Phân lập, chọn lọc các chủng vi sinh vật hữu ích sử dụng trong sản xuất chế phẩm vi sinh tổng hợp xử lý độn lót chuồng trong chăn nuôi gà tập trung

…………………… i LỜI CAM ðOAN Tơi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác. Tơi xin cam đoan rằng mọi thơng tin trích dẫn trong luận văn này đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả Lê Thị Thắm Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… ii LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài tốt nghiệp, tơi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ quý báu của nhà trường,khoa Chăn nuơi và nuơi trồng thủy sản , Viện đào tạo sau đại học , của các thầy giáo, cơ giáo và các bạn đồng nghiệp. Tơi xin trân trọng bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Thầy PGS.TS Bùi Quang Tuấn, Thầy đã động viên, hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tơi trong suốt thời gian tơi thực hiện luận văn tốt nghiệp. Tơi xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cơ giáo trong Bộ mơn Dinh dưỡng - Thức ăn, Khoa Chăn nuơi và Nuơi trồng thủy sản, Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội đã đĩng gĩp ý kiến và chỉ bảo để luận văn của tơi được hồn thành. Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới Ban Giám hiệu, Viện ðào tạo Sau đại học đã quan tâm, tạo điều kiện giúp đỡ tơi trong suốt thời gian hoc tập và nghiên cứu tại trường. Tơi xin cảm ơn cơ quan, các bạn đồng nghiệp và gia đình đã thường xuyên động viên, khích lệ, tạo điều kiện cho tơi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp. Tác giả Lê Thị Thắm Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng v Danh mục hình vi Phần I MỞ ðẦU 1 1.1. ðặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3. Yêu cầu 3 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. ðẶC ðIỂM SINH HỌC CỦA NẤM MEN 4 2.1.1. Phân loại nấm men 4 2.1.2. ðặc điểm hình thái, cấu tạo, sinh sản và thành phần của nấm men 4 2.1.3. Dinh dưỡng của nấm men 7 2.1.4 Cơ sở của việc sử dụng nấm men trong sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ chăn nuơi 9 2.2. ðẶC ðIỂM CHUNG CỦA VI KHUẨN LACTIC 10 2.2.1. Phân loại 10 2.2.2. Lên men lactic 12 2.2.3. Các chế phẩm sinh học cĩ chứa vi khuẩn lactic sử dụng trong chăn nuơi 14 2.2.4. Các hoạt chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic 16 2.3. CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG XỬ LÝ CHẤT THẢI ðỘNG VẬT 19 2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ðỘN LĨT CHUỒNG LÊN MEN TRONG CHĂN NUƠI 23 Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… iv 2.4.1. Tình hình nghiên cứu ngồi nước 23 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 29 Phần III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 33 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.2.1. ðối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 33 3.2.2. Nguyên vật liệu 33 3.2.3. Quy trình phân lập và chọn lọc các chủng vi sinh vật 34 3.3. XỬ LÝ SỐ LIỆU 40 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 4.1. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN 41 4.1.1. Phân lập các chủng nấm men 41 4.1.2. ðịnh giống các chủng nấm men 42 4.2. CHỌN LỌC CÁC CHỦNG NẤM MEN THÍCH HỢP ðỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH TỔNG HỢP 46 4.2.1. Kết quả xác định khả năng phân giải tinh bột 46 4.2.2. Kết quả xác định khả năng phân giải protein 48 4.2.3. Khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt dộ khác nhau 50 4.2.4. Khả năng sinh trưởng và khả năng tạo sinh khối trên các mơi trường nuơi cấy khác nhau 53 4.3. PHÂN LẬP VÀ ðỊNH LOẠI CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC HỮU ÍCH 56 4.3.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn lactic 56 4.3.2. ðịnh giống các chủng vi khuẩn lactic 58 4.4. CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC THÍCH HỢP ðỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH TỔNG HỢP 64 4.4.1. Xác định khả năng sinh axit lactic và phân giải protein 64 4.4.2. Xác định khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh 67 Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… v 4.4.3. Xác định khả năng sinh trưởng ở các mức nhiệt độ khác nhau 69 Phần V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 73 5.1. Kết luận 73 5.1.1. Phân lập các chủng nấm men và định loại 73 5.1.2. Chọn các chủng nấm men thích hợp để sản xuất chế phẩm sinh học 73 5.1.3. Phân lập các chủng vi khuẩn lactic và định loại 73 5.1.4. Chọn các chủng vi khuẩn lactic thích hợp để sản xuất chế phẩm sinh học 74 5.2. Tồn tại và ðề nghị 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic và cơ chế tác động 17 Bảng 4.1. Kết quả phân lập nấm men 41 Bảng 4.2. Xác định giống các chủng nấm men phân lập (theo hệ thống phân loại của Lodder, 1971) 43 Bảng 4.3. Xác định lại kết quả phân loại giống Saccharomyces 45 Bảng 4.4. Khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm men 47 Bảng 4.5. Khả năng phân giải protein của các chủng nấm men 49 Bảng 4.6. Khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men ở các mức nhiệt độ khác nhau 51 Bảng 4.7. Khả năng sinh trưởng và tạo sinh khối trên các mơi trường nuơi cấy khác nhau 54 Bảng 4.8. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn lactic 56 Bảng 4.9. ðặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn lactic được phân lập 59 Bảng 4.10. ðặc tính sinh lý, sinh hĩa của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được 61 Bảng 4.11. Kết quả định danh các chủng vi khuẩn lactic 63 Bảng 4.12. Khả năng phân giải protein và sinh axit lactic của các chủngvi khuẩn lactic 65 Bảng 4.13. Khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic 68 Bảng 4.14. Khả năng sinh trưởng ở các mức nhiệt độ khác nhau 70 Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… vii DANH MỤC HÌNH Hình 4.1. Sinh sản nảy chồi 43 Hình 4.2. Hình thành khuẩn ty giả 43 Hình 4.3. API® 20 CAUX test kit sau 72 giờ kiểm tra 45 Hình 4.4. Khả năng phân giải tính bột 48 Hình 4.5. Kết quả phản ứng catalaza 57 Hình 4.6. API test kit lúc 0h và sau 48h nuơi cấy 64 Hình 4.7. Khả năng phân giải protein của các chủng vi khuẩn lactic 67 Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Bánh men Hà Nam HN Bánh men Hải Dương HD Bánh men Gia Lâm GL Bánh men Bắc Ninh BN Bánh men Hà Tây cũ HT Sữa chua nếp cẩm SC Men bánh mì BM Nem chua NE Dưa muối ND Gấc ủ chua NG Sữa chua Vinamilk VN Sữa chua Ba Vì BV Sữa chua nếp cẩm SNC Yomost YM Elovi EV Wellyo WY Men sống Probio PR Bioacimin BA Biosubtyl BS Bioneo plus BN Lactophyl LP Biolactyl BL Mayonnaise MA Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 1 Phần I MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn đề Hiện nay ngành chăn nuơi truyền thống nĩi chung và chăn nuơi gà nĩi riêng đang phải đối mặt với một vấn đề rất nan giải đĩ là gây ra sự ơ nhiễm nghiêm trọng mơi trường khơng khí và nước. Mức ơ nhiễm nước thải chăn nuơi gia cầm được xác định vượt giới hạn cho phép hàng trăm lần như mức nhiễm Colifom vượt theo tăng dần theo quy mơ nơng hộ - gia trại – trang trại là 114,24 lần – 108,5 lần – 187,5 lần. Hàm lượng các khí độc tại khu vực cĩ chăn nuơi được xác định gấp 11,2 – 15 lần giới hạn cho phép và tăng dần ở quy mơ lớn. ðộ nhiễm khuẩn khơng khí cũng cao dần theo quy mơ và vượt giới hạn từ 19,72 lần đến 25,2 lần. Sự ơ nhiễm đã tạo ra mùi hơi, khí độc và ruồi muỗi trong chuồng nuơi, dễ phát sinh dịch bệnh, do đĩ làm tăng chi phí thuốc thú y, con vật chậm lớn, chi phí thức ăn cao, chất lượng sản phẩm kém, hiệu quả kinh tế thấp và ảnh hưởng đến sức khoẻ của con người (Drummon và cs. 1980, Attar và Brake, 1988). Trong chăn nuơi gà, do xử lý khơng tốt nên khí NH3, H2S ... thối, độc phát tán, gây bệnh đường hơ hấp cho gà đẻ trứng, tỷ lệ đẻ giảm thấp; một số cơ sở cĩ mơi trường nuơi dưỡng kém, tỷ lệ mắc bệnh mãn tính cao. Tỷ lệ chết trong suốt quá trình chăn nuơi lên tới 35% (Wathes, 1998). Một số biện pháp xử lý ơ nhiếm đã và đang sử dụng như thu gom chất thải hàng ngày, dọn rửa chuồng, sử dụng bể biogas, ủ phân, làm thức ăn cho cá ... đã phần nào giải quyết được vấn đề phân và chất thải chăn nuơi. Tuy nhiên trong chăn nuơi trang trại với số lượng lớn cũng khơng thể giải quyết sự lên men hết số lượng phân và nước thải rửa chuồng nuơi, hơn nữa biện pháp này cũng rất tốn nước và nhân cơng. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 2 Vì vậy, để cĩ thể xử lý phân, chất thải chăn nuơi một cách triệt để, tạo mơi trường trong sạch mà khơng phải tốn tiền và nhân cơng, khơng phải thực hiện hàng ngày thì một trong những giải pháp hiệu quả là sử dụng chế phẩm vi sinh vật để xử lý chất độn lĩt nền chuồng nuơi, nhằm làm giảm mùi hơi, phân huỷ phân, chất thải ngay tại chỗ. Vì vậy, để cĩ thể xử lý phân, chất thải chăn nuơi một cách triệt để, tạo mơi trường trong sạch mà khơng tốn tiền và nhân cơng, khơng phải thực hiện hàng ngày thì một trong những giải pháp hiệu quả là sử dụng chế phẩm vi sinh vật để xử lý độn lĩt nền chuồng nuơi, nhằm làm giảm mùi hơi, phân hủy phân, chất thải ngay tại chỗ. Việc sử dụng chế phẩm vi sinh này đem lại những lợi ích sau: - Làm giảm phân, giảm mùi hơi thối, giảm khí độc trong chuồng nuơi, tạo mơi trường sống tốt cho gà, cải thiện mơi trường sống cho người lao động; - Giảm tỷ lệ mắc bệnh đặc biệt là bệnh đường hơ hấp. Tỷ lệ chết và đào thải giảm; tăng chất lượng thịt, trứng: tỷ lệ nạc cao, giá trị dinh dưỡng lớn, giảm tồn dư kháng sinh; - Tăng hiệu quả kinh tế: Chu kỳ nuơi so với bình thường ngắn, rủi ro ít, lợi nhuận cao (giảm cơng lao động và giảm chi phí cho thay độn lĩt chuồng, giảm cơng và chi phí trong việc chữa trị con vật bị bệnh, giảm chi phí thức ăn…), thu hồi vốn nhanh và nhiều lợi ích khác. ðể cĩ được chế phẩm vi sinh tốt, đạt được mục tiêu đề ra cần phải từng bước thực hiện hai cơng việc cơ bản là: chọn lọc giống vi sinh vật và xây dựng quy trình sản xuất. ðĩ là cơ sở để chúng tơi thực hiện đề tài: “Phân lập, chọn lọc các chủng vi sinh vật hữu ích sử dụng trong sản xuất chế phẩm vi sinh tổng hợp xử lý độn lĩt chuồng trong chăn nuơi gà tập trung” 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Chọn lọc được các chủng vi sinh vật hữu ích từ bánh men rượu, các sản phẩm lên men, các sản phẩm thương mại cĩ chứa vi sinh vật hữu ích để sử Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 3 dụng trong sản xuất chế phẩm vi sinh tổng hợp xử lý độn lĩt chuồng trong chăn nuơi gà tập trung. 