Tài liệu Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cây lựu (Punica Granatum): ... Ebook Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cây lựu (Punica Granatum)
53 trang |
Chia sẻ: huyen82 | Lượt xem: 1655 | Lượt tải: 0
Tóm tắt tài liệu Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cây lựu (Punica Granatum), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
PhÇn I : Më ®Çu
1.1. §Æt vÊn ®Ò
Lùu ( Punica granatum. L) hay cßn gäi lµ Th¸p lùu, Th¹ch lùu, An th¹ch lùu, Kim bµng, Kim t¬ng…®ù¬c nhiÒu ngêi biÕt ®Õn, tríc hÕt lµ loµi c©y lÊy qu¶, sau ®ã ®Ó lµm c¶nh vµ c«ng dông kh«ng thÓ kh«ng kÓ ®Õn cña nã lµ lµm thuèc ch÷a bÖnh. Trªn thÕ giíi chóng ®îc sö dông vµ ®a vµo trång trät tõ rÊt l©u tríc c«ng nguyªn .Theo y häc cæ truyÒn, rÔ vµ vá lùu cã vÞ ®¾ng, ch¸t , tÝnh «n, cã ®éc, cã t¸c dông s¸t trïng trõ s¸n, s¸p trêng chØ ®íi. Vá qu¶ lùu cã vÞ chua ch¸t, tÝnh «n, cã ®éc cã t¸c dông s¸p trêng, chØ huyÕt, khö trïng. Hoa lùu cã vÞ chua , ch¸t tÝnh b×nh, cã t¸c dông chØ huyÕt.
NhiÒu nghiªn cøu cña y häc hiÖn ®¹i ®· ph¸t hiÖn những t¸c dụng cña lùu nh chèng oxy ho¸, ®Æc biÖt níc qu¶ lùu cã ho¹t tÝnh chèng ung th, cã thÓ ng¨n chÆn sù ph¸t triÓn cña cña khèi u, cã hiÖu qu¶ trong viÖc lo¹i bá mét sè lo¹i ung th nh ung th da, ung th vó vµ ruét kÕt. ë Anh, mét sè nhµ khoa häc ®· nghiªn cøu kh¶ n¨ng ph¸t triÓn thuèc diÖt virus tõ lùu nh lµ t¸c nh©n b¶o vÖ kh¸ng virus chèng l¹i HIV. Lùu cßn cã t¸c dông lµm gi¶m c¸c triÖu chøng xuÊt hiÖn ë thêi kú m·n kinh.
Mét trong nh÷ng ph¸t hiÖn míi nhÊt hiÖn nay lµ t¸c dông ch÷a bÖnh ®¸i th¸o ®êng và bệnh béo phì cña hoa lùu, nh÷ng c¨n bÖnh nhiÒu ngêi m¾c ph¶i.
ë ViÖt Nam, lùu lµ c©y ¨n qu¶ quen thuéc trong nh©n d©n. C©y ®îc trång nhiÒu ë c¸c tØnh phÝa nam vµ mét sè tØnh ë ®ång b»ng trung du B¾c bé. Để viÖc trång trät ®Ó lÊy nguyªn liÖu lµm thuèc cha ®îc quan t©m mét c¸ch thÝch ®¸ng. H¹t lùu dÔ dµng n¶y mÇm khi gieo xuèng ®Êt. Tuy nhiªn, ®Ó tr¸nh t×nh tr¹ng ph©n ly do trång b»ng h¹t, ngêi ta thêng sö dông biÖn ph¸p nh©n gièng v« tÝnh b»ng cµnh ®Ó trång. H¬n n÷a, ®èi víi c©y thuèc, sù kh«ng ®ång nhÊt vÒ di truyÒn dÉn ®Õn hËu qu¶ lµ nguyªn liÖu kh«ng æn ®Þnh vÒ mÆt chÊt lîng qua c¸c thÕ hÖ, g©y khã kh¨n cho viÖc ®a nguyªn liÖu vµo d©y chuyÒn s¶n xuÊt c«ng nghiÖp v× hµm lîng ho¹t chÊt cña nguyªn liÖu thay ®æi thÊt thêng. V× vËy, nh©n gièng v« tÝnh cã ý nghÜa to lín. Chóng duy tr× ®îc nh÷ng tÝnh tr¹ng quÝ hiÕm qua c¸c thÕ hÖ, ®¸p øng kh¶ n¨ng s¶n xuÊt nguyªn liÖu cã tiªu chuÈn æn ®Þnh cho c«ng nghiÖp. Trªn c¬ së nµy, chóng t«i ®· tiÕn hµnh ®Ò tµi ‘‘nghiªn cøu x©y dùng qui tr×nh nh©n gÝ«ng v« tÝnh c©y lùu (Punica granatum. L)’’
1.2. Môc ®Ých vµ yªu cÇu cña ®Ò tµi
1.2.1. Môc ®Ých
- X©y dùng qui tr×nh nh©n gièng v« tÝnh c©y lùu.
- §¸nh gi¸ ¶nh hëng cña chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng ®èi víi hÖ sè nh©n c©y in vitro vµ in vivo.
1.2.2. Yªu cÇu cña ®Ò tµi
- Qui tr×nh ph¶i ®¶m b¶o cã hÖ sè nh©n cao, c©y gièng cã chÊt lîng æn ®Þnh, ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn.
1.3. ý nghÜa khoa häc vµ thùc tiÔn cña ®Ò tµi
ý nghÜa khoa häc
Ph¸t hiÖn ®îc quy luËt t¸c dông cña c¸c yÕu tè m«i trêng dinh dìng ®èi víi qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i cña c©y, nh©n nhanh vµ t¹o nguån gièng cã chÊt lîng æn ®Þnh theo yªu cÇu s¶n xuÊt.
1.3.2. ý nghÜa thùc tiÔn
Cung cÊp qui tr×nh nh©n gièng v« tÝnh c©y lùu, phôc vô s¶n xuÊt gièng, n©ng cao hiÖu qu¶ kinh tÕ cña kh©u trång trät vµ gãp phÇn thóc ®Èy s¶n xuÊt lùu thµnh c©y trång cã tÝnh chÊt hµng hãa míi, gãp phÇn cho viÖc phßng chèng bÖnh tËt cña céng ®ång vµ xuÊt khÈu.
