Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây xuyên khung (Ligusticum wallichii Franch) từ nuôi cấy mô

cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Cao Thị Thuỷ LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành bản luận văn này ngoài sự cố gắng của bản thân tôi còn nhận được sự giúp đỡ tận tình của nhiều cá nhân và tập thể. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Vũ Quang Sáng, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn tới TS. Nguyễn Văn Thuận – Giám đốc trung tâm,Thạc sĩ Tạ Như Thục Anh, Thạc sĩ Trần Thị Liên – Trung tâm nghiên cứu cây thuốc, Viện Dược liệu - Bộ Y Tế đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập. Xin cảm ơn gia đình, ban bè và đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2009 Tác giả Cao Thị Thuỷ MỤC LỤC 1. MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích, yêu cầu của đề tài 2 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Giới thiệu chung về cây xuyên khung 4 2.2 Cơ sở khoa học của đề tài 7 2.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất xuyên khung 24 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Vật liệu nghiên cứu 26 3.2 Nội dung nghiên cứu 27 3.3 Phương pháp nghiên cứu 32 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Giai đoạn tạo nguồn vật liệu khởi đầu 37 4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ HgCl2 và thời gian khử trùng tới hiệu quả khử trùng mẫu xuyên khung đưa vào nuôi cấy 37 4.2 Giai đoạn nhân nhanh 41 4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân chồi của xuyên khung trong nuôi cấy 41 4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và αNAA đến hệ số nhân chồi của xuyên khung trong nuôi cấy 44 4.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới hệ số nhân chồi của xuyên khung trong môi trường nuôi cấy 48 4.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và αNAA tới hệ số nhân chồi của xuyên khung trong nuôi cấy 50 4.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa tới hệ số nhân chồi của xuyên khung trong nuôi cấy 53 4.3 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 55 4.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA tới sự tạo rễ của xuyên khung trong nuôi cấy 56 4.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp αNAA và than hoạt tính tới sự tại rễ của xuyên khung trong nuôi cấy 59 4.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA tới sự ra rễ của xuyên khung trong môi trường nuôi cấy 63 4.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp IBA + than hoạt tính tới sự tạo rễ của xuyên khung trong nuôi cấy 66 4.4 Giai đoạn ngoài vườn ươm 69 4.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể trồng tới sinh trưởng phát triển của cây xuyên khung 69 4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ ra cây tới tỷ lệ sống và sự sinh trưởng, phát triển của cây xuyên khung trong vườn ươm 73 4.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ chăm sóc cây xuyên khung in vitro ngoài vườn ươm 75 5 . KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 78 5.1. Kết luận 78 5.2 Đề nghị 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1. BA : Benzin adenin 2. IBA : Axit β – indol butyric 3.α NAA : α – Naphtyl axetic axit 4. MS : Murashige Skoog 5. CT : Công thức 6. NXB : Nhà xuất bản DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ HgCl2 và thời gian khử trùng khác nhau tới hiệu quả khử trùng mẫu xuyên khung đưa vào nuôi cấy 38 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ BA tới hệ số nhân chồi của cây xuyên khung sau 8 tuần nuôi cấy 42 4.3: Ảnh hưởng của BA và αNAA đến hệ số nhân chồi của mẫu xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 45 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới hệ số nhân chồi của xuyên khung sau 8 tuần nuôi cấy 48 4.5: Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin + αNAA tới hệ số nhân chồi của xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 51 4.6: Ảnh hưởng của nước dừa tới hệ số nhân chồi của xuyên khung sau 4 tuần nuôi cấy 53 4.7: Ảnh hưởng của αNAA tới sự ra rễ của xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 56 4.8: Ảnh hưởng của αNAA và than hoạt tính đến sự ra rễ của xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 60 4.9: Ảnh hưởng của nồng độ IBA tới khả năng ra rễ của xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 63 4.10: Ảnh hưởng của tổ hợp IBA + than hoạt tính đến sự tạo rễ của mẫu sau 6 tuần nuôi cấy 66 4.12: Ảnh hưởng của giá thể ra cây tới tỷ lệ sống và tình hình sinh trưởng của xuyên khung ngoài vườn ươm 45 ngày sau trồng 70 4.13: Ảnh hưởng của thời vụ ra cây tới tỷ lệ sống và sự sinh trưởng của cây xuyên khung sau 45 ngày trồng 73 4.14: Ảnh hưởng của chế độ chăm sóc cây xuyên khung in vitro ngoài vườn ươm 30 ngày sau trồng 76 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1. Một số hình ảnh về cây xuyên khung ngoài thực địa 4 4.1. Ảnh hưởng của HgCl2 0,07% tới hiệu quả khử trùng mẫu cấy trong thời gian 5, 10, 15, 20 phút 39 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ HgCl2 0,1% tới hiệu quả khử trùng mẫu trong thời gian 5, 10, 15, 20 phút 39 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ HgCl2 0,15% tới hiệu quả khử trùng mẫu trong thời gian 5, 10, 15, 20 phút 40 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ BA tới hệ số nhân chồi của mẫu xuyên khung sau 8 tuần nuôi cấy 43 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ BA tới hệ số nhân chồi của cây xuyên khung sau 8 tuần nuôi cấy 43 4.6. Ảnh hưởng của BA và αNAA đến hệ số nhân chồi sau 6 tuần nuôi cấy 46 4.7. Ảnh hưởng của nồng độ BA+ αNAA tới hệ số nhân chồi của cây xuyên khung sau 4 tuần nuôi cấy 46 4.8. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới hệ số nhân chồi của mẫu xuyên khung sau 8 tuần nuôi cấy 49 4.9. Ảnh hưởng của kinetin tới hệ số nhân chồi của cây xuyên khung sau 8 tuần nuôi cấy 49 4.10. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin + αNAA hệ số nhân chồi của cây xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 52 4.11. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin + αNAA tới khả năng nhân chồi của cây xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 52 4.12. Ảnh hưởng của nước dừa tới hệ số nhân chồi của cây xuyên khung sau 4 tuần nuôi cấy 54 4.13. Ảnh hưởng nước dừa tới hệ số nhân chồi của cây xuyên khung sau 4 tuần nuôi cấy 54 4.14. Ảnh hưởng của αNAA tới tỷ lệ ra rễ của xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 57 4.15. Ảnh hưởng của αNAA tới kích thước và số lượng rễ của xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 57 4.16. Ảnh hưởng của NAA tới sự ra rễ của mẫu sau 6 tuần nuôi cấy 58 4.17. Ảnh hưởng của αNAA + than hoạt tính tới tỷ lệ ra rễ của xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 61 4.18. Ảnh hưởng của αNAA + than hoạt tính tới số lượng rễ và kích thước rễ của xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 62 4.19. Ảnh hưởng của αNAA và than hoạt tính đến sự ra rễ của xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 62 4.20. Ảnh hưởng của IBA tới tỷ lệ ra rễ của xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 65 4.21. Ảnh hưởng của IBA tới số lượng và chiều kích thước rễ của xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 65 4.22. Ảnh hưởng của IBA + than hoạt tính tới tỷ lệ ra rễ của xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 67 4.23. Ảnh hưởng của IBA + than hoạt tính tới số lượng và kích thước rễ của xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 67 4.24. Ảnh hưởng của IBA+ than hoạt tính đến sự ra rễ của xuyên khung sau 6 tuần nuôi cấy 68 4.25. Ảnh hưởng của giá thể ra cây tới tỷ lệ sống xuyên khung ngoài vườn ươm 45 ngày sau trồng 72 4.26. Ảnh hưởng của giá thể ra cây tới sự sinh trưởng, phát triển của xuyên khung ngoài vườn ươm 45 ngày sau trồng 72 4.27. Ảnh hưởng của thời vụ ra cây tới tỷ lệ sống của cây xuyên khung sau 45 ngày trồng 74 4.28. Ảnh hưởng của thời vụ ra cây tới sự sinh trưởng của xuyên khung sau 45 ngày trồng 74 4.29. Ảnh hưởng của chế độ phun dinh dưỡng tới sinh trưởng cây xuyên khung ngoài vườn ươm sau 30 ngày trồng 77 4.30. Ảnh hưởng của chế độ phun dinh dưỡng tới sinh trưởng cây xuyên khung ngoài vườn ươm 77 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Xuyên khung (Ligusticum wallihii Franch) có nguồn gốc từ Tứ Xuyên - Trung Quốc, được du nhập sang trồng ở Việt Nam từ những năm 60 của thế kỷ XX [6] . Trong y học cổ truyền, xuyên khung là vị thuốc thiết yếu của rất nhiều các toa thuốc, có tác dụng hành huyết, điều kinh, trừ phong, giảm đau . Các công trình nghiên cứu gần đây của y học hiện đại đã xác định thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của xuyên khung như: ức chế sự co bóp tử cung, chống loạn nhịp tim, gây dãn động mạch vành, cải thiện tuần hoàn não, giảm cholesterol máu…[8,9 ] nên việc cung cấp nguyên liệu với số lượng lớn chất lượng ổn định cho ngành sản xuất thuốc ngày càng tăng. Trước những năm 60 đến đầu những năm 90 của thế kỷ XX, xuyên khung được trồng rộng rãi ở hầu hết các huyện vùng núi cao thuộc tỉnh Lào Cai như: SaPa, Bát Sát, Bắc Hà, Mường Khương, tỉnh Lai Châu trồng ở các huyện Sìn Hồ, Phong Thổ, Than Uyên... và một số tỉnh miền núi phía bắc như Hà Giang, Cao Bằng, Bắc Cạn, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa…Sản lượng thỏa mãn nhu cầu dược liệu trong nước, chủ yếu dùng trong thuốc cổ truyền. Tuy nhiên, năng suất dược liệu giảm dần, những năm 60 - 70 năng suất cây trồng đạt khoảng 2 - 3 tấn/ha, đến nay chỉ đạt 1,5 - 1,7 tấn/ha [10 ]. Nguyên nhân của hiện trạng này là do hậu quả của một số yếu tố như điều kiện tự nhiên, kỹ thuật canh tác nhưng cơ bản nhất vẫn là giống kém phẩm chất, thoái hóa và không được phục hồi chất lượng. Mặt khác phương thức trồng trọt là trồng bằng đốt thân được tách từ cây mẹ, mỗi cây mẹ chỉ chọn được từ 3 - 5 mầm đạt tiêu chuẩn. Vì vậy hệ số nhân của cây xuyên khung ngoài tự nhiên rất thấp. Hơn nữa cây giống không trồng ngay mà phải bảo quản sau 2 - 3 tháng mới trồng [10], việc bảo quản giống làm cho chi phí giống tăng lên đáng kể chưa kể đến hao hụt giống trong thời gian bảo quản dẫn tới hiệu quả kinh tế trong sản xuất xuyên khung thấp, diện tích trồng trọt có xu hướng ngày càng thu hẹp. Điều này dẫn tới một thực trạng tất yếuđó là ngành dược Việt Nam sẽ phải nhập khẩu nguyên liệu xuyên khung với số lượng lớn phục vụ cho việc sản xuất thuốc. Do đó, việc thiết lập hệ thống sản xuất cây giống xuyên khung có chất lượng cao là một nhu cầu bức thiết, cho đến nay vẫn chưa có công trình nào nghiên cứu để giải quyết vấn đề này một cách triệt để để ứng dụng vào sản xuất. