy các chất thải sau lên men. Là quá trình kỵ khí bắt buộc vì vậy việc thiết kế bể ủ rất phức tạp, tốn kém và đòi hỏi vốn đầu tư lớn. 2.2.2.2. Phương pháp chôn lấp (landfill) _ phương pháp ủ rác yếm khí Chôn lấp là phương pháp xử lý lâu đời, ở nhiều nơi người ta đào một hố sâu để đổ rác xuống và lấp lại. Đây cũng chính là ưu điểm của phương pháp này, rất dễ thực hiện. Sau một thời gian khoảng 2-3 năm rác được lên men và chuyển hoá thành mùn. Như vậy phương pháp này ít tốn kinh phí, dễ thực hiện nhưng vẫn còn có rất nhiều khiếm khuyết. Đó chính là: - Đòi hỏi thời gian rất dài để phân huỷ Đòi hỏi nhiều diện tích đất, tốn diện tích bề mặt Làm giảm thể tích rác ít Các chất hữu cơ trong rác khi phân huỷ sẽ tạo ra các khí độc hại như H2S, CH4... Ngoài ra lượng nước rác rỉ ra khó có thể kiểm soát gây ô nhiễm cho các nguồn nước xung quanh đặc biệt là các nguồn nước ngầm. Chịu ảnh hưởng của thời tiết. 2.2.2.3. Phương pháp ủ rác hiếu khí (aerobic composting). Các phương pháp ủ rác hiếu khí rất phong phú, được phân chia thành các nhiều phương pháp khác nhau: Phương pháp ủ rác thành đống lên men tự nhiên có đảo trộn (Windrow composting): Phương pháp này là một phương pháp cổ điển tuy rất dễ thực hiện nhưng ngược lại rất mất vệ sinh, gây ô nhiễm mạnh nguồn nước, không khí. Phương pháp ủ thành đống không đảo trộn có thổi khí (Aerated static pile composting): phương pháp này có ưu điểm là tiến hành nhanh hơn, nhiệt độ của đống rác được ổn định và phù hợp với sự phát triển của vi sinh vật. Phương pháp lên men trong các thiết bị (Vessel Composting Unit): phương pháp này có quá trình lên men nhanh hơn và dễ kiểm soát hơn nhờ các vi sinh vật được chọn lọc kỹ khi đưa vào lên men, bổ sung cho các vi sinh vật tự nhiên có trong rác thải. Ngoài ra phương pháp này còn giúp chúng ta kiểm soát chặt chẽ lượng khí và lượng nước thải trong quá trình lên men. Các hệ thống xử lý rác công nghiệp (Commercial composting systems): phương pháp này có tính tự động hoá cao, phân huỷ rác tốt nhưng bù lại để có thể vận hành dây chuyền xử lý thì lại rất tốn kém. Các phương pháp xử lý hiếu khí dễ kiểm soát, đem lại hiệu quả xử lý và bảo vệ môi trường khá cao. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi phải có vốn đầu tư lớn cùng với các thiết bị máy móc hiện đại. Trong các phương pháp xử lý rác bằng công nghệ vi sinh vật kể trên, phương pháp ủ hiếu khí có ưu điểm hơn phương pháp ủ yếm khí vì có thể rút ngắn quá trình phân hủy rác, dễ cơ giới và tự động hoá. Đây là phương pháp có khả năng áp dụng tốt trong điều kiện kinh tế, xã hội của Việt Nam hiện nay và cũng phù hợp với trào lưu công nghệ trên thế giới. 2.3. Sự phân bố và cấu trúc của xenluloza trong tự nhiên 2.3.1. Sự phân bố của xenluloza trong tự nhiên Sinh khối thực vật của trái đất ước tính khoảng 1,8.1012 tấn. Trong đó xenluloza chiếm khoảng 4.1010 tấn. Sản lượng xenluloza được tổng hợp hàng năm trong tự nhiên lớn hơn bất kỳ chất hữu cơ nào khác. Dưới dạng phế thải, xenluloza có trong các phế liệu nông nghiệp chăn nuôi, công nghiệp, đồ hộp, công nghiệp chế biến gỗ, trong chất thải sinh hoạt từ nhà bếp, đường phố ... Sự phân bố đa dạng với khối lượng lớn ở khắp nơi của xenluloza có trong rác thải là một khó khăn và trở ngại cho việc bảo vệ môi trường, do đó để thu gom và xử lý triệt để lượng chất thải hữu cơ này đòi hỏi phải có những biện pháp và công nghệ phù hợp với từng khu vực, từng vùng.