PhÇn II
Tæng quan tµi liÖu
2.1. Vµi nÐt vÒ c©y lùu
2.1.1. §Æc ®iÓm thùc vËt häc
Lùu thuéc hä Punicaceae. Chi Punica L. ®îc biÕt ®Õn tríc hÕt lµ loµi lùu cho qu¶ ¨n ®îc cã tªn khoa häc lµ Punica granatum L. Ngoµi ra, cßn 1 loµi kh¸c Ýt ®îc biÕt ®Õn lµ Punica protopunica Balf.f mäc hoang d¹i ë vïng Nam ¸, hay Trung A, d¶o Socotra. GÇn ®©y, ë ViÖt nam c©y P. granatum L. var. nana Person ®îc nhËp trång v× cã hoa ®Ñp, kh«ng kÕt qu¶, ®Ó lµm c¶nh. Cã tµi liÖu nãi r»ng loµi nµy cã qu¶ bÐ 2 in (5 cm).[2]
¶nh 1: C©y lùu(Punica granatum L)
Lùu lµ lo¹i c©y nhá hay nhì, cao tõ 2 - 4m, c©y hoang d¹i cã thÓ cao tíi 10m. Lùu lµ c©y sèng l©u n¨m. Th©n cã mµu x¸m, vá máng. Cµnh m¶nh ®«i khi cã gai. L¸ mäc ®èi, nhng thêng tô häp thµnh côm nhiÒu l¸, cuèng ng¾n, h×nh m¸c thu«n, dµi 5-6 cm, réng 1-2 cm, gèc thu«n, ®Çu tï hoÆc h¬i nhän, hai mÆt nh½n, mÆt trªn sÉm bãng; l¸ kÌm rÊt nhá, h×nh chØ. L¸ xanh quanh n¨m hoÆc rông hµng n¨m.
Hoa mäc ®¬n ®éc ë kÏ l¸, mµu ®á hoÆc vµng, lo¹i mµu tr¾ng lµ b¹ch lùu; ®µi 6 phiÕn dµy, mµu ®á nh¹t, hµn liÒn thµnh èng ng¾n ë phÇn díi; trµng 6 c¸nh máng, nh¨n nheo, nhÞ rÊt nhiÒu; bÇu cã hai tÇng, tÇng trªn 6-7 «, tÇng díi 3-4 «; no·n rÊt nhiÒu.
Qña mäng, to b»ng n¾m tay cã ®µi, tån t¹i ë ®Ønh, khi chÝn mµu vµng ®èm ®á n©u; h¹t mµu hång, cã vá ngoµi mäng níc thµnh mét líp c¬m trong ¨n ®îc. H¹t chiÕm kho¶ng 52% träng lîng cña qu¶.
2.1.2. Bé phËn sö dông
Vá qu¶, thêng lµ th¹ch lùu b×. Vá c©y, vá rÔ, thÞt qu¶ còng ®îc sö dông.
Vá th©n, vá rÔ thu h¸i quanh n¨m. §µo rÔ bãc lÊy vá, bá lâi, ph¬i hoÆc sÊy kh«. Qña h¸i vµo th¸ng 7, bãc lÊy vá qu¶, bá mµng trong, sÊy kh«. Khi dïng ®em vá kh« ®å cho mÒm, th¸i máng, sao qua. Cßn dïng c¶ hoa. B¶o qu¶n n¬i kh« r¸o, kh«ng dÓ l©u qu¸ hai n¨m.
2.1.3. Thµnh phÇn ho¸ häc
Vá rÔ vµ vá th©n lùu chøa alcaloid toµn phÇn víi hµm lîng tõ 5 ®Õn 7%. C¸c alcaloid chñ yÕu lµ pelletierin, iso pelletierin, methyl pelletierin, pseudopelletierin vµ methylisopelletierin.[2]
Tû lÖ alcaloid trung b×nh tÝnh b»ng d¹ng muèi sulfat trong 1 kg vá kh« lµ :
- pelletierin sulfat 0,7 – 1g
- iso pelletierin sulfat 1,3 – 1,5g
- pseudopelletierin 1,5 – 2g
- methylisopelletierin 0,04g
Tû lÖ alcaloid thay ®æi theo ®iÒu kiÖn thu h¸i vµ c¸ch b¶o qu¶n. Tû lÖ alcaloid trong rÔ bao giê còng cao h¬n trong th©n vµ cµnh. Ph©n tÝch vá lùu cña Nam t thÊy ngoµi c¸c alcaloid quen thuéc cßn 10 alcaloid kh¸c còng ®· ®îc ph¸t hiÖn nhê GMC-MS, trong ®ã, mét sè alcaloid cã nhãm thÕ ë vÞ trÝ 2 vµ 2,6 se®ridin, 2(2’ hydroxy propyl)’ piperidin, 2,2’(propenyl)piperidin vµ norpseudo pelletierin.
C¸c alcaloid hygrin vµ norhygrin chØ t×m thÊy trong vá rÔ.
RÔ lùu cßn chøa 2,5 – di – O – galloyl - 4,6 - O (S) hexahydroxydiphenol –D - glucuronic acid.
ChÊt diellagilacton cã t¸c dông gi¶m ®au, gi¶m sèt, chèng viªm ®· ®îc Kyota Yutaka, Watanabe Masuzumi chøng minh cÊu tróc.
Qña lùu chøa 52% ¨n ®îc. PhÇn nµy gåm 78% dÞch qu¶ vµ 22% h¹t. DÞch qu¶ t¬i chøa 85,4% níc, 10,6% ®êng, 1,4% pectin, 0,1g/100 ml acid citric, 0,7mg/100ml acid ascorbic, 19,6 mg/100 ml aminonitrogen tù do vµ 0,05 g/100ml tro.
Velioglu S; Unal C ®· x¸c ®Þnh dÞch qu¶ lùu vÒ mÆt ho¸ häc thÊy hµm lîng acid tõ 2 ®Õn 55g/l, tû lÑ glucose trªn fructose lu«n thÊp h¬n 1,0, hµm lîng Cl kh¸ cao (496mg/l) vµ nång ®é D.isocitric còng kh¸ cao tõ 4 ®Õn 186 mg/l.
DÞch chiÕt qu¶ lùu cã 4,95% monosaccharid 8,65% ®êng, 1,22% acid citric.
Gil Maria L., Garcia, Viguera cho r»ng cã sù thay ®æi mµu trong qu¸ tr×nh chÝn cña qu¶ lùu.
S¸u chÊt mµu anthocyanin ®· ®îc t×m thÊy trong sù h×nh thµnh mµu ®á cña dÞch qu¶ lµ delphinidin – 3 – glucosid, 3,5 diglucosid, cyanidin – 3 –glucosid 3 – 5 diglucosid, pelargonidin 3 glucosid vµ 3,5 diglucosid. Vá qu¶ chØ chøa cyanidin vµ pelargonidin. Thêi kú ®Çu, 3,5 diglucosid lµ chÊt mµu chñ yÕu, c¸c dÉn chÊt cña delphinidin lµ chÊt næi tréi nhÊt ë giai ®o¹n nµy ®Õn giai ®o¹n sau cña qu¸ tr×nh qu¶ chÝn. Tû lÖ c¸c monoglucosid t¨ng dÇn ®Õn b»ng hoÆc nhiÒu h¬n diglucosid vµ hîp chÊt cyanidin base lµ ch¸t næi tréi h¬n c¶.
Vá qu¶ lùu lµ nguån cung cÊp tanin víi hµm lîng thay ®æi tõ 20 ®Õn 30%. Hµm lîng tannin trong vá t¬i lµ 5,2% vµ 20,3% ë vá kh« ë nhiÖt ®é 50ºC. ViÖc xö lý vá qu¶ víi c¸c muèi sulfite kh¸c nhau trong qu¸ tr×nh lµm kh« ®Òu ¶nh hëng tíi hµm lîng tannin.
