Nhân giống Lan Dendronbium anosmum, Dendrobium mini bằng phương pháp nuôi cấy mô. Nghiên cứu các loại giá thể trồng lan Dendronium mini thích hợp và cho hiệu quả cao

RỒNG LAN Dendrobium mini THÍCH HỢP VÀ CHO HIỆU QUẢ CAO TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TNTN BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ________________ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NHÂN GIỐNG LAN Dendrobium anosmum, Dendrobium mini BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ. NGHIÊN CỨU CÁC LOẠI GIÁ THỂ TRỒNG LAN Dendrobium mini THÍCH HỢP VÀ CHO HIỆU QUẢ CAO Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN Cộng tác viên: TRỊNH HOÀI VŨ Long Xuyên, tháng 8 năm 2009 LỜI CẢM ƠN Chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý Khoa học, Phòng Kế hoạch và tài vụ, và đặc biệt là Ban chủ Nhiệm Khoa Nông nghiệp & TNTN Trường Đại học An Giang đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này. Rất biết ơn Thầy Võ Tòng Xuân, Thầy Võ Tòng Anh, Thầy Trương Bá Thảo, Thầy Nguyễn Hữu Thanh đã nhiệt tình động viên và ủng hộ tôi thực hiện đề tài. Cùng với Nguyễn Thị Thúy Diễm, Trịnh Hoài Vũ và các đồng nghiệp trong bộ môn đã nhiệt góp sức cùng tôi nghiên cứu thực hiện đề tài này. Cô Mai Dung, cô Đặng Phương Trâm là những người Thầy đã chỉ dẫn cho tôi trong hai lĩnh vực trồng lan và cấy mô. Rất cám ơn Thầy Chương cùng các cán bộ phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành các thí nghiệm. Các em sinh viên lớp DH3SH, DH4SH và DH5SH1 đã góp sức cùng tôi thực hiện đề tài. Nguyễn Thị Mỹ Duyên i PHẦN TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Nông Nghiệp & TNTN, Trường Đại học An Giang từ tháng 02 năm 2006 đến tháng 02 năm 2008. Đề tài thực hiện với hai qui trình vi nhân giống lan Dendrobium anosmum và Dendrobium mini, và thử nghiệm ra cây Dendrobium mini trên nhiều loại giá thể khác nhau. Với tổng cộng là 6 thí nghiệm gồm 5 thí nghiệm trong phòng và 1 thí nghiệm ngoài vườn. Qui trình vi nhân giống lan Dendrobium anosmum - Trái lan Dendrobium anosmum sau khi được tự thụ 4 tháng, khử trùng và gieo cấy hạt vào môi trường thích hợp. Sau 3 tháng gieo cấy thì tất cả các hạt đều nẩy mầm tốt, tỉ lệ đạt được là ≥ 85% trên môi trường MS + 1 mg/l NAA và môi trường MS + 1 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA. - Sang giai đoạn nhân nhanh: Chồi lan Dendrobium anosmum phát triển và nhẩy chồi rất tốt trên môi trường MS + 2mg/l BA, ở thời gian 3 tháng sau khi cấy đạt 3,17chồi, chồi cao 20,6 mm. Môi trường MS không bổ sung BA cho kết quả nhân chồi rất thấp. Đồng thời khi sử dụng BA ở nồng độ cao (10mg/l) vào môi trường nhân chồi cũng cho kết quả tạo chồi thấp (1,5 chồi), xuất hiện chồi dị dạng, cây phát triển yếu. - Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: Chồi lan Dendrobium anosmum tạo rễ tốt nhất trên môi trường MS + 1 mg/l NAA. Sau 3,5 tháng tạo được cây hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn để đưa ra ngoài vườn. Như vậy, sau thời gian 9,5 tháng thì từ hạt lan gieo cấy đã cho ra được cây lan con hoàn chỉnh có thể đưa ra ngoài vườn trồng. Qui trình vi nhân giống lan Dendrobium mini - Giai đoạn nhân chồi: Chồi lan Dendrobium mini phát triển và nhẩy chồi rất tốt trên môi trường có bổ sung 1 mg/l BA. Xét về tính kinh tế thì môi trường MS/2 + 1mg/l BA cho hiệu quả cao hơn trong việc nhân nhanh chồi lan Dendrobium mini. Sau 2 tháng nhân chồi thì đã 3,8 chồi, chồi cao 1,26cm. - Sự tạo rễ lan Dendrobium mini: môi trường MS/2 + 0,2 mg/l NAA cho kết quả ra rễ tốt và lại có tính kinh tế hơn so với các môi trường MS. Sau 2 tháng, chồi lan tạo rễ tốt thành cây hoàn chỉnh để đưa ra vườn ươm. - Thử nghiệm ra cây trên nhiều loại giá thể khác nhau thì thấy rằng đối với lan Dendrobium mini trong giai đoạn đầu nuôi trồng (từ cây mới ra mô đến khi cây được 7,5 tháng tuổi) thì giá thể thích hợp nhất cho cây là dớn và dừa miếng. Như vậy, sau 4 tháng nuôi cấy đã cho ra được cây lan con Dendrobium mini hoàn chỉnh có thể đưa ra ngoài vườn trồng. Cây con thuần dưỡng 1 tháng trong vườn ươm với chế độ chăm sóc đặc biệt. Sau đó đưa ra vườn trồng. ii MỤC LỤC Lời cảm ơn……..……………………………………………………………………….....…i Phần tóm tắt .……..………………………………………………………………………....ii Mục lục …………………………………………………………………………………….iii Danh sách bảng .……..………………………………………………………………..……vi Danh sách hình .……..………………………………………………………………...…...vii Danh mục các chữ viết tắt………………………………………………………………....viii CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU ….……..……………………………………………………….....1 I. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ….……..………………….……..….…….1 1. Mục tiêu ….……..………………………………..……………………….…………..….1 2. Nội dung ……………………….….……..……………………………….…………...….2 II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VỊ NGHIÊN CỨU ………………………………………..…2 1. Đối tượng ….……..………………………………..……………………….…………….2 2. Phạm vi ……………………….….……..……………………………….……………….2 III. CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .………………………….....3 1. Cơ sở lý thuyết … .……..…………………………………………………………...........3 1.1 Giới thiệu về giống lan Dendrobium …………….….……..….…………………….......3 1.1.1 Phân loại và phân bố …………………………………….……………………………3 1.1.2 Đặc điểm hình thái .……………………………………….…………………………..4 1.1.3 Lan Giả hạc (Dendrobium anosmum)…………………….…………………………...5 1.1.4 Lan Dendrobium mini …………………………………….…………………………..7 1.2 Giá thể trồng lan ………………………………...….……...……………………………7 1.3 Lan rừng Việt Nam ………..….……...…………………………………………...…….9 1.4 Hiện trạng canh tác hoa lan ở Việt Nam và trên thế giới ……………………...………10 1.5 Thành tựu nuôi cấy mô ở Việt Nam và trên thế giới ……..……….…………………...11 1.5.1 Trên thế giới …..………………………………………….………………………….11 1.5.2 Việt Nam …..……..…………………………………….………………..…………..11 1.6 Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật ……………….......11 1.7 Những khó khăn và lợi ích trong nhân giống in vitro ...…….………….………….......12 1.7.1 Khó khăn …..……..…………………………………….…………..………………..12 1.7.2 Lợi ích …..……..………………………………..……….…………………………..13 iii 1.8 Các yếu tố liên quan đến phương pháp vi nhân giống……….………………………...14 1.8.1 Qui trình vi nhân giống ……………………………….………………………..……14 1.8.2 Các thành phần trong môi trường nuôi cấy mô thực vật .……………………………16 2. Mô tả các phương pháp nghiên cứu liên quan đã được thực hiện …..…….…………….18 IV. PHƯƠNG PHÁP TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………...……19 1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm ….……..………………………………...…………..19 2. Phương tiện nghiên cứu…………………………………….…...…..…………………..19 3. Phương pháp nghiên cứu …………………………………….....…..….……..…...…….20 3. 1. Lan Dendrobium anosmum …………………………..…..…….....……..……..…….20 3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát một số môi trường gieo hạt thích hợp cho hạt lan Dendrobium anosmum ….…….……..…………………………………………………………..………20 3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng BA (6 – Benzyl – aminopurine) lên sự nhân chồi lan Dendrobium anosmum ………………..……..…..……22 3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng NAA (Naphthalene acetic acid) lên sự tạo rễ cho lan Dendrobium anosmum …..…………………………..….23 3. 2. Lan Dendrobium mini …………………………….……..…..….....……..……….….23 3.2.1 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu môi trường nuôi cấy mô thích hợp cho việc nhân chồi lan Dendrobium mini ………………….……..…..….....…………………………..………….23 3.2.2 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của NAA với hai loại môi trường cơ bản là MS và MS/2 lên sự tạo rễ từ chồi lan ……………….……..…..….....………....………….24 3.2.3 Thí nghiệm 6: Thử nghiệm ra cây lan Dendrobium mini trên các loại giá thể khác nhau ………………………….……..…..….....……..………………………………….….25 CHƯƠNG II. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ …..................27 I. Lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) ......................….…...…..……………….………..27 1. Thí nghiệm 1: Khảo sát một số môi trường gieo hạt thích hợp cho hạt lan Dendrobium anosmum ….……..…………...…………………………………………………..………..27 2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng BA (6 – Benzyl – aminopurine) lên sự nhân nhanh chồi lan Dendrobium anosmum ....…..….……..…….….28 3 Thí nghiệm 3: Khảo sát một số môi trường tạo rễ giống Dendrobium anosmum …..….....……..…………………………………………………………………….……….32 II. Lan Dendrobium mini …….………………………………………………….…………36 1. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu môi trường nuôi cấy mô thích hợp cho việc nhân chồi của Lan Dendrobium mini .…….……..……………....……………………………………….……36 2. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của NAA với hai loại môi trường cơ bản là MS và MS/2 lên sự tạo rễ từ chồi lan Dendrobium mini .……..…………....………….………39 iv 3 Thí nghiệm 6: Thử nghiệm ra cây lan Dendrobium mini trên các loại giá thể khác nhau …........……………………………………………………………………………….……. 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ….…….……..……………………….…………….…… 45 1. Kết luận ……………………………….……..…………………..…………...…………45 2. Kiến nghị ………….....…………………………………….…...…..…………………...47 TÀI LIỆU THAM KHẢO …….…….……..…………………………………...………….48 PHỤ CHƯƠNG …….…….……..………………………………………………………...50 v DANH SÁCH BẢNG Bảng Tựa bảng Trang 1.1 Các loại lan rừng có trữ lượng nhiều hoa đẹp được thị trường nước ngoài ưa chuộng 9 1.2 Ký hiệu các nghiệm thức theo môi trường cấy hạt lan 22 1.3 Ký hiệu các nghiệm thức theo môi trường cấy chồi lan Dendrobium anosmum 22 1.4 Ký hiệu các nghiệm thức thí nghiệm nhân chồi lan Dendrobium mini 24 1.5 Các nghiệm thức thí nghiệm tạo rễ lan Dendrobium mini 24 1.6 Các giá thể chọn làm thí nghiệm trồng lan 25 2.1 Kết quả gieo hạt lan Dendrobium anosmum 27 2.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự nhân chồi lan Dendrobium anosmum thời điểm 70 NSKC 28 2.