Phân lập Micromonospora có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ bùn hồ Bẩy Mẫu - Hà Nội

iá trị từ Streptomyces ngày càng ít. Vì vậy trong những năm gần đây một chi khác của xạ khuẩn được thế giới quan tâm nhiều là Micromonospora. Người ta đã nhận được từ chi này một số chất kháng sinh tốt, phổ rộng như: Gentamycin, Neomycin-B, Rifamycin..... ở Việt Nam chi Micromonospora mới được nghiên cứu từ những năm 90 nhưng kết quả còn rất hạn chế. Với mong muốn được tiếp tục tìm hiểu về đặc tính phân loại và khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Micromonospora ở Việt Nam, hy vọng có thể nhận được những chủng cho chất kháng sinh có ý nghĩa . Chúng tôi chọn đề tài: “Phân lập Micromonospora có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ bùn hồ Bẩy Mẫu - Hà Nội”. Với các nhiệm vụ sau: - Phân lập Micromonospora từ bùn hồ và thử phổ kháng khuẩn của các chủng phân lập. - Nghiên cứu phân loại một số chủng có hoạt tính kháng sinh tốt. - Sơ bộ xác định một số thành phần dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển và sinh tổng hợp kháng sinh của các chủng đã chọn. Từ kết quả nghiên cứu ban đầu của khoá luận chúng tôi hy vọng nó sẽ là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo. Phần 1. Tổng quan Đại cương về chi Micromonospora [ 7, 8, 12, 13,14] 1.1.1 Đặc điểm sinh thái của Micromonospora: Micromonospora là một chi thuộc họ Micromonosporaceae, bộ Actinomycetales, lớp Actynomycetes. Micromonospora có rất ít trong đất Teplakova và Maximova (1957) đã chỉ tìm thấy 1,2% Micromonospora trong các phân lập Actinomycetes. Szabo’Zsusza (1986) đã nhận thấy tỷ lệ của Micromonospora trong đất núi là 2,6%, đất trồng trọt là 14%, đất than bùn từ 50%-60%. - Đất bùn giàu nguyên liệu hữu cơ rất thích hợp cho sự phát triển của Micromonospora. Theo Cross và Collins (1966), 1 gam bùn hồ có khoảng 4000 Micromonospora. - Nước hồ có rất ít Actinomycetes nhưng có đến 76% là Micromonospora streptomyces chỉ có 6% (Unbreit và McCoy, 1941). - Gramein và Meyers (1958) đã tìm thấy Micromonospora từ nước biển và đất phù sa, những Micromonospora này rất chịu muối, chúng chiếm đa số trong các phân lập Actinomycetes từ đất phù sa của biển. 1.1.2 Đặc điểm hình thái của Micromonospora: -Micromonospora có khuẩn ticơ chất phân nhánh, thường không có khuẩn ti khí sinh, bắt màu Gram(+), không kháng acid. Đường kính khuẩn ti từ 0,2 đến 0,6àm. - Bào tử riêng lẻ không cuống hoặc có cuống nằm phân tán hoặc thành từng đám trên hệ sợi cơ chất phân nhánh. Thành bào tử dày tạo sự khúc xạ ánh sáng mạnh. Bào tử hình tròn, oval, hoặc các dạng khác nhau, bề mặt bào tử nhẵn, có gai hoặc xù xì. - Khuẩn lạc của Micromonospora có dạng hình cầu nhỏ nhô lên trên bề mặt môi trường. Trong những ngày phát triển đầu tiên khuẩn lạc của các loài rất giống nhau có màu da cam nhạt đến da cam. - Khi nuôi cấy già có thể tạo sắc tố đặc trưng tuỳ thuộc vào môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy . Khi hình thành bào tử khuẩn lạc có mầu nâu hoặc màu đen, chúng có thể khô hoặc trở thành ướt và nhầy. 1.1.3 Tính chất hoá học của thành tế bào: Cơ sở để phân biệt chi Micromonospora với các chi khác của xạ khuẩn là không có khuẩn ti khí sinh và sự hình thành bào tử, ngoài ra còn dựa trên tính chất thành tế bào kiểu II của nó. Thành tế bào kiểu II đặc trưng bởi thành phần hóa học có: m-diaminopimelic acid ,glycin và glutamic acid, thành phần đường là xylose và arabinose. Glucose, galactose, manose và rhamnose thì khác nhau của các loài. 1.1.4 Tính chất sinh lý, sinh hoá của Micromonospora. Micromonospora đóng vai trò vô cơ hoá các nguyên liệu hữu cơ và trong sự mùn hoá, ngoài ra Micromonospora có thể phân huỷ cellulose, kitin, lignin, xylan, tinh bột, casein, khử nitrat, protein. Nhiệt độ phát triển từ 200C -> 400C, nhưng không phát triển ở trên 500C. Hầu hết các loài hiếu khí, mẫn cảm với pH < 6,0. - Bào tử của Micromonospora ngược lại với bào tử Streptomyces, chịu được nhiệt độ và dung môi hữu cơ. Chúng có thể tồn tại trong nước 600C trong 90 phút, nhưng chết ở 900C trong 15 phút. Bào tử chịu được pH từ 6 ữ 8, thường bị mẫn cảm ở pH acid mạnh. Bào tử có thể sống sót trong các dung môi hữu cơ nồng độ không quá 80%, bào tử có sự kháng cao với dioxal, aceton. 