1.3. Yêu cầu Các chủng nấm men được chọn lọc phải đáp ứng các tiêu chí sau: - Cĩ khả năng phân giải tinh bột, protein cao; - Cĩ khả năng thích ứng với mơi trường, sinh trưởng tốt ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Các chủng vi khuẩn được chọn lọc phải đáp ứng các tiêu chí sau: - Cĩ khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh, gây thối trong chuồng nuơi như E. coli, Salmonella …; - Cĩ khả năng sinh axit lactic cao; - Cĩ khả năng thích ứng với mơi trường, sinh trưởng tốt ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 4 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. ðẶC ðIỂM SINH HỌC CỦA NẤM MEN 2.1.1. Phân loại nấm men Thuật ngữ Nấm men (yeast, levure) chỉ là tên chung để chỉ nhĩm vi nấm thường cĩ cấu tạo đơn bào và thường sinh sơi nảy nở bằng phương pháp nảy chồi (budding). Nấm men khơng thuộc về một taxon phân loại nào nhất định, chúng cĩ thể thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota) hoặc ngành Nấm đảm (Basidiomycota). Muốn phân loại nấm men người ta thường dựa vào đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý của nấm men. Căn cứ vào đặc điểm hình thái học cĩ thể xác định được tới giống men, cịn muốn phân loại chi tiết hơn cần căn cứ vào đặc tính sinh lý. Theo Lodder J. (1971) nấm men được chia thành 39 giống thuộc 3 họ. ðĩ là: - 22 giống trong họ Endomycetdaceae (Lớp nang khuẩn gồm các nấm men sinh bào tử). Một số giống phổ biến như Endomycopsis, Saccharomyces, Pichia, Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces. - 5 giống trong họ Sporobolomycetaceae (Lớp nấm bất tồn sinh bào tử bắn). Một số giống phổ biến như Rhodosponidium, Sporobolomyces - 12 giống trong họ Criptococcaceae (Lớp nấm bất tồn khơng sinh bào tử) trong đĩ cĩ một số giống phổ biến như Torulopsis, Candida, Pityrosporon, Trigonopsis, Cryptococcus. Cách phân loại này đã được sử dụng rộng rãi cho đến nay vì nĩ đã tổng kết lại một cách khá hồn thiện vấn đề phân loại nấm men của các tác giả trước. 2.1.2. ðặc điểm hình thái, cấu tạo, sinh sản và thành phần của nấm men 2.1.2.1. ðặc điểm hình thái, cấu tạo và sinh sản a. Hình thái, cấu tạo Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 5 Nấm men thường cĩ hình cầu hoặc hình bầu dục, một số loại cĩ hình que và một số hình dạng khác. Kích thước trung bình của nấm men là 3-5 x 5- 10µm. Cấu tạo tế bào của nấm men gồm thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân, khơng bào và các hạt dự trữ. b. Sinh sản của nấm men Tế bào men rượu sản sinh rất nhanh, chỉ trong thời gian ngắn đã sinh ra trong mơi trường một sinh khối rất lớn. Chính vì vậy tốc độ sinh sản và tổng lượng tế bào là những chỉ tiêu cần thiết để chọn giống nấm men tốt. Cho đến nay người ta thấy rằng nấm men khơng chỉ sinh sản bằng hình thức vơ tính mà cịn khả năng sinh sản bằng hình thức hữu tính. Sinh sản vơ tính: Gồm hai hình thức là tự phân và gián phân: Tự phân (amutoz): Nhân bắt đầu chia làm hai và sau đĩ chia tế bào men làm hai phần. Gián phân (mutoz): Là hình thức sinh sản mọc chồi. Tế bào men tạo thành chồi, chồi lớn dần lên và tách khỏi tế bào mẹ trở thành tế bào độc lập. Nảy chồi là cách sinh sản vơ tính điển hình của nấm men. Khi đĩ thành tế bào mở ra để tạo ra một chồi (bud). Chồi phát triển thành tế bào con và cĩ thể tách khỏi tế bào mẹ ngay từ khi cịn nhỏ hoặc cũng cĩ thể vẫn khơng tách ra ngay cả khi lớn bằng tế bào mẹ. Nhiều khi nhiều thế hệ vẫn dính vào một tế bào đầu tiên nảy chồi và tạo thành một cành nhiều nhánh tế bào trong giống như cây xương rồng. Chồi cĩ thể mọc ra theo bất kỳ hướng nào (nảy chồi đa cực - multilateral budding) hoặc chỉ nảy chồi ở hai cực (nảy chồi theo hai cực - Bipolar budding) hoặc chỉ nảy chồi ở một cực nhất định (nảy chồi theo một cực - monopolar budding). Nấm men cịn cĩ hình thức sinh sản phân cắt như vi khuẩn. Cĩ thể hình thành một hay vài vách ngăn để phân cắt tế bào mẹ thành những tế bào phân cắt (fission cells). ðiển hình cho kiểu phân cắt này là các nấm men thuộc chi Schizosaccharomyces. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 6 Dạng sinh sản hữu tính ở nấm men là dạng các bào tử túi (ascospore) được sinh ra từ các túi (asci). Cĩ thể xảy ra sự tiếp hợp (conjugation) giữa hai tế bào nấm men tách rời hoặc giữa tế bào mẹ và chồi. Nếu 2 tế bào nấm men cĩ hình thái kích thước giống nhau tiếp hợp với nhau thì được gọi là tiếp hợp đẳng giao. Nếu 2 tế bào nấm men khác nhau thì gọi là tiếp hợp dị giao. Cịn cĩ cả sự biến nạp trực tiếp trong 1 tế bào sinh dưỡng (vegetative cell), tế bào này biến thành túi khơng qua tiếp hợp (unconjugated ascus). Thường trong mỗi túi cĩ 4 hay đơi khi cĩ 8 bào tử túi. Trong một số trường hợp lại chỉ cĩ 1- 2 bào tử túi. Bào tử túi ở chi Saccharomyces cĩ dạng hình cầu, hình bầu dục; ở chi Hanseniaspora và lồi Hansenula anomala cĩ dạng hình mũ; ở lồi Hansenula saturnus bào tử túi cĩ dạng quả xồi giữa cĩ vành đai như dạng Sao Thổ. Một số bào tử túi cĩ dạng kéo dài hay hình xoắn… Bề mặt bào tử túi cĩ thể nhẵn nhụi, cĩ thể xù xì hoặc cĩ gai… Bào tử màng dày (hay bào tử áo - Chlamydospore) là dạng bào tử giúp nấm men vượt qua được điều kiện khĩ khăn của ngoại cảnh, chứ khơng phải là hình thức sinh sản. Một số nấm men cịn cĩ thể sinh vỏ nhày. Trong chu trình sống của nhiều lồi nấm men, cĩ sự kết hợp các hình thức sinh sản khác nhau. Sau đây là quá trình sinh sản của Saccharomyces serevisiae - một lồi nấm men phân bố rộng rãi trong thiên nhiên. Chu trình sống của nấm men này cĩ 2 giai đoạn đơn bội và lưỡng bội. ðầu tiên tế bào sinh dưỡng đơn bội (n) sinh sơi nảy nở theo lối nảy chồi. Sau đĩ 2 tế bào đơn bội kết hợp với nhau, cĩ sự trao đổi của tế bào chất và nhân hình thành tế bào lưỡng bội (2n). Tế bào lưỡng bội lại nảy chồi (sinh sản sinh dưỡng) thành nhiều tế bào lưỡng bội khác, cuối cùng hình thành hợp tử. Nhân của hợp tử phân chia giảm nhiễm thành 4 nhân đơn bội. Mỗi nhân đơn bội được bao bọc nguyên sinh chất, hình thành màng, tạo thành 4 bào tử nằm trong một túi gọi là bào tử túi. Khi túi vỡ, bào tử ra ngồi phát triển thành tế bào dinh dưỡng và lại phân chia theo lối này rồi tiếp tục chu trình sống. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 7 Ngồi hình thức sinh sản như ở S. serevisiae, một số lồi nấm men khác cĩ những hình thức sinh sản về cơ bản cũng giống như trên nhưng cĩ một số sai khác. Ví dụ như là Schizosaccharomyces octosporus hợp tử lưỡng bội phân chia 3 lần, lần đầu giảm nhiễm sinh ra 8 bào tử nằm trong nang. 2.1.2.2. Thành phần hĩa học của tế bào nấm men Về mặt chất thành phần hĩa học của nấm men tương đối ổn định, song về mặt lượng thì tùy theo điều kiện dinh dưỡng và giai đoạn phát triển mà cĩ sự biến đổi cơ bản. Thành phần nấm men bao gồm: nước (68-75%), protein (13-14%), carbohydrat (6-8%), xenluloza (1,8%), lipit (0,9%), khống (1,77%). ðiều quan trọng và đáng lưu ý nhất là thành phần nấm men chứa khá đầy đủ axit amin khơng thay thế và hàm lượng vitamin khá cao. Tùy thuộc vào điều kiện nuơi cấy, nấm men cĩ thành phần hĩa học khác nhau nhưng nĩi chung các chế phẩm men gia súc (độ ẩm 8%) thường chứa khoảng (48-52%) protein, 13-16% (carbohydrat), 2-3% (lipit), 22-40% (chất chiết khơng nitơ) và một tập hợp vitamin thuộc nhĩm B. Trong tế bào nấm men chứa khoảng 6,5-12% các chất khống. Ngồi ra trong tế bào nấm men cịn chứa phong phú các loại nguyên tố vi lượng. Lượng chứa axit nucleic trong tế bào nấm men thay đổi tùy theo giai đoạn phát triển của chúng, nhìn chung lượng ADN khá ổn định, lượng chứa ARN thường đạt đến mức cao nhất (11,1-11,7% trọng lượng khơ) ở giai đoạn logarit của quá trình phát triển. Nĩi chung nấm men cĩ giá trị dinh dưỡng cao hơn tất cả các loại thức ăn gia súc cĩ nguồn gốc thực vật. 2.1.3. Dinh dưỡng của nấm men Muốn tạo được tế bào nấm men cần cĩ các nguyên tố: C, N, S, P, K, Ca, Mg, Fe và một số nguyên tố khác. Do đĩ nguồn dinh dưỡng cho sự phát triển Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 8 của nấm men cần cĩ các nguyên tố trên tham gia dưới hình thức các hợp chất hĩa học. Nguồn dinh dưỡng chủ yếu của nấm men đáng kể trước tiên là carbohydrat, nĩ là nguồn năng lượng chủ yếu cung cấp cho hoạt động sống của nấm men, quá trình chuyển hĩa đường thành rượu và CO2 (hoặc CO2 và nước) giải phĩng ra một năng lượng khá lớn thỏa mãn yêu cầu của tế bào. Ngồi ra nĩ cịn tham gia vào cấu tạo tế bào, đồng thời qua các quá trình chuyển hĩa trung gian thường hình thành các hợp chất khác. Sự lợi dụng các hợp chất carbohydrat ở các loại nấm men khác nhau thì khác nhau. Những hợp chất như cyclo hexan, cyclo hexanol, maleic axit, ethylen glycol, methanol và anton được coi là những hợp chất bất khả xâm phạm của tất cả các loại nấm men. Những hợp chất được một vài nấm men sử dụng là maloic, lacvunilie, axit ascorbic. Nhiều nấm men cĩ thể lợi dụng được fumaric, malic và axit glutamic. Các hợp chất được nhiều loại nấm men sử dụng và cĩ giá trị nhiều trong phân loại là: xyloza, arabinoza, adonitol, dulutol, mannitol, sorbitol, salicin và muối của axit glutamic. Tất nhiên là chúng cũng lợi dụng các hexoza thường dùng, disaccharit và saccharit. Hợp chất được đa số nấm men sử dụng nên khơng cĩ giá trị trong phân loại là: ethanol, axit purovic và glycerol. Nguồn nitơ cho nấm men sinh trưởng là hợp chất chứa nitơ đơn giản như NH3, nitrat, axit amin, và hợp chất phức tạp như peptit, protein. Khả năng lợi dụng các chất chứa nitơ ở các nấm men khác nhau cũng khơng thống nhất. hầu hết các chủng của giống Saccharomyces, Pichia, Dibariomyses, Hanseniaspura khả năng đồng hĩa nitrat rất kém. Trái lại những Hansennula đồng hĩa nitrat khá cao. Hơn nưa nấm men cĩ thể sử dụng nitơ từ những hợp chất vơ cơ để tổng hợp nên axit amin của bản thân. Bên cạnh nguồn dinh dưỡng chủ yếu là Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 9 carbohydrat và hợp chất chứa nitơ, các chất khống cũng đĩng vai trị khá quan trọng, đặc biệt là K, P, Mg, Cs, Fe… Các chất khống cũng cần cĩ một tỷ lệ nhất đinh và giữa chúng cĩ sự tương quan cân xứng trong thành phần mơi trường nuơi cấy nấm men. Hoạt động sống của vi sinh vật nĩi chung, nấm men nĩi riêng bình thường khi mơi trường nuơi cấy cĩ đủ vitamin cần thiết. Trong thành phần tế bào vitamin tham gia vào nhĩm ghép của men, tham gia tổng hợp nucleprotit và quá trình trao đổi chất của tế bào. Một số loại nấm men rất nhạy cảm với vitamin nên người ta ứng dụng để định lượng vitamin. Vitamin cần thiết cho nấm men gồm: B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8, B9, B10, B11, B12… 2.1.4 Cơ sở của việc sử dụng nấm men trong sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ chăn nuơi Nấm men là nhĩm vi sinh vật được con người sử dụng sớm nhất trong chế biến thực phẩm. Hàng nghìn năm trước cơng nguyên con người đã biết sử dụng quá trình lên men để sản xuất rượu, làm bánh mì. Ngày nay, rất nhiều nhà máy với qui mơ lớn đã sử dụng vi sinh vật nĩi chung và nấm men nĩi riêng để sản xuất các sản phẩm quan trọng như cồn, axeton, glyxerin mà cịn được sử dụng rộng rãi trong cơng nghệ chế biến thực phẩm như sản xuất rượu, làm nở bột mì, trong sản xuất bánh mì, chế tạo các sản phẩm lên men như rượu sữa kefir (Tây Nam Á), Johurt (Thổ Nhĩ Kỳ), rượu sake (Nhật Bản), nước chấm lên men moromi (Nhật Bản)… Ngồi ra, người ta cịn sử dụng nấm men để sản xuất sinh khối nấm men giàu protein, cịn gọi là protein đơn bào (S.C.P-Single Cell Protein) hay dùng nấm men trong việc làm giàu protein cho các nguyên liệu giàu tinh bột, các phế phụ phẩm của ngành cơng nơng nghiệp