Nhân nhanh PLB Mẫn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) trong một số hệ thống khác nhau

CÔNG NGHỆ SINH HỌC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HỌ VÀ TÊN: TRẦN XUÂN NGỌC HUY MSSV: 106111012 NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP: 06DSH Đầu đề đồ án tốt nghiệp NHÂN NHANH PLB MÃN THIÊN HỒNG (Doritaenopsis sp.) TRONG MỘT SỐ HỆ THỐNG NUÔI CẤY KHÁC NHAU. Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu): Xác định môi trường tối ưu nhất để nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.). So sánh khả năng nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) trong một số hệ thống nuôi cấy khác nhau: rắn, lỏng tĩnh, lỏng lắc. Bước đầu thực hiện nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) bằng hệ thống Bioreactor tự tạo. Ngày giao Đồ án tốt nghiệp: ngày 01/04/2010. Ngày hoàn thành Đồ án: 28/06/2010. Họ tên người hướng dẫn Phần hướng dẫn CN. Bùi Văn Thế Vinh Toàn bộ Đồ án Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thông qua Bộ môn Ngày …… tháng …… năm 2010 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN Người duyệt (chấm sơ bộ):……………………………. Đơn vị:………………………………………………… Ngày bảo vệ:…………………………………………... Điểm tổng kết:………………………………………… Nơi lưu trữ Đồ án tốt nghiệp:…………………………. LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám hiệu Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Khoa Môi Trường & Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại Trường. Thầy Bùi Văn Thế Vinh đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài, cũng như khoảng thời gian bốn năm em được học tại Trường. Thầy Cô quản lý phòng thí nghiệm: Thầy Huỳnh Văn Thành, Thầy Nguyễn Trung Dũng, Cô Vũ Ngọc Yến Ly đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành tốt Đồ án này. Xin gửi lời cảm ơn đến bạn Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thu Thảo, Nguyễn Hoài Mỹ, Dương Thúy Vy, Thiều Quang Thiên Lý cùng tất cả các bạn trong lớp 06DSH đã gắn bó, giúp đỡ em trong suốt bốn năm qua. Con xin vô cùng biết ơn Bố Mẹ, Các Chị cùng Em gái đã động viên, khuyên bảo và cổ vũ tinh thần để con hoàn thành tốt bốn năm đại học và Đồ án tốt nghiệp này. Sinh viên thực hiện: Trần Xuân Ngọc Huy MỤC LỤC Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, các đ62 thỊ, các bản vẽ DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN: acid deoxynucleotide ABA: abscisic acid BA: 6 - benzyladenine BAP: N6 - benzylaminopurine CĐHSTTV: chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Dtps: Doritaenopsis IAA: indole – 3 – acetic acid GA3: gibberellic acid KNA: potassium α naphtaleneacetate MS: Murashige và Skoog NAA: α – naphtaleneacetic acid PLB: protocorm – like - body Phal: Phalaenopsis 2,4-D : 2,4 – dichlorophenoxyacetic acid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách các loài Mãn Thiên Hồng trên thị trường. Bảng 2.1: Môi trường MS ½ bổ sung BA và NAA ảnh hưởng lên sự nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng. Bảng 3.1: Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự tăng sinh PLB Mãn Thiên Hồng Doritaenopsis sp. Bảng 3.2: Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh PLB Mãn Thiên Hồng. Bảng 3.3: Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh PLB Mãn Thiên Hồng. Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các hệ thống nuôi cấy khác nhau lên sự hình thành PLB Mãn Thiên Hồng. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, CÁC ĐỒ THỊ, CÁC BẢN VẼ Hình 1.1: Mãn Thiên Hồng Hình 1.2: Một số loài Mãn Thiên Hồng thương mại Hình 1.3: Một số loài Mãn Thiên Hồng thương mại. Hình 1.4: Hình thái PLB được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi. Hình 1.5: PLB được nhân nhanh trong môi trường rắn Hinh 1.6: Hai dạng bioreactor phổ biến Hình 3.1: Hệ thống bioreactor tự tạo. MỞ ĐẦU Mục đích nghiên cứu: Ngày nay, sự đam mê thưởng thức cây cảnh của người dân ngày càng một gia tăng, để đáp ứng nhu cầu đó, cùng với sự tiến bộ và phát triển của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là công nghệ sinh học đã lai tạo ra nhiều loại hoa quý có nhiều màu sắc đa dạng và phong phú. Việc nhân giống bằng kỹ thuật thông thường như trước đây chưa cung cấp số lượng cây con cho thị trường tiêu thụ nên đòi hỏi phải có một kỹ thuật mới ra đời, đó là nhân giống vô tính in – vitro. Phong Lan Mãn Thiên Hồng là một trong những cây cảnh được mọi người ưa chuộng nhiều vì hoa có màu sắc đẹp, phát hoa có nhiều hoa, lâu tàn, dễ dàng chăm sóc và có thể đặt ở những nơi ít ánh sáng. Chính vì thế, rất tiện lợi khi trồng trong nhà, nên rất thích hợp cho việc trồng thưởng thức của người dân ở Thành Phố. Cây Phong Lan Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) có giá trị kinh tế cao ở trong nước cũng như nước ngoài. Trong tự nhiên cây Phong Lan Mãn Thiên Hồng tăng trưởng chậm. Thông thường, việc tạo cây con trong tự nhiên được thực hiện bằng hạt và bằng cách tách chiết, tuy nhiên với phương pháp này thời gian nhân giống rất dài và hệ số nhân giống rất thấp, hơn nữa cây con tạo thành có sức sống không cao. Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, ngành vi nhân giống cây trồng, đặc biệt trên đối tượng cây hoa lan từng bước phát triển, nhiều đơn vị nhà nước cũng như tư nhân đã mạnh dạn đầu tư để sản xuất cây giống phục vụ cho nông dân. Tuy nhiên việc phát triển sản xuất hoa lan trong nước còn gặp nhiều khó khăn đặc biệt là cây giống. Các cơ sở sản xuất cây giống trong nước không đủ đáp ứng nhu cầu sản xuất, các nhà vườn phải nhập cây giống từ nước ngoài bằng nhiều hạn nghạch khác nhau. Điều này rất khó khăn cho việc kiểm soát dịch bệnh và gây thụ động trong sản xuất hoa thương phẩm. Vì vậy, việc tập trung phát triển sản xuất cây giống trong sản xuất là cấp thiết ở nước ta hiện nay. . Đề tài “Nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) trong một số hệ thống nuôi cấy khác nhau” nhằm mục đích tìm ra môi trường thích hợp nhất để nhân PLB Mãn Thiên Hồng Doritaenopsis sp. nhằm đạt hiệu suất nhân giống cao nhất, đồng thời xác định với hệ thống nuôi cấy nào sẽ cho hiệu suất nhân nhanh cao nhất. Đồng thời bước đầu thử nghiệm trên hệ thống Bioreactor tự tạo. Ý nghĩa thực tiễn: Hiện nay để nhân giống các loại Lan, giai đoạn nhân PLB – một giai đoạn chuyển tiếp từ hạt sang phôi – được ứng dụng rộng rãi và sử dụng phổ biến. Nó không những ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng cây giống mà còn ảnh hưởng đến chất lượng hoa thương phẩm. Việc nhân PLB chất lượng cao là tiền đề thúc đẩy phát triển cây Lan giống trong nước, góp phần khắc phục hiện tượng thiếu hụt cây giống trong sản xuất hiện nay, từng bước nâng cao trình độ kỹ thuật nhân giống và thu nhập cho người sản xuất, hạn chế sự lây lan nguồn bệnh từ nước ngoài qua con đường nhập cây giống. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Sơ lược về Phong Lan Mãn Thiên Hồng: Phân loại cây Phong Lan Mãn Thiên Hồng: Cây Phong Lan Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) là loài cây đơn thân, sống biểu sinh, thuộc: Ngành: Magnoliophyta Lớp : Liliopsida Bộ : Orchidales Họ : Orchidaceae Hình 1.1: Mãn Thiên Hồng Mãn Thiên Hồng là một loại lan lai. Chúng được lai từ Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) và Kim Hồ Điệp (Doritis sp.). Do đó Mãn Thiên Hồng được mang cả hai ưu điểm của cây cha và mẹ như hoa nhiều, to, đẹp và cây dễ trồng, rất khỏe chịu đựng được nhiều mức độ khí hậu khác nhau. Sự sinh trưởng và phát triển của Mãn Thiên Hồng ngoài tự nhiên: Cơ quan dinh dưỡng: Cơ quan dinh dưỡng bao gồm một trục đơn thân, tạo ra bởi một đỉnh sinh trưởng hoạt động liên tục, có hai hàng lá, xếp đối diện, cách nhau bởi những đốt thân rất ngắn, không có giả hành. Lá hơi mọng nước hình dạng đơn giản (elipe thuôn dài, ngọn giáo), có bẹ ôm thân, lá dưới cùng héo rụng thì lá mới mọc lên từ ngọn. Tổng quan một cây có từ 4 – 5 lá hoạt động. Mỗi trục lá có hai chồi xếp chồng, chồi bên trên cho một trục phát hoa sau khi cảm ứng ra hoa, chồi bên dưới cho ra một cây con trong trường hợp có sự cố về hoạt động của đỉnh sinh trưởng ngọn. Rễ bất định khí sinh được mọc từ gốc của thân xuyên qua bẹ lá. Rễ rất nhiều và phân nhánh, rễ mập, dầy nạc, sự phân nhánh này tùy thuộc vào sự sinh trưởng của cây. Rễ bám chặt trên giá thể. Cây hút hơi nước trong không khí và những khoáng chất từ những cây mà nó sống bám trên đó, màu xanh của rễ cho thấy chắc chắn chúng có hoạt động quang hợp. Cơ quan sinh sản: Sự tạo thành trục phát hoa sớm được phân biệt với sự phát triển của rễ. Sự xuất hiện của đầu trục phát hoa tạo thành một khe thẳng xuyên qua bao vỏ lá, trục phát hoa bên, đơn giản hay phân nhánh, mang hoa ở hai bên, hoa đính vào trục nhờ cuống hoa. Trong khi ấy, sự xuất hiện của rễ được ghi nhận bởi một sự mở vòng tròn. Khi một hay hai trục phát hoa sinh ra từ những chồi bên. Chúng sẽ cạnh tranh các chất dinh dưỡng của cây. Trong trường hợp hai phát hoa xuất hiện cùng một lúc, thì sự phát triển của nó tùy thuộc vào thứ tự ngọn, nhưng không phải lúc nào cũng có trường hợp trên. Trong giai đoạn trổ hoa, sự phát triển của cơ quan dinh dưỡng có phần bị chậm lại, nhưng nếu cây được tưới nước và dinh dưỡng đầy đủ thì cây vẫn tiếp tục tăng trưởng tốt. Những đoạn lóng mang các mầm hoa có chiều dài thay đổi rất khác nhau, tùy thuộc vào giống và chế độ trồng trọt (Troll, 1974) (trích từ Võ Thị Bạch Mai, 1996). Các mầm bên trên của nhánh phát hoa được bao bởi những lá thu nhỏ lại, mỗi mầm sẽ phát triển thành chồi dinh dưỡng hoặc chồi sinh sản sau khi xử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật (CĐHSTTV). Cây Mãn Thiên Hồng không có giai đoạn nghỉ, khi nhiệt độ thấp sự tăng trưởng của cây hoàn toàn chậm lại để cảm ứng ra hoa. Dưới cùng một chế độ cảm ứng như cùng một vĩ tuyến, vào mùa đông các cây trồng trong nhà kính thì thời kì trổ hoa tùy theo loài. Đối với những giống lai, giai đoạn trổ hoa khó có thể xác định một cách chính xác. Sau khi được thụ phấn, bầu noãn lớn dần, khoảng tám đến chín tháng sau thì trái chín. Trái chứa rất nhiều hạt, hạt nhỏ li ti, không có phôi nhũ, phôi không phân hóa. Cây Mãn Thiên Hồng trên thị trường: Bảng 1.1. Danh sách các loài Mãn Thiên Hồng trên thị trường. Tên Nguồn gốc Đặc điểm Doritaenopsis Phalaenopsis Tom Boy x Doritaenopsis (Mt Beauty x Hama Lip) Cành hoa dài, cánh hoa màu trắng. Môi màu đỏ, đôi khi có ánh hồng. Doritaenopsis Dtps (Minho Princess x Nobby's Purple) Hoa màu hồng với những đường kẻ sọc màu hồng, đôi khi có chấm. Doritaenopsis Dtps [I-Hsin Actor x (Tom Boy x Mount Beauty)] Hoa màu trắng với màu với môi màu đỏ tương phản. Doritaenopsis  Dtps (Purple Gem x Taisuco Jewel) Hoa màu hồng và gần giống với Queen Beer. Doritaenopsis Dtps [Tom Boy x (Mount Beauty x Hama Lip) x I-Hsin Actor] Hoa màu trắng trong suốt với các môi màu hồng đến màu đỏ Doritaenopsis Dtps I-Hsin Model "KH6079" x (Sogo Davis x Minho Valentine) 86-3#1" Được nhân giống nhiều. Hoa có màu hồng đậm. Doritaenopsis  Dtps (Sweet Strawberry x Luchia Smile) Cành hoa dài phân nhánh với những bông hoa màu hồng, đỏ tươi. Doritaenopsis Chain Xen Pearl Phal Ching Hua Spring x Dtps Nobby's Pink Lady Hoa màu hồng với những chấm nhỏ màu trắng trên nền cánh hoa sẫm màu Doritaenopsis Fuchsia Princess Dtps pulcherima x P Coral Gleam Hoa màu sáng bóng với những cánh môi sẫm màu Doritaenopsis Han Ben's Girl 'HB728' Dtps (Tom Boy x Han Ben's Lip) Những bông màu trắng, lớn. Tương phản với những cánh môi màu đỏ. Dtps. I-Hsin Black Jack"KH5686#100" Phal Golden Peoker x Dtps Leopard Prince Hoa màu trắng sữa với những đường sọc kẻ màu hồng. Dtps. I-Hsin Black Jack"KH5706’ Phal Golden Peoker x Dtps Leopard Prince Hoa màu tím, cứng. cánh môi màu trắng Doritaenopsis I-Hsin Golden Prince Phal Golden Sun x Dtps Leopard Prince Hoa màu trắng được tô điểm them những chấm màu trắng. Doritaenopsis I-Hsin Idol Phal Chih Shang's Stripes x Dtps Minho Princess Đẹp nhất, dễ trồng. Có hoa màu hồng. Doritaenopsis I-Hsin Purple Jewel Dtps Purple Gem x Dtps Taisuco Jewel Cành hoa trãi rộng với những bông hoa màu đỏ tươi Doritaenopsis I-Hsin Sesame"KH5783#1" Phal Ching Her Buddha x Dtps Leopard Prince Hoa màu trắng Doritaenopsis I-Hsin Spring Dtps (Minho Stripes x Leopard Prince) Hoa màu hồng đôi khi cũng có loài màu trắng với những chấm đỏ. Doritaenopsis Minho Venus Dtps  Minho Valentine x Phal New Cinderella Canh hoa dài, phân nhánh. Chứa đến 11 hoa màu hồng tối. Doritaenopsis Sogo Vivien 'Golden Vivien' Dtps Sogo Alice x Phal Zuma's Pixie Hoa màu tím với những đường viền màu trắng kem. Doritaenopsis Taida Salu ‘Taida’ Dtps (Salu Spot x Happy Beauty) Hoa màu đỏ tươi với những đường viền cánh hoa màu vàng kem.  Hình 1.2: Một số loài Mãn Thiên Hồng thương mại Hình 1.3: Một số loài Mãn Thiên Hồng thương mại. Các kỹ thuật nhân giống Mãn Thiên Hồng: Nhân giống in – vivo: Nhân giống Mãn Thiên Hồng bằng cách tạo cây con trên cọng phát hoa. Chồi của Mãn Thiên Hồng được tạo ra ngay trên đốt hoa có mang mầm ngủ bằng cách bao quanh đốt một lớp rêu nước để giữ ẩm (Shara, 1938, 1952) (trích trong Arditti và Ernst, 1993) [10]. Rêu nước cũng có thể được sử dụng tạo cây con từ các phần phát hoa cắt rời bằng phương pháp bán vô trùng (semiaseptic method) (Grimes, 1987)[13]. Trong những năm gần đây, chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng để cảm ứng tạo cây con trên phát hoa trong in – situ. Cytokinin được trộn với chất mang và xử lý trực tiếp lên phát hoa (Võ Thị Bạch Mai, 1996 )[9] hay ở dạng bột nhão quấn quanh đốt hoa (McFarlane, 1977; Brasch và Kocsis, 1980). Để cho kết quả tốt nhất, vật liệu sử dụng là cây Mãn Thiên Hồng đã ra hoa chứa cả nụ hoa và hoa đã nở (Arditti và Ersnt, 1993). Nhân giống in – vitro: Đốt phát hoa có mang mầm ngủ của cây Mãn Thiên Hồng được cắt thành những đoạn có kích thước 65mm được khử trùng và đặt trên môi trường biến đổi Vacin – Went. Kết quả là chồi được hình thành sau một tháng nuôi cấy. Hầu hết chồi đều có rễ khỏe sau hai tháng. Kết quả ghi nhận được từ nuôi cấy đoạn phát hoa có mang mầm ngủ của nhiều tác giả cho thấy từ các mầm ngủ gần cuối cùng của đoạn phát hoa sẽ phát triển tạo thành cây con trực tiếp còn các mầm ở vị trí trên sẽ phát triển tạo thành phát hoa thứ cấp, khi dùng phương pháp này không phá hủy và gây nguy hiểm đến cây mẹ, nhưng không được thuận lợi là sự hình thành mô sẹo rất khó xảy ra. Phương pháp này bị giới hạn chỉ có giá trị cho nhân giống tạo chồi từ đốt hoa nên hệ số nhân giống không cao (Arditti