Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ cho tạo giống mía (Saccharum SSP.) chuyển gen

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI -------
 ------- BÙI NGỌC TRANG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH PHỤC VỤ CHO TẠO GIỐNG MÍA (SACCHARUM SSP.) CHUYỂN GEN LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT Mã số : 60.62.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS LÊ HUY HÀM HÀ NỘI - 2008 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i Lời cam ñoan Tôi xin cam ñoan rằng số liệu kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa sử dụng ñể bảo vệ trong một học vị nào. Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ trong luận văn này ñã ñược cảm ơn, mọi thông tin trích trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 09 năm 2008 Tác giả Bùi Ngọc Trang Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii Lời cảm ơn ðể hoàn thành luận văn, tôi nhận ñược rất nhiều sự quan tâm giúp ñỡ của mọi người. Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến các Thầy giáo, Cô giáo khoa Nông học, khoa Sau ðại học,bộ môn Công nghệ Sinh học, trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm luận văn.. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn, sự kính trọng sâu sắc nhất tới Thầy giáo - PGS.TS. Lê Huy Hàm, người ñã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn giúp ñỡ tôi thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Thị Lý Thu cùng tập thể cán bộ công nhân viên Viện Di truyền Nông nghiệp ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn bè ñồng nghiệp ñã ñộng viên giúp ñỡ tôi hoàn thành khoá học! Hà Nội, tháng 09 năm 2008 Tác giả Bùi Ngọc Trang Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Bảng kí hiệu các chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục biểu ñồ ix Danh mục hình x 1. Më ®Çu 1 1.1 ®Æt vÊn ®Ò 1 1.2 Môc ®Ých vµ yªu cÇu cña ®Ò tµi 3 1.2.1 Môc ®Ých 3 1.2.2 Yªu cÇu cña ®Ò tµi 3 1.3 ý nghÜa khoa häc vµ thùc tiÔn cña ®Ò tµi 3 1.3.1 ý nghÜa khoa häc 3 1.3.2 ý nghÜa thùc tiÔn 3 2. Tæng quan tµi liÖu 4 2.1 Mét sè nÐt vÒ c©y mÝa (Saccharum Ssp.) 4 2.1.1 Ph©n lo¹i vµ ®Æc ®iÓm thùc vËt häc 4 2.1.2 Ph©n bè vµ yªu cÇu sinh th¸i 5 2.1.3 Gi¸ trÞ c©y mÝa 6 2.2 C¬ së khoa häc cña x©y dùng hÖ thèng t¸i sinh 7 2.2.1 C¬ së khoa häc 7 2.2.2 Vai trß cña hÖ thèng t¸i sinh vµ mét sè hÖ thèng nu«i cÊy sö dông cho biÕn n¹p gen 8 2.3 Kü thuËt chuyÓn gen vµo thùc vËt 11 2.3.1 Kh¸i niÖm vÒ chuyÓn gen 11 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 2.3.2 C¸c ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen 11 2.3.3 Vai trß cña gen chØ thÞ trong kü thuËt chuyÓn gen 14 2.4 C¸c nghiªn cøu x©y dùng hÖ thèng t¸i sinh vµ chuyÓn gen vµo c©y mÝa 15 2.4.1 T×nh h×nh nghiªn cøu trªn thÕ giíi 15 2.4.2 T×nh h×nh nghiªn cøu ë ViÖt Nam 19 3. néi dung, vËt liÖu vµ Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 22 3.1 Néi dung nghiªn cøu 22 3.2.1 VËt liÖu thùc vËt 22 3.2.2 VËt liÖu di truyÒn 24 3.3 Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 25 3.3.1 M«i tr−êng nu«i cÊy 25 3.3.2 ChuÈn bÞ mÉu thÝ nghiÖm 25 3.3.3 Bè trÝ thÝ nghiÖm 25 3.3.4 ChØ tiªu theo dâi 33 3.3.5 Xö lý sè liÖu 34 4. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 35 4.1 §¸nh gi¸ kh¶ n¨ng t i¸ sinh c©y th«ng qua m« sÑo cña 4 gièng mÝa nhËp néi 35 4.1.1 ThÝ nghiÖm 1: §¸nh gi¸ kh¶ n¨ng t¹o m« sÑo tõ l¸ non cña 4 gièng mÝa 35 4.1.2 ThÝ nghiÖm 2: §¸nh gi¸ kh¶ n¨ng t¸i sinh cña 4 gièng mÝa 38 4.2 Nghiªn cøu x©y dùng hÖ thèng t¸i sinh 40 4.2.1 Giai ®o¹n khëi t¹o vµ nh©n m« sÑo 40 4.2.2 Giai ®o¹n t¸i sinh, nh©n chåi vµ ra rÔ 50 4.2. 3 Giai ®o¹n v−ên −¬m 62 4.3 Thö nghiÖm chuyÓn gen chØ thÞ GUS vµo m« sÑo cña c©y mÝa th«ng qua Agrobacterium tumefaciens 64 4.3.1 ThÝ nghiÖm 13. Lùa chän chñng vi khuÈn thÝch hîp cho thÝ nghiÖm chuyÓn gen vµo m« sÑo mÝa 65 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 4.3.2 ThÝ nghiÖm 14. Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña mËt ®é vi khuÈn ®Õn møc ®é biÓu hiÖn t¹m thêi cña gen gus ë m« sÑo mÝa 66 4.3.3 ThÝ nghiÖm 15. Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña AS tíi kh¶ n¨ng biÓu hiÖn t¹m thêi cña gen gus ë m« sÑo mÝa 67 4.3.4 ThÝ nghiÖm 16. Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña thêi gian l©y nhiÔm tíi kh¶ n¨ng biÓu hiÖn t¹m thêi cña gen gus ë m« sÑo mÝa 69 5. KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ 72 5.1 KÕt luËn 72 5.2 §Ò nghÞ 73 tµI LIÖU THAM KH¶O 76 pHô LôC 82 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi B¶ng kÝ hiÖu c¸c ch÷ viÕt t¾t §/C : §èi chøng §TST : §iÒu tiÕt sinh tr−ëng 2,4-D : 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid ADN : Acid deoxy ribo nucleic AS : Acetosyringone BAP : 6-Benzylaminopurine CS. : Céng sù CV : Correlation of Variants gus : β-glucuronidase IAA : Indole-3-acetic acid Ki : Kinetin (6-Furfurylaminopurine) LSD : Least Significant Difference MS : Murashige vµ Skoog, 1962 N6 : Chu vµ céng sù, 1975 OD600 : MËt ®é vi khuÈn ®o ë b−íc sãng 600 nm PCR : Polymerase Chain Reaction Q§ : QuÕ ®−êng ROC : Republic of China T-DNA : Transfered-DNA TDZ : Thidiazuron VIR : virulence X-Gluc : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid α-NAA : α-Naphtalenacetic acid Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1. ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo mô sẹo từ lá non mía 27 Bảng 2. ảnh hưởng phối hợp của auxin và cytokinin tới khả năng tạo mô sẹo từ lá non mía 27 Bảng 3. ảnh hưởng của cytokinin tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 28 Bảng 4. ảnh hưởng của cytokinin ñến khả năng nhân nhanh chồi mía 29 Bảng 5. Khả năng tạo mô sẹo từ lá non của 4 giống mía nhập nội 36 Bảng 6. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo của 4 giống giống mía nhập nội 38 Bảng 7. ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo 41 Bảng 8. ảnh hưởng của cytokinin trong tổ hợp với 2,4-D tới khả năng tạo mô sẹo 44 Bảng 9. ảnh hưởng của 2,4-D tới khả năng nhân mô sẹo trên hai nền môi trường MS và N6 46 Bảng 10. ảnh hưởng của hàm lượng 2,4-D tới khả năng nhân mô sẹo trên nền môi trường N6 48 Bảng 11. ảnh hưởng của Ki và BAP tới khả năng tái sinh cây từ mô sẹo 50 Bảng 12. ảnh hưởng của α-NAA phối hợp Ki tới khả năng tái sinh cây từ mô sẹo 54 Bảng 13. ảnh hưởng của Ki ñến khả năng nhân nhanh chồi mía 56 Bảng 14. ảnh hưởng phối hợp của auxin và Ki lên khả năng nhân nhanh chồi mía 58 Bảng 15. ảnh hưởng của α-NAA lên khả năng phát sinh rễ của chồi mía 60 Bảng 16. ảnh hưởng giá thể ñến Tỉ lệ sống của cây mía ngoài vườn ươm 62 Bảng 17. Lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumerfaciens thích hợp cho chuyển gen vào mô sẹo giống ROC 23 65 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii Bảng 18. ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn tới tỉ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở mô sẹo cây mía 66 Bảng 19. ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỉ lệ biểu hiện tạm thời 68 của gen gus 68 Bảng 20. ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới tỉ lệ biểu hiện 69 tạm thời của gen gus 69 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix DANH MỤC BIỂU ðỒ Biểu ñồ 1. Khả năng tạo mô sẹo của 4 giống mía 37 Biểu ñồ 2. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo của 4 giống mía 40 Biểu ñồ 3. ảnh hưởng của auxin tới khả năng khởi tạo mô sẹo của cây mía 42 Biểu ñồ 4. ảnh hưởng của cytokinin trong tổ hợp với 2,4-D 44 tới khả năng tạo mô sẹo cây mía 44 Biểu ñồ 5. Tương quan giữa nồng ñộ 2,4D và khả năng nhân mô sẹo trên hai nền môi trường MS, N6 47 Biểu ñồ 6. Tương quan giữa nồng ñộ 2,4-D và hệ số nhân mô sẹo của cây mía 49 Biểu ñồ 7. ảnh hưởng của cytokinin tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 51 Biểu ñồ 8. Tương quan giữa nồng ñộ α-NAA trong tác ñộng tổ hợp với Ki tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo cây mía 54 Biểu ñồ 9. Tương quan giữa nồng ñộ Ki và khả năng nhân nhanh chồi mía 57 Biểu ñồ 10. Tương quan giữa nồng ñộ auxin trong tác ñộng tổ hợp với Ki tới khả năng nhân nhanh chồi mía 58 Biểu ñồ 11. Tương quan giữa nồng α-NAAvà khả năng phát sinh rễ 61 của chồi mía 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… x DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cây mía (Saccharum ssp.) 4 Hình 2. Sơ ñồ thể hiện quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào thực vật 8 Hình 3. Vectơ nhị thể pCAMBIA1301 25 Hình 4. Kết quả tạo mô sẹo từ lá non của 4 giống mía nhập nội 37 Hình 5. Tái sinh cây từ mô sẹo của 4 giống mía 39 Hình 6. ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo mô sẹo của cây mía 43 Hình 7. Mô sẹo khởi tạo trên môi trường: (a) (b) 2 mg/l 2,4-D; 45 Hình 8. Mô sẹo ñược nhân trên môi trường 49 Hình 9. Chồi tái sinh từ mô sẹo 52 Hình 10. Chồi mía tái sinh trên các công thức: 55 Hình 11. Chồi mía ñược nhân nhanh trên công thức : 59 Hình 12. Cây con ra rễ trên môi trường: 62 Hình 14. Sơ ñồ hệ thống tái sinh ở giống mía ROC 23 64 Hình 15. Biểu hiện tạm thời của gen gus trên mô sẹo mía sau khi lây nhiễm với các chủng vi khuẩn A. Tumefaciens 66 Hình 16. Biểu hiện tạm thời của gen gus ở các mật ñộ vi khuẩn khác nhau 67 Hình 17. ảnh hưởng của hàm lượng AS tới biểu hiện tạm thời của gen gus 69 Hình 18 . ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới biểu hiện tạm thời của gen gus 70 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 1. MỞ ðẦU 1.1 ðẶT VẤN ðỀ Cây mía (Saccharum ssp.) là một trong những cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao, quan trọng ở các nước nhiệt ñới và á nhiệt ñới, ñược trồng ở hơn 70 nước trên thế giới. 70% lượng ñường trên thế giới ñược sản xuất từ cây mía [52]. Tầm quan trọng của mía ngày càng tăng bởi cây mía là nguồn nguyên liệu thô cho ngành công nghiệp ñường và các ngành công nghiệp sản xuất rượu, acid acetic, butanol, giấy, gỗ dán, công nghệ enzyme và thức ăn chăn nuôi. Những năm gần ñây, mía trở thành một trong những ñối tượng ñặc biệt ñược quan tâm trong chương trình sản xuất nhiên liệu sinh học. Ở Việt Nam, mía là nguồn nguyên liệu duy nhất cho ngành công nghiệp chế biến ñường. Triển vọng phát triển ngành trồng mía ở nước ta là rất lớn vì chúng ta có những ñiều kiện thuận lợi ñể nâng cao năng suất và sản lượng mía, ñáp ứng nhu cầu ñường trong nước cũng như xuất khẩu [4]. Hiện nay, ngành mía ñường nước ta ñã có những bước phát triển vượt bậc kể từ khi thực hiện chương trình 1 triệu tấn ñường do nghị quyết ðại hội ðảng lần thứ 8 ñề ra. Tuy nhiên, bình quân trên cả nước năng suất mía trong suốt giai ñoạn 1996 - 2005 chỉ tăng 1,5%/năm. Giai ñoạn 2005-2006 năng suất bình quân ñạt 55,3 tấn mía/ha, bằng 67% năng suất bình quân của toàn thế giới và thấp hơn nhiều các nước trong khu vực. Một số dự báo cho biết, với quy mô sản xuất như hiện nay thì năm 2010 Việt Nam phải nhập khẩu khoảng 500000- 600000 tấn ñường [54]. Tất cả các kết quả trên là hệ quả tất yếu của việc thiếu nguyên liệu mía. Thực tiễn sản xuất cho thấy, các vùng trồng mía trong nước còn thiếu giống năng suất tốt, chất lượng cao, hầu hết các giống mía ñang sản xuất là giống nhập nội. ðể khắc phục tình trạng ñó và ñạt chỉ tiêu ñịnh hướng tới 2020 mức sản xuất ñường sẽ là 2,1 triệu tấn, ðảng và nhà nước ta ñã và ñang triển khai nhiều biện pháp nhằm cải tạo giống mía. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 2 Trải qua hàng ngàn năm, bằng phương pháp chọn giống cổ truyền, người ta ñã ñưa ra hàng vạn giống cây trồng mới có ñặc ñiểm quí giá, phẩm chất tốt, song vẫn còn nhiều hạn chế như năng suất thấp, khả năng chống chịu sâu bệnh, ñiều kiện ngoại cảnh kém. Từ những năm 70, với sự ra ñời và ứng dụng mạnh mẽ của sinh học phân tử ñã ñem lại nhiều thành công trong công cuộc cải tạo giống cây trồng như: nuôi cấy tế bào trần, biến dị dòng soma, chuyển gen. Trong ñó, phương pháp chuyển gen là phương pháp hết sức mới mẻ, hữu hiệu, là một kỹ thuật thông dụng trong tạo giống cây trồng [5], ñặc biệt với cây mía- cây có mức bội thể cao (2n=36-170), hay có những biến ñổi về mặt di truyền mà các chương trình nhân giống thông thường khó có thể thực hiện ñược [55] . Ở Việt Nam, việc phát triển mía chủ yếu ở các vùng có ñiều kiện tự nhiên khó khăn không tưới (khô hạn), cây thường bị bệnh (nấm, virus, ñen ngọn...) làm giảm giá trị. Vì vậy, nghiên cứu chuyển gen mang ñặc tính có giá trị vào cây mía là một hướng ñi mới cần ñược quan tâm. Mía là cây tái sinh tốt, ñây là tiền ñề quan trọng cho việc xây dựng hệ thống tái sinh cây hoàn chỉnh làm cở sở cho các nghiên cứu chọn tạo giống mía chuyển gen. Tuy nhiên, ở nước ta chưa có tác giả nào nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ cho tạo giống mía bằng phương pháp chuyển gen. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ cho tạo giống mía (Saccharum ssp.) chuyển gen" Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 3 1.2 MỤC ðÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ðỀ TÀI 1.2.1 Mục ñích Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh cây mía (Saccharum ssp.) phục vụ cho tạo giống mía chuyển gen- làm cơ sở cho chọn tạo giống mía năng suất cao, chất lượng tốt,chống chịu những ñiều kiện bất thuận. 1.2.2 Yêu cầu của ñề tài - ðánh giá khả năng tạo mô sẹo từ lá non và tái sinh cây của 4 giống mía nhập nội - Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng tới khả năng hình thành, duy trì và nhân mô sẹo tạo nguyên liệu cho chuyển gen ở cây mía. - Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng tới khả năng tái sinh, nhân nhanh, ra rễ của chồi mía in vitro. - Xác ñịnh loại giá thể thích hợp cho tỉ lệ sống cao của cây mía in vitro ở giai ñoạn vườn ươm. - Thử nghiệm chuyển gen chỉ thị gus vào mô sẹo của cây mía thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ðỀ TÀI 1.3.1 Ý nghĩa khoa học ðề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học về vấn ñề hệ thống tái sinh và chuyển gen cây mía 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen tạo cơ sở cho việc chuyển các gen mang các ñặc tính có giá trị vào cây mía. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 4 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 MỘT SỐ NÉT VỀ CÂY MÍA (SACCHARUM SSP.) 2.1.1 Phân loại và ñặc ñiểm thực vật học Theo phân loại thực vật, cây mía thuộc: Giới: Thực vật (Plantae) Phân giới: Thực vật có mạch (Tracheobionta) Liên ngành: Thực vật có hạt (Spermatophyta) Ngành: Hạt kín (Magnoliophyta) Lớp: Một lá mầm (Liliopsida) Phân lớp: Commelinidae Bộ: Hoà thảo (Poales) Họ: Hòa thảo (Poaceae) Chi: Saccharum L. Hình 1. Cây mía (Saccharum ssp.) Trong chi Saccharum có 13 loài trong ñó có 5 loài ñặc biệt quan trọng trong sản xuất và lai tạo giống: - Loài Nhiệt ñới (Saccharum officinarum L.) - Loài Trung Quốc (Saccharum sinensis Roxb Emend. Jesw) - Loài Ấn ðộ (Saccharum barberi Jesw) - Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.) - Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround and Jesw) Cây mía thuộc nhóm thực vật quang hợp C4. Do vậy, nó ñược coi là một trong những cỗ máy chuyển hóa năng lượng mặt trời hiệu quả và có tiềm năng sản sinh ra một lượng lớn sinh khối [19]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 5 Cây mía thuộc họ hoà thảo, hoa lưỡng tính, mỗi hoa có 3 nhị ñực, 1 bầu noãn và 2 ñầu nhị cái. Hạt mía rất bé, kích thước khoảng 1-1,25 mm và nặng khoảng 0,15-0,25 g. Lá mía mọc thành 2 hàng so le, ñối nhau hoặc theo ñường vòng trên thân cây mía. Thân mía là ñối tượng thu hoạch, nguyên liệu ñể chế biến và là bộ phận làm giống cho các vụ sau, gồm nhiều lóng và ñốt hợp thành. Rễ mía thuộc loại rễ chùm. So với những cây hoà thảo ngắn ngày khác, cây mía có bộ rễ phát triển ñặc biệt mạnh (1 khóm có 500-2000 rễ; Tổng chiều dài rễ tới 100-500 m) [9] 2.1.2 Phân bố và yêu cầu sinh thái 2.1.2.1. Phân bố Mía là cây có nguồn gốc nhiệt ñới và á nhiệt ñới nên có cần nóng ấm và sợ giá rét. Trên thế giới, cây mía phân bố từ vĩ ñộ 35o bắc ñến 35o nam, phần lớn nằm từ vĩ ñộ 30o bắc ñến 30o nam, tương ñối ít ở vùng xích ñạo, tập trung nhiều ở gần nam, bắc chí tuyến. Về ñộ cao, cây mía phân bố từ vùng ñất thấp duyên hải ñến vùng ñồi, cao nguyên và giới hạn ñộ cao 1000-2000 m ở vùng xích ñạo, giới hạn 700 m ñộ cao ở vùng chí tuyến. 2.1.2.2. Yêu cầu sinh thái - Nhiệt ñộ: Mía sinh trưởng ñạt ñến mức ñộ tối ña khi nhiệt ñộ khoảng 30o-34o C. Nhìn chung, nhiệt ñộ thích hợp cho cả quá trình sinh trưởng là từ 24o – 30o C. - Ánh sáng: Mía là cây rất nhạy cảm với ánh sáng, cần cường ñộ ánh sáng mạnh và rất sợ bóng râm. Trong suốt cuộc ñời mình, cây mía cần khoảng 2000 ñến 3000h chiếu sáng, tối thiểu phải có từ 1200h chiếu sáng trở lên. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 6 - Nước: Mía là cây cần nhiều nước nhưng lại sợ úng thuỷ. ðể ñạt năng suất cao, mía cần một lượng mưa hữu hiệu tối thiểu là 1500mm cho cả chu kỳ sinh trưởng. Lượng mưa hữu hiệu ñó tương ñương với lượng mưa thực tế là 2000-2500mm. - ðất: ðất thích hợp với cây mía là loại ñất có khả năng giữ nước, hút nước tốt, ñất xốp, thoáng, có khoảng 40% chất rắn, 30% nước và 30% không khí. ðất ñạt các yêu cầu trên là ñất cát pha, ñất thịt nhẹ, ñất thịt trung bình và trong ñất còn chất hữu cơ, nhiều mùn. Thành phần cơ giới có 10-15% sét, 25- 35% limông, 40-50% cát. ðộ pH=5,5-7,5. 2.1.3 Giá trị cây mía Hiện nay, mía là nguyên liệu chủ yếu ñể chế biến ra ñường (chiếm 70%) trên thế giới. Một cân ñường cung cấp năng lượng tương ñương 0,5kg mỡ; 50-60kg rau quả. ðường cung cấp 10% nhu cầu năng lượng của cộng ñồng [9]. Bên cạnh ñó, mía còn là cây xoá ñói giảm nghèo cho nông dân trung du, miền núi, là cây có hiệu quả kinh tế cao nhờ vào ñặc tính thực vật học, cho nên mía có khả năng chịu hạn khá, có thể trồng trên các vùng ñồi núi. Nếu ñược chăm bón tốt, nó có thể cho 200-250 tấn sinh khối/ha/năm. Theo thống kê năm 2006 ở Việt Nam, giá bán 1 tấn mía cây trung bình là 700.000ñ, cao hơn nhiều lần các cây trồng khác. Do ñó, mía ñã trở thành cây làm giàu cho nhiều gia ñình, nhiều khu vực rộng lớn, nhất là vùng trung du và nhiều ñồi thấp. Theo dự báo của một số nhà khoa học về kinh tế, cuối thế kỷ XXI và các thể kỷ sau, năng lượng hoá thạch sẽ ngày càng cạn kiệt. Và ñể khắc phục tình trạng này, người ta ñã nghĩ ñến việc sử dụng năng lượng mới từ thực vật. Trong các cây có thể khai thác, chế biến ra nhiên liệu lỏng, cây mía ñược nhiều người quan tâm nhất và ñược xếp là cây năng lượng hàng ñầu trong số các loài thực vật. Từ 1 tấn mía tốt, người ta có thể sản xuất ra 35-50 lit cồn 96o – loại cồn thay xăng ñể chạy máy ñốt trong. 