1.1.5 Khả năng gây bệnh của Micromonospora: Micromonospora có thể gây bệnh cho người, động vật, tuy nhiên khả năng gây bệnh cũng có hạn chế và chưa rõ ràng, mặc dù một số tác giả đã phân lập được Micromonopora từ các tổ chức bị bệnh , ví dụ : Erikson (1935) đã tìm thấy Micromonospora gallica từ máu; Morquer và Comby (1943) đã ghi Micromonospora caballi gây bệnh cho da giống Actinomyces; Morch (1975) đã tìm thấy một chủng M .chalcea từ tổ chức, và chủng này gây bệnh trên da của chim bồ câu. 1.1.6 Sự tạo kháng sinh của Micromonospora: Micromonospora có khả năng tạo kháng sinh thuộc nhiều nhóm khác nhau về mặt hoá học như: amynoglycosid, macrolid, ansamycin, polypeptid. - Một số kháng sinh nhóm aminoglycosid: Gentamycin do M.echinospora và M.purpurea. (Weinstein & cộng tác 1963; Luedemann & Brodsky 1964). Micromonosporin do M.sp ATCC 10026 (Wagman & cộng tác 1974). Sisomycin do M.injoensis (Weinstein & cộng tác 1970). Neomycin B do M.sp 69-638 (Wagman & cộng tác 1973). Verdamycin do M.Gramisea (Weinstein & cộng tác 1975). Fortimycin A & B do M. olivasterospora (Naro & cộng tác 1977; Kawamoto & cộng tác 1983). - Một số kháng sinh nhóm Macrolid: Megalomycin do M.megalomicea (Weinstein & cộng tác 1969). Rosamycin do M.rosarria (Wagman & cộng tác 1972). XK - 41 do M. inositola (Kawamoto & cộng tác 1974). Juvenimycin do M. chalcea & izumensis (Hatano & cộng tác 1976). M - 4365 do M.capillata (Furumai & cộng tác 1977). Erythromycin B từ M. sp. 1225 (Marquez 1976). - Một số kháng sinh nhóm ansamycin: Halomicins do M.halophytica (Weinstein & cộng tác 1968; Luedemann & cộng tác 1970). Rifamicin từ M. ellipsaspora 71372. - Một số kháng sinh nhóm polipeptid: Chalcidin do M. chalcea H85 (Gauze & cộng tác 1970). Những nghiên cứu về phân loại trên quần thể Micromonospora. [5,7,9,12,14] : - Wagman S.A (1961) đã nhận định trong các loài đặc chủng của Micromonospora các tính chất về hình thái là những tiêu chuẩn, ban đầu cho việc xác định loài. Các đặc tính sinh lý, sinh hoá như phân huỷ cellulose, khử nitrat cũng quan trọng. Mầu và hình dạng của khuẩn lạc không được coi là những đặc tính cơ bản, vì mầu của nó không cố định mà thay đổi từ vàng sang da cam, hồng, đỏ, nâu và đen. Các loài Micromonospora là hiếu khí hoặc kỵ khí. Chúng có thể sử dụng các nguồn nitrogen và carbon vô cơ, hữu cơ khác nhau. Wagman S.A đã chia chi Micromonospora thành 9 loài bao gồm: M. chalcea M. parva M. coerulea M. gallica M. fusca M.propionica M. globosa M. elongata M. bicolo - Sveshmikova và cộng tác năm (1970) đã nghiên cứu những loài Micromonospora từ đất bùn ở ngoại ô Moscow. Họ đã đưa ra 5 loài mới nhưng chỉ dựa trên rất ít đặc tính như sử dụng 6 nguồn carbon, sự tạo sắc tố trong môi trường và kiểu bào tử. Nhưng theo họ tiêu chuẩn này cũng không luôn luôn ổn định. - Singal và Solovieva (1974) cũng đã nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn carbon của Micromonospora.Tuy nhiên không có những kết luận về phân loại từ những số liệu này. - Luedemann (1970, 1971), sau những nghiên cứu chi tiết trên nhiều phân lập Micromonospora ông đã đưa ra nhiều tính chất hữu ích dễ phân biệt loài trong chi Micromonospora. Theo ông ngoài sắc tố khuẩn ti màu da cam thì