Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa huệ hương (Polianthes tuberosa L.)

giúp đỡ cho luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả Nguyễn Thị Y Thanh LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo, bạn bè, người thân và các cơ quan đơn vị. Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo đã trực tiếp giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học – Sinh học phân tử và công nghệ vi sinh đã chân thành đóng góp ý kiến quý báu giúp cho luận văn của tôi được hoàn thiện hơn. Đặc biệt tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Quang Thạch đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ công nhân viên Phòng Công nghệ sinh học, Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ - Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình Định đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả người thân, bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tác giả Nguyễn Thị Y Thanh MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MS : Murashige and Skoog, 1962. BA : benzyl adenin IBA : indol butyric acid α-NAA : α-naphtyl acetic acid 2,4-D : 2,4 diclorophenoxy acetic acid IAA : indol acetic acid ĐC : Đối chứng PSHT : Phát sinh hình thái CT : Công thức DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1. Ảnh hưởng HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu (sau 4 tuần nuôi cấy). 38 4.2. Ảnh hưởng kết hợp của HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu (sau 4 tuần nuôi cấy). 40 4.3. Ảnh hưởng của kinetin ở các nồng độ khác nhau đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy (sau 8 tuần nuôi cấy). 43 4.4. Ảnh hưởng của BA ở các nồng độ khác nhau đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy (sau 8 tuần nuôi cấy). 45 4.5. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và các auxin đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy (sau 8 tuần nuôi cấy). 49 4.6. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi. 53 4.7. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi (sau 6 tuần nuôi cấy). 56 4.8. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và α-NAA đến hệ số nhân và chiều cao chồi (sau 6 tuần nuôi cấy). 59 4.9. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IAA đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi (sau 6 tuần nuôi cấy). 62 4.10. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa bổ sung vào môi trường đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi 66 4.11. Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân và chiều cao chồi khi nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm (sau 6 tuần nuôi cấy). 69 4.12. Ảnh hưởng của BA và a-NAA đến hệ số nhân và chiều cao chồi khi nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm (sau 6 tuần). 72 4.13. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ và chất lượng rễ (sau 5 tuần) 76 4.14. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ và chất lượng rễ (sau 5 tuần) 79 4.15. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây huệ (sau 4 tuần) 83 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1. Cây hoa huệ hương 27 4.1. Hiệu quả khử trùng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau 39 4.2. Hiệu quả khử trùng của HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% ở các mức thời gian khác nhau 41 4.3. Ảnh hưởng của Kinetin ở các nồng độ khác nhau đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy 44 4.4. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 2mg/l kinetin 44 4.5. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 4mg/l BA 47 4.6. Ảnh hưởng của BA ở các nồng độ khác nhau đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy 47 4.7. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và các auxin đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. 50 4.8. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 0,25mg/l IBA + 4mg/l BA 51 4.9. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 0,25mg/l 2,4D + 4mg/l BA 51 4.10. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 0,25mg/l α-NAA + 4mg/l BA 51 4.11. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 0,25mg/l IAA + 4mg/l BA 51 4.12. Kết quả nhân nhanh chồi trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 0,25mg/l α-NAA + 2mg/l BA 54 4.13. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hệ số nhân chồi 55 4.14. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến chiều cao chồi tạo thành 55 4.15. Kết quả nhân nhanh trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 0,25mg/l IAA + 3mg/l BA 57 4.16. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA đến hệ số nhân chồi . 57 4.17. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA đến chiều cao chồi tạo thành 58 4.18. Kết quả nhân nhanh trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,5mg/l kinetin + 0,25mg/l α-NAA 60 4.19. Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin và α-NAA đến hệ số nhân chồi 61 4.20. Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin và α-NAA đến chiều cao chồi tạo thành 61 4.21. Kết quả nhân nhanh chồi trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 2,5mg/l kinetin + 0,25 mg/l IAA 63 4.22. Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin và IAA đến hệ số nhân chồi 64 4.23. Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin và IAA đến chiều cao chồi tạo thành 64 4.24. Kết quả nhân nhanh chồi trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 2mg/l BA + 0,25mg/l α-NAA +150ml/l nước dừa 67 4.25. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa bổ sung vào môi trường đến hệ số nhân chồi 67 4.26. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa bổ sung vào môi trường đến chiều cao chồi 68 4.27. Kết quả nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm trên môi trường MS + 30 g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 3mg/l BA 70 4.28. Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân khi nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm. 71 4.29. Ảnh hưởng của BA đến chiều cao chồi tạo thành khi nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm. 71 4.30. Kết quả nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm trên môi trường MS + 30 g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 3mg/l BA + 0,5mg/l a-NAA 73 4.31. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hệ số nhân khi nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm 74 4.32. Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến chiều cao chồi tạo thành khi nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm 74 4.33. Chồi đủ tiêu chuẩn đưa vào môi trường tạo cây hoàn chỉnh 75 4.34. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến số rễ trung bình /chồi 77 4.35. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến chiều dài trung bình của rễ 78 4.36. Cây con hoàn chỉnh trên môi trường MS + 30 g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 2g/l than hoạt tính 78 4.37. Cây con hoàn chỉnh trên môi trường MS + 30 g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1mg/l α-NAA 80 4.38. Ảnh hưởng của α-NAA đến số rễ trung bình của chồi. 81 4.39. Ảnh hưởng của α-NAA đến chiều dài trung bình của rễ. 81 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) là cây hoa cắt cành thuộc nhóm thân thảo, thích cường độ ánh sáng cao và cho hoa quanh năm. Hoa huệ được nhập vào nước ta từ rất lâu. Cây hoa huệ được trồng phổ biến tại vùng Nam Trung Bộ đem lại thu nhập khá cao cho người trồng và chính là cây xoá đói giảm nghèo cho vùng chuyên canh loài cây này. Hiện nay, việc canh tác cây huệ thường chủ yếu được nhân giống bằng kỹ thuật nhân giống truyền thống, chủ yếu là lấy củ trồng. Với phương pháp nhân giống này dễ lây lan các mầm bệnh có sẵn trong củ, đặc biệt là bệnh virus làm giảm năng suất và phẩm chất hoa, khiến cho giống hoa ngày càng thoái hoá. Trong những năm gần đây, bệnh hại trên cây hoa huệ xuất hiện nhiều, đặc biệt trong đó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông. Tác nhân gây bệnh hiện vẫn chưa xác định được. Bệnh xuất hiện trên diện rộng làm ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất hoa. Bệnh không làm cây chết ngay nhưng làm cho chồi, củ và hoa kém phát triển, làm thất thu nguồn thu nhập của nông dân. Các triệu chứng bệnh do virus được mô tả bởi Horner và Person (1988), Chen và Chang (1998) gần giống các biểu hiện của cây huệ ở Nam Trung Bộ. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tạo nguồn giống sạch bệnh cung cấp cho nhân dân? Sự phát triển của công nghệ sinh học trong lĩnh vực chọn giống đã giúp các nhà chọn giống rất nhiều trong việc giải quyết vấn đề trên. Phương pháp nhân giống in vitro với rất nhiều ưu điểm, tạo được cây con trẻ hoá và sạch bệnh nên tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao, khắc phục được nhược điểm của phương pháp nhân giống truyền thống, khôi phục lại các phẩm chất vốn có của giống. Đồng thời hệ số nhân của phương pháp nhân giống này cao đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao, ổn định đáp ứng nhu cầu sản xuất trên quy mô rộng. Cho đến nay kĩ thuật nuôi cấy mô đã được nghiên cứu ứng dụng rất có hiệu quả trong việc nhân giống hàng loạt các loại cây trồng tạo ngân hàng cây giống sạch bệnh, khỏe mạnh cho năng suất cao, phẩm chất tốt cung cấp cho sản xuất. Cây hoa huệ là đối tượng mới của sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô ở nước ta, cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu nào được công bố, chỉ có một thông báo khoa học của các tác giả trường Đại học Cần Thơ. Năm 2007, xuất phát từ yêu cầu bức xúc của thực tiễn, nhằm khắc phục hiện tượng chai bông trên cây hoa huệ và yêu cầu nhân nhanh giống huệ hương, một giống huệ quý mang lại hiệu quả cao cho nông dân, tỉnh Bình Định đã có chủ trương xây dựng quy trình nhân giống cây hoa huệ bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào. Trên cơ sở đó, Bộ Khoa học và Công nghệ giao cho tỉnh Bình Định dự án xây dựng quy trình nhân giống cây hoa huệ, đặc biệt là cây huệ hương. Chính vì thế, Trung tâm Ứng dụng tiến bộ Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình Định (Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình Định) đã bước đầu tiến hành nghiên cứu thử nghiệm nhân nhanh giống huệ này bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. Có thể nói, việc nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây huệ là một yêu cầu bức xúc của thực tiễn, đề tài được nghiên cứu sẽ có nhiều phát hiện mới về khoa học. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa huệ hương (Polianthes tuberosa L.)” 1.2. Mục đích, yêu cầu 1.2.1. Mục đích Xác định được những khâu cơ bản trong quy trình nhân giống cây hoa huệ bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào, làm cơ sở cho việc hình thành quy trình nhân giống in vitro cây hoa huệ hương, góp phần giải quyết những bức xúc của thực tiễn sản xuất hoa tỉnh Bình Định. 1.2.2. Yêu cầu Xác định được phương pháp khử trùng mẫu thích hợp. Xác định được môi trường nuôi cấy phù hợp nhất cho các giai đoạn khởi động mẫu, nhân nhanh, tạo rễ và tạo cây hoàn chỉnh trong nuôi cấy in vitro. Xác định được giá thể ra cây nuôi cấy thích hợp. Bước đầu đề xuất quy trình nhân giống cây huệ hương in vitro. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. 1.3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về nhân giống vô tính cây hoa huệ hương bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào, góp phần làm phong phú hơn cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô cây hoa. Đề tài đã đưa ra được các minh chứng về tác động của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cấy, tác động của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng phát sinh hình thái, hệ số nhân nhanh chồi, nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm, tác động của chất điều tiết sinh trưởng và than hoạt tính đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh, tác động của giá thể đến khả năng sống và sinh trưởng của cây in vitro. Các kết quả nghiên cứu của đề tài có thể được sử dụng để giảng dạy và nghiên cứu trong nuôi cấy mô, tế bào cây hoa. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ giúp chúng tôi đề xuất một quy trình nhân giống cây huệ hương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào, góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lượng tốt, khắc phục được những hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống. Kết quả nghiên cứu được ứng dụng vào sản xuất sẽ góp phần phục tráng giống và nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành sản xuất cây hoa huệ. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về cây hoa huệ 2.1.1. Nguồn gốc Cây hoa huệ có tên khoa học là Polianthes tuberosa L. Đây là loài hoa cắt cành, thuộc nhóm cây thân thảo, cho hoa quanh năm, nở hoa vào ban đêm có nguồn gốc chủ yếu từ Mexico và hiện đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới như: Singapore, Indonexia, Iran, Hawaii...[51]. Loài cây này đã được du nhập vào nước ta từ rất lâu và được trồng phổ biến tại một số tỉnh thuộc vùng Nam Trung Bộ và Nam Bộ như: Bình Định, Khánh Hòa, Tiền Giang, Cần Thơ… Hiện nay nó đang là cây trồng chính của người dân nơi đây [18]. 2.1.2. Phân loại Trong hệ thống phân loại thực vật học [5], cây hoa huệ là cây thuộc: - Giới: Cây trồng. - Lớp: Một lá mầm (Monocotylendon). - Bộ: Hành (Liliadae). - Họ: Thủy tiên (Amaryllidaceae). Theo kết quả thống kê trên thế giới thì hiện tại ở Mexico có khoảng 12 loài tuberosa [51]. Riêng ở Việt Nam hiện nay, dựa vào đặc điểm của hoa thì chia thành 2 giống, chủ yếu là huệ đơn và huệ kép: - Huệ đơn hay còn gọi là huệ xẻ: cây thấp, mảnh khảnh, cánh hoa nhỏ, bông chỉ có một lớp cánh nhưng hương thơm rất đậm. - Huệ kép còn gọi là huệ tứ diện: cây cao, hoa dày và bông dài hơn huệ đơn nhưng hương thơm kém hơn [52]. 2.1.3. Đặc điểm thực vật học 2.1.3.1. Thân Huệ thuộc cây thân thảo, thân hành hay còn gọi là thân giả được kết bởi các bẹ lá xếp chồng lên nhau, bẹ lá trước xếp phủ lên bẹ lá sau. Thân thẳng đứng không phân nhánh vươn lên thành ngồng hoa cao khoảng 0,8 -1m [9]. 2.1.3.2. Lá Cây hoa huệ có lá đơn mọc quanh gốc, xanh và dài, cuống lá góc rộng và to thành hình như cái bao bao lấy củ, giữa phiến lá và bẹ lá không phân biệt rõ ràng. Chiều dài lá khoảng 20-30cm, bề rộng của lá từ 0,5-1cm [9]. 2.1.3.3. Hoa Cây hoa huệ là cây cho hoa quanh năm, nhưng hoa nở chủ yếu vào mùa hè còn mùa đông tỷ lệ ra hoa ít, hoa nhỏ và bông ngắn hơn. Hoa huệ có màu trắng, bao hoa hình phễu, thường tỏa hương vào ban đêm. Hoa có vị ngọt, hơi chát, thơm, không độc. Cành hoa thường dài, ở nách mỗi lá bắc có 2 hoa màu trắng, có tràng đơn hay tràng kép, nhị gắn giữa ống, bầu dưới 3 ô [5], [53]. 2.1.3.4. Củ và rễ Cây huệ có bộ rễ chùm phát triển mạnh, rễ phân bố chủ yếu ở lớp đất mặt 0-15cm. Có 2 loại rễ: rễ mọc từ củ mẹ ban đầu (củ mẹ), gọi là rễ sơ cấp và rễ mọc từ củ con do củ mẹ đẻ ra gọi là rễ thứ cấp, củ huệ thực chất chính là thân ngầm của cây huệ [9]. 2.1.4. Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa huệ 2.1.4.1. Nhiệt độ Nhiệt độ là yếu tố vật lý có ảnh hưởng lớn đến thời gian sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng phân hóa hoa của cây hoa huệ. Cây hoa huệ là cây ưa nhiệt độ mát mẻ (20-250C), nhưng chịu nóng tốt, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, cho hoa tốt vào mùa hè. Tuy vậy, khi nhiệt độ mùa hè quá cao kéo dài sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới khả năng sinh trưởng của cây, chất lượng hoa và nhất là sâu bệnh phá hại mạnh. Trước khi phân hóa hoa và lúc cây có 5-6 lá cần nhiệt độ mát mẻ (15-220C) nếu không tỷ lệ nở hoa sẽ rất thấp và chất lượng hoa kém [9]. 2.1.4.2. Ánh sáng Cây huệ là cây ưa ánh sáng mạnh. Giai đoạn đầu sau khi trồng, cây sống chủ yếu nhờ vào nguồn dinh dưỡng từ củ. Khi cây ra lá, cây sử dụng chất dinh dưỡng từ quá trình quang hợp. Trong thời kỳ phân hóa mầm hoa nếu không cung cấp đủ ánh sáng thì tỷ lệ ra hoa thấp, hoa nhỏ… Ngoài ra nếu thiếu ánh sáng cây hoa huệ rất dễ bị nhiễm bệnh. Trong điều kiện ngày ngắn, ánh sáng yếu thì ảnh hưởng mạnh đến sự sinh trưởng phát triển của cây. Cường độ ánh sáng cũng là yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phân hóa mầm hoa. Nếu cường độ chiếu sáng dưới 3500lux thì cường độ quang hợp và sự thoát hơi nước giảm, cây mọc vống, cành lá yếu. Do đó khi trồng ở vụ đông cần đảm bảo chế độ chiếu sáng phù hợp để tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân hóa mầm hoa, hoa tự dài đồng thời tăng chất lượng hoa. Số giờ chiếu sáng thích hợp cho cây hoa huệ sinh trưởng và phát triển tốt từ 12-16 giờ và cường độ ánh sáng khoảng 6000lux [9]. 2.1.4.3. Nước Cây hoa huệ là cây rễ củ nên khi nảy mầm cũng như quá trình sinh trưởng cần phải có đủ nước. Các giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì có nhu cầu về nước khác nhau. Sau khi trồng vài ngày, rễ mầm nhú ra và phát triển thì yêu cầu đất xung quanh củ phải đủ ẩm, vì vậy trước khi trồng nên tưới nước. Khi cây mọc nếu đất quá khô thì phải tưới nước ngay. Trong suốt thời kỳ sinh trưởng, cây hoa huệ cần rất nhiều nước, đặc biệt là ở giai đoạn có 3-7 lá, đây là thời kỳ cây có nhu cầu về nước lớn, nếu thiếu nước cây sẽ sinh trưởng chậm ảnh hưởng đến khả năng phân hóa của hoa. 2.1.4.4. Đất Cây hoa huệ có thể trồng trên bất cứ loại đất nào, tuy vậy cây chỉ sinh trưởng tốt, cho hoa đẹp trên loại đất hơi kiềm (pH = 6 -7), có cấu trúc mịn, giữ ẩm tốt. Tuy vậy, huệ không thích hợp nơi đất quá trũng, chua hay cớm bóng [20]. Cây hoa huệ có thể trồng trên các loại đất có thành phần cơ giới sau: - Đất cát pha có độ tơi xốp cao, độ hổng lớn, thoáng khí, ngấm nước tốt nhưng có độ phì kém. Do đó, khi trồng hoa huệ trên loại đất này cần phải bón nhiều phân hữu cơ để bổ sung dinh dưỡng cho cây. - Đất thịt nhẹ, thoát nước tốt, giàu dinh dưỡng là loại đất trồng thích hợp đối với cây hoa huệ. Nếu đất quá ẩm, rễ rất dễ bị thối, vì thế vào mùa mưa cần chống úng, tháo nước kịp thời không để ruộng bị ngập úng. Mặt khác hoa huệ cũng là cây rất mẫn cảm với các loại muối kim loại nặng. Đặc biệt là loại đất có hàm lượng chì cao, rễ cây sinh trưởng kém, cây phát triển chậm và khả năng ra hoa kém. Chính vì vậy trước khi trồng huệ cần chú ý đến các biện pháp canh tác đất [9]. 