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự nhân chồi lan Giả hạc Dendrobium anosmum thời điểm 80 NSKC 29 2.4 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự nhân chồi lan Giả hạc Dendrobium anosmum thời điểm 90 NSKC 30 2.5 Mẫu lan Giả hạc tạo rễ ở thời điểm 30 NSKC 33 2.6 Mẫu lan Giả hạc tạo rễ ở thời điểm 60 NSKC 33 2.7 Mẫu lan Giả hạc tạo rễ ở thời điểm 105 NSKC 34 2.8 Ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi lan Dendrobium mini 30 NSKC 36 2.9 Ảnh hưởng của BA lên quá trình nhân nhanh chồi lan Dendrobium mini 45 NSKC 37 2.10 Ảnh hưởng của BA lên quá trình nhân nhanh chồi lan Dendrobium mini 60 NSKC 38 3.11 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự tạo cây hoàn chỉnh của lan Dendrobium mini 39 3.12 Ảnh hưởng của giá thể trồng lên sự phát triển của của lan Dendrobium mini 15 NSKT 41 3.13 Ảnh hưởng của giá thể trồng lên sự phát triển của của lan Dendrobium mini 30 NSKT 41 3.14 Ảnh hưởng của giá thể trồng lên sự phát triển của của lan Dendrobium mini 195 NSKT 42 vi DANH SÁCH HÌNH Hình Tựa hình Trang 1.1 Hoa lan Dendrobium anosmum 6 1.2 Hoa lan Dendrobium mini 7 1.3 1.4 1.5 Sự tạo thành chồi ngang (a) và chồi bất định (b) Các bước cơ bản của vi nhân giống Hiệu quả của sự tương tác NAA và BA trên cây Bowiea volubilis 13 14 18 1.6 Hoa lan Dendrobium anosmum và trái lan được thụ 20 1.7 Qui trình khử trái và gieo hạt lan Dendrobium anosmum 21 1.8 Chuẩn bị vật liệu trồng và bố trí thí nghiệm 26 2.1 Số lượng chồi lan Giả hạc Dendrobium anosmum tạo trên môi trường có BA ở thời điểm 70, 80, 90 NSKC 31 2.2 Lan Giả hạc ra hoa trong keo nuôi cấy 32 2.3 Qui trình vi nhân giống lan Dendrobium anosmum từ hạt 35 2.4 Qui trình nhân giống lan Dendrobium mini 43 2.5 Một số hiện tượng trong quá trình sinh trưởng của lan Dendrobium mini 44 vii viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT BA 6 - Benzyl - Aminopurine HLCC Hoa lan cây cảnh MS Murashige & Skoog NAA 1- Naphhalene Acetic Acid NSKC Ngày sau khi cấy NSKG Ngày sau khi gieo NSKT Ngày sau khi trồng NT Nghiệm thức Tp HCM Thành phố Hồ Chí Minh CHƯƠNG I MỞ ĐẦU Nói đến hoa lan thì ai cũng nghĩ ngay đến một loài hoa vương giả, thanh cao vì hoa lan không chỉ rất đẹp mà giá trị lại rất cao. Ngày nay, nhờ kỹ thuật nhân giống hiện đại bằng phương pháp nuôi cấy mô hỗ trợ cho phương pháp nhân giống cổ truyền theo kiểu tách chiết, nên đã nhân được số lượng lớn lan giống cung cấp cho thị trường hoa lan, vì thế giá thành của cây lan cũng tương đối dễ chịu hơn. Cũng từ đó thú chơi lan trong dân ta ngày càng phát triển thông qua các Hội thi hoa lan ngày càng đa dạng và phong phú hơn. Hơn thế nữa, Hoa lan đã dần dần chiếm vị trí cao trong các bàn tiệc, hội nghị, lễ, đám cưới,… bằng cách trang trí giỏ hoa, lẵng hoa, bình hoa, và hoa cài áo, trang điểm cô dâu. Do đó Hoa lan đang được xem là một loại hoa trang trí quan trọng và có giá trị kinh tế cao, là mặt hàng xuất khẩu chiến lược của nhiều quốc gia. Chẳng hạn chỉ với loại hoa chủ lực là Dendrobium, Thái Lan đã xuất khẩu đạt doanh thu gần 600 triệu USD mỗi năm. Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, năm 2000, tổng sản lượng lan bán ra thị trường đạt xấp xỉ 100.000.000 USD, trong đó Phalaenopsis chiếm 75% (Griesbach, R.J. 2002). Bên cạnh đó, ở các nước phát triển như: Anh, Mỹ, Đức, Ý, Singgapore, Hồng Kông,... đều nhập khẩu rất nhiều phong lan. Việt Nam chúng ta cũng có nhiều triển vọng kinh doanh xuất khẩu phong lan (Huỳnh Văn Thới, 2005). Với kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật, thì ngoài các ưu điểm là khả năng nhân giống nhanh với hệ số nhân cao trong thời gian ngắn, có thể nhân được từ nhiều bộ phận khác nhau của thực vật, tạo ra cây giống sạch bệnh. Xa hơn nữa, thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô sẽ tạo ra nguồn vật liệu lai tạo ra cây giống mới có được các đặc tính ưu việc chỉ với thời gian ngắn. Ưu điểm nữa của nuôi cấy mô là giúp cho việc nẩy mầm của hạt lan. Vì hạt lan có đặc tính là chỉ có phôi mà không có (hoặc có quá ít) phôi nhũ và kích thước hạt quá nhỏ khó nẩy mầm ngoài tự nhiên. Nên ngoài phương pháp nhân giống cổ truyền là tách chiết với tốc độ nhân giống rất chậm, người ta phải sử dụng kỹ thuật gieo hạt trong ống nghiệm. Ngoài ra, nhân giống bằng hạt cũng được áp dụng cho công tác lai tạo giống mới, đặc biệt là hoa Lan. Tuy nhiên, một yếu tố không kém phần quan trọng quyết định đến sự thành công của qui trình nhân giống bằng nuôi cấy mô là việc đưa cây mô ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao. Do đó, đề tài “Nhân giống lan Dendrobim anosmum và Dendrobium mini bằng phương pháp nuôi cấy mô. Nghiên cứu các loại giá thể trồng lan Dendrobium mini thích hợp và cho hiệu quả cao” được thực hiện nhằm nhân nhanh hai loài lan này và nghiên cứu qui trình ra cây lan mô cho tỷ lệ sống cao để cung cấp cây giống cho thị trường hoa lan trong và ngoài tỉnh. I. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1. Mục tiêu: - Đưa ra qui trình vi nhân giống lan Dendrobium anosmum bằng phương pháp nuôi cấy hạt lan giúp cho việc nhân nhanh và bảo tồn loài hoa quí hiếm này của nước ta. - Đưa ra qui trình vi nhân giống lan Dendrobium mini nhằm nhân nhanh loài hoa lan này để cung cấp cây giống cho thị trường hoa lan trong và ngoài tỉnh. - Nghiên cứu sự ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng (NAA và BA) trên các mẫu cấy. 1 - Nghiên cứu qui trình ra cây của cây lan cấy mô nhằm giúp gia tăng tỉ lệ cây sống sau khi đưa ra ngoài. 2. Nội dung Nghiên cứu môi trường gieo hạt thích hợp cho hạt lan, môi trường nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh lan Dendrobium anosmum (Giả hạc). Nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợp cho việc nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh cho lan Dendrobium mini. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố bên trong và bên ngoài, giá thể trồng ảnh hưởng đến sự sống và phát triển của của lan con Dendrobium mini từ phòng thí nghiệm ra ngoài vườn. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng 1.1 Lan Denbrobium anosmum thuộc giống Dendrobium, là loài lan rừng của Việt Nam còn có tên Giả hạc. Đây là đối tượng quý hiếm và đặc biệt chỉ có ở Việt Nam, Lào, Thái Lan, Philippines, New Guinea, Borneo, Indonesia, Malaya and Sri Lanka. Đặc điểm của giống là sai hoa, hoa to, đẹp và có hương thơm nên rất được ưa chuộng. Hiện nay giống lan này đang rất được ưa chuộng trong và ngoài nước, trong khi việc nhân giống bằng tách chiết thông thường không kịp đáp ứng nhu cầu. Cây lan giống (cây mẹ) được mua về từ Đà Lạt và trồng tại vườn lan của Trường Đại học An Giang. Sau đó thụ phấn tạo trái lan. Khi trái được 4 tháng thì cắt đem vào phòng thí nghiệm khử trùng và cấy vào môi trường nuôi cấy. 1.2 Lan Dendrobium mini, theo hướng dẫn của Công ty Long Đỉnh thì đây là một giống mới được lai tạo từ Thái Lan và mới được du nhập vào nước ta. Đặc điểm của loài này là cây chỉ cao 15 – 20 cm, số hoa trên cành 6-12 hoa, thời gian hoa tàn 2,5 – 3 tháng, Thời gian từ cây seedling đến ra hoa khoảng 4 – 5 tháng nếu nuôi tốt. Do đặc điểm cây nhỏ gọn lại siêng hoa, thời gian ra hoa nhanh nên rất phù hợp cho trang trí nội thất, đám tiệc,... Nên cần nhân nhanh và rộng giống lan Dendrobium mini để cung cấp cho thị trường hoa tươi. 2. Phạm vi nghiên cứu Trong thế giới các loài hoa, hoa lan được coi là loài hoa vương giả, nữ hoàng của các loài hoa. Bởi vì hoa lan không những đẹp về màu sắc mà còn đẹp cả về hình dáng. Cái đẹp của hoa lan thể hiện từ những đường nét của cánh hoa, cấu trúc đặc biệt quyến rũ của môi lan, cho đến những điểm xuyến ngộ nghĩnh trên các lá lan, hay cấu trúc đa dạng của thân lan. Nhiều loài hoa lan, nhất là các loài lan rừng Việt Nam, có hương thơm rất nồng nàn và quyến rũ như Giáng hương, Giả hạc, Ngọc điểm,… Việt Nam là một quốc gia được quốc tế công nhận là có trữ lượng lan rừng rất lớn và có nhiều loài có giá trị cao, được nhiều người yêu thích. Một trong những loài đó đó điển hình là loài lan Giả hạc. Nhưng do nhà nước ta chưa có chính sách bảo tồn triệt để nên lượng lan rừng Việt Nam hiện bị thất thoát ra nước ngoài rất nhiều và trở nên khan hiếm tại thị trường trong nước. Việc nhân giống theo phương pháp truyền thống là tách chiết không thể đáp ứng đủ với nhu cầu thị trường. Do đó, ngày nay các nghiên cứu về nhân giống lan bằng phương pháp cấy mô rất được các nhà khoa học quan tâm đầu tư, vì chỉ có nuôi cấy mô mới có thể nhân ra lượng lớn cây giống cung cấp cho thị trường trong thời gian ngắn. 2 Loài lan Denbrobium anosmum hiện đang rất được các nghệ nhân Việt Nam và thế giới ưa chuộng. Do loài lan này có hoa rất to, đẹp, lại có hương rất thơm. Hiện thị trường trong nước một cây lan giả hạc với một đơn vị nhỏ cũng phải giá cả trăm ngàn, nếu là đơn vị lớn thì hàng trăm đến triệu đồng. Do giá trị cao nên hiện Đài Loan đã lai tạo ra loài Giả hạc Hawaii và đang được rất nhiều nước ưa chuộng, ngay cả Việt Nam cũng đã nhập cây giống của loài này. Như vậy để thấy việc bảo tồn, lai tạo và nhân giống loài lan này là rất cần thiết. Tuy nhiên, hiện nay vấn đề làm cho các phòng cấy mô trong nước không phát triển mạnh được, một trong các nguyên nhân là việc không tiêu thụ được cây cấy mô. Vì người dân khó biết để tìm mua. Phần khác họ không biết cách ra cây nên tỉ lệ thất thoát ra đưa cây mô ra vườn là rất cao, do đó họ rất e ngại khi mua cây con từ các chai mô. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài này cũng nhằm để nghiên cứu qui trình vi nhân giống hai loài lan này nhằm cung ứng nhu cầu cây giống cho thị trường. Mặt khác thông qua đề tài nghiên cứu qui trình ra cây con cấy mô nhằm gia tăng tỉ lệ cây mô sống sau khi đưa ra ngoài. Sau đó có thể triển khai hướng dẫn kỹ thuật cho các nghệ nhân trồng lan. III. CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Cở sở lý thuyết 1.1 Giới thiệu về giống lan Dendrobium 1.1.1 Phân loại và phân bố Thuộc lớp một lá mầm: Monocotyledones Bộ: Orchidales Họ: Orchidaceae Họ phụ: Epidendroideae Tông: Epidendreae Giống: Dendrobium Họ Orchidaceae có khoảng 750 chi, 25.000 loài, chiếm vị trí thứ hai sau họ Cúc trong ngành thực vật hạt kín và là họ lớn nhất trong ngành một lá mầm. Các loài trong hệ thống này phân bố rất rộng, do đó hình thái và cấu tạo cũng hết sức đa dạng và phức tạp (Dương Công Kiên, 2006). Theo Huỳnh Văn Thới (2005), tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Grec Dendron nghĩa là cây gỗ và bios là tôi sống. Dendrobium là giống phụ sinh, sống trên cây gỗ. Có người gọi là Hoàng Lan, có người gọi là Đăng Lan. Dendrobium có trên 1.600 loài và chia thành 2 dạng chính: + Dạng đứng (Dendrobium phalaenopsis) thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm và rất siêng ra hoa: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên, Sonia,… + Dạng thòng (Dendrobium mobile) chịu khí hậu mát mẽ: Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp vàng,… Với 1.600 loài khác nhau đòi hỏi nhiều cách chăm sóc khác nhau, nguyên do là vì chúng du nhập từ nhiều địa danh khác nhau: Nhật Bản, Triều Tiên và Newzealand, đặc biệt là Guinea là nơi sản sinh ra nhiều loài Dendrobium nhất (Thiên Ân, 2002). 3 Ở Việt Nam, Dendrobium có đến 100 loài, xếp trong 14 tông được phân biệt bằng thân (giả hành), lá và hoa (Nguyễn Công Nghiệp, 2004). 