đặt vấn đề
Hiện nay ở nước ta, việc nghiên cứu sinh dược học và dược động học của thuốc là một lĩnh vực tương đối mới, đang ngày càng được quan tâm. Trong khi đó, ở các nước khác, đây là một tiêu chí bắt buộc các hãng Dược phẩm phải làm nếu muốn đưa thuốc ra thị trường. Một trong những vấn đề đánh giá sinh dược học của thuốc là mức độ hấp thu thuốc và nồng độ thuốc đạt được trong huyết tương.
Các phương pháp phân tích hay dùng để xác định nồng độ thuốc trong huyết tương (dịch sinh vật) là sắ
37 trang |
Chia sẻ: huyen82 | Lượt xem: 1497 | Lượt tải: 0
Tóm tắt tài liệu Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
c ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ), sắc ký khí (GC), sắc ký khí gắn với máy khối phổ (GC - MS ), phóng xạ miễn dịch, điện di mao quản.... Trong đó, HPLC đặc biệt là HPLC pha đảo với detector UV là phương pháp hayđược dùng hơn cả, do tinh ưu việt nổi trội về độ nhạy, tính chính xác, độ chọn lọc, tính kinh tế.
Để có một qui trình dùng HPLC đảm bảo độ tin cậy để phân tích thuốc trong dịch sinh vật, chúng ta khảo sát các điều kiện sắc ký thích hợp như cột; dung môi pha động; lưu lượng dòng; bước sóng.... quy trình xử lý mẫu, khoản nồng độ khảo sát.
Ketoprofen- acid -2 (- benzoyl phenyl ) propionic - là thuốc chống viêm phi steroid; có tác dụng giảm đau, chống viêm, ức chế quá trình tổng hợp prostaglandin và leukotrien; ức chế sự kết dính tiểu cầu được dùng nhiều trong điều trị thấp khớp mãn tính, đặc biệt viêm đa khớp dạng thấp, thoái hoá khớp nặng. Ketoprofen là thuốc mới được đưa vào sản xuất ở nước ta và chưa có tài liệu trong nước nào đánh giá định lượng ketoprofen trong huyết tương. Do đó
chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương” với mục tiêu:
-Khảo sát và lựa chọn dung môi chiết ketoprofen trong huyết tương cho hiệu xuất chiết cao.
-Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng ketoprofen trong huyết tương .
-Xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương bằng HPLC.
-áp dụng định lượng ketoprofen trong huyết tương người sau khi uống thuốc và theo dõi độ ổn định của ketoprofen theo thời gian bảo quản.
Phần i: tổng quan.
1.1 Đại cương về Ketoprofen.
1.1.1 Công thức và tính chất lý hoá[1] [ 5].
CH – COOH
C
O
CH3
- Phân tử lượng : 254.29
- Tên khoa học :acid 2 ( - benzoyl phenyl ) propionic
- Tính chất: Bột kết tinh trắng, không mùi. Thực tế không tan trong nước ở 200C, tan hoàn toàn trong kiềm mạnh, ethanol 960, aceton cloroform và ether. pKa =5,94 trong hỗn hợp methanol - nước (3 : 1). Cực đại hấp thụ trong methanol ở bước sóng 255 nm. Nhiệt độ nóng chảy khoảng 950C.
1.1.2 Tác dụng dược lý và dược động học [5] [6].
Ketoprofen là thuốc chống viêm phi steroid, thuộc dẫn chất của acid aryl propionic, có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm. Ketoprofen ức chế quá trình tổng hợp prostaglandin và ức chế sự kết tập tiểu cầu.
Ketoprofen được hấp thu rất nhanh vào máu , đạt nồng độ tối đa sau
45 - 60 phút nếu đặt hậu môn và 60- 90 phút sau khi uống. Liên kết với protein huyết tương 99%, thời gian bán thải là 1,5-2,5 giờ. Sau khi uống 4 giờ nồng độ ketoprofen trong bao hoạt dịch cao hơn trong máu. Thuốc qua được hàng rào nhau thai. Một phần nhỏ chuyển hoá bằng cách hydroxyl hoá, còn phần lớn liên hợp với acid glucuronic. Thải trừ chủ yếu qua nước tiểu (75- 90%), một ít qua phân( 1-8% ). ở nước tiểu ( 65-75%) là dạng glucuronyl, 1% là dạng chưa biến đổi. Sau khi uống 6 giờ ketoprofen sẽ bị thải trừ 50% qua thận.
1.1.3 Chỉ định [5] [6]:
Ketoprofen được chỉ định điều trị dài hạn các triệu chứng trong:
- Viêm thấp khớp mãn tính, đặc biệt là viêm đa khớp dạng thấp, viêm cứng khớp cột sống.
- Bệnh cứng khớp gây đau và tàn phế.
Điều trị ngắn hạn các triệu chứng trong các cơn cấp tính của các bệnh:
- Bệnh thấp khớp ngoài khớp (đau vai cấp tính, viêm gân ... ).
- Viêm khớp vi tinh thể.
- Thoái hoá khớp.