các endopigment luôn khác nhau (nâu, hồng, tím, xanh lá cây, xanh... ) các sắc tố hoà tan này rất có ý nghĩa. Sự hình thành bào tử không luôn luôn là những đặc tính có giá trị nhưng cần dựa trên những kiểu khác nhau của hình thành bào tử để phân loại. Phổ sử dụng nguồn carbon cũng có ý nghĩa nhưng giá trị này không đủ cho việc xác định 1 loài. Tính chất chịu NaCl và sự phát triển trên miếng khoai tây acid và trung tính cũng là những đặc tính hữu ích cho phân loại. Tuy nhiên những chủng riêng biệt có sự thay về mức độ và một số tính chất. Đặc biệt là phổ sử dụng carbon có sự lặp lại thấp. Sự so sánh với chủng chuẩn là cần thiết nó giúp cho việc phân loại nhanh và chính xác. - Ivanitskaya và cộng tác (1983) cũng đưa ra một số tính chất sinh lý, sinh hoá để xác định 3 loài mới của Micromonospora và người ta cũng đã tìm thấy có sự liên quan giữa sự tạo kháng sinh với một số đặc tính riêng về phân loại của Micromonospora. Sổ tay định loại vi sinh vật của Bergey (1980) đã đưa ra khoá phân loại của chi Micromonospora bao gồm 14 loài hiếu khí và 2 loại kỵ khí trên cơ sở những đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hoá của chúng. - Szabó. Zsuzsa (1982) đã sử dụng phương pháp số học để phân loại quần thể Micromonospora của bùn hồ Bulaton (Hungari). Phương pháp này có tính ưu việt so với phương pháp phân loại truyền thống. - Trong khoá luận này với khả năng và giới hạn về các thông tin cho phép chúng tôi nghiên cứu phân loại 5 Micromonospora đại diện theo khoá phân loại của Luedemann G.M (1969) và sổ tay định loại vi sinh vật của Bergey (1980) đồng thời đối chiếu với khoá phân loại của Waksman S.A (1961). Có so sánh với các chủng chuẩn là: Micromonospora chalcea ATCC 12452. Micromonospora halophytica ssp halophytica ATCC 27596. Micromonospora narashino ATCC 27331. Phần 2. Thực nghiệm và kết quả 2.1 Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm 2.1.1 Nguyên liệu: - Nguyên liệu để phân lập chủng, các mẫu bùn của hồ Bảy Mẫu- Hà Nội. - Các môi trường nuôi cấy: Các môi trường của Luedemann (1971) và Szabo’zsuzsa (1982) đã được sử dụng trong nghiên cứu. - Chủng Micromonospora dùng trong nghiên cứu: Chủng Micromonospora dùng trong nghiên cứu được phân lập từ các mẫu bùn hồ Bẩy Mẫu. Trên cơ sở phổ kháng khuẩn chúng tôi đã chọn 5 chủng để nghiên cứu phân loại được ký hiệu là M14, M16, M26, M30, M47. - Chủng vi sinh vật chỉ thị: Gồm 9 vi khuẩn và 1 vi nấm. - Vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus ATCC 12228. Bacillus pumilus NTCC 8241. Bacillus subtilis ATCC 6633. Sarcina lutea ATCC 9314. - Vi khuẩn Gram (-) . Escherichia coli ATCC 25922. Salmonella typhi DT 220. Shigella flexneri DT 112. Proteus mirabilis BV 108 Pseudomonas aeruginosa VM 201. - Vi nấm: Candida albicans ATCC 10231 . Các chủng vi sinh vật chỉ thị là chủng quốc tế hoặc được phân lập tại các viện nghiên cứu của Việt Nam. 2.1.2 Phương pháp thực nghiệm: theo Szabo zs. (1982) và Luedemann (1971) 2.1.2.1 Phương pháp lấy mẫu và phân lập chủng Micromonospora: Bùn được lấy ở lớp bề mặt từ 0 ->15cm ở các vị trí cách bờ hồ: 5m;10m; 20m; 50m, sau đó được trộn đều để phân lập chủng. 10g bùn được hoà vào 90ml dung dịch K2Cr2O4 0,4%, lắc đều trong 2 giờ, pha loãng tiếp thành các nồng độ 10-2, 10-3, 10-4 cấy vào các môi trường phân lập sau: - Môi trường men tinh bột: (MT1) Tinh bột tan 20,0g. Cao men 10,0g. Thạch 18,0g. Nước cất 1000,0ml pH: 7 ± 0,2. - Môi trường Gauze I: (MT 2). Tinh bột tan 20,0g. K2HPO4 . 7 H20 0,5g. NaCl 0,5g. MgSO4 . 