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên Viện Dược Liệu tiến hành đề tài nghiên cứu phục tráng và xây dựng hệ thống sản xuất giống xuyên khung có chất lượng cao lượng cao bắt nguồn từ nuôi cấy in vitro.Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây xuyên khung (Ligusticum wallichii Franch) từ nuôi cấy mô ” để phục vụ cho công tác phục tráng giống sau này. 1.2 Mục đích, yêu cầu của đề tài 1.2.1 Mục đích Nghiên cứu quy luật tác động của các chất điều hòa sinh trưởng và một số yếu tố hữu cơ khác tới sinh trưởng, phát triển của cây xuyên khung in vitro Đề xuất quy trình nhân giống in vitro cây xuyên khung (Ligusticum wallichii Franch). 1.2.2 Yêu cầu Xác định được các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng nhân giống của xuyên khung trong in vitro và in vivo: - Phương pháp khử trùng mẫu cấy - Các chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tạo cụm chồi - Các chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh - Các hợp chất hữu cơ (than hoạt tính, đường saccharose, nước dừa) tới sinh trưởng phát triển của mẫu xuyên khung trong nuôi cấy - Các giá thể ra cây - Thời vụ trồng - Chế độ chăm sóc (bón phân). 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học Phát hiện được quy luật tác dụng của các yếu tố môi trường tới quá trình phát sinh hình thái của xuyên khung trong nuôi cấy để có thể nhân nhanh và tạo nguồn cây giống có chất lượng cao và ổn định. Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp tài liệu tham khảo phục vụ công tác giảng dạy và nghiên cứu về cây xuyên khung nói riêng cây thuốc nói chung. 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Cung cấp giống chất lượng cao và quy trình nhân giống in vitro cây xuyên khung, phục vụ sản xuất giống, nâng cao hiệu quả kinh tế của khâu trồng trọt và thúc đẩy sản xuất xuyên khung thành cây trồng có tính chất hàng hóa mới, góp phần cho việc phòng chống bệnh tật của cộng đồng và xuất khẩu. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây xuyên khung 2.1.1 Đặc điểm thực vật học Xuyên khung có tên khoa học là Ligusticum wallichii Franch, thuộc họ hoa tán (Apiaceae). Xuyên khung là cây thân thảo, sống lâu năm. Rễ phình lên thành củ rất thơm. Thân mềm, có khía dọc, rỗng giữa. Lá xẻ lông chim, 2-3 lần, mọc so le, có cuống dài và bẹ to, các thuỳ mọc đối, hình mác, gốc tròn hoặc men theo cuống, đầu nhọn thuỳ lớn, chia thành những thuỳ nhỏ, nông và khía răng không đều, hai mặt nhẵn, mặt trên màu lục bóng. Cụm hoa mọc thành tán kép, hoa nhỏ màu trắng. Qủa bế, hình trống. Toàn cây, nhất là rễ củ có tinh dầu [6]. 2.1.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố Xuyên khung là cây của vùng ôn đớí ấm. Nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng: 13 - 160C; tối cao tuyệt đối là 300C và tối thấp tuyệt đối có khi xuống tới 00C. Lượng mưa 2600 - 2865 mm/năm. Độ ẩm không khí 85%. Xuyên khung thích ứng đặc biệt với các loại đất mùn tơi xốp, dễ thấm nước ở chân núi đá vôi, pH của đất là 6 - 7. Cây sinh trưởng mạnh trong mùa xuân – hè, đến mùa thu bắt đầu có hoa quả. Tuy nhiên hạt không được sử dụng để nhân giống mà là các đốt của gốc thân, sau khi đã thu hoạch củ [10]. Xuyên khung có nguồn gốc từ vùng Đông Bắc Trung Quốc. Cây đã được trồng từ lâu đời, hiện nay không còn thấy trong hoang dại. Chúng cũng được trồng nhiều ở Đài Loan, Nhật Bản và Triều Tiên và một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam [48,49]. 2.1.3 Thành phần hoá học và công dụng [50] Bộ phận làm thuốc của xuyên khung là thân rễ (rhizoma). Theo y học cổ truyền, xuyên khung có vị cay, tính ấm, quy vào ba kinh can, đởm, tâm bào, có tác dụng hành khí, hoạt huyết, điều kinh, trừ phong, giảm đau. Các công trình nghiên cứu của y học hiện đại đã xác định thành phần hóa học trong dược liệu là 1% tinh dầu, axit ferulic, các phthalid: butylphthalid, butylidephthalid, ligustilid và các hợp chất có nitơ như adenin, adenosin, ligustazin. Nghiên cứu dược lý chứng minh nhóm phthalid như ligustilis có tác dụng ức chế sự co bóp tử cung, chống loạn nhịp tim, gây dãn động mạch vành. Nhóm hợp chất chứa N như ligustazin có tác dụng ức chế sự kết tập tiểu cầu nên có khả năng dự phòng chống đông máu ở động mạch; làm dãn mao mạch trên in vitro nên có tác dụng tốt trong điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu não; axít ferulic trong xuyên khung có tác dụng ức chế co bóp cơ trơn tử cung. Trong điều trị huyết khối não, xuyên khung có tác dụng làm giảm độ nhớt của máu, độ nhớt của huyết thanh, tăng tốc độ điện di hồng cầu, giảm tỷ lệ kết tập tiểu cầu. Cao nước sắc xuyên khung có tác dụng làm tăng khả năng biến dạng, tăng sức bền của hồng cầu, có tác dụng chống đông máu chung, ức chế các giai đoạn đông máu nội sinh và ngoại sinh, sự tạo fibrin. Xuyên khung còn có tác dụng giảm cholesterol máu trong mô hình gây tăng cholesterol máu ngoại sinh trên chuột nhắt và chuột cống trắng. Tinh dầu xuyên khung có tác dụng kháng khuẩn với một số chủng như phế cầu, liên cầu, tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ xanh. Xuyên khung có tác dụng chống phóng xạ, trị chứng thiếu vitamin E. Việc sử dụng xuyên khung cùng các vị thuốc khác dùng để hoạt huyết cũng được sử dụng trong công nghệ dược mỹ phẩm [15]. 2.1.4 Một số bài thuốc hay có sử dụng xuyên khung [47] * Trị đau đầu: - Xuyên khung 3g, tế tân 2g, hương phụ 3g, nước 300ml sắc còn 100ml chia 3 lần uống trong ngày. - Xuyên khung 12g, kinh giới 12g, bạc hà 24g, phòng phong 4g, tế tân 3g, khương hoạt 6g, bạch chỉ 6g, tán nhỏ trộn đều, ngày uống 2 lần, mỗi lần 6g, uống với nước chè. - Trị đau nửa đầu: Độc vị xuyên khung tán nhỏ. Ngày uống 2 lần mỗi lần từ 4 - 6g với nước chè. * Trị bệnh mạch vành đau thắt ngực: Dùng xuyên khung chiết xuất axit ferulic 20mg cho vào glucose 5% - 250ml, nhỏ tĩnh mạch ngày 1 lần liên tục trong 10 ngày, làm hết cơn đau thắt ngực, mỡ trong máu giảm ở mức độ khác nhau. * Trị viêm cột sống phì đại và gai xương gót chân: Dùng bột xuyên khung đựng vào bọc đắp ở chỗ đau hoặc lót vào giầy, mỗi tuần thay một lần, nếu sau 2 tháng tái phát lại đắp tiếp. * Trị nhồi máu não và tắc mạch máu não: Dùng dịch tiêm phức hợp xuyên khung, xích thược, đan sâm, xuyên quy làm lưu lượng huyết dịch đều. * Trị đau các khớp, mình mẩy: Xuyên khung 6g, bạc hà 6g, tế tân 3g, khương hoạt 8g, bạch chỉ 12g, phòng phong 12g, kinh giới 12g, cam thảo vài lát sắc uống hoặc tán thành bột 4 g/lần pha với nước trà. * Trị ngực sườn đau tức: - Thương truật, hương phụ, xuyên khung, lục khúc, sơn chi tử xao lên lượng bằng nhau, tán bột mịn hồ hoàn, mỗi lần uống 8 - 10g với nước ấm. - Khung quy tả can thang: xuyên khung, hồng hoa mỗi thứ 6g, quy vĩ, chỉ xác đều 10g, thanh bì, hương phụ, đào nhân 8g, cho nước và rượu mỗi thứ một nửa sắc uống. * Dùng trong ngoại khoa - Trường hợp chấn thương té ngã, dùng phối hợp xuyên khung với đương quy, xích thược, hoa hồng để hoạt huyết chỉ thống. - Trường hợp mụn nhọt làm mủ lâu mới khỏi xuyên khung phối hợp với đương quy, tạo giác thích để bổ khí huyết, hoạt huyết tiêu sưng. Liều lượng và cách dùng: dùng với lượng từ 3 - 10g, tán bột mịn mỗi lần 1 - 1,5g. 2.2 Cơ sở khoa học của đề tài 2.2.1 Cơ sở lý luận của phương pháp nhân giống in vitro Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro là học thuyết về tính toàn năng (totipotence) của tế bào. Theo Haberland.G, nhà thực vật học người Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đó đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh [32]. Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn [42]. Morel là người đầu tiên đã thành công trong việc tái sinh và nhân nhanh giống lan quý Cymbidium bằng phương pháp này [38]. Trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được hàng triệu cá thể, nhờ vậy mà hoa Cymbidium vốn đắt tiền đã có giá thành hạ hơn và đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng của nhiều người. Ở Thái Lan 90% lan thương mại được nhân bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Thành công đối với họ Orchidaceae không những chỉ là bằng chứng mà còn mở đường cho việc ứng dụng kỹ thuật này đối với các loài cây khác như cây ăn quả, cây lương thực, cây lâm nghiệp, cây thuốc, cây cảnh...., ở nhiều nước trên thế giới: Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, đặc biệt ở Hà Lan sử dụng phương pháp này để nhân giống cúc cho hệ số nhân giống cao từ 410-1010/năm [11]. Các lĩnh vực ứng dụng khác kỹ thuật in vitro cũng mang lại nhiều kết quả trong việc cải tạo và phục tráng giống cây trồng. Qúa trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là kết quả của các qúa trình phân hoá và phản phân hoá. Tất cả các tế bào trong các cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hoá để đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hoá tế bào. Còn quá trình phản phân hoá thì ngược lại với qúa trình phân hoá, có nghĩa là tế bào đã phân hoá thành mô chức năng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia [32]. 