1 ha mía có thể sản xuất Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 7 7000-8000 lit cồn làm nhiên liệu [9]. Gần ñây, ở Mỹ ñã cố gắng sản xuất cồn nhiên liệu ñạt 5,67 tỷ lit/năm [6] Ngày nay, khi khoa học kỹ thuật phát triển thì giá trị cây mía ngày càng ñược nâng cao. Ngoài các giá trị ñã ñược biết ñến ở trên, xenllulozo trong bã mía ñược ngành giấy và công nghiệp gỗ ép, công nghiệp dệt khai thác. Công nghiệp hoá chất thông qua các phản ứng khử, oxy hoá, ester hoá... ñể sản xuất sobitol, glixerin, nannitol, axit gluconic... Từ bùn lọc có thể sản xuất sáp, chất béo và phân bón 2.2 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH 2.2.1 Cơ sở khoa học Việc xây dựng 1 hệ thống tái sinh ở thực vật nói chung và cây mía nói riêng có thể thực hiện ñược nhờ vào tính toàn năng của tế bào thực vật. Tính toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào ñã ñược biệt hoá (trừ một số loại tế bào ñã biệt hoá sâu như ống mạch, mao dẫn...) có khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có thể trong ñiều kiện phù hợp sẽ phát triển phôi dẫn ñến việc hình thành cây hoàn chỉnh mới Trong một cơ thể thực vật bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong ñó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện các chức năng khác nhau. Các mô có cấu trúc chuyên môn nhất ñịnh là nhờ sự phân hoá. Phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, ñảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Trong ñiều kiện thích hợp, các tế bào ñã phân hoá có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại phân chia mạnh mẽ. Qúa trình này gọi là quá trình phản phân hoá. Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá Sự phân hoá tế bào Sự phản phân hoá tế bào Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 8 Hình 2. Sơ ñồ thể hiện quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào thực vật [11]. Sự phân hoá cơ quan cũng như tái sinh cơ thể nguyên vẹn là kết quả của quá trình tái phân hoá các tế bào và mô nuôi cấy. Về mặt bản chất, các quá trình trên là sự hoạt hoá của các gen trong tế bào. Trong ñiều kiện tự nhiên, ở những giai ñoạn phát triển cá thể nhất ñịnh một số gen sẽ ñược hoạt hoá, một số gen khác sẽ bị ức chế theo ñúng chương trình ñã ñược mã hoá trong phân tử ADN. Trong nuôi cấy thực vật in vitro, con người có thể ñiều khiển ñược sự phân hoá và phản phân hoá ñể tái sinh một cây hoàn chỉnh từ mô, tế bào nhờ việc tạo ra những môi trường thích hợp cho mỗi loại ñối tượng thực vật. 2.2.2 Vai trò của hệ thống tái sinh và một số hệ thống nuôi cấy sử dụng cho biến nạp gen Trong quá trình chuyển gen thực vật, việc xây dựng ñược dạng tế bào ñích có khả năng tiếp nhận gen mới và tái sinh thành cây hoàn chỉnh là hết sức quan trọng. Vì vậy, hệ thống tái sinh là ñiều kiện tiên quyết ñể thực hiện thành công biến nạp gen. Xây dựng một hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây hoàn chỉnh là tiền ñề quan trọng cho các nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng nói chung và cây mía nói riêng. Một số hệ thống nuôi cấy thường ñược sử dụng: 2.2.2.1 Nuôi cấy phân hoá ðây là phương pháp dựa trên cơ sở nuôi cấy mô, từ các cơ quan xác ñịnh có sự phân hoá hình thành nên các cơ quan mới. Bao gồm 1 số phương pháp như: Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng và chồi bên; Nuôi cấy tạo chồi bất ñịnh ;Nuôi cấy tạo phôi vô tính. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 9 • Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng và chồi bên: Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng là một phương pháp cấy mô ñược ứng dụng rộng rãi nhất trong nông nghiệp và nghề làm vườn với các ưu ñiểm: - Nhân nhanh hàng loạt, ñồng nhất với số lượng lớn cây giống từ một cây mẹ ban ñầu - Loại trừ bệnh virus - Bảo quản quỹ gen in vitro - Sử dụng trong chuyển gen Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng là các mô phân sinh của ñỉnh sinh trưởng nằm ở chóp ñỉnh chồi. Kích thước mẫu nuôi cấy phụ thuộc vào loài thực vật và mục ñích nghiên cứu. • Nuôi cấy tạo chồi bất ñịnh Sự tái sinh chồi bất ñịnh chính là sự phát sinh, phân hoá các cơ quan nhằm tạo mới các chồi bất ñịnh trên mẫu từ nhiều nguồn khác nhau thông qua giai ñoạn callus. ðây là dạng nhân giống in vitro có thể sử dụng ñể tái sinh dòng hoặc nhân nhanh với lượng lớn. • Nuôi cấy tạo phôi vô tính Phôi vô tính là các thể nhân giống có cực tính, bắt nguồn từ các tế bào dinh dưỡng (tế bào soma). Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, ngoài các ñiều kiện vật lý, hoá học thuận lợi cho sự tạo phôi, còn phụ thuộc rất lớn vào loài, giống, chủng trong cùng một loài. Việc tạo ra phôi vô tính ở thực vật ñem lại tiềm năng ứng dụng với mục ñích nhân dòng số lượng lớn, nuôi cấy tế bào trần, tạo các biến dị soma có lợi... 2.2.2.2 Nuôi cấy không phân hoá Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 10 Từ các mô, cơ quan nuôi cấy sẽ tạo nên các khối tế bào vô tổ chức, không có hình dạng nhất ñịnh gọi là mô sẹo (callus) và ở những môi trường thích hợp, mô sẹo ñược nuôi cấy ñể nhân khối. • Nuôi cấy mô sẹo (callus) Mô sẹo là khối các tế bào mô mềm có mức ñộ cấu trúc di truyền thấp, chưa phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến ñộng di truyền cao. Mô sẹo thu ñược bằng nuôi cấy in vitro các cơ quan của thực vật như thân, rễ, lá, hoa... trong môi trường chứa chất ñiều tiết sinh trưởng nhóm auxin với ñiều kiện nuôi cấy thích hợp. Mô sẹo có thể ñược duy trì liên tục trên môi trường nuôi cấy bằng cách cấy chuyển ñịnh kì. • Nuôi cấy tế bào huyền phù Nuôi cấy tế bào huyền phù là kỹ thuật nuôi cấy tế bào ñơn hoặc cụm nhỏ tế bào trong môi trường lỏng. Các tế bào này cũng ñược tạo từ mô sẹo có nguồn gốc từ thân, rễ, lá, hoa, phôi... Tuy nhiên, nhược ñiểm của phương pháp này là thời gian nuôi cấy dài và ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng tái sinh cây. • Nuôi cấy tế bào trần Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao bọc chỉ còn lại khối nguyên sinh chất ñược bao bọc bởi màng nguyên sinh khi ñược nuôi cấy trên môi trường thích hợp thì tái tạo thành tế bào, phát triển thành khối mô sẹo và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Ứng dụng có ý nghĩa nhất của phương pháp này là tạo cây soma, tạo cây lai tế bào chất thông qua dung hợp tế bào trần và biến nạp gen. Tuy nhiên, nhằm mục ñích xây dựng một hệ thống nuôi cấy tái sinh cây phục vụ chuyển gen, cần nghiên cứu ñến khả năng sống sót của tế bào sau khi chuyển gen trên môi trường chọn lọc. Do vậy, hệ thống nuôi cấy qua mô sẹo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 11 thích hợp hơn cả với ưu ñiểm : Tỉ lệ tái sinh cây cao; Thời gian nuôi cấy không quá dài... Tái sinh cây qua con ñường mô sẹo có thể hình thành phôi hay tái sinh tạo chồi trực tiếp. Tuy nhiên, cây tái sinh từ phôi soma xuất phát từ một tế bào ñơn, riêng lẻ và phát triển thành một cây hoàn chỉnh nên duy trì ñược tính ñồng nhất của hệ gen và do vậy hạn chế hiện tượng khảm ở cây chuyển gen [1]. 