Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cây lựu (Punica Granatum)

PhÇn I : Më ®Çu 1.1. §Æt vÊn ®Ò Lùu ( Punica granatum. L) hay cßn gäi lµ Th¸p lùu, Th¹ch lùu, An th¹ch lùu, Kim bµng, Kim t­¬ng…®ù¬c nhiÒu ng­êi biÕt ®Õn, tr­íc hÕt lµ loµi c©y lÊy qu¶, sau ®ã ®Ó lµm c¶nh vµ c«ng dông kh«ng thÓ kh«ng kÓ ®Õn cña nã lµ lµm thuèc ch÷a bÖnh. Trªn thÕ giíi chóng ®­îc sö dông vµ ®­a vµo trång trät tõ rÊt l©u tr­íc c«ng nguyªn .Theo y häc cæ truyÒn, rÔ vµ vá lùu cã vÞ ®¾ng, ch¸t , tÝnh «n, cã ®éc, cã t¸c dông s¸t trïng trõ s¸n, s¸p tr­êng chØ ®íi. Vá qu¶ lùu cã vÞ chua ch¸t, tÝnh «n, cã ®éc cã t¸c dông s¸p tr­êng, chØ huyÕt, khö trïng. Hoa lùu cã vÞ chua , ch¸t tÝnh b×nh, cã t¸c dông chØ huyÕt. NhiÒu nghiªn cøu cña y häc hiÖn ®¹i ®· ph¸t hiÖn những t¸c dụng cña lùu nh­ chèng oxy ho¸, ®Æc biÖt n­íc qu¶ lùu cã ho¹t tÝnh chèng ung th­, cã thÓ ng¨n chÆn sù ph¸t triÓn cña cña khèi u, cã hiÖu qu¶ trong viÖc lo¹i bá mét sè lo¹i ung th­ nh­ ung th­ da, ung th­ vó vµ ruét kÕt. ë Anh, mét sè nhµ khoa häc ®· nghiªn cøu kh¶ n¨ng ph¸t triÓn thuèc diÖt virus tõ lùu nh­ lµ t¸c nh©n b¶o vÖ kh¸ng virus chèng l¹i HIV. Lùu cßn cã t¸c dông lµm gi¶m c¸c triÖu chøng xuÊt hiÖn ë thêi kú m·n kinh. Mét trong nh÷ng ph¸t hiÖn míi nhÊt hiÖn nay lµ t¸c dông ch÷a bÖnh ®¸i th¸o ®­êng và bệnh béo phì cña hoa lùu, nh÷ng c¨n bÖnh nhiÒu ng­êi m¾c ph¶i. ë ViÖt Nam, lùu lµ c©y ¨n qu¶ quen thuéc trong nh©n d©n. C©y ®­îc trång nhiÒu ë c¸c tØnh phÝa nam vµ mét sè tØnh ë ®ång b»ng trung du B¾c bé. Để viÖc trång trät ®Ó lÊy nguyªn liÖu lµm thuèc ch­a ®­îc quan t©m mét c¸ch thÝch ®¸ng. H¹t lùu dÔ dµng n¶y mÇm khi gieo xuèng ®Êt. Tuy nhiªn, ®Ó tr¸nh t×nh tr¹ng ph©n ly do trång b»ng h¹t, ng­êi ta th­êng sö dông biÖn ph¸p nh©n gièng v« tÝnh b»ng cµnh ®Ó trång. H¬n n÷a, ®èi víi c©y thuèc, sù kh«ng ®ång nhÊt vÒ di truyÒn dÉn ®Õn hËu qu¶ lµ nguyªn liÖu kh«ng æn ®Þnh vÒ mÆt chÊt l­îng qua c¸c thÕ hÖ, g©y khã kh¨n cho viÖc ®­a nguyªn liÖu vµo d©y chuyÒn s¶n xuÊt c«ng nghiÖp v× hµm l­îng ho¹t chÊt cña nguyªn liÖu thay ®æi thÊt th­êng. V× vËy, nh©n gièng v« tÝnh cã ý nghÜa to lín. Chóng duy tr× ®­îc nh÷ng tÝnh tr¹ng quÝ hiÕm qua c¸c thÕ hÖ, ®¸p øng kh¶ n¨ng s¶n xuÊt nguyªn liÖu cã tiªu chuÈn æn ®Þnh cho c«ng nghiÖp. Trªn c¬ së nµy, chóng t«i ®· tiÕn hµnh ®Ò tµi  ‘‘nghiªn cøu x©y dùng qui tr×nh nh©n gÝ«ng v« tÝnh c©y lùu (Punica granatum. L)’’ 1.2. Môc ®Ých vµ yªu cÇu cña ®Ò tµi 1.2.1. Môc ®Ých - X©y dùng qui tr×nh nh©n gièng v« tÝnh c©y lùu. - §¸nh gi¸ ¶nh h­ëng cña chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng ®èi víi hÖ sè nh©n c©y in vitro vµ in vivo. 1.2.2. Yªu cÇu cña ®Ò tµi - Qui tr×nh ph¶i ®¶m b¶o cã hÖ sè nh©n cao, c©y gièng cã chÊt l­îng æn ®Þnh, ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn. 1.3. ý nghÜa khoa häc vµ thùc tiÔn cña ®Ò tµi ý nghÜa khoa häc Ph¸t hiÖn ®­îc quy luËt t¸c dông cña c¸c yÕu tè m«i tr­êng dinh d­ìng ®èi víi qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i cña c©y, nh©n nhanh vµ t¹o nguån gièng cã chÊt l­îng æn ®Þnh theo yªu cÇu s¶n xuÊt. 1.3.2. ý nghÜa thùc tiÔn Cung cÊp qui tr×nh nh©n gièng v« tÝnh c©y lùu, phôc vô s¶n xuÊt gièng, n©ng cao hiÖu qu¶ kinh tÕ cña kh©u trång trät vµ gãp phÇn thóc ®Èy s¶n xuÊt lùu thµnh c©y trång cã tÝnh chÊt hµng hãa míi, gãp phÇn cho viÖc phßng chèng bÖnh tËt cña céng ®ång vµ xuÊt khÈu. PhÇn II  Tæng quan tµi liÖu 2.1. Vµi nÐt vÒ c©y lùu 2.1.1. §Æc ®iÓm thùc vËt häc Lùu thuéc hä Punicaceae. Chi Punica L. ®­îc biÕt ®Õn tr­íc hÕt lµ loµi lùu cho qu¶ ¨n ®­îc cã tªn khoa häc lµ Punica granatum L. Ngoµi ra, cßn 1 loµi kh¸c Ýt ®­îc biÕt ®Õn lµ Punica protopunica Balf.f mäc hoang d¹i ë vïng Nam ¸, hay Trung A, d¶o Socotra. GÇn ®©y, ë ViÖt nam c©y P. granatum L. var. nana Person ®­îc nhËp trång v× cã hoa ®Ñp, kh«ng kÕt qu¶, ®Ó lµm c¶nh. Cã tµi liÖu nãi r»ng loµi nµy cã qu¶ bÐ 2 in (5 cm).