2.2.2 Ứng dụng của nhân giống in vitro trong nhân giống cây thuốc và một số loại cây trồng khác Khi lĩnh vực sản xuất giống cây trồng được thực hiện trên quy mô công nghiệp thì phương pháp nhân giống invitro ngày càng được khai thác và sử dụng một cách triệt để. Có rất nhiều loại cây trồng nói chung và cây thuốc nói riêng được nhân nhanh bằng phương pháp này. Thí dụ: sử dụng chồi nách để nhân có thể tạo ra hàng chục vạn cây D.floribunda trong vòng một năm [37] hay 26 vạn cây cam thảo trong năm tháng [35], chỉ từ một lát cắt ban đầu mà thông thường từ một cây D.floribunda chỉ tạo ra 8 - 10 cây trong một năm, và cam thảo chỉ cho 5 - 7 cây nếu nhân giống bằng cành [37]. Ở Việt Nam, Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số nhân 532 trong vòng 1 năm đối với khoai tây [25], hệ số nhân giống của cây hà thủ ô đỏ là 105/ năm, cây trinh nữ hoàng cung, hệ số nhân giống vô tính truyền thống là 6 - 7 cây/năm nhưng khi nhân bằng phương pháp in vitro hệ số này có thể lên tới 2 x 35 cây từ một lát cắt của củ giống [1], đặc biệt cây cọ dầu thường phải mất 10 - 15 năm mới cho quả thu hoạch và nhân giống từ hạt. Ứng dụng nhân nhanh in vitro cho đối tựơng này, người ta có thể cung cấp được 500.000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm [46]. Mai Xuân Lương, Nguyễn Văn Kết dự tính hàng năm có thể thu được 76 cây giống khi nuôi cấy chồi của cây cẩm chướng [16]. Trong công tác giống cây trồng, vấn đề được quan tâm hàng đầu là chất lượng và số lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo ra được những giống cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và Cornel đã chứng minh được rằng nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trưởng [37], riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus [38]. Nguyên nhân của hiện tượng này là: Đỉnh sinh trưởng không có hệ thống mô dẫn làm cho virus và vi sinh vật không có khả năng xâm nhập. Đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin khá cao, auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus. Qúa trình phân chia tế bào phôi sinh (đỉnh sinh trưởng) không kéo theo sự phân chia của virus. Nuôi cấy mô tế bào chủ yếu được dùng để phục tráng và nhân nhanh theo các hướng vi nhân giống, sản xuất hạt giống nhân tạo và làm sạch bệnh. Qua nuôi cấy in vitro tế bào được trẻ hoá thông qua quá trình phản phân hoá để trở về trạng thái phôi sinh, từ đó cho ra đời những cây con có tuổi sinh lý trẻ hơn, làm sức sống của cây trồng tăng lên, dẫn đến tăng năng suất và chất lượng sản phẩm [42]. Những kỹ thuật này ở nước ngoài đã được áp dụng trên phần lớn cây trồng. Đối với cây thuốc, giống địa hoàng, ở Trung Quốc, Hàn Quốc, bạch truật ở Nhật Bản…. cũng đã thành công theo phương pháp này. Tóm lại, phương pháp nhân giống in vitro với các ưu thế về hệ số nhân giống cực kỳ lớn, tiềm năng công nghiệp hoá cao và tính khả thi rộng, đã thực sự trở thành công cụ cần thiết trong công tác giống cây trồng. 2.2.3 Ý nghĩa, ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy in vitro * Ý nghĩa Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô tính, đối với nhiều loài thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là công cụ vô cùng hữu ích. Trên thực tế có nhiều loài thực vật nhân giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro là do các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho ra các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần hoá học [31]. Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối với cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng (hàm lượng các chất hoạt tính) sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất, cây cọ dầu khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 đến 11,3 %, hàm lượng lynalylacetat từ 11 đến 78 %; cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu [46]. Đối với nhiều cây dược liệu, việc nhân giống hữu tính gặp khó khăn như ô dầu, bạch thược có hạt nảy mầm chậm, hay với đan sâm hạt chín không đều và thời gian nảy mầm kéo dài, gây khó khăn cho việc sản xuất đại trà. Một số cây gỗ khác có thời gian sinh trưởng kéo dài như sơn thù, đỗ trọng khi di thực về trồng ở SaPa phải mất mười năm cây mới ra hoa, bộ phận làm thuốc của cây sơn thù là quả nhưng khi cây còn trẻ chỉ cho hoa đực vì vậy không có quả . Các cây tam thất, nhân sâm, hoàng liên phải sử dụng hạt tươi mới nảy mầm nên thu hoạch đến đâu cần gieo ngay đến đó gây nhiều khó khăn cho sản xuất…[4]. Mặt khác phương pháp nhân giống truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: xuyên khung 2 – 5/cây mẹ [4], chuối là 2 – 3/cây mẹ [26], …hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém. Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn lao, nhân giống vô tính tạo ra các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ [3] nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến khi thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài… * Ưu điểm - Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây. Hệ số nhân giống thường đạt ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36 đến 1012 / năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào. - Chọn lọc được các cây ưu tú, sản phẩm đồng nhất và đưa ra sản phẩm nhanh hơn. Theo lý thuyết, từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu tú nào đều có thể đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế - Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm gây bệnh - Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt kém trong những điều kiện sinh thái nhất định - Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và chiếu sáng, nhiệt độ,…nên có thể sản xuất quanh năm trong một dây truyền sản xuất liên tục - Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội - Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen. *Nhược điểm Bên cạnh những ưu điểm trên, nhân giống in vitro vẫn không tránh khỏi một số nhược điểm như: - Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Nhiều loài thực vật quý hiếm chưa thể tiến hành nhân giống do gặp khó khăn liên quan tới lý thuyết nuôi cấy và tái sinh thực vật - Chi phí sản xuất cao, vi nhân giống đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và lao động có tay nghề - Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình [39] Sở dĩ nuôi cấy in vitro có thể chủ động trong nhiều khâu trong sản xuất là do có những điểm khác biệt so với các phương pháp nhân giống truyền thống đó là, nhân giống in vitro được thực hiện trên một môi trường đặc biệt, cung cấp đầy đủ các điều kiện cho mô, tế bào nuôi cấy phát triển. Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng quyết định đến kết quả của nuôi cấy. 2.2.4 Môi trường nuôi cấy Trong nuôi cấy in vitro, cả hai nhóm yếu tố hóa học và vật lý trong các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ. Ngoài ra môi trường dinh dưỡng để nuôi cây phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết [41], nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố định và một thành phần cần cho sự sống khác cũng phải được cung cấp đó là nước. Các nhân tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng (chất lượng và thời gian chiếu sáng) và áp lực thẩm thấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận. Nguồn dinh dưỡng trong một môi trường nuôi cấy thông thường phải đảm bảo các thành phần hoá học sau: · Nguyên tố đa lượng: Các nhân tố này thường chiếm 0,1% khối lượng khô của thực vật. Trong đó nitơ, phốt pho, kali, magiê, can xi và lưu huỳnh là các nguyên tố đa lượng. Các nguyên tố này thường được sử dụng ở dạng các muối vô cơ. Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục, protein, acid nucleic, acid amin...), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào,…. · Nguyên tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh trưởng, phát triển và có nhiều vai trò khác nhau. Các nguyên tố vi lượng được sử dụng thông dụng là Mn, I, Cu, Co, B, Mo, Fe và Zn là các nguyên tố vi lượng, ngoài ra niken và nhôm cũng được tìm thấy trong một số công thức. Nguyên tố vi lượng thường có mặt trong thành phần của một số coenzyme, vitamin tham gia vào các phản ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp lục,… · Chất hữu cơ bổ sung: Gồm có vitamin và amino acid. Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor của nhiều phản ứng sinh hoá [32]. Chỉ có 2 loại vitamin B1 và myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro. Tuy nhiên vì lý do lịch sử các loại vitamin khác cũng được thêm vào để nuôi cấy. Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái, amino acid thường được sử dụng là glysine ngoài ra arginine, asparagine, aspartic acid, alanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết. · Nguồn cacbon: Các mô tế bào thực vật nuôi cấy mô thực vật nói chung không thể quang hợp hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và nhiều điều kiện khác…do đó phải bổ sung thêm cacbon. Saccharose thường được sử dụng làm nguồn cacbon cung cấp cho môi trường nuôi cấy do có những đặc tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hoá triệt để và tương đối ổn định. Ngoài ra, các loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường saccharose. · Tác nhân làm đặc môi trường: Tuỳ thuộc vào loại sinh trưởng, môi trường nuôi cấy cần được sử dụng ở dạng lỏng hoặc đặc, nhiều loại nuôi cấy đòi hỏi tế bào hoặc mô thực vật phải sinh trưởng trên bề mặt nên agar là tác nhân được sử dụng phổ biến nhất khi tiến hành làm môi trường. Agar được sản xuất từ tảo biển, ở dạng tinh khiết hay dạng agarose có thể cũng được sử dụng nhưng có thể khác nhau về độ đặc. · Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật. Các chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng thông thường là các hormone thực vật hoặc các chất tổng hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene. Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được._. sử dụng như môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…Trong đó môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm [30]. Trên môi trường dinh dưỡng, các mô tế bào thực vật thực hiện quá trình phản biệt hóa rồi lại biệt hóa để cho ra cây hoàn chỉnh. Mỗi đối tượng thực vật có đặc tính khác nhau do đó có những cách thức biến đổi khác nhau, mặc dù kết quả cuối cùng là tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một con đường chung cho tất cả các thực vật. 2.2.5 Các đường hướng trong nhân giống in vitro Quá trình thực hiện nhân giống in vitro sẽ tạo ra các dòng vô tính, theo khái niệm chung về dòng vô tính trong chọn giống thì dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được nhân bằng sinh sản vô tính, các dòng vô tính này sẽ được tạo ra theo các đường hướng sau: - Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách - Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo · Tái sinh cây trực tiếp Tái sinh trực tiếp từ mẫu nuôi cấy: Là quá trình phát động những điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy phân chia và tái sinh thành cây. Xét về nguồn gốc các cây này có thể phát sinh từ chồi đỉnh, chồi nách phá ngủ hoặc từ chồi mới phát sinh [32]. Các cây con này được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ . Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng đó là các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa….Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các điểm sinh trưởng phụ sau đó tái sinh thành cây con . Sác xuất biến dị và đột biến thường cao hơn so với tái sinh từ ở trường hợp nói trên [29]. · Con đường tái sinh gián tiếp Mẫu cấy khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp có chứa auxin và cytokinin có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào không tổ chức đó chính là các tế bào mô sẹo. Trong nuôi cấy, sự tăng sinh này có thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ. Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng này nên sử dụng các mô sẹo các loại mô sẹo vừa mới phát sinh. Nuôi cấy mô sẹo có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma từ đó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh [19] . Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù hay tạo ra hạt nhân tạo [13]. Để có thể thực hiện nuôi cấy có kết quả tốt, dù bằng con đường nào đi chăng nữa cũng cần chú ý tới các yếu tố ảnh hưởng tới nuôi cấy vì chính các yếu tố này quyết định đường hướng vô tính cũng như chất lượng của cây giống thu được. 2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy 2.2.6.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một vấn đề cần thiết vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn, nấm… tuy nhiên, mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nguyên liệu ban đầu. Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại chất khử trùng, nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chất khử trùng vào các kẽ, những phần gồ gề trên bề mặt của mô cấy. Để làm tăng hiệu quả người ta thường nhúng mẫu vào ethanol 70% trong 30 giây để làm tăng sức căng bề mặt mẫu rồi sau đó mới khử trùng bằng dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường được sử dụng Một số hoá chất khử trùng thông dụng Chất khử trùng Nồng độ (%) Thời gian khử trùng (phút) Calcium hypocholorite 9- 10 5- 30 Sodium hypocholorite 0,5- 5 5- 30 Hydrogen peroxide 3- 12 5- 15 Bromime water 1- 2 2- 10 Ethyl alcohol 70- 95 0,2- 5,0 Silver nitrate 1 5- 30 Murcurric choloride 0,1- 1,0 2- 10 Benzalknium choloride 0,01- 0,1 5- 20 Thuỷ ngân clorua 0,1 2 - 40 Nguồn:Dương Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, Đại học Quóc Gia thành phố Hồ Chí Minh Đối với các mẫu quá bẩn, việc rửa kỹ bằng nước xà phòng và để dưới vòi nước chảy từ 20 đến 30 phút sẽ có tác dụng làm giảm đáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy [32]. Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy. Với hypochlorit, người ta thường khử trùng trong thời gian 15 - 30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn. Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu bị nhiễm khuẩn. Để đạt hiệu quả cao trong khử trùng cho một số mẫu nuôi cấy người ta không chỉ sử dụng một loại hoá chất mà còn sử dụng kết hợp nhiều loại đã cho kết quả rất khả quan như ở cây kiwi, cây lát hoa côn đảo…, khử trùng hypo-Na sau đó mới khử trùng bằng HgCl2 [18, 27] Sau khi khử trùng thu được nguồn nguyên liệu vô trùng, các mẫu cấy được chuyển sang các môi trường có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng để thực hiện công đoạn nhân nhanh. Năng suất nhân nhanh phụ thuộc vào quá trình tác động của các chất điều tiết sinh trưởng. 2.2.6.2 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng Các chất điều tiết sinh trưởng được dùng phổ biến nhất hiện nay là auxin và cytokinin. · Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử. Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hoá sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hoá của rễ, chồi…[22]. Các auxin được sử dụng với nồng độ thấp từ 10-6 - 10-1 M tuỳ theo từng chất mục đích và đối tượng nghiên cứu. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hoá rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo. Auxin được chia thành hai nhóm do có nguồn gốc khác nhau. Trong đó, auxin tự nhiên quan trọng nhất là IAA, nhưng nó chỉ được dùng trong một số môi trường nuôi cấy vì IAA không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng. Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D, IBA, NAA, Dicamba, 2,4,5-T, MCPA, Picloram… [30]. · Cytokinin kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sinh trưởng của tế bào, cảm ứng hình thành chồi cây và loại bỏ ưu thế ngọn [22] Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin được dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ [23]. Trong các cytokinin tự nhiên có hai nhóm được sử dụng trong môi trường nuôi cấy đó là zeatin và 2iP (2-isopentyl adenin). Nhưng chúng không được dùng phổ biến vì rất đắt (đặc biệt là zeatin) và không ổn định [22]. Các chất tổng hợp tương tự như kinetin và BAP được sử dụng thông dụng hơn. Các chất hoá học không có based purin nhưng thay thế bằng phenylureas, cũng được sử dụng như cytokinin trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật. Trong cây có sự cân bằng nội hoocmone [30]. Do vậy khi sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy cần đặc biệt lưu tâm tới vấn đề này. Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ, nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi, ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo [28]. Ngoài các chất kích thích sinh trưởng nguồn cacbon bổ sung cũng có tác động đến quá trình nuôi cấy, ảnh hưởng đến chất lượng mẫu cấy và quá trình phát sinh hình thái mẫu. 2.2.6.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường Ở mô và tế bào nuôi cấy sự quang hợp thường bị hạn chế do vậy, cần bổ sung nguồn cacbon cho mô tăng trưởng. Đường vừa là nguồn các bon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường. Đường đóng góp khoảng 50 - 70% vào khả năng thẩm thấu của môi trường [13]. Thông thường đường saccharose được sử dụng ở nồng độ 2 - 3%, nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau có khi xuống tới 2% (tạo dòng), có khi tăng lên đến 12% (gây cảm ứng stress nước). Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp hoặc ngoại sinh vì thực chất sự ra rễ là một quá trình hô hấp. Ở hầu hết các loài thực vật khi ra rễ thích hợp với lượng đường 20 - 30 g/lít [21]. Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in vitro đã phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin, độ thoáng khí cao, tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể, cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường. Trong khi đó cây nuôi cấy theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitrro ra vườn ươm. Tỷ lệ sống 95 - 100 % sau một tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không có đường, trái lại chỉ từ 70 - 80% theo phương pháp truyền thống [21]. Nghiên cứu nhằm tăng năng suất nhân nhanh cũng như chất lượng các mô tế bào nuôi cấy in vitro, người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhiều thành phần khác. Trong đó, than hoạt tính là thành phần rất được quan tâm vì có nhiều tác động tích cực cho nuôi cấy. 2.2.6.4 Ảnh hưởng của than hoạt tính Than hoạt tính ban đầu được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cố gắng mô phỏng điều kiện trồng trọt sau đó, nó được sử dụng rất rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy. Tác dụng của than hoạt tính với các mẫu cấy in vitro là tỷ lệ cây sống cao, cây sinh trưởng tốt, cải thiện chất lượng và độ khoẻ của cây. Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy mô thực vật đó là, sự hút thấm bề mặt của thành phần môi trường, hút thấm các thành phần không sạch của agar, hút thấm hoặc giải phóng chất điều hoà sinh trưởng, làm đen môi trường, ảnh hưởng tới pH môi trường, xúc tác bẻ gãy đường saccharose trong khử trùng . Điều tra tác dụng của than hoạt tính trong khử trùng và sự thuỷ phân đường trong môi trường nuôi cấy cho thấy. Sau khử trùng, ở môi trường MS + 5 % saccharose tỷ lệ đường thuỷ phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 % còn ở môi trường không có than hoạt tính là 20% [21]. Như vậy than hoạt tính có ảnh hưởng rõ ràng tới môi trường nuôi cấy. Ngoài ra than hoạt tính còn được công nhận là có tác dụng kích thích sự phát triển của mô in vitro như kích thích tạo củ của trinh nữ hoàng cung [1], tác dụng hình thành rễ ở cây bạch đàn, trầm hương [7]. Sau khi đã tạo được cây hoàn chỉnh có chất lượng tốt, các cây in vitro này được chuyển ra ngoài môi trường tự nhiên, giai đoạn này gặp nhiều khó khăn và có ảnh hưởng rất lớn đến năng suất nuôi cấy. 2.2.6.5. Ảnh hưởng của điều kiện ra cây Đây là giai đoạn quan trọng nhằm đưa cây nuôi cấy ra ngoài điều kiện tự nhiên, huấn luyện cây thích nghi với các điều kiện nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng tự nhiên và chuyển từ chế độ dị dưỡng sang chế độ tự dưỡng. Đối với một số cây có thể chuyển chồi chưa có rễ ra đất nhưng với đa số các loài cây trồng thì chỉ sau khi chồi đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới được cấy chuyển ra vườn ươm. Quá trình thích nghi dần với điều kiện ngoài vườn ươm cây con cần được chăm sóc đặc biệt. - Cây được trồng trong điều kiện được bảo vệ và được cung cấp đủ ẩm bằng cách tưới phun sương. - Giá thể trồng có thể là đất mùn, đất cát hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất - Các chất dinh dưỡng bón bổ sung thường ở dạng dung dịch phun qua lá Khi đã xác định được toàn bộ cách thức và các yếu tố cần thiết cho nuôi cấy thì có thể tạo ra được một quy trình sản xuất cây giống với quy mô công nghiệp hợp lý. Mặc dù với mỗi đối tượng có sai khác nhưng qua quá trình nghiên cứu và sản xuất cây giống từ cây nuôi cấy mô đã tổng kết quá trình này cơ bản có những bước chung. 