L. Satomi Hayato; Umemura Keijro ph¸t hiÖn trong vá lùu chÊt ellagitanin cã t¸c dông øc chÕ carbonic anhydrase lµ punicalin, punicagalin, granatin B, gallay dilacton, casuarinin, pedunculagin, tellimagradin. Bèn chÊt kh¸c cã t¸c dông yÕu h¬n lµ acid gallic, granatin B, corilagin vµ acid ellagic
H¹t lùu chøa 35% níc, 6,9% chÊt bÐo, 9,4% hîp chÊt chøa nit¬, 12,6% tinh bét, 23,4% sîi, 1,5% tro.
C¸c acid bÐo trong lipid h¹t lùu chiÕm 83,6% gåm 11 thø trong ®ã acid caprilic nhiÒu h¬n c¶, chiÕm 36,3%, tiÕp theo lµ acid stearic 22,5%. Acid oleic 5,1% vµ acid linoleic 10,3%.
H¹t lùu cßn chøa 6% pectin, 4,7% ®êng. Yusuph. Mahiinur; Mann John ®· t×m th¸y trong h¹t lùu mét triglycerid lµ di- O – punicyl – O – octadeca – 8 – Z – 11 – Z 13E trienyl glycerol. Almed ®· x¸c dÞnh sù cã mÆt cña oestrogen glusid vµ Moneam N.M.A el Sharaky x¸c ®Þnh hµm lîng estron trong h¹t lµ 0,8% vµ lo¹i estrogen phi steroid coumestrol lµ 0,036%.
L¸ lùu chøa nhiÒu hîp chÊt phenolic nh N – (2’,5’ ®ihdroxy phenyl) pyridinium chlorid, c¸c flovin glusid nh apigenin – 4 – O – b glucopyranosid, luteolin 4’- O- b glucopyranosid, luteolin 3’- O- b glucopyranosid, luteolin 3’- O- b xyloppyranosid.
C¸c t¸c gi¶ cßn x¸c ®Þnh sù cã mÆt cña c¸c phenol kh¸c trong l¸ nh brevifolin, acid carboxylic,corilagin3,6(R) hexahydroxy diphenol – (a,b) – 1C4 – glucopiranose; 1,3,6 tri – O – galloy - b- 4Cl – glucopiranose, acid ellagic; 3,4,8,9,10 penta, hy®roxyibenzo(b,d) pyran 6 on, granatin B vµ punicafolin.
HÇu hÕt c¸c bé phËn cña c©y lùu ®Òu chøa tanin. Castonguay, Adre; Gali Hala chøng minh c¸c ho¹t chÊt chèng u trong lùu gåm ellagitanin,punicalagin (d¹ng a vµ b) cïng víi c¸c ellargic, authocyanin vµ procyanin.
Ngoµi nh÷ng chÊt quan träng nh c¸c alcaloid, tanin, polyphenol, ngêi ta cßn t×m thÊy trong lùu c¸c acid h÷u c¬ nh acid maslinic, asiatic, pipecolinic, betulinic, ursolic. ChÊt flanoid pelagorin gåm mét ph©n tö pelargonidin vµ 2 ph©n tö glucose ë vÞ trÝ 3 vµ 5.
2.1.4. T¸c dông dîc lý
Tõ xa, ë Trung quèc vµ Ch©u ¢u, ngßi ta ®· biÕt dïng vá rÔ lùu ®Ó trÞ bÖnh giun s¸n ®êng ruét. N¨m 1807, Buchanan ®· c«ng bè vá th©n vµ vá rÔ cã t¸c dông tÈy giun s¸n trªn l©m sµng. N¨m 1884, Schroeder thÊy r»ng vá lùu vµ ho¹t chÊt pelletierin cã t¸c dông diÖt s¸n rÊt m¹nh. HiÖn nay ngêi ta ®· chøng minh thµnh phÇn chÝnh cã t¸c dông diÖt s¸n lµ isopelletierin vµ pelletierin, nhng do ®é ®éc qu¸ lín nªn chóng Ýt ®îc sö dông trong ®iÒu trÞ. §Ó gi¶m bít ®é ®éc h¹i vµ t¨ng cêng hiÖu lùc diÖt s¸n, ngêi ta thêng sö dông d¹ng tannat pelletierin v× d¹ng nµy kh«ng hoµ tan trong dÞch ruét nªn kh«ng bÞ hÊp thu nhanh chãng vµo m¸u, ®ång thêi t¨ng nång ®é tiÕp xóc víi s¸n. Trong vá rÔ vµ vá th©n c©y lùu, pelletierin thêng kÕt hîp tù nhiªn víi tanin díi d¹ng tannat nªn ngêi ta thêng dïng vá rÔ vµ vá th©n ®Ó ch÷a s¸n.
DÞch chiÕt b»ng níc cña vá rÔ lùu cho thá uèng cã t¸c dông thóc ®Èy qu¸ tr×nh ®«ng m¸u.
Níc s¾c vá qu¶ lùu cã t¸c dông øc chÕ c¸c khuÈn: Bacillus dysenteriae, B.typhy, Streptococcus aureus, B.pyocyaneus, E.coli. DÞch tõ vá qu¶ lùu thÝ nghiªm trªn èng kÝnh víi nång ®é 10g/l cã t¸c dông chèng nÊm Piricularia oryzae Cav vµ nÊm Colletotrichum falcatum Went lµ nh÷ng t¸c nh©n g©y bÖnh cho c©y lóa vµ c©y mÝa. Níc s¾c vá qu¶ lùu cho thá uèng qua ®êng d¹ dµy, ngµy 2 lÇn cã t¸c dông cÇm tiªu ch¶y. Bét vá qu¶ lùu cho chuét cèng tr¾ng vµ chuét lang uèng qua ®êng d¹ dµy, cã t¸c dông gi¶m tû lÖ sinh ®Î c¶ chuét. Cã b¸o c¸o cho r»ng alcaloid toµn phÇn cña vá qu¶ cã t¸c dông kÝch thÝch tö cung.
NhiÒu nghiªn cøu cho thÊy lùu cã chøa rÊt nhiÒu chÊt chèng «xy ho¸, cã t¸c dông ng¨n ngõa sù t¾c nghÏn ®éng m¹ch, c¾t gi¶m c¬n ®au tim, ¸p huyÕt cao. Níc chiÕt qu¶ lùu cßn cã ho¹t tÝnh chèng ung th, cã gi¸ trÞ trong viÖc ng¨n chÆn sù ph¸t triÓn cña cña khèi u, hiÖu qu¶ trong viÖc lo¹i bá mét sè lo¹i ung th nh ung th da, ung th vó vµ ruét kÕt.[25]. ë Anh, c¸c nhµ khoa häc ®· nghiªn cøu kh¶ n¨ng ph¸t triÓn thuèc diÖt virus tõ lùu nh lµ t¸c nh©n b¶o vÖ kh¸ng virus chèng l¹i HIV.