[2] ¶nh 1: C©y lùu(Punica granatum L) Lùu lµ lo¹i c©y nhá hay nhì, cao tõ 2 - 4m, c©y hoang d¹i cã thÓ cao tíi 10m. Lùu lµ c©y sèng l©u n¨m. Th©n cã mµu x¸m, vá máng. Cµnh m¶nh ®«i khi cã gai. L¸ mäc ®èi, nh­ng th­êng tô häp thµnh côm nhiÒu l¸, cuèng ng¾n, h×nh m¸c thu«n, dµi 5-6 cm, réng 1-2 cm, gèc thu«n, ®Çu tï hoÆc h¬i nhän, hai mÆt nh½n, mÆt trªn sÉm bãng; l¸ kÌm rÊt nhá, h×nh chØ. L¸ xanh quanh n¨m hoÆc rông hµng n¨m. Hoa mäc ®¬n ®éc ë kÏ l¸, mµu ®á hoÆc vµng, lo¹i mµu tr¾ng lµ b¹ch lùu; ®µi 6 phiÕn dµy, mµu ®á nh¹t, hµn liÒn thµnh èng ng¾n ë phÇn d­íi; trµng 6 c¸nh máng, nh¨n nheo, nhÞ rÊt nhiÒu; bÇu cã hai tÇng, tÇng trªn 6-7 «, tÇng d­íi 3-4 «; no·n rÊt nhiÒu. Qña mäng, to b»ng n¾m tay cã ®µi, tån t¹i ë ®Ønh, khi chÝn mµu vµng ®èm ®á n©u; h¹t mµu hång, cã vá ngoµi mäng n­íc thµnh mét líp c¬m trong ¨n ®­îc. H¹t chiÕm kho¶ng 52% träng l­îng cña qu¶. 2.1.2. Bé phËn sö dông Vá qu¶, th­êng lµ th¹ch lùu b×. Vá c©y, vá rÔ, thÞt qu¶ còng ®­îc sö dông. Vá th©n, vá rÔ thu h¸i quanh n¨m. §µo rÔ bãc lÊy vá, bá lâi, ph¬i hoÆc sÊy kh«. Qña h¸i vµo th¸ng 7, bãc lÊy vá qu¶, bá mµng trong, sÊy kh«. Khi dïng ®em vá kh« ®å cho mÒm, th¸i máng, sao qua. Cßn dïng c¶ hoa. B¶o qu¶n n¬i kh« r¸o, kh«ng dÓ l©u qu¸ hai n¨m. 2.1.3. Thµnh phÇn ho¸ häc Vá rÔ vµ vá th©n lùu chøa alcaloid toµn phÇn víi hµm l­îng tõ 5 ®Õn 7%. C¸c alcaloid chñ yÕu lµ pelletierin, iso pelletierin, methyl pelletierin, pseudopelletierin vµ methylisopelletierin.[2] Tû lÖ alcaloid trung b×nh tÝnh b»ng d¹ng muèi sulfat trong 1 kg vá kh« lµ : - pelletierin sulfat 0,7 – 1g - iso pelletierin sulfat 1,3 – 1,5g - pseudopelletierin 1,5 – 2g - methylisopelletierin 0,04g Tû lÖ alcaloid thay ®æi theo ®iÒu kiÖn thu h¸i vµ c¸ch b¶o qu¶n. Tû lÖ alcaloid trong rÔ bao giê còng cao h¬n trong th©n vµ cµnh. Ph©n tÝch vá lùu cña Nam t­ thÊy ngoµi c¸c alcaloid quen thuéc cßn 10 alcaloid kh¸c còng ®· ®­îc ph¸t hiÖn nhê GMC-MS, trong ®ã, mét sè alcaloid cã nhãm thÕ ë vÞ trÝ 2 vµ 2,6 se®ridin, 2(2’ hydroxy propyl)’ piperidin, 2,2’(propenyl)piperidin vµ norpseudo pelletierin. C¸c alcaloid hygrin vµ norhygrin chØ t×m thÊy trong vá rÔ. RÔ lùu cßn chøa 2,5 – di – O – galloyl - 4,6 - O (S) hexahydroxydiphenol –D - glucuronic acid. ChÊt diellagilacton cã t¸c dông gi¶m ®au, gi¶m sèt, chèng viªm ®· ®­îc Kyota Yutaka, Watanabe Masuzumi chøng minh cÊu tróc. Qña lùu chøa 52% ¨n ®­îc. PhÇn nµy gåm 78% dÞch qu¶ vµ 22% h¹t. DÞch qu¶ t­¬i chøa 85,4% n­íc, 10,6% ®­êng, 1,4% pectin, 0,1g/100 ml acid citric, 0,7mg/100ml acid ascorbic, 19,6 mg/100 ml aminonitrogen tù do vµ 0,05 g/100ml tro. Velioglu S; Unal C ®· x¸c ®Þnh dÞch qu¶ lùu vÒ mÆt ho¸ häc thÊy hµm l­îng acid tõ 2 ®Õn 55g/l, tû lÑ glucose trªn fructose lu«n thÊp h¬n 1,0, hµm l­îng Cl kh¸ cao (496mg/l) vµ nång ®é D.isocitric còng kh¸ cao tõ 4 ®Õn 186 mg/l. DÞch chiÕt qu¶ lùu cã 4,95% monosaccharid 8,65% ®­êng, 1,22% acid citric. Gil Maria L., Garcia, Viguera cho r»ng cã sù thay ®æi mµu trong qu¸ tr×nh chÝn cña qu¶ lùu. S¸u chÊt mµu anthocyanin ®· ®­îc t×m thÊy trong sù h×nh thµnh mµu ®á cña dÞch qu¶ lµ delphinidin – 3 – glucosid, 3,5 diglucosid, cyanidin – 3 –glucosid 3 – 5 diglucosid, pelargonidin 3 glucosid vµ 3,5 diglucosid. Vá qu¶ chØ chøa cyanidin vµ pelargonidin. Thêi kú ®Çu, 3,5 diglucosid lµ chÊt mµu chñ yÕu, c¸c dÉn chÊt cña delphinidin lµ chÊt næi tréi nhÊt ë giai ®o¹n nµy ®Õn giai ®o¹n sau cña qu¸ tr×nh qu¶ chÝn. Tû lÖ c¸c monoglucosid t¨ng dÇn ®Õn b»ng hoÆc nhiÒu h¬n diglucosid vµ hîp chÊt cyanidin base lµ ch¸t næi tréi h¬n c¶. Vá qu¶ lùu lµ nguån cung cÊp tanin víi hµm l­îng thay ®æi tõ 20 ®Õn 30%. Hµm l­îng tannin trong vá t­¬i lµ 5,2% vµ 20,3% ë vá kh« ë nhiÖt ®é 50ºC. ViÖc xö lý vá qu¶ víi c¸c muèi sulfite kh¸c nhau trong qu¸ tr×nh lµm kh« ®Òu ¶nh h­ëng tíi hµm l­îng tannin. L. Satomi Hayato; Umemura Keijro ph¸t hiÖn trong vá lùu chÊt ellagitanin cã t¸c dông øc chÕ carbonic anhydrase lµ punicalin, punicagalin, granatin B, gallay dilacton, casuarinin, pedunculagin, tellimagradin. Bèn chÊt kh¸c cã t¸c dông yÕu