2.2.7 Quá trình sản xuất cây nuôi cấy mô 2.2.7.1. Chuẩn bị mẫu làm vật liệu khởi đầu Đây là gia đoạn rất quan trọng, cần đặc biệt chú ý vì những đặc tính của vật liệu khởi đầu sẽ được duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này. Giai đoạn này bao gồm các khâu: - Chọn lọc cây mẹ để lấy mẫu, thường là cây ưu việt, khoẻ, có giá trị kinh tế cao - Chọn cơ quan để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non và hạt - Chọn mô để nuôi cấy, mô có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm sạch bệnh, giữ được các đặc tính ưu việt của cây mẹ, ít có nguy cơ biến dị. 2.2.7.2. Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng Đây là giai đoạn đưa các mẫu nuôi cây vào quá trình sản xuất vô trùng gồm các khâu sau: - Khử trùng bề mặt mẫu vật - Cấy mẫu đã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi trường nhân tạo Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus sẽ được lưu giữ trong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính. Sau một thời gian nhất định tuỳ thuộc vào loại cây, mẫu cấy đó được chuyển sang giai đoạn tiếp theo. 2.2.7.3. Nhân nhanh chồi Khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra, từ đó nhân lên thành các cụm chồi hoặc các phôi vô tính sinh trưởng tốt quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất. Giai đoạn này cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy vì vậy, thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh. Quy trình cấy chuyển nhân nhanh chồi thông thường diễn ra trong khoảng từ một đến hai tháng tháng tuỳ loại cây. Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển đạt khoảng 2- 8 lần/lần cấy chuyển. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma. Ví dụ: từ một chồi cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên khoảng 2000 - 3000 chồi cây sau 7 - 8 lần cấy chuyển [26]. Các chồi nhân nhanh cần được chuyển sang môi trường tạo rễ để tái sinh thành cây hoàn chỉnh. 2.2.7.4. Tạo rễ Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh nhưng thông thường các chồi này phải được cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ. Ở một số loài khác thì các chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực tiếp ra đất. Giai đoạn này trong vòng từ 2 - 8 tuần. Sau khi cây đã được tái sinh hoàn chỉnh sẽ được đưa trở về điều kiện tự nhiên để sản xuất đại trà. Để cây thích ứng được với điều kiện tự nhiên vốn rất khác biệt so với điều kiện phòng nuôi cần rất lưu ý đến quá trình chuyển cây ra vườn ươm. 2.2.7.5. Chuyển cây ra vườn ươm Đây là giai đoạn đầu tiên chuyển cây từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra điều kiện ngoài tự nhiên. Cây cần được chăm sóc cẩn thận để đạt tỷ lệ sống cao. Giai đoạn này đòi hỏi từ 4 - 16 tuần tuỳ từng đối tượng nghiên cứu. 2.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất xuyên khung Xuyên khung là loại cây có nguồn gốc ở khu vực miền núi của tỉnh Tứ Xuyên Trung Quốc, được người dân Trung Quốc đưa vào trồng trọt đến nay không còn thấy trong hoang dại. Xuyên khung được di thực vào Việt Nam từ năm 1964 tại trại thuốc Sapa, trại thuốc Tam đảo thuộc Viện Dược Liệu. Tại đây những nghiên cứu về xuyên khung được tiền hành. Nghiên cứu đầu tiên trên đối tượng này là việc tìm hiểu một số biện pháp kỹ thuật trồng trọt và nhân giống như: Biện pháp làm đất, mật độ và khoảng cách trồng, phân bón và kỹ thuật bón, thời vụ trồng. Từ đó đã đưa xuyên khung vào sản xuất đại trà ở một số vùng núi cao của các tỉnh Hà Giang, Cao Bằng, Sơn La, Lào Cai, Thanh Hoá. Sản lượng đáp ứng nhu cầu sử dụng trong nước, chủ yếu cung cấp cho thuốc y học cổ truyền và thuốc hạ nhiệt, giải cảm khung chỉ. Cuối những năm 60, Viện dược liệu đã tổng kết kinh nghiệm trồng xuyên khung trong tài liệu “Kỹ thuật trồng cây thuốc”, đề tài cấp bộ “Hồi cứu xây dựng qui trình trồng một số cây thuốc thiết yếu”, đã nghiên cứu kỹ thuật nhân giống bằng hom thân với các thí nghiệm xử lý mầm qua đông. Kỹ thuật trồng xuyên khung được xuất bản trong tài liệu “Kỹ thuật trồng , sử dụng và chế biến cây thuốc ” xuất bản năm 2005. Trong quá trình trồng trọt ở Việt Nam, do yếu tố khí hậu, đất đai, sâu bệnh và một số yếu tố kỹ thuật không phù hợp đã làm cho năng suất và chất lượng xuyên khung giảm sút, sản lượng không đáp ứng đủ nhu cầu tiêu dùng trong nước. Cho đến nay vấn đề thoái hoá xuyên khung chưa được quan tâm thích đáng và chưa có nghiên cứu nào nhằm khôi phục chất lượng giống. Cũng chính vì lý do trên nên hiện nay tổng diện tích trồng xuyên khung trong cả nước bị thu hẹp, vùng trồng rải rác manh mún nên những số liệu thông kê chính xác về diện tích, sản lượng trồng cây thuốc này chưa được thống kê chính xác và cụ thể. 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu - Nguồn vật liệu vật liệu cho khử trùng là chồi đỉnh của xuyên khung được thu hái từ thực địa - Nguồn vật liệu cho giai đoạn nhân nhanh chồi là chồi đơn được lựa chọn ở giai đoạn tạo nguồn vật liệu ban đầu. - Nguồn vật liệu cho giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh là các chồi đơn đủ tiêu chuẩn ( 4 lá/chồi, không bị biến dị ) ở giai đoạn nhân nhanh. - Môi trường nuôi cấy cơ bản: Là môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) có cải tiến, pH môi trường được điều chỉnh tới 5,8 và hấp dưới áp suất 0,8 kg/cm2 ở nhiệt độ 1200C trong 25phút. - Thành phần môi trường MS cải tiến gồm: + Khoáng đa lượng, vi lượng + Vitamin: Vitamin B1 với nồng độ 1mg/l Vitamin PP với nồng độ 1mg/l + Agar 7g/l - Chất điều hoà sinh trưởng: BA, IBA, αNAA, Kinetin - Các hợp chất hữu cơ (than hoạt tính, đường saccharose, nước dừa) - Chất khử trùng clorua thuỷ ngân (HgCl2). - Giá thể ngoài vườn ươm: + Đất: Đất dùng trong thí nghiệm là đất phù sa được lấy từ bãi sông, thường được dùng để đóng bầu ươm nhiều loại cây con giống. + Cát: là loại cát đen cũng được hút từ sông sau đó được phơi và sàng sạch lẫn tạp. + Phân chuồng: Loại phân chuồng được dùng là phân được ủ hoai mục. - Dung dịch MS (chỉ gồm khoáng đa lượng và vi lượng): Đây là loại dung dịch được coi là tương đối giàu và cân đối phù hợp với nhiều loại cây trồng trong đó có cả cây một lá mầm và hai lá mầm. - Dung dịch dinh dưỡng AB [24]: Là một sản phẩm phân bón dạng lỏng do ông Lomarirton Pot người Australia nghiên cứu và sáng chế sau đó được sử dụng rất rộng rãi. Tới nay công nghệ sản xuất loại phân này đã được chuyển giao và sản xuất tại Trung Quốc. + Thành phần của phân gồm hai phần: . Loại dinh dưỡng A: chứa đầy đủ các chất đa, trung, vi lượng giúp cây trồng tăng cường khả năng tích luỹ phát triển rễ, củ, hoa, quả, hạt. . Loại dinh dưỡng B: chứa nhiều nguyên tố đa lượng chủ yếu là đạm, lân giúp cây phát triển về thân, lá, làm tăng chất xanh cho cây. + Cách dùng phun qua lá: Giai đoạn cây non: Phối trộn với tỷ lệ: 2B - 1A pha với nồng độ 1% Giai đoạn cây trưởng thành: Phối trộn với tỷ lệ: 1A - 1B pha với nồng độ 1%. 3.2 Nội dung nghiên cứu Nội dung nghiên cứu của đề tài được tóm tắt bằng sơ đồ thí nghiệm sau: Chồi đỉnh của xuyên khung Tạo nguồn vật liệu ban đầu Nhân nhanh chồi Tạo cây hoàn chỉnh Vườn ươm I. Tạo nguồn vật liệu ban đầu Ảnh hưởng của nồng độ khử trùng (0,07%; 0,1%; 0,15%) và thời gian khử trùng (5, 10, 15, 20 phút) tới hiệu quả khử trùng II. Giai đoạn nhân nhanh 1. Ảnh hưởng của Kienin 2. Ảnh hưởng của Kinetin + αNAA 3. Ảnh hưởng của BA 4. Ảnh hưởng của BA + αNAA 5. Ảnh hưởng của nước dừa III.Tạo cây hoàn chỉnh 1. Ảnh hưởng của αNAA 2. Ảnh hưởng của αNAA + than hoạt tính 3. Ảnh hưởng của IBA 4. Ảnh hưởng của IBA + than hoạt tính 5. Ảnh hưởng đường tới sự phát sinh hình thái IV. Giai đoạn ngòai vườn ươm 1. Ảnh hưởng của giá thể trồng 2. Ảnh hưởng của thời vụ ra cây 3. Ảnh hưởng của chế độ chăm sóc 3.2.1 Nội dung 1: Tạo nguồn vật liệu ban đầu Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,07%, 0,1%, 0,15% trong thời gian 5, 10, 15, 20 phút 3.