- Dạng viên nang còn dùng để giảm đau: đau lưng, đau rễ thần kinh...
1.1.4 Chống chỉ định [6]:
- Dị ứng với ketoprofen, aspirin, và các thuốc chống viêm phi steroid cùng loại.
- Loét dạ dày-tá tràng tiến triển.
- Suy thận nặng, suy gan tế bào nặng.
- Phụ nữ có thai( 3 tháng cuối) và cho con bú.
1.1.5 Tác dụng không mong muốn [6]
- Tác dụng phụ ở đường tiêu hoá: khó chịu vùng dạ dày-ruột, đau dạ dày, buồn nôn, nôn mửa, táo bón, tiêu chảy, nặng thì loét dạ dày, xuất huyết tiêu hoá, thủng ruột.
- Nhức đầu, chóng mặt, buồn ngủ.
- Phản ứng quá mẫn ở da( nổi ban, mề đay, ngứa) và đường hô hấp (suyễn, nhất là những người dị ứng với aspirin và các kháng viêm không steroid khác).
- Giảm nhẹ hồng cầu ở người bị thiếu máu, một vài trường hợp giảm bạch cầu nhẹ đã được ghi nhận.
1.1.6 Liều dùng:
Liều khởi đầu: 300 mg chia làm 3 lần, uống khi no.
Liều duy trì: 150-200mg hoặc nạp ngày 1-2 viên thuốc đạn.
Tiêm bắp ngày100-200mg chia 2 lần.
Không nên phối hợp Ketoprofen với thuốc chống đông máu đường uống và các kháng viêm không steroid khác (kể cả salicylat liều cao) do làm tăng nguy cơ loét và xuất huyết tiêu hoá.
1.1.7 Dạng bào chế [5] [6].
- Viên nang 25mg, 50mg, 75mg.
- Viên nén 100mg, 150mg.
- Viến bao tan ở ruột 50mg.
- Viên bao tác dụng kéo dài 200mg, viên nang tác dụng kéo dài 100mg, 150mg, 200mg.
- Thuốc tiêm 100mg.
- Thuốc mỡ 2,5%.
Biệt dược: Biprofenid, Profenid, Kefenid, Fastum, Ketum, Ketopron….
1.1.8 Các phương pháp định lượng.
A. Phương pháp acid- bazơ:
Định lượng ketoprofen nguyên liệu, xác định điểm tương đương bằng chỉ thị đỏ phenol [18] hoặc bằng phương pháp đo điện thế [ 10] [18].
Tiến hành:
Hoà tan khoảng 200mg Ketoprofen (cân chính xác) vào 25ml alcol. Thêm 25ml nước và vài giọt đỏ phenol. Chuẩn độ với NaOH 0,1N.
Song song làm một mẫu trắng trong cùng điều kiện.
1ml NaOH 0,1N tương đương với 25,43mg C16H14O3.
- Hoặc: Hoà tan khoảng 200mg Ketoprofen (cân chính xác) vào 25ml alcol. Thêm 25ml nước Chuẩn độ với NaOH 0,1N, xác định điểm tương đương bằng bước nhảy điện thế.
1ml NaOH 0,1N tương đương với 25,43mg C16H14O3.
B. Phương pháp quang phổ [7] [8][10]:
Dùng để định lượng ketoprofen trong chế phẩm.
Hoà một lượng chế phẩm có chứa khoảng 50 mg ketoprofen (cân chính xác) trong 300 ml methanol 75 %, lắc trong 10 phút, thêm methanol 75 % vừa đủ 500 ml. Lọc. Lấy 5 ml dịch lọc pha loãng thành 100 ml với methanol 75 % và đem đo độ hấp thụ của dung dich này ở bước sóng 258nm; cuvet thạch anh có chiều dày 1 cm với mẫu trắng là methanol 75%.
Tính kết quả dựa vào A (1%, 1cm) ở bước sóng 258 nm là 662.
C. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ).
Dùng để định lượng ketoprofen trong huyết tương và xác định tạp chất trong nguyên liệu.
stt
tài liệu
pha động
cột
mẫu thử
1
[10] [18]
Đệm phosphat pH 3,5 - ACN - H2O (2:43:55)
C18 5mm
150*4,6 mm
Nguyên liệu
2
[10]
NH4CH3COO 1% - MeOH - ACN (55:30:15)
C18 5mm
200*4,6 mm
Nguyên liệu
3
[13]
Đệm phosphat pH 3,2 - ACN (60:40)
C18 2mm
250*4,6 mm
Huyết tương
4
[12]
NH4CH3COO 20 mM - MeOH; điều chỉnh pH 7,0.
C18 4 mm
Huyết tương
5
[11]
ACN : AcOH 1%
( 38 : 62 ).
C18 10mm
3,9*300 mm
Huyết tương
6
[16]
Đệm Phosphat 0,05M pH 7 : ACN (90 : 10 ).
C18 5 mm
4,6*250mm
Huyết tương
D. Phương pháp điện di mao quản: Định lượng ketoprofen trong huyết tương [14] và tách đồng phân của ketoprofen [17].
1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ).
Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography ) còn gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiện đại ra đời vào những năm cuối 1960. Nó được xây dựng và phát triển không ngừng và ngày càng thể hiện rõ tính ưu việt, đặc biệt là trong lĩnh vực nghiên cứu sinh dược học của thuốc.
Phân loại các phương pháp sắc ký [ 2]:
Sắc ký phân bố : + sắc ký lỏng- lỏng.
+sắc ký phân bố pha liên kết.
Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao.
Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel ( sắc ký theo loại cỡ ).
Trong phân tích sinh dược học và kiểm nghiệm, người ta hay sử dụng phương pháp sắc ký lỏng phân bố pha liên kết (Bonded Phase Chromatography ).
Đặc điểm phương pháp [2]:
Trong sắc ký lỏng phân bố pha liên kết, pha tĩnh được gắn hoá học (liên kết ) với chất mang ( Silicagel ) tạo nên hợp chất cơ Siloxan
Si
CH3
CH3
CH3
Cl
CH3
OH
Si
R
Si
Si
O
CH3
CH3
R
+
H3C
H3C
Nhóm Silanol Dẫn chất Dẫn chất Siloxan
của Silicagel clorosilan
- Nếu R là một nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl và dung môi phân cực như methanol, acetonitril thì có sắc ký pha đảo (sắc ký pha ngược ).
- Nếu R là nhóm khá phân cực như: alkylamin - ( - CH2- )n-NH2 hay alkyl nitril -( - CH2- )n- CN và dung môi ít phân cực như hexan thì ta có sắc ký pha thuận.
- Cách chọn pha: thường chọn pha tĩnh có tính chất phân cực giống các chất cần tách và khác với pha động.
Nguyên tắc của phương pháp [2] [3]:
Các chất trong hỗn hợp được tách dựa trên khả năng phân bố khác nhau của chúng vào hai pha không hoà lẫn vào nhau, luôn tiếp xúc nhau: một pha tĩnh và một pha động.
Dung dịch mẫu thử được đưa vào hệ thống sắc ký qua van tiêm mẫu và được dung môi pha động kéo tới cột phân tích nhờ một bơm cao áp. Tại cột xảy ra quá trình tách, những phân tử nào có ái lực thấp với pha tĩnh thì được rửa giải ra trước, còn những phân tử nào có ái lực mạnh với pha tĩnh thì được rửa giải ra sau. Chất ra khỏi cột được phát hiện bằng detector gắn với máy ghi, máy tính hay máy tích phân. Thời gian lưu tR là đặc trưng định tính của chất, chiều cao hay diện tích pic là đặc trưng định lượng của chất. Sắc ký được tiến hành so với chuẩn.
Một số thông số đặc trưng của HPLC [2]:
Ví dụ: Ta có 1 sắc đồ sau:
- Thời gian lưu tR ( phút ) là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh của pic. So sánh thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện ta sẽ định tính được chất đó.
- Thời gian chết tM ( phút ) là thời gian của một chất không bị lưu giữ tức là bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi.
Thời gian lưu hiệu chính tR, được tính theo công thức:
tR = tR, + tM ( hay tR, = tR - tM ).
- Thừa số dung lượng k’ dùng để mô tả tốc độ di chuyển của một chất
Qs t’R tR - tM VR -VM
k’ = = = =
QM tM tM VM
- Thừa số chọn lọc a : Mô tả tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất.
kB k’B t’R,B
a = = =
kA k’A t’R,A
Qui ước B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên a ³ 1. Để tách riêng 2 chất thì a > 1, thường từ 1,05 – 2,00.
Số đĩa lý thuyết N: Biểu thị hiệu lực cột sắc ký.
N = hoặc N =
Trong đó: WB chiều rộng pic ở đáy pic.
W1/2 chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh.
- Độ phân giải RS là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký. tR,B – tR,A
Rs =
1/2( WB + WA )
Để tách riêng hai chất, Rs ³ 1,5 ( khi 2 sắc đồ có độ lớn cùng cỡ ).
- Chiều cao pic hay diện tích pic là đặc trưng định lượng của chất. Khi so sánh chiều cao pic hay diện tích pic của mẫu thử và chuẩn trong cùng điều kiện làm ta tính được hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử.
Pha tĩnh và pha động trong HPLC [3].
*Pha tĩnh trong HPLC chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất phân tích. Nó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt từ 3-10mm, diện tích bề mặt riêng thường từ 50-500 m2/g.Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trên cột tách, người ta chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử. Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong kỹ thuật HPLC.
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký phân bố pha liên kết. Bản chất chính của sự tách trong loại sắc ký này là dựa trên khả năng tách của các chất trong hai pha không hoà lẫn vào nhau.
Các yêu cầu chung của pha tĩnh trong kỹ thuật HPLC:
+ Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, không có các phản ứng hoá học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân tích.
+ Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký.
+ Tính chất bề mặt phải ổn định.
+ Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
+ Cỡ hạt phải tương đối dồng nhất.