[3,5,11,20] Bảng 4. Hàm lượng xenluloza có trong một số nguyên liệu. Nguyên liệu Xenluloza (%) Nguyên liệu Xenluloza (%) Kiều mạch Vỏ đậu tương Mía Cây trưởng thành Bã Thân ngô Cỏ Trấu lúa mì 42.8 51.0 34.0 42.0 56.6 36.0 28.0 30.5 Vỏ hạt Sợi Gỗ thông Giấy báo Rơm Lúa mì Lúa mạch Bông 60.0 91.0 41.0 40-80 44.0 30.5 34.0 91.0 2.3.2. Cấu trúc của xenluloza. Xenluloza là thành phần cơ bản của tế bào thực vật. Thông thường, xenluloza của tế bào thực vật chiếm 50% tổng số hydratcacbon có trên trái đất của chúng ta. Người ta nhận thấy rằng trong thiên nhiên hầu như không gặp xenluloza ở dạng tinh khiết mà nó thường tồn tại ở dạng kết hợp với những chất khác như hemixenluloza, lignin, pectin... các chất này liên kết với nhau tạo nên màng tế bào thực vật và có tên gọi chung là ligno-xenluloza. Trong đó, xenluloza và hemixenluloza chiếm tỷ lệ cao nhất. Hai chất này được bao bọc bởi một lượng lignin.Các thành phần này thường có tỷ lệ khác nhau trong các loại cây khác nhau tạo ra các đặc tính hoá lý riêng cho từng loại thực vật. Về mặt cấu tạo hoá học, xenluloza là một polime mạch thẳng, có thành phần cấu trúc cơ bản là các D-glucopiranoza. Các gốc này nối với nhau nhờ liên kết β-1,4-glucozit. Mức độ polime hoá của phân tử xenluloza thay đổi nhiều (từ vài trăm đến 15000) trung bình là 3000. Các đơn phân glucoza trong xenluloza thì có cấu trúc dạng ghế bành (hình 1).Trong công thức phối cảnh, người ta biểu diễn glucoza số chẵn, quay góc 180o so với glucza số lẻ và các nhóm hydroxyl đều nằm trên mặt phẳng nằm ngang[11,17]. O O H CH2OH H OH H HO H H H OH H CH2OH H HO H O O H Hình 1: Cấu trúc của phân tử xenluloza Dùng phương pháp phân tích của Rơngen, người ta đã chứng minh được rằng phân tử xenluloza có dạng sợi. Các sợi này của xenluloza lại gắn với nhau nhờ liên kết hydro tạo thành từng bó nhỏ gọi là các microfibrin (hình 2A). Microfibrin có cấu trúc không đồng nhất và thường có hai vùng (hình 2B). -Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự rất cao, vì thế nó rất bền vững với tác động bên ngoài. -Vùng vô định hình có cấu trúc trật tự không chặt do đó kém bền vững hơn. Hình 2: Cấu trúc bậc cao của xenluloza trong tự nhiên Vùng vô định hình Vùng kết tinh A B A - Bó sợi xenluloza song song với nhau nhờ liên kết hydro B – Lát cắt bên của một sợi Do có cấu trúc như thế, vùng vô định hình của xenluloza có thể hấp thụ nước và trương lên. Trong khi đó vùng kết tinh, mạng lưới liên kết hydrogen ngăn cản sự trương này. ở vùng kết tinh, enzym chỉ tác dụng lên bề mặt các sợi.[5] Xenluloza là một hợp chất cao phân tử có cấu trúc rất bền vững. Nó không tan trong nước, không được tiêu hoá trong đường tiêu hoá của người và động vật có dạ dày một túi. Tuy nhiên, trong dạ dày của động vật nhai lại và trong đất có tồn tại rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh sản xenlulaza, là enzym thuỷ phân xenluloza. Cấu trúc của xenluloza là một cấu trúc phức tạp, chặt chẽ. Chính vì vậy mà xenluloza rất bền trong tự nhiên. Các thành phần hợp thành xenluloza có cấu tạo và tính chất rất khác nhau. Do đó, việc phá vỡ cấu trúc này đòi hỏi phải có sự hiểu biết sâu sắc đặc tính riêng của từng phần tạo ra chúng. Từ đó tìm ra những biện pháp, những chủng vi sinh vật thích hợp để phân giải chúng. Bên cạnh đó,xenluloza là thành phần có số lượng và cấu tạo phức tạp hơn cả trong ligno-xenluloza . Sự tồn tại của hai vùng kết tinh và vô định hình của xenluloza cũng đòi hỏi phải có những biện pháp hoàn toàn khác nhau. Chính vì thế, quá trình thuỷ phân xenluloza trong tự nhiên thường diễn ra rất chậm chạp. Vấn đề xử lý các chất thải có chứa xenluloza là vấn đề không dễ dàng.