2.1.5. Kỹ thuật trồng và chăm sóc Theo Đặng Phương Trâm (2005) [19] thì trong quá trình trồng và chăm sóc cây huệ cần chú ý các khâu sau: 2.1.5.1. Chuẩn bị giống Theo phương pháp canh tác truyền thống, cây huệ trồng bằng củ, vì vậy khi cây có nhiều lá úa vàng thì bới củ, tách nhẹ nhàng từng củ, chọn những củ có kích thước đạt tiêu chuẩn sau đó cắt bỏ lá và rễ tiến hành phơi nắng 2-3 ngày cho lá héo rồi đem bảo quản nơi thoáng mát, cao ráo, sau 2-3 tháng có thể đem trồng trở lại. Trong thời gian bảo quản nên thường xuyên kiểm tra tránh hiện tượng củ bị thối. Trong những năm gần đây, xuất hiện bệnh chai bông trên diện rộng, vì vậy để phòng trừ bệnh chai bông trên cây huệ cần tiến hành các bước sau: - Không sử dụng củ bị nhiễm bệnh hoặc lấy củ từ những ruộng đã bị nhiễm bệnh trước đó làm củ giống. - Phơi củ trong vòng 1-1,5 tháng trước khi đem ra trồng. - Nên thay đổi chân đất sau mỗi vụ trồng hoặc luân canh cây huệ với một loại cây trồng khác. - Khi phát hiện thấy có triệu chứng bệnh cần loại bỏ cây bệnh ra khỏi ruộng, phơi khô và đốt bỏ. Khi không có củ giống sạch bệnh, có thể chọn củ ở cây không có triệu chứng bệnh và tiến hành phơi nắng kỹ từ 1-1,5 tháng, sau đó xử lý củ với nước nóng khoảng 56-570C. Quy trình xử lý củ huệ bằng nước nóng để phòng trừ bệnh chai bông gồm các bước sau: - Bước 1: Chuẩn bị củ huệ để xử lý. Sau khi thu hoạch, đem phơi củ trong 1-1,5 tháng, chọn những củ có đường kính từ 3cm trở lên để xử lý. - Bước 2: Xử lý củ huệ bằng nước nóng Đổ nước nóng và nước lạnh vào trong một thùng nhựa với tỷ lệ 6:5, rồi điều chỉnh để nhiệt độ nước trong thùng khoảng 56-570C thì bắt đầu cho củ vào nước. Lượng nước xử lý cần gấp 6-7 lần lượng củ xử lý. Sau đó đậy nắp thùng khoảng 15 phút và lại chỉnh cho nước trở lại nhiệt độ 56-570C bằng cách đổ thêm một ít nước sôi từ từ khuấy đều, và ngâm củ trong thùng đậy kín trong 15 phút nữa. - Bước 3: Sau khi xử lý xong, củ được rải đều và phơi khô trong 2 ngày sau rồi đem trồng ra ruộng. 2.1.5.2. Chuẩn bị đất Nên chọn nơi trảng nắng, luống trồng lên liếp rộng khoảng 1,2m và sâu 0,5m để có thể giữ nước tốt. Luống đất nên bố trí dọc theo hướng mặt trời để cây nhận ánh sáng tốt và đồng đều. Trước khi trồng nên bón phân lót và phun xịt các loại thuốc diệt nấm và mầm bệnh. 2.1.5.3. Chăm sóc Trong canh tác cây hoa huệ yêu cầu về nước là rất quan trọng, phải thường xuyên tưới nước đồng thời phải xới đất và làm cỏ giúp cho bộ rễ phát triển tốt. Phân bón thường sử dụng để bón cho cây là hỗn hợp (Urea, lân và Kali), sau khi trồng được khoảng 2-3 năm cây huệ bắt đầu bị thoái hóa: sinh trưởng chậm, cho hoa ít và kém chất lượng. Do đó phải nhổ lên phân loại củ và trồng lại trên một diện tích khác. Trong thời gian trồng và thu hoạch cần tiến hành trừ cỏ, xới đất, bón phân, tưới nước, phun thuốc..., thường xuyên để tránh lây lan nguồn sâu bệnh hại. Khi trừ cỏ phải tiến hành theo nguyên tắc trừ sớm, trừ khi cỏ còn non và trừ sạch, có thể trừ cỏ bằng tay hoặc bằng thuốc. Trong quá trình trồng, nên bón phân với số lượng ít và chia thành nhiều đợt như bón lót, bón thúc. Ngoài cách bón vào đất còn có thể phun lên lá để bổ sung dinh dưỡng, hỗ trợ cho quá trình ra hoa và chống rụng nụ hoa. Trong thời kỳ phân hóa mầm hoa cần bón thêm phân đạm, khi ra nụ và sau khi ra hoa cần bón thêm lân và kali [9]. 2.1.6. Vấn đề sâu bệnh trên cây huệ Trên cây hoa huệ, sâu thường gặp là rệp sáp, nhện đỏ và nhất là tuyến trùng. Bệnh gây hại trên cây huệ được chia thành hai nhóm: - Nhóm bệnh không truyền nhiễm, do ngoại cảnh không phù hợp thường gặp nhất là thối xám, thối gốc, đốm lá, gỉ sắt... có thể phòng trị bằng các loại thuốc hóa học. - Nhóm bệnh truyền nhiễm chủ yếu do vi sinh vật ký sinh gây ra bao gồm: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm, mycoplasma, virus... thường rất khó trị, nhất là bệnh do virus gây ra do rất dễ lây lan và phát tán thành dịch, gây hại nghiêm trọng và truyền từ đời này sang đời khác, đặc biệt là ở nhóm cây nhân giống vô tính (bằng củ) như cây huệ [8]. Virus không thể phòng chống hay tiêu diệt bằng hóa chất như vi khuẩn, nấm và sâu bệnh, cách duy nhất để loại bỏ virus là phải tách chúng ra khỏi cây bị bệnh, trả lại cho cây cuộc sống bình thường khỏe mạnh. Vì vậy biện pháp làm sạch virus phải luôn được kết hợp với biện pháp duy trì tính sạch bệnh [3]. Sau khi trồng khoảng 1 tháng, ở cây hoa huệ thường bị nhện đỏ phá hại nặng trên lá, từ 3-4 tháng trở đi cây dễ bị rệp sáp phá hại nên có thể phòng trị bằng các loại thuốc sau: Nissorun, Kelthan 20 EC, Comite, Basudin 10H. Khoảng tháng 9-10, khi trời mưa kéo dài huệ dễ bị úng thối lá, thối củ thì có thể khắc phục hiện tượng này bằng các loại thuốc như: Anuil, Topsin, Ridomol...[52]. 2.1.7. Giá trị kinh tế và sử dụng của cây huệ Với đặc điểm sinh thái dễ thích nghi với vùng khí hậu nhiệt đới như ở nước ta đồng thời yêu cầu trồng và chăm sóc không quá khắt khe nên huệ được trồng khá phổ biến và đem lại thu nhập rất cao cho người dân. Trong những năm gần đây, cây hoa huệ đem lại thu nhập cao cho người dân các tỉnh phía Nam như Tiền Giang, Đồng Tháp... Đặc biệt, tại các tỉnh Nam Trung Bộ như Bình Định, Khánh Hòa, từ khi người dân mở rộng diện tích và nâng cao kỹ thuật canh tác, cây hoa huệ đã trở thành cây trồng chính, đem lại thu nhập cao và trở thành cây xóa đói giảm nghèo. Hiện nay, thu nhập từ cây hoa huệ ở đồng bằng sông Cửu Long bình quân từ 150-200 triệu/ha và ở Nam Trung bộ là 80-150 triệu/ha. Ngoài giá trị sử dụng thông thường như trên, gần đây người ta còn sử dụng một số bộ phận của cây này làm thuốc chữa bệnh và chế ra các loại dầu thơm [54]. Hiện nay, một số nghiên cứu về loài hoa này đã tìm ra một số thành phần hoá học có liên quan đến việc sản xuất ra các loại dầu thơm, nước hoa quý,... được chiết xuất từ các bộ phận như hoa và sáp hoa... trong đó loại tinh dầu tuyệt đối thu được khi chiết xuất từ hoa như alcol benzil chiếm 0,7%, benzoat metil (4,5%), antranilat metil (8,0%), metilisoeugenol (10%), benzoat benzil (24%). Ngoài ra, n-alkan chiếm tỷ lệ không nhỏ tới 42% trong sáp hoa cũng là một thành phần hoá học quan trọng trong việc chế xuất các loại nước hoa, dầu thơm [54]. Bên cạnh đó, cây hoa huệ còn có công dụng trong y học, bộ phận được sử dụng là củ huệ. Trong tinh dầu củ huệ có chứa thành phần sapogenin, sapogenin bao gồm hecogenin và tigogenin là loại hợp chất được chiết xuất để bào chế ra một số loại thuốc quý. Từ lâu trong dân gian người dân đã biết sử dụng cây hoa huệ để làm thuốc chữa một số bệnh đơn giản. Ở Ấn Độ người ta đã dùng củ phơi khô, tán thành bột để làm thuốc trị liệu, hoặc ở Vũng Tàu người dân nơi đây đã dùng củ huệ để chữa bệnh sốt rét. Ở một số nơi, dân gian còn dùng củ huệ để chữa bệnh hóc xương bằng cách đem giã nát củ, vắt lấy nước rồi nhỏ vào họng của người bị hóc xương sau 1-2 phút sẽ khỏi [54]. 2.2. Tình hình sản xuất hoa huệ trong nước Du nhập vào nước ta từ lâu và được trồng rộng rãi trong cả nước, nhưng cây huệ được trồng phổ biến hơn cả ở Miền Nam và Nam Trung Bộ. Trong những năm gần đây, diện tích canh tác cây hoa huệ ngày càng được mở rộng và đem lại thu nhập cao cho người trồng. Theo thống kê hiện nay, trên địa bàn các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long có diện tích trồng huệ lớn hơn cả. Trung bình các tỉnh có khoảng 500-1000 ha canh tác cây hoa huệ, khi thu hoạch có thể cho thu nhập từ 150-200 triệu đồng/ha [55]. Do cây này dễ trồng, chi phí đầu tư thấp, ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố thời tiết và đặc biệt hơn là hoa huệ cho thu hoạch tới 14 tháng/vụ nên trong điều kiện thuận lợi thường cho thu nhập cao. Trong những năm gần đây, trên địa bàn các tỉnh vùng Nam Trung bộ bắt đầu đẩy mạnh canh tác cây hoa huệ, đặc biệt là ở Bình Định và Khánh Hòa. Ở Bình Định, cây hoa huệ dần trở thành cây trồng chính. Theo đánh giá của người dân nơi đây, trong điều kiện thuận lợi mỗi ha bình quân cho thu nhập trên 80-120 triệu đồng [53]. Mặc dù vậy, hiện nay việc canh tác cây huệ đang gặp nhiều khó khăn, do bị sâu bệnh hại phá hoại nhiều, trong đó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông. Hiện nay, bệnh phá hoại rất mạnh, có thể làm giảm đến 60% năng suất cây trồng. Chính vì vậy, năng suất huệ trên nhiều vùng có xu hướng không ổn định và chất lượng hoa thì giảm đáng kể. Hiện nay, bệnh chai bông đang là nguyên nhân chính làm giảm năng suất và phẩm chất hoa trên các vùng chuyên canh, đặc biệt ở Nam Trung Bộ và Nam Bộ. Triệu chứng bệnh thể hiện: - Trên lá: trước khi ra hoa, trên lá của cây con bị nhiễm bệnh thường xuất hiện các đường gân sọc màu nâu đỏ kéo dài từ bẹ lá đến chóp lá, lá có thể bị xoắn. - Trên bông: nếu bị nhiễm nặng, bông sẽ bị chai không trỗ được hoặc bông bị đen thui và khô, bẹ lá hầu như bị thâm màu nâu đỏ. - Trên thân: khi bị nhiễm bệnh, thân bị lùn, vỏ thân có những gai sần dày đặc. Tác nhân gây bệnh hiện nay vẫn chưa được làm rõ, tuy nhiên các triệu chứng bệnh thể hiện giống với những mô tả các triệu chứng bệnh do virus của Horner và Person (1988), Chen và Chang (1998) [28], [32]. Theo phương pháp nhân giống truyền thống, đối với huệ, nguồn vật liệu ban đầu để sản xuất hoa thương phẩm là củ giống, chất lượng củ giống đóng vai trò quan trọng, nó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và chất lượng của hoa sau này. Củ huệ tái sinh theo phương pháp thông thường dựa trên nguyên lý chung là ở phía trong các nách lá có một chồi ngủ (chồi nách), các chồi này khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành chồi bên. Nhìn chung, phương pháp này đơn giản, dễ làm và chi phí đầu tư không cao nhưng có rất nhiều nhược điểm như: hệ số nhân thấp, thường làm thoái hóa giống, gây nhiễm bệnh hàng loạt ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng hoa. 2.3. Nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào. Là phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng và tái sinh chúng thành cây con. Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào là phương pháp mới bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống truyền thống nhiều kỹ thuật tiến bộ, có thể khắc phục được những hạn chế của các phương pháp nhân giống truyền thống. 