NhiÒu nhµ khoa häc NhËt b¶n ngµy nay ®· ph¸t hiÖn tiÒm n¨ng cña níc lùu lªn men vµ níc chiÕt vá qu¶ cã thÓ trî gióp tÕ bµo b¹ch cÇu trë vÒ tr¹ng th¸i b×nh thêng vµ cã thÓ ®a ra liÖu ph¸p hç trî quan träng kh«ng g©y ®éc cho tÕ bµo b¹ch cÇu.
2.2.5. T×nh h×nh s¶n xuÊt lùu
Lùu cã nguån gèc tõ Iran tíi d·y Himalaya ë B¾c Ên ®é, ®îc ®a vµo trång trät tõ thêi cæ ®¹i ë vïng §Þa Trung H¶i, Ch©u ¸, Ch©u Phi vµ Ch©u ¢u. Tõ Iran ®îc ®a vµo nam vµ trung t©m Ên §é vµo kho¶ng thÕ kû ®Çu tiªn sau c«ng nguyªn vµ trång ë Indonexia vµo n¨m 1416. Sau ®ã chóng ®îc trång réng r·i ë Ên §é vµ c¸c vïng kh« cña §«ng Nam ¸, Malayxia, T©y Ên §é vµ rõng nhiÖt ®íi Ch©u Phi. Lùu lµ c©y trång truyÒn thèng cña c¸c níc thuéc vïng ven biÓn §Þa Trung H¶i. Nh÷ng vïng trång quan träng lµ Ai CËp, Trung Quèc, Afghanistan, Pakistan, Bangladesh, Iran, Iraq, Ên §é, Burma vµ ¶ RËp Xªut. ë Mü, Clifornia hµng n¨m s¶n xuÊt kho¶ng 17.000 mega tÊn lùu, trªn diÖn tÝch gÇn 12000ha.
ë ViÖt nam, lùu còng lµ c©y ¨n qu¶ quen thuéc trong nh©n d©n. C©y ®îc trång nhiÒu ë c¸c tØnh phÝa nam vµ mét sè tØnh ë ®ång b»ng trung du B¾c bé. C©y cã biªn ®é sinh th¸i réng, vÒ mïa ®«ng cã thÓ chÞu ®îc nhiÖt ®é -15 oC (Vïng Trung ¸ vµ Trung quèc) vµ ë nhiÖt ®é cao ®Õn 40 oC vµo mïa hÌ. Tuy nhiªn, nh×n chung c©y thÝch nghi nhÊt ë khÝ hËu nãng ë vïng nhiÖt ®íi víi nhiÖt ®é trung b×nh nhÊt lµ 24-26 oC . Vïng trång thÝch hîp nhÊt ®èi víi lùu lµ ®Êt liÒn cã mïa hÌ nãng vµ kh«, ë ®ã qu¶ sÏ cã mµu s¾c vµ h¬ng vÞ ngon nhÊt. Vïng duyªn h¶i vµ mïa hÌ «n hoµ lµ nh÷ng vïng h¹n chÕ ®èi víi môc ®Ých th¬ng m¹i, vµ trong nh÷ng ®iÒu kiÖn nh vËy c©y thêng ®îc trång víi môc ®Ých lµm c¶nh.
2.2. C¬ së khoa häc cña ®Ò tµi
Nh©n gièng c©y trång lµ qu¸ tr×nh t¹o ra vµ ph¸t triÓn cña c¸c c¸ thÓ míi. C¸c c¸ thÓ nµy ®îc dïng ®Ó thiÕt lËp nªn vô mïa míi.
Cã 2 ph¬ng ph¸p nh©n gièng chÝnh: Ph¬ng ph¸p h÷u tÝnh – dïng h¹t vµ ph¬ng ph¸p v« tÝnh (asexual ) hay cßn gäi lµ ph¬ng ph¸p dinh dìng (vegetative) – dùa vµo kh¶ n¨ng kh¶ n¨ng t¸i sinh cña mét bé phËn nµo ®ã cña c©y nh l¸, th©n, rÔ, m« hoÆc tÕ bµo. (Hartman and Kester, 1975).[24]
2.2.1. Nh©n gièng h÷u tÝnh ( b»ng h¹t)
Ph¬ng ph¸p nh©n gièng nµy cho hÖ sè nh©n gièng cao, dÔ b¶o qu¶n vµ vËn chuyÓn. Tuy nhiªn, mét sè c©y trång, nÕu nh©n gièng b»ng h¹t cã thÓ cho nh÷ng c¸ thÓ con kh«ng hoµn toµn gièng bè mÑ chóng c¶ vÒ h×nh th¸i lÉn thµnh phÇn ho¸ häc (Carson, 1964). §Æc biÖt, ®èi víi c©y thuèc, sù kh«ng ®ång nhÊt vÒ di truyÒn dÉn ®Õn hËu qu¶ lµ nguyªn liÖu kh«ng æn ®Þnh vÒ mÆt chÊt lîng qua c¸c thÕ hÖ, g©y khã kh¨n cho viÖc ®a nguyªn liÖu vµo d©y chuyÒn s¶n xuÊt c«ng nghiÖp v× hµm lîng ho¹t chÊt cña nguyªn liÖu thay ®æi thÊt thêng.
2.2.2. Nh©n gièng v« tÝnh
Ph¬ng ph¸p nµy sö dông kh¶ n¨ng t¸i sinh cña c¸c c¬ quan dinh dìng kh¸c nhau nh th©n, rÔ, l¸, m« hay tÕ bµo.
Nh©n gièng v« tÝnh bao gåm nh©n gièng v« tÝnh truúªn thèng (chiÕt, ghÐp, gi©m) vµ nh©n gièng v« tÝnh in vitro.
Nh©n gièng v« tÝnh t¹o ra c©y con ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn do duy tr× ®îc c¸c tÝnh tr¹ng cña c©y mÑ (Petrop, 1989). Ph¬ng ph¸p nh©n gièng cã tÇm quan träng sèng cßn ®èi víi c©y dîc liÖu. VÝ dô : C¸c loµi Dioscorea, nguån nguyªn liÖu sè mét cña c«ng nghiÖp steroid (Ph¹m Kim M·n, 1992), trång b»ng cñ bao giê còng cho hµm lîng diosgenin æn ®Þnh h¬n trång b»ng h¹t (Bammin, Randhava, 1975; Gupta et al, 1979).[19]. §Ó duy tr× hµm lîng diosgenin cao cña c¸c dßng ®· ®îc chän läc, ngêi ta qui ®Þnh chØ dïng ph¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh (Asolka, Chadha, 1979).[18]
Sù ph©n ly vÒ h×nh th¸i còng nh thµnh phÇn ho¸ häc khi nh©n gièng b»ng h¹t thêng dÉn ®Õn sù tho¸i ho¸ gièng ®· ®îc nhiÒu t¸c gi¶ ®Ò cËp ®Õn trong nghiªn cøu nhiÒu c©y kh¸c nh híng d¬ng (Stotsnova, 1973), thiªn tróc qu×, thanh cao hoa vµng (NguyÔn Gia ChÊn vµ cs, 1991)[3], long n·o (Ph¹m V¨n KhiÓn, 1992).[6]
Nh vËy gi¸ trÞ to lín nhÊt cña ph¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh lµ duy tr× ®îc nh÷ng tÝnh tr¹ng quÝ hiÕm qua c¸c thÕ hÖ vµ v× vËy t¹o ra kh¶ n¨ng s¶n xuÊt nguyªn liÖu cã tiªu chuÈn æn ®Þnh cho c«ng nghiÖp.