[11] 2.4.Hemixenluloza Trong tế bào thực vật, hemixenluloza đứng thứ hai về khối lượng. Hemixenluloza là nhóm polisacarit có phân tử lượng nhỏ hơn rất nhiều so với xenluloza. Thông thường chúng chỉ có 150 gốc đưòng. Các gốc đưòng được nối với nhau bằng liên kết β-1.4, β -1.5, β -1.6 glucozit. Chúng tạo thành mạch ngắn và phân nhánh. Do đó, so với xenluloza thì hemixenluloza có cấu trúc không chặt chẽ bằng, chúng dễ dàng bị phân giải khi bị axit loãng tác dụng. Đôi khi hemixenluloza còn bị phân giải trong nước nóng và chúng dễ dàng bị phân giải bởi enzym hemixenlulaza. Hemixenluloza tồn tại chủ yếu ở các phần như hạt, bẹ ngô, cám, rơm, rạ, trấu. Trong các loại hemixenluloza thì xylan là loại có nhiều trong tự nhiên. Trong đó nhiều nhất là ở rơm, rạ (chiếm hơn 30%) kế đến là cây lá rộng (20 – 30%). ở cây lá kim, xylan ít hơn nhiều (7 – 17%).[5,10,20] 2.5.Lignin Lignin là hợp chất cao phân tử ngưng tụ từ ba loại rượu chủ yếu: rượu trans-P-cumarylic, trans-conyferylic và trans-cynapylic.[5] Tuy nhiên, tỷ lượng ba loại rượu nói trên trong lignin của các loại thực vật khác nhau không giống nhau.Trong lignin các đơn phân này thường liên kết với nhau bằng liên kết C-O và C-C. Trong đó kiểu liên kết aryl-glyxecol, aryl-aryl hoặc diaryl ete là phổ biến. Lignin của cây gỗ gồm 8% conyferylic; 14% cumarylic và 6% cynapylic. Trong thực vật, lignin tập trung ở các mô hoá gỗ và vai trò như chất liên kết tế bào, do đó mà làm tăng độ bền cơ học, tăng khả năng chống thấm, ngăn chặn các chất độc gây bệnh và các vi sinh vật gây bệnh cũng như các tác dụng khác từ bên ngoài. Lignin không hoà tan trong nước, trong các dung môi hữu cơ đậm đặc kể cả axit. Chỉ có tác dụng với kiềm bisunfit natri và axit sunfurơ, lignin mới mới lại bị phân giải từng phần. Lignin rất bền đối với tác dụng của các enzym. Do đó trong cây lignin chỉ được tạo ra mà không tham gia vào sự trao đổi chất. Ba cấu tử xenluloza, hemixenluloza, lignin tạo nên ligno-xenluloza. Thành phần lignin, xenluloza, hemixenluloza trong các loại thực vật có sự khác biệt lớn. Sự khác biệt này quyết định sự khác nhau giữa các loại thực vật về tính chất vật lý và thành phần hoá học. Chính vì thế đòi hỏi phải có biện pháp, tác nhân xử lý khác nhau đối với các loại thực vật khác nhau.[5, 20] 2.6.Cơ chế chuyển hoá ligno-xenluloza Từ các yếu tố trên ta thấy rằng ligno-xenluloza là một chất rất khó chuyển hóa và chuyển hoá rất chậm trong điều kiện tự nhiên. Đặc tính khó chuyển hoá này do một số nguyên nhân: Ligno-xenluloza là một tập hợp thành phần phức tạp, có mức độ polime cao, khó tan trong nước, do đó rất khó bị thuỷ phân bởi enzym. Các cấu phần hợp thành nên ligno-xenluloza được liên kết chặt chẽ với nhau và liên kết với các thành phần khác tạo ra một cấu trúc hết sức chặt chẽ. Do thành phần cấu tạo của ligno-xenluloza rất đa dạng và phức tạp nên để có thể thuỷ phân được chúng một cách triệt để cần phải có một phức hệ enzym tương ứng. Một loại vi sinh vật riêng rẽ không đủ khả năng để có thể sinh tổng hợp một phức hệ enzym phong phú và đa dạng như vậy. Muốn chuyển hoá được ligno-xenluloza cần phải có sự phối hợp của các loại vi sinh vật khác nhau. 2.6.1.Enzym