Pha tĩnh thường được chế tạo trên các chất nền sau:
+ Pha tĩnh trên nền Silicagel ( SiO2 )
+ Pha tĩnh trên nền Oxid nhôm ( Al2O3 )
+ Pha tĩnh trên nền cao phân tử hữu cơ ( polystyren, cellulo...)
+ Pha tĩnh trên nền mạch carbon.
Trong 4 loại này thì nền Silicagel được sử dụng nhiều nhất và pha tĩnh được chế tạo trên nền này cũng có nhiều ưu việt hơn, như khả năng chịu áp cao, độ trương nở nhỏ khi thay đổi dung môi rửa giải, bền với nhiệt.
*Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan ( chất phân tích ) ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trính sắc ký. Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ như Metanol, Acetonitril, n-Hexan, hay cũng có thể là hỗn hợp của hai hay nhiều dung môi trộn với nhau theo những tỷ lệ phù hợp. Nó cũng có thể là dung dịch nước của các muối có chứa chất đệm, chất tạo phức, chất làm chậm. Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải riêng cho nó, để có được hiệu quả tốt. Pha động là một trong những yếu tố quyết định thời gian lưu giữ của chất mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký, ảnh hưởng tới sự phân giải của chất trong pha tĩnh.
Pha động trong kỹ thuật HPLC cần phải thoả mãn một số điều kiện sau:
+ Phải trơ đối với pha tĩnh.
+ Phải hoà tan được chất mẫu
+ Phải bền vững theo thời gian
+Phải có độ tinh khiết cao
+ Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký
+ Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích.
Trong sắc ký phân bố pha liên kết, pha động là hệ dung môi phân cực, nó là những dung môi trộn lẫn đượcvới nước và trong nhiều trường hợp thì nước lại là một thành phần chính của pha động. Tiêu biểu và được dùng khá phổ biến trong loại sắc ký phân bố pha liên kết là các dung môi methanol, tetrahydrofuran, acetonitril, hay hỗn hợp của methanol, acetonitril với nước, với đệm.
Sắc ký phân bố pha liên kết được sử dụng rất phổ biến để tách nhiều loại hỗn hợp mẫu từ vô cơ đến hữu cơ, chất không phân cực đến phân cực.
Trong hệ pha này thì thành phần của pha động cũng ảnh hưởng đến kết quả tách sắc ký.
Cách tính kết quả trong phương pháp HPLC.
- Phương pháp đường chuẩn
- Phương pháp thêm
- Phương pháp so sánh
Đối với việc xác định nồng độ hoạt chất trong dịch sinh học, tính toán kết quả dựa vào đường chuẩn được xây dựng bằng cách chủ động cho chất chuẩn với nồng độ khác nhau vào dịch sinh vật. Xử lý mẫu và đem chạy sắc ký.
Phần 2: thực nghiệm và kết quả
2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu.
2.1.1 Nguyên vật liệu và hoá chất
*Nguyên vật liệu:
- Ketoprofen 99,3% (Đạt theo BP 2001).
- Ibuprofen 99,0 % (Đạt theo USP 24).
- Naproxen 99,6% (Đạt theo USP 24).
*Hoá chất:
- Acetonitril ( HPLC grade-Merck ).
- Methanol ( HPLC grade- Merck ).
- Acid acetic băng ( HPLC grade - Merck ).
- Triethylamin ( PA grade - Merck ).
*Dụng cụ:
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
+ Bơm cao áp Merck- Hitachi L-6000.
+ Detector Merck-Hitachi L-4000 UV.
+ Máy tích phân Merck - Hitachi D-2500 chromato-integrator.
+ Van tiêm mẫu Rheohyne 1725 - USA.
- Máy quang phổ Beckman DU-640 spectrophotometer (Mỹ).
- Máy lọc nước siêu sạch Elga (Anh).
- Cân phân tích Satorius (Đức).
- Ly tâm điện Jouan (Pháp).
- Máy siêu âm Branson (Mỹ).
- Máy lắc Labinco.
- Autopipet 10-100mcl, 100 - 1000mcl.
- Dụng cụ thuỷ tinh, bơm tiêm, ống nghiệm, bình định mức.
2.1.2 Phương pháp thực nghiệm
a.Khảo sát điều kiện sắc ký
Khảo sát chọn dung môi chiết Ketoprofen trong huyết tương
Khả năng chiết hoạt chất được biểu thị bằng hiệu suất chiết và khả năng loại tạp cản trở sự phát hiện ketoprofen trong mẫu phân tích.
Lắc 1 phút
Cắn
Dung môi hữu cơ
Mẫu thử được xử lý với các dung môi khác nhau theo sơ đồ sau:
Huyết tương
Lắc 5 phút
Ly tâm 15phút(3000 vòng/phút)
Khí
Pha động
Dịch chiết
Lọc
Ly tâm 15 phút(3000 vòng /phút)
Dịch lọc
Hình 1: Sơ đồ xử lý mẫu huyết tương ( chiết đơn )
Để tăng hiệu suất chiết, nhằm mục đích chiết kiệt hết hoạt chất trong huyết tương, ta tiến hành chiết lặp (chiết 3 lần). Tiến hành như sơ đồ 1 thực hiện thêm hai lần từ lúc thêm dung môi hữu cơ đến khi thu được cắn. Tất cả các dịch chiết của 3 lần được tập trung vào một ống nghiệm, đuổi dung môi thu được cắn như sơ đồ 1.