Nh©n gièng v« tÝnh cßn cã t¸c dông rót ng¾n thêi gian tõ khi trång tíi khi thu ho¹ch t¹o ®iÒu kiÖn t¨ng vô, t¨ng s¶n phÈm vµ dÉn ®Õn t¨ng hiÖu qu¶ kinh tÕ. §Ó thu ®îc n¨ng suÊt nh nhau, c¸c loµi Dioscorea nÕu trång b»ng h¹t sÏ ph¶i kÐo dµi thêi gian sinh trëng Ýt nhÊt 6 th¸ng so víi trång b»ng cñ (Husain et al, 1979; Martin, Gaskins, 1969; Ph¹m V¨n HiÓn vµ ctv, 1988). §èi v¬Ý mÝa dß, Starin (1977) ®· kÕt luËn lµ trång b»ng h¹t kh«ng kinh tÕ. NhiÒu c©y thuèc kh¸c nÕu nh©n gièng b»ng h¹t còng sÏ ph¶i kÐo dµi thêi gian sinh trëng tõ 1 ®Õn nhiªï n¨m so v¬Ý nh©n gièng v« tÝnh nh b¹ch thîc, b¸n h¹, ®an s©m, kim ng©n...
Tuy nhiªn, nh©n gièng b»ng ph¬ng ph¸p v« tÝnh truyÒn thèng còng cã nhîc ®iÓm nhÊt ®Þnh, ®Æc biÖt lµ sù l©y nhiÔm bÖnh qua nguyªn liÖu gièng thêng phæ biÕn vµ phøc t¹p. Sù l©y nhiÔm vµ tÝch tô c¸c ký sinh trïng ®Æc hiÖu, nhÊt lµ virus, lµm gi¶m n¨ng suÊt vµ chÊt lîng c©y trång. ThiÖt h¹i do hiÖn tîng nµy g©y ra cã thÓ thÊy rÊt râ ë khoai t©y (Vò TriÖu M©n vµ cs, 1986; Van de Zaag, 1983)[10], b¹c hµ (Muschiatxe, 1985), lóa m×, ®¹i m¹ch vµ nhiÒu c©y kh¸c.
HÖ sè nh©n gièng cña ph¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh th«ng thêng rÊt thÊp. ThÝ dô cña Dioscorea floribunda khi nh©n b»ng cñ lµ 8 – 10c©y/ n¨m (Bammi, Radha, 1975), cña cam th¶o lµ 5 – 7 (Shah, Dalal, 1980)[35]. HÖ sè nh©n gièng cña b¹c hµ piperota khi nh©n gièng b»ng th©n ngÇm trung b×nh lµ 2 – 3 (Foldesi, Havas, 1979), cña b¹c hµ arvensis lµ 6 – 7 (ViÖn dîc liÖu, 1976)[7]. Thªm vµo ®ã, nguyªn liÖu cñ gièng lµ m« t¬i, cã khèi lîng lín, viÖc vËn chuyÓn vµ b¶o qu¶n thêng gÆp nhiÒu khã kh¨n. ViÖc sö dông chÝnh c¸c bé phËn lµm thuèc ®Ó lµm nguyªn liÖu gièng g©y nhiÒu l·ng phÝ, tèn kÐm.
C¸c ph¬ng ph¸p nh©n gièng truyÒn thèng gåm cã:
ChiÕt: lµ ph¬ng ph¸p t¹o ra c¸ thÓ míi, thêng lµ trªn th©n c©y, tríc khi t¸ch khái c©y mÑ. ¦u ®iÓm cña ph¬ng ph¸p nµy lµ cµnh chiÕt ®îc c¸ thÓ mÑ cung cÊp níc vµ dinh dìng, ®Æc biÖt lµ cacbohydrat, protein, phytohormon tríc khi cã thÓ tù nu«i sèng m×nh.
D©m: lµ sù t¹o ra c©y con tõ mét l¸t c¾t th©n, l¸, rÔ, hoÆc tõ 1 l¸, cñ, rÔ nguyªn, sau khi ®· t¸ch ra khái c©y mÑ. ph¬ng ph¸p d©m thêng cã hÖ sè nh©n cao h¬n ph¬ng ph¸p chiÕt vµ ghÐp, nhng cÇn ®¶m b¶o (nh©n t¹o) c¸c ®iÒu kiÖn néi t¹i vµ ngo¹i c¶nh thÝch hîp cho qu¸ tr×nh ra rÔ vµ t¸i sinh mÇm.
GhÐp: lµ sù liªn kÕt gi÷a hai bé phËn : cµnh ghÐp vµ gèc ghÐp cña hai c¸ thÓ kh¸c nhau (thêng ¸p dông ®èi víi c©y th©n gç). C©y ghÐp thêng cã u thÕ cña c¶ gèc ghÐp vµ cµnh ghÐp. H¹n chÕ cña ph¬ng ph¸p nµy lµ chØ thùc hiÖn ®îc trong ph¹m vi c¸c c©y th©n gç cã sinh trëng thø cÊp (c©y h¹t trÇn vµ c©y hai l¸ mÇm), c©y mét l¸ mÇm hÇu nh kh«ng ghÐp ®îc. ThËm chÝ c¸c c©y nµy ph¶i rÊt gÇn nhau vÒ mÆt ph©n lo¹i th× tû lÖ thµnh c«ng míi cao. Ngoµi ra viÖc lùa chän ®îc gèc ghÐp phï hîp kh«ng ph¶i lµ dÔ vµ thêi gian tån t¹i c©y gièng trong vßn ¬m l©u.
Ph¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro ®· bæ sung cho c¸c kü thuËt nh©n gièng truyÒn thèng nhiÒu kü thuËt tiÕn bé, kh¾c phôc ®îc nh÷ng h¹n chÕ cña c¸c ph¬ng ph¸p nh©n gièng nãi trªn .
2.2.3. Nh©n gièng v« tÝnh in vitro
Lµ ph¬ng ph¸p nu«i cÊy m« , tÕ bµo trªn m«i trêng dinh dâng nh©n t¹o trong ®iÒu kiÖn v« trïng vµ t¸i sinh chóng thµnh c©y con.