2.3.1. Lịch sử nuôi cấy mô, tế bào thực vật Năm 1838, trên cơ sở những nghiên cứu độc lập, hai nhà bác học người Đức là Schleiden và Schwamn cùng khởi xướng học thuyết tế bào. Học thuyết này cho rằng tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của sinh vật, vì vậy có khả năng tồn tại độc lập. Gottlibe Haberlandt là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật vào năm 1902 để chứng minh học thuyết về tính toàn năng của tế bào. Theo ông mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể nào đều mang toàn bộ hệ thống di truyền cần thiết và đầy đủ thông tin của sinh vật đó, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh. Ông tiến hành thí nghiệm với tế bào khí khổng và các tế bào đã được biệt hoá về chức năng khác nhưng không thành công. Điều đó đã giảm sự tin tưởng của các nhà khoa học đối với phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong thời gian dài. Đến năm 1922 học trò của Gottlibe Haberlandt là Kotte và Robbinss đã làm lại thí nghiệm của ông. Họ đã lấy đỉnh sinh trưởng của rễ cây hòa thảo nuôi cấy trong môi trường có khoáng, đường, đầu rễ đã sinh trưởng mạnh và tạo ra hệ rễ nhỏ và cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh trưởng chỉ tồn tại trong một thời gian mặc dù chuyển sang môi trường mới. Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 trong lịch sử nuôi cấy mô, tế bào thực vật khi White đã nuôi cấy thành công đầu tiên rễ cà chua trên môi trường lỏng có chứa đường, muối khoáng, dịch chiết nấm men. Các thí nghiệm tiếp theo ông thay thế dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 vitamin nhóm B: thiamin (B1), nicotinic acid (B3), pyridioxin (B6). Sau đó ít lâu Went và Thimann tìm ra chất kích thích sinh trưởng đầu tiên là IAA. Năm năm sau Gautheret đã thông báo về sự tái sinh của cà rốt, đây cũng là lần đầu tiên sự phát triển của mô sẹo không bị giới hạn. Bằng cách thêm IAA vào môi trường nuôi cấy, ông có thể kích thích sự phát triển của mô đã biệt hoá trên vết cắt của bề mặt mẫu cấy vô trùng. Sau này người ta mới thấy rằng callus có thể trực tiếp nuôi cấy vô thời hạn. Đến năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt. Trong thời gian này nhiều chất sinh trưởng thuộc nhóm auxin được tổng hợp như nap._.hthylacetic acid (NAA), 2,4 – Diclophenoxyacetic acid (2,4D). Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4D đã giúp tạo mô sẹo gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật trước đó khó nuôi cấy. Năm 1955, Miller và Skoog đã xác định vai trò của chất kích thích sinh trưởng là 6 – Furfuryl aminopurin (kinein). Việc phát hiện ra chất kích thích sinh trưởng, vitamin và nước dừa là những bước tiến quan trọng trong giai đoạn thứ hai. Năm 1957, Miller và Skoog công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ auxin/kinetin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan, tỷ lệ auxin/kinetin thấp, mô sẹo có khuynh hướng tạo chồi, ngược lại tỷ lệ auxin/kinetin tăng, mô sẹo có khuynh hướng tạo rễ. Hiện nay, những kết quả này cũng được quan sát thấy trên nhiều loại cây khác nhau và đóng góp nhiều vào việc điều khiển quá trình sinh trưởng, phát triển và phát sinh các cơ quan của mô, tế bào trong nuôi cấy. Thành công của Miller và Skoog đã mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật. Những thành công trên là cơ sở bùng nổ ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật trong sản xuất. Morel và Martin đã phát triển kỷ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo giống sạch bệnh ở khoai tây và hoa lan. Chính hai nhà khoa học này đã mở đầu cho một hướng mới của nuôi cấy tế bào thực vật, đó là vi nhân giống. Từ những năm 1960, ngoài các hướng trên, nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần được phát triển mạnh. Các kỷ thuật lai soma bằng dung hợp tế bào trần và kỷ thuật chuyển gen được phát triển và thu được những thành tựu đáng kể. Chúng ta đang bước vào giai đoạn thứ 4 của nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Đó là giai đoạn nuôi cấy mô, tế bào được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. 2.3.2. Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro là học thuyết về tính toàn năng (totipotence) của tế bào. Theo Haberlandt G. (1902), nhà thực vật người Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh [24]. Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên qui mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn (Murashige, 1980) [41]. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là kết quả của các quá trình phân hóa và phản phân hóa. Tất cả các tế bào trong các cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hóa để đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hóa tế bào. Còn quá trình phản phân hóa thì ngược lại với quá trình phân hóa, có nghĩa là tế bào đã phân hóa thành mô chức năng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia. Tế bào dãn Phân hóa tế bào Phản phân hóa tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hóa Các quá trình trên có thể tóm tắt như sau: Ví dụ như khi nuôi cấy mảnh lá hay đốt thân cây thuốc lá, ở điều kiện môi trường thích hợp, các tế bào đã phân hóa của lá, đốt thân sẽ phản phân hóa, phân chia trở lại thành mô sẹo, không còn là tế bào có chức năng như tế bào lá, đốt thân nữa. Nếu chuyển sang môi trường khác thì tùy theo thành phần môi trường mà các tế bào mô sẹo có thể phân hóa theo các hướng khác nhau (hình thành rễ, chồi hay cây hoàn chỉnh...). Bản chất của quá trình này là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Trong quá trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số gen nhất định được hoạt hóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi nằm trong khối mô bình thường, tế bào luôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh. Khi tế bào được tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế bào xung quanh không còn nữa thì các gen được hoạt hóa và quá trình phân hóa sẽ xảy ra theo một chương trình định sẵn [16]. 2.3.3. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp. Sau đây là những ưu điểm chính: - Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao. - Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc. - Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao. - Tạo được cây có genotip mới (đa bội, đơn bội). - Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen. - Có khả năng sản xuất quanh năm. - Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém. - Hệ số nhân giống cực kỳ cao (thường đạt được ở loài cây khác nhau trong phạm vi từ 36-1012/năm), rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà [3]. Trong công tác giống cây trồng, vấn đề được quan tâm hàng đầu là chất lượng và số lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo ra được những giống cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và Cornel (1945) [36] đã chứng minh được rằng, nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel và Martin, 1952) [37]. Nguyên nhân của hiện tượng này là: - Đỉnh sinh trưởng không có hệ mô dẫn, làm cho virus và vi sinh vật không có khả năng thâm nhập. - Đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin khá cao, auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus. - Quá trình phân chia của tế bào phôi sinh (ở đỉnh sinh trưởng) không kéo theo sự phân chia của virus. Về phương diện hệ số nhân, nhân giống in vitro là phương pháp không gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Chỉ tính riêng lĩnh vực true-to-type, nuôi cấy in vitro có thể coi là một cuộc đại cách mạng về hệ số nhân. Thí dụ: sử dụng chồi nách để nhân có thể tạo ra hàng chục vạn cây D.fLoribunda trong vòng một năm (Chaturvedi, Sinha, 1979) [27], (Phạm Văn Hiển và cs, 1988) [7] hay 26 vạn cây cam thảo trong 5 tháng (Shah, Dalal, 1980) [43] từ một lát cắt ban đầu. Thông thường một cây D.foLoribunda chỉ tạo ra 8-10 cây trong một năm, và cam thảo chỉ cho 5-7 cây nếu nhân giống bằng cành. Ở Việt Nam, Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số nhân 532 trong vòng một năm đối với cây khoai tây bằng phương pháp này [13]. Đặc biệt, cây cọ dầu thường phải mất 10-15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới rất khó khăn [23]. Bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Staricky, 1970) [49]. Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác (Nickell, 1973) [44]. Ngoài ra, phương pháp này còn có những bất lợi sau: - Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao nhưng cây con có kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm. - Cây có thể có những đặc tính không mong muốn. - Khả năng tạo đột biến tăng. - Khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền callus hay huyền phù tế bào nhiều lần. - Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt. Tuy vậy phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng rãi để phục vụ những mục đích sau: - Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác chọn giống. - Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây cảnh và cây dược liệu thuộc nhóm cây thân thảo. - Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quí hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm thân gỗ. - Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus. - Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài giao phấn trong ngân hàng gen. 2.3.4. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro Kỹ thuật nuôi cấy in vitro có thể chia thành các bước sau: + Lựa chọn đối tượng (cây trồng, giống, bộ phận cây) thích hợp Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy mô, tế bào thực vật có thể là bất cứ bộ phận nào của cây: các đoạn của rễ, thân, các phần của lá (cuống lá, phiến lá...), các cấu trúc của phôi như lá mầm, trụ trên, trụ dưới lá mầm, hạt phấn, noãn... thậm chí cả mẩu thân ngầm hay cơ quan dự trữ dưới mặt đất (củ, căn hành...) cũng được dùng cho nuôi cấy [23]. + Khử trùng mẫu và tiến hành nuôi cấy Nguyên liệu để nuôi cấy in vitro được lựa chọn từ những cá thể ưu tú của loài, khỏe và sạch bệnh, nhưng ít nhiều đều có nhiễm vi sinh vật và nấm tùy thuộc vào sự tiếp xúc của chúng với môi trường xung quanh. Có một số bộ phận như phôi trong hạt, mô trong quả, dòng lúa non... ít bị nhiễm vi sinh vật hơn các bộ phận khác, ngược lại các bộ phận nằm dưới mặt đất như rễ, củ, thân ngầm, có lượng vi khuẩn và nấm rất cao. Phương pháp thông dụng nhất hiện nay để loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi vật liệu nuôi cấy là sử dụng các hóa chất có hoạt tính diệt khuẩn và nấm [24]. Khả năng tiêu diệt nấm và vi sinh vật của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy. Để làm tăng hiệu quả, người ta thường nhúng mẫu vào ethanol 70-80% trong 30 giây, sau đó mới xử lý bằng dụng dịch diệt khuẩn. Đối với những mẫu có bề mặt được bao phủ lớp sáp, muốn đạt được kết quả tốt nhất cần cho thêm vào dung dịch khử trùng một vài giọt Tween 20, Tween 80 hay teapol... vì các chất này làm tăng tính bám dính của hóa chất khử trùng. Với các mẫu quá bẩn phải rửa kỹ bằng nước xà phòng và để dưới vòi nước chảy từ 20 đến 30 phút sẽ có tác dụng làm giảm đáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy (Narayanswamy S., 1997) [42]. Tác nhân khử trùng, ngoài tác dụng diệt vi sinh vật còn ảnh hưởng đến mô cấy vì vậy việc lựa chọn loại hóa chất phải căn cứ vào mức độ nhiễm khuẩn và độ mẫn cảm của từng mẫu. Trong số các hóa chất hay được sử dụng để khử trùng thì canxi hypoclorit và natri hypoclorit là hay được sử dụng hơn cả vì có độc tính thấp đối với mô được xử lý, không gây ức chế sinh trưởng và hiệu quả diệt khuẩn tốt. Nồng độ của canxi hypoclorit và natri hypoclorit tương ứng thường là 5-15% và 0,5-2% trong thời gian 15-30 phút. Tuy nhiên, những chất này không bền nên trong thực tế HgCl2 cũng hay được dùng để thay thế. + Xác định điều kiện nuôi cấy (môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng) để điều khiển quá trình phát triển mô nuôi cấy theo định hướng. Thành công của phương pháp nuôi cấy in vitro phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy. Nhu cầu dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu của các loài là không giống nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một cơ thể cũng ít nhiều khác nhau (Murashige và Skoog, 1962) [39]. Sự lựa chọn môi trường nuôi cấy bao gồm cả chất lượng và số lượng hóa chất sử dụng đóng vai trò quyết định đối với bản thân sự phân hóa và chiều hướng phân hóa của tế bào. Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Linsmaer và Skoog (1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974)... Đây là những môi trường cơ bản và sẽ được cải tiến thành nhiều loại môi trường khác nhau phù hợp với mỗi đối tượng nghiên cứu và mục đích thí nghiệm. Trong số đó, môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số các loài thực vật và chính Murashige (1974) đã dùng môi trường này để nuôi cấy nhiều loài cây trồng [40]. Thành phần chủ yếu của tất cả các loại môi trường gồm những nhóm chất sau: muối khoáng đa lượng và vi lượng (muối chlorid, nitral, sulphat, chất tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi... (Bhojwani and Razdan, 1983) [26]. Các auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, thường được sử dụng với nồng độ từ 10-1M đến 10-6M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu. Auxin được thêm vào môi trường nuôi cấy sẽ kết hợp với auxin nội sinh để điều khiển chiều hướng và cường độ các quá trình sinh trưởng. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, ngược lại ở hàm lượng cao sẽ phát động sự tạo mô sẹo. Các auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là IBA (indol butyric acid), α-NAA (α-naphtylacetic acid), 2,4-D (2,4 diclorophenoxy acetic acid), IAA (indol acetic acid). Cytokinin là nhóm phytohormon dẫn xuất của adenin, có vai trò sinh lý tương tự nhau. Cytokinin liên quan chặt chẽ với phân bào, duy trì sự trẻ hóa các cơ quan, làm giảm ưu thế ngọn, kích thích sự phân hóa chồi từ mô sẹo nuôi cấy... Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayanaswamy S., 1997) [42]. Các cytokinin thường được dùng trong nuôi cấy là kinetin, 2ip, BAP (benzylaminopurin) với nồng độ 10-4-10-7M. Nhiều tác giả đã tổng kết rằng sự biệt hóa cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động qua lại giữa hai nhóm auxin và cytokinin. Cân bằng tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích sự hình thành rễ, ngược lại nếu cân bằng này nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy sự tạo chồi. Ở tỷ lệ trung gian, mô sẹo được hình thành. Đây là nguyên tắc chung để điều khiển quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Các mô khác nhau có phản ứng không giống nhau. Vì vậy, với từng loại mô và từng giai đoạn sinh trưởng khác nhau, việc tìm được tổ hợp nồng độ auxin-cytokinin thích hợp có ý nghĩa rất quan trọng. + Đưa những cây tái sinh được trở lại điều kiện tự nhiên. Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm việc huấn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn. Quá trình thích nghi ở đây được hiểu là quá trình thay đổi đặc điểm sinh lý và giải phẫu của cây in vitro. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần. 2.3.5. Các đường hướng nhân giống vô tính in vitro Khả năng thành công của nuôi cấy mô, tế bào phụ thuộc chủ yếu vào trạng thái tuổi của tế bào. Tế bào càng gần trạng thái phôi sinh bao nhiêu, khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu. Như vậy tế bào phôi thường có triển vọng nhất rồi đến tế bào các đỉnh sinh trưởng đang ở trạng thái hoạt động (đỉnh ngọn, chóp rễ) và sau đó là tế bào ở trạng thái ngủ nghỉ (chồi nách). Trong nhân giống in vitro, cây con có thể được tái sinh từ các điểm sinh trưởng có sẵn trong các bộ phận (phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những mô có khả năng hình thành điểm sinh trưởng phụ. Có hai phương pháp tái sinh cây con: + Tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn, chồi hay chồi nách. + Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo. Tái sinh trực tiếp (direct regeneration) từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm sinh trưởng đã tồn tại sẵn trong mô nuôi cấy phân chia và tái sinh thành cây. Các điểm sinh trưởng này bao gồm các tế bào phôi sinh chứa 2n nhiễm sắc thể đặc trưng cho loài. Cây con tạo ra theo con đường này hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được những tính trạng của cây mẹ (Hu and Xang, 1983) [33]. Trong đường hướng tái sinh gián tiếp, mẫu nuôi cấy không tái sinh thành cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo (callus). Có thể thấy ngay là hệ số nhân của con đường này vô cùng lớn. Từ một khối mô sẹo có thể tạo ra khối lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn thông qua kỹ thuật tạo phôi soma hoặc chế ra hạt giống nhân tạo. Nhiều cây tái sinh từ mô sẹo có thể rất khác với cây mẹ về mặt di truyền. Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong quá trình phát sinh và phát triển của mô sẹo, thường xuất hiện những tế bào đột biến mang số nhiễm sắc thể không giống với tế bào ban đầu hoặc chứa những đột biến gen do hiện tượng nội nguyên phân (endomitosis hay endoreduplication). Nội nguyên phân là hiện tượng nhân đôi nhiễm sắc thể không kèm theo sự phân bào trong thực tế và là một hiện tượng tự nhiên trong cơ thể thực vật, nhưng tăng lên dưới ảnh hưởng của các thành phần của môi trường dinh dưỡng và điều kiện cũng như phương pháp nuôi cấy, nhất là khi cấy chuyển nhiều lần (D’Amato, 1977) [30]. Đột biến tuy không có lợi cho việc duy trì nguyên trạng những đặc tính di truyền (trueness-to-type) trong quá trình tạo giống nhưng lại chính là đối tượng tìm kiếm trong quá trình cải tạo giống. Ngoài việc cung cấp những đột biến tự nhiên, mô sẹo còn là đối tượng lý tưởng để tạo ra những đột biến nhân tạo bằng các tác nhân gây đột biến hoặc công nghệ gen. Vì vậy, trong nhân giống in vitro, để nhân nhanh những cá thể đã chọn lọc người ta thường tái sinh cây theo đường hướng trực tiếp, còn mục tiêu của tái sinh gián tiếp là tạo ra nhiều biến dị để phục vụ cho việc chọn lọc và cải tạo giống cây trồng. 2.3.6. Quy trình nhân giống in vitro Theo Debergh (1991) [31] thì quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn: 2.3.6.1. Lấy mẫu và xử lý mẫu Đây là giai đoạn quan trọng quyết định vi nhân giống. Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu trong điều kiện khử trùng. Mỗi cây đều có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu. Với cây nhiệt đới và á nhiệt đới thì nhiệt độ 250C, độ ẩm 75% là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Debergh và Zimmerman, 1991) [31]. 2.3.6.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy. Mẫu thường là chồi đỉnh, chồi nách hay lát cắt đốt thân tùy thuộc đối tượng và mục đích nghiên cứu. Quan trọng nhất là cần chú ý đến trạng thái sinh lý của mẫu. Khả năng thành công của nuôi cấy mô, tế bào phụ thuộc chủ yếu vào trạng thái tuổi của tế bào, càng gần trạng thái phôi sinh bao nhiêu thì nuôi cấy càng có khả năng thành công bấy nhiêu. Như vậy, tế bào phôi thường có triển vọng nhất rồi đến tế bào đỉnh sinh trưởng đang hoạt động (đỉnh ngọn, đầu rễ), sau đó là tế bào ở trạng thái ngủ nghỉ (chồi nách). 