1.1.2 Đặc điểm hình thái Theo Nguyễn Công Nghiệp (2004) thì không có một hình dạng chung nhất về hoa và dạng cây do số lượng quá lớn, phân bố rộng rãi. Riêng giống lan Dendrobium đều có bộ phận sinh dưỡng như rễ, thân, giả hành, lá và cơ quan sinh sản như hoa, trái. Rễ: Cây có hệ rễ khí sinh, có một lớp hút ẩm dày bao quanh gồm những lớp tế bào chết chứa đầy không khí nên rễ ánh lên màu xanh bạc. Vì vậy rễ hút được nước mưa chảy dọc trên vỏ cây gỗ hay nước lơ lửng trong không khí, hơi sương và hơi nước, giúp cây hút dinh dưỡng và chất khoáng, mặt khác giúp cây bám chặt vào giá thể, không bị gió cuốn. Một số loài có thân lá kém phát triển thậm chí tiêu giảm hoàn toàn, có hệ rễ chứa diệp lục tố giúp cây hấp thụ ánh sáng cần thiết cho sự ra hoa và quang hợp (Nguyễn Công Nghiệp, 2004). Rễ của lan Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ cây sẽ bị mục nát và cây bị chết (Dương Công Kiên, 2006). Rễ lan Dendrobium cũng giống như rễ lan Vũ nữ, Cattleya thuộc loại rễ bán gió. Nhóm này thường có rễ nhỏ nhưng rất nhiều rễ, chủ yếu bám vào giá thể, vào thân cây để hút dưỡng chất dính vào giá thể như nước, cho nên khi trồng vào chậu, phải để giá thể nhiều hơn, gần như toàn bộ rễ đều bám vào giá thể, vào thành chậu, chỉ có một số ít rễ chìa ra ngoài. Đối với lan rễ bán gió phải trồng với giá thể nhỏ hơn và nhiều hơn, để bộ rễ bám dày đặc hút nhiều dưỡng chất v.v... (Huỳnh Văn Thới, 2005) Giá thể của lan Dendrobium có cấu tạo tương tự như các loài thuộc giống Cattleya, nghĩa là chậu phải thật thông thoáng và không úng nước. Tuy nhiên do bản năng sinh học và cấu trúc thực vật với giả hành có thân, các loài thuộc giống Dendrobium có thể dùng giá thể hơi ẩm hơn Cattleya chút ít nhưng không được làm thối căn hành. Vì thế một số loài lan Dendrobium có thể phát triển trên các giá thể là xơ dừa hay cả quả dừa, dùng như một cái chậu chứa sẵn giá thể. Cũng có thể trồng lan Dendrobium với căn hành cách đáy chậu khoảng 3 cm, rồi rải thật thoáng xung quanh căn hành một số rễ lục bình giặt sạch. Với cách trồng này thì kích thước chậu và cây phải thật tương xứng. Tuy nhiên giá thể than và gạch vẫn tỏ ra hiệu quả nhất (Nguyễn Công Nghiệp, 2004) Thân: Theo Nguyễn Công Nghiệp (2004) thì Dendrobium thuộc nhóm đa thân (còn gọi là nhóm hợp trục) có hệ thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá thể hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ. Một số Dendrobium lá chỉ có ở các mầm non, là loài chống tàn chúng vàng úa và rụng vào mùa thu, thân phì to giống như củ không có lá là nơi dự trữ năng lượng (Trần Văn Bảo, 1999). Giả hành: Giả hành là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao. Ngoài ra, giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được (Nguyễn Công Nghiệp, 2004). Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa dạng: hình cầu, thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ (Dương Công Kiên, 2006). 4 Một số loài ở xứ lạnh chỉ có nhiện vụ dự trữ chất dinh dưỡng nên giả hành không có màu xanh nhưng phía trên có mang lá (Dương Công Kiên, 2006). Lá: Các lá mọc xen kẽ nhau và ôm lấy thân giả do lá có tận cùng bằng một cuốn hay thuôn dài xuống thành bẹ ôm thân, hình dạng và cấu trúc lá rất đa dạng (Nguyễn Công Nghiệp, 2004). Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại mọng nước nạc, dai, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tuỳ thuộc vào vị trí sống của cây. Phiến lá trãi rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình chữ V. Những lá sát dưới gốc đôi khi giảm đi chỉ còn những bẹ không phát triển hay giảm hẳn thành vảy (Dương Công Kiên, 2006). Các loài thuộc giống Dendrobium vùng nhiệt đới nói riêng và họ Orchidaceae nói chung đôi khi trút lá vào mùa khô hạn. Sau đó, cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặp mưa thì cho chồi mới (Trần Văn Bảo, 1999). Hoa: Theo Nguyễn Công Nghiệp (2004) thì Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá. Chồi hoa mọc từ các mắt ngủ giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và cả trên ngọn cây. Sự biểu hiện trước khi ra hoa khác biệt như có nhiều loài rụng hết lá trước khi ra hoa. Thời gian ra hoa đầu mùa mưa hay đầu tết (Nguyễn Công Nghiệp, 2004). Giống Dendrobium khi đủ dinh dưỡng thì cho hoa thành chùm, phát hoa dài và thời gian ra hoa trung bình 1- 2 tháng (Nguyễn Công Nghiệp, 2004). Trái: Họ Orchidaceae đều có quả thuộc quả nang, khi hạt chín, các nang bung ra chỉ còn dính lại với nhau ở đỉnh và gốc. Ở một số loài, khi chín quả không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi quả bị mục nát (Dương Công Kiên, 2006). Hạt: Những hạt giống không chứa các chất dinh dưỡng do gió gieo vãi, để được nẩy mầm cần có nấm cộng sinh hỗ trợ các chất cần thiết, đặc biệt ở đầu các giai đoạn phát triển (Trần Văn Huân và Văn Tích Lượm, 2004). Theo Dương Công Kiên (2006), thì quả chứa 10.000 – 100.000 hạt đôi khi đến 3 triệu hạt có kích thước rất nhỏ nên phôi hạt chưa phân hoá. Sau 3 – 5 tháng hạt chín và phát tán nhờ gió. 1.1.3 Lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) Dendrobium anosmum xuất xứ từ các nước như Philippin, Malaysia., Lào, Việt Nam. Lindley đặt tên cho lan Giả hạc từ năm 1845. Lan Giả hạc có nhiều trên dãy Trường Sơn từ Nam ra Bắc (Nguyễn Thiện Tịch, Hội HLCC - Tp HCM được trích bởi Trần Văn Bảo, 1999). Dendrobium anosmum là một giống lan thường mọc ở các quốc gia thuộc vùng Đông Nam Á Châu nhưng nay phổ thông trên khắp thế giới bởi vì khá dễ trồng, nhiều hoa và hương thơm ngào ngạt (Bùi Bảo Lộc, 2008). 5 www.theorchiddoctor.com www.myriadgardens.com Hình 1.1 Hoa lan Dendrobium anosmum Lan còn có tên là Dendrobium superbum và người Hawaii gọi là Dendrobium honohono có nghĩa là lá mọc đối cách. Người Việt chúng ta thường gọi là Dã Hạc, Giả hạc, Lưỡng điểm hạc, Phi diệp... Lan thường mọc trên các cành cây ở cao độ khoảng 1000-1300 m tại các rừng cây thuộc Đô Lương, Vinh, Krong Pha, Đà Lạt, Bảo lộc, Đắc Lắc, Sông Bé, Lộc Ninh v.v... (Bùi Bảo Lộc, 2008). Thân dài tới 1,20 m buông rũ xuống. Lá mọc đối cách dài 8 - 12 cm, rộng từ 4 - 7 cm. Hoa to tới 10 cm mọc từ 1- 3 chiếc ở các đốt đã rụng lá, nở vào mùa Xuân. Dendrobium anosmum có hai màu sắc chính: tím hồng và trắng. Tuy nhiên có khá nhiều biến dạng hồng nhạt, hồng thẫm hoặc cánh trắng lưỡi tím, nhưng rất dễ nhầm lẫn với Dendrobium parishii thân ngắn chỉ chừng 30-40 cm và hoa tím sẫm hơn nhiều. Hoa có hương thơm ngào ngạt và lâu tàn (3 - 4 tuần lễ). Nhiều hoa trên phát hoa, một cây nếu mạnh khỏe có thể ra tới 50 - 70 hoa (Bùi Bảo Lộc, 2008). Sau khi hoa tàn, những đốt gần trên ngọn hoặc ở gần dưới gốc thường nẩy sinh ra những cây con (keiki). Vài tháng sau, khi các cây con mọc rễ dài chừng 3 - 4 cm có thể tách ra trồng riêng. Năm đầu cây này còn nhỏ và ngắn chừng 30 - 40 cm và không ra hoa, nhưng sẽ ra hoa vào năm tới. Khi đó duới gốc sẽ ra tới 3 - 4 mầm non, những mầm cây này mọc mạnh và lớn hơn rất nhiều có thể đạt tới 1- 1,20 m nếu nuôi trồng đúng cách (Bùi Bảo Lộc, 2008). Ngoài ra ta cũng có thể nhân giống loài lan này theo phương pháp truyền thống: cắt thân cây già thành từng đoạn dài 15 - 20 cm, đặt lên khay có rong rêu hoặc mùn cây ẩm ướt, vài tháng sau cây con sẽ mọc ra từ các đốt (những đốt vừa ra hoa sẽ không mọc cây non). Khi cây non cao chừng 4 - 5 cm hay rễ dài khoảng 3 - 4 cm đem trồng trong chậu hay trên vỏ cây như đã nói ở trên (Bùi Bảo Lộc, 2008). 6 Người ta trồng Dendrobium anosmum với nhiều vật liệu khác nhau như: mảnh cây dương sỉ, cành cây, mảnh gỗ hay trong chậu với vỏ thông, vỏ dừa v.v... nhưng tốt hơn cả là trồng trong chậu gỗ và treo lên bởi vì cây cần thoáng gió và thoáng gốc (Bùi Bảo Lộc, 2008). 1.1.4 Lan Dendrobium mini Nếu như Lan Giả hạc là một loài thuộc nhóm lan rừng Việt Nam có giá trị cao, thân thòng, thì lan Dendrobium mini lại là một loài lai tạo, thân đứng. Loài lan này được lai tạo từ Thái Lan và được du nhập vào nước ta. Đặc điểm của loài lan này là cây dạng bụi, lùn (chỉ cao 15 – 20 cm), nhưng rất siêng hoa, hoa nở quanh năm. Cây nhỏ nhưng nhảy chồi rất mạnh, nhảy chồi ngay cả trên các thân già hay cây suy yếu. Hoa có kích thước không lớn chỉ khoảng 4 x 5 cm nhưng hoa rất đẹp, số hoa trên cành nhiều từ 6 - 13 hoa, hoa rất bền lâu tàn (1,5 – 2 tháng). Thông thường trên một giả hành có tới 3 - 4 phát (cành) hoa, nếu cây tốt có thể lên đến 5 phát hoa. Hình 1.2 Hoa lan Dendrobium mini 1.2. Giá thể trồng lan (compost) Trồng Phong lan ta phải sử dụng đến giá thể. Giá thể là những chất liệu dùng để cải thiện độ ẩm là chính, còn cung cấp chất dinh dưỡng cho lan chỉ là việc phụ, không đáng kể. 7 Với một số loài Lan trồng không cần dùng đến giá thể vẫn sinh trưởng tốt, nhưng nếu môi trường sống có giá thể vẫn tốt hơn. Giá thể của lan gồm những thứ dễ kiếm, nhiều khi không cần mất tiền mua, vì có sẳn chung quanh ta. Những chất liệu này không phải nước nào cũng dùng như nhau và chúng được chọn tùy theo điều kiện ngoại cảnh, nhân lực, loài lan và qui mô sản xuất. Theo Nguyễn Công Nghiệp (2004) và Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2006), thì có các loại giá thể trồng lan và đặc tính của từng loại như sau: a. Than gỗ: trồng lan bằng những thanh than gỗ ngắn, với kích cỡ bằng ngón tay cái, ngón chân cái là vừa. Đặc tính của than gỗ là hút nước và giữ ẩm được lâu. Nên chọn loại than xốp, với than chắc quá như than đước không nên dùng vì khả năng giữ ẩm k._.ém. Than không mục như gỗ, cũng không có mầm bệnh nên giới nghệ nhân trồng lan không ai chê thứ giá thể quí giá này. b. Xơ dừa: Dừa là thổ sản của nước mình nên xơ dừa gần như không cần phải mua, mà mua cũng với giá rẻ. Khi cần dùng đến quanh năm lúc nào cũng có. Xơ dừa làm giá thể để trồng lan chính là vở của trái dừa khô. Xơ dừa được tách ra thành từng mảng lớn, tuỳ theo nhu cầu mà nhà vườn để nguyên miếng, hoặc xé ra, chặt khúc ra để sắp xếp trồng lan trên vạt tre hoặc cho vào chậu. Xơ dừa rút ẩm rất tốt, tốt hơn cả than gỗ, nhưng khuyết điểm là mau mục và là nơi đeo bám lý tưởng của rêu và cỏ dại. Trong xơ dừa có chất tanin là chất chát, vì vậy trước khi dùng ta nên ngâm nước nhiều ngày, sau đó vớt ra phơi khô, rồi cẩn thận hơn nên phun thuốc trừ sâu bệnh,... c. Gạch: Gạch là chất hút nước tốt, giữ ẩm cao. Gạch được nung chín xốp vừa nhẹ vừa hút nước nhiều. Khi dùng làm giá thể, gạch được đập vụn ra từng thanh nhỏ bằng ngón tay cái. Khuyết điểm của gạch là dễ mọc rêu và ... nặng, vì vậy ít ai trồng Lan với giá thể là gạch không thôi, mà trộn lẫn với vài giá thể khác như than gỗ hay vỏ cây hoặc xơ dừa, mỗi thứ một ít. d. Vỏ cây: Trong các loại cây như vú sữa, sao, me, thông,… thì vỏ thông là loại vỏ cây được ưa chuộng nhất vì trong vỏ thông có chất resin là chất sát khuẩn cao, lâu mục, không đóng rêu, ít có mầm bệnh nên trồng lan rất tốt Vỏ thông được lấy từ cây thông 2 lá (Pinus merkussi) hoặc cây thông 3 lá (Pinus khasya) có nhiều ở Bảo Lộc và Đà Lạt. Cây lan được trồng bằng vỏ cây thời gian đầu phát triển tốt. Sau 1 năm vỏ bị phân huỷ thành mùn, gây úng nước, thối rễ và cũng là môi trường thích hợp cho sự xuất hiện một số loài côn trùng cắn phá rễ. Vì vậy khi trồng bằng vỏ cây, cây lan phải được thay chậu thường xuyên. e. Dớn: dớn là chất liệu làm giá thể trồng lan mới được sử dụng gần đây thôi. Dớn là chất trồng được lấy từ thân và rễ của cây Dương xỉ. Giống cây thảo này được mọc nhiều ở cao nguyên Đà Lạt. Ưu điểm của dớn là giữ ẩm tốt. Có hai loại dớn: dớn sợi và dớn vụn - Thứ được ưa chuộng nhất là dớn sợi do thân rễ cây dương xỉ già tạo nên. Dớn sợi thích hợp cho việc trồng Lan xứ nóng vì nó có độ thông thoáng. - Dớn vụn: Là loại thứ cấp của dớn do các phần vỏ, lá, rễ của dớn sau khi khai thác sợi bị nát vụn ra. Loại này sử dụng trồng lan rất tốt ở vùng lạnh vì độ hút ẩm cao, thiếu thoáng khí nên nhiệt độ trong chậu cao hơn bên ngoài. Tuy nhiên ở vùng nhiệt đới Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) không nên dùng loại dớn này, vì nhiệt độ cao và 8 ẩm độ thấp, nên phải tưới nước nhiều, dớn vụn bị bít dễ làm thối rễ lan. Ngời ra điều kiện nóng ẩm rất thuận lợi cho một số loại côn trùng và nấm bệnh chọn dớn làm mục tiêu cắn phá. f. Rong biển: rất được ưu chuộng đối với lan Hồ điệp. Tuy nhiên, loại giá thể này hút nước nhiều và giữ ẩm cao nên hết sức cẩn thận khi sử dụng. g. Rễ lục bình: có khắp nơi và rất dễ kiếm. Rễ lục bình có độ hút ẩm cao, có nhiều đạm giúp cây ra rễ và tăng trưởng rất mạnh trong thời gian đầu, nhưng dễ bị mục rã nên mắc các khuyết điểm như xơ dừa và dớn vụn. h. Phụ phẩm nông nghiệp: vỏ hạt cà phê, vỏ đậu phộng. 