7 H20 0,5g KNO3 1,0g. FeSO4 .7 H20 0,01g. Thạch 18,0g. Nước cất 1000,0ml pH: 7 ± 0,2 Sau 5 đến 7 ngày nuôi cấy ở 280C đến 320C các khuẩn lạc Micromonospora hình thành. Dựa vào hình dạng mầu sắc khuẩn lạc, hệ sợi cơ chất đặc trưng để phân biệt Micromonospora với các khuẩn lạc vi sinh vật khác. Những khuẩn lạc sạch mọc riêng rẽ được cấy sang môi trường men tinh bột và môi trường Gauze I. 2.1.2.2 Phương pháp xác định khả năng tạo kháng sinh của các chủng phân lập: Các phân lập sạch sau 1 tuần nuôi cấy trong ống thạch nghiêng được cấy lên bề mặt thạch đĩa Gauze I. Sau đó 5 đên 7 ngày nuôi cấy được thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch dựa trên nguyên tắc chất kháng sinh có trong khối thạch được khuếch tán vào môi trường đã cấy vi sinh vật chỉ thị tạo vòng vô khuẩn có đường kính tỷ lệ thuận với logarit nồng độ. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của các phân lập được đánh giá bằng đường kính vòng ức chế. - Chuẩn bị nhũ dịch vi sinh vật chỉ thị: Các vi sinh vật sau 18 đến 24 giờ nuôi cấy trên các môi trường thích hợp được làm thành nhũ dịch (có khoảng 107 – 108 tế bào trong 1ml) trong NaCl 0,9%. - Môi trường: Môi trường cao thịt cao men (thử ức chế vi khuẩn): MT3 Pepton 10,0g. Cao thịt 1,5g. Cao men 3,0g. Glucose 1,0g. Thạch 18,0g. Nước cất 1000,0ml pH: 7,0 ± 0,2. Môi trường Sabouraud (thử ức chế vi nấm): MT 4 Pepton 10,0g. Glucose 40,0g. Thạch 18,0g. Nước cất 1000,0ml. pH: 7,0 ± 0,2. - Các khối thạch của Micromonospora được đặt lên bề mặt của các đĩa môi trường đã có vi sinh vật chỉ thị với tỷ lệ 1% (v/v). Đo đường kính vòng ức chế sau 18 – 24 giờ nuôi cấy ở 350C đến 370C (đối với vi khuẩn) và 280C – 300C (đối với vi nấm). 2.1.2.3 Phương pháp xác định đặc tính hình thái: Hình dạng bề mặt và mầu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ti cơ chất, sự hình thành bào tử được theo dõi trên môi trường: MT 1 và MT 2. Hình dạng khuẩn ti và cuống sinh bào tử được quan sát bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi đối quang với phương pháp nuôi cấy microfilm. 2.1.2.4 Xác định đặc điểm nuôi cấy: Các đặc điểm nuôi cấy như sự phát triển, sự tạo sắc tố hoà tan, khả năng tạo bào tử được nghiên cứu trên các môi trường MT 1 & MT 2, - Môi trường glucose- asparagine (MT 5): Glucose 10,0g Asparagine 0,5g K2HPO4 0,5g. Thạch 18,0g. Nước cất 1000,0ml. pH: 7,0 ± 0,2. - Môi trường Czaperk - Saccharose: (MT 6) NaNO3 2,0g. K2HPO4 . 7 H2O 1,0g. MgSO4 . 7 H2O 0,5g. KCl 0,5g. FeSO4 .7 H2O 0,1g. Saccharose 30,0g. Thạch 18,0g. Nước cất 1000,0ml pH: 7,0 ± 0,2. - Môi trường thạch sữa (MT 7): Cao men 5,0g. Glucose 1,0g. CaCO3 1,0g. Thạch 18,0g. Sữa loại bơ 100,0g. Nước cất 1000,0ml pH: 7,0 ± 0,2. Đặc điểm nuôi cấy được quan sát sau 7 đến 14 ngày. 2.1.2.5 Xác định sự tạo sắc tố melanin. Khả năng tạo sắc tố melanin được thử trên môi trường ISP 6 (MT 8) Pepton 20,0g. Sắt amoni citrat 0,5g. K2HPO4 1,0g. Na2S2O3 0,08g. Cao men 1,0g. Thạch 18,0g. Nước cất 1000,0ml. pH: 7,0 ± 0,2. Sau 7 đến 14 ngày nuôi cấy nhận xét sự hình thành các sắc tố qua sự chuyển màu của môi trường. 2.1.2.6 Nghiên cứu đặc tính mẫn cảm với pH acid của Micromonospora trên miếng khoai tây: - Khoai tây được gọt vỏ cắt thành từng miếng có kích thước khoảng 1 x 1 x 6cm. Sau đó được cắt vát theo chiều dọc, cho vào ống nghiệm hấp tiệt trùng, đo pH của miếng khoai tây đã vô trùng. Một phần các miếng khoai tây khác được xử lý với CaCO3 trước khi hấp tiệt trùng sao cho miếng khoai tây có pH từ 6,6 – 7,0. - Các chủng được cấy song song lên 2 loại miếng khoai tây. Quan sát sự phát triển của chúng sau 7 – 10 ngày nuôi cấy. 2.1.2.7 Thử khả năng khử nitrat: Sự khử nitrat thành nitrit được thực hiện trên môi trường sau: Môi trường 9 (MT 9): pepton 5,0g. Cao thịt 3,0g. KNO3 1,0g. Nước cất 1000,0ml pH: 7 ± 0,2. Đóng ống: 5ml/1 ống. Sau thời gian nuôi cấy 7 đến 10 ngày sự khử Nitrat được phát hiện bằng cách thêm vào ống môi trường đã nuôi cấy 1,0ml thuốc thử acid sulfanilic ( 8g acid sulfanilic trong 1 lít acid acetic 5N) và 1ml thuốc thử dimethyl- α- naphthylamin (6 ml dimethyl- α- naphthylamin trong 1 lít acid acetic 5N). Nếu có màu đỏ là phản ứng dương tính. Nếu không có màu đỏ thêm một ít bột kẽm vào ống thử, nếu nitrat còn sẽ được khử thành nitrit, nếu có màu đỏ xuất hiện, phản ứng âm tính. Nếu không có màu sau khi thêm bột kẽm chứng tỏ nitrat đã được sử dụng hoàn toàn hoặc đã được khử thành NH3 hoặc N2. 