h¬n lµ acid gallic, granatin B, corilagin vµ acid ellagic H¹t lùu chøa 35% n­íc, 6,9% chÊt bÐo, 9,4% hîp chÊt chøa nit¬, 12,6% tinh bét, 23,4% sîi, 1,5% tro. C¸c acid bÐo trong lipid h¹t lùu chiÕm 83,6% gåm 11 thø trong ®ã acid caprilic nhiÒu h¬n c¶, chiÕm 36,3%, tiÕp theo lµ acid stearic 22,5%. Acid oleic 5,1% vµ acid linoleic 10,3%. H¹t lùu cßn chøa 6% pectin, 4,7% ®­êng. Yusuph. Mahiinur; Mann John ®· t×m th¸y trong h¹t lùu mét triglycerid lµ di- O – punicyl – O – octadeca – 8 – Z – 11 – Z 13E trienyl glycerol. Almed ®· x¸c dÞnh sù cã mÆt cña oestrogen glusid vµ Moneam N.M.A el Sharaky x¸c ®Þnh hµm l­îng estron trong h¹t lµ 0,8% vµ lo¹i estrogen phi steroid coumestrol lµ 0,036%. L¸ lùu chøa nhiÒu hîp chÊt phenolic nh­ N – (2’,5’ ®ihdroxy phenyl) pyridinium chlorid, c¸c flovin glusid nh­ apigenin – 4 – O – b glucopyranosid, luteolin 4’- O- b glucopyranosid, luteolin 3’- O- b glucopyranosid, luteolin 3’- O- b xyloppyranosid. C¸c t¸c gi¶ cßn x¸c ®Þnh sù cã mÆt cña c¸c phenol kh¸c trong l¸ nh­ brevifolin, acid carboxylic,corilagin3,6(R) hexahydroxy diphenol – (a,b) – 1C4 – glucopiranose; 1,3,6 tri – O – galloy - b- 4Cl – glucopiranose, acid ellagic; 3,4,8,9,10 penta, hy®roxyibenzo(b,d) pyran 6 on, granatin B vµ punicafolin. HÇu hÕt c¸c bé phËn cña c©y lùu ®Òu chøa tanin. Castonguay, Adre; Gali Hala chøng minh c¸c ho¹t chÊt chèng u trong lùu gåm ellagitanin,punicalagin (d¹ng a vµ b) cïng víi c¸c ellargic, authocyanin vµ procyanin. Ngoµi nh÷ng chÊt quan träng nh­ c¸c alcaloid, tanin, polyphenol, ng­êi ta cßn t×m thÊy trong lùu c¸c acid h÷u c¬ nh­ acid maslinic, asiatic, pipecolinic, betulinic, ursolic. ChÊt flanoid pelagorin gåm mét ph©n tö pelargonidin vµ 2 ph©n tö glucose ë vÞ trÝ 3 vµ 5. 2.1.4. T¸c dông d­îc lý Tõ x­a, ë Trung quèc vµ Ch©u ¢u, ng­ßi ta ®· biÕt dïng vá rÔ lùu ®Ó trÞ bÖnh giun s¸n ®­êng ruét. N¨m 1807, Buchanan ®· c«ng bè vá th©n vµ vá rÔ cã t¸c dông tÈy giun s¸n trªn l©m sµng. N¨m 1884, Schroeder thÊy r»ng vá lùu vµ ho¹t chÊt pelletierin cã t¸c dông diÖt s¸n rÊt m¹nh. HiÖn nay ng­êi ta ®· chøng minh thµnh phÇn chÝnh cã t¸c dông diÖt s¸n lµ isopelletierin vµ pelletierin, nh­ng do ®é ®éc qu¸ lín nªn chóng Ýt ®­îc sö dông trong ®iÒu trÞ. §Ó gi¶m bít ®é ®éc h¹i vµ t¨ng c­êng hiÖu lùc diÖt s¸n, ng­êi ta th­êng sö dông d¹ng tannat pelletierin v× d¹ng nµy kh«ng hoµ tan trong dÞch ruét nªn kh«ng bÞ hÊp thu nhanh chãng vµo m¸u, ®ång thêi t¨ng nång ®é tiÕp xóc víi s¸n. Trong vá rÔ vµ vá th©n c©y lùu, pelletierin th­êng kÕt hîp tù nhiªn víi tanin d­íi d¹ng tannat nªn ng­êi ta th­êng dïng vá rÔ vµ vá th©n ®Ó ch÷a s¸n. DÞch chiÕt b»ng n­íc cña vá rÔ lùu cho thá uèng cã t¸c dông thóc ®Èy qu¸ tr×nh ®«ng m¸u. N­íc s¾c vá qu¶ lùu cã t¸c dông øc chÕ c¸c khuÈn: Bacillus dysenteriae, B.typhy, Streptococcus aureus, B.pyocyaneus, E.coli. DÞch tõ vá qu¶ lùu thÝ nghiªm trªn èng kÝnh víi nång ®é 10g/l cã t¸c dông chèng nÊm Piricularia oryzae Cav vµ nÊm Colletotrichum falcatum Went lµ nh÷ng t¸c nh©n g©y bÖnh cho c©y lóa vµ c©y mÝa. N­íc s¾c vá qu¶ lùu cho thá uèng qua ®­êng d¹ dµy, ngµy 2 lÇn cã t¸c dông cÇm tiªu ch¶y. Bét vá qu¶ lùu cho chuét cèng tr¾ng vµ chuét lang uèng qua ®­êng d¹ dµy, cã t¸c dông gi¶m tû lÖ sinh ®Î c¶ chuét. Cã b¸o c¸o cho r»ng alcaloid toµn phÇn cña vá qu¶ cã t¸c dông kÝch thÝch tö cung. NhiÒu nghiªn cøu cho thÊy lùu cã chøa rÊt nhiÒu chÊt chèng «xy ho¸, cã t¸c dông ng¨n ngõa sù t¾c nghÏn ®éng m¹ch, c¾t gi¶m c¬n ®au tim, ¸p huyÕt cao. N­íc chiÕt qu¶ lùu cßn cã ho¹t tÝnh chèng ung th­, cã gi¸ trÞ trong viÖc ng¨n chÆn sù ph¸t triÓn cña cña khèi u, hiÖu qu¶ trong viÖc lo¹i bá mét sè lo¹i ung th­ nh­ ung th­ da, ung th­ vó vµ ruét kÕt.