C¬ së lý luËn cña nu«i cÊy in vitro
C¬ së lý luËn cña ph¬ng ph¸p nu«i cÊy m«, tÕ bµo in vitro lµ häc thuyÕt vÒ tÝnh toµn n¨ng (totipotence) cña tÕ bµo. Theo Haberland.G (1902), nhµ thùc vËt häc ngêi §øc, tÊt c¶ c¸c tÕ bµo cña c©y ®Òu mang toµn bé lîng th«ng tin di truyÒn cña c¬ thÓ, khi gÆp ®iÒu kiÖn thÝch hîp, mçi tÕ bµo ®ã ®Òu cã kh¶ n¨ng t¸i sinh vµ ph¸t triÓn thµnh c¸ thÓ hoµn chØnh. Thùc tÕ ®· chøng minh ®îc kh¶ n¨ng t¸i sinh mét c¬ thÓ thùc vËt hoµn chØnh tõ mét tÕ bµo riªng rÏ. Hµng tr¨m loµi c©y trång ®· ®îc nh©n gièng trªn qui m« th¬ng m¹i b»ng c¸ch nu«i cÊy trong m«i trêng nh©n t¹o v« trïng vµ t¸i sinh chóng thµnh c©y víi hÖ sè nh©n gièng v« cïng lín (Murashige, 1930)[30]. Morel (1966)[28] lµ ngêi ®Çu tiªn ®· thµnh c«ng trong viÖc t¸i sinh vµ nh©n nhanh gièng lan quÝ Cymbidium b»ng ph¬ng ph¸p nµy. Trong mét thêi gian ng¾n ngêi ta cã thÓ thu ®îc hµng triÖu c¸ thÓ, nhê vËy mµ hoa Cymbidium vèn ®¾t tiÒn ®· cã gi¸ thµnh h¹ h¬n vµ ®¸p øng ®îc nhu cÇu tiªu dïng cña nhiÒu ngêi. ë Th¸i Lan 90% lan th¬ng m¹i ®îc nh©n b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro. Thµnh c«ng ®èi víi hä Orchidaceae kh«ng nh÷ng chØ lµ b»ng chøng mµ cßn më ®êng cho viÖc øng dông kü thuËt nµy ®èi víi c¸c loµi c©y kh¸c nh c©y ¨n qu¶, c©y l¬ng thùc, c©y l©m nghiÖp, c©y thuèc, c©y c¶nh.... Cóc ë NhËt B¶n, Trung Quèc, Mü, ®Æc biÖt ë Hµ Lan sö dông ph¬ng ph¸p nµy cho hÖ sè nh©n gièng cao tõ 410-1010/n¨m (NguyÔn Xu©n Linh, 1988). C¸c lÜnh vùc øng dông kh¸c cña ph¬ng ph¸p nµy còng mang l¹i nhiÒu kÕt qu¶ trong viÖc c¶i t¹o vµ phôc tr¸ng gièng c©y trång.
Qóa tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i trong nu«i cÊy in vitro thùc vËt thùc chÊt lµ kÕt qu¶ cña c¸c qóa tr×nh ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n ho¸. TÊt c¶ c¸c tÕ bµo trong c¸c c¬ quan kh¸c nhau cña c¬ thÓ thùc vËt trëng thµnh ®Òu b¾t nguån tõ tÕ bµo ph«i sinh. Sù chuyÓn tÕ bµo ph«i sinh thµnh c¸c tÕ bµo chuyªn ho¸ ®Ó ®¶m nhiÖm c¸c chøc n¨ng kh¸c nhau ®îc gäi lµ sù ph©n ho¸ tÕ bµo . Cßn qu¸ tr×nh ph¶n ph©n ho¸ th× ngîc l¹i víi qóa tr×nh ph©n ho¸, cã nghÜa lµ tÕ bµo ®· ph©n ho¸ thµnh m« chøc n¨ng kh«ng hoµn toµn mÊt ®i kh¶ n¨ng ph©n chia mµ ë ®iÒu kiÖn thÝch hîp, chóng cã thÓ trë vÒ d¹ng ph«i sinh vµ t¸i ph©n chia.
C¸c qóa tr×nh trªn cã thÓ tãm t¾t nh sau:
Ph©n ho¸ tÕ bµo
TÕ bµo d·n
TÕ bµo ph«i sinh
TÕ bµo chuyªn ho¸
Ph¶n ph©n ho¸
tÕ bµo
VÝ dô : khi nu«i cÊy m¶nh l¸ hay ®èt th©n c©y thuèc l¸, ë ®iÒu kiÖn m«i trêng thÝch hîp c¸c tÕ bµo ®· ph©n ho¸ cña l¸, ®èt th©n sÏ ph¶n ph©n ho¸, ph©n chia trë l¹i thµnh m« sÑo kh«ng cßn lµ tÕ bµo cã chøc n¨ng nh tÕ bµo l¸, ®èt th©n n÷a. NÕu chuyÓn sang m«i trêng kh¸c th× tuú theo thµnh phÇn m«i trêng mµ c¸c tÕ bµo m« sÑo cã thÓ ph©n ho¸ theo c¸c híng kh¸c nhau (h×nh thµnh rÔ, chåi hay t¹o c©y hoµn chØnh...)
¦u, nhîc ®iÓm cña ph¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro
Ph¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro cã kh¶ n¨ng kh¾c phôc ®îc nhiÒu trë ng¹i mµ nh÷ng ph¬ng ph¸p nh©n gièng kh¸c thêng gÆp. Cô thÓ lµ:
T¹o c©y con ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn, b¶o tån ®îc c¸c tÝnh tr¹ng ®· chän läc.
T¹o ®îc dßng thuÇn cña c¸c c©y t¹p giao. §iÒu nµy cã ý nghÜa rÊt lín víi c©y thuèc nãi chung, ®Æc biÖt ®èi víi c¸c c©y trång ®Ó chiÕt lÊy ho¹t chÊt.
T¹o ®îc c©y cã genotip míi( ®a béi, ®¬n béi).
B¶o qu¶n vµ lu gi÷ tËp ®oµn gen.
Phôc tr¸ng gièng th«ng qua kü thuËt cÊy ®Ønh sinh trëng vµ c¶i t¹o gièng b»ng kü thuËt gen.
Cã kh¶ n¨ng s¶n xuÊt quanh n¨m.
Cã thÓ nh©n nhanh nhiÒu c©y kh«ng kÕt h¹t trong nh÷ng ®iÒu kiÖn sinh th¸i nhÊt ®Þnh hoÆc h¹t nÈy mÇm kÐm.
HÖ sè nh©n gièng cùc kú cao (thêng ®¹t ®îc ë c¸c loµi c©y kh¸c nhau trong ph¹m vi tõ 36 – 1012/ n¨m), rót ng¾n thêi gian ®a mét gièng míi vµo s¶n xuÊt ®¹i trµ.