để chăn nuơi gia súc. Dùng nấm men để lên men trực tiếp thức ăn cho gia súc (phương pháp ủ men) hay sản xuất chế phẩm sinh học như men tiêu hĩa dùng cho lợn con. Việc sử dụng nấm men trong sản xuất và chế biến thức ăn gia súc dựa trên những đặc điểm cơ bản của nấm men: Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 10 - Chủng loại nấm men nhiều, đa dạng trong chuyển hĩa và tổng hợp các hợp chất hữu cơ. ða dạng hĩa về điều kiện sống (nhiệt độ, độ ẩm, độ pH, áp suất, khơng khí, thành phần dinh dưỡng…) nên cĩ thể dễ dàng chọn được các chủng nấm men cĩ khả năng thích ứng với qui trình sản xuất và đáp ứng được yêu cầu về sản phẩm mà thực tế sản xuất địi hỏi. - Nấm men cĩ tốc độ phát triển cực kỳ nhanh chĩng. ðể tăng đơi khối lượng cơ thể thì nấm men chỉ cần từ 1-2 giờ, vi khuẩn cần 20-60 phút, nấm sợi cần 4-12 giờ. Trong khi đĩ gà con cần 200 giờ, lợn con cần 600 giờ, bê nghé cần 1500 giờ (Nguyễn Lân Dũng, 1986) - Nấm men cĩ khả năng phát triển trên nhiều nguồn dinh dưỡng khác nhau, cho phép người ta sử dụng các nguồn dinh dưỡng sẵn cĩ, rẻ tiền mà con người khơng thể sử dụng làm thực phẩm để sản xuất sản phẩm từ nấm men sẽ tăng được số lượng và giảm được giá thành. - Chỉ cĩ một số lồi gây bệnh cho động thực vật như Candida albicus, cịn hầu hết nấm men khơng sinh độc tố trong mơi trường tự nhiên cũng như mơi trường nhân tạo như nấm mốc và vi khuẩn. - Nấm men cũng như vi sinh vật dễ gây đột biến bằng tác nhân vật lý, hĩa học. Do đĩ cĩ thể dùng cơng nghệ di truyền để biến đổi đặc điểm sinh học nấm men theo hướng cĩ lợi - Giá trị dinh dưỡng của nấm men rất lớn, đặc biệt là hàm lượng protein, các axit amin và vitamin nhĩm B trong tế bào rất cao và dễ hấp thu. - Với đặc điểm sinh lý của nấm men dễ dàng thiết lập dây truyền cơng nghệ cao để khai thác sản phẩm từ nấm men nhằm phục vụ cho thực tiễn sản xuất 2.2. ðẶC ðIỂM CHUNG CỦA VI KHUẨN LACTIC 2.2.1. Phân loại Từ xa xưa con người đã biết lợi dụng quá trình lên men để chế biến và bảo quản thực phẩm như muối dưa, cà; chế biến bơ, fomat…Các vi sinh vật cĩ kiểu lên men này được gọi là các vi khuẩn lactic do chúng cĩ khả năng lên Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 11 men sản sinh axit lactic làm đơng vĩn sữa. Vì vậy chúng cịn được gọi là “các vi sinh vật gây chua sữa”. Năm 1909, Orla Jensen đã xếp chung nhĩm các vi khuẩn lactic vào họ Lactobacteriaceae dựa vào các đặc điểm chung của nhĩm như chỉ sản sinh axit lactic hoặc axit lactic và axetic, rượu, CO2. Theo phân loại của Bergey thì vi khuẩn lactic được xếp vào các giống và giống phụ sau đây: Vi khuẩn lactic thường ít phát hiện thấy trong đất và trong nước, thường phát hiện trong sữa và các chế phẩm của sữa: Lactobacillus (L.) casei, L. lactic, L. fermenti, Streptococcus lactic, Strep. diacetylacetic; cĩ thể thấy trong thực vật hoặc xác thực vật như L. delbrucki, L. fermeti, L. brevis, Strep. lactic, L. plantarum; vi khuẩn lactic cịn thấy trong ruột người và động vật như L. acidophylus, Bifidobacterium, Strep. faecalis, Strep. salivarus, Strep. bovis, Strep. pyogenes. Mặc dù các nhĩm vi khuẩn này khơng đồng nhất về mặt hình thái (gồm tất cả các vi khuẩn dạng que ngắn, que dài, lẫn các vi khuẩn hình cầu) song về mặt sinh lý chúng lại tương đối đồng nhất. Tất cả đều là vi khuẩn Gram dương, khơng tạo thành bào tử (kể cả Sporoalactobacillus inulinus) và hầu Họ Lactobacteriaceae Họ phụ Streptococcaceae Họ phụ Lactobacteriaceae Họ Streptococus Họ Leuconostoc Giống Lactobacteriaceae Giống phụ Thesmobacterium Giống phụ Betabacterium Giống phụ Treptobacterium Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 12 hết khơng di động. Thu nhận năng lượng nhờ carbohydrat và tiết ra axit lactic. Các vi khuẩn lactic là nhĩm lên men bắt buộc, chúng khơng chứa các xitocrom và men catalaza, tuy nhiên chúng cĩ thể sinh trưởng được khi cĩ mặt của oxy. ðĩ là nhĩm sống từ kỵ khí đến vi khuẩn hiếu khí. Vi khuẩn lactic cĩ thể dễ dàng lên men các loại đường đơn (glucoza, levuloza, galactoza, mantoza), cịn các đường kép (dextrin, tinh bột, Inulin…) thì chỉ được lên men lactic bởi một vài loại vi khuẩn. Vi khuẩn lactic thường địi hỏi các thức ăn đạm hữu cơ (protein, peptit, axit amin) chỉ cĩ một số lồi cĩ khả năng sinh trưởng cĩ đạm vơ cơ. Vì thế người ta hay nuơi cấy trên các mơi trường phức tạp chứa một số lượng tương đối lớn cao nấm men, dịch cà chua hoặc thậm chí máu. ðiều đáng ngạc nhiên là một số vi khuẩn lactic khi sinh trưởng trên mơi trường chứa máu cĩ thể tạo thành xitocrom và thậm chí tiến hành cả quá trình photphoryl hĩa chuỗi hơ hấp. Rõ ràng vi khuẩn lactic khơng cĩ khả năng tổng hợp photphoryl, song nếu bổ sung các photphoryl vào mơi trường nuơi cấy chúng thì một số vi khuẩn cĩ thể tạo nên sắc tố hermin tương ứng. Muốn phát triển bình thường vi khuẩn lactic thường địi hỏi một số chất sinh trưởng; cĩ những loại vi khuẩn lactic (L. leichmannii, L. casei, L. arabinosus,…) tính mẫn cảm rất cao với một số loại chất sinh trưởng nào đĩ. Người ta thường sử dụng chúng để định lượng các chất sinh trưởng này. 2.2.2. Lên men lactic Lên men lactic là quá trình chuyển hĩa kỵ khí đường với sự tích lũy axit lactic. Trong thực tiễn người ta đã biết đến hiện tượng này từ lâu và đã sử dụng rộng rãi để chế biến các loại thức ăn chua (làm sữa chua, dưa muối, cà muối…) ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc để sản xuất axit lactic và các loại lactat. Năm 1780 nhà khoa học Thụy ðiển Scheele lần đầu tiên đã tách được axit lactic từ sữa bị lên men chua. Năm 1857 Pasteur đã chứng minh rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhĩm vi sinh vật đặc biệt gọi Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 13 là vi khuẩn lactic. Năm 1878 Lister phân lập thành cơng vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactis (hiện nay gọi là Streptococcus lactis) về sau các nhà khoa học liên tiếp phân lập được nhiều loại vi khuẩn lactic khác nhau. Cơng nghiệp lên men để sản xuất axit lactic cĩ thể nĩi đã được hình thành từ năm 1881. Tùy theo các sản phẩm sinh ra trong quá trình lên men mà người ta chia làm hai loại: lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình. a. Lên men lactic đồng hình Sản phẩm lên men chỉ là axit lactic cũng cĩ thể thấy xuất hiện một lương rất nhỏ axit bay hơi, rượu etylic và một số sản phẩm khác. Các vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải glucoza theo con đường EMP, hình thành axit như sơ đồ sau: Tùy thuộc vào tính chuyển hĩa khơng gian của men xúc tác cho phản ứng này là lctathydrogenaza, và tùy thuộc vào sự tồn tại của một men lactatraxemaza mà cĩ thể xuất hiện các axit lactic dạng D(-), L(+) hay DL. Chỉ cĩ một phần nhỏ pyruvat được decacboxyl hĩa và chuyển thành axit axetic, etanol và CO2 cũng thành axeton. Mức độ tạo thành sản phẩm này rõ ràng phụ thuộc vào sự cĩ mặt của oxy. b. Lên men lactic dị hình Sản phẩm sinh ra ngồi axit lactic cịn cĩ một lượng tương đối lớn các chất như axit axetic, rượu etylic, glyxerin và CO2: Glucoza 2Pyruvat + 2ATP + 2NAD.H2 COOH CO CH3 Pyruvat COOH CHOH CH3 Axit lactic NAD.H2 NAD Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 14 ðơi khi trong quá trình lên men lactic khơng đồng hình người ta thấy xuất hiện cả axetilmethylcacbinol và diaxetyl. Các sản phẩm này cĩ thể sinh ra từ axetaldehyd - sản phẩm trung gian của quá trình lên men lactic khơng điển hình. Các vi khuẩn lactic dù lên men đồng._. hình hay dị hình thì sản phẩm cuối cùng vẫn là axit lactic. Sự khác biệt về đặc điểm lên men cũng như đặc điểm sống khơng chỉ ở giữa các lồi mà trong cùng một giống cũng cĩ sự khác nhau. 2.2.3.Các chế phẩm sinh học cĩ chứa vi khuẩn lactic sử dụng trong chăn nuơi Cĩ thể kể đến rất nhiều sản phẩm Probiotic từ vi khuẩn Lactic được sản xuất và sử dụng khá phổ biến hiện nay trong phịng và trị rối loạn tiêu hĩa và tiêu chẩy với các tên thương phẩm khác nhau như: - Biolactyl I: Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus casei. Do D.B.Pharma France sản xuất. Thành phần chứa 1.106tees baof/g. Ngoaif ra cịn cĩ Biolactyl của cơng ty Porvinks International Berkshre England - Lactobacilli acidophile của hãng DB Pharma Paris – France sản xuất. - Antibio (Lyonphylized antibiotic resistant lactobacilli): Thành phần Lactobacillus acidophillus (1.108 tế bào/g ). Do Hanwha Pharma Co,Ltd Seoul Korea sản xuất theo nhượng quyền của N.V. Organo Oss Holland. - Lactomed: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bifidus, Streptococcus feacalis (6.106/viên 200mg). Do Ildong Phảm Co.Ltd Soul Korea sản xuất. - Lacteol Fort: Lactobacillus acidophillus (10billions) - Lactomin Plus: Lactobacillus acidophillus, Bifidobacterium longgum, streptococcus feacalis. Chứa 1.108 tế bào/g. Nghiên cứu và sử dụng probiotic như là nguồn thức ăn bổ sung trong C6H12O6 CH3CHOHCOOH + CH3COOH + CH3CH2OH + CH2OHCHOHCH2OH + CO2 + Kcal Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 15 chăn nuơi được tiến hành ở hầu hết các nước trên thế giới. Lactocobacillus fermentation: Do hãng Diamond V – Cedaz Rapids,Iowa – USA sản xuất, cĩ chứa các vi khuẩn Lactobacillus acidophylus, Lactobacillus lactis và các thành phần bổ sung như vitamin B, A, D, E và khống vi lượng. Chế phẩm được dùng như là thức ăn bổ sung hàng ngày cho gia súc. Chế phẩm Lactobacillus: do hãng Tanin pharmacentical Industries Co.Ltd (ðài Loan ) sản xuất cĩ chứa các vi khuẩn Lactic như Lactobacillus casei, Lactobacillus arabinosus, Lactobacillus fermenti. Cĩ đặc điểm là xúc tiến quá trình sinh trưởng của gia súc và gia cầm, nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn, tăng hiệu quả kinh tế do chi phí thức ăn, rút ngắn thời gian nuơi dưỡng. Sử dụng để trộn vào thức ăn, pha vào nước uống hoặc hỗn hợp với kháng sinh cho uống trực tiếp cĩ tác dụng đường hĩa tinh bột thức ăn, tăng cường sự hấp thu các thành phần tinh bột, protein, mỡ, giúp nâng cao hiệu quả tiêu hĩa và lợi dụng thức ăn, phịng các chứng bệnh đường ruột như rối loạn tiêu hĩa do dùng kháng sinh, đại tiện táo, và tiêu chảy mãn tính do nhiễm khuẩn. Cĩ thể nĩi một vài năm gần đây giống Lactobacillus được quan tâm nghiên cứu như nguồn vi sinh vật hữu ích cho vật nuơi (Gusils và cs, 1999). Theo Shoeb và cs. ( 1997) thấy tốc độ sinh trưởng của gà broiler (tăng từ 4,88 – 6,12) và hiệu quả chuyển hĩa thức ăn được cải thiện rõ rệt khi được ăn thức ăn cĩ bổ sung vi khuẩn Lactic sống (2002) Tại Việt Nam, cũng cĩ nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic trong chăn nuơi. Viện cơng ghệ sinh học- Trung tâm khoa học và cơng nghệ quốc gia đã sản xuất chế phẩm Biolactyl đơng khơ từ chủng Lactobacillus acidophilus. Chế phẩm thương phẩm được chế ở dạng viên nén, cĩ thể bảo quản ở nhiệt độ 15-20oC cĩ hoạt lực cao trong phịng trị bệnh đường ruột ở người và gia súc (Nguyễn Văn Uyển 1994). Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 16 Phạm Ngọc Lan và Lê Thanh Bình (2003) đã phân lập được 2 chủng kí hiệu CH 123 và CH156 từ 789 chủng vi khuẩn lăctic trong ruột gà. Các tác giả đã xác định được chúng cĩ những tính chất probiotic gần giống với lồi Lactobacillus agllis, Lactobacillus sallvarius như đề kháng với 40% axit mật, sinh trưởng được ở mơi trường pH= 4,0 và nồng độ muối 6,0%, cĩ hoạt tính kháng với Salmonella và E. coli và cĩ khả năng sử dụng như nguồn probiotic ứng dụng trong chăn nuơi . Nguyễn thị Hồng Hà và cs ( 2003 ) ở Viện cơ điện nơng nghiệp và cơng nghệ sau thu hoặch đã sử dụng 2 chủng vi khuẩn Bifidobacterium bifidum và Lactobacllus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic, bước đầu đã nghiên cứu bằng cơng nghệ sấy phun. Chế phẩm sau 6 tháng vẫn cĩ vi khuẩn sống ở mức 106 CFU/g và cĩ khả năng ức chế Salmonella. Lê Tấn Hưng và Võ Thị Hồng Hạnh và ctv (2003) ở Viện sinh học nhiệt đới đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm BIO I và BIO II. Chế phẩm BIO II cĩ các vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus, Bacillus và nấm Saccharomyces phối hợp thêm các enzym dùng rộng rãi trong sử lý nước để nuơi cá nhưng chế phẩm BIO I dùng trong chăn nuơi hiệu quả chưa cao (Trần ðình Từ, 2003) Nguyễn Thúy Hương và Trần Thị Tưởng An (2008) đã tiến hành thu nhận bacteriocins từ vi khuẩn L. Lactis sử dụng trong bảo quản thực phẩm. 2.2.4. Các hoạt chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic sản sinh nhiều các hợp chất khác nhau như các axit hữu cơ (axit lactic, axit axetic), diacetyl, hydrogen peroxide và các chất kháng khuẩn (bacteriocins) hay các protein cĩ khả năng kháng khuẩn (bactericidal proteins) trong quá trình lên men lactic (Oyetayo et al., 2003; Olivera và cs., 2008). Phổ kháng khuẩn của các hợp chất kháng khuẩn này tương đối rộng, bao gồm các vi khuẩn gây thối, gây hư hỏng thức ăn và các vi khuẩn gây bệnh như L. monocytogenes and Streptococcus aureus (Bromberg và cs, 2004). Phổ kháng khuẩn của vi khuẩn Lactic cĩ thể tĩm tắt ở bảng 2.3. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 17 Bảng 2.1: Hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic và cơ chế tác động Chất kháng khuẩn Cơ chế tác động Axit lactic và các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi khác Ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của tế bào Hydrogen peroxit (H2O2) Khử hoạt chất của những phân tử sinh học cần thiết của chuỗi phản ứng superoxit anion. Cacbon dioxit (CO2) Tạo mơi trường kỵ khí và ức chế enzyme khử CO2 hoặc phá vỡ màng tế bào Diaxety Can thiệp vào việc sử dụng arginin Bacterioxin Phá vỡ màng tế bào (cịn được biết quá ít) * Axit lactic và axit axetic Axit lactic là sản phẩm chất trao đổi chất cuối cùng được sinh ra bởi vi khuẩn lactic. Hàm lượng axit lactic sinh ra phụ thuộc rất lớn vào cơ chất và nhĩm vi sinh vật. Axit lactic cĩ khả năng kháng vi khuẩn do những phân tử khơng phân ly, địi hỏi hoạt động ở pH trên 4,5. Trong hệ tiêu hĩa, vi khuẩn Lactic sinh ra axit lactic và axit axetic sẽ làm giảm pH của mơi trường, do đĩ ảnh hưởng đến mọi mặt của quá trình trao đổi chất và kìm hãm sự sinh trưởng của các vi sinh vật khơng cần thiết trong mơi trường. Axit lactic và axit axetic khơng phân ly, dễ thấm vào màng tế bào, làm rối loạn trao đổi điện thế màng, do đĩ sẽ kìm hãm sự vận chuyển các chất cần thiết qua màng và sự hoạt động của enzim ATPaza. * Hydrogen peroxit Hydrogen peroxit (H2O2) sinh ra vi khuẩn Lactic cĩ khả năng ức chế vi khuẩn Gram âm như Pseudomonas và vi khuẩn Gram dương như Staphylococcus aureus. Vì vi khuẩn Lactic khơng sinh Catalaza nên H2O2 sinh ra sẽ tích lũy xung quanh mơi trường tạo mơi trường kỵ khí. Hiệu quả gây chết của H2O2 cĩ thể do nĩ khử hoạt tính sinh học của các phân tử cần thiết bởi chuỗi phản ứng anion O2 -. Nĩ Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 18 cũng cĩ thể do chức năng của hệ thống Lactoperoxitaza- thyocyanat. H2O2 oxy hĩa thyocyanat, giải phĩng ra các sản phẩm oxy hĩa, là những chất độc gây hại cho vi sinh vật gây bệnh. H2O2 cĩ hiệu quả như chất diệt bào tử hơn là chất diệt khuẩn. * Cacbon dioxit Khả năng kháng khuẩn của CO2 là do nĩ ức chế enzim khử CO2, tạo mơi trường kỵ khí hoặc cĩ khả năng phá vỡ màng tế bào do tích lũy chất khí trong lớp lipit kép. * Diaxetyl Diaxetyl được vi khuẩn Lactic tổng hợp từ pyruvat, nĩ ức chế cả vi khuẩn Gram âm, Gram dương (khác vi khuẩn Lactic và nấm men). Diaxetyl sẽ phản ứng với arginin làm cản trở sử dụng arginin- một axit amin cần thiết của vi khuẩn Gram âm. * Bacteriocins Bacteriocins là những peptides kháng khuẩn cĩ khả năng ức chế những chủng vi khuẩn nhậy cảm gram âm và gram dương . Bacteriocin của vi khuẩn lactic được phân vào nhĩm II (class II bacteriocins), đĩ là những đoạn peptide ngắn khoảng 20-60 amino acids, nhưng cĩ khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn bằng cách tác động và màng tế bào, làm giảm tính thấm của màng (Ennahar và cs., 2000). Hơn 50 bacteriocin peptide được gọi là đã được phân lập trong những năm gần đây (Nes và Holo, 2000). Một số bacteriocins quan trọng là nisin, diplococcin, acidophilin, bulgarican, helveticins, lactacins and plantaricins (Nettles và Barefoot, 1993). Trong đĩ, nisin, do L. lactis spp. sản sinh, được nghiên cứu nhiều nhất cho đến nay và duy nhất được sử dụng như là một chất bổ sung trong thực phẩm trên thế giới (Delves-Broughton và cs., 1996). Các bacteriocins được sản sinh từ các vi khuẩn lactic rất được sử dụng để kiểm sốt các vi khuẩn gây bệnh, gây hư hỏng thức ăn cĩ trong thực phẩm (Schillinger và cs., 1996). Hai loại bacteriocins là lactocin do L. curvatus sản Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 19 sinh và nisin do L. lactis được kết hợp sử dụng để chống lại E. coli trong điều kiện in vivo đã được báo cáo (Belfiore và cs., 2007). Desouky và Ibrahim (2009) cho biết, sử dụng kết hợp các loại bacteriocins của vi khuẩn lactic trong bảo quản thực phẩm cĩ thể tăng hiệu quả kháng khuẩn, an tồn và kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm. 2.3. CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG XỬ LÝ CHẤT THẢI ðỘNG VẬT Ngành cơng nghiệp chăn nuơi truyền thống đang phải đối mặt với một vấn đề rất nan giải đĩ là gây ra sự ơ nhiễm nghiêm trọng mơi trường khơng khí và nước. Sự ơ nhiễm đã tạo ra mùi hơi, khí độc và ruồi muỗi trong chuồng nuơi, dễ phát sinh dịch bệnh do đĩ làm tăng chi phí thuốc thú y, con vật chậm lớn, chi phí thức ăn cao, chất lượng sản phẩm kém, hiệu quả kinh tế thấp và ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Trong chăn nuơi gà, một số xử lý khơng tốt nên khí NH3, H2S… thối độc phát tán, gây bệnh đường hơ hấp cho gà đẻ trứng, tỷ lệ đẻ giảm thấp; một số cơ sở cĩ mơi trường nuơi dưỡng kém, tỷ lệ mắc bệnh mãn tính cao, tỷ lệ chết suốt quá trình nuơi cao. Việc xử lý mơi trường ơ nhiễm là vấn đề được cả thế giới quan tâm giải quyết, song vẫn chưa cĩ biện pháp nào được coi là lý tưởng. Lượng phân thải bằng 2,7 lần chất thải rắn cơng nghiệp, nếu xử lý khơng tốt sẽ uy hiếp mơi trường sinh thái và gây nên những vấn đề xã hội nghiêm trọng. ðể xử lý ơ nhiễm con người đã ứng dụng khá nhiều biện pháp, kết hợp với sự thu gom chất thải hàng ngày thì các biện pháp sinh học cũng đã được sử dụng rộng rãi để nhằm loại trừ mùi hơi và khí độc của chuồng nuơi. ðĩ là việc sử dụng bể biogas, một biện pháp phổ biến và cĩ hiệu quả, tuy nhiên trong chăn nuơi lớn với số lượng gia súc nhiều cũng khơng thể giải quyết sự lên men hết số phân và nước thải rửa chuồng nuơi. Ngồi ra biện pháp này cũng rất tốn nước và nhân lực. Hiện nay chế phẩm sinh học đang được coi là cơng cụ hữu hiệu tạo nền tảng vững chắc cho các hoạt động chăn nuơi trên thế giới. Nhiều nhà khoa học thống nhất là các chế phẩm probiotic tạo nên các đáp ứng tích cực ở Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 20 vật nuơi chỉ khi các chế phẩm cĩ đầy đủ các đặc tính của probiotic, sự thiếu một hoặc nhiều đặc tính của probiotic cĩ thể là nguyên nhân của các đáp ứng âm tính. Chế phẩm sinh học khơng những được ứng dụng rộng rãi trong cải thiện mơi trường nuơi mà cịn khống chế bệnh dịch và tăng cường sức đề kháng cho vật nuơi. Thành phần của chế phẩm sinh học thường là một tập hợp các chủng vi sinh vật sống, được tuyển chọn và tối ưu hố tác dụng của chúng. Các nhà sản xuất đã lựa chọn những lồi khác nhau để cho ra một sản phẩm cĩ tác dụng tốt trong quá trình sử dụng, tuy nhiên hiện nay phổ biến nhất là các lồi: Bacillus (B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium…), vi khuẩn Lactic (L. plantarum, L. casei, L. bulgaricus…), Nitrobacter, Thiobacterium, nấm men Saccharomyces serevisiae… Hiện nay cĩ khoảng 400 loại chế phẩm sinh học đang lưu thơng trên thị trường, trong đĩ cĩ khoảng 430 loại dùng để xử lý mơi trường và trên 60 loại dùng để trộn vào thức ăn nhằm mục đích kích thích tăng trưởng, tăng sức đề kháng nhưng chủ yếu tập trung vào xử lý mơi trường, các loại chế phẩm này cĩ nguồn gốc từ nhiều nước: Trung Quốc, Indonesia, ðài Loan, Anh, Mỹ, Ấn ðộ, Hàn Quốc, Úc, ðức, Thái Lan… Cơ chế tác động của các vi sinh vật hữu ích trong xử lý chất thải chăn nuơi cĩ thể kể đến: - Khả năng tiêu hủy phân và mùi hơi: Một số vi sinh vật hữu ích cĩ khả năng phân giải và đồng hĩa các chất thải động vật như phân, nước tiểu. Quá trình phân giải này tạo thành các thành phần trao đổi chất cĩ tác dụng khử mùi trong chuồng trại như axit hữu cơ (trung hịa và cố định NH3), rượu (trung hịa mùi lạ và diệt virus…), các enzyme, các chất loại kháng sinh … ðặc biệt, vi sinh vật đồng hĩa phân, nước tiểu để tạo thành protein của chính bản thân chúng, nguồn protein vi sinh vật này được đơng vật sử dụng. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 21 - Khả năng khử mùi hơi và khí độc: Vấn đề khử mùi hơi và khí độc được đặt ra trong những năm gần đây khi chăn nuơi phát triển với tốc độ nhanh gây ơ nhiễm lớn mơi trường chăn nuơi. Trong nuơi gà, nhất là vào mùa đơng chuồng nuơi thường đĩng kín cửa hay nuơi gà theo phương pháp chuồng kín đã tạo ra mùi thối rất khĩ chịu và cĩ hại do tích nhiều các khí NH3, H2S, CO2, CO … làm cho gà dễ sinh các bệnh đường hơ hấp, ảnh hưởng đến sinh trưởng, tiêu tốn thức ăn lớn, bị tổn thất về kinh tế, làm ảnh hưởng đến sức khỏe của người chăn nuơi và những người xung quanh. Tác dụng khử mùi hơi và khí độc của các vi sinh vật hữu ích trong chế phẩm sinh học là rất mạnh. Chỉ cần pha lỗng chế phẩm sinh học thành dung dịch với tỷ lệ 1: 50-100 để phun trực tiếp lên chuồng trại nơi chứa phân, trên cơ thể con vật cũng thấy ngay tác dụng khử mùi của chế phẩm Sự khử các chất khí thối độc trong độn lĩt lên men nhờ sự tác động của nhiều nhân tố. Cụ thể là: + Khống chế nguồn phát sinh khí: Sử dụng dịch lên men để lên men thức ăn gia súc sẽ tăng cường sự tiêu hĩa hấp thu thức ăn, nên một mặt làm giảm lượng phân thải ra mặt khác làm giảm thải các chất dinh dưỡng cịn lại trong phân, do đĩ làm giảm sự hình thành các khí thối độc. + Tác dụng khử khử mùi hơi và khí độc quan trọng nhất là do vi sinh vật. Vi sinh vật cĩ ích thực hiện sự giảm mùi theo các cách: (i) Ức chế và khử vi khuẩn cĩ hại, lên men gây thối trong độn chuồng. Với một số lượng tế bào rất lớn các chủng loại vi sinh vật khác nhau đã tạo ra sự áp đảo và tiêu diệt các loại vi khuẩn lên men gây thối trong phân. Các vi sinh vật cĩ ích bằng sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng, bằng việc sản sinh ra các chất gây ức chế như các axit hữu cơ, chất cĩ hoạt tính kháng sinh ... Khi chế thành dịch lên men thì dịch lên men cĩ độ pH thấp là khoảng 4, do cĩ hàm lượng các axit hữu cơ 3-8%; vi sinh vật cĩ ích cĩ khoảng 5.108 CFU/g (Lactobacillus sp., Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 22 Streptococcus lactis, vi khuẩn quang hợp…) nấm men khoảng 8.108 CFU/g đã sản sinh các chất kháng vi khuẩn thối như axit lactic, axit axetic, rượu ethylic, ester, H2O2, bacterioxin … Axit hữu cơ cĩ thể trung hịa hấp phụ NH3. (ii) Trong thành phần của tổ hợp vi sinh vật được đưa vào xử lý độn chuồng cĩ những chủng cĩ thể sử dụng các khí độc làm nguồn dinh dưỡng cho sự sinh trưởng phát triển của mình, do đĩ mà gĩp phần làm giảm nhanh khí độc trong độn lĩt (phân mới thải ra đã cĩ nhiều khí thối độc do sự lên men của các vi khuẩn thối rữa trong ruột già động vật ). Ví dụ: các chủng nấm men được chọn lọc cĩ thể sử dụng NH3 cho sinh tổng hợp thành protein của tế bào hay vi khuẩn quang hợp cĩ màu lục cĩ thể sử dụng cơ chất là H2S trong quá trình đồng hĩa CO2 để tạo ra các hợp chất hữu cơ cần cho tế bào … ðiều đĩ cũng giải thích vì sao dùng dịch lên men của chế phẩm vi sinh để phun vào nơi cĩ mùi hơi thì chỉ sau một thời gian ngắn đã giảm mùi rõ rệt. Sự lên men oxy hĩa của vi sinh vật để phân giải phân thành các chất khơng cĩ mùi. ðĩ là sự oxy hĩa triệt để các chất dinh dưỡng trong phân để thu năng lượng và tạo ra CO2 và nước. Nhờ đĩ mà cĩ thể giảm lượng lớn khí độc trong chuồng nuơi. Cần chú ý khi chế độn lĩt cĩ sự lên men mạnh lúc đầu sản sinh nhiều loại khí độc cần mở cửa cho thơng thống - Khả năng duy trì sự cân bằng sinh thái vi sinh vật trong chuồng nuơi: Các chế phẩm vi sinh sử dụng để xử lý phân và rác thải động vật thường bao gồm một tập hợp các vi sinh vật được chọn lọc rất nghiêm ngặt theo các tiêu chí về đặc điểm sinh hĩa học cụ thể. Một trong những tiêu chí quan trọng là giữa chúng phải cĩ được mối quan hệ cộng sinh và hỗ sinh để từ đĩ tạo ra sự cân bằng sinh thái trong mơi trường mà chúng tồn tại. Nếu giữa các chủng vi sinh vật khơng cĩ được mối quan hệ tương hỗ thì chắc chắn tổ hợp vi sinh vật được chọn lọc và tập hợp sẽ bị phá vỡ trong một thời gian ngắn. Bởi lẽ sự phát triển độc lập của từng chủng trong mơi trường nhiều chất thải sẽ chịu sự tác động của nhiều yếu tố, trong đĩ cĩ cả sự canh tranh ngay trong các chủng Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 23 của tổ hợp với nhau và sự cạnh tranh của nhiêu vi khuẩn cĩ hại cĩ mặt trong chất thải. Sự cân bằng sinh thái vi sinh vật trong chuồng nuơi sẽ ức chế các vi khuẩn gây thối, vi khuẩn gây bệnh trong chuồng nuơi, làm giảm mùi hơi trong chuồng và giảm bệnh cho gia súc. 2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ðỘN LĨT CHUỒNG LÊN MEN TRONG CHĂN NUƠI 2.4.1. Tình hình nghiên cứu ngồi nước Ơ nhiễm chuồng nuơi là một trong những vấn đề lớn của chăn nuơi gà tập trung. Rất nhiều các chất khí độc hại trong chuồng nuơi được sinh ra trong quá trình trao đổi chất của gà cũng như trong quá trình phân hủy của chất thải (phân, nước tiểu) như khí metan (CH4), hydro sunfua (H2S), CO2, và NH3. Trong số đĩ, amoniac là chủ yếu. Các khí độc này khơng những ảnh hưởng đến sức khỏe của gia cầm, sức khỏe của người chăn nuơi mà cịn gây ra mùi khĩ chịu và ơ nhiễm mơi trường (Gürdil và cs, 2001). Việc sử dụng độn lĩt chuồng trong chăn nuơi gà là một trong những nguyên nhân làm tăng hàm lượng amoniac trong chuồng nuơi. Amoniac là sản phẩm của quá trình phân hủy axit uric trong nước tiểu, các hợp chất hữu cơ chứa nitơ trong phân và thức ăn rơi vãi của vi sinh vật. Chúng được tạo thành dưới một trong hai dạng: khí NH3 (amoniac) và các ion amoni NH4 + tùy thuộc vào độ pH của độn lĩt nền chuồng. Nếu độn lĩt nền cĩ pH dưới 7,0 amoniac sẽ tồn tại ở dạng ion amoni (NH4 +) và amoniac tồn tại chủ yếu ở dạng khí NH3 khi pH lớn hơn 8,0 (Carr và cs, 1990; Gürdil và cs, 2001). Các yếu tố ảnh hưởng tới hàm lượng NH3 trong chuồng nuơi cĩ thể kể đến: Sử dụng độn lĩt chuồng cũ hoặc khơng được thay trong thời gian dài dẫn đến sự tích tụ NH3 trên ngưỡng cho phép; ðộn lĩt chuồng ướt (độ ẩm>30- 40%), nhiệt độ cao, pH của độn lĩt >8 và sự cĩ mặt của các vi khuẩn, nấm men, nấm mốc sẽ nhanh chĩng phân hủy axit uric thành NH3 bay hơi (Carr và cs, 1990; Zifei Liu và cs, 2007). Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 24 Tác động cĩ hại của amoniac trong chăn nuơi gia cầm đã được báo cáo từ lâu. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng amoniac trong chuồng nuơi lớn hơn 25ppm khơng những làm giảm tăng trọng và chuyển hĩa thức ăn mà hệ hơ hấp của gà cũng bị ảnh hưởng do các nhung mao ở phế quản bị phá hủy, dẫn đến sức đề kháng đối với bệnh đường hơ hấp giảm, làm cho mầm bệnh dễ dàng xâm nhập và cĩ cơ hội gây bệnh (Carlile, 1984). Ngồi ra, hàm lượng NH3 cao hơn 25ppm cĩ thể gây hại niêm mạc mắt của gia cầm, gây chảy nước mắt (Gürdil và cs, 2001). Các phương pháp xử lý độn lĩt nền chuồng nuơi chủ yếu nhằm làm giảm độ pH của độn lĩt, vì vậy các vi khuẩn phân hủy axit uric giải phĩng amoniac sẽ bị bất hoạt và giảm số lượng, từ đĩ giảm ơ nhiễm chuồng nuơi. Một trong những phương pháp phổ biến là sử dụng hĩa chất để xử lý độn lĩt nền. Trên thị trường cĩ nhiều sản phẩm xử lý độn lĩt chuồng nuơi gà như Poultry Litter Treatment (PLTTM), Al-ClearTM (Granulated aluminum sulfate), Poultry GuardTM (PG), Hydrated Lime (HL), A-7TM (liquid axitified aluminum sulfate LA) và sulfuric axit đậm đặc (98% H2SO4) (SA). Tuy nhiên các sản phẩm này cĩ những hạn chế như giá thành cao, sử dụng phức tạp do địi hỏi phải cĩ bảo hộ lao động đặc biệt. Mặc khác, các sản phẩm này cĩ thể gây tổn thương da và những nguy hiểm khác cho cơng nhân khi sử dụng. Chính vì vậy, việc sử dụng vi sinh vật để làm giảm hàm lượng amoniac ở các trang trại chăn nuơi gà tập trung đã được nghiên cứu. Chiang và Hsieh (1995) báo cáo rằng, sử dụng chế phẩm cĩ chứa Lactobacillus axitophilus, Streptococcus faecium và Bacillus subtilis cĩ thể làm giảm hàm lượng amoniac trong phân và chất độn chuồng trong chăn nuơi gà thịt thương phẩm. Theo Yeo và Kim (1997), bổ sung Lactobacillus casei vào khẩu phần ăn của gà thịt cĩ thể làm giảm sự hoạt động của ureaza trong chất chứa ruột non ở 3 tuần đầu tiên. Tuy nhiên, tác giả đã khơng báo cáo về việc giảm khí amoniac và các hợp chất hữu cơ bay hơi trong chuồng nuơi. Chang và Chen (2003) Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 25 tiến hành bổ sung chế phẩm thương mại Ecozyme cĩ chứa các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. vào thức ăn cho gà thịt 56 ngày tuổi đã làm giảm đáng kể hàm lượng khí amoniac trong chuồng nuơi và làm giảm độ ẩm ướt, độ pH của phân gà, dẫn đến giảm đáng kể mùi hơi thối trong chuồng nuơi. Tuy nhiên, hiện nay trên thế giới, các nghiên cứu phối hợp nhiều chủng vi sinh vật khác nhau để sản xuất các chế phẩm sinh học tổng hợp sử dụng trong chăn nuơi để đạt được nhiều mục đích: vừa kích thích tăng trưởng, phịng bệnh và giảm ơ nhiễm mơi trường nuơi vẫn cịn rất hạn chế. Một trong những chế phẩm vi sinh tổng hợp đã được nhiều người biết đến, đĩ là chế phẩm sinh học EM (là chữ viết tắt của cụm từ tiếng Anh Effective Microorganisms cĩ nghĩa là vi sinh vật hữu hiệu) do giáo sư, tiến sĩ Teruo Higa người Nhật nghiên cứu sản xuất vào năm 1980 và được du nhập vào Việt Nam những năm sau đĩ. Theo sự phân tích của các nhà khoa học Việt Nam thì chế phẩm EM cĩ chứa 87 chủng vi sinh vật khác nhau thuộc 05 nhĩm cơ bản: nhĩm vi khuẩn quang hợp (Rodopseudomonas), nhĩm vi khuẩn Lactobacillus, nhĩm nấm men (Saccharomyces), nhĩm nấm sợi (Aspergillus và Penicillium). Theo như tài liệu hướng dẫn thì từ chế phẩm gốc EM1 cĩ thể chế ra các chế phẩm khác như: EM thứ cấp, EM Bokashi B (làm thức ăn cho gia súc) và EM Bokashi C (để xử lý mơi trường). Các chế phẩm sinh học EM thường dùng để bổ sung vào thức ăn, nước uống với mục đích: - Tăng sức đề kháng; - Tăng khả năng tiêu hĩa thức ăn, tăng sinh trưởng; - Khử mùi hơi, làm giảm ơ nhiễm mơi trường, chuồng trại chăn nuơi gia súc, gia cầm; - Xử lý các chất thải hữu cơ trong phân gia súc, gia cầm, rác thải, phế thải nơng nghiệp thành phân bĩn. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 26 Như vậy, đây là một chế phẩm đa năng. Người ta cho rằng do nhĩm vi sinh vật hữu hiệu EM sống cộng sinh trong cùng một mơi trường thì sẽ tạo ra một mơi trường sinh thái đồng nhất, hỗ trợ lẫn nhau cùng sinh trưởng và phát triển, sản sinh ra nhiều sản phẩm khác nhau, nên chế phẩm EM cĩ được hiệu quả đa dạng như trên. Xét về mặt khoa học thì khơng thể cĩ một chế phẩm vi sinh vật được sử dụng chung cho nhiều lĩnh vực và với các mục đích khác nhau. Bởi lẽ mỗi một lĩnh vực đều cĩ những đặc điểm rất riêng, vì vậy muốn tác động cĩ hiệu quả thì một chế phẩm sinh học phải cĩ những chủng vi sinh vật được lựa chọn thật phù hợp. Việc sử dụng một hỗn hợp các vi sinh vật hữu hiệu (EM) chung cho nhiều lĩnh vực sẽ khơng mang lại kết quả thật sự tốt cho tất cả. Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, muốn cho động vật nuơi ít bị bệnh, tăng cường được khả năng tiêu hĩa hấp thu thức ăn, cĩ sự sinh trưởng phát triển tốt, tăng khả năng sinh sản ... thì vấn đề quan tâm đặc biệt phải là vấn đề mơi trường sống. Nếu một con giống tốt, được nuơi với một chế độ dinh dưỡng hồn hảo và đảm bảo tốt các yêu cầu về nuơi dưỡng khác mà lại phải sống trong một mơi trường khơng trong sạch, cĩ nhiều khí thải độc hại, cảm nhiễm nhiều vi sinh vật gây bệnh, nhiệt độ và độ ẩm khơng đảm bảo thì chắc chắn khơng những khơng cĩ sự sinh trưởng phát triển tốt mà rất dễ bị mắc bệnh. Vấn đề vệ sinh mơi trường chăn nuơi cĩ liên quan chặt chẽ đến vấn đề thải phân và nước tiểu của động vật nuơi. Vấn đề xử lý các chất thải này được người chăn nuơi thực hiện hàng ngày với cách làm truyền thống như quét dọn, tẩy rửa, thu gom phân vào bể biogas hay hố ủ hay sử dụng độn lĩt chuồng và định kỳ bổ sung hoặc thay thế độn lĩt... Việc xử lý này khơng những tốn nhiều cơng sức và cả tiền của mà cịn khơng thể xử lý triệt để mơi trường, sự ơ nhiễm vẫn cịn nặng ảnh hưởng đến con vật, người chăn nuơi và khu dân cư. Việc sử dụng các chế phẩm sinh học để xử lý phân và làm giảm mùi hơi khơng giải quyết tận gốc của vấn đề và cũng khơng triệt để. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 27 Làm sao để cĩ thể xử lý phân, chất thải chăn nuơi một cách triệt để tạo mơi trường trong sạch cĩ lợi cho sự sinh trưởng phát triển của con vật, giảm được tỷ lệ mắc bệnh và đem lại các lợi ích khác nữa mà khơng phải tốn tiền và nhân cơng, khơng phải thực hiện hàng ngày? Câu hỏi này đã được các nhà khoa học Trung Quốc giải đáp, đĩ là sử dụng Chế phẩm lên men Hoạt tính 99 dùng chế tạo độn lĩt lên men dùng trong chăn nuơi. Chế phẩm lên men Hoạt tính 99 là một sản phẩm bổ sung đa năng do Trung tâm chuyên khai thác sản phẩm kỹ thuật “Cao-Mới-Tinh” Nghi Xuân nghiên cứu thành cơng năm 1999. Chế phẩm lên men Hoạt tính 99 được giới thiệu là chế phẩm lên men và phịng bệnh rất hữu hiệu. Năng lực lên men cả thể dịch và thể rắn, kết hợp với cơng năng bảo vệ sức khỏe động vật được đánh giá rất cao ở Trung Quốc hiện nay (Trương Khải Bình, 2009). Thành phần của Chế phẩm lên men Hoạt tính 99 bao gồm: - Quần thể các vi sinh vật cĩ ích với số lượng tế bào đạt 120.106 CFU/g hoặc ml; - Các thành phần của quá trình lên men và bổ sung tạo chế phẩm: hoạt chất đa đường-oligosaccharit, các enzyme tiêu hĩa, chất xúc tiến lên men, chất axit hĩa, chất tăng trưởng, viên nấm men, đa sinh tố, axit amin, các peptit mạch ngắn, kháng sinh tự nhiên (của vi khuẩn lactic Streptococcus lactis), cơng năng tổng hợp của dược thảo và một số thành phần được bổ sung thêm. Chế phẩm lên men Hoạt tính 999 được sử dụng rộng rãi nhất trong chăn nuơi hiện nay ở Trung Quốc với trên 100.000 hộ để lên men thức ăn và phịng bệnh cho vật nuơi. Tác dụng của Chế phẩm lên men Hoạt tính 99: - Lên men thức ăn; biến đổi thức ăn cĩ giá trị thấp thành thức ăn cĩ giá trị cao, tăng tính ngon miệng; - Phịng bệnh cho vật nuơi: giảm tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ chết; - Tăng cường tiêu hĩa hấp thu thức ăn, giảm tiêu tốn thức ăn; Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 28 - Khử mùi hơi, giảm ơ nhiễm mơi trường, - Cải thiện chất lượng sản phẩm, tạo sản phẩm an tồn; - Lên men phân động vật để thành phân vi sinh cĩ chất lượng dinh dưỡng cao; - Lên men các nguyên liệu để tạo độn lĩt chuồng lên men dùng trong chăn nuơi lợn, gà, ngan. Trong các tác dụng được nêu trên thì việc sử dụng Chế phẩm lên men Hoạt tính 99 để chế độn lĩt chuồng lên men được đặc biệt nhấn mạnh trong các tài liệu do Cục Khuyến nơng một số tỉnh phát hành. Người Trung Quốc coi đây là phát kiến quan trọng mà họ gọi là “Kỹ thuật nuơi dưỡng bằng độn lĩt chuồng vi sinh hoạt tính“. (Trương Khải Bình, 2009). Những đặc điểm của độn lĩt chuồng lên men này là: Số lượng vi sinh vật đạt rất cao trong độn lĩt: 5.107 CFU/g (lên men bằng chế phẩm vi sinh khác chỉ đạt 0,8.106 CFU); - Các vi sinh vật trong độn lĩt cĩ mối quan hệ cộng sinh, cộng tồn đã tạo nên sự cân bằng chắc chắn, liên kết tạo ra sự phân giải mạnh mẽ, hiệu quả ổn định trong giảm mùi hơi và giảm bệnh; - ðộn lĩt lên men khơng dễ bị lên mốc và biến chất; năng lực phân giải mạnh; - Trong quá trình nuơi dưỡng, cĩ thể sử dụng các xử lý tiêu độc bình thường mà khơng ảnh hưởng đến cơng năng của chế phẩm; - Cách tạo độn lĩt đơn giản, bảo dưỡng dễ; - Tạo cho chuồng nuơi cĩ được một tiểu khí hậu tốt: nhiệt độ, độ ẩm thích hợp, khơng khí trong lành, khơng cĩ mùi thối và khí độc, giảm thiểu vi sinh vật gây bệnh; - Khơng cần phải thu dọn phân và tẩy rửa chuồng trong suốt quá trình nuơi. Từ đĩ đem lại hiệu quả tác dụng rất to lớn cho người chăn nuơi cũng như tồn xã hội. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 29 Sử dụng độn lĩt chuồng lên men trong chăn nuơi đem lại nhiều lợi ích cho người chăn nuơi. Trước hết cần nhận thấy đĩ là chuồng thiết kế đơn giản với sự đầu tư thấp; xử lý độn lĩt nhanh vối sự đầu tư ban đầu ít, khơng phức tạp nhưng lại cĩ giá trị sử dụng cao, lâu dài. Một độn lĩt nền chuồng được xử lý tốt cĩ thể sử dụng liên tục trên 6 tháng thậm chí tới hàng năm. ðộn lĩt sau đĩ vẫn cĩ thể được sử dụng làm phân bĩn cĩ chất lượng cao cho cây trồng. Bình thường thì sau 3-4 tháng hoặc cĩ thể tới 5-6 tháng sử dụng mới cần bổ sung 5% độn lĩt lên men mới là cĩ thể sử dụng lại. Như vậy bất cứ trong tình huống nào thì việc sử dụng độn lĩt chuồng lên men trong chăn nuơi._.cidophilus. b. Xác định khả năng phân giải protein Các vi khuẩn lactic cĩ khả năng phân giải protein do chúng cĩ thể sản sinh enzyme proteaza. Mỗi chủng vi khuẩn lactic khác nhau cĩ khả năng phân giải protein khác nhau. Hoạt lực proteaza của các chủng lactic tương đối cao. Trong 26 chủng tiến hành thí nghiệm cĩ: - 9 chủng vi khuẩn phân lập cĩ đường kính vịng phân giải dao động từ 7,00-9,33mm, đĩ là các chủng: MA2d, BV1b, YM1b, MA2c, BV1a, WY1c, MA1b, BV2c, EV1b; - 4 chủng khơng cĩ khả năng phân giải protein là: PR1c, PR2f, LP1a, BN1a. Các chủng cịn lại cĩ khả năng phân giải protein ở mức trung bình và yếu. ðường kính vịng phân giải dao động từ 2,33-6,00mm. Như vậy, 6 chủng cĩ khả năng phân giải protein tốt nhất với đường kính vịng phân giải từ 8,00-9,33mm là MA2d, BV1b, YM1b, MA2c, BV1a, WY1c. Từ kết quả trên 16 chủng cĩ khả năng phân giải protein và sinh axit lactic tốt nhất được chọn là: - 06 chủng L. acidophilus: MA2d, YM1b, BV1b, BV1a, NE1a, LP1d - 02 chủng L. plantarum: ND1b, ND1a - 04 chủng Strep. lactis: MA2c, YM1a, EV1b, BA2c - 02 chủng Strep. cremonis: MA1a, WY1c - 02 chủng L. bulgaticus: EV1a, VN1a Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 67 Hình 4.7. Khả năng phân giải protein của các chủng vi khuẩn lactic 4.4.2. Xác định khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh Kết quả xác định khả năng kháng hai loại vi khuẩn gây bệnh đường ruột là E. coli và Salmonella typhymurium được trình bày ở bảng 4.13. Tất cả 26 chủng vi khuẩn lactic phân lập được đều cĩ khả năng kháng 2 loại vi khuẩn đường ruột là E. coli và Salmonella. ðường kính vịng kháng khuẩn dao động từ 1,66-9,00mm khi thử với E. coli và từ 1,33-8,00mm khi thử với Salmonella. Khả năng kháng khuẩn được coi là mạnh đối với vi khuẩn lactic khi đường kính vịng kháng khuẩn >12mm. Như vậy, kết quả thu được cho thấy các chủng vi khuẩn lactic phân lập được cĩ khả năng kháng khuẩn ở mức trung bình và yếu. Những chủng vi khuẩn cĩ khả năng kháng E. coli mạnh là: BA2c>YM1a, EV1a>VN1c>BV1b, BL1a, PR2f. Những chủng vi khuẩn cĩ khả năng kháng Salmonella mạnh là: BV1b>ND1b, PR1a>EV1b, WY1c Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 68 Bảng 4.13. Khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic ðường kính vịng kháng khuẩn (mm) STT Ký hiệu chủng E.coli Salmonella typhymurium 1 NE1a 4,33 3,00 2 ND1a 5,00 2,33 3 ND1b 5,00 6,00 4 NG1b 4,00 1,66 5 LP1a 3,33 2,33 6 LP1d 5,00 2,33 7 BA2c 9,00 2,00 8 BS1b 3,33 4,00 9 BN1a 5,00 2,33 10 BL1a 6,33 3,00 11 EV1a 8,00 4,33 12 EV1b 4,33 5,00 13 BV1a 1,66 4,00 14 BV1b 6,00 8,00 15 PR1a 3,33 6,00 16 PR1c 4,00 4,00 17 PR2f 6,00 4,33 18 YM1a 8,00 1,66 19 YM1b 3,33 3,00 20 WY1c 3,00 5,33 21 SNC1b 1,33 1,33 22 VN1a 3,00 1,66 23 VN1c 7,33 3,00 24 MA1a 3,33 4,00 25 MA2c 3,33 3,00 26 MA2d 4,00 3,33 SEM 0,88 0,77 P <0,001 <0,001 Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic là do chúng cĩ thể sản sinh ra các hợp chất khác nhau như các axit hữu cơ (axit lactic, axit axetic), diaxetyl, hydrogen peroxit và các chất kháng khuẩn (bacteriocins) hay các protein cĩ khả năng kháng khuẩn (bactericidal proteins) trong quá trình lên men lactic (Oyetayo et al, 2003; Olivera và cs, 2008). Phổ kháng khuẩn của Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 69 các hợp chất kháng khuẩn này tương đối rộng, bao gồm các vi khuẩn gây thối, gây hư hỏng thức ăn và các vi khuẩn gây bệnh như L. monocytogenes and Streptococcus aureus (Bromberg và cs, 2004). Trong hệ tiêu hĩa, vi khuẩn lactic sinh ra axit lactic và axit axetic sẽ làm giảm pH của mơi trường, do đĩ ảnh hưởng đến mọi mặt của quá trình trao đổi chất và kìm hãm sự sinh trưởng của các vi sinh vật khơng cần thiết trong mơi trường. Axit lactic và axit axetic khơng phân ly, dễ thấm vào màng tế bào, làm rối loạn trao đổi điện thế màng, do đĩ sẽ kìm hãm sự vận chuyển các chất cần thiết qua màng và sự hoạt động của enzyme ATPaza. Kết quả 10 chủng cĩ khả năng kháng E. coli và Salmonella tốt nhất được chọn là: - 03 chủng L. acidophilus: BL1a, BV1b, VN1c - 02 chủng L. platarum: ND1a, ND1b - 02 chủng L. bulgaticus: EV1a, PR1a - 03 chủng Strep. lactis: BA2c, EV1b, YM1a. 4.4.3. Xác định khả năng sinh trưởng ở các mức nhiệt độ khác nhau Kết quả đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic ở các mức nhiệt độ khác nhau được trình bày ở bảng 4.14. a. Khả năng sinh trưởng ở 370C Các chủng vi khuẩn lactic đều sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 370C. Sau 24 giờ nuơi cấy, số lượng tế bào đã tăng từ 4-7,9 lần so với ban đầu. Số lượng tế bào dao động từ 26,28.106-51,35.106 tế bào/ml. Các chủng cĩ số lượng tế bào lớn nhất sau 24h nuơi cấy là: BV1a, BN1a, ND1b, VN1a với số lượng tế bào >50.106/ml. Tuy nhiên chủng cĩ tốc độ tăng trưởng cao nhất lại là chủng BS1b với tốc độ tăng số lượng tế bào là 7,9 lần. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 70 Bảng 4.14. Khả năng sinh trưởng ở các mức nhiệt độ khác nhau 370C (106tế bào/ml) 450C (106tế bào/ml) 500C (106tế bào/ml) Ký hiệu chủng 0h 24h 48h 0h 24h 48h 0h 24h 48h NE1a 5,6 28,0 61,2 5,7 3,5 2,2 5,8 2,4 1,5 ND1a 11,7 49,7 95,1 11,8 7,3 24,0 11,5 14,7 3,3 ND1b 11,5 50,8 99,3 11,7 7,0 24,7 11,7 15,3 3,6 NG1b 11,0 47,6 95,4 11,0 6,5 2,6 10,6 5,9 2,3 LP1a 11,7 47,7 94,3 11,6 25,7 44,3 11,7 17,0 15,9 LP1d 12,4 49,9 95,5 12,3 27,0 39,8 12,3 21,7 27,3 BA2c 11,3 49,0 93,5 11,3 38,1 48,3 11,4 26,4 31,3 BS1b 4,8 36,1 59,0 4,7 10,3 17,4 4,7 6,8 5,2 BN1a 12,7 50,6 110,6 12,7 29,0 48,0 12,6 18,3 17,3 BL1a 4,9 26,2 67,0 4,9 11,7 18,7 5,0 7,3 5,8 EV1a 13,0 48,0 96,2 13,0 6,6 3,0 13,1 4,0 2,0 EV1b 10,9 46,8 93,8 11,1 42,3 49,3 11,2 22,2 25,7 BV1a 11,0 51,3 94,7 11,0 25,3 41,9 11,0 15,7 14,3 BV1b 11,1 49,0 95,3 10,7 6,0 2,3 10,7 5,0 1,8 PR1a 5,2 27,0 62,3 5,3 17,3 24,0 5,3 10,0 15,7 PR1c 12,3 49,0 97,7 12,3 25,7 38,0 12,3 21,7 19,3 PR2f 12,7 47,7 96,3 12,7 35,8 45,0 12,7 21,7 27,0 YM1a 10,3 46,3 96,0 10,3 35,0 54,0 10,3 30,7 40,1 YM1b 11,7 47,7 98,0 11,7 6,0 2,3 11,7 4,0 1,7 WY1c 11,0 49,7 94,3 11,2 5,3 1,8 11,2 4,3 1,0 SNC1b 10,0 46,0 93,0 9,9 4,3 1,6 10,0 3,3 1,8 VN1a 12,3 50,3 98,7 12,3 5,3 3,7 12,3 4,8 3,0 VN1c 9,4 49,7 95,7 9,3 5,0 3,0 9,3 3,7 1,3 MA1a 5,5 26,3 65,8 5,3 2,4 1,0 5,4 1,5 1,0 MA2c 11,0 49,2 93,7 11,0 32,5 39,2 11,0 22,0 27,0 MA2d 12,3 50,0 96,0 12,3 28,3 47,0 12,3 18,0 16,0 SEM 2,4 3,7 4,0 2,1 1,5 1,8 1,9 1,5 1,2 P <0,05 <0,001 <0,001 <0,05 <0,001 <0,001 <0,05 <0,001 <0,001 Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 71 Ở thời điểm 48 giờ sau khi nuơi cấy, phần lớn các chủng đều cĩ sự tăng trưởng mạnh. 21/26 chủng cĩ số lượng tế bào >90.106/ml. Trong số đĩ, chủng BN1a cĩ sự tăng trưởng mạnh nhất với số lượng tế bào là 110,6.106 tế bào/ml. Các chủng NE1a, BS1a, BL1a, PR1a, MA1a là 5 chủng cĩ số lượng tế bào thấp <70.106/ml. Sở dĩ như vậy là do, số lượng tế bào nuơi cấy ban đầu của các chủng này thấp hơn rõ rệt so với các chủng khác. Tuy nhiên các chủng này cĩ tốc độ tăng số lượng tế bào rất lớn từ 10-13 lần. Vì vậy, cĩ thể nĩi rằng tất cả các chủng vi khuẩn lactic phân