2.3.6.3. Nhân nhanh chồi Đây là giai đoạn đánh giá tính ưu việt của phương pháp vi nhân giống (liên quan đến hệ số nhân chồi). Môi trường ở giai đoạn này được bổ sung hormon sinh trưởng (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux. Ánh sáng tím là thành phần kích thích phân hóa mạnh, nhiệt độ thích hợp từ 20-300C. 2.3.6.4. Tái sinh rễ Khi chồi đạt đến một kích thước nhất định, mẫu được chuyển sang môi trường tạo rễ. Môi trường này thường được bổ sung auxin (IBA, α-NAA, 2,4-D) ở liều lượng thích hợp. Tuy nhiên, ở một số cây như chuối thì sự hình thành rễ tốt hơn ở môi trường không có chất sinh trưởng (Bhojwani và Razdan, 1983) [26]. 2.3.6.5. Đưa cây in vitro ra đất Ở giai đoạn này, cây được chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng. Vì vậy cần phải huấn luyện cho cây thích nghi với sự biến đổi của môi trường, đồng thời thay đổi những đặc điểm sinh lý và giải phẫu của cây con. 2.4. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây hoa huệ trong nước và trên thế giới. 2.4.1. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây hoa huệ ở Việt Nam. Hoa huệ khi nhân giống bằng củ thường cho hệ số nhân thấp. Mặt khác, nếu nhân giống theo phương pháp truyền thống liên tục trong nhiều năm sẽ làm lây lan các mầm bệnh sẵn có trong củ, tăng lượng virus tích lũy trong củ, và có thể truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác làm cây sinh trưởng kém, hoa nhỏ và ra ít. Để khắc phục nhược điểm trên người ta đã sử dụng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào. Cây hoa huệ là một đối tượng mới của phương pháp nuôi cấy mô ở nước ta. Hiện nay, mới chỉ có một vài nghiên cứu bước đầu được thực hiện và cho kết quả. Năm 2006, trước tình hình diễn biến bệnh chai bông gây hậu quả nghiêm trọng đến năng suất và phẩm chất hoa huệ tại Đồng bằng sông Cửu Long, Nguyễn Lê Trâm Anh dưới sự hướng dẫn của T.S Nguyễn Bảo Toàn và các cộng sự ở Bộ môn Sinh lý Sinh hóa, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ đã tiến hành nuôi cấy phân sinh mô chồi cây huệ. Từ cây huệ bị nhiễm bệnh ngoài đồng, các tác giả đã phân lập phân sinh mô chồi. Phân sinh mô chồi (còn gọi là đỉnh sinh trưởng) là nơi tận cùng của chồi hoặc rễ. Khi phân sinh mô chồi phát triển, nó có thể phát sinh chồi, lá non hoặc hoa. Để phân lập phân sinh mô chồi, các tác giả đã dùng 2 biện pháp: phân lập trực tiếp từ chồi ngọn được lấy ngoài đồng và phân lập gián tiếp từ nuôi cấy mầm trong ống nghiệm. Các phân sinh mô chồi sau khi phân lập, được nuôi cấy trong ống nghiệm với các chất điều hòa sinh trưởng và các chất dinh dưỡng để tạo ra cây con. Các tác giả đã nhận thấy môi trường MS bổ sung 0,25 mg/l 2,4-D là môi trường tốt nhất kích thích mẫu tạo chồi. Cũng theo kết quả này, trên nền môi trường MS bổ sung các loại auxin khác nhau thì sự gia tăng kích thước đỉnh sinh trưởng, số chồi tạo thành và chiều cao chồi tái sinh khác biệt không ý nghĩa. Môi trường nuôi cấy tạo cây hoàn chỉnh là MS + 3g/l than hoạt tính + 500 ml nước dừa + 0,125 mg/l 2,4-D [2]. Sau đó, khi nghiên cứu môi trường nhân nhanh cây hoa huệ bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, Huỳnh Thị Huế Trang đã sử dụng chồi cây huệ được tái sinh từ đỉnh sinh trưởng của nghiên cứu trên để làm vật liệu nghiên cứu, đã xác định môi trường nhân nhanh tốt đối với cây hoa huệ là môi trường MS bổ sung 1mg/l BA đạt hệ số nhân chồi 6,3. Môi trường tốt nhất cho quá trình tạo cây hoàn chỉnh là MS + 3 g/l than hoạt tính + Atonik 10 ml. Thuần dưỡng cây huệ trên giá thể Xơ dừa và phủ bằng khay mủ có lỗ thoáng khí cho tỷ lệ sống cao nhất [18]. 2.4.2. Những nghiên cứu nuôi cấy mô cây hoa huệ trên thế giới. Nuôi cấy mô cây hoa huệ trên thế giới đã đạt được nhiều thành công trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây. Theo các nguồn tài liệu, các nghiên cứu về nuôi cấy mô cây hoa huệ được các nhà khoa học trên thế giới bắt đầu tiến hành từ năm 1998 và đã thu được nhiều thành công. Khi nuôi cấy các chồi ngủ của cây hoa huệ trên môi trường MS có bổ sung IAA, BA với các nồng độ khác nhau, Sangavai C và Chellapandi P (1998) đã đưa ra kết luận rằng khi nồng độ BA là 0,5 mg/l thì khả năng tái sinh của các chồi ngủ là cao nhất (98%) với tỷ lệ hình thành chồi trung bình là 2,2 ± 1,2 chồi/ mẫu. Sau khi các chồi ngủ được tái sinh trên môi trường MS có bổ sung 0,5mg/l BA thì ông tiến hành lấy nguồn mẫu lá trên chồi huệ tái sinh để tiến hành thí nghiệm phân tích một số chất và các thành phần hóa học quan trọng của cây hoa huệ [46]. Cũng trong thí nghiệm này, Chellapand P (1998) đã tiến hành các nghiên cứu về ảnh hưởng tổ hợp của IAA và BA đến sự hình thành callus và tạo chồi từ các chồi ngủ cây hoa huệ. Khi cảm ứng để tạo callus trên các môi trường có bổ sung các nồng độ IAA khác nhau từ 0,5-3,5mg/l tổ hợp với BA nồng độ 0,5mg/l thì kết quả cho thấy ở môi trường có bổ sung 3,0mg/l IAA và 0,5mg/l BA cho tỷ lệ tạo callus trung bình nhiều nhất là 37,8 ± 1,2. Sau đó, các callus tạo thành được cấy chuyển sang môi trường MS chứa 35g/l saccaroza có bổ sung tổ hợp BA với nồng độ thay đổi từ 0,5-2mg/l và 0,5mg/l IAA ông đã đưa ra kết luận trên môi trường cho tỷ lệ callus tạo chồi đạt cao nhất (87%) là MS có bổ sung 1,5mg/l BA và 0,5mg/l IAA. Cũng trên môi trường này, sự tái sinh chồi đạt được trung bình là 2,3 ± 1,2 chồi/callus [46]. Một nghiên cứu khác cũng tiến hành nhằm cảm ứng tạo callus từ các chồi ngủ cây hoa huệ của Muhamdad (2003). Ông tiến hành thí nghiệm và đã tạo callus từ các chồi ngủ hoa huệ từ trên môi trường MS có bổ sung α-NAA nồng độ 1mg/l. Sau đó, các callus được cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 0,4mg/l 2,4-D thì hệ số nhân chồi là 4 chồi/callus. Các chồi tạo thành được tách ra và cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 0,1mg/l L-arginine thì số chồi tăng lên 10 chồi/callus sau 12 tuần nuôi cấy. Khi các chồi tạo thành có chiều cao khoảng 2-3cm tiếp tục cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 2mg/l BA tổ hợp với 2,4-D nồng độ 0,4mg/l thì thấy các chồi mới mọc lên rất nhanh tại chính vị trí cắt [38]. Nghiên cứu ảnh hưởng của TDZ, BA, NAA và một số auxin khác đến quá trình nhân giống in vitro cây hoa huệ. Kết quả thí nghiệm của Hutchinson, M.J., Onamu, R., Obukosia, S. (2004) cho thấy khi tổ hợp TDZ và BA với nồng độ thấp dưới 0,5mg/l thì có hiệu quả cao nhất, nó làm tăng nhanh chiều cao chồi trung bình từ 0,7-1cm và chiều dài của lá/chồi trung bình đạt từ 2,7-3,2cm sau 2 tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, khi nồng độ TDZ sử dụng cao hơn 0,5mg/l thì gây độc và có thể làm chồi bị chết. Ngoài ra, khi kết hợp giữa NAA và TDZ hoặc với BA thì các chồi ngủ có xu hướng tạo callus [34]. Ngoài các nghiên cứu trên, một số tác giả cũng đã tiến hành các nghiên cứu trên đối tượng cây hoa huệ. Uthairatannakij A (2003) đã nghiên cứu sự biến đổi của hoa huệ sau khi cắt trên môi trường có bổ sung TDZ với nồng độ khác nhau. Thí nghiệm tiến hành với môi trường chỉ chứa 20% saccaroza và môi trường có tổ hợp của 20% saccaroza và TDZ có nồng độ tương ứng là 1mg/l; 2mg/l; 5mg/l. Các công thức thí nghiệm đều đặt ở nhiệt độ 200C trong 12 giờ. Sau 5 phút theo dõi ông chỉ ra rằng với môi trường chỉ bổ sung 20% saccaroza thì hoa không có sự thay đổi so với ban đầu, nhưng trên môi trường có tổ hợp của 20% saccaroza và TDZ thì có hiện tượng các nụ hoa được bật ra khác so với ban đầu, trong đó ở nồng độ 5mg/l TDZ thì tỷ lệ bật nụ cao nhất (67%) và thấp nhất (23,1%) khi nồng độ TDZ là 1mg/l [50]. Nagar (1995) sau khi nghiên cứu các củ huệ sau khi thu hoạch ông đã phát hiện ra sự có mặt của acid abcisic (ABA) trong thời gian ngủ nghỉ của củ huệ, đồng thời ông thấy một loạt các acid và một số dạng phenol liên kết cũng bị biến đổi trong pha ngủ nghỉ. Ông đã khẳng định, khi hàm lượng IAA trong củ càng thấp thì khả năng bật chồi của củ huệ càng diễn ra sớm [43]. Theo Phua R.S, Ghosh, S.K (2002) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các chỉ tiêu như kích thước củ, chất lượng bảo quản và xử lý củ bằng các hợp chất hóa học đến khả năng sinh trưởng của cây và sự tăng chất lượng của hoa huệ. Ông thấy với các củ có đường kính từ 1,5-2,0cm, củ được bảo quản trong 10-30 ngày ở nhiệt độ từ 4 -100C và các củ này được ngâm trong GA3 (200mg/l) và thiourea (2000mg/l) trong 6 giờ thì những củ này được sử dụng để đánh giá khả năng sinh trưởng của cây, tăng số lượng bông và chất lượng hoa. Việc xử lý củ theo cách trên cũng liên quan đến hiện tượng ra hoa sớm và làm tăng chất lượng hoa [45]. 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng Đề tài được tiến hành trên giống huệ hương, đây là giống huệ quý được lưu giữ tại Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ thuộc sở Khoa học và Công nghệ Bình Định. Vật liệu dùng để nuôi cấy là phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa huệ, có kích thước 1-2mm. Đề tài được thực hiện từ tháng 7/2008 đến 08/2009. 3.2. Nội dung nghiên cứu 3.2.1. Giai đoạn khử trùng mẫu: Xác định phương pháp khử trùng tốt nhất đối với mẫu nuôi cấy là phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa huệ. Để tìm ra được hóa chất và phương pháp khử trùng có hiệu quả cao nhất, tiến hành các thí nghiệm sau: Thí nghiệm 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu. Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar + 2mg/l BA Công thức Thời gian khử trùng (phút) CT1( Đ/C) 7 CT 2 10 CT 3 12 CT 4 15 CT 5 17 CT 6 20 Thí nghiệm 2. Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar + 2mg/l BA Công thức HgCl2 0,1% (phút) Ca(OCl)2 15% (phút) CT1 15 0 CT 2 15 10 CT 3 15 20 CT 4 15 30 CT 5 15 40 Ghi chú: 15 phút khử trùng HgCl2 0,1% là công thức tốt nhất của thí nghiệm 1 3.2.2. Giai đoạn nuôi cấy khởi động Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng trên nền môi trường đặc (có 6,5g/l agar) bổ sung 30 g/l saccaroza tới quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy. Thí nghiệm 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Công thức Nồng độ kinetin (mg/l) CT1(Đ/C) 0 CT 2 1 CT 3 2 CT 4 3 CT 5 4 CT 6 5 Thí nghiệm 4. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Công thức Nồng độ BA (mg/l) CT1(Đ/C) 0 CT 2 1 CT 3 2 CT 4 3 CT 5 4 CT 6 5 Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Công thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ auxin (mg/l) CT1 4 0 CT 2 4 0,25 a-NAA CT 3 4 0,25 IAA CT 4 4 0,25 IBA CT 5 4 0,25 2,4D Ghi chú: 4mg/l BA là công thức tốt nhất của thí nghiệm 2 3.2.3. Giai đoạn nhân nhanh 3.2.3.1. Nhân nhanh chồi Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và a-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi. Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar Công thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ a-NAA (mg/l) CT1 0,0 0,25 CT 2 0,5 0,25 CT 3 1,0 0,25 CT 4 1,5 0,25 CT 5 2,0 0,25 CT 6 2,5 0,25 CT 7 3,0 0,25 Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi. Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar Công thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ IAA (mg/l) CT1 0,0 0,25 CT 2 0,5 0,25 CT 3 1,0 0,25 CT 4 1,5 0,25 CT 5 2,0 0,25 CT 6 2,5 0,25 CT 7 3,0 0,25 Thí nghiệm 8. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và a-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi. Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar Công thức Nồng độ kinetin (mg/l) Nồng độ a-NAA (mg/l) CT1 0,0 0,25 CT 2 0,5 0,25 CT 3 1,0 0,25 CT 4 1,5 0,25 CT 5 2,0 0,25 CT 6 2,5 0,25 CT 7 3,0 0,25 Thí nghiệm 9. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi. Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar Công thức Nồng độ kinetin (mg/l) Nồng độ IAA (mg/l) CT1 0,0 0,25 CT 2 0,5 0,25 CT 3 1,0 0,25 CT 4 1,5 0._.--------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CHOI FILE TN6 10/ 8/** 18:17 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CAO CHOI CHIEU CAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 2.96411 .494019 673.66 0.000 2 * RESIDUAL 14 .102667E-01 .733335E-03 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 2.97438 .148719 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN6 10/ 8/** 18:17 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------ CT$ NOS HSN CAO CHOI 1 3 1.20000 4.22000 2 3 2.15000 4.00333 3 3 4.26667 3.55000 4 3 4.91667 3.78000 5 3 7.31667 3.72000 6 3 7.06667 3.30000 7 3 6.71667 3.03000 SE(N= 3) 0.140861E-01 0.156347E-01 5%LSD 14DF 0.427262E-01 0.474236E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN6 10/ 8/** 18:17 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 21 4.8048 2.3053 0.24398E-01 0.5 0.0000 CAO CHOI 21 3.6576 0.38564 0.27080E-01 0.7 0.0000 Thí nghiệm 7. Ảnh hưởng của BA và IAA đến hệ số nhân chồi BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE TN7 10/ 8/** 18:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 HSN HE SO NHAN CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 94.9581 15.8263 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 14 .149994E-01 .107139E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 94.9731 4.74865 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CHOI FILE TN7 10/ 8/** 18:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CAO CHOI CHOI CHOI CHIEU CAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 1.90786 .317976 106.84 0.000 2 * RESIDUAL 14 .416668E-01 .297620E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 1.94952 .974762E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN7 10/ 8/** 18:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSN CAO CHOI 1 3 1.08333 3.96667 2 3 1.66667 3.41667 3 3 3.13333 3.23333 4 3 4.21667 3.08333 5 3 6.06667 3.26667 6 3 6.45000 3.06667 7 3 6.61667 3.03333 SE(N= 3) 0.188978E-01 0.314971E-01 5%LSD 14DF 0.573213E-01 0.955377E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN7 10/ 8/** 18:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 21 4.1762 2.1791 0.32732E-01 0.8 0.0000 CAO CHOI 21 3.2952 0.31221 0.54555E-01 1.7 0.0000 Thí nghiệm 8. Ảnh hưởng của kinetin và α-NAA đến hệ số nhân chồi BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE TN8 10/ 8/** 18:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 HSN HE SO NHAN CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 36.6514 6.10857 434.84 0.000 2 * RESIDUAL 14 .196671 .140480E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 36.8481 1.84240 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CHOI FILE TN8 10/ 8/** 18:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CAO CHOI CHOI CHOI CHOI CHIEU CAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 3.29143 .548571 25.04 0.000 2 * RESIDUAL 14 .306667 .219048E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 3.59810 .179905 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN8 10/ 8/** 18:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------ CT$ NOS HSN CAO CHOI 1 3 1.00000 4.16667 2 3 1.46667 3.76667 3 3 2.18333 3.93333 4 3 4.65000 3.16667 5 3 4.60000 2.93333 6 3 3.18333 3.63333 7 3 2.68333 3.53333 SE(N= 3) 0.684299E-01 0.854493E-01 5%LSD 14DF 0.207563 0.259187 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN8 10/ 8/** 18:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 21 2.8238 1.3574 0.11852 4.2 0.0000 CAO CHOI 21 3.5905 0.42415 0.14800 4.1 0.0000 Thí nghiệm 9. Ảnh hưởng của kinetin và IAA đến hệ số nhân chồi BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE TN9 10/ 8/** 18:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 HSN HE SO NHAN CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 54.2698 9.04496 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 14 .113339 .809566E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 54.3831 2.71915 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CHOI FILE TN9 10/ 8/** 18:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CAO CHOI CHOI CHOI CHOI CHOI CHIEU CAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 1.82416 .304027 79.81 0.000 2 * RESIDUAL 14 .533335E-01 .380953E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 1.87750 .938748E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN9 10/ 8/** 18:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------ CT$ NOS HSN CAO CHOI 1 3 1.00000 4.08000 2 3 1.16667 4.13667 3 3 2.90000 3.95000 4 3 3.55000 4.03333 5 3 4.66667 3.66667 6 3 5.20000 3.36667 7 3 4.90000 3.43333 SE(N= 3) 0.519476E-01 0.356349E-01 5%LSD 14DF 0.157569 0.108088 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN9 10/ 8/** 18:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 21 3.3405 1.6490 0.89976E-01 2.7 0.0000 CAO CHOI 21 3.8095 0.30639 0.61721E-01 1.6 0.0000 Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của nước dừa đến hệ số nhân chồi và chất lượng chồi. BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE TN10 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 HSN HE SO NHAN CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 3.18567 .796417 116.55 0.000 2 * RESIDUAL 10 .683335E-01 .683335E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 3.25400 .232429 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CHOI FILE TN10 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CAO CHOI CHOI CHOI CHOI CHOI CHOI CHIEU CAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 2.48833 .622083 373.24 0.000 2 * RESIDUAL 10 .166669E-01 .166669E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 2.50500 .178929 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN10 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------ CT$ NOS HSN CAO CHOI 1 3 7.00000 3.13333 2 3 7.01667 3.85000 3 3 7.48333 4.06667 4 3 7.85000 4.21667 5 3 6.50000 4.23333 SE(N= 3) 0.477261E-01 0.235704E-01 5%LSD 10DF 0.150387 0.742711E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN10 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 15 7.1700 0.48211 0.82664E-01 1.2 0.0000 CAO CHOI 15 3.9000 0.42300 0.40825E-01 1.0 0.0000 Thí nghiệm 11. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE TN11 29/ 8/** 9: 7 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 CHOI TY LE MAU TAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 8666.67 1733.33 249.60 0.000 2 * RESIDUAL 12 83.3334 6.94445 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 8750.00 514.706 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE TN11 29/ 8/** 9: 7 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 HSN HE SO NHAN CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 93.6776 18.7355 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 12 .219541 .182951E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 93.8971 5.52336 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CHOI FILE TN11 29/ 8/** 9: 7 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V005 CAO CHOI CHIEU CAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 .183133 .366266E-01 13.62 0.000 2 * RESIDUAL 12 .322667E-01 .268889E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 .215400 .126706E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN11 29/ 8/** 9: 7 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------ CT$ NOS CHOI HSN CAO CHOI 1 3 41.6667 1.20000 2.67667 2 3 100.000 4.33333 2.46667 3 3 100.000 6.91667 2.43333 4 3 100.000 8.28333 2.39333 5 3 83.3333 6.76333 2.41000 6 3 65.0000 5.32667 2.38000 SE(N= 3) 1.52145 0.780921E-01 0.299382E-01 5%LSD 12DF 4.68811 0.240628 0.922498E-01 -------------------------------------------------------------------------------  ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN11 29/ 8/** 9: 7 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CHOI 18 81.667 22.687 2.6352 3.2 0.0000 HSN 18 5.4706 2.3502 0.13526 2.5 0.0000 CAO CHOI 18 2.4600 0.11256 0.51854E-01 2.1 0.0002 Thí nghiệm 12. Ảnh hưởng của BA và a-NAA đến khả năng nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE TN12 29/ 8/** 9:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 CHOI TY LE MAU TAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 0.000000 0.000000 0.00 1.000 2 * RESIDUAL 12 0.000000 0.000000 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 0.000000 0.000000 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE TN12 29/ 8/** 9:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 HSN HE SO NHAN CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 17.3490 3.46981 462.64 0.000 2 * RESIDUAL 12 .899996E-01 .749997E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 17.4390 1.02583 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CHOI FILE TN12 29/ 8/** 9:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V005 CAO CHOI CHOI CHOI CHIEU CAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 .721250 .144250 173.10 0.000 2 * RESIDUAL 12 .100000E-01 .833334E-03 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 .731250 .430147E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN12 29/ 8/** 9:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------ CT$ NOS CHOI HSN CAO CHOI 1 3 100.000 8.23333 2.31667 2 3 100.000 8.38333 2.66667 3 3 100.000 8.53333 2.86667 4 3 100.000 7.51667 2.88333 5 3 100.000 6.38333 2.63333 6 3 100.000 6.03333 2.48333 SE(N= 3) 0.000000 0.499999E-01 0.166667E-01 5%LSD 12DF 0.000000 0.154067 0.513557E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN12 29/ 8/** 9:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CHOI 18 100.00 0.00000 0.00000 0.0 1.0000 HSN 18 7.5139 1.0128 0.86602E-01 1.2 0.0000 CAO CHOI 18 2.6417 0.20740 0.28868E-01 1.1 0.0000 Thí nghiệm13: Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ BALANCED ANOVA FOR VARIATE TY LE RE FILE TN13 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 TY LE RE TY LE RA RE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 0.000000 0.000000 0.00 1.000 2 * RESIDUAL 10 0.000000 0.000000 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 0.000000 0.000000 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO RE FILE TN13 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 SO RE SO RE TREN CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 87.5173 21.8793 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 10 .800008E-01 .800008E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 87.5973 6.25695 -----------------------------------------------------------------------------  BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDTB RE FILE TN13 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V005 CDTB RE CHIEU DAI TRUNG BINH RE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 16.7773 4.19433 399.46 0.000 2 * RESIDUAL 10 .105000 .105000E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 16.8823 1.20588 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CAY FILE TN13 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V006 CAO CAY CHIEU CAO CAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 2.86000 .715000 59.58 0.000 2 * RESIDUAL 10 .120000 .120000E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 2.98000 .212857 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO LA FILE TN13 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V007 SO LA SO LA TREN CAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 4.32933 1.08233 13.53 0.001 2 * RESIDUAL 10 .800001 .800001E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 5.12933 .366381 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN13 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 6 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TY LE RE SO RE CDTB RE CAO CAY 1 3 100.000 2.86667 2.03333 4.50000 2 3 100.000 4.40000 2.16667 5.26667 3 3 100.000 6.80000 3.13333 5.36667 4 3 100.000 8.33333 4.30000 5.60000 5 3 100.000 9.36667 4.60000 5.76667 SE(N= 3) 0.000000 0.516400E-01 0.591607E-01 0.632455E-01 5%LSD 10DF 0.000000 0.162720 0.186418 0.199289 CT$ NOS SO LA 1 3 5.13333 2 3 5.23333 3 3 6.06667 4 3 6.40000 5 3 6.30000 SE(N= 3) 0.163299 5%LSD 10DF 0.514562 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN13 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 7 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | TY LE RE 15 100.00 0.00000 0.00000 0.0 1.0000 SO RE 15 6.3533 2.5014 0.89443E-01 1.4 0.0000 CDTB RE 15 3.2467 1.0981 0.10247 3.2 0.0000 CAO CAY 15 5.3000 0.46136 0.10954 2.1 0.0000 SO LA 15 5.8267 0.60529 0.28284 4.9 0.0006 Thí nghiệm 14. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ BALANCED ANOVA FOR VARIATE TY LE RE FILE TN14 10/ 8/** 18:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 TY LE RE LE RE TY LE RA RE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 0.000000 0.000000 0.00 1.000 2 * RESIDUAL 12 0.000000 0.000000 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 0.000000 0.000000 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO RE FILE TN14 10/ 8/** 18:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 SO RE RE SO RE TREN CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 77.3267 15.4653 592.29 0.000 2 * RESIDUAL 12 .313335 .261112E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 77.6400 4.56706 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDTB RE FILE TN14 10/ 8/** 18:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V005 CDTB RE RE CHIEU DAI TRUNG BINH RE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 24.4752 4.89504 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 12 .485340E-01 .404450E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 24.5237 1.44257 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CAY FILE TN14 10/ 8/** 18:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V006 CAO CAY CAY CHIEU CAO CAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 5.87176 1.17435 162.35 0.000 2 * RESIDUAL 12 .868003E-01 .723336E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 5.95856 .350504 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO LA FILE TN14 10/ 8/** 18:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V007 SO LA LA SO LA TREN CAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 4.81833 .963667 78.85 0.000 2 * RESIDUAL 12 .146667 .122222E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 4.96500 .292059 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN14 10/ 8/** 18:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 6 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------ CT$ NOS TY LE RE SO RE CDTB RE CAO CAY 1 3 100.000 4.20000 1.16667 4.43333 2 3 100.000 7.60000 3.23667 4.83333 3 3 100.000 8.33333 3.11000 5.66333 4 3 100.000 9.26667 4.21000 5.66667 5 3 100.000 10.6000 4.60000 6.05333 6 3 100.000 9.80000 4.39000 5.76667 SE(N= 3) 0.000000 0.932938E-01 0.367174E-01 0.491031E-01 5%LSD 12DF 0.000000 0.287470 0.113139 0.151303 CT$ NOS SO LA 1 3 5.13333 2 3 5.33333 3 3 5.96667 4 3 6.20000 5 3 6.56667 6 3 6.30000 SE(N= 3) 0.638285E-01 5%LSD 12DF 0.196677 ------------------------------------------------------------------------------ ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN14 10/ 8/** 18:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 7 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | TY LE RE 18 100.00 0.00000 0.00000 0.0 1.0000 SO RE 18 8.3000 2.1371 0.16159 1.9 0.0000 CDTB RE 18 3.4522 1.2011 0.63596E-01 1.8 0.0000 CAO CAY 18 5.4028 0.59203 0.85049E-01 1.6 0.0000 SO LA 18 5.9167 0.54042 0.11055 1.9 0.0000 Thí nghiệm 15. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống BALANCED ANOVA FOR VARIATE SONG FILE TN15 29/ 8/** 9:29 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 SONG TY LE SONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 1491.26 745.632 201.72 0.000 2 * RESIDUAL 6 22.1779 3.69631 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 1513.44 189.180 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO LA FILE TN15 29/ 8/** 9:29 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 SO LA SO LA TRUNG BINH LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 8.90889 4.45445 125.28 0.000 2 * RESIDUAL 6 .213333 .355555E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 9.12222 1.14028 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN15 29/ 8/** 9:29 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------ CT$ NOS SONG SO LA 1 3 61.1100 4.43333 2 3 81.1100 6.00000 3 3 92.2200 6.83333 SE(N= 3) 1.11000 0.108866 5%LSD 6DF 3.83967 0.376585 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN15 29/ 8/** 9:29 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SONG 9 78.147 13.754 1.9226 2.5 0.0000 SO LA 9 5.7556 1.0678 0.18856 3.3 0.0001 ._.