1.3 Lan rừng Việt Nam Hiện ở Việt Nam có hai thứ lan: lan bản xứ (lan rừng) và lan lai. Rừng Việt Nam có nhiều loại lan bản xứ rất đẹp, có trữ lượng cao nhưng chưa được điều tra chính xác. Các loại lan rừng Việt Nam phân bố từ đồng bằng đến cao nguyên và cả trên cây bóng mát ở Tp.HCM (Nguyễn Công Nghiệp, 2004). Việt Nam là một trong những nước có lan nhiều trên thế giới, và lan rừng nước ta có rất nhiều loài quí do màu sắc đẹp, hương thơm nồng nàn. Đây là ưu điểm chính của lan rừng Việt Nam. Mặc dù lan rừng Việt Nam có nhược điểm là mau tàn và kích thước nhỏ hơn các loài lan lai, nhưng vẫn hấp dẫn được nhiều người yêu lan nhờ đa số đều có hương thơm nồng nàn, quyến rũ như Giả hạc, Ngọc điểm, Mỹ dung dạ hương, Đuôi cáo, Thanh ngọc,… Bảng 1.1 Các loại lan rừng có trữ lượng nhiều hoa đẹp được thị trường nước ngoài ưa chuộng Stt Tên Việt Nam Tên khoa học 1 Hồng lan Đà Lạt Cymbidium insigne 2 Hoàng lan Đà Lạt Cymbidium iridioides 3 Hồng hoàng Đà Lạt C.insigne x C.iridioides 4 Bạc lan Đà Lạt C.eburnum var erythrostylum 5 Tuyết ngọc Coelogyne mooreana 6 Kim hài Paphipedium villosum 7 Vân hài Paphipedium callosum 8 Huyết nhung Renanthera imschootiana 9 Mỹ dung dạ hương Vanda denisoniana 10 Giả hạc Dendrobium anosmum 11 Long tu Dendrobium primulinum 12 Kim điệp Dendrobium capillies 13 Thuỷ tiên trắng Dendrobium farmeri 14 Thuỷ tiên vàng Dendrobium chrysotoxum 9 15 Thuỷ tiên mỡ gà Dendrobium densiflorum 16 Thuỷ tiên tím Dendrobium amabile 17 Thuỷ tiên cam Dendrobium thhyrsiflorum 18 Nhất điểm hồng Dendrobium draconis 19 Lụa vàng Dendrobium heterocarpum 20 Hoàng phi hạc Dendrobium signatum 21 Ý thảo Dendrobium gratiossimum 22 Tóc tiên Holeolossum subulifolium 23 Hạc đỉnh Phaius tankervilliae 24 Hoả hoàng Ascocentrum miniatum 25 Ngọc điểm Rhynchostylis gigantea 26 Đuôi cáo Aerides multiflora 27 Đại ý thảo Dendrobium aphyllum 28 Lan quế Aerides odorata 29 Long nhãn kim điệp Dendrobium fimbriatum 30 Long châu Papilionanthe pedunculatta 31 Huyết nhung giún Renanthera coccinea 32 Bò cạp tía Arachnis annamensis 33 Bạch vĩ hồ Rhynchostylis retusa 34 Cẩm báo Hygrochilus parishii 35 Uyên ương Christensonia vietnammica (Nguồn: Nguyễn Công Nghiệp, 2004). Một số loài lan rừng Việt Nam rất quý, được nước ngoài biết đến và đặt mua với số lượng lớn nhưng ta chưa gây trồng mà chủ yếu khai thác trong tự nhiên nên không đáp ứng được nhu cầu của khách hàng, đồng thời lại vi phạm các điều khoản của Hiệp ước CITES. Ví dụ như loài Tuyết ngọc Coelogyne mooreana Sander ex Rolfe, Thanh đạm Coelogyne cristata Lindl., Thanh lan Cymbidium cyperifolium Wall. ex Lindl. (một trong những loài lan đẹp nhất thế giới), Mạc lan Cymbidium ensifolium (L.) Sw., Giả hạc Dendrobium anosmum Lindl., Vân hài Paphyopedilum callosum (Reichenb.f.) Stein, Hài đỏ Paphyopedilum delenatii Guillaume, Kim hài Paphyopedilum villosum (Lindl.) Stein, Lá gấm Ludisia discolor (Ker-Gawl.) A. Rich (Nông Văn Duy, Nguyễn Thị Lang và ctv, 2001). 1.4 Hiện trạng canh tác hoa lan ở Việt Nam và trên Thế giới Thị trường phong lan ngày nay đã trở thành một mặt hàng lớn trên quốc tế, thu rất nhiều ngoại tệ. Ở các nước phát triển như: Anh, Mỹ, Đức, Ý, Singgapore, Hồng Kông,... đều nhập khẩu rất nhiều phong lan, Thái Lan là nước xuất khẩu phong lan 10 nhiều nhất Đông Nam Á. Việt Nam chúng ta cũng có nhiều triển vọng kinh doanh xuất khẩu phong lan (Huỳnh Văn Thới, 2005). Theo điểm tin trên tạp chí Hoa cảnh số 10/2008, thì số loại hoa xuất khẩu đi Nhật Bản từ 12 – 19/9/2008: Hoa cúc 0,21 USD/cành, kim ngạch 65.622 USD; Hoa lan 1,50 USD/cành, kim ngạch 8.595 USD; Hoa Hồng 0,15 USD/cành, kim ngạch 6.882 USD (Minh Tú, 2008). Cũng theo bản tin thì ngoài thị trường lớn là Nhật Bản, Trung Quốc cũng là thị trường lớn tiêu thụ hoa tươi Việt Nam nhất là hoa Hồng, Cẩm chướng, Ly ly, Lan,… Trung bình thị trường Trung Quốc tiêu thụ gần 576.000 USD hoa tươi của Việt Nam/năm (Minh Tú, 2008). Ngoài ra, Việt Nam còn có thị trường xuất khẩu hoa sang các nước như Đài Loan, Hàn Quốc, Singapore,… Tuy nhiên ta lại không có đủ lượng hoa để xuất cho họ, nhất là hoa lan. 1.5 Thành tựu nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam 1.5.1 Trên thế giới Nuôi cấy mô trên thế giới đã có từ rất lâu đời và đến nay đã có các thành tựu rất đáng kể như: vào năm 1978, Melchers lai tạo thành công cây lai giữa Khoai tây và Cà chua bằng dung hợp tế bào chất; năm 1990, Vasil và cộng sự tái sinh cây lúa mì hoàn chỉnh từ nuôi cấy tế bào trần. Vasil và cộng sự (1991) báo cáo về tạo cây lúa mì chuyển gen bằng súng bắn gen vào các phôi non; hay như năm 1994, cây cà chua Favr-savr chuyển gen được chấp nhận cho buôn bán ở Hoa Kỳ,… 1.5.2 Ở Việt Nam Nuôi cấy mô và tế bào thực vật được phát triển ở Việt Nam ngay sau khi chiến tranh kết thúc (1975). Phòng nuôi cấy mô và tế bào thực vật đầu tiên được xây dựng tại viện sinh học, Viện khoa học Việt Nam do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu. Bước đầu chỉ nghiên cứu sự phát triển của túi phấn, mô sẹo và protoplast, nhưng sự thành công thì chỉ có ở 2 cây là lúa và khoai tây. Tiến đến những năm 80 trở lại đây thì nuôi cấy mô phát triển khá mạnh mẽ và kết quả khích lệ đã đạt được ở các giống: chuối, dứa, mía, hồng, cúc, phong lan,…(Nguyễn Đức Thành, 2000). Như kỹ thuật tạo cây lan Cymbidium giống sạch bệnh bằng xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của Nguyễn Văn Uyển và ctv (1984). Bước đầu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống lan Hồ điệp của Cung Hoàng Phi Phượng và ctv, trích trong Hội nghị khoa học – Công nghệ sinh học thực vật trong công tác và chọn tạo giống hoa của Dương Tấn Nhựt (2007). Tiến xa hơn là tạo ra giống lan mới bằng kỹ thuật gây đột biến nhân tạo hoa lan cắt cành Dendrobium bằng tia gamma của Lê văn Hòa và ctv, trích trong Hội nghị khoa học – Công nghệ sinh học thực vật trong công tác và chọn tạo giống hoa của Dương Tấn Nhựt (2007). Chuyển gen phát sáng GFP (Green Flourescent Protein) vào cây Lilium oriental hybrid “siberia” nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của Nguyễn Thị Lý Anh và ctv, trích trong Hội nghị khoa học – Công nghệ sinh học thực vật trong công tác và chọn tạo giống hoa của Dương Tấn Nhựt (2007). 1.6 Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Phương pháp này có ý nghĩa vô cùng to lớn đối với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống. * Về mặt lý luận sinh học cơ bản: đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống. Thực tế đã cho phép chúng ta tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh (meristem) rồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hoá gọi là mô sẹo (callus) và từ mô sẹo thì có thể kích thích tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh. Bằng 11 * Về mặt thực tiễn sản xuất: Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng quí, có giá trị kinh tế cao. Hiện nay phương pháp này đã trở thành phổ biến và áp dụng trong công tác chọn giống cây trồng. Ngoài ra, bằng phương pháp này chỉ sau thời gian ngắn chúng ta có thể tạo được sinh khối lớn có hoạt chất sinh học được tạo ra vẫn giữ nguyên được hoạt tính của mình (Nguyễn Đức Lượng, 2002). 1.7 Những khó khăn và lợi ích trong nhân giống in vitro 1.7.1 Khó khăn Tuy nhân giống in vitro đạt được những thành tựu to lớn nhưng cạnh đó đã gặp không ít khó khăn, theo Nguyễn Văn Uyển và ctv (1984) thì có một số khó khăn sau: - Nhân giống trên môi trường agar thì giá thành sản xuất vẫn còn cao và thời gian nhân giống dài. - Khi sản xuất ở qui mô công nghiệp thì chi phí cho năng lượng và nhân công vẫn còn ở mức cao. - Đôi khi xảy ra biến dị soma trong quá trình nuôi cấy, đặc biệt là tái sinh thông qua mô sẹo. - Giới hạn sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống do cây con tạo ra thường đồng nhất về mặt di truyền. - Quá trình nhân giống phức tạp. Tính bất định về mặt di truyền Nhân giống in vitro là tạo quần thể đồng nhất với số lựợng lớn. Tuy nhiên trong một số trường hợp phương pháp này cũng tạo ra biến dị soma, mà tế bào mô sẹo thì có nhiều biến dị hơn so với đỉnh chồi. Những nhân tố thường gây ra biến dị soma là: + Kiểu di truyền: các loài cây khác nhau thì tạo ra các biến dị khác nhau, nói chung cây càng có mức độ bội thể cao thì càng dễ biến dị. + Số lần cấy truyền: số lần cấy truyền càng nhiều thì độ biến dị càng cao. Amstrong và Phillips (1988) khi nuôi cấy dài hạn thường gây ra biến dị nhiễm sắc thể. Ngoài ra, khi cấy truyền nhiều lần, môi trường phát triển các chồi ngang có thể chuyển sang tạo ra các bất định (adventitious shoots). Kết quả là có thể tạo ra các biến dị tế bào soma. Vì vậy cây con tạo ra không đồng nhất. Đối với mục đích vi nhân giống, sự tạo chồi ngang là kỹ thuật thích hợp đang được sử dụng. Theo nguyên tắc, cách này tạo ra đúng kiểu cây (Debergh, 2006). 