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu giai đoạn nhân nhanh Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA tới hệ số nhân chồi của xuyên khung trong nuôi cấy Công thức 1: Môi trường MS Công thức 2: Môi trường MS + 0,5mg/l BA Công thức 3: Môi trường MS + 0,75mg/l BA Công thức 4: Môi trường MS + 1,0 mg/l BA Công thức 5: Môi trường MS + 1,5 mg/l BA Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và αNAA tới hệ số nhân chồi của xuyên khung trong nuôi cấy Công thức 1: Môi trường MS Công thức 2: Môi trường MS + C mg/lít BA + 0,1 mg/l αNAA Công thức 3: Môi trường MS + C mg/lít BA + 0,2 mg/l αNAA Công thức 4: Môi trường MS + C mg/lít BA + 0,3 mg/l αNAA (Trong đó C là nồng độ BA cho hệ số nhân chồi cao nhất) Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin tới hệ số nhân chồi của cây xuyên khung trong nuôi cấy Công thức 1: Môi trường MS Công thức 2: Môi trường MS + 0,5mg/l kinetin Công thức 3: Môi trường MS + 0,75mg/l kinetin Công thức 4: Môi trường MS + 1,0 mg/l kinetin Công thức 5: Môi trường MS + 1,5 mg/l kinetin Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp kinetin + αNAA tới hệ số nhân chồi của cây xuyên khung trong nuôi cấy C ông thức 1: Môi trường MS Công thức 2: Môi trường MS + D mg/lít BA + 0,1 mg/l αNAA Công thức 3: Môi trường MS + D mg/lít BA + 0,2 mg/l αNAA Công thức 4: Môi trường MS + D mg/lít BA + 0,3 mg/l αNAA (Trong đó D là nồng độ kinetin cho hệ số nhân chồi cao nhất) Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của nước dừa tới hệ số nhân chồi của xuyên khung trong nuôi cấy Công thức 1: MS Công thức 2: MS + 5% nước dừa Công thức 3: MS + 10% nước dừa Công thức 4: MS + 15% nước dừa Công thức 5: MS + 20% nước dừa 3.2.3 N ội dung 3: Nghiên cứu giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của αNAA tới sự ra rễ của cây xuyên khung trong nuôi cấy Công thức 1: Môi trường MS Công thức 2: Môi trường MS + 0,1mg/l αNAA Công thức 3: Môi trường MS + 0,3mg/l αNAA Công thức 4: Môi trường MS + 0,5mg/l αNAA Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của tổ hợp αNAA + than hoạt tính tới sự ra rễ của cây xuyên khung trong nuôi cấy Công thức 1: Môi trường MS Công thức 2: Môi trường MS + E mg/l αNAA + 0,25g/l than hoạt tính Công thức 3: Môi trường MS + E mg/l αNAA + 0,5g/l than hoạt tính Công thức 4: Môi trường MS + E mg/l αNAA + 1,0g/l than hoạt tính (Trong đ ó E l à nồng độ αNAA thích hợp nhất cho việc ra rễ) Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của IBA tới sự ra rễ của cây xuyên khung trong nuôi cấy Công thức 1: Môi trường MS Công thức 2: Môi trường MS + 0,1mg/l IBA Công thức 3: Môi trường MS + 0,3mg/l IBA Công thức 4: Môi trường MS + 0,5mg/l IBA Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của tổ hợp IBA + than hoạt tính tới sự ra rễ của cây xuyên khung trong nuôi cấy Công thức 1: Môi trường MS Công thức 2: Môi trường MS + F mg/l IBA + 0,25g/l than hoạt tính Công thức 3: Môi trường MS + F mg/l IBA+ 0,5g/l than hoạt tính Công thức 4: Môi trường MS + F mg/l IBA + 1,0g/l than hoạt tính (Trong đó F là nồng độ IBA thích hợp nhất cho việc ra rễ) 3.2.4 Nội dung 4: Giai đoạn ngoài vườn ươm Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ra cây tới tỷ lệ sống, tình hình sinh trưởng của cây xuyên khung ngoài vườn ươm Công thức 1: Giá thể cát Công thức 2: Giá thể đất Công thức 3: Giá thể hỗn hợp: đất + cát + phân chuồng hoai mục theo tỷ lệ 1: 1: 1 Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ ra cây tới tỷ lệ sống và tình hình sinh trưởng, phát triển của xuyên khung trong vườn ươm Thời vụ 1: 22/12/2008 Thời vụ 2: 12/01/2009 Thời vụ 3: 02/02/2009 Thời vụ 4: 22/02/ 2009 Thời vụ 5: 12/03/2009 Thời vụ 6: 02/04/ 2009 Thí nghiệm 13: Nghiên cứu chế độ chăm sóc cho cây xuyên khung ở ngoài vườn ươm Công thức 1: Phun dung dịch dinh dưỡng AB Công thức 2: Phun dung dịch MS (gồm khoáng đa lượng và vi lượng) Công thức 3: Phun dung dịch với nồng độ 1/2 MS Công thức 4: Phun dung dịch dinh dưỡng 1/4 MS Công thức 5: Phun nước sạch 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu, xử lý khử trùng và nuôi cấy mẫu - Phương pháp lấy mẫu: Cây được lựa chọn để lấy mẫu là những cây sinh trưởng khoẻ không bị sâu bệnh thường được lấy vào buổi sáng của ngày khô và có nắng trên mỗi cây lựa chọn chồi đỉnh khoẻ tương đối đồng đều nhau. - Phương pháp xử lý khử trùng mẫu được tóm tắt qua các bước sau: + Rửa nhiều lần bằng nước sạch, tránh làm dập mẫu + Ngâm trong nước xà phòng loãng khoảng 5 - 7 phút + Rửa sạch xà phòng + Tráng lại bằng nước cất + Mang mẫu vào phòng cấy, tráng lại bằng nước cất vô trùng + Khử trùng . Tráng qua cồn 750 trong thời gian 20 giây . Tráng lại bằng nước cất vô trùng . Ngâm trong trong dung dịch thuỷ ngân clorua nồng độ từ 0,07- 0, 15% trong thời gian từ 5 - 15 phút tuỳ từng công thức khử trùng . Tráng lại bằng nước cất vô trùng từ 4-5 lần . Ngâm trong nước cất vô trùng 15 phút Trong quá trình khử trùng, mẫu cấy được ngâm ngập hoàn toàn trong môi trường xử lý. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của tác nhân vô trùng lên mô cấy cần để lại một lớp màng mỏng bọc ngoài khi ngâm mẫu vào dung dịch diệt khuẩn, lớp cuối cùng này sẽ được cất bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mô lên môi trường nuôi cấy. Những phần mô bị tác nhân vô trùng làm trắng ra cũng cần được cắt bỏ trước khi cấy mẫu vào môi trường. - Phương pháp nuôi cấy: Các mẫu cấy sau khi đã khử trùng được đưa vào ống nghiệm chứa môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng. Chồi tái sinh một số lượng nhất định được chọn ra những chồi trội và cấy chúng vào các bình tam giác chứa môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau tuỳ thuộc vào mục đích từng thí nghiệm. Các mẫu xuyên khung trong thí nghiệm được nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo của phòng nuôi có quang chu kỳ là 14 giờ sáng/10giờ tối, cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ phòng 25 ± 20 C. Khi cây đạt yêu cầu về chiều cao (5- 6cm), số lá 3 - 4 lá, 3 - 4 rễ, kích thước rễ 1,5 - 2 cm được đưa ra nhà màn cách ly và được trồng trên ba loại giá thể khác nhau. 3.3.2 Phương pháp thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Các thí nghiệm in vitro được bố trí trong bình tam giác 250 ml. Mỗi công thức bố trí 10 bình, mỗi bình cấy 2 mẫu với 3 lần nhắc lại mỗi lần theo dõi 10 cây. Các thí nghiệm in vivo được bố trí trên các khay nhựa chuyên dụng cho việc ra cây có kích thước 60 x 40 cm, mỗi công thức trồng 30 cây, 3 lần nhắc lại mỗi lần theo dõi 10 cây. Các số liệu của thí nghiệm được xử lý bằng chương trình IRRISTAT. 3.3.3 Các chỉ tiêu theo dõi 3.3.3.1. Chỉ tiêu theo dõi trong phòng Tỷ lệ mẫu sống (%) = Tổng số mẫu sống x 100 Tổng số mẫu ban đầu Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tổng số mẫu chết x 100 Tổng số mẫu ban đầu Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi tạo thành Tổng số chồi đưa vào Chiều cao trung bình/chồi (cm) = Tổng chiều cao Tổng số chồi đưa vào Số lá trung bình/cây = Tổng số lá Tổng số cây theo dõi Tỷ lệ ra rễ (%) = Tổng số chồi ra rễ x 100 Tổng số chồi theo dõi Số rễ trung bình/chồi = Tổng số rễ Tổng số cây theo dõi Độ dài trung bình của rễ (cm) = Tổng chiều dài rễ Tổng số rễ - Chất lượng chồi +++: Tốt (chồi mập, lá to, xanh đậm) ++: Trung bình (chồi nhỏ, lá nhỏ, màu xanh) +: Yếu (chồi nhỏ, lá nhỏ, màu xanh nhạt) - Chất lượng rễ +++: Tốt (rễ mập, dài) ++: Trung bình (rễ ngắn, mảnh) +: Yếu (rễ ngắn, xốp, giòn) * Đánh giá kết quả ngoài vườn ươm Tỷ lệ cây sống (%) = Tổng số cây sống x 100 Tổng số cây theo dõi Tỷ lệ cây chết (%) = Tổng số cây chết x 100 Tổng số cây theo dõi Chiều cao trung bình/cây (cm) = Tổng chiều cao Tổng số cây theo dõi Số lá trung bình/cây = Tổng số lá Tổng số cây theo dõi 3.3.4 Địa điểm tiến hành thí nghiệm Các thí nghiệm trên được tiến hành tại phòng nuôi cấy mô thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học thuộc Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc - Viện Dược liệu Hà Nội Thực hiện đề tài từ 1/7/2008 – 1/6/2009 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Giai đoạn tạo nguồn vật liệu khởi đầu Đây là giai đoạn đầu tiên của quá trình nuôi cấy invitro, mẫu cấy được lấy từ ngoài sản xuất nên thường nhiễm các loại kí sinh như: vi khuẩn, virus, nấm... nên ngay ở giai đoạn đầu tiên này các thao tác kỹ thuật và các thí nghiệm cần phải đạt được những yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu sống, cao hơn thế, mẫu phải tồn tại, phân hoá, sinh trưởng tốt. Để đạt được mục đích này, cần phải tìm ra phương pháp khử trùng có hiệu quả. 4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ HgCl2 và thời gian khử trùng tới hiệu quả khử trùng mẫu xuyên khung đưa vào nuôi cấy Khử trùng mẫu là khâu đầu tiên của quá trình nuôi cấy nhằm loại bỏ các nguồn nấm, khuẩn, ...sống cộng sinh, kí sinh trên mẫu được đưa vào nuôi cấy, có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết quả khử trùng như thời gian khử trùng, hoá chất khử trùng, phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu .... Tuy nhiên trong kỹ thuật invitro, hai yếu tố ảnh hưởng sâu sắc nhất đến kết quả khử trùng được khẳng định là: hoá chất khử trùng và thời gian khử trùng. Loại hoá chất được sử dụng để làm sạch mẫu cấy thường là các chất hoá học như: canxihypocloxit (CaOCl2), natrihypoclorit (NaOCl), hyđroperoxit (H2O2), clorua thuỷ ngân (HgCl2).... Việc lựa chọn hoá chất, nồng độ, thời gian khử trùng phụ thuộc rất lớn vào đặc điểm tình trạng mẫu cấy. Xuyên khung thuộc họ hoa tán, là cây thân thảo, thân lại rỗng nên tương đối “nhạy cảm” với hoá chất khử trùng hơn nữa nguyên liệu đưa vào khử trùng là chồi ngọn, bộ phận non nhất trên cây nên việc lựa chọn nồng độ khử trùng có ảnh hưởng rất lớn đến tỷ lệ mẫu sống trong thí nghiệm. Đã có nhiều thí nghiệm nghiên cứu cho rằng, việc sử dụng clorua thuỷ ngân 0,1% tỏ ra ưu việt hơn các loại hoá chất khử trùng khác, ngoài ra dựa vào đặc điểm của nguyên liệu mẫu đưa vào khử trùng nên chúng tôi tiến hành thí nghiệm làm sạch mẫu cấy bằn._.05, tr 42 -44 Hoàng Minh tấn và cs (2004), Sinh lý thực vật, NXB Nông Nghiệp Vũ Quang Sáng (2005), Sinh lý học thực vật ứng dụng, NXB Nông Nghiệp Nguyễn Thanh Sắc (2008), Nghiên cứu xây dựng quy trình trồng cây ban Âu, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Quốc Gia Hà Nội 25. Mai Thị Tân, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn và cộng sự (1993), Phục tráng giống khoai tây Thường Tín bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Kết quả nghiên cứu khoa học , NXB Hà Nội Đoàn Thị Ái Thuyền, Nguyễn Thị Quỳnh, Trần Văn Minh, Nguyễn Đức Hùng, Nhân Giống chuối bằng phương pháp cấy mô, Trung tâm công nghệ Sinh Học Hà Nội Đoàn Thị Ái Thuyền, Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống cây kiwi, Trung tâm công nghệ Sinh Học Nguyễn Văn Uyển (1985), Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong công tác chọn giống cây trồng, NXB thành phố hồ Chí Minh Đỗ Năng Vịnh (2002), Công nghệ sinh học cây trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Vũ Văn Vụ (1992), Sinh lý thực vật ứng dụng, NXB Giáo dục Tài liệu tiÕng Anh Bammi, R.K., Randhava, G.S (1975), Dioscorea Improvement Project – Status Report. IJHR. Bangalore. Bhojwani S.S, Factors affecting in vitro stage of micropropagation. Plant physiol., 65 (Suppel) 90, 1980 (Abst). Bhojwani S.S and Razdan M.K. Plant tissue culture- Theory and practice, Elsevier Academic Publ., Amsterdam. Carlson R.F. (1964), Dwarf fruit trees, Mich. Agr. Ext. Serv.Bull.pp.432. Chaturvedi, H.C., Sinha, M. (1979), Mass propagation of Dioscorea floribunda by tissue culture. Ext. Bull. No 6. NBRI. Lucknow. India. Hartman H.T. Kester D.E, Davies F.T, Geneve R.L, Plant propagation, Principles and Practices. 