lập được đều cĩ khả năng sinh trưởng tốt ở 370C. b. Khả năng sinh trưởng ở 450C Sau 24h nuơi cấy, chỉ cĩ 12/26 chủng cĩ sự tăng trưởng về số lượng tế bào. Các chủng tăng trưởng tốt nhất sau 24 giờ nuơi cấy là EV1b, BA2c, PR2f, YM1a, MA2c. Tuy nhiên nếu so sánh tốc độ tăng số lượng tế bào của các chủng ở 450C với tốc độ sinh trưởng của chúng ở 370C thì thấy rằng đã cĩ sự giảm rõ rệt. Số lượng tế bào sau 24h nuơi cấy chỉ tăng từ 2,1-3,8 lần so với số lượng tế bào ban đầu. Sau 48h nuơi cấy, các chủng tăng trưởng âm tiếp tục giảm số lượng tế bào. Tốc độ tăng trưởng của các chủng này chỉ từ 0,1-0,4 lần. Trong khi đĩ, một số chủng lại cho thấy sự tăng trưởng liên tục ở 48h sau khi cấy là: YM1a>EV1b>BA2c>BN1a>MA2d>PR2f. Số lượng tế bào của 6 chủng này dao động từ 45.106-54.106 tế bào/ml. Từ kết quả nghiên cứu trên 4 chủng được chọn cĩ khả năng sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 450C là EV1b, BA2c, PR2f, YM1a. c. Khả năng sinh trưởng ở 500C Phần lớn các chủng cĩ sinh trưởng âm ở mức nhiệt độ này. Tuy nhiên vẫn cĩ 10/26 chủng cĩ tăng trưởng dương với tốc độ tăng số lượng tế bào sau 48h nuơi cấy, dao động từ 1,1-3,8 lần. Các chủng cĩ khả năng sinh trưởng được Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 72 ở mức nhiệt độ này là YM1a>BA2c>LP1d>MA2C>PR2f>EV1b. Số lượng tế bào sau 24h nuơi cấy của 6 chủng này dao động từ 25.106-40.106 tế bào/ml. Tuy nhiên khi tăng mức nhiệt độ lên 550C thì tất cả các chủng đều cĩ tăng trưởng âm hoặc số lượng tế bào khơng tăng sau 24h nuơi cấy. Như vậy, từ kết quả trên chọn ra được 4 chủng chịu nhiệt là: EV1b, BA2c, PR2f, YM1a. Kết quả 15/26 chủng cĩ khả năng sinh trưởng tốt ở mức nhiệt độ thơng thường và nhiệt độ cao được chọn là: - 07 chủng L. acidophilus: MA2d, PR1c, BV1a, BL1a, BN1a, LP1d, LP1a - 02 chủng L. plantarum: ND1a, ND1b - 04 chủng Strep. lactis: MA2c, YM1a, EV1b, BA2c - 02 chủng L. bulgaticus: PR2f, PR1a. Các kết quả nghiên cứu trên cho phép chọn lọc được 15 chủng thích hợp cho bước nghiên cứu tiếp theo là: : - 06 chủng L. acidophilus: MA2d, BV1b, BV1a, YM1b, LP1d, BL1a, - 02 chủng L. plantarum: ND1a, ND1b - 04 chủng Strep. lactis: MA2c, YM1a, EV1b, BA2c - 02 chủng L. bulgaricus: VN1a, PR1c - 01 chủng Strep. cremonis: WY1c Các chủng vi khuẩn lactic được chọn lọc ở trên thỏa mãn tất cả các điều kiện sau: vừa cĩ khả năng phân giải protein, sản sinh axit lactic tốt, vừa cĩ khả năng sinh trưởng nhanh, sinh trưởng tốt ở nhiệt độ cao và kháng vi khuẩn gây bệnh. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 73 Phần V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 5.1.1. Phân lập các chủng nấm men và định loại - ðã phân lập được 20 chủng nấm men từ 15 mẫu nguyên liệu là bánh men rượu, men bánh mì và sữa chua nếp cẩm; - ðã xác định 9/20 chủng thuộc về giống Saccharomyces, 5/20 chủng thuộc về giống Candida và 3/20 chủng thuộc về giống Torulopsis; - Tiến hành định danh 9 chủng thuộc giống Saccharomyces bằng kít định danh thương mại API 20CAUX trong đĩ 7 chủng được xác định là Saccharomyces cerevisiae là BN1a, HD3h, SCa, HT1a, GL2c, GL1c và HN2a. Hai chủng cần phải tiến hành thêm các test bổ trợ. 5.1.2. Chọn các chủng nấm men thích hợp để sản xuất chế phẩm sinh học Chọn lọc được 8 chủng nấm men thích hợp cho bước nghiên cứu tiếp theo để sản xuất chế phẩm vi sinh tổng hợp là: - 03 chủng S. boulardii: SB1, SB2, SB3 - 03 chủng S. cerevisiae: GL2c, BNa, Sca - 02 chủng Candida sp. HN2b, GL2b 5.1.3. Phân lập các chủng vi khuẩn lactic và định loại - ðã phân lập được 26 chủng vi khuẩn lactic từ 34 mẫu nguyên liệu là thực phẩm lên men và các chế phẩm sinh học (men tiêu hĩa); - ðã xác định 13/26 chủng thuộc về lồi Lactobacillus acidophilus, 4/26 chủng thuộc về lồi L. bulgaricus, 2/26 chủng thuộc về lồi ; L. plantarum, 4/26 chủng thuộc về lồi Streptococcus (Str) lactis và 2/26 chủng thuộc về lồi Str. Cremonis; Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 74 - Tiến hành định danh 8 chủng bằng kít định danh thương mại API® 50CHB để kiểm định độ tin cậy của các chủng khi phân loại dựa vào hệ thống phân loại Bergey. Trong đĩ chỉ cĩ 1 chủng được xác định là L. brevis thay vì là L. acidophilus. Các chủng cịn lại đều chính xác. 5.1.4. Chọn các chủng vi khuẩn lactic thích hợp để sản xuất chế phẩm sinh học Chọn lọc được 15 chủng thích hợp cho bước nghiên cứu tiếp theo để sản xuất chế phẩm vi sinh tổng hợp là: : - 06 chủng L. acidophilus: MA2d, BV1d, BV1a, YM1b, LP1d, BL1a, - 02 chủng L. plantarum: ND1a, ND1b - 04 chủng Strep. lactis: MA2c, YM1a, EV1b, BA2c - 02 chủng L. bulgaricus: VN1a, PR1c - 01 chủng Strep. cremonis: WY1c 5.2. Tồn tại và ðề nghị Tồn Tại - Do điều kiện thời gian cĩ hạn, nên chúng tơi mới chỉ tiến hành phân lập và chọn lọc được các chủng vi khuẩn Lactic và nấm men. Các chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus vẫn chưa được tiến hành phân lập và chọn lọc. ðề nghị - Tiếp tục chọn lọc các chủng vi khuẩn Bacillus thích hợp cho sản xuất chế phẩm sinh học. - Nghiên cứu các cơng thức phối hợp các chủng nấm men, vi khuẩn lactic đã chọn lọc ở trên và các chủng vi khuẩn Bacillus sẽ chọn lọc để chọn được tổ hợp tốt nhất cho sản xuất chế phẩm vi sinh tổng hợp. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Lê Thanh Bình, Phạm Ngọc Lan, Yoshi Benno (1999).“Tác dụng tăng cường đối với gia cầm của chế phẩm vi sinh vật PRO 99”. Tuyển tập báo cáo tại hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc năm 1999. 2. Nguyễn Lân Dũng (1970).Giá trị dinh dưỡng của nấm men và việc sản xuất, sử dụng nấm men gia súc hiện nay. Nấm men dùng trong chăn nuơi lợn. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, 239-257, 1970. 3. Nguyễn Lân Dũng (1986). Men gia súc và men rượu. NXB Khoa học kỹ thuật 1986, tr. 71. 4. Nguyễn Lân Dũng (1993). Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men thuộc chi Sacharomycopsis tích luỹ sinh khối cao trong mơi trường cĩ nguồn carbon duy nhất là tinh bột. (Cộng tác với Nguyễn Thị Mùi, Cù Phương Lan). Tạp chí Sinh học, 1993, 15(4): 100-104. 5. Nguyễn Thị Hồng Hà, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thuỳ Châu. 2003. Nghiên cứu cơng nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic probiotic. Tuyển tập báo cáo tại Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc năm 2003. 75-79. 251-255. 6. Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trương Hồng Vân, Lê Tấn Hưng, Trần Thạnh Phong (2004a). ”Kết quả khảo nghiệm chế phẩm VEM và BIOII trên ao nuơi tom sú”. Tuyển tập Hội thảo Tồn Quốc về nghiên cứu và ứng dụng Khoa học Cơng nghệ trong nuơi trồng thuỷ sản tại Vũng Tàu 22-24/12/2004, tr. 257-266. 7. Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trương Hồng Vân, Lê Tấn Hưng, Trần Thạnh Phong (2004b). ”Nghiên cứu sản xuất chế phẩm VEM dùng trong nuơi trồng thuỷ sản” Tuyển tập Hội thảo Tồn Quốc về nghiên Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 76 cứu và ứng dụng Khoa học Cơng nghệ trong nuơi trồng thuỷ sản taị Vũng Tàu 22-24/12/2004, tr 911-918. 8. Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trương Hồng Vân, Lê Tấn Hưng, Trần Thạnh Phong (2007a). Sản xuất và thương mại hĩa các sản phẩm sinh học dùng trong nuơi trồng thủy sản. Báo cáo Hội nghị khoa học và cơng nghệ 2007. Phần II. Tr. 291-225. 9. Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Hồng Vân (2007b). Giảm thiểu ơ nhiễm mùi hơi chuồng trại và sản xuất phân vi sinh từ chuồng bằng chế phẩm sinh học. Báo cáo Hội nghị khoa học và cơng nghệ 2007. Phần II. Tr. 226-230. 10. Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trương Thị Hồng Vân (2003). “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm Probiotic BIO II và kết quả thử nghiệm trên ao nuơi tơm”, Tuyển tập báo cáo khoa học tại Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn Quốc 2003, Hà Nội, 16-17/12/2003, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 75-79. 11. Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An (2008). Thu nhận Bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào lactococcus lactic cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu. Science & Technology Development, Vol 11, No.09 – 2008. 12. Phạm Thị Ngọc Lan và Lê Thanh Bình, (2003). ðặc điểm phân loại chủng Lactobacillus probiotic CH123 và CH 126 phân lập từ đường ruột của gà. Tuyển tập báo cáo tại Hội nghị Cơng nghệ Sinh học Tồn quốc năm 2003. tr.101-105. 13. Lê Khắc Quảng (2004). “ Cơng nghệ EM – Một giải pháp phịng bệnh cho gia cầm cĩ hiệu quả ”. Báo cáo chuyên đề khoa học. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 77 14. Nguyễn Quang Thạch (2000). “ Nghiên cứu thử nghiệm và tiếp thu cơng nghệ vi sinh vật hứu hiệu trong nơng nghiệp và vệ sinh mơi trường ” Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề tài khoa học. 15. Nguyễn Khắc Tuấn (1996). Giáo trình Vi sinh vật học. NXB Nơng nghiệp Hà Nội, 1996. 16. Viện sinh học nhiệt đới (2005). “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm BIO-F sản xuất phân bĩn hữu cơ vi sinh từ rác thải sinh hoạt” Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề tài khoa học. II. TÀI LIỆU NƯỚC NGỒI 17. Attar, A.J. and J.T. Brake. 1988. Ammonia control: Benefits and trade- offs. Poultry Digest, August, 1988. 18. Ahmed, T. & Kanwal, R. (2004). Biochemical characteristics of lactic acid producing bacteria and preparation of camel milk cheese by using starter culture. Pakistan Veterinary Journal, 24, 87-91. 19. Anjum M. I., Khan A. G., Azim A., Afzal M. (2005). Effect of dietary supplementation of multi-strain probiotic on broiler growth performance. Pakistan Vet. J., 2005. 25(1). 20. Bayane A, Roblain D, Dauphin RD, Destain J, Diawara B, Thonart P(2006). Assessment of the physiological and biochemical characterization of a Lactic acid bacterium isolated from chicken faeces in sahelian region. Afr. J. Biotechnol. 5: 629-634. 21. Belfiore, C., P. Castellano and G. Vignolo, 2007. Reduction of Esche- richia coli population following treatment with bacteriocins from lactic acid bacteria and chelators. Food Microbiology, 24: 223-229. 22. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2nd ed. 2004), 23. Bromberg Renata, Izildinha Moreno, Cintia Lopes, Zaganini, Roberta Regina Delboni, Josiane de Oliveira, (2004). Isolation of Bacteriocin Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 78 producing Lactic acid bacteria from meat amd meat products and its spectrum of inhibitory activity. Brazilian J. Microbiol., 35, 137-144. 24. Carlie F. S. (1984). Ammonia in Poultry Houses: A Literature Review. World's Poultry Sc. 40:99-111. 25. Carr, L. E., F.W.Wheaton, and L.W. Douglas (1990). Empirical models to determine ammonia concentrations from broiler litter. Trans. ASAE 33:1337–1342. 26. Chang M. H. và. Chen T. C (2003). Reduction of Broiler House Malodor by Direct Feeding of a Lactobacilli Containing Probiotic. International Journal of Poultry Science 2, 2003. (5): 313-317. 