[25]. ë Anh, c¸c nhµ khoa häc ®· nghiªn cøu kh¶ n¨ng ph¸t triÓn thuèc diÖt virus tõ lùu nh­ lµ t¸c nh©n b¶o vÖ kh¸ng virus chèng l¹i HIV. NhiÒu nhµ khoa häc NhËt b¶n ngµy nay ®· ph¸t hiÖn tiÒm n¨ng cña n­íc lùu lªn men vµ n­íc chiÕt vá qu¶ cã thÓ trî gióp tÕ bµo b¹ch cÇu trë vÒ tr¹ng th¸i b×nh th­êng vµ cã thÓ ®­a ra liÖu ph¸p hç trî quan träng kh«ng g©y ®éc cho tÕ bµo b¹ch cÇu. 2.2.5. T×nh h×nh s¶n xuÊt lùu Lùu cã nguån gèc tõ Iran tíi d·y Himalaya ë B¾c Ên ®é, ®­îc ®­a vµo trång trät tõ thêi cæ ®¹i ë vïng §Þa Trung H¶i, Ch©u ¸, Ch©u Phi vµ Ch©u ¢u. Tõ Iran ®­îc ®­a vµo nam vµ trung t©m Ên §é vµo kho¶ng thÕ kû ®Çu tiªn sau c«ng nguyªn vµ trång ë Indonexia vµo n¨m 1416. Sau ®ã chóng ®­îc trång réng r·i ë Ên §é vµ c¸c vïng kh« cña §«ng Nam ¸, Malayxia, T©y Ên §é vµ rõng nhiÖt ®íi Ch©u Phi. Lùu lµ c©y trång truyÒn thèng cña c¸c n­íc thuéc vïng ven biÓn §Þa Trung H¶i. Nh÷ng vïng trång quan träng lµ Ai CËp, Trung Quèc, Afghanistan, Pakistan, Bangladesh, Iran, Iraq, Ên §é, Burma vµ ¶ RËp Xªut. ë Mü, Clifornia hµng n¨m s¶n xuÊt kho¶ng 17.000 mega tÊn lùu, trªn diÖn tÝch gÇn 12000ha. ë ViÖt nam, lùu còng lµ c©y ¨n qu¶ quen thuéc trong nh©n d©n. C©y ®­îc trång nhiÒu ë c¸c tØnh phÝa nam vµ mét sè tØnh ë ®ång b»ng trung du B¾c bé. C©y cã biªn ®é sinh th¸i réng, vÒ mïa ®«ng cã thÓ chÞu ®­îc nhiÖt ®é -15 oC (Vïng Trung ¸ vµ Trung quèc) vµ ë nhiÖt ®é cao ®Õn 40 oC vµo mïa hÌ. Tuy nhiªn, nh×n chung c©y thÝch nghi nhÊt ë khÝ hËu nãng ë vïng nhiÖt ®íi víi nhiÖt ®é trung b×nh nhÊt lµ 24-26 oC . Vïng trång thÝch hîp nhÊt ®èi víi lùu lµ ®Êt liÒn cã mïa hÌ nãng vµ kh«, ë ®ã qu¶ sÏ cã mµu s¾c vµ h­¬ng vÞ ngon nhÊt. Vïng duyªn h¶i vµ mïa hÌ «n hoµ lµ nh÷ng vïng h¹n chÕ ®èi víi môc ®Ých th­¬ng m¹i, vµ trong nh÷ng ®iÒu kiÖn nh­ vËy c©y th­êng ®­îc trång víi môc ®Ých lµm c¶nh. 2.2. C¬ së khoa häc cña ®Ò tµi Nh©n gièng c©y trång lµ qu¸ tr×nh t¹o ra vµ ph¸t triÓn cña c¸c c¸ thÓ míi. C¸c c¸ thÓ nµy ®­îc dïng ®Ó thiÕt lËp nªn vô mïa míi. Cã 2 ph­¬ng ph¸p nh©n gièng chÝnh: Ph­¬ng ph¸p h÷u tÝnh – dïng h¹t vµ ph­¬ng ph¸p v« tÝnh (asexual ) hay cßn gäi lµ ph­¬ng ph¸p dinh d­ìng (vegetative) – dùa vµo kh¶ n¨ng kh¶ n¨ng t¸i sinh cña mét bé phËn nµo ®ã cña c©y nh­ l¸, th©n, rÔ, m« hoÆc tÕ bµo. (Hartman and Kester, 1975).[24] 2.2.1. Nh©n gièng h÷u tÝnh ( b»ng h¹t) Ph­¬ng ph¸p nh©n gièng nµy cho hÖ sè nh©n gièng cao, dÔ b¶o qu¶n vµ vËn chuyÓn. Tuy nhiªn, mét sè c©y trång, nÕu nh©n gièng b»ng h¹t cã thÓ cho nh÷ng c¸ thÓ con kh«ng hoµn toµn gièng bè mÑ chóng c¶ vÒ h×nh th¸i lÉn thµnh phÇn ho¸ häc (Carson, 1964). §Æc biÖt, ®èi víi c©y thuèc, sù kh«ng ®ång nhÊt vÒ di truyÒn dÉn ®Õn hËu qu¶ lµ nguyªn liÖu kh«ng æn ®Þnh vÒ mÆt chÊt l­îng qua c¸c thÕ hÖ, g©y khã kh¨n cho viÖc ®­a nguyªn liÖu vµo d©y chuyÒn s¶n xuÊt c«ng nghiÖp v× hµm l­îng ho¹t chÊt cña nguyªn liÖu thay ®æi thÊt th­êng. 2.2.2. Nh©n gièng v« tÝnh Ph­¬ng ph¸p nµy sö dông kh¶ n¨ng t¸i sinh cña c¸c c¬ quan dinh d­ìng kh¸c nhau nh­ th©n, rÔ, l¸, m« hay tÕ bµo. Nh©n gièng v« tÝnh bao gåm nh©n gièng v« tÝnh truúªn thèng (chiÕt, ghÐp, gi©m) vµ nh©n gièng v« tÝnh in vitro. Nh©n gièng v« tÝnh t¹o ra c©y con ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn do duy tr× ®­îc c¸c tÝnh tr¹ng cña c©y mÑ (Petrop, 1989). Ph­¬ng ph¸p nh©n gièng cã tÇm quan träng sèng cßn ®èi víi c©y d­îc liÖu. VÝ dô : C¸c loµi Dioscorea, nguån nguyªn liÖu sè mét cña c«ng nghiÖp steroid (Ph¹m Kim M·n, 1992), trång b»ng cñ bao giê còng cho hµm l­îng diosgenin æn ®Þnh h¬n trång b»ng h¹t (Bammin, Randhava, 1975; Gupta et al, 1979).[19]. §Ó duy tr× hµm l­îng diosgenin cao cña c¸c dßng ®· ®­îc chän läc, ng­êi ta qui ®Þnh chØ dïng ph­¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh (Asolka, Chadha, 1979).[18] Sù ph©n ly vÒ h×nh th¸i còng nh­ thµnh phÇn ho¸ häc khi nh©n gièng b»ng h¹t th­êng dÉn ®Õn sù tho¸i ho¸ gièng ®· ®­îc nhiÒu t¸c gi¶ ®Ò cËp ®Õn trong nghiªn cøu nhiÒu c©y kh¸c nh­ h­íng d­¬ng (Stotsnova, 1973), thiªn tróc qu×, thanh cao hoa vµng (NguyÔn Gia ChÊn vµ cs, 1991)[3], long n·o (Ph¹m V¨n KhiÓn, 1992).