6th edition,Practice Hall International, Inc, 1997. Limasset cad Cornel (1949), C.R Acad. Sci Paris 228. pp 1888-1890. Morel and Martin (1952), C.R Acad. Sci: pp 235, 1324 – 1325. Murashige, T., Serpa, M.,Jones, J.B. (1974), Clonal multiplication of Gerbera Through tissue culture. Hortcience, 9, pp175-180. Murashige, T., Plant Propagation through Tissue Culture Ann. Rev plant Physiol, 25, pp 136-166, 1974. Murashige T, Skoog F (1962), A revised medium for rapid growth on bio-assays with tabaco tissue culture. Physiol Plantar (Copenhague) Murashige T. (1980) Plant Growth, Substances & Commercial Uses of tissues Verlarg, Berlin, Heidelberg, Newyork . Narayanaswamy. 1972, The Wealth of Indian Raw Materials, Vol 9, Publications and Information Directorale, CSIR, New Delhi, pp 240- 244. Nickell, L.G (1973) , Test-tube Approaches to By pass Sex, Hawaiian Planter’s Record. 58, pp 239-314. Shad, R.R., Dalal, K.C. (1980), Propagation of liquorice by exillary bud cultures, In: Plant tissue Culture. Genetic Manipulation and Somatic Hybridisation of plant Cell. Eds.P.S.Rao, M.R. Heble and M.S. Chadha. Bhabha Atomic Research Centre, Bombay.40 Staritsky, G. (1970), Tissue culture of the oil palm (Elaeis guineensis Jacq) as a tool for its vegetative propagation, Euphytica, pp 288 – 292. Tài liệu tiếng Trung Thang dược bản thảo, cổ kinh trung Hoa Trang web eFloras. Org wikipedia. Org yhocotruyen.htmedsoft.com PHỤ LỤC XỬ LÝ THỐNG KÊ 1)Ảnh hưởng của nồng độ BA tới hệ số nhân chồi của cây xuyên khung BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE BA HSNC 20/ 8/** 22:45 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Anh huong cua nong do BA den he so nhan choi cay xuyen khung VARIATE V003 HSNC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 61.4000 15.3500 684.66 0.000 2 * RESIDUAL 10 .224200 .224200E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 61.6242 4.40173 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BA HSNC 20/ 8/** 22:45 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Anh huong cua nong do BA den he so nhan choi cay xuyen khung MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSNC CT1 3 1.50333 CT2 3 5.70000 CT3 3 7.30333 CT4 3 6.50000 CT5 3 4.50333 SE(N= 3) 0.864484E-01 5%LSD 10DF 0.272402 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BA HSNC 20/ 8/** 22:45 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Anh huong cua nong do BA den he so nhan choi cay xuyen khung F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSNC 15 5.1020 2.0980 0.14973 2.9 0.0000 2)Ảnh hưởng của BA và α NAA đến hệ số nhân chồi của xuyên khung trong nuôi cấy BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE BA NHSNC 20/ 8/** 22:49 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Anh huong cua BA va NAA den he so nhan choi cua cay xuyen khung VARIATE V003 HSNC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 41.2215 13.7405 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 8 .761340E-01 .951675E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 41.2977 3.75433 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BA NHSNC 20/ 8/** 22:49 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Anh huong cua BA va NAA den he so nhan choi cua cay xuyen khung MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSNC CT1 3 6.20000 CT2 3 8.10333 CT3 3 5.00333 CT4 3 3.00000 SE(N= 3) 0.563227E-01 5%LSD 8DF 0.183663 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BA NHSNC 20/ 8/** 22:49 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Anh huong cua BA va NAA den he so nhan choi cua cay xuyen khung F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSNC 12 5.5767 1.9376 0.97554E-01 1.7 0.0000 3)Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin tới hệ số nhân chồi của cây xuyên khung BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE K HSNC 20/ 8/** 22:51 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Anh huong cua nong do Kinetin den he so nhan choi cay xuyen khung VARIATE V003 HSNC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 12.4416 3.11041 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 10 .176664E-01 .176664E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 12.4593 .889950 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE K HSNC 20/ 8/** 22:51 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Anh huong cua nong do Kinetin den he so nhan choi cay xuyen khung MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSNC CT1 3 1.20000 CT2 3 1.30000 CT3 3 3.50000 CT4 3 3.00000 CT5 3 2.39667 SE(N= 3) 0.242669E-01 5%LSD 10DF 0.764658E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE K HSNC 20/ 8/** 22:51 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Anh huong cua nong do Kinetin den he so nhan choi cay xuyen khung F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSNC 15 2.2793 0.94337 0.42031E-01 1.8 0.0000 4)Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin + αNAA tới khả năng tạo cụm chồi của cây xuyên khung BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE K_N HSNC 20/ 8/** 22:52 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Anh huong cua to hop Kinetin + NAA den he so nhan choi cay xuyen khung VARIATE V003 HSNC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 22.4580 7.48601 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 8 .522662E-01 .653328E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 22.5103 2.04639 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE K_N HSNC 20/ 8/** 22:52 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Anh huong cua to hop Kinetin + NAA den he so nhan choi cay xuyen khung MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSNC CT1 3 5.10000 CT2 3 6.00000 CT3 3 4.20000 CT4 3 2.30333 SE(N= 3) 0.466665E-01 5%LSD 8DF 0.152175 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE K_N HSNC 20/ 8/** 22:52 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Anh huong cua to hop Kinetin + NAA den he so nhan choi cay xuyen khung F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSNC 12 4.4008 1.4305 0.80829E-01 1.8 0.0000 5)Ảnh hưởng của nước dừa tới khả năng nhân chồi của xuyên khung BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE NDUA_HSC 20/ 8/** 22:54 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Anh huong cua nuoc dua toi kha nang nhan choi cua cay xuyen khung VARIATE V003 HSNC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 8.19363 2.04841 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 10 .116664E-01 .116664E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 8.20529 .586092 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NDUA_HSC 20/ 8/** 22:54 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Anh huong cua nuoc dua toi kha nang nhan choi cua cay xuyen khung MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSNC CT1 3 1.00000 CT2 3 2.30333 CT3 3 3.00000 CT4 3 1.60000 CT5 3 1.20000 SE(N= 3) 0.197200E-01 5%LSD 10DF 0.621385E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NDUA_HSC 20/ 8/** 22:54 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Anh huong cua nuoc dua toi kha nang nhan choi cua cay xuyen khung F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSNC 15 1.8207 0.76557 0.34156E-01 1.9 0.0000 6)Ảnh hưởng của α NAA tới sự ra rễ của xuyên khung BALANCED ANOVA FOR VARIATE RE/CAY FILE N_ RARE 20/ 8/** 22:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Anh huong cua nong do NAA den su ra re xuyen khung VARIATE V003 RE/CAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 10.1025 3.36750 728.11 0.000 2 * RESIDUAL 8 .369998E-01 .462497E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 10.1395 .921773 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE N_ RARE 20/ 8/** 22:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Anh huong cua nong do NAA den su ra re xuyen khung MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS RE/CAY CT1 3 3.00000 CT2 3 4.30000 CT3 3 5.50000 CT4 3 3.70000 SE(N= 3) 0.392639E-01 5%LSD 8DF 0.128036 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE N_ RARE 20/ 8/** 22:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Anh huong cua nong do NAA den su ra re xuyen khung F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | RE/CAY 12 4.1250 0.96009 0.68007E-01 1.6 0.0000 7)Ảnh hưởng của α NAA + than hoạt tính đến sự ra rễ của xuyên khung BALANCED ANOVA FOR VARIATE RE/CHOI FILE N T _RE 20/ 8/** 23: 1 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Anh huong cua NAA + than hoat tinh den so re/choi cua xuyen khung VARIATE V003 RE/CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 12.0825 4.02750 331.47 0.000 2 * RESIDUAL 8 .972024E-01 .121503E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 12.1797 1.10725 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE N T _RE 20/ 8/** 23: 1 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Anh huong cua NAA + than hoat tinh den so re/choi cua xuyen khung MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS RE/CHOI CT1 3 5.50000 CT2 3 5.90000 CT3 3 6.50000 CT4 3 3.80000 SE(N= 3) 0.636404E-01 5%LSD 8DF 0.207525 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE N T _RE 20/ 8/** 23: 1 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Anh huong cua NAA + than hoat tinh den so re/choi cua xuyen khung F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | RE/CHOI 12 5.4250 1.0523 0.11023 2.0 0.0000 8)Ảnh hưởng của nồng độ IBA tới khả năng ra rễ của xuyên khung BALANCED ANOVA FOR VARIATE RE/CHOI FILE IBA RE 20/ 8/** 23: 3 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Anh huong cua nong do IBA den su ra re cua xuyen khung VARIATE V003 RE/CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 87.6850 29.2283 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 8 .716691E-01 .895864E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 87.7567 7.97788 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE IBA RE 20/ 8/** 23: 3 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Anh huong cua nong do IBA den su ra re cua xuyen khung MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS RE/CHOI CT1 3 2.50000 CT2 3 6.99667 CT3 3 5.50000 CT4 3 0.000000 SE(N= 3) 0.546462E-01 5%LSD 8DF 0.178196 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE IBA RE 20/ 8/** 23: 3 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Anh huong cua nong do IBA den su ra re cua xuyen khung F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | RE/CHOI 12 3.7492 2.8245 0.94650E-01 2.5 0.0000 9)Ảnh hưởng của tổ hợp than hoạt tính + IBA lên sự tạo rễ của xuyên khung BALANCED ANOVA FOR VARIATE RE/CHOI FILE IBAT RE 20/ 8/** 23: 5 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Anh huong cua to hop than hoat tinh + IBA den su tao re xuyen khung VARIATE V003 RE/CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 9.18102 3.06034 108.59 0.000 2 * RESIDUAL 8 .225467 .281834E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 9.40649 .855136 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE IBAT RE 20/ 8/** 23: 5 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Anh huong cua to hop than hoat tinh + IBA den su tao re xuyen khung MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS RE/CHOI CT1 3 7.00333 CT2 3 8.20000 CT3 3 9.40000 CT4 3 7.70000 SE(N= 3) 0.969251E-01 5%LSD 8DF 0.316063 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE IBAT RE 20/ 8/** 23: 5 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Anh huong cua to hop than hoat tinh + IBA den su tao re xuyen khung F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | RE/CHOI 12 8.0758 0.92474 0.16788 2.1 0.0000 10) Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự sinh trưởng của cây xuyên khung BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CHOI FILE DUONG 20/ 8/** 23: 9 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Anh huong cua nong do duong den su sinh truong cua xuyen khung VARIATE V003 CAO CHOI CHOI CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 20.4472 5.11181 143.86 0.000 2 * RESIDUAL 10 .355336 .355336E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 20.8026 1.48590 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE RE/CHOI FILE DUONG 20/ 8/** 23: 9 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Anh huong cua nong do duong den su sinh truong cua xuyen khung VARIATE V004 RE/CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 10.1080 2.52701 422.10 0.000 2 * RESIDUAL 10 .598672E-01 .598672E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 10.1679 .726278 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE DUONG 20/ 8/** 23: 9 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Anh huong cua nong do duong den su sinh truong cua xuyen khung MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS CAO CHOI RE/CHOI CT1 3 7.00333 1.99667 CT2 3 8.50000 3.20000 CT3 3 7.60000 4.40000 CT4 3 6.50000 4.00000 CT5 3 5.00333 3.40000 SE(N= 3) 0.108833 0.446719E-01 5%LSD 10DF 0.342935 0.140763 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE DUONG 20/ 8/** 23: 9 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 Anh huong cua nong do duong den su sinh truong cua xuyen khung F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CAO CHOI 15 6.9213 1.2190 0.18850 2.7 0.0000 RE/CHOI 15 3.3993 0.85222 0.77374E-01 2.3 0.0000 12)Ảnh hưởng của giá thể ra cây tới tình hình sinh trưởng của xuyên khung ngoài vườn ươm BALANCED ANOVA FOR VARIATE H_CAY FILE GIA THE 20/ 8/** 23:15 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Anh huong cua gia the ra cay den tinh hinh sinh truong cua xuyen khung ngoai vuon uom VARIATE V003 H_CAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .194289 .971445E-01 0.61 0.591 3 2 CT$ 2 13.4700 6.73501 42.08 0.003 3 * RESIDUAL 4 .640177 .160044 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 14.3045 1.78806 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO LA FILE GIA THE 20/ 8/** 23:15 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Anh huong cua gia the ra cay den tinh hinh sinh truong cua xuyen khung ngoai vuon uom VARIATE V004 SO LA LA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .128356 .641778E-01 38.25 0.004 3 2 CT$ 2 1.32936 .664678 396.17 0.000 3 * RESIDUAL 4 .671110E-02 .167778E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 1.46442 .183053 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE GIA THE 20/ 8/** 23:15 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Anh huong cua gia the ra cay den tinh hinh sinh truong cua xuyen khung ngoai vuon uom MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------- NLAI NOS H_CAY SO LA 1 3 10.6067 3.65000 2 3 10.6033 3.90333 3 3 10.2933 3.65000 SE(N= 3) 0.230972 0.236487E-01 5%LSD 4DF 0.905361 0.926976E-01 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS H_CAY SO LA CT1 3 9.00333 3.20333 CT2 3 12.0000 3.90000 CT3 3 10.5000 4.10000 SE(N= 3) 0.230972 0.236487E-01 5%LSD 4DF 0.905361 0.926976E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE GIA THE 20/ 8/** 23:15 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 Anh huong cua gia the ra cay den tinh hinh sinh truong cua xuyen khung ngoai vuon uom F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | H_CAY 9 10.501 1.3372 0.40006 3.8 0.5908 0.0034 SO LA 9 3.7344 0.42785 0.40961E-01 1.1 0.0039 0.0003 13)Ảnh hưởng của thời vụ ra cây tới sự sinh trưởng của cây xuyên khung BALANCED ANOVA FOR VARIATE H_CAY FILE THOI VU 20/ 8/** 23:16 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Anh huong cua thoi vu den tinh hinh sinh truong cua xuyen khung ngoai vuon uom VARIATE V003 H_CAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .231078 .115539 1.05 0.386 3 2 CT$ 5 101.021 20.2043 184.02 0.000 3 * RESIDUAL 10 1.09794 .109794 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 102.350 6.02061 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO LA FILE THOI VU 20/ 8/** 23:16 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Anh huong cua thoi vu den tinh hinh sinh truong cua xuyen khung ngoai vuon uom VARIATE V004 SO LA LA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .348100 .174050 134.93 0.000 3 2 CT$ 5 16.6101 3.32201 ****** 0.000 3 * RESIDUAL 10 .128996E-01 .128996E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 16.9711 .998297 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THOI VU 20/ 8/** 23:16 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Anh huong cua thoi vu den tinh hinh sinh truong cua xuyen khung ngoai vuon uom MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------- NLAI NOS H_CAY SO LA 1 6 9.55333 5.07833 2 6 9.46667 4.78333 3 6 9.28167 4.78333 SE(N= 6) 0.135274 0.146627E-01 5%LSD 10DF 0.426252 0.462026E-01 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS H_CAY SO LA CT1 3 7.50000 4.50000 CT2 3 11.6000 6.29667 CT3 3 12.5033 5.79667 CT4 3 10.6000 5.00000 CT5 3 8.69667 4.29667 CT6 3 5.70333 3.40000 SE(N= 3) 0.191306 0.207361E-01 5%LSD 10DF 0.602811 0.653403E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THOI VU 20/ 8/** 23:16 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 Anh huong cua thoi vu den tinh hinh sinh truong cua xuyen khung ngoai vuon uom F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |CT$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | H_CAY 18 9.4339 2.4537 0.33135 3.5 0.3865 0.0000 SO LA 18 4.8817 0.99915 0.35916E-01 0.7 0.0000 0.0000 14)Ảnh hưởng của chế độ chăm sóc cây xuyên khung invitro ngoài vườn ươm BALANCED ANOVA FOR VARIATE H_CAY FILE CHAM SOC 20/ 8/** 23:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Anh huong cua che do cham soc den tinh hinh sinh truong cua xuyen khung ngoai vuon uom VARIATE V003 H_CAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 260.916 65.2290 143.01 0.000 2 * RESIDUAL 10 4.56121 .456121 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 265.477 18.9627 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO LA FILE CHAM SOC 20/ 8/** 23:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Anh huong cua che do cham soc den tinh hinh sinh truong cua xuyen khung ngoai vuon uom VARIATE V004 SO LA LA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 10.9440 2.73600 73.39 0.000 2 * RESIDUAL 10 .372801 .372801E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 11.3168 .808343 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CHAM SOC 20/ 8/** 23:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Anh huong cua che do cham soc den tinh hinh sinh truong cua xuyen khung ngoai vuon uom MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS H_CAY SO LA CT1 3 12.0000 4.20000 CT2 3 18.0000 5.00000 CT3 3 24.7000 6.50000 CT4 3 20.7000 6.00000 CT5 3 20.3000 6.20000 SE(N= 3) 0.389924 0.111475 5%LSD 10DF 1.22866 0.351262 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CHAM SOC 20/ 8/** 23:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 Anh huong cua che do cham soc den tinh hinh sinh truong cua xuyen khung ngoai vuon uom F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | H_CAY 15 19.140 4.3546 0.67537 3.5 0.0000 SO LA 15 5.5800 0.89908 0.19308 3.5 0.0000 ._.