12 a b Hình 1.3 Sự tạo thành chồi ngang (a) và chồi bất định (b) (Debergh, 2006) 1.7.2 Những lợi ích Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống in vitro có những ưu điểm sau: - Tạo các cây con đồng nhất và giống cây mẹ. - So với kiểu nhân giống thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong một thời gian ngắn. - Không chiếm nhiều diện tích. - Có thể cung cấp cây giống bất cứ thời điểm nào vì chủ động được, do không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. - Có thể tạo ra các cây con sạch bệnh bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kết hợp xử lý nhiệt và vi ghép trong ống nghiệm. - Có thể tạo và nhân được các giống mới bằng kỹ thuật cứu phôi, chuyển gen. - Một số cây quí có thể nhân nhanh để đưa vào sản xuất và việc trao đổi giống được dễ dàng. Ngoài ra, kỹ thuật nuôi cấy mô còn giúp cho việc nhân giống hữu tính các đối tượng quí mà với kỹ thuật nhân giống thông thường khó thực hiện được (như trường hợp gieo hạt lan). Bởi vì như chúng ta biết, trái lan có tới hàng triệu hạt. Tuy nhiên hạt lan không chứa albumin và có một phôi chưa phân hoá vì thế sự nẩy mầm của hạt rất khó khăn trong điều kiện tự nhiên, tỉ lệ nẩy mầm rất thấp (khoảng 1 phần triệu). Do đó để nhân giống lan bằng hạt có 3 phương pháp: nẩy mầm cộng sinh nấm, nẩy mầm không cộng sinh và hiện nay người ta dùng phương pháp gieo hạt hoàn toàn mới đó là phương pháp gieo hạt xanh (sau khi thụ tinh trái lan sẽ được đem vào phòng thí nghiệm khử trùng và mổ trái trong điều kiện vô trùng, vỏ quả được tách ra bằng một dụng cụ đã khử trùng và gieo hạt trực tiếp lên môi trường cấy). Ngày nay đã có nhiều công thức môi trường gieo hạt cho từng loại lan (Nguyễn Công Nghiệp, 2004) Có nhiều loại môi trường gieo hạt Lan đã được khuyến cáo. Môi trường phổ biến nhất là môi trường Knudson C (1946). 13 Thành phần của môi trường Knudson C (1946) Hoá chất Lượng (g.l-) Ca(NO3)2.4H2O 1,000 (NH4)2SO4 0,500 MgSO4.7H2O 0,250 KH2PO4 0,250 FeSO4.7 H2O 0,025 MnSO4 0,0075 (Nguyễn Thiện Tịch và ctv, 2006) 1.8 Các yếu tố liên quan đến phương pháp vi nhân giống Vi nhân giống là một phương pháp nhân giống hiện đại hay nhân giống vô tính trong phòng thí nghiệm. Vi nhân giống là việc nhân đúng kiểu cây (true-to-type) của một kiểu gen được tuyển chọn bằng cách sử dụng kỹ thuật in vitro. Vi nhân giống thông thường là phương pháp nhân nhanh và giảm giá thành. Hình 1.3 trình bày một sơ đồ tổng quát quy trình vi nhân giống. Hình 1.4 Các bước cơ bản của vi nhân giống (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) 14 1.8.1 Qui trình vi nhân giống Qui trình vi nhân giống đã được Debergh và Zimmerman (1991) chia thành 4 giai đoạn khác nhau, mỗi giai đoạn có một chức năng riêng. Sự thành công của công việc vi nhân giống tuỳ thuộc vào tất cả các giai đoạn (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). In vivo Giai đoạn 0: Sự chuẩn bị của cây mẹ In vitro Giai đoạn 1: Bắt đầu tiệt trùng Giai đoạn 2: Nhân Giai đoạn 3a: Kéo dài Giai đoạn 3b: Tạo rễ và tiền thuần dưỡng In vivo Giai đoạn 4: Thuần dưỡng Giai đoạn 0 (chuẩn bị của cây mẹ): là chọn cây mẹ hoàn toàn sạch bệnh, tốt nhất là chọn cây mẹ trong nhà kính. Mẫu thì lấy vào giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Giai đoạn này còn được hiểu là cải thiện điều kiện vệ sinh của cây mẹ. Phương pháp tưới nhỏ giọt của cây mẹ cho phép cải thiện tình trạng sinh lý của cây mẹ, để mẫu cấy tuân thủ theo qui trình cấy. Tình trạng sinh lý của cây mẹ cũng như nguồn dùng làm mẫu cấy có thể được cải thiện bởi một số kỹ thuật như ghép nhiều tầng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Giai đoạn 1: Mục đích là thực hiện thao tác cấy. Nó là một sự kết hợp giữa một phương pháp tiệt trùng đầy đủ và một tỉ lệ sống cao của mẫu cấy và không bị nhiễm. Thông thường khó đạt thành công 100% trong kỹ thuật vô trùng mẫu. Khử trùng mẫu cấy thường được sử dụng các chất diệt nấm bệnh, sản phẩm dùng để khử trùng tốt nhất là các sản phẩm rẻ tiền, không độc với mẫu cũng như đối với người thao tác và hiệu quả loại các vi sinh vật trong một phạm vi rộng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Giai đoạn 2: Quá trình kích thích các trung tâm mô phân sinh như đỉnh sinh trưởng, chồi chính, chồi bên. Có nhiều kiểu tăng tốc độ nhân như cấy mắt. Trong kỹ thuật này có hai kiểu tạo chồi, một kiểu tạo chồi từ một mẫu cấy chỉ có một mắt hoặc mẫu cấy có nhiều mắt. Cả hai điều tạo ra số chồi nhiều và hệ số nhân tuỳ thuộc vào các đoạn chồi mới tạo thành. Phương pháp nhân giống này thường được ứng dụng trên những cây không có mầm bệnh (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Phương pháp khác để gia tăng số chồi ở giai đoạn 2 là cấy đỉnh sinh trưởng (meristem culture) hoặc cấy đỉnh chồi (shoot tip culture). Đỉnh sinh trưởng hoặc chồi có thể được lấy từ chồi chính hoặc chồi ngang. Theo cách cấy này hai kiểu dạng chồi có thể được tạo thành là chồi dài và cụm chồi. Ở chồi dài, các chồi phát triển lóng dài và các chồi ngang cũng dài. Vì vậy, cây con được tạo ra từ chồi này có dạng bình thường. Trong khi đó cụm chồi tạo ra nhiều chồi nhưng lóng ngắn nên cây con được tạo ra có thể là cây con hoặc cụm cây con (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Ở giai đoạn 2, việc gia tăng số chồi phụ thuộc nhiều vào việc sử dụng cytokinin. Sử dụng hàm lượng cytokinin cao có thể gây ra một số vấn đề trong các cây được nhân 15 giống như sự thừa nước, tạo thành bụi rậm, biến dị vô tính, các vấn đề về rễ và chậm ra hoa… (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Giai đoạn 3: Được chia thành hai giai đoạn là giai đoạn kéo dài (3a), kích thích tạo rễ và tiền thuần dưỡng (3b). Giai đoạn (3a) Kéo dài: Trong nhiều trường hợp sự kéo dài là một yêu cầu cho sự tạo rễ đầy đủ. Môi trường kéo dài thường không chứa cytokinin hoặc một cytokinin yếu hơn cytokinin đã được sử dụng trong giai đoạn 2; Giai đoạn (3b) Kích thích rễ và tiền thuần dưỡng: Auxin thường được sử dụng để kích thích tạo rễ. Tạo rễ tốt nhất thường đạt được trên môi trường với hàm lượng khoáng thấp (ví dụ môi trường Knop ½) (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Giai đoạn 4: Nhằm làm giảm tối thiểu sự chết cây con, khi chuyển từ in vitro sang nhà lưới hoặc điều kiện ngoài đồng. Trong giai đoạn này các yếu tố cần được quan tâm là tình trạng cây con khi chuyển ra môi trường trồng, và các yếu tố về môi trường như nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). 1.8.2 Các thành phần trong môi trường nuôi cấy mô thực vật a/ Khoáng đa lượng: Đạm (N), Lân (L), Kali (K), Magie (Mg), Calci (Ca), Sắt (Fe). Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên (Nguyễn Đức Lượng, 2002). b/ Khoáng vi lượng: Nhu cầu vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật là lĩnh vực rất ít được nghiên cứu. Tuy nhiên nó được chứng minh là không thể thiếu đối với sự phát triển của mô và tế bào. Tuy nhiên có những trường hợp, một số khoáng vi lượng là không cần thiết. Các nguyên tố vi lượng thường dùng trong nuôi cấy mô là manganese, boron, kẽm, đồng, cobalt, idodine, molypdenum (Nguyễn Đức Lượng, 2002). c/ Carbon và nguồn năng lượng: Nguồn carbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải là do quá trình quang hợp cung cấp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường. Hai dạng đường thường gặp trong nuôi cấy in vitro là glucose và sucrose. Các nguồn carbohydrate khác cũng được thử nghiệm nhưng hiệu quả kém hơn glucose và sucrose (Nguyễn Đức Lượng, 2002). d/ Vitamin: Thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6), và myo-inositol (Nguyễn Đức Lượng, 2002). e/ Các hợp chất hữu cơ bổ sung không xác định: Các chất bổ sung này là protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước cam, nước cà chua. Nhưng hiện nay người ta thường dùng dịch chuối và protein hydrolysate hơn (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Chất có hoạt tính trong nước dừa được chứng minh là myo-inositol và một số các acid amin khác, lượng nước dừa (lấy từ trái dừa già) dùng trong môi trường thường khá lớn từ 15 – 20% thể tích môi trường (Nguyễn Văn Uyển và ctv, 1984). Trong dịch chuối xiêm chín hoàn toàn thì có sự chuyển hoá tinh bột thành đường gần như hoàn toàn, ngoài ra còn có các chất Ca, Fe, P và các vitamin B, C. Vì vậy dịch chuối xiêm chín là nguồn cung cấp đường, khoáng, vitamin cho môi trường nuôi cấy (Nguyễn Tấn Đàm, 1990). 16 f. Các chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật: Theo Đặng Phương Trâm (2005), thì chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật được chú ý vào năm 1928 khi Went phát hiện vai trò của Auxin lên khả năng phát triển tế bào của lúa mạch, đã mở đầu cho việc phát hiện, ứng dụng chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật vào nuôi cấy mô. Chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật là cách gọi chung cho những hợp chất hữu cơ có tác dụng kích thích hay ngăn cản đến sự phát triển sinh lý của thực vật, ở một nồng độ rất thấp (Mai Trần Ngọc Tiếng và ctv, 1991 trích theo Đặng Phương Trâm, 2005. Các chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển của cây từ lúc tế bào trứng thụ tinh, phát triển thành phôi cho tới khi cây ra hoa, kết quả là hình thành cơ quan sinh sản, dự trữ và kết thúc chu kỳ sống của mình (Vũ Văn Vụ, 1999 trích theo Đặng Phương Trâm, 2005). Trong nhân giống in vitro ta thường sử dụng hai chất điều hòa sinh trưởng đó là Auxin và Cytokinin. Auxin: Trong môi trường nuôi cấy thì Auxin được kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng để kích thích tạo mô sẹo, huyền phù tế bào và phát sinh hình thái, đặc biệt là khi sử dụng kết hợp với Cytokinin (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Trong quá trình phát sinh hình thái, sự di chuyển của Auxin có vai trò trong việc thiết lập tính hữu cực của cơ quan thực vật và tác động theo nồng độ trong sự phát sinh cơ quan (Bùi Trang Việt, 2001). Các Auxin được dùng phổ biến: + 2,4-D (2,4- Dichlorophenoxyacetic). + IAA (indole 3- aceticacid). + IBA (indole 3- butyric acid). + NAA (1-naphhalene acetic acid). Trong đó 2,4-D là một dạng Auxin mạnh rất cần thiết trong sự biệt hoá để tạo mô sẹo, tuỳ theo mục đích mà 2,4-D được sử dụng riêng lẽ hay kết hợp với các Auxin khác (Nguyễn Văn Uyển và ctv, 1984). Cytokinin: Trong nuôi cấy mô thực vật Cytokinin có tác dụng làm phân chia tế bào, nó ảnh hưởng rõ rệt lên sự phát sinh chồi, kích thích phân chia chồi và định hướng phân hoá tế bào. Khi trong môi trường có chứa nồng độ Cytokinin thích hợp thì các mầm bên của đỉnh chồi sẽ phát triển thành chồi (Đặng Phương Trâm, 2005). Nếu tỷ lệ Auxin/Cytokinin thấp thì sẽ kích thích thành lập chồi, ngược lại thì sẽ hình thành rễ, còn nếu ở một mức độ cân bằng thì thuận lợi cho sự phát triển mô sẹo. Vì vậy chúng ta có thể sử dụng Cytokinin kết hợp với Auxin theo một tỷ lệ nào đó để thu được các sản phẩm như mong muốn (Nguyễn Đức Thành, 2000). Các Cytokinin phổ biến dùng để phân hóa chồi thân mầm và chồi rễ mầm: + BAP (6 - benzyl - aminopurine). + Zea (zeatin). + Kinetine. Từ lâu người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng giữa tỉ lệ Auxin và Cytokinin có ý nghĩa rất quyết định trong quá trình phát sinh hình thái của nuôi cấy mô in vitro cũng như trên cây nguyên vẹn. Nếu Auxin cao hơn Cytokinin thì kích thích sự tạo rễ còn ngược lại thì kích thích sự tạo chồi (Vũ Văn Vụ, 2001 trích theo Nguyễn Đức Thành, 2000). 