và Ersnt, 1993)[10]. Để cải thiện sự tăng trưởng chồi từ đốt thân Hồ Điệp người ta sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy, BAP kích thích tốt sự tăng trưởng chồi từ mầm ngủ (Koch, 1974)[14] . Khi tăng BA trong khoảng 0.1 – 3 mg/l, trọng lượng chồi cũng tăng theo. NAA hiện diện trong môi trường nuôi cấy làm giảm sự hình thành chồi (Tse và cộng sự, 1971). IAA, KNA (auxin – potassium α naphtaleneacetate) và 2,4-D làm tăng chiều dài của sơ khởi chồi nhưng lại ức chế các giai đoạn sau đó (Koch, 1974). Để kích thích tăng số lượng chồi thì các mầm ngủ trên các đoạn phát hoa được cảm ứng khi nuôi cấy trên môi trường REM có bổ sung 25mg/l BA. Rễ được cảm ứng hình thành khi chuyển chúng sang môi trường không chứa chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhưng có chứa 10% w/v dịch chiết chuối (Arditti và Ernst, 1993). Nhân giống lan Mãn Thiên Hồng thông qua việc gây vết thương trên các chồi con được tạo thành từ phát hoa. Một vài chồi thân hoa lan Mãn Thiên Hồng không tăng trưởng tiếp tục mà được cảm ứng để tạo thành mô sẹo (Tse và cộng sự, 1971; Hackett và cộng sự, 1973) [17]. Mỗi đốt mang chồi trước khi đặt vào môi trường Knudson C hay môi trường Mureshige – Skoog có hoặc không có bổ sung 2,0 mg/l NAA, phải gây vết thương bằng cách hoặc cắt theo hướng chéo và song song với trục thân hoặc đâm vào đỉnh chồi mầm ngủ bằng dao cấy vô trùng. Kết quả mô sẹo được hình thành (Arditti và Ernst, 1993)[10]. Trong môi trường Murashige – Skoog biến đổi, lá Mãn Thiên Hồng vừa mới nhú lên từ chồi con, được tách rời và cấy vào môi trưởng lỏng Vacin – Went biến đổi có bổ sung 2,5mg/l BAP và chứa 20% (v/v) nước dừa, kết quả là tạo được PLBs từ mô cấy (Tanaka và Sakanashi, 1978) [18]. Ngoài ra, có thể dùng môi trường MS lỏng có bổ sung IAA – ala và BAP để tạo ra số lượng lớn PLB từ chồi con có hai lá được phát triển từ mầm ngủ. Kết quả PLB được phát triển từ phần gốc lá (Arditti và Ernst, 1993) [10]. Tiền củ: Theo Edwin F. George Ph.D. năm 1993 cho rằng hạt lan chứa một phôi nhỏ có đường kính khoảng 0,1 mm và chúng không có nội nhũ dự trữ. Khi hạt nảy mầm, phôi tăng rộng để hình thành một cấu trúc nhỏ giống như là corm và được gọi là protocorm (tiền củ) và chúng phát triển thành một cực chồi và một cực rễ đối diện nhau. Trong tự nhiên, protocorm có màu xanh và tích tụ carbonhydrate thông qua quang hợp. Sự tích tụ dự trữ chất hữu cơ với mục đích là giúp cực chồi và cực rễ tăng trưởng thành cây hoàn chỉnh. Việc tạo somatic protocorm trong nuôi cấy in – vitro thì không tương tự như ở hạt, chính vì thế nhiều nhà nuôi cấy mô dùng thuật ngữ “protpcorm – like body (PLBs)” đại diện cho somatic protocorm. Champagnat và Morel (1972) và Norstog (1979) xem sự tạo PLB như là một giai đoạn đặc biệt trong con đường phát triển phôi. Như vậy, protocorm đại diện như là một giai đoạn sinh phôi sớm. Sự tạo thành protocorm ở họ lan được xem như là đại diện cho sự sinh phôi trực tiếp (protocorm hình thành từ mô cấy mà không qua giai đoạn tạo mô sẹo) hoặc sinh phôi gián tiếp (protocorm hình thành từ mô sẹo có khả năng sinh phôi)(Edwin F. George Ph. D., 1993) Tiền củ (protocorm) là thuật ngữ chỉ riêng cho họ orchidaceae. Chúng ta dùng thuật ngữ tiền củ để chỉ cho tất cả các giai đoạn mà khối mô chưa hình thành lá. Tiền củ không có hình dạng rõ ràng và chúng không có một cấu trúc hình thái rõ ràng như ở thân và rễ. Hình 1.4: Hình thái PLB được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi. Hình 1.5: PLB được nhân nhanh trong môi trường rắn Kỹ thuật nhân giống in vitro (nuôi cấy mô tế bào thực vật): Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro: Ưu điểm: Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ một cây trong vòng 1 – 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây. Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp. Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống. Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh. Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15 - 30% so với giống gốc. Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi. Nhược điểm: Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống. Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen. Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp. Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo. Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt. Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất điều hòa sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro: Nhân giống vô tính cây trồng thường trải qua các bước sau: Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Tạo thể nhân giống in – vitro Nhân giống in – vitro Tái sinh thành cây hoàn chỉnh in – vitro Chuyển cây ra vườn ươm để thuần hóa Nhân giống in – vitro Tạo cây con bầu đất. Đưa các cây ra đồng ruộng Chọn lọc cây đầu dòng. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng: Mẫu được nuôi cấy thường còn ở giai đoạn non, quá trình phân chia và phân hóa mạnh. Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng ở hầu hết các loại cây trồng. Ngoài ra, chồi đỉnh và chồi non của hạt mới nảy mầm cũng được sử dụng. Đỉnh sinh trưởng nhỏ được tách bằng kính lúp. Môi trường được sử dụng rộng rãi trong nhân giống hiện nay là môi trường Murashige và Skoog. Đối với mẫu dễ bị hóa nâu môi trường thường được bổ sung than hoạt tính hay ngâm mẫu với hỗn hợp ascorbic acid và citric acid (25-150 mg/l) Tạo thể nhân giống in – vitro: Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in – vitro. Có hai thể nhân giống in – vitro : thể chồi (multiple shoot) và thể cắt (cutting) đốt ngoài ra còn có tiền củ (protocorm). Tạo thể nhân giống in –vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên có những cây trồng không có khả năng nhân giống người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi bằng mô sẹo. Để tạo thể nhân giống trong môi trường thường bổ sung Cytokinin, Auxin, GA3 và các chất hữu cơ khác. Nhân giống in – vitro: Là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nuôi cấy kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được nhanh chóng. Cây nhân giống in – vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn. Tái sinh cây hoàn chỉnh in – vitro: Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân lá và rễ chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh nhằm đảm bảo sức sống khi ra ngoài môi trường bên ngoài. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy tương tự với quá trình nuôi cấy ngoài tự nhiên, một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in – vitro. Thường dùng các chất thuộc nhóm auxin kích thích ra rễ. Chuyển cây in – vitro ra vườn ươm: Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in - vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ. Khi chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn cây con dễ bị mất nước, mau bị héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm nuôi cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí mát, độ ẩm cao… Cây con thường được cấy trong luống ươm có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp giữ được ẩm. Trong những ngày đầu cần được phủ nilon để giảm quá trình thoát hơi nước. Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần lụi đi và rễ mới xuất hiện. Cây con thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ. Nhân giống ex – vitro: Cây con sau khi được chuyển ra luống ươm hay cấy vào bầu đất sau 7-10 ngày thì bắt đầu ra rễ. sau đó được phun dinh dưỡng với hỗn hợp N, P, K (1g/l cho mỗi loại). Tuy nhiên do quá trình nhân giống in vitro có nhiều tốn kém thì cây con được sử dụng như là cây mẹ và được tiếp tục nhân giống trên luống ươm. Điều kiện nhân giống trên luống ươm phải tiếp tục đảm bảo cây mẹ ở trạng thái tốt nhất bằng cách giảm dinh dưỡng, duy trì độ ẩm cao, nhiệt độ không khí thấp…Hệ số nhân giống trên luống ươm càng cao giúp cho việc giảm giá thành càng có ý nghĩa. Cây con bầu đất: Cây con từ ống nghiệm hay được nhân giống trên luống ươm được cấy trên luống đất 15-20 ngày cho cây ra rễ và phát triển khỏe, sau đó được cấy vào bầu đất (cây chuối). Bầu đất có cơ chất xốp đầy đủ chất dinh dưỡng tỉ lệ đất/phân là 1/1, ngoài ra hàng tuần được phun dinh dưỡng khoáng 1-2 lần/tuần thường dùng phân khoáng có tỉ lệ N- P- K: 20-20-20. Thời gian cây con ở giai đoạn bầu đất phụ thuộc đặc điểm cây trồng khoảng 20 ngày (khoai tây) đến 2,5 tháng (cây chuối). Cây bầu đất được đặt ở nơi có nhiều ánh sáng, độ ẩm cao, nhiệt độ không khí mát để cây phát triển nhanh và khỏe. Trồng cây ra ruộng: Cây con sau khi đạt được kích thước về chiều cao, số lá đường kính thân thích hợp sẽ được chuyển ra trồng ở đồng ruộng. Duy trì độ ẩm cao trong giai đoạn này giúp cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên, các nhân tố nông học khác được tác động giống như cây trồng tập quán. Chọn lọc cây đầu dòng: Là vấn đề quan trọng đối với cây ăn trái nhằm tạo ra một quần thể đồng đều có năng suất cao và ổn định. Những cây được chọn đầu dòng được đưa vào nhân giống trở lại bằng nuôi cấy mô. Hiện tại công nghiệp nhân giống được ứng dụng nhiều trong kinh tế để giải quyết nhu cầu về giống cho sản xuất, giống cho cây lâm nghiệp, trồng rừng, rau, ngũ cốc, cây ăn trái, hoa và cây dược liệu. Các vấn đề liên quan đến nhân giống in – vitro: Ảnh hưởng của mẫu cấy và môi trường đến nhân giống in – vitro: Mẫu nuôi cấy: Các nhân tố khi chọn mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu. Kiểu gen: ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy, số lượng chồi tạo được, sự khác nhau về tăng sinh chồi, sự khác nhau về khả năng phát sinh phôi. Chọn cơ quan: hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng nuôi cấy in – vitro. Ví dụ: Nuôi cấy thân mầm cây để tạo protoplast có khả năng phát sinh phôi. Nuôi cấy lát cắt mỏng ở mô lá cây thuốc lá có thể tái sinh các cơ quan khác nhau như chồi và rễ phụ thuộc vào lớp mỏng tế bào ở bộ phận nào của cây được nuôi cấy và các hocmon được sử dụng. Tuổi và sinh lý: Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa tế bào. Tùy vào đối tượng cây thì có tuổi sinh lý khác nhau. Ví dụ: Khả năng tái sinh cao ở lá cây trưởng thành so với lá cây còn non. Ngược lại mẫu non cắt cành của Hedora helix dễ ra mẫu hơn so với mẫu trưởng thành và nuôi cấy lá non phát sinh cơ quan tốt hơn so với nuôi cấy lá trưởng thành. Sức sống của mẫu: Mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in – vitro . Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất ra cây sạch bệnh. Ảnh hưởng của môi trường: Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Nhưng các loài khác nhau có thể đòi hỏi môi trường nuôi cấy khác nhau. Samartin (1989) đã sử dụng 6 công thức muối đa lượng khác nhau đối với cây trà Camelia japonica và thấy rằng môi trường MS cho tốc độ sinh trưởng nhanh nhất khi thu mẫu từ cây non. Môi trường MS đã chứng tỏ không thích hợp cho mẫu lấy từ cây già, trong khi môi trường muối loãng hơn (Heller, 1953) lại cho kết quả khá. Tính độc của môi trường MS cũng được quan sát ở một số loài (Sommer, 1982; Vieitez, 1983) do môi trường này chứa hàm lượng muối đa lượng cao, có thể gây độc cho tế bào in – vitro, nhất là protoplast. Phương pháp đơn giản nhất là giảm nồng độ muối khoáng xuống 1/3 hoặc 1/2 (Grosser, 1994). Môi trường cơ bản MS có hàm lượng NH4NO3, KNO3 giảm một nửa, bổ sung thêm glutamine 1,550 mg/l, KCl 750 mg/l rất tốt cho nuôi cấy mô sẹo phôi hoá và giảm tích luỹ tinh bột ở một số giống Citrus (Grosser và Gmitter, 1990). Trong số các muối đa lượng, muối nitơ có ý nghĩa quyết định đến sự tái sinh chồi. Welander (1985) cho biết khi nồng độ NH4NO3 và KNO3 trong MS giảm đi 1/2, đỉnh sinh trưởng của dâu tây phát triển khá hơn, rễ tái sinh mạnh hơn. Giảm muối khoáng trong một số trường hợp có tác dụng tốt đối với sự ra rễ ở một số loài (Murashige, 1977; Hasegawa, 1980; Drew, 1987) như trường hợp chồi hoa hồng ra rễ tốt hơn khi nồng độ nitơ tổng số giảm (Hyndman cs., 1982). Nguồn carbon cũng rất quan trọng đối với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Nồng độ đường 1- 3 % được sử dụng phổ biến. Nồng độ đường sucrose cao hơn 3% tỏ ra độc ở một số trường hợp (Rublue và Kartha, 1985). Chong và Pua (1985) đã sử dụng sucrose, glucose, fructose and sorbitol nồng độ từ 1-7% trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng giống táo Ottawa 3 và thấy rằng nồng độ sucrose 3% là tối ưu cho sinh trưởng, 100% chồi tạo rễ và chất lượng cây con khoẻ mạnh. Trạng thái vật lý của môi trường cũng có ý nghĩa quan trọng trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Đa số các trường hợp người ta sử dụng môi trường agar nhưng khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng một số loài, môi trường lỏng tỏ ra tốt hơn (Mellor và Stace Smith, 1969). Nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thấp trong môi trường có thể làm giảm các biến dị tế bào soma (Grosser và Gmitter, 1990). Tế bào mô sẹo phôi hoá ở cây có múi có thể nuôi cấy và bảo quản lâu dài trong môi trường không có chất kích thích sinh trưởng. Tính bất định về mặt di truyền: Mặc dù kỹ thuật nhân giống vô tính được sử dụng nhằm mục đích tạo ra quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp này cũng tạo ra những quần thể biến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô sẹo và nuôi cấy tế bào đơn. Những biến dị này được nghiên cứu vận dụng vào cải thiện giống cây trồng nhưng rất ít những biến dị có lợi được báo cáo. Tần số biến bị hoàn toàn khác nhau và không lặp lại. nuôi cấy mô sẹo và tế bào đơn có sự biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh. Cây trồng biến dị tế bào soma qua nuôi cấy thường là biến dị về chất lượng, số lượng và năng suất, và biến dị này không di truyền. Nguyên nhân gây ra biến dị chưa được làm sáng tỏ chủ yếu là do những biến đổi trong vật chất di truyền như đứt gãy, chuyển đoạn ADN hoặc đảo đoạn. Những nguyên nhân gây biến dị tế bào soma là: + Kiểu di truyền + Thể bội : cây đa bội thể tần số biến dị cao hơn cây nhị bội + Số lần cấy truyền: số lần cấy truyền càng cao thì tần số biến dị càng lớn + Loại mô. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy: Hiện tượng hóa mẫu hóa nâu hay bị đen là chết mẫu hay làm giảm sự tăng trưởng. Nguyên nhân của hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều tannin hay hydroxyphenol có nhiều trong mô già hơn mô sẹo Một số phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu: Tách các phần._.