và cơ chế thuỷ phân xenluloza a) Enzym thuỷ phân xenluloza: xenlulaza Xenlulaza ở vi sinh vật và cơ chế tác dụng của chúng gần đây đã được một số tác giả tổng kết khá chi tiết. Đây là phức hệ enzym thuỷ phân xenluloza tạo ra các đường đủ nhỏ để đi qua vách tế bào thực vât. Nhiều tác giả cho rằng phức hệ enzym xenlulaza bao gồm ba enzym chủ yếu sau: -Exo-β(1,4)-glucanaza (Avicelaza) hay xenlobiohydrolaza (1,4 β-D-glucanxenlobiohydrolaza E.C.3.2.1.91) Enzym này phân cắt chuỗi xenluloza từ đầu không khử và giải phóng ra xenlobioza. Enzym này không thuỷ phân xenluloza kết tinh cũng như xenluloza hoà tan (caboxymetyl xenluloza) nhưng có thể thuỷ phân được xenluloza đã bị cắt ngắn mạch. Có lẽ vai trò chính của enzym này là giúp cho enzym endoxenlulaza tác động lên được xenluloza kết tinh. -Endoglucanaza hay Endoxenlulaza (1,4 β-D-glucano-hydrolaza E.C.3.2.1.4) Enzym này có nhiệm vụ cắt đứt các liên kết β 1,4-glucozit trong phân tử xenluloza một cách ngẫu nhiên để giải phóng ra xenlodextrin, xenlobioza và glucoza. Enzym này phân giải mạnh mẽ các xenluloza vô định hình nhưng lại tác dụng yếu trên xenluloza kết tinh và không phân giải được xenlobioza. Chính nhờ sự phân cắt trước của endoxenlulaza, đã tạo ra các đầu không khử làm dễ dàng enzym xenlobio-hydrolaza, do đó mà thuỷ phân được xenluloza kết tinh. Còn thứ tự ngược lại thì hiện nay người ta chưa biết. -Enzym β-1,4-glucozidaza hay xenlobiaza Đây là những enzym rất đặc hiệu. β-glucozidaza làm thuỷ phân xenlobioza và các xenlooligo-sacarit mạch ngắn thành glucoza. Vận tốc chung của phản ứng thuỷ phân xenluloza phụ thuộc chặt chẽ vào quá trình hoạt động của xenlobiaza. Tuy nhiên theo một số tác giả cơ chế thuỷ phân xenluloza bởi phức hệ enzym trên diễn ra theo một trật tự khác nhau. b)Cơ chế thuỷ phân xenluloza Theo Reese và các đồng sự thì C1 là enzym “tiền tố thuỷ phân” hay là không đặc hiệu. Các enzym này chỉ có tác dụng làm trương xenluloza tự nhiên. Các xenluloza tự nhiên sẽ được chuyển thành các xenluloza hoạt động trương nở có mạch ngắn hơn. Các chuỗi này sẽ được enzym Cx tiếp tục phân cắt tạo thành đường tan (xenlobioza) và sau cùng thành glucoza[11]. Xeluloza tự nhiên Xenluloza hoạt động Đường tan Glucoza C1 Cx Xenlobiaza Tuy nhiên Erikson và các đồng sự lại cho rằng: Đầu tiên enzym endoglucanaza tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt xenluloza, cắt các liên kết β-1,4 glucozit và tạo ra các đầu mạch tự do. Sau đó exoglucanaza sẽ cắt ra tạo thành những đoạn xenlobioza. Kết quả tạo thành xenlo-oligosacarit mạch ngắn,xelobioza, glucoza. Cuối cùng enzym xenlobiaza thuỷ phân tiếp theo tạo thành glucoza. Endoglucanaza Vùng vô định hình Vùng kết tinh Exoglucanaza β-glucozidaza Glucoza Dựa trên kết quả trên mà Reese đã hiệu chỉnh quan niệm của mình về enzym C1 và Cx. Theo ông thì C1 có tác dụng làm trương nở xenluloza kết tinh, phá vỡ liên kết đồng hoá trị tạo ra xenluloza biến tính. Sau đó enzym endoglucanaza tác động lên chuỗi và tạo ra xenlobioza. Ông cho rằng sự thuỷ phân xenluloza là kết quả của sự tác động cùng một lúc của cả endoglucanaza, enxoglucanaza và xenlobiaza. Mặc dù có rất nhiều kết quả nghiên cứu về quá trình thuỷ phân xenluloza nhưng cho đến này thì cơ chế thuỷ phân xenluloza vẫn chưa hoàn toàn thồng nhất. 2.6.2. Enzym và cơ chế thuỷ phân hemixenluloza Khi nghiên cứu hemixenluloza, người ta nhận thấy có nhiều điểm giống nhau giữa hai