NÕu xÐt vÒ ph¬ng diÖn hÖ sè nh©n th× nh©n gièng in vitro lµ ph¬ng ph¸p kh«ng g× cã thÓ s¸nh kÞp, kÓ c¶ ph¬ng ph¸p nh©n gièng b»ng h¹t. ChØ tÝnh riªng lÜnh vùc true - to – type, nu«i cÊy in vitro cã thÓ coi lµ mét cuéc ®¹i c¸ch m¹ng vÒ hÖ sè nh©n. ThÝ dô: sö dông chåi n¸ch ®Ó nh©n cã thÓ t¹o ra hµng chôc v¹n c©y D.floribunda trong vßng mét n¨m (Chaturvedi, Sinha, 1979; Ph¹m V¨n HiÓn vµ cs, 1988)[5] hay 26 v¹n c©y cam th¶o trong 5 th¸ng (Shah, Dalal, 1980)[35] tõ mét l¸t c¾t ban ®Çu mµ th«ng thêng 1 c©y D.floribunda chØ t¹o ra 8 – 10 c©y trong mét n¨m, vµ cam th¶o chØ cho 5 – 7 c©y nÕu nh©n gièng b»ng cµnh. Tõ mét cñ gièng khoai t©y trong thêi gian 8 th¸ng, ngêi ta thu ®îc 2000 cñ ®ång nhÊt di truyÒn, trång ®îc trªn mét vïng 40ha, cã nghÜa lµ tèc ®é nh©n gièng >100 000 so víi sinh s¶n h÷u tÝnh (Senez, 1987). ë ViÖt nam, Mai ThÞ T©n vµ céng sù ®· ®¹t ®îc hÖ sã nh©n 532 trong vßng 1 n¨m ®èi víi khoai t©y b»ng ph¬ng ph¸p nµy[12]. §Æc biÖt, c©y cä dÇu thêng ph¶i mÊt 10 – 15 n¨m míi cho thu ho¹ch, viÖc chän, t¹o vµ nh©n nhanh ®îc mét gièng míi rÊt khã kh¨n. B»ng ph¬ng ph¸p nh©n nhanh in vitro, ngêi ta cã thÓ cung cÊp ®îc 500 000 c©y con gièng hÖt nhau trong vßng mét n¨m (Starisky, 1970)[36]. Whitehead vµ Giles (1977) dù tÝnh hµng n¨m cã hÓ thu ®îc 106 c©y gièng khi nu«i cÊy chåi cña Popolus nigra, P.yannanensis vµ con lai cña Popolus.
Nhîc ®iÓm chÝnh cña ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro lµ ®ßi hái trang thiÕt bÞ ®¾t tiÒn vµ kü thuËt cao nªn chØ cã hiÖu qu¶ ®èi víi nh÷ng c©y cã gi¸ trÞ cao hoÆc khã nh©n giång b»ng c¸c ph¬ng ph¸p kh¸c (Nickell, 1973)[33]. Ngoµi ra, ph¬ng ph¸p nµy cßn cã nh÷ng bÊt lîi sau:
MÆc dï sè lîng c©y gièng thu ®îc cã thÓ rÊt cao, nhng c©y con cã kÝch thíc nhá, ®ßi hái ph¶i cã chÕ ®é ch¨m sãc ®Æc biÖt ë giai ®o¹n sau èng nghiÖm.
C©y cã thÓ cã nh÷ng ®Æc tÝnh kh«ng mong muèn.
Kh¶ n¨ng t¹o ®ét biÕn cã thÓ t¨ng.
Kh¶ n¨ng t¸i sinh cã thÓ bÞ mÊt ®i do cÊy truyÒn callus hay huyÒn phï tÕ bµo nhiÒu lÇn.
C©y gièng cã thÓ bÞ nhiÔm bÖnh ®ång lo¹t.
Tuy vËy ph¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro ngµy cµng ®îc sö dông réng r·i ®Ó phôc vô nh÷ng môc ®Ých sau:
Duy tr× vµ nh©n nhanh c¸c kiÓu gen quÝ hiÕm lµm vËt liÖu cho c«ng t¸c chän gièng.
Nh©n nhanh vµ duy tr× c¸c c¸ thÓ ®Çu dßng tèt ®Ó cung cÊp h¹t gièng c¸c lo¹i c©y trång kh¸c nhau nh c©y l¬ng thùc cã cñ, c©y rau, c©y hoa, c©y c¶nh vµ c©y dîc liÖu thuéc nhãm c©y th©n th¶o.
Nh©n nhanh vµ kinh tÕ c¸c kiÓu gen quÝ cña gièng c©y l©m nghiÖp vµ gèc ghÐp trong nghÒ trång c©y ¨n qu¶, c©y c¶nh thuéc nhãm c©y thÉn gç,
Nh©n nhanh ë ®iÒu kiÖn v« trïng vµ c¸ch ly t¸i nhiÔm kÕt hîp víi lµm s¹ch virus.
B¶o qu¶n vµ lu gi÷ c¸c tËp ®oµn gièng nh©n gièng v« tÝnh vµ c¸c loµi giao phÊn trong ng©n hµng gen.
Kü thuËt nu«i cÊy in vitro
Cã thÓ chia thµnh c¸c bíc sau:
Lùa chän ®èi tîng (c©y trång, gièng, bé phËn c©y) thÝch hîp.
Nguyªn liÖu sö dông cho nu«i cÊy m«, tÕ bµo thùc vËt cã thÓ lµ bÊt cø bé phËn nµo cña c©y: c¸c ®o¹n cña rÔ, th©n, c¸c phÇn cña l¸ (cuèng l¸, phiÕn l¸...), c¸c cÊu tróc cña ph«i nh l¸ mÇm, trô trªn, trô díi l¸ mÇm, h¹t phÊn, no·n.. thËm chÝ c¶ mÈu th©n ngÇm hay c¬ quan dù tr÷ díi mÆt ®Êt (cñ, c¨n hµnh..) còng ®îc dïng cho nu«i cÊy.
Khö trïng mÉu vµ tiÕn hµnh nu«i cÊy
Nguyªn liÖu ®Ó nu«i cÊy in vitro ®îc lùa chän tõ nh÷ng c¸ thÓ u tó cña loµi, khoÎ vµ s¹ch bÖnh virus, nhng Ýt hay nhiÒu ®Òu cã nhiÔm vi sinh vËt vµ nÊm tuú thuéc vµo sù tiÕp xóc cña chóng víi m«i trêng xung quanh. Cã mét sè bé phËn nh ph«i trong h¹t, m« trong qu¶, ®ßng lóa non ... Ýt bÞ nhiÔm vi sinh vËt h¬n c¸c bé phËn kh¸c cña c©y, ngîc l¹i c¸c bé phËn n»m díi mÆt ®Êt nh rÔ, cñ, th©n ngÇm, cã lîng vi khuÈn vµ nÊm rÊt cao. Ph¬ng ph¸p th«ng dông nhÊt hiÖn nay ®Ó lo¹i bá hÖ vi sinh vËt khái vËt liÖu cÊy lµ sö dông c¸c ho¸ chÊt cã ho¹t tÝnh diÖt khuÈn vµ nÊm.
T¸c nh©n khö trïng, ngoµi t¸c dông diÖt vi sinh vËt cßn ¶nh hëng ®Õn m« cÊy, v× vËy viÖc lùa chän lo¹i ho¸ chÊt ph¶i c¨n cø vµo møc ®é nhiÔm khuÈn vµ ®é mÉn c¶m cña tõng mÉu. Trong sè c¸c ho¸ chÊt hay ®îc sö dông ®Ó khö trïng th× canxi hypoclorit vµ natri hypoclorit lµ hay ®îc sö dông h¬n c¶ v× ®Æc tÝnh cña chóng: cã ®éc tÝnh thÊp ®èi víi m« ®îc xö lý, kh«ng g©y øc chÕ sinh trëng vµ hiÖu qu¶ diÖt khuÈn tèt. Nång ®é cña canxi hypoclorit vµ natri hypoclorit hay ®îc sö dông lµ 5 – 15% vµ 0,5 – 2% trong thêi gian tõ 15 – 30 phót.