2.1.2.8 Thủy phân tinh bột : Sự thuỷ phân tinh bột được nghiên cứu trên môi trường 10: Môi trường 10 (MT10): Pepton 5,0g. Tinh bột 10,0g Cao thịt 5,0g. Thạch 18,0g NaCl 5,0g. Nước cất 1000,0ml pH: 7,0 ± 0,2 Đọc kết quả sau 7 đến 10 ngày nuôi cấy cho dung dịch lugol (Iod 5g; KI 10g; nước cất 1000ml ), lên bề mặt đĩa thạch đã nuôi cấy. Sự thuỷ phân tinh bột sẽ tạo một vòng sáng xung quanh chỗ chủng thử phát triển. Phần tinh bột không bị thuỷ phân sẽ có màu xanh tím. 2.1.2.9 Thuỷ phân cellulose: - Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường 11 (MT 11): Cao men 5,0g CaCO3 1,0g Bột cellulose 5,5g Thạch 18g Nước cất 1000,0ml pH: 7,0 ± 0,2 Kết quả được coi là dương tính nếu có 1vòng sáng xung quanh chỗ Micromonospora phát triển sau 7 đến 10 ngày nuôi cấy. Thủy phân gelatin: Khả năng dịch hoá gelatin được nghiên cứu trên môi trường 12 (MT 12) Gelatin 100,0g Pepton 5,0g Glucose 20,0g Thạch 18,0g Nước cất 1000,0 ml pH: 7,0 ± 0,2 Sau 7 đến 10 ngày nuôi cấy, các đĩa thử được thêm acid acetic đặc. Vòng sáng xuất hiện xung quanh điểm nuôi cấy xác định sự thuỷ phân gelatin. Acid acetic đặc sẽ tạo tủa trắng đục ở phần còn gelatin. 2.1.2.11 Thử khả năng chịu muối NaCl. Môi trường: Cao men 5,0g. CaCO3 1,0g. Thạch 18,0g. Nước cất 1000,0ml. pH: 7,0 ± 0,2. Các chủng được cấy trên môi trường men tinh bột (MT 1) với nồng độ NaCl cuối cùng là 2%, 3%, 4%, 5%, và 6%, Sau 7 đến 10 ngày nuôi cấy, xác định nồng độ muối cao nhất cho phép chủng thử phát triển. 2.1.2.12 Thử khả năng sử dụng các nguồn Carbon: Khả năng sử dụng các nguồn đường khác nhau được thử trên môi trường cơ bản sau: - Môi trường 13 (MT 13): Cao men 5,0g. CaCO3 1,0g. Thạch 18,0g. Nước cất 1000,0ml pH: 7,0 ± 0,2. + Nguồn Carbon: D- glucose D- galactose D- fructose D- mannitol D- lactose I- inositol L- arabinose Nguồn Carbon được tiệt trùng qua màng lọc vi khuẩn sau đó được bổ xung vào môi trường cơ bản với tỷ lệ 1%. Song song với các ống môi trường thử làm 2 ống chứng: ống chứng (+): môi trường cơ bản thêm 1% glucose. ống chứng (- ): chỉ có môi trường cơ bản. Đọc kết quả sau thời gian nuôi cấy ở 300C -> 320 C trong 2 tuần. Nếu chủng phát triển tốt hơn ống chứng âm là kết quả dương tính. 2.1.2.13 Chọn môi trường thích hợp cho sự sinh tổng hợp kháng sinh của các chủng nghiên cứu: Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của 5 chủng Micromonospora được nghiên cứu trên 4 môi trường có các nguồn đường và đạm khác nhau và được so sánh với môi trường Gauze I: - Môi trường 14 (MT 14): Tinh bột khoai tây 40,0g. Cao men 10,0g. NaCl 2,0g. K2HPO4 2,0g. MgSO4 2,0g. CaCO3 1,0g. Thạch 18,0g. Nước cất 1000,0ml pH: 7,0 ± 0,2. - Môi trường 15 (MT 15): Cao thịt 30,0g. Glucose 20,0g. K2HPO4 3,0g. KH2PO4 1,0g. MgSO4 0,5g. NaCl 2,0g. CaCO3 1,0g. Thạch 18,0g. Nước cất 1000,0ml. pH: 7,0 ± 0,2 - Môi trường 16 (MT 16): Tinh bột khoai tây 20,0g. Cao ngô 5,0g. Bột đậu tương 10,0g. CaCO3 1,0g. Thạch 18,0g. Nước cất 1000,0ml. pH: 7,0 ± 0,2. - Môi trường 17 (MT 17): Cao men 10,0g. Bột gạo 20,0g. Pepton 5,0g. CaCO3 1,0g. Thạch 18,0g. Nước cất 1000,0ml pH: 7,0 ± 0,2. Các môi trường sau khi tiệt trùng được đổ vào các hộp petri có kích thước như nhau với 1 lượng bằng nhau. Cấy các chủng nghiên cứu lên bề mặt đĩa thạch. Sau thời gian 7 ngày nuôi cấy xác định khả năng sinh tổng hợp kháng sinh bằng phương pháp khối thạch trên vi khuẩn chỉ thị B. subtilis ATCC 6633. 