[6] Nh­ vËy gi¸ trÞ to lín nhÊt cña ph­¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh lµ duy tr× ®­îc nh÷ng tÝnh tr¹ng quÝ hiÕm qua c¸c thÕ hÖ vµ v× vËy t¹o ra kh¶ n¨ng s¶n xuÊt nguyªn liÖu cã tiªu chuÈn æn ®Þnh cho c«ng nghiÖp. Nh©n gièng v« tÝnh cßn cã t¸c dông rót ng¾n thêi gian tõ khi trång tíi khi thu ho¹ch t¹o ®iÒu kiÖn t¨ng vô, t¨ng s¶n phÈm vµ dÉn ®Õn t¨ng hiÖu qu¶ kinh tÕ. §Ó thu ®­îc n¨ng suÊt nh­ nhau, c¸c loµi Dioscorea nÕu trång b»ng h¹t sÏ ph¶i kÐo dµi thêi gian sinh tr­ëng Ýt nhÊt 6 th¸ng so víi trång b»ng cñ (Husain et al, 1979; Martin, Gaskins, 1969; Ph¹m V¨n HiÓn vµ ctv, 1988). §èi v¬Ý mÝa dß, Starin (1977) ®· kÕt luËn lµ trång b»ng h¹t kh«ng kinh tÕ. NhiÒu c©y thuèc kh¸c nÕu nh©n gièng b»ng h¹t còng sÏ ph¶i kÐo dµi thêi gian sinh tr­ëng tõ 1 ®Õn nhiªï n¨m so v¬Ý nh©n gièng v« tÝnh nh­ b¹ch th­îc, b¸n h¹, ®an s©m, kim ng©n... Tuy nhiªn, nh©n gièng b»ng ph­¬ng ph¸p v« tÝnh truyÒn thèng còng cã nh­îc ®iÓm nhÊt ®Þnh, ®Æc biÖt lµ sù l©y nhiÔm bÖnh qua nguyªn liÖu gièng th­êng phæ biÕn vµ phøc t¹p. Sù l©y nhiÔm vµ tÝch tô c¸c ký sinh trïng ®Æc hiÖu, nhÊt lµ virus, lµm gi¶m n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng c©y trång. ThiÖt h¹i do hiÖn t­îng nµy g©y ra cã thÓ thÊy rÊt râ ë khoai t©y (Vò TriÖu M©n vµ cs, 1986; Van de Zaag, 1983)[10], b¹c hµ (Muschiatxe, 1985), lóa m×, ®¹i m¹ch vµ nhiÒu c©y kh¸c. HÖ sè nh©n gièng cña ph­¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh th«ng th­êng rÊt thÊp. ThÝ dô cña Dioscorea floribunda khi nh©n b»ng cñ lµ 8 – 10c©y/ n¨m (Bammi, Radha, 1975), cña cam th¶o lµ 5 – 7 (Shah, Dalal, 1980)[35]. HÖ sè nh©n gièng cña b¹c hµ piperota khi nh©n gièng b»ng th©n ngÇm trung b×nh lµ 2 – 3 (Foldesi, Havas, 1979), cña b¹c hµ arvensis lµ 6 – 7 (ViÖn d­îc liÖu, 1976)[7]. Thªm vµo ®ã, nguyªn liÖu cñ gièng lµ m« t­¬i, cã khèi l­îng lín, viÖc vËn chuyÓn vµ b¶o qu¶n th­êng gÆp nhiÒu khã kh¨n. ViÖc sö dông chÝnh c¸c bé phËn lµm thuèc ®Ó lµm nguyªn liÖu gièng g©y nhiÒu l·ng phÝ, tèn kÐm. C¸c ph­¬ng ph¸p nh©n gièng truyÒn thèng gåm cã: ChiÕt: lµ ph­¬ng ph¸p t¹o ra c¸ thÓ míi, th­êng lµ trªn th©n c©y, tr­íc khi t¸ch khái c©y mÑ. ¦u ®iÓm cña ph­¬ng ph¸p nµy lµ cµnh chiÕt ®­îc c¸ thÓ mÑ cung cÊp n­íc vµ dinh d­ìng, ®Æc biÖt lµ cacbohydrat, protein, phytohormon tr­íc khi cã thÓ tù nu«i sèng m×nh. D©m: lµ sù t¹o ra c©y con tõ mét l¸t c¾t th©n, l¸, rÔ, hoÆc tõ 1 l¸, cñ, rÔ nguyªn, sau khi ®· t¸ch ra khái c©y mÑ. ph­¬ng ph¸p d©m th­êng cã hÖ sè nh©n cao h¬n ph­¬ng ph¸p chiÕt vµ ghÐp, nh­ng cÇn ®¶m b¶o (nh©n t¹o) c¸c ®iÒu kiÖn néi t¹i vµ ngo¹i c¶nh thÝch hîp cho qu¸ tr×nh ra rÔ vµ t¸i sinh mÇm. GhÐp: lµ sù liªn kÕt gi÷a hai bé phËn : cµnh ghÐp vµ gèc ghÐp cña hai c¸ thÓ kh¸c nhau (th­êng ¸p dông ®èi víi c©y th©n gç). C©y ghÐp th­êng cã ­u thÕ cña c¶ gèc ghÐp vµ cµnh ghÐp. H¹n chÕ cña ph­¬ng ph¸p nµy lµ chØ thùc hiÖn ®­îc trong ph¹m vi c¸c c©y th©n gç cã sinh tr­ëng thø cÊp (c©y h¹t trÇn vµ c©y hai l¸ mÇm), c©y mét l¸ mÇm hÇu nh­ kh«ng ghÐp ®­îc. ThËm chÝ c¸c c©y nµy ph¶i rÊt gÇn nhau vÒ mÆt ph©n lo¹i th× tû lÖ thµnh c«ng míi cao. Ngoµi ra viÖc lùa chän ®­îc gèc ghÐp phï hîp kh«ng ph¶i lµ dÔ vµ thêi gian tån t¹i c©y gièng trong v­ßn ­¬m l©u. Ph­¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro ®· bæ sung cho c¸c kü thuËt nh©n gièng truyÒn thèng nhiÒu kü thuËt tiÕn bé, kh¾c phôc ®­îc nh÷ng h¹n chÕ cña c¸c ph­¬ng ph¸p nh©n gièng nãi trªn . 2.2.3. Nh©n gièng v« tÝnh in vitro Lµ ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy m« , tÕ bµo trªn m«i tr­êng dinh d­âng nh©n t¹o trong ®iÒu kiÖn v« trïng vµ t¸i sinh chóng thµnh c©y con. C¬ së lý luËn cña nu«i cÊy in vitro C¬ së lý luËn cña ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy m«, tÕ bµo in vitro lµ häc thuyÕt vÒ tÝnh toµn n¨ng (totipotence) cña tÕ bµo. Theo Haberland.G (1902), nhµ thùc vËt häc ng­êi §øc, tÊt c¶ c¸c tÕ bµo cña c©y ®Òu mang toµn bé l­îng th«ng tin di truyÒn cña c¬ thÓ, khi gÆp ®iÒu kiÖn thÝch hîp, mçi tÕ bµo ®ã ®Òu cã kh¶ n¨ng t¸i sinh vµ ph¸t triÓn thµnh c¸ thÓ hoµn chØnh. Thùc tÕ ®· chøng minh ®­îc kh¶ n¨ng t¸i sinh mét c¬ thÓ thùc vËt