thành phần này.Chính vì vậy mà nhiều tác giả cho rằng enzym hemixenlulaza cũng có nhiều điểm tương đồng với xenlulaza ví dụ như cơ chế tác động.... Tuy nhiên, giữa hemixenlulaza và xenlulaza vẫn còn nhiều điểm khác biệt: - Hemixenluloza có phân tử nhỏ hơn, cấu trúc phân tử đơn giản và kém bền hơn so với xenluloza - Hemixenluloza là cơ chất dễ đồng hoá hơn xenluloza do đó hemixenlulaza thường được tạo thành sớm hơn trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Mặc dù vậy thì quá trình phân giải hemixenluloza thường diễn ra song song với quá trình phân giải xenluloza.[5] 2.6.3. Enzym và cơ chế thuỷ phân lignin Có nhiều quan điểm trái ngược nhau về cơ chế phân giải lignin. Một số tác giả cho rằng, lignin có tác dụng như một nguồn cảm ứng để tổng hợp ra ligninaza. Nhưng một số tác giả khác lại cho rằng quá trình phân giải lignin là một quá trình trao đổi chất thứ cấp. Chúng chỉ xảy ra khi môi trường thiếu các nguồn dinh dưỡng cacbon dễ đồng hoá hoặc thiếu nguồn nitơ. Nếu thêm nitơ vào sẽ làm giảm nhanh quá trình phân giải lignin. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có khoảng 15 loại enzym tham gia vào quá trình thuỷ phân lignin . Ligninaza không thuỷ phân lignin thành các tiểu phần hoà tan như phân giải xenluloza và hầu hết các polime khác, vì lignin chứa một số lượng các liên kết có thể bị phân huỷ nhỏ. Mặt khác ligninaza lại rất khó hoà tan, chúng sẽ liên kết theo một kiểu nào đó cho phép tiếp xúc với lignin . Quá trình thuỷ phân có thể diễn ra theo điều kiện phản ứng hoá học sau: -Cắt oxy hoá mạch bên của đơn vị phenylpropan -Hình thành nhóm carboxyl thơm -Tách nhóm methoxyl - Hydroxyl hoá vòng thơm 2.7. Vi sinh vật phân giải xenluloza và một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của vi sinh vật 2.7.1. Vi sinh vật phân giải xenluloza Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza vô cùng phong phú bao gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn. 2.7.1.1. Nấm sợi Trong rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp xenlulaza thì nấm sợi thuộc nhóm có khả năng tổng hợp xenlulaza mạnh nhất. Chúng là những vi sinh vật thuộc nhóm hạ đẳng, không có diệp lục, chúng chủ yếu sống hoại sinh ở trong đất và tiết ra môi trường một lượng lớn enzym chuyển hoá các tàn dư của thực vật thành những chất dinh dưỡng cung cấp cho cây và làm cho đất trở nên màu mỡ hơn.[11] Trong thực tế không có một loại nấm hay vi sinh vật nào có khả năng sinh tổng hợp đầy đủ cả một phức hệ enzym cần cho quá trình chuyển hoá xenluloza đến sản phẩm cuối cùng mà mỗi loài chỉ có thể sinh tổng hợp một vài loại enzym nào đó mà thôi. Các loại nấm đáng chú ý nhất là:Alternaria tenuis, Aspergillus wentii, Aspergillus fumigatus, Trichoderma reesei, Fusarium solani, Penicillium pinophinum,, Aspergillus niger... [10] Các nấm ưa nhiệt cũng được chú ý vì chúng có thể tổng hợp các enzym bền nhiệt hơn, chúng sinh trưởng và phân giải nhanh xenluloza nhưng hoạt tính xenlulaza của dịch lọc lại thấp. Nấm có khả năng sinh trưởng và sản xuất xenlulaza cực đại ở phạm vi pH bằng 3,5 - 6,6.[11] 2.7.1.2. Vi khuẩn Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy một số vi sinh vật kỵ khí có khả năng phân giải xenluloza. Những năm đầu thế kỷ XX(1903) G.Van Iterson phân lập được các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng này. Trong các vi khuẩn hiếu khí phân giải xenluloza, niêm vi khuẩn chi._.