X¸c ®Þnh ®iÒu kiÖn nu«i cÊy(m«i trêng dinh dìng, nhiÖt ®é, ¸nh s¸ng) ®Ó ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh ph¸t triÓn m« nu«i cÊy theo ®Þnh híng.
Thµnh c«ng cña ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro phô thuéc rÊt nhiÒu vµo ®iÒu kiÖn nu«i cÊy. Nhu cÇu dinh dìng cho sù sinh trëng vµ ph¸t triÓn tèi u cña c¸c loµi lµ kh«ng gièng nhau, ngay c¶ gi÷a c¸c bé phËn trong cïng mét c¬ thÓ còng Ýt nhiÒu cã sù kh¸c nhau (Murashige vµ Skoog, 1962). Sù lùa chän m«i trêng nu«i cÊy, bao gåm c¶ chÊt lîng vµ sè lîng ho¸ chÊt sö dông ®ãng vai trß quyÕt ®Þnh ®èi víi b¶n th©n sù ph©n ho¸ vµ chiÒu híng ph©n ho¸ cña tÕ bµo.
Cho ®Õn nay ®· cã nhiÒu lo¹i m«i trêng dinh dìng ®îc t×m ra: M«i trêng Murashige vµ Skoog (1962), m«i trêng Linsmainer vµ Skoog (1963), m«i trêng Gamborg (1968), m«i trêng Knop (1974)... §©y lµ nh÷ng m«i trêng c¬ b¶n vµ sÏ ®îc c¶i tiÕn thµnh nhiÒu lo¹i m«i trêng kh¸c nhau cho phï hîp víi mçi ®èi tîng nghiªn cøu vµ môc ®Ých thÝ nghiÖm. Trong sè ®ã m«i trêng MS (Murashige vµ Skoog, 1962) ®îc ®¸nh gi¸ lµ phï hîp nhÊt cho ®a sè c¸c loµi thùc vËt vµ chÝnh Murashige (1974) ®· dïng m«i trêng nµy ®Ó nu«i cÊy nhiÒu lo¹i c©y trång.
Thµnh phÇn chñ yÕu cña tÊt c¶ c¸c lo¹i m«i trêng gåm nh÷ng nhãm chÊt sau: muèi kho¸ng ®a lîng vµ vi lîng (muèi chloride, nitrat, sulphat, phosphat vµ iodid cña Ca, Mg, K, Na, Fe, Mn, Zn vµ B), vitamin, nguån cacbon, yÕu tè sinh trëng h÷u c¬ (axit amin, pepton), hormon sinh trëng.
§êng lµ mét thµnh phÇn kh«ng thÓ thiÕu trong bÊt cø m«i trêng nu«i cÊy nµo. Nã ®îc sö dông lµm nguån cacbon cung cÊp n¨ng lîng chñ yÕu trong m«i trêng nu«i cÊy nhiÒu loµi thùc vËt (Hu et al., 1979). M« vµ tÕ bµo thùc vËt nu«i cÊy in vitro sèng chñ yÕu theo ph¬ng thøc dÞ dìng, mÆc dï ë mét sè trêng hîp chóng cã thÓ sèng b¸n dÞ dìng nhê ¸nh s¸ng nh©n t¹o vµ lôc l¹p cã kh¶ n¨ng quang hîp. H¬n n÷a, ®êng cßn ®ãng vai trß thÈm thÊu chÝnh cña m«i trêng.
Vitamin cã vai trß xóc t¸c c¸c qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt diÔn ra trong tÕ bµo. HÇu hÕt c¸c m« nu«i cÊy ®Òu cã kh¶ n¨ng tæng hîp c¸c vitamin cÇn thiÕt nhng kh«ng ®Çy ®ñ vÒ sè lîng, v× vËy ®Ó ®¹t ®îc sù sinh trëng tèi u ngêi ta thêng bæ sung mét sè vitamin nh: thiamin(B1), axit nicotinic(PP), vitamin B5, piridoxin(B6). Trong ®ã B1 ®îc coi lµ thiÕt yÕu ®èi víi sù sinh trëng cña tÕ bµo thùc vËt (Weavaer R.J.,1972; Bhojwani vµ Razdan, 1983)[22]. Ngoµi ra cßn cã thÓ sö dông vitamin C vµ c¸c chÊt chèng oxy ho¸ kh¸c. Nång ®é sö dông vitamin thêng tõ 0,1 – 1mg/l.
§iÒu khiÓn t¸i sinh c©y hoµn chØnh tõ m« nu«i cÊy
C¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng thùc vËt (phytohormon) lµ thµnh phÇn quan träng bËc nhÊt trong m«i trêng nu«i cÊy. Dùa vµo nh÷ng chÊt nµy, c¸c nhµ nghiªn cøu cã thÓ chñ ®éng ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i cña thùc vËt in vitro. Cã hai nhãm chÊt ®îc sö dông réng r·i lµ auxin vµ cytokinin.
Nhãm auxin gåm mét sè hîp chÊt cã chøa nh©n idol trong ph©n tö. Trong nu«i cÊy in vitro, auxin thóc ®Èy sinh trëng cña mÉu do ho¹t ho¸ sù ph©n chia vµ gi·n në cña tÕ bµo, kÝch thÝch c¸c qu¸ tr×nh tæng hîp vµ trao ®æi chÊt, tham gia ®iÒu chØnh sù ph©n ho¸ cña rÔ, chåi...(Bhojwani and Razdan,1983)[32].
C¸c auxin ®Òu cã hiÖu qu¶ sinh lý ë nång ®é thÊp, thêng ®îc sö dông víi nång ®é tõ 10-1 – 10-6M tuú theo tõng chÊt, môc dÝch vµ ®èi tîng nghiªn cøu.Auxin ®îc thªm vµo m«i trêng nu«i cÊy sÏ kÕt hîp víi auxin néi sinh ®Ó ®iÒu khiÓn chiÒu híng vµ cêng ®é c¸c qu¸ tr×nh sinh trëng. Hµm lîng auxin thÊp sÏ kÝch thÝch sù ph©n ho¸ rÔ, ngîc l¹i ë hµm lîng cao sÏ ph¸t ®éng sù t¹o m« sÑo.
C¸c auxin thêng ®îc sö dông trong nu«i cÊy m« lµ IBA (idol butiric acid), NAA (a-naphtylacetic acid), 2,4-D (2,4 diclorophenoxy acetic acid), IAA (idol acetic acid).
Cytokinin lµ nhãm phytohormon dÉn xuÊt cña adenin, cã vai trß sinh lý t¬ng tù nhau. Cytokinin liªn quan chÆt chÏ víi ph©n bµo, duy tr× sù ._.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- HA84.DOC