hoµn chØnh tõ mét tÕ bµo riªng rÏ. Hµng tr¨m loµi c©y trång ®· ®­îc nh©n gièng trªn qui m« th­¬ng m¹i b»ng c¸ch nu«i cÊy trong m«i tr­êng nh©n t¹o v« trïng vµ t¸i sinh chóng thµnh c©y víi hÖ sè nh©n gièng v« cïng lín (Murashige, 1930)[30]. Morel (1966)[28] lµ ng­êi ®Çu tiªn ®· thµnh c«ng trong viÖc t¸i sinh vµ nh©n nhanh gièng lan quÝ Cymbidium b»ng ph­¬ng ph¸p nµy. Trong mét thêi gian ng¾n ng­êi ta cã thÓ thu ®­îc hµng triÖu c¸ thÓ, nhê vËy mµ hoa Cymbidium vèn ®¾t tiÒn ®· cã gi¸ thµnh h¹ h¬n vµ ®¸p øng ®­îc nhu cÇu tiªu dïng cña nhiÒu ng­êi. ë Th¸i Lan 90% lan th­¬ng m¹i ®­îc nh©n b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro. Thµnh c«ng ®èi víi hä Orchidaceae kh«ng nh÷ng chØ lµ b»ng chøng mµ cßn më ®­êng cho viÖc øng dông kü thuËt nµy ®èi víi c¸c loµi c©y kh¸c nh­ c©y ¨n qu¶, c©y l­¬ng thùc, c©y l©m nghiÖp, c©y thuèc, c©y c¶nh.... Cóc ë NhËt B¶n, Trung Quèc, Mü, ®Æc biÖt ë Hµ Lan sö dông ph­¬ng ph¸p nµy cho hÖ sè nh©n gièng cao tõ 410-1010/n¨m (NguyÔn Xu©n Linh, 1988). C¸c lÜnh vùc øng dông kh¸c cña ph­¬ng ph¸p nµy còng mang l¹i nhiÒu kÕt qu¶ trong viÖc c¶i t¹o vµ phôc tr¸ng gièng c©y trång. Qóa tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i trong nu«i cÊy in vitro thùc vËt thùc chÊt lµ kÕt qu¶ cña c¸c qóa tr×nh ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n ho¸. TÊt c¶ c¸c tÕ bµo trong c¸c c¬ quan kh¸c nhau cña c¬ thÓ thùc vËt tr­ëng thµnh ®Òu b¾t nguån tõ tÕ bµo ph«i sinh. Sù chuyÓn tÕ bµo ph«i sinh thµnh c¸c tÕ bµo chuyªn ho¸ ®Ó ®¶m nhiÖm c¸c chøc n¨ng kh¸c nhau ®­îc gäi lµ sù ph©n ho¸ tÕ bµo . Cßn qu¸ tr×nh ph¶n ph©n ho¸ th× ng­îc l¹i víi qóa tr×nh ph©n ho¸, cã nghÜa lµ tÕ bµo ®· ph©n ho¸ thµnh m« chøc n¨ng kh«ng hoµn toµn mÊt ®i kh¶ n¨ng ph©n chia mµ ë ®iÒu kiÖn thÝch hîp, chóng cã thÓ trë vÒ d¹ng ph«i sinh vµ t¸i ph©n chia. C¸c qóa tr×nh trªn cã thÓ tãm t¾t nh­ sau: Ph©n ho¸ tÕ bµo TÕ bµo d·n TÕ bµo ph«i sinh TÕ bµo chuyªn ho¸ Ph¶n ph©n ho¸ tÕ bµo VÝ dô : khi nu«i cÊy m¶nh l¸ hay ®èt th©n c©y thuèc l¸, ë ®iÒu kiÖn m«i tr­êng thÝch hîp c¸c tÕ bµo ®· ph©n ho¸ cña l¸, ®èt th©n sÏ ph¶n ph©n ho¸, ph©n chia trë l¹i thµnh m« sÑo kh«ng cßn lµ tÕ bµo cã chøc n¨ng nh­ tÕ bµo l¸, ®èt th©n n÷a. NÕu chuyÓn sang m«i tr­êng kh¸c th× tuú theo thµnh phÇn m«i tr­êng mµ c¸c tÕ bµo m« sÑo cã thÓ ph©n ho¸ theo c¸c h­íng kh¸c nhau (h×nh thµnh rÔ, chåi hay t¹o c©y hoµn chØnh...) ¦u, nh­îc ®iÓm cña ph­¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro Ph­¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro cã kh¶ n¨ng kh¾c phôc ®­îc nhiÒu trë ng¹i mµ nh÷ng ph­¬ng ph¸p nh©n gièng kh¸c th­êng gÆp. Cô thÓ lµ: T¹o c©y con ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn, b¶o tån ®­îc c¸c tÝnh tr¹ng ®· chän läc. T¹o ®­îc dßng thuÇn cña c¸c c©y t¹p giao. §iÒu nµy cã ý nghÜa rÊt lín víi c©y thuèc nãi chung, ®Æc biÖt ®èi víi c¸c c©y trång ®Ó chiÕt lÊy ho¹t chÊt. T¹o ®­îc c©y cã genotip míi( ®a béi, ®¬n béi). B¶o qu¶n vµ l­u gi÷ tËp ®oµn gen. Phôc tr¸ng gièng th«ng qua kü thuËt cÊy ®Ønh sinh tr­ëng vµ c¶i t¹o gièng b»ng kü thuËt gen. Cã kh¶ n¨ng s¶n xuÊt quanh n¨m. Cã thÓ nh©n nhanh nhiÒu c©y kh«ng kÕt h¹t trong nh÷ng ®iÒu kiÖn sinh th¸i nhÊt ®Þnh hoÆc h¹t nÈy mÇm kÐm. HÖ sè nh©n gièng cùc kú cao (th­êng ®¹t ®­îc ë c¸c loµi c©y kh¸c nhau trong ph¹m vi tõ 36 – 1012/ n¨m), rót ng¾n thêi gian ®­a mét gièng míi vµo s¶n xuÊt ®¹i trµ. NÕu xÐt vÒ ph­¬ng diÖn hÖ sè nh©n th× nh©n gièng in vitro lµ ph­¬ng ph¸p kh«ng g× cã thÓ s¸nh kÞp, kÓ c¶ ph­¬ng ph¸p nh©n gièng b»ng h¹t. ChØ tÝnh riªng lÜnh vùc true - to – type, nu«i cÊy in vitro cã thÓ coi lµ mét cuéc ®¹i c¸ch m¹ng vÒ hÖ sè nh©n. ThÝ dô: sö dông chåi n¸ch ®Ó nh©n cã thÓ t¹o ra hµng chôc v¹n c©y D.floribunda trong vßng mét n¨m (Chaturvedi, Sinha, 1979; Ph¹m V¨n HiÓn vµ cs, 1988)[5] hay 26 v¹n c©y cam th¶o trong 5 th¸ng (Shah, Dalal, 1980)[35] tõ mét l¸t c¾t ban ®Çu mµ th«ng th­êng 1 c©y D.floribunda chØ t¹o ra 8 – 10 c©y trong mét n¨m, vµ cam th¶o