2.3 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT 2.3.1 Khái niệm về chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ñưa một hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, ñộng vật...) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein ñặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các ñặc tính mới của cơ thể chuyển gen 2.3.2 Các phương pháp chuyển gen Chuyển gen hữu ích vào cây trồng là một trong những bước tiến nhảy vọt của công nghệ sinh học hiện nay. Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc rất lớn vào bản chất cây trồng, ñặc tính di truyền cũng như phương pháp biến nạp. Mục ñích chính của kỹ thuật chuyển gen là phải ñạt hiệu quả cao, áp dụng ñược với nhiều ñối tượng cây trồng, từ ñó các nhà nghiên cứu công nghệ gen ñã xây dựng nhiều giải pháp kỹ thuật chuyển gen khác nhau. Chuyển gen vào thực vật có thể chia làm 2 nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển gen trực tiếp. 2.3.2.1 Phương pháp chuyển gen gián tiếp • Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 12 ADN ñược chuyển vào tế bào thực vật nhờ cơ chế truyền ñặc trưng của loài vi khuẩn Agrobacterium làm môi giới. Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium thường ñược áp dụng thành công ở các loại cây 2 lá mầm. Nhờ áp dụng các kỹ thuật di truyền mà Ti-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium ñã trở thành một vectơ chuyển gen hữu hiệu. Người ta ñã có thể cắt bỏ những ñoạn gen cần thiết, lắp ráp, bổ sung các cấu trúc và các gen quan tâm vào các vị trí nằm giữa hai ñoạn biên của T-DNA. Phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium là phương pháp chuyển gen ñược sử dụng rộng rãi nhất, có nhiều ưu ñiểm hơn hẳn các phương pháp chyển gen khác như: - Số bản sao ñược chuyển vào tế bào thực vật rất thấp dẫn tới giảm sự không biểu hiện của các gen ñã chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao [37]. - Tránh ñược sự hình thành các cây chuyển gen khảm (hiện tượng thường gặp ở các phương pháp chuyển gen trực tiếp) [30]. Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn này ñã ñược áp dụng thành công trên nhiều ñối tượng cây trồng, ñặc biệt trên cây hai lá mầm. Người ta cũng ñã tìm ra các chủng Agrobacterium mẫn cảm với cây 1 lá mầm, trong ñó có ngô, lúa và ñã nhận ñược các cây chuyển gen hữu thụ bằng phương pháp này [35][36][42]. • Chuyển gen nhờ virus Ngoài vi khuẩn, người ta còn dùng virus làm vectơ chuyển gen cho cây trồng do virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật. Bên cạnh ñó, trong cấu tạo của virus cũng có mặt axit nucleic làm cơ sở cho việc gắn các gen cần chuyển vào. Tuy nhiên, việc chuyển gen nhờ virus ít ñược sử dụng do vius không truyền qua hạt nên việc nhân giống các cây chuyển gen nhờ virus phải tiến Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 13 hành bằng phương pháp vô tính- phương pháp không thể thực hiện ñược cho tất cả các loại cây. ðây chính là nhược ñiểm lớn nhất của phương pháp chuyển gen này. 2.3.2.2 Phương pháp chuyển gen trực tiếp • Phương pháp xung ñiện Phương pháp này dựa vào hiện tượng phóng ñiện ñể tạo lỗ trên màng tế bào, ñưa ADN vào tế bào dễ hơn, nhất là khi ADN ñã tiếp giáp với màng tế bào trong nuôi cấy tế bào trần hoặc mô sẹo. Tuy nhiên phương pháp này chưa có những kết quả chứng minh chắc chắn cho sự biến nạp. Hơn nữa, việc nuôi cấy tế bào trần ở một số loài cây trồng vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Phương pháp này chủ yếu dùng trong nghiên cứu biểu hiện tạm thời của các gen. • Phương pháp vi tiêm Phương pháp sử dụng loại kim siêu nhỏ và kính hiển vi ñể tiêm ADN vào những tế bào nhất ñịnh. Kỹ thuật này tạo ñược dòng biến nạp từ tế bào trần và cây biến nạp khảm từ nuôi cấy hạt phấn của cây cải dầu. Tuy nhiên, mỗi lần tiêm chỉ ñược một tế bào và thao tác ñòi hỏi rất khéo léo, chính xác. • Phương pháp vĩ tiêm Phương pháp này sử dụng kim tiêm có ñường kính lớn hơn ñường kính tế bào ñể ñưa ADN ngoại lai vào tế bào, các tế bào bị phá vỡ và ADN xâm nhập vào tế bào bị thương và sau ñó ñược chuyển vào tế bào bên cạnh. • Phương pháp chuyển gen thông qua ống phấn ðây là phương pháp chuyển gen dựa trên nguyên tắc là ADN có thể xâm nhập vào hạt phấn ở giai ñoạn nảy mầm, nhờ ñó ADN có ñiều kiện di chuyển vào nhân của tế bào hạt phấn hoặc hợp tử qua ống ph._.ấn. Kỹ thuật chuyển gen này ñơn giản nhưng hiệu quả chuyển gen thấp • Phương pháp sử dụng súng bắn gen Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 14 Chuyển gen bằng súng bắn gen là một trong những kỹ thuật ñua các gen ngoại lai và tế bào. Kỹ thuật biến nạp này dựa trên nguyên tắc sử dụng các viên ñạn kim loại (thương dùng hạt vàng hoặc volfram) có kích thước hiển vi, tỷ trọng cao ñể ñạt gia tốc lớn xuyên qua vỏ và màng tế bào, ñưa lớp ADN bọc ngoài tiếp cận với bộ mày di truyền của tế bào. Phương pháp này thường áp dụng với những giống cây trồng mà việc chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium khó thực hiện ñược hoặc khả năng tái sinh kém do nó có những ưu ñiểm nổi bật như: Dễ sử dụng; Các vectơ ñược thiết kế ñơn giản; Cần lượng nhỏ plasmid ADN; Biểu hiện gen tạm thời có thể quan sát sau vài ngày; Chuyển ADN ngoại lai vào tế bào nhanh. Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen này ñòi hỏi thiết bị ñắt tiền, hiệu quả chuyển gen chưa cao, biểu hiện gen không bền vững. 2.3.3 Vai trò của gen chỉ thị trong kỹ thuật chuyển gen Gen chỉ thị là gen có trách nhiệm thông báo kết quả của quá trình chuyển AND ngoại lai vào hệ gen của thực vật. Thực tế cho thấy, chỉ một Tỉ lệ ít tế bào thực vật ñược biến nạp thành công nhờ các phương pháp chuyển gen. Do ñó, rất cần có phương pháp nhận biết những tế bào ñã ñược biến nạp gen ñể tạo cây con mang gen mong muốn từ các tế bào chưa biến ñổi di truyền [8]. Sử dụng gen chỉ thị ñể nhận biết những tế bào ñã ñược biến nạp là một trong những phương pháp phổ biến hiện nay. Các gen như: Chloramphenicol-acetyl transferaza (CAT),β- glucuronidaza (GUS) ñược dùng làm gen chỉ thị những tế bào ñã biến ñổi chứa gen ngoại lai ổn ñịnh. Ngoài ra còn có gen LUX của ñom ñóm, gen vibrio harveyi mã hoá enzym uciferase phát tia sáng, dễ phát hiện nên ñược sử dụng làm gen chỉ thị. Ở nước ta, ñã có những thành công nhất ñịnh trong nghiên cứu chuyển gen vào thực vật. Ví dụ như việc chuyển gen kháng hgromycin, gen GUS và gen Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 15 kháng bệnh bạc lá Xa-21 vào lúa bằng phương pháp bắn gen [13]; Tác giả Lã Tuấn Nghĩa và cộng sự ñã chuyển gen GUS và gen kháng kanamycin vào cà chua [51]… 2.4 CÁC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN VÀO CÂY MÍA 2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới • Các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh Ngày nay, nghiên cứu về cây mía ñã ñược nhiều quốc gia quan tâm, nhất là ở các nước nhiệt ñới và á nhiệt ñới- nơi khởi nguồn của cây mía. Những nghiên cứu thành công bước ñầu về cây mía in vitro ñã, ñang tạo ñà phát triển cho các nghiên cứu về cây trồng tiếp theo. Sự thành công của các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh phụ thuộc chủ yếu vào ñiều kiện phát triển của nguồn nguyên liệu [25], thành phần cấu tạo của môi trường, ñiều kiện nuôi cấy [46] và các kiểu gen của cây thí nghiệm. Cây mía lần ñầu tiên ñược nghiên cứu nuôi cấy in vitro từ năm 1961 tại Hawai [44] ñể làm vật liệu khởi ñầu cho các nghiên cứu về nhân giống, gây ñột biến [37], chọn tạo giống, làm sạch virus [48] và bảo quản nguồn tài nguyên cây trồng [50]. Những nghiên cứu về nguồn vật liệu ban ñầu cho tái sinh cây mía từ nuôi cấy in vitro của các tác giả: Ho & Vasil (1983) [40], Chen và cộng sự (1988) [26] cho rằng có thể nhân nhanh cây mía bằng tái sinh trực tiếp từ chồi nách. Taylor (1994) (1997) ñã áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào ñể trồng ñược hơn 200 giống mía từ nuôi cấy chồi ñỉnh [50] [48]. Từ năm 1986, việc tách và nuôi cấy tế bào trần của cây mía cũng ñược các nhà khoa học chú ý nghiên cứu. Sreenivason & Vasil ñã tái sinh ñược cây mía từ nuôi cấy tế bào trần của giống mía B4362. Chen & cộng sự (1988) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 16 cũng ñã tái sinh cây con hoàn chỉnh từ huyền phù tế bào của giống mía ðài Loan F164 [26]. Tiếp ñó, một loạt phương pháp tạo phôi soma và phát sinh cơ quan ñược xây dựng thông qua giai ñoạn mô sẹo từ các mảnh lá non [16] [31]. Trong hầu hết các nghiên cứu này, mô sẹo ñược tạo ta trong môi trường có 2,4D hoặc picloram. ðể tăng khả năng tái tạo, mô sẹo ñược chuyển vào môi trường giảm nồng ñộ auxin hoặc không có auxin. Gần ñây, ñể tái sinh chồi từ mô sẹo nhanh, người ta sử dụng môi trường MS cải tiến có TDZ [33]. Tất cả các kết quả ñạt ñược từ việc sử dụng TDZ ñể tạo chồi nhanh hơn sử dụng Ki/NAA. Các nghiên cứu của Larkin & Scocroft (1981), Dix (1993), Ashraf (1994) ñã lựa chọn ñược các dòng tế bào soma thích hợp khác nhau từ nuôi cấy callus có bổ sung thêm công cụ sản xuất cây kháng stress [43] [28] [21]. Nghiên cứu của Anblagan và cộng sự (2000) ñã chia callus mía thành 2 dạng (i) dạng nhớt lỏng, không phôi hóa (ii) dạng cục xốp màu vàng trắng, phôi hóa và xác ñịnh ñược nồng ñộ tối ưu của các chất ñiều hòa sinh trưởng bổ sung vào môi trường MS nhằm mục ñích tái sinh cây. Nồng ñộ NAA cao hoặc NAA kết hợp với IAA, IBA sẽ kích thích quá trình tạo rễ [21]. Nghiên cứu của Alam và cộng sự cho thấy callus khởi tạo trên môi trường MS bổ sung 2,4-D cho tỉ lệ tái sinh chồi cao hơn callus khởi tạo trên môi trường bổ sung NAA. Và hầu hết các nghiên cứu ñều cho thấy chồi mía ñược tái sinh với tỉ lệ cao trên các môi trường MS bổ sung cytokinin ở nồng ñộ cao (BAP, kinetin 1-3 mg/l) và auxin ở nồng ñộ thấp hơn (NAA, IAA 0,5 mg/l) [13]. Năm 2002, 2004, Gill và cộng sự ñã nghiên cứu trên hai giống Co.J.83, Co.J.86 và thấy rằng việc bổ sung 30 mg/l maltose, 560 mg/l prolin, 2 mg/l ABA hoặc 3 mg/l 2,4-D có tác dụng kích thích quá trình tạo callus phôi hóa. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 17 Chồi tái sinh thu ñược trên môi trường chứa 0,5 mg/l BAP và môi trường tạo rễ là môi trường có chứa 5 mg/l NAA (kích thích tạo rễ tốt hơn môi trường bổ sung 2 mg/l IBA và 3 mg/l NAA). Các môi trường ñều ñược bổ sung 7% sucrose [34]. Hiện nay, một số báo cáo ñã ñưa ra phương pháp mới tái sinh cây mía mà không thông qua giai ñoạn tạo mô sẹo. Kết quả của nghiên cứu mơí này ñã tạo ra một khối lượng cây lớn từ những cụm hoa chưa trưởng thành [27] và các chồi [50]. • Các nghiên cứu chuyển gen Mía là cây có bộ nhiễm sắc thể ña bội (2n= 36-170), tính di truyền không ổn ñịnh, cho nên, việc nhân giống truyền thống ñòi hỏi phải mất nhiều thời gian mới tạo ra ñược môt giống mới. Công nghệ sinh học sử dụng kỹ thuật di truyền ñể cải tạo giống cây trồng bằng cách ñưa trực tiếp những gen có giá trị vào hệ gen của thực vật, cho phép tạo ra hàng loạt cây trồng mang gen hữu ích là một hướng ñi hữu hiệu. Vì vậy, sau khi ñã có hệ thống tái sinh hoàn chỉnh, cần xây dựng một phương pháp chuyển gen hiệu quả cao ñể cài các gen mong muốn vào bộ nhiễm sắc thể mía [21]. Từ năm 1987, Chen và cộng sự ñã tiến hành các thí nghiệm chuyển gen vào tế bào trần của mía sử dụng kĩ thuật PEG (polyethylene glycol). Các tế bào trần sau khi chuyển gen (tần số 8/107) ñã mang plasmid pABD1 và hình thành các cụm tế bào kháng kanamycin. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, họ ñã không thu ñược callus và cây chuyển gen tái sinh [26]. Nghiên cứu ñầu tiên về cây mía chuyển gen thành công ñược Bower & Bich báo cáo vào năm 1992 sử dụng súng bắn gen [23]. Năm 1997, Arencibia và cộng sự cũng ñã xây dựng quy trình chuyển gen vào ñỉnh sinh trưởng của cây bằng phương pháp xung ñiện [21]. Năm 2002, Gallo-Meagher và CS ñã tiến hành chuyển gen vào mô sẹo mía thông qua kĩ thuật bắn gen. Gen ñược ñưa vào là gen cấu trúc vỏ virus Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 18 dòng E và gen manA (gen mã hóa enzym phosphomannose isomerase). Trong quá trình chọn lọc, callus chuyển gen ñược tái sinh trên môi trường MS bổ sung 2,5 µM TDZ và 3 g/l mannose. Khoảng 100 chồi chuyển gen ñược tái sinh và cây con ñược chuyển ra vườm ươm sau khi ñược tạo rễ trên môi trường chứa 5 mg/l IBA [32]. Tiếp theo, những báo cáo tương tự về vấn ñề này cũng ñược ñưa ra như: chuyển gen chỉ thị [21][24][29], gen kháng virus khảm [41], kháng côn trùng [20]… vào mía. Thực tế cho thấy hầu hết các cây ngũ cốc và thân cỏ không phải là vật chủ của Agrobacterium tumefaciens, do vậy việc