17 Thí nghiệm về hiệu quả của sự tương tác NAA và BA trên cây Bowiea volubilis Hình 1.5 Hiệu quả của sự tương tác NAA và BA trên cây Bowiea volubilis (Debergh, 2006) Theo các nghiên cứu của nhiều tác giả đã cho thấy tỉ lệ auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự thành lập tạo chồi và rễ. Một tỉ lệ cao cytokinin và auxin thấp thích hợp cho sự tạo chồi. Trong khi tỉ lệ cao auxin và cytokinin thấp thích hợp cho sự tạo rễ, mức độ trung gian giữa hai tỉ lệ này thích hợp tạo callus. Hình 1.5 là thí nghiệm các mức độ BA và NAA khác nhau trên sự thành lập chồi và rễ trên cây Bowiea volubilis. 2. Mô tả các phương pháp nghiên cứu liên quan đã được thực hiện Có rất nhiều các nơi thực hiện kỹ thuật gieo cấy hạt lan như Công ty Long Đỉnh (Tp. Hồ Chí Minh), Công ty Tân Xuân, hay như trong sách Nuôi Cấy Mô – tập 3 của Dương Công Kiên (2006), sách Kỹ Thuật Nuôi Trồng Hoa Lan của Nguyễn Thiện Tịch (2006),… nhưng chỉ là qui trình gieo cấy do các tác giả thực hiện mà ít có thí nghiệm để so sánh. Tuy nhiên, sau khi gieo hạt lên chồi rồi thì đây là nguồn vật liệu được các công trình nghiên cứu tiếp theo sử dụng rất phổ biến (Dương Công Kiên, 2006) như: - Gandewijaja (1980), sử dụng chồi đỉnh dài từ 1- 1,5 mm của cây con gieo hạt in vitro sẽ tạo cụm chồi và tạo rễ. Áp dụng cho giống Dendrobium phalaenosis (Dương Công Kiên, 2006). - Vij và Pathak (1989), dùng chồi bên lấy từ giả hành của cây gieo hạt in vitro được 40 tuần tuổi. Sau một thời gian quan sát thấy có sự tạo chồi và tạo thành cây từ chồi bên. Cây con được tái sinh từ chồi bên có tính tế bào ổn định (Dương Công Kiên, 2006). 18 - Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường, vitamin, và điều kiện thoáng khí lên sự tăng trưởng của cụm chồi lan Dendrobium Burana Fancy nuôi cấy in vitro (Dương Công Kiên, 2006). - Nghiên cứu sự ảnh hưởng của đường, loại giá thể (agar hoặc Cocobi) và điều kiện chiếu sáng (tự nhiên hay nhân tạo) lên sự tăng trưởng của lan Dendrobium Burana Fancy (Dương Công Kiên, 2006). - Vi nhân giống lan Dendrobium Sonia: (1) khử mẫu là chồi lan Dendrobium Sonia, (2) tạo cây con in vitro từ chồi thân, (3) Tạo cụm chồi và protocorm từ chồi đỉnh, (4) nhân giống nhanh protocorm (Dương Công Kiên, 2006). Ngoài ra, theo Nguyễn Văn Uyển (1984), ông cùng với một số ctv đã nghiên cứu nhân giống lan Cymbidium bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng; và tạo thể chồi lan Spathoglotis từ hạt trên môi trường nuôi cấy là Knudson C không có chất sinh trưởng. Sau 12 tuần có các khối tế bào trắng mọc từ hạt. Hay như tại Phân viện Sinh học tại Đà Lạt, Vũ Quốc Luận và Dương Tấn Nhựt (2007), bước đầu nghiên cứu khả năng tạo chồi hoa Dendrobium Mild Yumi trong nuôi cấy in vitro. Đầu tiên ông cũng cho tự thụ trái lan, sau đó khử trùng và cấy hạt hình thành protocorm và lên chồi tạo cây hoàn chỉnh. Và chồi lan được sử dụng bố trí thí nghiệm tạo chồi hoa với các môi trường MS1 đến MS9 có sự thay đổi thành phần khoáng. Sau 90 ngày kết thúc thí nghiệm thì có một số môi trường có sự tạo nụ hoa tốt, trong khi một số khác không tạo nụ hoa (Dương Tấn Nhựt, 2007). Tại Trường Đại học Cần Thơ, Lê Văn Hòa và một số ctv (2007), có công trình nghiên cứu khả năng gây đốt biến nhân tạo lan Dendrobium udormsri bằng tia gamma (Dương Tấn Nhựt, 2007). IV. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm Thời gian Địa điểm Công việc Tháng 2/2006 – tháng 7/2007 Phòng Nuôi cấy mô thuộc Khoa Nông nghiệp & TNTN - Trường Đại học An Giang Nhân giống lan Dendrobium anosmum Tháng 2/2006 – tháng 2/2007 Phòng Nuôi cấy mô thuộc Khoa Nông nghiệp & TNTN - Trường Đại Học An Giang Nhân giống lan Dendrobium mini Tháng 2/2007 – tháng 2/2008 Vườn lan Khoa Nông nghiệp & TNTN - Trường Đại học An Giang Thử nghiệm ra cây lan Dendrobium mini trên các loại giá thể khác nhau 2. Phương tiện nghiên cứu a. Dụng cụ - Ống đong, ống hút, đũa thủy tinh, kẹp dài 25 – 30 cm, kéo cắt mẫu cấy. - Dao cắt mẫu cấy (loại số 10) - Bình nuôi cấy - chai thuỷ tinh chịu nhiệt hàng Việt Nam. 19 - Đèn cồn, bình tia, bình xịt đựng cồn, giấy thanh trùng. - Cốc thủy tinh chia vạch: 50ml, 100ml, 200ml, 1000ml. b. Thiết bị Cân phân tích, máy đo pH, bếp điện, tủ cấy vô trùng, tủ sấy, tủ lạnh dùng để trữ hóa chất, nồi hấp thanh trùng môi trường cấy mô (autoclave). c. Các hóa chất - Khoáng đa lượng: KNO3, NH4NO3, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, Na2EDTA. - Khoáng vi lượng: MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, H3BO3, KI, CuSO4.5H2O, CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O, Na2MoO4.2H2O. - Vitamin và các chất hữu cơ: Glycine, Thiamine HCl, Pyridoxin HCl, Acid nicotinic. - Đường saccharose và Agar. d. Phòng nuôi mẫu: phòng kín có kệ để các mẫu cấy; hệ thống đèn neon chiếu sáng cho mẫu cấy 16/24 giờ; phòng được gắn máy lạnh nuôi mẫu cấy ở nhiệt độ 26 – 28oC. 3. Phương pháp nghiên cứu 3.1. Lan Dendrobium anosmum 3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát một số môi trường gieo hạt thích hợp cho hạt lan Dendrobium anosmum Vật liệu: Trái lan Dendrobium anosmum được thụ phấn từ cây lan giống tại Vườn lan Khoa Nông nghiệp & TNTN Trường Đại Học An Giang. b c Hình 1.6 Hoa và trái lan lan Dendrobium anosmum được thụ 4 tháng 20 Qui trình khử trùng và gieo hạt: Trái lan được thụ phấn khoảng 3 - 5 tháng chín sẽ được cắt đem lên phòng Nuôi cấy mô khử trùng bằng xà phòng 5 phút → rữa dưới vòi nước chảy 15 phút → ngâm cồn 70o trong 1 phút (trong tủ cấy vô trùng) → rữa 3 lần với nước cất 2 lần (trong tủ cấy) → sau đó ngâm trong clorox 15 phút (trong tủ cấy) → rữa 5 lần với nước cất 2 lần (trong tủ cấy) → Gắp trái ra và xẻ lấy hạt cấy vào môi trường đã được chuẩn bị sẵn (Qui trình khử trái và gieo hạt theo như hình 1.7). f e d c b a Hình 1.7 Qui trình khử trái và gieo hạt lan Dendrobium anosmum (2.2a: ngâm trái lan trong dung dịch clorox; 2.2b,c,d,e: gắp trái ra và xẻ lấy hạt cấy vào môi trường đã được chuẩn bị sẵn; 2.2f: Hạt lan sau khi gieo được một tháng) 21 Môi trường cấy hạt: Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) (xem phụ chương) với các kích thích tố BA và NAA với các nồng độ và tỷ lệ khác nhau. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn t._.n cây từ khay ươm sang chậu, giai đoạn đầu cây bị sốc một chút, cây chựng lại chậm phát triển. Cũng giống như trường hợp trồng lan lớn mới tách chiết, cây mới tách mẹ sẽ mất sức. Và thông thường khi sống đơn độc một mình trong một chậu quá lớn so với kích thước, cây sẽ bị yếu và thời gian hồi phục rất lâu. Điều này thường được các nghệ nhân trồng lan gọi là “lạnh”. Trong giai đoạn này do cây bố trí thí nghiệm đã được tuyển chọn kỹ nên không có tỷ lệ cây chết. Đến 15 ngày sau khi trồng (NSKT), cây đã bắt đầu thích nghi nhưng không đáng kể. Việc khác biệt trong các chỉ tiêu ở các nghiệm thức theo số liệu thống kê trong bảng 2.12 là do các cây trong bố trí thí nghiệm không đều, dẫn đến có sự khác biệt giữa các nghiệm thức. Do đó số liệu này có giá trị thống kê ý nghĩa, nhưng trong thực tế không ý nghĩa, mà nó làm nền tảng cho các so sánh ở các giai đoạn phát triển tiếp theo của cây. 40 Bảng 2.12 Ảnh hưởng của giá thể trồng lên sự phát triển của Lan Dendrobium mini 15 ngày sau khi trồng (NSKT) Nghiệm thức Giá thể trồng Cao cây (cm) Số lá Dài lá (cm) Số chồi T1 Dớn 1,01 3,38 1,82 c 2,40 a T2 Than 1,02 4,20 2,18 abc 1,00 b T3 Than + Dớn 1,32 4,20 2,64 ab 1,40 b T4 Dừa miếng 1,04 3,10 2,82 a 1,40 b T5 Dừa sợi 1,20 3,10 1,94 bc 1,40 b F ns ns * * CV (%) 36,80 27,39 24,28 32,23 Chú thích: Trên cùng một cột, các số trung bình theo sau bởi cùng một chữ thì khác biệt không có ý nghĩa; * = khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. Sang 30 NSKT thì cây đã bắt đầu có sự phát triển như cây cao hơn và lá dài hơn, nhưng khác biệt này không đáng kể và không có ý nghĩa thống kê ở các nghiệm thức về chỉ tiêu cao cây, số lá, dài lá. Riêng về chỉ tiêu số chồi thì sự khác biệt này là do các chồi trên cây đã có sẳn, chưa có thêm chồi mới xuất hiện. Bảng 2.13 Ảnh hưởng của giá thể trồng lên sự phát triển của Lan Dendrobium mini 30 NSKT Nghiệm thức Giá thể trồng Cao cây (cm) Số lá Dài lá (cm) Số chồi T1 Dớn 1,08 3,58 1,90 2,40 a T2 Than 1,20 4,60 2,40 1,00 b T3 Than + Dớn 1,52 4,80 2,96 1,40 b T4 Dừa miếng 1,30 3,60 2,92 1,40 b T5 Dừa sợi 1,26 3,10 2,68 1,40 b F ns ns ns * CV (%) 29,46 27,97 25,21 32,23 Chú thích: Trên cùng một cột, các số trung bình theo sau bởi cùng một chữ thì khác biệt không có ý nghĩa; * = khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. Khi cây được 195 NSKT thì lúc này cây có sự phát triển rất rõ. Thân cây phình to hình trụ, các đốt thân lộ rõ. Chiều cao cây tăng cao và có khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Nghiệm thức T1 (giá thể trồng là Dớn) cho chiều cao cây cao nhất (1,85 cm), không khác biệt ý nghĩa so với nghiệm thức T4 (giá thể trồng là vỏ dừa miếng), khác biệt thống kê có ý nghĩa ở mức 5% so với các nghiệm thức T2 (than), T3 (than + dớn), 41 T5 (dừa sợi). Điều này cũng khá phù hợp vì đối với giá thể trồng ở nghiệm thức T1 và T4 là hai loại giá thể mềm, giữ ẩm tốt, bản thân giá thể cũng có chất hữu cơ nên rất thích hợp đối với lan giống Dendrobium. Ta nhận thấy điều này rất rõ ở các vườn lan, đối với lan Dendrobium rất hay được các nghệ nhân trồng lan trồng vào vỏ các trái dừa, chính vỏ các trái dừa cung cấp chất hữu cơ và giữ ẩm độ rất tốt cho rễ lan. Do đó chúng phát triển rất tốt. Tuy nhiên, giá thể này cũng sẽ gặp một số hạn chế mà chúng ta sẽ tìm hiểu tiếp ở phần sau. Và tương phản với điều này thể hiện ở hai nghiệm thức T2, T3 với chất trồng là than. Vì than là chất giữ ẩm không cao, lại không chứa chất hữu cơ cung cấp cho rễ lan. Do đó cây trồng ở giá thể này cho thấy sự tăng trưởng chậm hơn. Và ở giá thể T5 (dừa sợi) cũng cho kết quả thấp dù đây cũng là giá thể giữ ẩm khá hơn than. Đó là vì bản thân dừa sợi chỉ còn là chất xơ, các cám (mụn) dừa đã bị lấy đi. Do đó giá thể này không còn chứa chất hữu cơ, lại thô ráp nên không thích hợp cho rễ lan Dendrobium mini. Bảng 2.14 Ảnh hưởng của giá thể trồng lên sự phát triển của Lan Dendrobium mini 195 NSKT (6,5 tháng) Nghiệm thức Giá thể trồng Cao cây (cm) Số lá Dài lá (cm) Số chồi T1 Dớn 1,85 a 3,00 3,75 2,30 T2 Than 1,26 c 2,60 4,40 1,48 T3 Than + Dớn 1,43 c 2,75 4,75 1,55 T4 Dừa miếng 1,78 ab 3,40 4,80 2,00 T5 Dừa sợi 1,47 bc 2,67 7,33 1,73 F * ns ns ns CV (%) 17,26 26,66 40,49 25,37 Chú