Tìm chất chuẩn nội.
Dùng những chất có công thức hoá học gần giống với ketoprofen cho vào huyết tương đã chứa ketoprofen, xử lý mẫu như sơ đồ hình 1. Chạy sắc ký để xác định thời gian lưu của chất chuẩn nội và ketoprofen, tính thừa số chọn lọc a ( tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất ) xem mức độ tách của hai chất. Chất chuẩn nội phải tách hẳn với ketoprofen , hiệu suất chiết ổn định, bền vững, phát hiện dễ dàng ở điều kiện sắc ký trên.
Khảo sát chọn hệ dung môi ( pha động ) chạy sắc ký.
Trong sắc ký phân bố pha liên kết, pha động là một hệ dung môi phân cực, hay dùng là các dung môi methanol, acetonitril, hay hỗn hợp của methanol, acetonitril với nước, với đệm.
Chuẩn bị các hệ dung môi khảo sát, tiến hành chạy sắc ký với từng hệ dung môi mẫu huyết tương có chứa ketoprofen và chuẩn nội được xử lý như sơ đồ hình 1.Tính RS của từng hệ dung môi từ đó chọn được hệ để phân tích ketoprfen trong huyết tương.
b.Xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương
Xây dựng đường chuẩn trong pha động:
Pha 1 dãy dung dịch hỗn hợp ketoprofen và chất chuẩn nội trong pha động với nồng độ ketoprofen lần lượt là 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml và nồng độ chất chuẩn nội là 25mg/ml. Tiến hành chạy sắc ký, xác định thời gian lưu và diện tích pic của ketoprofen và chuẩn nội, từ đó tính được tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và chất chuẩn nội . Xây dựng mối tương quan giữa nồng độ ketoprofen và tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và chất chuẩn nội.
Xây dựng đường chuẩn trong huyết tương.
Chủ động cho ketoprofen vào huyết tương để được một dãy các nồng độ 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml. Tiếp đó cho vào các ống nghiệm cùng một nồng độ chất chuẩn nội. Xử lý mẫu như sơ đồ hình 1.Chạy sắc ký, từ đó tìm ra mối tương quan giữa nồng độ ketoprrofen và tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và chất chuẩn nội.
Xác định tính chính xác của phương pháp (trong cùng một ngày và giữa các ngày phân tích).
Làm nhiều lần ở cùng một nồng độ để xác định sai số của phương pháp ( biểu thị bằng RSD ). Làm ở hai nồng độ : 0,5mcg/ml; 4mcg/ml.
Xác định tính đúng của phương pháp: Bằng phương pháp thêm
Thêm chính xác một lượng mẫu chuẩn vào mẫu thử đã biết nồng độ ketoprofen, xử lý mẫu như sơ đồ hình 1 và tiến hành chạy sắc ký. Tính % ketoprofen chuẩn tìm lại được.
ứng dụng
Dùng phương pháp đã xây dựng để định lượng ketoprofen mẫu huyết tương người sau khi uống viên nang ketoprofen 50 mg; 1,50 giờ và theo dõi độ bền vững của ketoprofen trong huyết tương bảo quản ở - 300C, sau 1; 2; 3 tháng.
2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét
2.2.1 Khảo sát tìm dung môi chiết xuất
Dung môi hữu cơ dùng để chiết xuất phải có khả năng hoà tan tốt ketoprofen và chất chuẩn nội, đồng thời phải loại được tạp chất và làm đông vón protein huyết tương. Khảo sát khả năng chiết của một số dung môi ta thu được kết quả sau:
Bảng 1: Hiệu suất chiết ketoprofen từ huyết tương.
Dung môi
Hiệu suất chiết (%)
Cloroform
Ether
Acetonitril
Ethylacetat
Dichloromethan
51.5
53.8
91.2
78.3
36,6
Từ kết quả trên cho thấy acetonitril có hiệu suất chiết ketoprofen cao nhất. Dùng Acetonitril chiết ketoprofen ở nồng độ 4mcg/ml. Chiết 1 lần và chiết 3 lần ta thu được kết quả sau:
Bảng 2 : Hiệu suất chiết Ketoprofen bằng ACN.
Lần
Chiết đơn ( % )
Chiết lặp ( % )
1
83,32
96,45
2
84,56
99,91
3
80,44
96,72
4
82,32
95,1
5
81,5
97,12
Trung bình
82,43
97,06
RSD
1,934
1,818
Thời gian chiết
60 phút
160 phút
Đối với mẫu chiết lặp, sau khi lấy riêng dịch chiết lần đầu, chiết lần hai, chiết lần ba, chiết lần bốn đuổi dung môi, hoà tan trong pha động và tiến hành chạy sắc ký thì không phát hiện được ketoprofen trong dịch chiết lần bốn. Như vậy chiết ba lần là phù hợp.