chuyển gen vào cây một lá mầm thông qua Agrobacterium tumefaciens gặp nhiều khó khăn hơn so với cây hai lá mầm. Tuy nhiên, gần ñây, nhiều nghiên cứu ñã xây dựng quy trình chuyển gen vào ngũ cốc nói chung và mía ñường nói riêng thông qua Agrobacterium tumefaciens. Báo cáo ñầu tiên về chuyển gen mang ñặc tính quan tâm vào mía thông qua A. tumefaciens ñược công bố bởi Arencibia và cộng sự (1998). Trong những thí nghiệm này, chủng LBA4404 (pTOK233) và EHA101 (pMTCA31G) mang vectơ nhị phân chứa gen kháng côn trùng ñã ñược chuyển thành công vào mía thông qua callus. Trong 395 cây tái sinh có 341 cây sống sót và ñược ñem trồng trong nhà kính. Phân tích Southern ñã khẳng ñịnh T-DNA ñã ñược chuyển vào hệ gen mía với số bản sao là từ 1 – 3 bản [23]. Năm 2003, Manickavasagam và cộng sự ñã tiến hành chuyển gen vào chồi mắt của giống mía Co92061 và Co671 thông qua Agrobacterium chủng LBA4404 và EHA105 mang vectơ nhị phân pGA492. Gen ñược chuyển gồm có nptII, bar và gus-intron (β-glucuronidase). Hiệu quả chuyển gen ñược khẳng ñịnh bởi biểu hiện gen gus và phân tích PCR ñối với gen bar. Phân tích Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 19 Southern cho thấy gen bar ñược chuyển vào hai vị trí của genom trong hầu hết mẫu chuyển gen. Chủng EHA105 cho hiệu quả chuyển gen cao hơn, lượng chồi tạo ra nhiều gấp ñôi so với chủng LBA4404. Kết quả cho thấy với quy trình này, chồi chuyển gen ñược tái sinh và nhân lên sau 5 tháng với hiệu quả chuyển gen khoảng 50% [45]. Theo công bố mới nhất, các nhà khoa học ðức và Indonesia ñã tạo ra một loại mía chyển gen cho thu hoạch cao hơn, trong khi ñó lại cần ít phân bón hơn. Bên cạnh ñó, các nghiên cứu thuộc trường ðH Nông nghiệp Bogor và Trung tâm sinh học phân tử ở Karlsruhe, ðức ñã tạo ra một loại mía chuyển gen có chứa gen phytase làm tăng khả năng hấp thu các khoáng chất quan trọng trong ñất (canxi, magie...), tăng sản lượng mía mà không cần phải bón phân. Hiện nay, 70 dòng mía chuyển gen ñang ñược trồng thử và dòng ñược chọn sẽ cho người nông dân tự do sử dụng [53]. Như vậy, các nghiên cứu về chuyển gen vào cây mía ñã và ñang mở hướng ñi mới cho công tác chọn tạo giống mía năng suất, chất lượng cao phù hợp với các vùng sinh thái. 2.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Cây mía là một trong những cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao. Ở nước ta, mía là nguồn nguyên liệu duy nhất cho ngành công nghiệp chế biến ñường [4]. Do ñó, những nghiên cứu về cây mía, ñặc biệt là nghiên cứu cây mía in vitro với mục ñích nâng cao năng suất, sản lượng mía nhằm ñáp ứng lượng ñường tiêu dùng trong nước và xuất khẩu ngày càng ñược quan tâm. Quy trình nhân giống mía in vitro ñầu tiên của nước ta ñược xây dựng tại viện Di truyền Nông nghiệp. Quy trình này ñã ñược công nhận là tiến bộ kĩ thuật và ñược khuyến nghị sử dụng rộng rãi trong sản xuất [3] Từ năm 1980, Phân viện Công nghệ sinh học thuộc Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia ñã tiến hành triển khai nhân giống mía Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 20 bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Vật liệu nuôi cấy ban ñầu là chồi ñỉnh [7]. Kết quả ñã ñưa ñược giống F156 ra phục vụ cho sản xuất. Tiếp ñó, tác giả ñã xây dựng ñược quy trình nhân giống cho một số giống mía từ khi ñưa chồi ñỉnh vào nuôi cấy ñến khi tạo ra giống cấp I, II phục vụ cho sản xuất. Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam ñã nghiên cứu sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào ñể nhân nhanh một số giống mới, có triển vọng trong sản xuất: CP 5243, VN 72234, ROC1, ROC10... Vật liệu tạo cụm chồi mía là lá non thông qua giai ñoạn callus tái sinh thành cây [12] Tiếp sau ñó, Trung tâm ứng dụng tiến bộ khoa hoc kỹ thuật Bình ðịnh, Viện Nghiên cứu Ngô, Viện Di truyền nông nghiệp cũng tiến hành nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào ñể nhân một số giống mía: ROC 1, ROC 10... phục vụ cho nhu cầu sản xuất [14]. Viện Di truyền nông nghiệp sử dụng mô phân sinh ñỉnh tách từ ngọn mía ñể tạo chồi trực tiếp, không qua giai ñoạn tạo mô sẹo thay cho nguồn vật liệu lá non, tránh sự hình thành các biến dị soma và hiện tượng hoá ñen của mẫu nuôi cấy. Viện nghiên cứu Dầu thực vật, tinh dầu, hương liệu, mỹ phẩm Việt Nam ñã xây dựng thành công quy trình công nghệ sản xuất các giống mía năng suất cao bằng phương pháp nuôi cấy mô. Quy trình này ñã ñược chuyển giao công nghệ từ phòng thí nghiệm ñến ngoài ñồng ruộng với giá chào bán là 30 triệu ñồng. Tác giả Nguyễn Thị Nhẫn ñã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong công tác nhân giống mía lai: Quế ñường 15 (Hoa Nam 52-12x Nội Giang 59- 782) và F134 (CO 290 x POJ28/78). Nguyên liệu sử dụng trong các thí nghiệm là các mắt mía và ñỉnh sinh trưởng ngọn. Như vậy, các nghiên cứu về cây mía ở Việt Nam mới chỉ tập trung vào việc nhân giống in vitro ñã góp phần không nhỏ trong việc nhân nhanh tạo lượng cây lớn, duy trì tính trạng tốt, cây sạch bệnh... nhằm thu ñược giống Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 21 cây trồng với năng suất, sản lượng, chất lượng ñáp ứng yêu cầu của nhà trồng trọt. Tuy nhiên, công tác chọn tạo giống mía mới, ñặc biệt chọn tạo giống mía nhờ phương pháp biến nạp di truyền còn hết sức mới mẻ và chưa ñược quan tâm nghiên cứu. Do ñó, ñể tạo tiền ñề cho những thành công tiếp theo trong các nghiên cứu về cây mía, việc xây dựng một hệ thống tái sinh hoàn chỉnh tạo nguồn vật liệu khởi ñầu cho các nghiên cứu chuyển gen ở cây mía. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 22 3. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ðể ñạt ñược mục tiêu ñã ñề ra, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với các nội dung chủ yếu sau: 1. ðánh giá khả năng tạo mô sẹo và tái sinh của 4 giống mía nhập nội. 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng thực vật tới khả năng hình thành, duy trì và nhân mô sẹo làm nguyên liệu phục vụ cho chuyển gen ở cây mía. 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất diều tiết sinh trưởng thực vật tới khả năng tái sinh, nhân nhanh, ra rễ của chồi mía in vitro 4. Xác ñịnh loại giá thể thích hợp cho tỉ lệ sống cao của cây mía in vitro trong giai ñoạn vườn ươm. 5. Thử nghiệm chuyển gen chỉ thị gus vào mô sẹo của cây mía thông qua Agrobacterium tumefaciens. Nội dung 2,3,4,5: Tiến hành thí nghiệm trên giống mía ñã lựa chọn ñược từ nội dung 1. 