2.2 Kết quả nghiên cứu 2.2.1 Đặc điểm phân lập . Từ bùn hồ Bẩy Mẫu (Hà Nội) chúng tôi đã nhận được 47 phân lập Micromonospora và 20 phân lập Streptomyces. Như vậy số Micromonospora, chiếm 70%, số Micromonospora trong 1 gam mẫu từ 0,8.105 đến 3.105. Kết quả này cũng phù hợp với những nghiên cứu của các tác giả trước đây [4,7,12] 2.2.2 Đặc tính hình thái: Các chủng Micromonospora phân lập được chỉ có khuẩn ti cơ chất, không có khuẩn ti khí sinh. Sợi cơ chất hầu hết từ vàng nhạt đến da cam, tất cả các phân lập đều tạo bào tử. Khi tạo bào tử khuẩn lạc chuyển sang màu nâu sẫm đến đen. Một số phân lập có bề mặt khuẩn lạc nhầy khi nuôi cấy già. Trên môi trường men tinh bột và Gauze I, một số tạo sắc tố vàng hoặc nâu đen. 2.2.3 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh: 47 phân lập Micromonospora được thử hoạt tính kháng sinh trên 9 vi khuẩn và vi nấm candida albicans. Kết quả được thể hiện ở Bảng 1 Qua kết quả thí nghiệm chúng tôi nhận thấy 40% số phân lập Micromonospora có hoạt tính kháng sinh, kết quả này cũng tương tự với nhận xét của các nghiên cứu trước. 5 chủng có phổ kháng sinh rộng (ức chế 7- 10 vi sinh vật chỉ thị được thử) chiếm 25% số chủng có hoạt tính kháng sinh. 1,5% số phân lập kháng nấm Candida albicans. Dựa vào đặc tính hình thái và phổ kháng khuẩn, chúng tôi chọn 5 chủng đại diện cho kháng sinh phổ rộng để nghiên cứu phân loại. Bảng 1: Khả năng STH kháng sinh của các phân lập Micromonospora 2.2.4 Đặc điểm phân loại của một số phân lập Micromonospora: Các chủng Micromonospora được nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sự hình thành bào tử, đặc tính nuôi cấy trên một số môi trường phân biệt của các loài Micromonospora, một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá điển hình (Bảng 2): Bảng 2: Đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hoá của 5 chủng Micromonospora được nghiên cứu phân loại:  Tên chủng Đặc điểm M14 M16 M26 M30 M47 Màu sắc khuẩn lạc trước khi tạo bào tử Da cam Đỏ da cam Vàng nâu Da cam đậm Da cam Bề mặt khuẩn lạc Gấp nếp Gấp nếp Gấp nếp Gấp nếp Gấp nếp Tạo bào tử Có Có Có Có Có Hình thái của sự tạo bào tử Bào tử không cuống hình hành từng đám trên khuẩn ti Bào tử không cuống hình hành từng đám trên khuẩn ti Bào tử có cuống ngắn Bào tử không cuống hình hành từng đám trên khuẩn ti Bào tử không cuống hình hành từng đám trên khuẩn ti Sắc tố màu tím trên môi trường thạch sữa – – – – – Men tinh bột Nâu đen Vàng Nâu đỏ Vàng nhạt Nâu đen Tạo sắc tố melanin – – – – – Phát triển trên môi trường: Men tinh bột +++ +++ +++ +++ +++ Gauze I ++ +++ +++ ++ ++ Glucose- asparagine + +++ +++ ++ + Czaperk-saccharose ++ ++ +++ + + Phát triển trên miếng khoai tây: Không có CaCO3 +++ +++ + +++ +++ Có CaCO3 +++ +++ +++ +++ +++ Thuỷ phân tinh bột + + + + + Thuỷ phân cellulose – + + + – Thuỷ phân gelatin + + + + + Khử nitrat – + + + – Sự chịu NaCl tối đa 5% 5% 4% 4% 5% Đồng hóa đường: D- galactose +++ +++ +++ +++ ++ D- glucose +++ +++ +++ ++ +++ D- frutose ++ +++ ++ ++ +++ D- lactose +++ +++ +++ +++ ++ L- arabinose + ++ ++ + +++ I- inositol – ± – ± ± D- mannitol – ± ± ± ± Đối chiếu với khoá phân loại của Wagman S.A (1961), Luedemann G.M (1969) và sổ tay định loại vi sinh vật của Bergey (1980) chúng tôi nhận thấy rằng: * Chủng M14 và M47 có nhiều đặc điểm giống nhau, bào tử riêng lẻ, không cuống, hình thành từng đám trên khuẩn ti cơ chất, khuẩn lạc lúc đầu có màu da cam sau chuyển thành màu nâu đen đến đen, do phụ thuộc vào sự hình thành bào tử và bào tử chín. Chủng phát triển trên môi trường men tinh bột tốt hơn trên Gauze I, glucose- aspragine và Czaperk- saccharose không tạo sắc tố melanin. Sau khoảng 2 tuần nuôi