27. Chiang, S. H. and W. M. Hsieh, 1995. Effect of direct-fed microorganisms on broiler growth performance and litter ammonia level. Asian-Aust. J. Anim. Sci., 8: 159-162. 28. Delves-Broughton J., Blackburn P., Evans R.J., Hugenholtz J. (1996): Applications of the bacteriocin, nisin. Antonie van Leeuwenhoek, 69: 193–202. 29. Desouky SG, Ibrahim SM. Effect of antimicrobial metabolites produced by lactic acid bacteria (Lab) on quality aspects of frozen tilapia (Oreochromis niloticus) fillets. World Journal of Fish and Marine Sciences. 2009;1(1):40–45. 30. Drummond, J.G., S.E. Cursi, J. Simon and H.W. Norton. 1980. Effects of aerial ammonia on growth and health of young pigs. J. Animal Sci. 50:1085-1091. 31. Ennahar S., Sashihara T., Sonomoto K., Ishizaki A. (2000). Class IIa bacteriocins: biosynthesis, structure and activity. FEMS Microbiol. Rev. 24, p. 85–106. 32. Gürdil G. A. K., Kic P., Yıldız Y., Ưner Đ. (2001). The Effect of Hot Climate on Concentrations of NH3 in Broiler and Laying-Hen Houses. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 79 International Conference on Weather Extremes as a Limiting Factor of Biometeorological Processes. International Bioclimatological Workshop, Racková – Slovak Republic. 33. Havenaar, R., Ten Brink, B. and Huis in’t Veld J. H. J. (1992). Selection of strains for Probiotic use. In: Probiotics. The Scientific Basis, R. Fuller (Ed.) (Chapman & Hall, London) pp. 209–221. 34. Liu, Z. F.; Wang, L. J.; Beasley, D.; Oviedo, E (2007). Effect of moisture content on ammonia emissions from broiler litter: A laboratory study. J. Atmos. Chem. (2007) 58: 41-53. 35. Lodder, J. (Ed.) (1971): The yeasts. 2nd Ed.Amsterdam. London. North- Holland Publ. Comp. 1385 pp. 36. Nair, P.S. and Surendran, P.K. (2005). Biochemical Characterization of lactic acid bacteria isolated from fish and prawn. J. of Culture Collections, 4:48-52. 37. Nes IF, Holo H. 2000. Class II antimicrobial peptides from lactic acid bacteria. Biopolymers 55:50-61. 38. Nettles CG, Barefoot SF (1993). Biochemical and genetic characteristics of Bacteriocins of food-associated lactic acid bacteria. J. Food Prot. 56: 338-356. 39. O’Dea E. E., Fasenko G. M.,. Allison G. E, Korver D. R., Tannock G. W., Guan L. L. (2006). Investigating the Effects of Commercial Probiotics on Broil Chick Quality and Production Efficiency. Poult Sci 2006. 85:1855-1863. 40. Olaoye OA, Onilude AA (2009). Isolation and biochemical profiles of numerous strains of lactic acid producing bacteria from various parts of a domestic West African goat (Capra hircus). Australian J. Basic and Appl. Sci. 3: 460–466. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 80 41. Oliveira, B.P, Afonso, deL., and M.A. Gloria (2008). Screening of lactic acid bacteria from packaged beef for antimicrobial activity. Brazilian J. Microbiol. 39, 368-374. 42. OYETAYO V.O., ADETUYI F.C., AKINYOSOYE F.A. (2003): Safety and Protective effect of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei used as probiotic agent in vivo. Afr. J. Biotech. 2, 448-452. 43. Rodrigeuz M J., Cintas L.M, Casus P., Honr N., Dodd H.M, Hernandez P.E, Gasson M.J (1992).“ Isolation of nisin producing Lactococcus lactis trains from dry fermented sausages”. Journal of applied Bacteriology 73 (1992) 290-298. 44. Schillinger, U., R. Geisen, W.H. Holzapflel, 1996. Potential antagonistic micro-organisms and bacteriocins for the biological preservation of foods. Trends of Food Science and Technology, 7: 158-208. 45. Trương Khải Bình, Tưởng Ái Quốc, Hồng Thừa, Lý Thăng Hoa (2009) “ Kỹ thuật nuơi lợn bằng độn lĩt lên men sinh thái của vi sinh vật hoạt tính ” Cục khuyến nơng Nam Ninh (2009) (tiếng Trung Quốc). 46. Wathes C.M. (1998). Aerial emissions from poultry production. World's Poultry Science Journal, 54 , pp 241-251. 47. Yeo, J. and K. Kim (1997). Effect of feeding diets containing an antibiotic, a probiotic, or yucca extract on growth and intestinal urease activity in broiler chicks. Poult. Sci., 76: 381-385. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 81 PHỤ LỤC 1. Các phản ứng sinh hĩa 1.1. Phản ứng catalaza (catalase test): Lấy 1 ít khuẩn lạc của các mẫu cần kiểm tra (mới nuơi cấy được 1 ngày) đặt lên phiến kính, nhỏ lên đĩ 1 vài giọt oxy già (H2O2 3%). Kết quả: Dương tính: Cĩ bọt khí sủi lên Âm tính: Khơng cĩ bọt khí. 1.2. Phản ứng Voges-Proskauer tets (VP test) và Methyl Red (MR test) Hai phản ứng này sử dụng mơi trường cấy các chủng cần kiểm tra vào mơi trường Clark and Lubb, cơng thức như sau: Peptone: 5g K2HPO4: 5g Glucoza: 5g Nước cất: 1000ml ðiều chỉnh pH=7,0-7,2 Mơi trường được chia vào ống nghiệm, 1 ống làm phản ứng VP, 1 ống làm phản ứng MR. 1.3. Phản ứng VP Pha thuốc thử VP reagent: A: 5% alpha napthol trong cồn tuyệt đối (5g alpha napthol /100ml cồn). B: 40% KOH (40g KOH /100 ml nước cất). Lấy 1ml dung dịch nuơi cấy đã dược 24h ở trên cho vào ống nghiệm; cho thêm 15 giọt VP reagent A, lắc nhẹ cho đều; cho thêm 5 giọt VP reagent B, lắc nhe cho đều. Kết quả: Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 82 Dương tính: Dung dịch nuơi cấy chuyển sang màu đỏ trong 20 giây. Âm tính: Dung dịch nuơi cấy chuyển sang màu vàng trong 20 giây. 1.4. Phản ứng MR (MR test) Pha thuốc thử methyl đỏ: 0.1g methyl đỏ trong 300ml dung dịch cồn 95%, sau đĩ cho thêm nước cất cho đủ 500ml. Lấy 0.5ml dung dịch nuơi cấy đã được 24h trên cho vào ống nghiệm nhỏ, cho thêm 10-15 giọt thuốc thử methyl đỏ, lắc nhẹ cho đều. Kết quả: Dương tính: Dung dich nuơi cấy chuyển sang màu đỏ. Âm tính: Dung dich nuơi cấy chuyển sang màu vàng. 1.5. Phản ứng citrate Làm mơi trường thạch nghiêng gồm mơi trường Simmon's citrate: NH4H2PO4: 1g Agar: 15-20g Bromothylmol blue: 0,08g NaCl: 5g K2HPO4: 1g Nước cất: 1000ml MgSO4: 0,2g Na3C6H5O7: 2g ðiều chỉnh PH =7 (mơi trường cĩ màu xanh lá cây). Chọn khuẩn lạc mới nuơi cấy 18-24 h, ria cấy trên bề mặt mơi trường, nuơi cấy ở 370C/18-24h. Kết quả: Dương tính: Mơi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh tím. Âm tính: Mơi trường khơng chuyển màu. 1.6. Phản ứng OF (Oxidation/Fermentation test) Mơi trường Hugh & Leifon: Peptone: 2g NaCl: 5g Nước cất: 1000ml K2HPO4: 0,3g Bromothylmol blue: 0,08g Glucoza: 10g Agar 2-5g Phân vào mỗi 2 ống nghiệm, mỗi ống 5ml, 1/2 số ống cho đổ thêm 1ml paraffin lỏng/1 ống (để tạo mơi trường yếm khí). Nuơi cấy khuẩn lạc, cấy Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 83 trích sâu vào mơi trường, mỗi chủng cấy vào một ống hiếu khí và một ống yếm khí. Nuơi cấy ở 370C/24-48h. Kết quả: Dương tính: O: Ống hiếu khí chuyển màu vàng, ống yếm khí màu xanh. F: Cả 2 ống chuyển màu vàng. Âm tính: Cả 2 ống màu xanh (khơng chuyển màu). 1.7. Các phản ứng lên men đường Sử dụng các loại đường sau: glucoza, saccharoza, xyloza, galactoza, rafinoza, lactoza, maltoza. Chuẩn bị dung dịch đường 10% (của tất cả các loại đường trên): 10g đường pha với 100ml nước cất, điều chỉnh pH=7,2, hấp tiệt trùng bằng phương pháp Tyndall (hấp cách thủy ngắt quãng trong 3 ngày liên tiếp). Chuẩn bị dung dịch peptone: gồm peptone (10g/l), NaCl (5g/l), điều chỉnh pH=7,2 . Phân vào các ống nghiệm, mối ống 5ml, hấp tiệt trùng ở 1210C/15- 20 phút. Cho thêm vào mối ống 1-2 giọt chỉ thị màu phenol đỏ 0,1%, hấp tiệt trùng ở 1210C/15-20 phút. Mỗi ống cho thêm 0,5ml dung dịch đường 10% và 1-2 giọt chủng giống nuơi cấy trên mơi trường dịch thể, để tủ ấm 370C/24-48h. Chỉ tiêu theo dõi: Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ màu đỏ sang màu vàng. Quan sát sự hình thành khí CO2 . ðánh giá kết quả: Quá trình lên men chậm thường sau 48 giờ mới đổi màu. Màu vàng nâu đậm, đục ít. ++: Lên men trung bình, dung dịch đổi màu sau 24h, mơi trường đục, màu vàng rơm. +++: Lên men mạnh: dung dịch đổi màu chỉ sau 12h nuơi cấy, mơi trường đục, màu vàng chanh nhiều cặn dưới đáy. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 84 2. Xác định hoạt lực tổng số Amylase của các chủng nấm men Phương pháp Wolhgemuth: Cho một lượng nấm men tác động lên dung dịch tinh bột, xác định mức độ phân giải tinh bột qua phản ứng màu với iod để đánh giá hoạt lực enzyme amylase qua hai chỉ tiêu: - ðộ dài thời gian (giờ) làm biến dung dịch 1% tinh bột tan thành dextrin khơng bắt màu với iod. - ðơn vị hoạt động của amylase (HdA- đơn vị Wolhgemuth) HdA(30oC/24h)= Ax B x C Trong đĩ: A) Lượng dung dịch tinh bột 1% B) Nơng độ dịch tinh bột 1% C) Nồng độ pha lỗng dịch men nguyên ở các ơng thử 3. Xác định hoạt tính enzyme protease Xác định sự phân giải protein (casein) của các chủng nấm men trên mơi trường thạch đĩa, sau đĩ đo đường kính vịng phân giải (mm) + Pha mơi trường Hansen sữa (thay peptone bằng sữa) đổ đĩa sau đĩ cấy các chủng ở ống thạch nghiêng sang đĩa. + ðiều chỉnh PH=7-7.2 + Khống chế ở nhiệt độ 370C. + Tiện hành trong tủ cấy vơ trùng - Thời gian theo dõi: 24h. - Chỉ tiêu theo dõi: + ðo vịng phân giải protein bằng thước cĩ chia đến mm 4. ðánh giá khả năng sinh trưởng và tạo sinh khối của các chủng nấm men trên các mơi trường khác nhau Theo dõi khả năng sinh trưởng của nấm men trên các mơi trường dinh dưỡng khác nhau. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 85 - Mục đích: Chọn ra các chủng nấm men phát triển tốt trên các mơi trường và thích ứng với điều kiên sản xuất hiện nay ở nước ta. ðơng thời thơng qua đĩ để xác định mơi trường thích hợp nhất cho nấm men phát triển. - ðiều kiện thí nghiệm: + Lượng men cấy vào mơi trường phải đồng đều nhau. + Ở cùng điều kiện nhiệt độ: 32-370C. + ðiều chỉnh pH=5.5-6 + Các mơi trường nuơi cấy gồm các thành phần sau: Thành phần các mơi trường dinh dưỡng nuơi cấy nấm men Mơi trường dịch cám gạo Mơi trường dịch sắn Mơi trường bột ngơ Cám gạo loại 1: 150g Bột sắn: 150g Ngơ nghiền bột mịn: 150g (NH4)2SO4: 0,6% (6g) (NH4)2SO4: 0,6% (6g) (NH4)2SO4: 0,6% (6g) MgSO4: 0,3% (3g) MgSO4: 0,3% (3g) MgSO4: 0,3% (3g) K2HPO4: 0,3% (3g) K2HPO4: 0,3% (3g) K2HPO4: 0,3% (3g) Nước cất: 1000ml pH=5,5-6 - Thời gian theo dõi: 12h, 24h, 48h. - Chỉ tiêu theo dõi: + Quan sát đặc điểm lên men trên các mơi trường + Tốc độ sinh trưởng của giống men nghiên cứu (đếm số lượng tế bào ở các thời điểm trên bằng buồng đếm Neubauer) + Tích lũy sinh khối ở 48h. 5. ðánh giá khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau * Theo dõi khả năng sinh trưởng của các chủng giống nấm men ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. - Mục đích: Chọn ra các chủng giống nấm men cĩ khả năng sinh trưởng tốt ở các nhiệt độ khác nhau. Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… 86 - ðiều kiện thì nghiệm: + Cùng một mơi trường Hansen dịch thể. + Lượng TB/1ml mơi trường là tương đối đồng đều nhau. + Nuơi cấy ở các nhiệt độ sau: 250C, 300C, 350C, 450C, 600C. - Thời gian theo dõi: 24h, 48h. - Chỉ tiêu theo dõi: + ðếm tổng lượng tế bào ở các thời điểm trên (đếm bằng buồng đếm Neubauer). + Quan sát các đặc điểm lên men Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp …………………… i ._.