Nhận xét: Chiết lặp ketoprofen bằng ACN hiệu xuất chiết cao, gần như chiết được hết (97,06%) ketoprofen trong huyết tương, nhưng thời gian xử lý mẫu quá dài. Còn chiết đơn (chiết dưới hợp thức) ketoprofen trong huyết tương hiệu xuất chiết tuy thấp hơn ( 82,43% ), nhưng sai lệch giữa các lần làm không cao ( RSD = 1,934 ), so với chiết nhiều lần ( RSD = 1,818 ), và thời gian xử lý mẫu không quá dài. Do đó, có thể dùng ACN chiết một lần để chiết ketoprofen trong huyết tương mà vẫn thu được kết quả tốt.
2.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký: Dùng sắc ký phân bố pha đảo
Cột sắc ký:
Tiến hành khảo sát trên các cột sắc ký khác nhau: cột C8, cột C18, cột phenyl. Qua các kết quả thu được thấy cột C18 phù hợp.
Khảo sát tìm chất chuẩn nội :
Dùng những chất có công thức hoá học gần giống với ketoprofen, khảo sát để tìm ra chất chuẩn nội.
Chất chuẩn nội phải đảm bảo tách khỏi ketoprofen và ổn định trong điều kiện sắc ký.
Pha các dung dịch ketoprofen và acid-2-(4-isobutylphenyl) propionic, ketoprofen và acid -2-[( 6- methoxy) naphtyl] propionic (IS1)
trong pha động và trong huyết tương. Tiến hành chạy sắc ký, xác định thời gian lưu tR của các chất, tính thừa số chọn lọc a của các chất đối với ketoprofen, từ đó xác định chất nội chuẩn ( chất có a lớn nhất nhưng thời gian làm mẫu không quá dài).
Kết quả thu được như sau:
Chất
tR
a
CH
CH3
COOH
C
O
Ketoprofen
Acid - 2 ( - benzoyl phenyl ) propionic
6,77
CH3
CH
COOH
H3CO
Acid -2-[( 6- methoxy) naphtyl] propionic (IS1)
6,90
1,019
CH3
CH
COOH
CH2
CH
CH3
CH3
Acid - 2- ( 4 -isobutylphenyl ) propionic (IS2)
9,95
1,47
Trong đó a là tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất được đặc trưng bởi đại lượng thừa số chọn lọc hay hệ số chọn lọc. a càng lớn thì hai chất càng tách ra khỏi nhau, thường dùng a trong khoảng 1,05- 2,0. ở đây aIS2/ket > aIS1/ket nên khả năng tách của IS2 và ketoprofen sẽ tốt hơn khả năng tách của IS1 và Ketoprofen. Tốc độ di chuyển tỷ đối của IS2 và ketoprofen a = 1,47 và tR,IS2 = 9,96 nên thời gian làm mẫu cũng không quá lâu. Vì vậy, có thể dùng acid -2-(4 - isobutylphenyl) propionic làm nội chuẩn trong phương pháp định lượng Ketoprofen trong huyết tương .
Pha động:
Tiến hành khảo sát trên các hệ pha động khác nhau, xác định độ phân giải và khả năng tách của ketoprofen với các tạp chất trong huyết tương và khả năng tách của ketoprofen với chất chuẩn nội.
Chúng tôi đã tiến hành sắc ký, dùng cột C18 với các hệ pha động sau: ACN: dung dịch đệm phosphat 0,05M pH = 7 (90 : 10).
NH4CH3COO 1%: MeOH: ACN (điều chỉnh về pH= 6,5 bằng CH3COOH băng) ( 55 : 30 : 15 )
MeOH: AcOH: H2O ( 50 : 1 : 49 ).
ACN: AcOH : H2O ( 60 : 1 : 39 ).
Nhận xét : Các hệ 1, 2, 3 cho kết quả tách không tốt, ketoprofen chưa tách được khỏi tạp chất cũng như chất chuẩn nội. Riêng hệ 4 đã cho kết quả tách tốt nhưng các pic còn bị tù và chân pic tách không gọn. Khi ta cho thêm Triethylamin vào thì các pic sắc nét hơn và chân pic gọn hơn. Khảo sát hệ dung môi gồm 4 thành phần ( ACN, AcOH, Tri, H2O ) với các tỷ lệ ACN là 60, 50, 40, ta thu được các sắc đồ sau:
Hình 2: Hệ ACN : AcOH : Tri : H2O ( 40 : 1 : 0,3 : 58,7 ).
Hình 3 : Hệ ACN : AcOH : Tri : H2O ( 50 : 1 : 0,3 : 48,7 ).
Hình 4 : Hệ ACN : AcOH : Tri : H2O ( 60 : 1 : 0,3 : 38,7 ).