cấy khuẩn ti bị cắt đoạn thành các hình cầu nhỏ, khuẩn lạc trở lên nhầy. Phát triển trên 2 loại miếng khoai tây, khuẩn lạc có mầu vàng sáng gấp nếp sau chuyển nâu đen do tạo nhiều bào tử. Thuỷ phân tinh bột, dịch hoá gelatin. Trên môi trường thạch sữa có sắc tố mầu xám nhạt. Khử nitrat âm tính, khi thủy phân cellulose. Đồng hoá các nguồn carbon ở mức độ khác nhau, không sử dụng I- inositol & D- mannitol. Đặc tính của 2 chủng này tương tự với Micromonospora narashino. Trong loài này có chủng M. narashino (Arai & kuroda (1965)) cho kháng sinh Nocardorubin. Kháng sinh này chỉ có tác dụng với vi khuẩn Gram(+) và trực khuẩn lao, nhưng chất kháng sinh từ M14, M47 có tác dụng với cả vi khuẩn Gram(-) và Candida albicans. Như vậy về khả năng đối kháng 2 chủng này tạo chất kháng sinh khác với Nocardorubin. * Chủng M26 : Khuẩn lạc có màu vàng nâu, nuôi cấy già chuyển màu đen, khuẩn ti cơ chất không bị bẻ gẫy thành các đoạn nhỏ đa hình. Bào tử có cuống ngắn phát triển trên khuẩn ti cơ chất. Mọc tốt trên cả 4 môi trường: Men tinh bột, Gauze I, Glucose- asparagine, Czaperk- saccharose, không tạo melamin trên môi trường ISP 6, phát triển nghèo trên miếng khoai tây đã tiệt trùng, ngược lại phát triển tốt và tạo bào tử trên miếng khoai tây được xử lý với CaCO3. - Chủng M26 có khả năng thuỷ phân tinh bột, cellulose, khử nitrat thành nitrit, dịch hoá gelatin. Sử dụng đường L- arabinose, D- galactose, D- glucose, D- lactose, D- fructose cho sự phát triển. Phát triển rất yếu trên các nguồn đường là I- inositol, D- mannitol, chịu muối tối đa ở 4%. Tính chất của chủng M26 rất giống với M. halophytica. subsp halophytica (Weinstein & cộng tác 1968). Kháng sinh Halomycin được phân lập từ M. halophytica. subsp nigra [(Wagman & cộng tác 1980) và theo (Bibikova MV & cộng tác 1989)] đã phân lập được kháng sinh Lincomycin từ 1 chủng của M. haloplytica, nhưng 2 kháng sinh này chỉ có tác dụng với các vi khuẩn Gram(+). Chất kháng sinh từ chủng M26 có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế cả vi khuẩn Gram(+) và Gram(-). * Hai chủng M16 và M30 có nhiều đặc điểm tương tự với M. chalcea (Ludemann & Brodsky 1964). Khuẩn lạc khi còn non có mầu hơi đỏ da cam, bề mặt gấp nếp sau đó chuyển màu nâu, nâu đen và đen do tạo bào tử. Bào tử không cuống hình thành nhiều sau 4 đến 5 ngày nuôi cấy nằm trên khuẩn ti cơ chất thành từng đám. Khuẩn ti dài, mỏng, phân nhánh không có vách ngăn. Khuẩn ti không bị cắt đoạn thành các hình thể khác nhau. Lớp bào tử ướt nhưng không nhầy, dễ lấy ra khỏi bề mặt thạch. Hai chủng đều phát triển tốt trên môi trường men tinh bột và tạo sắc tố mầu vàng nhạt. Trên môi trường thạch sữa có sắc tố vàng nâu, không tạo sắc tố đen trên môi trường ISP 6. - Trên môi trường Czaperk- saccharose và môi trường Glucose- asparagine chủng M30 phát triển kém hơn so với M16 , cả 2 chủng đều thuỷ phân tinh bột, phân hủy cellulose, thuỷ phân gelatin, khử nitrat thành nitrit. Chúng phát triển tốt trên cả 2 loại miếng khoai tây, chịu được nồng độ muối 5%. Các đường D- galactose, D- glucose, D- lactose, D- fructose thích hợp cho sự phát triển và tạo nhiều bào tử. Hai chủng này đều phát triển rất yếu với I- inositol và D- mannitol. Chủng M30 không tạo bào tử trên 2 loại đường này. Sự tạo kháng sinh của M. chalcea đã được các nhà nghiên cứu nhắc đến. Năm 1970 Gauze và cộng tác đã phân lập được 1 kháng sinh polypeptid là Chalcidin từ M. chalcea 485. Năm 1976 Hatano và cộng tác cũng tìm được 1 kháng sinh nhóm marclorid là Juvenimicin từ M.chalcea var. izumensis. Hai chất kháng sinh này chỉ có tác dụng với vi khuẩn. Chất kháng sinh do M16 và M30 tạo thành có hoạt tính với cả vi khuẩn Gram(+) & Gram(-) và Candida albicans. Bảng 3: So sánh đặc điểm của 5 chủng