chØ cho 5 – 7 c©y nÕu nh©n gièng b»ng cµnh. Tõ mét cñ gièng khoai t©y trong thêi gian 8 th¸ng, ng­êi ta thu ®­îc 2000 cñ ®ång nhÊt di truyÒn, trång ®­îc trªn mét vïng 40ha, cã nghÜa lµ tèc ®é nh©n gièng >100 000 so víi sinh s¶n h÷u tÝnh (Senez, 1987). ë ViÖt nam, Mai ThÞ T©n vµ céng sù ®· ®¹t ®­îc hÖ sã nh©n 532 trong vßng 1 n¨m ®èi víi khoai t©y b»ng ph­¬ng ph¸p nµy[12]. §Æc biÖt, c©y cä dÇu th­êng ph¶i mÊt 10 – 15 n¨m míi cho thu ho¹ch, viÖc chän, t¹o vµ nh©n nhanh ®­îc mét gièng míi rÊt khã kh¨n. B»ng ph­¬ng ph¸p nh©n nhanh in vitro, ng­êi ta cã thÓ cung cÊp ®­îc 500 000 c©y con gièng hÖt nhau trong vßng mét n¨m (Starisky, 1970)[36]. Whitehead vµ Giles (1977) dù tÝnh hµng n¨m cã hÓ thu ®­îc 106 c©y gièng khi nu«i cÊy chåi cña Popolus nigra, P.yannanensis vµ con lai cña Popolus. Nh­îc ®iÓm chÝnh cña ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro lµ ®ßi hái trang thiÕt bÞ ®¾t tiÒn vµ kü thuËt cao nªn chØ cã hiÖu qu¶ ®èi víi nh÷ng c©y cã gi¸ trÞ cao hoÆc khã nh©n giång b»ng c¸c ph­¬ng ph¸p kh¸c (Nickell, 1973)[33]. Ngoµi ra, ph­¬ng ph¸p nµy cßn cã nh÷ng bÊt lîi sau: MÆc dï sè l­îng c©y gièng thu ®­îc cã thÓ rÊt cao, nh­ng c©y con cã kÝch th­íc nhá, ®ßi hái ph¶i cã chÕ ®é ch¨m sãc ®Æc biÖt ë giai ®o¹n sau èng nghiÖm. C©y cã thÓ cã nh÷ng ®Æc tÝnh kh«ng mong muèn. Kh¶ n¨ng t¹o ®ét biÕn cã thÓ t¨ng. Kh¶ n¨ng t¸i sinh cã thÓ bÞ mÊt ®i do cÊy truyÒn callus hay huyÒn phï tÕ bµo nhiÒu lÇn. C©y gièng cã thÓ bÞ nhiÔm bÖnh ®ång lo¹t. Tuy vËy ph­¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro ngµy cµng ®­îc sö dông réng r·i ®Ó phôc vô nh÷ng môc ®Ých sau: Duy tr× vµ nh©n nhanh c¸c kiÓu gen quÝ hiÕm lµm vËt liÖu cho c«ng t¸c chän gièng. Nh©n nhanh vµ duy tr× c¸c c¸ thÓ ®Çu dßng tèt ®Ó cung cÊp h¹t gièng c¸c lo¹i c©y trång kh¸c nhau nh­ c©y l­¬ng thùc cã cñ, c©y rau, c©y hoa, c©y c¶nh vµ c©y d­îc liÖu thuéc nhãm c©y th©n th¶o. Nh©n nhanh vµ kinh tÕ c¸c kiÓu gen quÝ cña gièng c©y l©m nghiÖp vµ gèc ghÐp trong nghÒ trång c©y ¨n qu¶, c©y c¶nh thuéc nhãm c©y thÉn gç, Nh©n nhanh ë ®iÒu kiÖn v« trïng vµ c¸ch ly t¸i nhiÔm kÕt hîp víi lµm s¹ch virus. B¶o qu¶n vµ l­u gi÷ c¸c tËp ®oµn gièng nh©n gièng v« tÝnh vµ c¸c loµi giao phÊn trong ng©n hµng gen. Kü thuËt nu«i cÊy in vitro Cã thÓ chia thµnh c¸c b­íc sau: Lùa chän ®èi t­îng (c©y trång, gièng, bé phËn c©y) thÝch hîp. Nguyªn liÖu sö dông cho nu«i cÊy m«, tÕ bµo thùc vËt cã thÓ lµ bÊt cø bé phËn nµo cña c©y: c¸c ®o¹n cña rÔ, th©n, c¸c phÇn cña l¸ (cuèng l¸, phiÕn l¸...), c¸c cÊu tróc cña ph«i nh­ l¸ mÇm, trô trªn, trô d­íi l¸ mÇm, h¹t phÊn, no·n.. thËm chÝ c¶ mÈu th©n ngÇm hay c¬ quan dù tr÷ d­íi mÆt ®Êt (cñ, c¨n hµnh..) còng ®­îc dïng cho nu«i cÊy. Khö trïng mÉu vµ tiÕn hµnh nu«i cÊy Nguyªn liÖu ®Ó nu«i cÊy in vitro ®­îc lùa chän tõ nh÷ng c¸ thÓ ­u tó cña loµi, khoÎ vµ s¹ch bÖnh virus, nh­ng Ýt hay nhiÒu ®Òu cã nhiÔm vi sinh vËt vµ nÊm tuú thuéc vµo sù tiÕp xóc cña chóng víi m«i tr­êng xung quanh. Cã mét sè bé phËn nh­ ph«i trong h¹t, m« trong qu¶, ®ßng lóa non ... Ýt bÞ nhiÔm vi sinh vËt h¬n c¸c bé phËn kh¸c cña c©y, ng­îc l¹i c¸c bé phËn n»m d­íi mÆt ®Êt nh­ rÔ, cñ, th©n ngÇm, cã l­îng vi khuÈn vµ nÊm rÊt cao. Ph­¬ng ph¸p th«ng dông nhÊt hiÖn nay ®Ó lo¹i bá hÖ vi sinh vËt khái vËt liÖu cÊy lµ sö dông c¸c ho¸ chÊt cã ho¹t tÝnh diÖt khuÈn vµ nÊm. T¸c nh©n khö trïng, ngoµi t¸c dông diÖt vi sinh vËt cßn ¶nh h­ëng ®Õn m« cÊy, v× vËy viÖc lùa chän lo¹i ho¸ chÊt ph¶i c¨n cø vµo møc ®é nhiÔm khuÈn vµ ®é mÉn c¶m cña tõng mÉu. Trong sè c¸c ho¸ chÊt hay ®­îc sö dông ®Ó khö trïng th× canxi hypoclorit vµ natri hypoclorit lµ hay ®­îc sö dông h¬n c¶ v× ®Æc tÝnh cña chóng: cã ®éc tÝnh thÊp ®èi víi m« ®­îc xö lý, kh«ng g©y øc chÕ sinh tr­ëng vµ hiÖu qu¶ diÖt khuÈn tèt. Nång ®é cña canxi hypoclorit vµ natri hypoclorit hay ®­îc sö dông lµ 5 – 15% vµ 0,5 – 2% trong thêi gian tõ 15 – 30 phót. X¸c ®Þnh ®iÒu kiÖn nu«i cÊy(m«i tr­êng dinh d­ìng, nhiÖt ®é, ¸nh s¸ng) ®Ó ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh ph¸t triÓn m« nu«i cÊy theo ®Þnh h­íng. Thµnh c«ng cña ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro phô thuéc rÊt nhiÒu vµo ®iÒu kiÖn nu«i cÊy. Nhu cÇu dinh d­ìng cho sù sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn tèi ­u cña c¸c loµi lµ kh«ng gièng nhau, ngay c¶ gi÷a c¸c bé phËn trong cïng mét c¬ thÓ còng Ýt nhiÒu cã sù kh¸c nhau (Murashige vµ Skoog, 1962). Sù lùa chän m«i tr­êng nu«i cÊy, bao gåm c¶ chÊt l­îng vµ sè l­îng ho¸ chÊt sö dông ®ãng vai trß quyÕt ®Þnh ®èi víi b¶n th©n sù ph©n ho¸ vµ chiÒu h­íng ph©n ho¸ cña tÕ bµo. Cho ®Õn nay ®· cã nhiÒu lo¹i m«i tr­êng dinh d­ìng ®­îc t×m ra: M«i tr­êng Murashige vµ Skoog (1962), m«i tr­êng Linsmainer vµ Skoog (1963), m«i tr­êng Gamborg (1968), m«i tr­êng Knop (1974)... §©y lµ nh÷ng m«i tr­êng c¬ b¶n vµ sÏ ®­îc c¶i tiÕn thµnh nhiÒu lo¹i m«i tr­êng kh¸c nhau cho phï hîp víi mçi ®èi t­îng nghiªn cøu vµ môc ®Ých thÝ nghiÖm. Trong sè ®ã m«i tr­êng MS (Murashige vµ Skoog, 1962) ®­îc ®¸nh gi¸ lµ phï hîp nhÊt cho ®a sè c¸c loµi thùc vËt vµ chÝnh Murashige (1974) ®· dïng m«i tr­êng nµy ®Ó nu«i cÊy nhiÒu lo¹i c©y trång. Thµnh phÇn chñ yÕu cña tÊt c¶ c¸c lo¹i m«i tr­êng gåm nh÷ng nhãm chÊt sau: muèi kho¸ng ®a l­îng vµ vi l­îng (muèi chloride, nitrat, sulphat, phosphat vµ iodid cña Ca, Mg, K, Na, Fe, Mn, Zn vµ B), vitamin, nguån cacbon, yÕu tè sinh tr­ëng h÷u c¬ (axit amin, pepton), hormon sinh tr­ëng. §­êng lµ mét thµnh phÇn kh«ng thÓ thiÕu trong bÊt cø m«i tr­êng nu«i cÊy nµo. Nã ®­îc sö dông lµm nguån cacbon cung cÊp n¨ng l­îng chñ yÕu trong m«i tr­êng nu«i cÊy nhiÒu loµi thùc vËt (Hu et al., 1979). M« vµ tÕ bµo thùc vËt nu«i cÊy in vitro sèng chñ yÕu theo ph­¬ng thøc dÞ d­ìng, mÆc dï ë mét sè tr­êng hîp chóng cã thÓ sèng b¸n dÞ d­ìng nhê ¸nh s¸ng nh©n t¹o vµ lôc l¹p cã kh¶ n¨ng quang hîp. H¬n n÷a, ®­êng cßn ®ãng vai trß thÈm thÊu chÝnh cña m«i tr­êng. Vitamin cã vai trß xóc t¸c c¸c qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt diÔn ra trong tÕ bµo. HÇu hÕt c¸c m« nu«i cÊy ®Òu cã kh¶ n¨ng tæng hîp c¸c vitamin cÇn thiÕt nh­ng kh«ng ®Çy ®ñ vÒ sè l­îng, v× vËy ®Ó ®¹t ®­îc sù sinh tr­ëng tèi ­u ng­êi ta th­êng bæ sung mét sè vitamin nh­: thiamin(B1), axit nicotinic(PP), vitamin B5, piridoxin(B6). Trong ®ã B1 ®­îc coi lµ thiÕt yÕu ®èi víi sù sinh tr­ëng cña tÕ bµo thùc vËt (Weavaer R.J.,1972; Bhojwani vµ Razdan, 1983)[22]. Ngoµi ra cßn cã thÓ sö dông vitamin C vµ c¸c chÊt chèng oxy ho¸ kh¸c. Nång ®é sö dông vitamin th­êng tõ 0,1 – 1mg/l. §iÒu khiÓn t¸i sinh c©y hoµn chØnh tõ m« nu«i cÊy C¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng thùc vËt (phytohormon) lµ thµnh phÇn quan träng bËc nhÊt trong m«i tr­êng nu«i cÊy. Dùa vµo nh÷ng chÊt nµy, c¸c nhµ nghiªn cøu cã thÓ chñ ®éng ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i cña thùc vËt in vitro. Cã hai nhãm chÊt ®­îc sö dông réng r·i lµ auxin vµ cytokinin. Nhãm auxin gåm mét sè hîp chÊt cã chøa nh©n idol trong ph©n tö. Trong nu«i cÊy in vitro, auxin thóc ®Èy sinh tr­ëng cña mÉu do ho¹t ho¸ sù ph©n chia vµ gi·n në cña tÕ bµo, kÝch thÝch c¸c qu¸ tr×nh tæng hîp vµ trao ®æi chÊt, tham gia ®iÒu chØnh sù ph©n ho¸ cña rÔ, chåi...(Bhojwani and Razdan,1983)[32]. C¸c auxin ®Òu cã hiÖu qu¶ sinh lý ë nång ®é thÊp, th­êng ®­îc sö dông víi nång ®é tõ 10-1 – 10-6M tuú theo tõng chÊt, môc dÝch vµ ®èi t­îng nghiªn cøu.Auxin ®­îc thªm vµo m«i tr­êng nu«i cÊy sÏ kÕt hîp víi auxin néi sinh ®Ó ®iÒu khiÓn chiÒu h­íng vµ c­êng ®é c¸c qu¸ tr×nh sinh tr­ëng. Hµm l­îng auxin thÊp sÏ kÝch thÝch sù ph©n ho¸ rÔ, ng­îc l¹i ë hµm l­îng cao sÏ ph¸t ®éng sù t¹o m« sÑo. C¸c auxin th­êng ®­îc sö dông trong nu«i cÊy m« lµ IBA (idol butiric acid), NAA (a-naphtylacetic acid), 2,4-D (2,4 diclorophenoxy acetic acid), IAA (idol acetic acid). Cytokinin lµ nhãm phytohormon dÉn xuÊt cña adenin, cã vai trß sinh lý t­¬ng tù nhau. Cytokinin liªn quan chÆt chÏ víi ph©n bµo, duy tr× sù ._.