Hình 2
Hình 3 Hình 4
Bảng 3: Kết quả RS của các hệ dung môi đã chạy
STT
ACN
AcOH
Tri
Lưu lượng dòng
(ml/phút)
RS , 1
RS ,2
RS ,3
Thời gian
(phút)
1
60
1
0,3
0,85
0,97
0,99
0,97
11
2
60
1
0,3
1,2
1,05
1,44
1,22
10,62
3
60
1
0,3
0,5
1,23
1,41
0,98
12,5
4
50
1
0,3
0,5
1,05
1,28
0,99
20,28
5
50
1
0,3
0,85
1,63
1,61
1,09
17,94
6
50
1
0,3
0,85
1,39
2,99
1,35
16,52
7
40
1
0,3
1,2
2,04
6,39
6,39
25,5
8
40
1
0,3
0,5
7,35
17,28
17,28
50,71
9
40
1
0,3
0,85
2,2
8,08
6,96
30,28
Nhận xét: Độ phân giải RS của các hệ tăng dần khi tỷ lệ ACN giảm dần. Nhưng thời gian chạy sắc ký cũng tăng lên rất nhiều. Hệ 7, 8, 9 ( tỷ lệ ACN là 40 ) có độ phân giải RS cao nhất nhưng thời gian chạy sắc ký quá lâu. Hệ 6 có độ phân giải RS,1 =1,39; RS,2 =2,99; RS,3 =1,35 ; các pic tách nhau gần như hoàn toàn và thời gian chạy sắc ký không quá lâu. Do đó trong đề tài này chúng tôi chọn hệ dung môi pha động số 6.
ACN : AcOH : Tri : H2O ( 50 : 0,5 : 0,3 : 49,2 ).
*Bước sóng: Để tăng độ nhạy khi phát hiện ketoprofen trong huyết tương chúng tôi tiến hành xác định cực đại hấp thụ của ketoprofen trong điều kiện giống như phân tích mẫu thực.
Pha dung dịch ketoprofen chuẩn trong dung môi pha động. Quét phổ UV. Ketoprofen có cực đại hấp thụ ở bước sóng 253 nm.
Từ các kết quả trên, điều kiện sắc ký được chọn là:
- Pha tĩnh : Cột Nucleosil ODS 5mm (4,6*250 mm)
- Pha động: ACN: AcOH : Tri :H2O ( 50 : 0,5 : 0,3 : 48,7).
- Lưu lượng dòng: 0,85ml/ phút.
- Bước sóng : 253 nm.
- Thể tích mẫu tiêm : 50ml.
2.2.3. Xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương.
Xây dựng đường chuẩn trong pha động:
Pha một dãy các dung dịch hỗn hợp ket và IS trong pha động với các nồng độ của ket là 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml ; 0,8mcg/ml ; 2mcg/ml ; 5mcg/ml và nồng độ IS là 25mcg/ml.
Tiến hành chạy sắc ký với điều kiện như ở trang 21. Kết quả thu được biểu thị bằng diện tích pic từ đó tính tỷ số diện tích pic của ket và IS .
Bảng 4: Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng Ketoprofen trong pha động
Nồng độ
( mcg/ml )
0,05
0,2
0,8
2
5
AKet
4245
17779
900375
242424
613525
AIS
118674
110665
127804
119413
114211
RKet/IS
0,036
0,161
0,704
2,030
5,372
Đồ thị 1 : Đường chuẩn Ketoprofen trong pha động.
Phương trình hồi qui y = 1,085 x - 0,087
Trong đó: y là tỷ số diện tích pic giữa Ket và IS
x là nồng độ Ketoprofen (mcg/ml ).
Hệ số tương quan hồi qui : r = 0,9998.
Xây dựng đường chuẩn trong huyết tương .
Chuẩn bị một thang chuẩn trong huyết tương với các nồng độ ket là 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml, nồng độ IS 25mcg/ml. Tiến hành xử lý mẫu như sơ đồ hình 1 và tiến hành chạy sắc ký với điều kiện như ở trang 21. Kết quả thu được biểu thị bằng diện tích pic, từ đó tính RKet/IS.
Bảng 5 : Kết quả xây dựng đường chuẩn Ketoprofen trong huyết tương.
Nồng độ
( mcg /ml )
0,05
0,2
0,8
2
5
AKet
3882
14047
86292
232658
607150
AIS
105190
105131
105812
104177
106458
RKet/IS
0,037
0,134
0,815
2,233
5,730
Đồ thị 2 : Đường chuẩn định lượng Ketoprofen trong huyết tương .
Phương trình hồi qui : y = 1,154x - 0,074
Trong đó : y là tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và IS
x là nồng độ Ketoprofen ( mcg/ml ).
Hệ số tương quan hồi qui : r= 0,9998
y + 0,074
Từ đó suy ra: x =
1,154
Như vậy, đường chuẩn của ket/ huyết tương có độ dốc lớn hơn (1,154) so với đường chuẩn của nó trong pha động (1,085), do đó đường chuẩn có xu hướng đi lên.
Xác định tính chính xác của phương pháp.
Lấy các mẫu huyết tương có chứa ketoprofen với các nồng độ 0,5 mcg/ml; 4mcg /ml và chất chuẩn nội có nồng độ 25 mcg /ml. Xử lý mẫu như sơ đồ hình 1 và tiến hành chạy sắc ký với các điều kiện như ở trang 21. Kết quả thu được biểu thị bằng diện tích pic, từ đó tính được tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và IS.