thích: Trên cùng một cột, các số trung bình theo sau bởi cùng một chữ thì khác biệt không có ý nghĩa; * = khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. Như vậy xét ở giai đoạn đầu đến khi cây được 7,5 tháng tuổi sau khi chuyển từ chai mô ra ngoài thì giá thể thích hợp nhất cho cây ở giai đoạn này là dớn và dừa miếng. Ở 7,5 tháng tuổi, cây lan Dendrobium mini cao trung bình 2 – 3 cm tính trên chồi chính, có khoảng từ 2 đến 6 lá, và trung bình trên mỗi cây ban đầu sẽ cho thêm từ 1 – 4 chồi con. Giai đoạn này cây lan con có tỉ lệ hao hụt nhưng không cao, chủ yếu là do rễ non của lan con rất hấp dẫn các chú ốc sên, sâu … cắn phá làm cho cây chựng lại chậm phát triển. Nếu việc giữ cho lan khỏi sự tấn công của hai đối tượng trên tốt và tránh ẩm ướt nhiều thì cây lan con sẽ phát triển tốt. Nếu trồng tiếp thì đến 18 tháng tuổi sau khi trồng thì cây mới đạt được tiêu chuẩn cây giống (như hình 2.4 e). Và khoảng 4 – 5 tháng sau từ khi trồng cây giống thì cây sẽ ra hoa. Điều này không giống với những đặc tính cây mà Công ty Long Đỉnh đã 42 đưa ra. Có thể vì Công ty quảng cáo để bán sản phẩm nên đưa ra tiêu chuẩn lý tưởng hơn để hấp dẫn người mua, hay do khâu chăm sóc trong thí nghiệm của ta chưa tốt (thực tế ta dùng phân bón rất ít và không sử dụng thuốc kích thích). Do kinh phí đề tài có hạn nên không thể nghiên cứu sâu hơn. Tuy nhiên, bước đầu đã thành công trong qui trình nhân giống và đưa cây ra vườn ươm đạt tỉ lệ sống khá cao. a b c d e f Hình 2.4 Qui trình nhân giống lan Dendronium mini (a: Lan Dendrobium mini tạo cụm chồi, b: Lan Dendrobium mini ra rễ, c và d: Cây con 5 tháng tuổi, e: Cây lan giống, f: Cây ra hoa) 43 Một số ghi nhân được trong quá trình trồng lan con Dendrobium mini Cây có hiện tượng nhẩy chồi rất mạnh, từ một chồi ban đầu có thể nhẩy thêm rất nhiều chồi con. Giá thể trồng với dớn và dừa miếng cho cây phát triển rất tốt. Tuy nhiên với với loại giá thể này khi trồng cần lưu ý: (1) Dễ gây ra úng rễ do dư nước nếu tưới quá nhiều hoặc gặp mùa, (2) Dễ có hiện tượng rong bám bề mặt chậu gây cản trở hô hấp cho bộ rễ lan và dễ phát sinh bệnh do côn trùng kí sinh. Vì đây là môi trường rất hấp dẫn cho các loại côn trùng và vi sinh vật (như ở hình 2.5). a b c d e f Hình 2.5 Một số hiện tượng trong quá trình sinh trưởng của lan Dendronium mini (a: Cây bị bệnh hạch hạt cải do nấm Sclerotium rolfisii Sacc; b: Côn trùng cắn hại rễ non của lan; c: Ốc sên cắn phá lá và rễ non; d: Rong rêu tấn công bề mặt giá thể trồng; e,f: Cây nhảy con trên thân cây mẹ già yếu hay còn được gọi là keiki) 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Qua thời gian dài nghiên cứu đã cho ra được hai qui trình vi nhân giống của hai loài lan sau: 1.1. Lan Giả hạc Dendrobium anosmum - Gieo hạt: Nghiệm thức NT5 (môi trường MS + 1 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA) và NT6 (MS + 1 mg/l NAA) là hai môi trường thích hợp nhất cho hạt lan nẩy mầm. Chỉ 3 tháng sau khi gieo thì tất cả các hạt đều nẩy mầm tốt, tỉ lệ đạt được là ≥ 85%. - Nhân chồi: Nghiệm thức A1 (MS + 1 mg.l- BA) và A2 (MS + 2 mg.l- BA) cho kết quả nhân chồi rất tốt đối với lan Giả hạc. Tốt nhất là nghiệm thức A2, ở thời gian 90 NSKC, đạt 3,17chồi, chồi cao 20,6 mm, chồi xanh tốt. Môi trường khi không có bổ sung BA (nghiệm thức A0) cho kết quả nhân chồi rất thấp. Đồng thời khi sử dụng BA cao cũng cho kết quả không tốt, như nghiệm thức A4 (MS + 10mg/l BA) cho số chồi thấp, xuất hiện chồi dị dạng, cây phát triển yếu. - Tạo rễ: Nghiệm thức X2 (MS + 1 mg/l NAA) cho hiệu quả tạo rễ tốt nhất. Sau 3,5 tháng tạo được cây hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn để đưa ra ngoài vườn. Như vậy, sau thời gian 9,5 tháng thì từ hạt lan gieo cấy đã cho ra được cây lan con hoàn chỉnh có thể đưa ra ngoài vườn trồng. Qui trình vi nhân giống lan Dendrobium anosmum 4 tháng Xử lý bằng cồn 70o (1 phút) + clorox 10 % (15 phút) (tỉ lệ nẩy chồi đạt được là ≥ 85%) 3 tháng MS + 1 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA và MS + 1 mg/l NAA (Chồi phát triển xanh tốt, hệ số nhân là 34 chồi/năm, chồi cao 20,6 mm) 3 tháng MS + 1 mg.l- BA và MS + 2 mg.l- BA ↓ 3,5 tháng MS + 1 mg/l NAA Gieo hạt Trái lan thụ Nhân chồi Tạo rễ thành cây hoàn chỉnh Trồng cây ra vườn ươm 45 1.2. Lan Dendrobium mini - Nhân chồi: Nghiệm thức C2 (MS + 1 mg/l BA) và D2 (MS/2 + 1 mg/l BA) là hai nghiệm thức thích hợp nhất cho việc nhân chồi ở lan Dendrobium mini. Điều này chứng tỏ môi trường có bổ sung 1 mg/l BA sẽ cho kết quả nhân chồi tốt nhất đối với lan Dendrobium mini. Và nếu xét về tính kinh tế ta nên chọn nghiệm thức D2. Sau 2 tháng nhân chồi thì đã 3,8 chồi, chồi cao 1,26cm. - Ra rễ: Lan Dendrobium mini là đối tượng có khả năng tạo rễ rất mạnh, chồi lan ra rễ ngay trên môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng NAA (nghiệm thức NT1 và NT6). Môi trường ở nghiệm thức NT7 (MS/2 + 0,2 mg/l NAA) cho kết quả ra rễ tốt và có tính kinh tế hơn tất cả các nghiệm thức khác trong cùng thí nghiệm. Ở 60 NSKC, chồi lan tạo rễ tốt thành cây hoàn chỉnh để đưa ra vườn ươm. - Ra cây mô: Trong giai đoạn đầu nuôi trồng (từ cây mới ra mô đến khi cây được 7,5 tháng tuổi) thì giá thể thích hợp nhất cho cây là dớn và dừa miếng. Qui trình vi nhân giống lan Dendrobium mini Cụm chồi Nhân chồi (hệ số nhân chồi là 46 chồi/năm, chồi cao 12,8 mm) 2 tháng MS/2 + 1 mg/l BA Tạo rễ 2 tháng MS/2 + 0,2 mg/l NAA (…) Thuần dưỡng cây con ngoài vườn ươm 1 tháng - Giá thể là dớn, hạn chế nước tưới - Che lưới 2 lớp 6,5 tháng - Giá thể thích hợp là dớn và dừa miếng Cây trồng ngoài vườn Cây lan giống 46 2. Kiến nghị Nghiên cứu tiếp sự ảnh hưởng của nồng độ cao các chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến mẫu cấy và chất lượng cây đưa ra ngoài trồng. Vì hiện có nhiều cơ sở nhân giống vì lợi nhuận mà sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng auxin và cytokinin ở nồng độ cao, hay việc cấy chuyền quá nhiều lần gây ảnh hưởng đến phẩm chất cây giống. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự ra hoa trong ống nghiệm của lan Dendrobium anosmum. Thực hiện một qui mô nghiên cứu lớn hơn với sự nhân giống và ra cây lan Dendrobium anosmum. Vì đây là đối tượng rất có giá trị kinh tế hiện nay. Nên tổ chức mở các lớp hướng dẫn mọi người kỹ thuật đưa cây mô ra vườn ươm. Nhằm giúp cho mọi người mạnh dạn hơn trong việc trồng cây con cấy mô. Có như vậy mới tạo được mối liên kết giữa nhà khoa học với nhà sản xuất hay các nghệ nhân trồng lan. Như vậy mới mong thúc đẩy được việc cung ứng các cây lan giống chất lượng tốt đến người chơi lan, đáp ứng được nhu cầu thị trường hoa lan hiện nay. 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Bá Bổng. 1995. Nhân giống cây bằng nuôi cấy mô. An Giang: Sở Khoa Học và Công Nghệ Môi Trường An Giang. Bùi Bảo Lộc. 2008. Lan Việt: Dã Hạc, Phi Điệp – Dendrobium anosmum (Lindl.). Hoa lan Việt Nam. (11/4/2009). Bùi Trang Việt. 2001. Tế bào học. Thành phố Hồ Chí Minh: Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Debergh Pierre. 2006. Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô trong nghiên cứu và sản xuất hoa - kiểng ở Đồng bằng Sông Cửu Long. Bài giảng, Đại học Cần Thơ. Dương Công Kiên. 2006. Nuôi cấy mô (tập III). Tủ sách ĐH KHTN. Dương Tấn Nhựt. 2007. Hội Nghị khoa học – Công nghệ sinh học thực vật trong công tác nhân và chọn tạo giống hoa. NXB Nông Nghiệp – TP. HCM. Đặng Phương Trâm. 2005. Nuôi cấy mô thực vật và các ứng dụng. Bài giảng, ĐH Cần Thơ. Griesbach, R.J. 2002. Development of Phalaenopsis Orchids for the Mass-Market. In: J. Janick and A. Whipkey (eds.). Trends in new crops and new uses. ASHS Press, Alexandria, VA p. 458–465.. [on-line]. Available from: (Accessed 10.01.2008) Huỳnh Văn Thới. 2005. Cẩm nang nuôi trồng và kinh doanh phong lan. Hà Nội: NXB Trẻ. Minh Tú. 2008. Bản tin. Tạp chí Hoa Cảnh, số 10 (148):32. Tp. Hồ Chí Minh. Nguyễn Bảo Toàn. 2004. Nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Giáo trình, ĐH Cần Thơ. Nguyễn Công Nghiệp. 2004. Trồng hoa lan – In lần ba. Tp. HCM: NXB Trẻ. Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên. 2002. Công nghệ tế bào. TP. Hồ Chí Minh. NXB ĐH Quốc gia. Nguyễn Đức Thành. 2000. Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng dụng. NXB Nông nghiệp Hà Nội. Nguyễn Thị Mỹ Duyên. 2004. Kỹ thuật trồng và chăm sóc hoa lan. Bài giảng, ĐH An Giang. Nguyễn Tấn Đàm. 1990. Xác định môi trường thích hợp trên sự sinh trưởng và phát triển của giống lan Dendrobium harliquine. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư trồng trọt, Khoa Nông Nghiệp - Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Thiện Tịch Đoàn Thị Hoa, Trần Sĩ Dũng, Huỳnh Thị Ngọc Nhân. 2006. Kỹ thuật nuôi trồng hoa lan. Tp. HCM: NXB Nông nghiệp. Nguyễn Văn Uyển và các tác giả. 1984. Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống cây trồng. Nhà xuất bản Thành phố Hồ Chí Minh. Nông Văn Duy, Nguyễn Thị Lang và ctv. 2001. Kết quả điều tra thu thập các loài lan Orchidaceae của Lâm Đồng. Thông tin khoa học và Công nghệ - Số 1 – 2001. Thiên Ân. 2002. Những Phương pháp trồng lan. NXB Mỹ Thuật – Tp. HCM. trang 54. 48 49 Trần Văn Bảo. 1999. Kỹ thuật nuôi trồng Phong lan. NXB Trẻ - Tp. HCM. trang 75. Trần Văn Huân và Văn Tích Lượm. 2004. Kỹ thuật nuôi trồng cấy lan. Tp.HCM: NXB Mỹ Thuật. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp. 2005. Công nghệ sinh học tế bào. Hà Nội: NXB Giáo dục. PHỤ CHƯƠNG PHỤ CHƯƠNG 1 Bảng 1 Môi trường MS (Murashige & Skoog), 1962 Thành phần Hàm lượng (mg/l) Khoáng đa lượng KNO3 1900 NH4NO3 1650 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 FeSO4.7H2O 27,8 Na2 EDTA 37,2 Khoáng vi lượng MnSO4.4H2O 22,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Na2MoO4.2H2O 0,025 Vitamin và các chất hữu cơ Glycine 2,00 Thiamine HCl 0,10 Pyridoxin HCl 0,50 Acid nicotinic 0,50 Saccharose 20000 Agar 7000 50 Bảng 2 Ảnh hưởng của NAA lên quá trình tạo rễ của Lan Dendrobium anosmum 15 NSKC NT So la So re Dai re So choi Chieu cao choi X0 3,875 b 0,313 0,022 0,250 1,275 X1 4,000 b 0,000 0,000 0,063 1,234 X2 4,625 ab 0,000 0,000 0,125 1,356 X3 5,438 a 0,063 0,006 0,000 1,194 F * ns ns ns ns CV (%) 7.32 14.68 1.56 11.01 8.47 Bảng 3 Ảnh hưởng của NAA lên quá trình tạo rễ của Lan Dendrobium anosmum 75 NSKC NT So la So re Dai re So choi Chieu cao choi X0 4,438 0,917 0,159 0,875 2,203 X1 4,875 1,750 0,318 1,313 2,097 X2 5,375 1,750 0,198 1,688 2,681 X3 5,396 1,625 0,194 0,563 2,178 F ns ns ns ns ns CV (%) 9.75 21.22 6.82 17.09 9.09 Bảng 4 Ảnh hưởng của NAA lên quá trình tạo rễ của Lan Dendrobium anosmum 90 NSKC NT So la So re Dai re So choi Chieu cao choi X0 4,375 1,500 0,270 b 1,000 2,509 X1 4,583 4,167 0,597 a 1,333 2,329 X2 5,250 4,625 0,395 b 2,063 2,866 X3 4,125 3,375 0,332 b 1,438 2,557 F ns ns ** ns ns CV (%) 10.35 22.04 6.33 14.25 7.85 51 PHỤ CHƯƠNG 2 Bảng 1 Số lá lan Giả hạc 15 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,096 0,385 0,032 0,032 0,998 ns Tổng cộng 15 0,482 CV (%) = 7,95 Bảng 2 Số rễ lan Giả hạc 15 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,050 0,194 0,017 0,016 1,022 ns 0,4171 Tổng cộng 15 0,244 CV (%) = 16,08 Bảng 3 Chiều dài rễ lan Giả hạc 15 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,001 0,003 0,000 0,000 0,852 ns Tổng cộng 15 0,004 CV (%) = 2,30 Bảng 4 Số chồi lan Giả hạc 15 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,210 0,269 0,070 0,022 3,130 ns 0,0657 Tổng cộng 15 0,479 CV (%) = 15,99 Bảng 5 Chiều cao chồi lan Giả hạc 15 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,027 0,116 0,009 0,010 0,943 ns Tổng cộng 15 0,143 CV (%) = 6,81 52 Bảng 6 Số lá lan Giả hạc 30 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,088 0,443 0,029 0,037 0,792 ns Tổng cộng 15 0,530 CV (%) = 8,32 Bảng 7 Số rễ lan Giả hạc 30 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,282 0,904 0,094 0,075 1,246 ns 0,3363 Tổng cộng 15 1,185 CV (%) = 26,38 Bảng 8 Chiều dài rễ lan Giả hạc 30 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,009 0,017 0,003 0,001 2,213 ns 0,1393 Tổng cộng 15 0,026 CV (%) = 4,93 Bảng 9 Số chồi lan Giả hạc 30 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,516 0,386 0,172 0,032 5,344 * 0,0144 Tổng cộng 15 0,902 CV (%) = 16,00 Bảng 10 Chiều cao chồi lan Giả hạc 30 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,005 0,166 0,002 0,014 0,131 ns Tổng cộng 15 0,171 CV (%) = 7,62 53 Bảng 11 Số lá lan Giả hạc 60 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,113 0,524 0,038 0,044 0,861 ns Tổng cộng 15 0,636 CV (%) = 8,99 Bảng 12 Số rễ lan Giả hạc 60 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,174 1,006 0,058 0,084 0,690 ns Tổng cộng 15 1,180 CV (%) = 23,98 Bảng 13 Chiều dài rễ lan Giả hạc 60NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,010 0,038 0,003 0,003 1,080 ns 0,3944 Tổng cộng 15 0,048 CV (%) = 7,02 Bảng 14 Số chồi lan Giả hạc 60 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,590 0,443 0,197 0,037 5,327 * 0,0145 Tổng cộng 15 1,034 CV (%) = 16,22 Bảng 15 Chiều cao chồi lan Giả hạc 60 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,010 0,206 0,003 0,017 0,195 ns Tổng cộng 15 0,216 CV (%) = 8,16 54 Bảng 16 Số lá lan Giả hạc 75 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,119 0,625 0,040 0,052 0,763 ns Tổng cộng 15 0,744 CV (%) = 9,75 Bảng 17 Số rễ lan Giả hạc 75 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,248 1,043 0,083 0,087 0,952 ns Tổng cộng 15 1,291 CV (%) = 21,22 Bảng 18 Chiều dài rễ lan Giả hạc 75 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,019 0,040 0,006 0,003 1,856 ns 0,1908 Tổng cộng 15 0,058 CV (%) = 6,82 Bảng 19 Số chồi lan Giả hạc 75 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,444 0,542 0,148 0,045 3,277 ns 0,0587 Tổng cộng 15 0,986 CV (%) = 17,09 Bảng 20 Chiều cao chồi lan Giả hạc 75 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,069 0,275 0,023 0,023 1,002 ns 0,4254 Tổng cộng 15 0,343 CV (%) = 9,09 55 Bảng 21 Số lá lan Giả hạc 90 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,144 0,646 0,048 0,054 0,891 ns Tổng cộng 15 0,790 CV (%) = 10,35 Bảng 22 Số rễ lan Giả hạc 90 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 1,623 2,127 0,541 0,177 3,052 ns 0,0698 Tổng cộng 15 3,751 CV (%) = 22,04 Bảng 23 Chiều dài rễ lan Giả hạc 90 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,065 0,043 0,022 0,004 6,032 ** 0,0096 Tổng cộng 15 0,108 CV (%) = 6,33 Bảng 24 Số chồi lan Giả hạc 90 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,295 0,464 0,098 0,039 2,540 ns 0,1055 Tổng cộng 15 ,0759 CV (%) = 14,25 Bảng 25 Chiều cao chồi lan Giả hạc 90 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,045 0,225 0,015 0,019 0,797 ns Tổng cộng 15 0,270 CV (%) = 7,85 56 Bảng 26 Số lá lan Giả hạc 105 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,193 0,446 0,064 0,037 1,728 ns 0,2144 Tổng cộng 15 0,639 CV (%) = 9,15 Bảng 27 Số rễ lan Giả hạc 105 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 3,168 2,607 1,056 0,217 4,862 * 0,0194 Tổng cộng 15 5,775 CV (%) = 21,05 Bảng 28 Chiều dài rễ lan Giả hạc 105 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,119 0,093 0,040 0,008 5,123 * 0,0164 Tổng cộng 15 0,212 CV (%) = 8,59 Bảng 29 Số chồi lan Giả hạc 105 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,795 0,567 0,265 0,047 5,612 * 0,0122 Tổng cộng 15 1,362 CV (%) = 15,44 Bảng 30 Chiều cao chồi lan Giả hạc 105 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 3 12 0,177 0,376 0,059 0,031 1,886 ns 0,1858 Tổng cộng 15 0,553 CV (%) = 9,81 57 Bảng 31 Ảnh hưởng của BA lên số chồi của Lan Dendrobium mini 30 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 9 40 6,680 7,900 0,742 0,198 3,758** Tổng cộng 49 14,580 CV (%) = 24,97 Bảng 32 Ảnh hưởng của BA lên số chồi của Lan Dendrobium mini 45 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 9 40 11,720 13,400 1,302 0,335 3,887 ** Tổng cộng 49 25,120 CV (%) = 25,61 Bảng 33 Ảnh hưởng của BA lên số chồi của Lan Dendrobium mini 60 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 9 40 23,105 11,100 2,567 0,278 9,251 ** Tổng cộng 49 34,205 CV (%) = 17,39 Bảng 34 Ảnh hưởng của BA lên chiều cao chồi của Lan Dendrobium mini 30 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 9 40 0,550 0,602 0,061 0,015 4,058 ** Tổng cộng 49 1,152 CV (%) = 12,71 Bảng 35 Ảnh hưởng của BA lên chiều cao chồi của Lan Dendrobium mini 45 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 9 40 1,246 0,250 0,138 0,011 12,300 ** Tổng cộng 49 1,697 CV (%) = 9,27 58 Bảng 36 Ảnh hưởng của BA lên chiều cao chồi của Lan Dendrobium mini 60 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 9 40 0,446 0,337 0,050 0,008 5,883 ** Tổng cộng 49 0,783 CV (%) = 7,30 Bảng 37 Ảnh hưởng của BA lên số lá của Lan Dendrobium mini 30 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 9 40 19,448 12,932 2,161 0,323 6,684 Tổng cộng 49 32,380 CV (%) = 24,47 Bảng 38 Ảnh hưởng của BA lên số lá của Lan Dendrobium mini 45 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 9 40 30,229 4,597 3,359 0,115 29,228** Tổng cộng 49 34,826 CV (%) = 11,34 Bảng 39 Ảnh hưởng của BA lên số lá của Lan Dendrobium mini 60 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 9 40 8,388 3,658 0,932 10,191** Tổng cộng 49 12,046 0,091 CV (%) = 8,18 Bảng 40 Số rễ lan Dendrobium mini 30 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 9 30 142,525 131,250 15,836 4,375 3,620** 0,0037 Tổng cộng 39 273,775 CV (%) = 32,55 59 Bảng 41 Chiều dài rễ lan Dendrobium mini 30 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 9 30 4,309 2,055 0,479 0,069 6,989** 0,0000 Tổng cộng 39 6,364 CV (%) = 45,13 Bảng 42 Số rễ lan Dendrobium mini 45 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 9 30 798,100 351,500 88,678 11,717 7,569** 0,0000 Tổng cộng 39 1149,600 CV (%) = 28,29 Bảng 43 Chiều dài rễ lan Dendrobium mini 45 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 9 30 6,790 4,285 0,754 0,143 5,282** 0,0002 Tổng cộng 39 11,075 CV (%) = 38,76 Bảng 44 Số rễ lan Dendrobium mini 60 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 9 30 673,400 304,500 74,822 10,150 7,372** 0,0000 Tổng cộng 39 977,900 CV (%) = 19,97 Bảng 45 Chiều dài rễ lan Dendrobium mini 60 NSKC Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 9 30 7,640 3,208 0,849 0,107 7,940** 0,0000 Tổng cộng 39 10,848 CV (%) = 25,80 60 Bảng 46 Ảnh hưởng của vật liệu trồng đến chiều cao cây Dendrobium mini 15 NSKT Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 4 20 0,374 3,386 0,094 0,169 0,553 ns Tổng cộng 24 3,760 CV (%) = 36,80 Bảng 47 Ảnh hưởng của vật liệu trồng đến số lá cây Dendrobium mini 15 NSKT Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 4 20 6,342 19,408 1,585 0,970 1,634 ns 0,2049 Tổng cộng 24 25,750 CV (%) = 27,39 Bảng 48 Ảnh hưởng của vật liệu trồng đến chiều dài lá cây Dendrobium mini 15 NSKT Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 4 20 3,792 6,128 0,948 0,306 3,094 * 0,0390 Tổng cộng 24 9,920 CV (%) = 24,28 Bảng 49 Ảnh hưởng của vật liệu trồng đến số chồi Dendrobium mini 15 NSKT Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 4 20 5,440 4,800 1,360 0,240 5,667 ** 0,0032 Tổng cộng 24 10,240 CV (%) = 32,23 Bảng 50 Ảnh hưởng của vật liệu trồng đến chiều cao cây Dendrobium mini 30 NSKT Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 4 20 0,526 2,807 0,132 0,140 0,937 ns Tổng cộng 24 3,333 CV (%) = 29,46 61 Bảng 51 Ảnh hưởng của vật liệu trồng đến số lá cây Dendrobium mini 30 NSKT Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 4 20 10,630 24,248 2,567 1,212 2,192 ns 0,1068 Tổng cộng 24 34,878 CV (%) = 27,97 Bảng 52 Ảnh hưởng của vật liệu trồng đến chiều dài lá cây Dendrobium mini 30 NSKT Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 4 20 3,822 8,408 0,956 0,420 2,273 ns 0,0973 Tổng cộng 24 12,230 CV (%) = 25,21 Bảng 53 Ảnh hưởng của vật liệu trồng đến số chồi Dendrobium mini 30 NSKT Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 4 20 5,440 4,800 1,360 0,240 5,667 ** 0,0032 Tổng cộng 24 10,240 CV (%) = 32,23 Bảng 54 Ảnh hưởng của vật liệu trồng đến chiều cao cây Dendrobium mini 6 tháng 15 NSKT Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 4 20 1,244 1,444 0,311 0,072 4,308* 0,0113 Tổng cộng 24 2,689 CV (%) = 17,26 Bảng 55 Ảnh hưởng của vật liệu trồng đến số lá Dendrobium mini 6 tháng 15 NSKT Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 4 20 2,125 11,817 0,531 0,591 0,899 ns Tổng cộng 24 13,942 CV (%) = 26,66 62 63 Bảng 56 Ảnh hưởng của vật liệu trồng đến số chồi Dendrobium mini 6 tháng 15 NSKT Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 4 20 37,315 82,167 9,329 4,108 2,271 ns 0,0975 Tổng cộng 24 119,482 CV (%) = 40,49 Bảng 57 Ảnh hưởng của vật liệu trồng đến chiều cao cây Dendrobium mini 8 tháng SKT Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 4 20 2,307 4,224 0,577 0,211 2,731 ns 0,0580 Tổng cộng 24 6,531 CV (%) = 25,37 Bảng 58 Ảnh hưởng của vật liệu trồng đến số lá Dendrobium mini 8 tháng SKT Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 4 20 1,109 13,667 0,277 0,683 0,406ns Tổng cộng 24 14,776 CV (%) = 29,17 Bảng 59 Ảnh hưởng của vật liệu trồng đến số chồi Dendrobium mini 8 tháng SKT Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương F Prob, Nghiệm thức Sai số 4 20 64,817 86,367 16,204 4,318 3,752* 0,0196 Tổng cộng 24 151,184 CV (%) = 33,59 ._.