Micromonospora phân lập được với đặc điểm của các chủng chuẩn. Chú thích bảng 2; 3: ++ Phát triển tốt. ++ Phát triển khá. + Phát triển yếu (hoặc có kết quả thử dương tính). ± Phát triển không rõ rệt. – Không phát triển (hoặc kết quả thử âm tính). K Không có số liệu. Hình 1: Khuẩn ty cơ chất Micromonospora M14 Hình 2: Khuẩn ty cơ chất Micromonospora M16 Hình 3: Khuẩn ty cơ chất Micromonospora M26 Hình 4: Khuẩn ty cơ chất Micromonospora M30 2.2.5 Nghiên cứu môi trường sinh tổng hợp kháng sinh: Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của năm chủng Micromonospora được thực hiện trên 4 môi trường có nguồn đạm và đường khác nhau và so sánh với môi trường Gauze I. Khả năng sinh tổng hợp sinh kháng sinh được đánh giá bằng đường kính vòng ức chế vi khuẩn chỉ thị B. subtilis ATCC 6633. Kết quả được thể hiện ở bảng 4: Bảng 4: Khả năng tạo kháng sinh của các chủng M14; M16; M26; M30; M47 trên các môi trường (vi khuẩn chỉ thị B. subtilis ATCC 6633). Chủng Micromonospora Môi trường Đường kính vòng vô khuẩn (mm) M14 M16 M26 M30 M47 MT14 14,5 21,5 11,0 13,6 12,2 MT15 10,5 18,4 19,0 12,8 10,9 MT16 11,5 22,3 17,2 11,5 19,4 MT17 15,3 22,5 10,8 12,5 22,7 Gauze I 20,0 20,3 15,5 11,0 24,0 Từ kết quả nghiên cứu chúng tôi sơ bộ nhận thấy rằng khả năng đồng hoá các nguồn đường, đạm cho sự phát triển và sinh tổng hợp kháng sinh của các chủng có khác nhau. Chủng M14 và M47 phát triển tốt trên các môi trường có nguồn đường là các nguyên liệu tự nhiên như bột khoai tây, bột gạo, nhưng khả năng tạo kháng sinh trên môi trường Gauze I là tốt nhất. Điều này chứng tỏ hai chủng này có thể sử dụng nguồn đạm vô cơ là KNO3 cho sự phát triển và sinh tổng hợp kháng sinh. Chủng M26 phát triển mạnh và tạo nhiều bào tử trên môi trường MT 15, sự tạo kháng sinh của chủng trên môi trường này cũng tốt hơn các môi trường khác. Như vậy nguồn carbon là đường đơn (glucose) và nguồn đạm hữu cơ (cao thịt) là thích hợp cho sự phát triển và tạo kháng sinh của chủng M26. Khả năng phát triển và và tạo kháng sinh của 2 chủng M16 và M30 trên các môi trường không có sự khác biệt nhiều, nhưng trên các môi trường có nguồn đạm là các chất hữu cơ thích hợp hơn cho sự sinh tổng hợp sinh kháng sinh của chúng. Đặc biệt là chủng M16 cũng cho hoạt tính kháng sinh cao trong môi trường có nguồn đạm tự nhiên là cao ngô (MT 16). Trên đây là mới là những kết quả sơ bộ ban đầu của chúng tôi. Quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Micromonospora là một vấn đề quan trọng cần phải được nghiên cứu sâu. Ngoài 2 thành phần là đường và đạm, các nguyên tố khoáng và nguyên tố vi lượng trong môi trường nuôi cấy cũng đóng vai trò quan trọng. Các nguyên tố này tham gia vào thành phần men, hoạt hoá men, thúc đẩy quá trình chuyển hoá của vi sinh vật. Vì thời gian có hạn, hơn nữa do giới hạn của khoá luận, và những lĩnh vực chuyên môn chúng tôi không có điều kiện nghiên cứu sâu hơn. Hình 5: Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng M47 trên các môi trường Phần 3 : Kết luận và đề xuất 1. Từ bùn hồ Bẩy Mẫu (Hà Nội) chúng tôi đã phân lập được 67 chủng xạ khuẩn. Trong đó có 47 phân lập Micromonospora và 20 là Streptomyces. Như vậy trong bùn hồ số Micromonospora chiếm đa số so với Streptomyces; số lượng cá thể trong 1g mẫu khá cao (0,8.105 đến 3,0.105). 2. 47 chủng Micromonospora được thử hoạt tính kháng sinh trên các vi khuẩn Gram(+), Gram(-) và Candida albicans. 40% số phân lập có hoạt tính kháng sinh ở các mức độ khác nhau. 25% số chủng có hoạt tính có phổ kháng khuẩn rộng; 1,5% kháng nấm C. albicans. 3. 5 chủng Micomonospora có hoạt tính kháng sinh tốt đựơc nghiên cứu phân loại . - Chủng M14 và M47 có nhiều đặc điểm giống nhau và tương tự loài Micromonospora narashino. Hai chủng này cho._.