C
0,5 mcg/ml
4mcg/ml
AKet
AIS
RKet/IS
AKet
AIS
RKet/IS
1
55794
119470
0,4659
484278
115522
4,192
2
61432
128838
0,4768
483315
116414
4,152
3
57239
118666
0,4723
475357
114211
4,162
4
57678
129152
0,4466
483012
115792
4,171
5
58622
125792
0,4660
482356
116534
4,139
6
64353
148740
0,4426
476235
115235
4,132
TB
Phương sai
RSD
0,4617
TB
Phương sai
RSD
4,158
0,0139
0,0219
3,016
0,528
Chúng tôi tiến hành xác định độ chính xác như trên ở một ngày phân tích khác. Kết quả thu được như sau:
0,5 mcg/ml
4mcg/ml
TB
Phương sai
RSD
0,4922
TB
Phương sai
RSD
4,037
0,0123
0,023
2,5
0,581
Từ các kết quả thu được (trong cùng một ngày và giữa các ngày phân tích) để đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương ở 2 nồng độ 0,5mcg/ml; 4mcg/ml với n = 6, cho thấy phương pháp có tính chính xác cao.
Tính đúng của phương pháp:
- Mẫu thử: huyết tương người sau khi uống viên nang ketoprofen 50 mg khoảng 90 phút, thêm IS 25mcg/ml.
- Mẫu chuẩn: Ketoprofen chuẩn 0,8mcg/ml trong huyết tương, thêm IS 25 mcg/ml.
- Mẫu chuẩn + thử: mẫu thử + ketoprofen chuẩn 0,8mcg/ml + IS 25mcg/ml.
Xử lý các mẫu trên như sơ đồ hình 1. Tiến hành chạy sắc ký với các điều kiện như ở trang 21. Xác định tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và IS, ta có các sắc đồ sau:
Hình 5: Mẫu trắng.
Hình 6: Mẫu chuẩn trong pha động.
Hình 7: Mẫu chuẩn trong huyết tương.
Hình 8: Mẫu thực.
Hình 5 Hình 6
Hình 7 Hình 8
Kết quả thu được biểu thị bằng tỷ số diện tích pic giữa Ketoprofen và chất nội chuẩn.
Mẫu
Chuẩn
Thử
Thử + Chuẩn
1
0,704
1,116
1,867
2
0,684
1,217
1,845
3
0,712
1,119
1,905
4
0,728
1,136
1,83
5
0,685
1,122
1,901
Trung bình
0,7032
1,142
1,8696
RSD
2,5506
3,372
1,778
Bảng 7 : Kết quả xác định tính đúng của phương pháp.
% Tìm lại =
Nhận xét: Như vậy, lượng ketoprofen chuẩn tìm lại là 103,5%, RSD = 1,778, n = 5 cho thấy phương pháp định lượng này có tính đúng đảm bảo cho phép định lượng ketoprofen trong huyết tương.
Kết luận: Với tính đúng đảm bảo, tính chính xác tốt và sự tuyến tính chặt chẽ giữa tỷ số diện tích pic ketoprofen / IS và nồng độ ketoprofen trong khoảng khảo sát, cho thấy phương pháp này có thể áp dụng để định lượng ketoprofen trong huyết tương.
* áp dụng
áp dụng định lượng mẫu thực: một người tình nguyện khoẻ mạnh, uống1 viên nang 50 mg, sau 90 phút lấy máu đem ly tâm để lấy huyết tương. Xử lý mẫu như sơ đồ hình 1, tiến hành chạy sắc ký thu được sắc đồ hình 9.
Thẩm định phương pháp dùng Detector UV Diod arrays (Phòng vật lý- Viện kiểm nghiệm - Bộ Y Tế) để định lượng ketoprofen trong mẫu thực
Chọn 5 điểm: chân phía trước của pic, 1/2 phía trước của pic, đỉnh pic, 1/2 phía sau của pic, chân phía sau của pic của Ketoprofen. Quét phổ hấp thụ. Song song làm mẫu chuẩn Ketoprofen trong pha động, chồng phổ hấp thụ của mẫu thực và mẫu chuẩn ở các điểm tương ứng nhau.
ở các điểm đều thu được hệ số Match ³ 995.
Hình 10: Chồng phổ hấp thụ của mẫu thực và mẫu chuẩn ở đỉnh pic.
Hình 9 Hình 10
Kết luận: với điều kiện xử lý mẫu đã chọn và chương trình sắc ký đã xây dựng cho thấy phương pháp này hoàn toàn thích hợp để định lượng Ketoprofen trong huyết tương.
Theo dõi độ ổn định của ket trong mẫu thử theo thời gian bảo quản.
Mẫu huyết tương người sau khi uống thuốc 90 phút, được bảo quản ở -300C, sau thời gian 1, 2, 3 tháng lấy ra đem xử lý mẫu như sơ đồ hình 1 và tiến hành chạy sắc ký với các điều kiện như ở trang 21. Tính kết quả ._.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
29846.doc