3.2VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2.1 Vật liệu thực vật: Các giống mía nhập nội: Qð 94-119, Qð 93-159, ROC 23, ROC 26 ñược trồng tại nhà lưới của Viện Di truyền Nông nghiệp, nguồn gốc và lý lịch giống như sau: Giống mía Qð 94-119 - Tổ hợp cây bố mẹ: Cây mía trương 76-65 x nhại 71-374 - Nguồn gốc giống mía: Sở nghiên cứu cây mía ñường Quảng Tây - ðặc ñiểm: + Thân cây dài, từ vừa cho tới lớn + Dóng mía dạng ống + Thân cây có màu tím nhạt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 23 + Lá mía có màu xanh lục nhạt, dày, cứng và ngắn. Lá non mọc thẳng vút, lá già vươn ra ngoài, bẹ lá màu tím nhạt. + Tỉ lệ nảy mầm cao, mầm nảy ñều, mập, khoẻ, mọc nhanh và sinh trưởng khoẻ + Hàm lượng ñường có thể ñạt tối ña 17,8% Giống mía Qð 93-159 - Tổ hợp cây bố mẹ: Quế nông 73.204 x CP 72-1210 - Nguồn gốc giống mía: Trạm thí nghiệm Trạm Giang- Viện Nghiên cứu công nghiệp ñường- Tổng hội công nghiệp nhẹ Trung quốc. - ðặc ñiểm: + Mầm mọc nhanh, ñều, hiệu suất nảy mầm cao, phân nhánh tốt + Rễ mía phát triển sớm, nhiều, mạnh + Thân to trung bình ñến lớn, số cây hữu hiệu nhiều, dễ bóc lá, không rễ phụ, ñường kính thân bình quan của mía trồng mới là 2,96 cm + Chống hạn, chống ñổ tốt + ðề kháng tốt với bệnh ñốm vòng, chống bọ hung, chống bệnh than + Chín sớm, ñường cao (15-17%), ñộ tinh khiết cao (90-95%). Giống mía ROC 23 - Tổ hợp cây bố mẹ: F 166 x 74-575 - Nguồn gốc giống mía: Viện Nghiên cứu mía ñường ðàI Loan - ðặc ñiểm: + Mầm có hình tam giác cân, lồi lộ, có cách mầm dài, phân nhánh tốt. Dáng mọc thẳng. + Thân to trung bình ñến lớn, lóng dài 20-23cm, khả năng vươn lóng mạnh, mau cao về kích thước, cứng cây, có ra rễ phụ từ lóng 1 dến lóng 8,9 thân, hay mọc nhánh chét. Màu sắc thân xanh nhạt có phấn trắng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 24 + Năng suất ổn ñịnh (> 80 tấn/ha), hàm lượng ñường (14- 15%). + Kháng bệnh nấm, bệnh ñen ngọn tốt, kháng bệnh rỉ vàng, nâu và khô lá ở mức ñộ trung bình. Dễ nhiễm bệnh khảm virus, bệnh cháy lá, bệnh rệp xơ bông trắng. + Chống hạn, úng, chống ñổ tốt. Giống mía ROC 26 - Nguồn gốc giống mía: Viện Nghiên cứu mía ñường ðài Loan - ðặc ñiểm: + Thân mầm trung bình, hình tròn, phân nhánh khoẻ. Lóng mía hình trụ. + Thân cây thô, dài, giữa ñốt thành hình ống. Màu sắc thân xanh tím có phấn trắng + Năng suất ổn ñịnh (>80 tấn/ha), hàm lượng ñường (14- 15%) + Kháng bệnh nấm, bệnh ñen ngọn tốt, kháng bệnh rỉ vàng, nâu và khô lá ở mức ñộ trung bình. + Chịu hạn, chịu úng tốt. 3.2.2 Vật liệu di truyền Chúng tôi ñã sử dụng 3 chủng vi khuẩn A. tumerfaciens là EHA105, AGL-1và GV3101. Các chủng này ñều mang vectơ nhị thể pCAMBIA1301 chứa gen chỉ thị gus, gen chọn lọc hptII (gen kháng hygromycin). Cả hai gen này ñều ñược ñiều Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 25 khiển bởi ñoạn gen khởi ñộng CaMV35S. Hình 3. Vectơ nhị thể pCAMBIA1301 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Môi trường nuôi cấy Các thí nghiệm ñược tiến hành trên môi trường khoáng MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung agar, ñường sucrose, than hoạt tính. ðiều kiện thí nghiệm: Cường ñộ ánh sáng 2000 lux Nhiệt ñộ 25 ± 2o C Chu kỳ chiếu sáng 10/14h Ẩm ñộ tương ñối phòng nuôi cấy 60% pH trước khử trùng 5,8 3.3.2 Chuẩn bị mẫu thí nghiệm Lát cắt lá non (2x2mm) ñỉnh sinh trưởng của cây mía 6 tháng tuổi (Saccharum ssp.). ðể thu ñược mẫu tốt, không bị nhiễm khuẩn trong quá trình nuôi cấy, nguồn nguyên liệu ban ñầu phải ñược lấy từ những cây sinh trưởng tốt, không sâu bệnh. Quá trình thu và vận chuyển mẫu không bị dập nát, dụng cụ lấy mẫu phải sạch ñể tránh lây lan nấm bệnh, nhiễm khuẩn sau này Ngọn mía 6 tháng tuổi sau khi thu từ vườn về ñược khử trùng bề mặt bằng ethanol 70o . Sau ñó, chúng tôi tiến hành bóc các lớp lá ngoài của ngọn mía và lấy phần lá non nhất bao quanh ñỉnh sinh trưởng. 3.3.3 Bố trí thí nghiệm: 3.3.3.1 ðánh giá khả năng tạo mô sẹo, tái sinh cây của 4 giống mía nhập nội. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 26 Từ 4 giống mía nhập nội: Qð 94-119, Qð 93-159, ROC 23, ROC 26, chúng tôi tiến hành ñánh giá Tỉ lệ tạo mô sẹo, tái sinh của các giống mía phục vụ cho các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen sau này Nền môi trường: MS + 30 g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH = 5,8 - Thí nghiệm 1: Giai ñoạn tạo mô sẹo: môi trường bổ sung 2mg/l 2,4D [2] Mẫu cấy: 10 mẫu lá non (2x2mm)/ñĩa. Mỗi công thức gồm 3 ñĩa petri. Mỗi ñĩa chứa 10ml môi trường nuôi cấy, thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại Thời gian theo dõi: 10 ngày/ lần. ðánh giá kết quả sau 30 ngày. - Thí nghiệm 2: Giai ñoạn tái sinh cây từ mô sẹo: môi trường bổ sung 2 mg/l Ki + 0,5 mg/l NAA [2] Mẫu cấy: 10 mẫu mô sẹo/ bình Mỗi công thức gồm 4 bình tam giác. Mỗi bình chứa 50ml môi trường nuôi cấy, thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại Thời gian theo dõi: 10 ngày/ lần. ðánh giá kết quả sau 30 ngày. 3.3.3.2 Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh Các thí nghiệm trong giai ñoạn này sử dụng giống mía có Tỉ lệ tạo mô sẹo, tái sinh cao từ thí nghiệm 2.1 3.3.3.2.1 Giai ñoạn khởi tạo và nhân mô sẹo Nền môi trường: MS + 30 g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH = 5,8 Bố trí thí nghiệm: mỗi công thức gồm 6 ñĩa petri. Mỗi ñĩa chứa 10ml môi trường nuôi cấy với 5 mẫu kích thước (2x2) mm Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại Thời gian theo dõi: 10 ngày/lần. ðánh giá kết quả sau 30 ngày ðĩa thí nghiệm ñược ñặt ở nhiệt ñộ 27 ± 10oC, không chiếu sáng, ñộ ẩm 90% trong tủ nuôi ñiều khiển nhiệt ñộ, ánh sáng của hãng SANYO. • Giai ñoạn khởi tạo mô sẹo: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 27 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo mô sẹo từ lá non mía Bảng 1. Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo mô sẹo từ lá non mía Nồng ñộ (mg/l) Auxin 0 1 2 3 2,4D ðC CT1 CT2 CT3 IAA ðC CT4 CT5 CT6 NAA ðC CT7 CT8 CT9 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng phối hợp của auxin và cytokinin tới khả năng tạo mô sẹo từ lá non mía Dựa vào kết quả thí nghiệm 1, nền môi trường có bổ sung nồng ñộ chất ñiều tiết sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin thích hợp nhất (thí nghiệm 1) phối hợp với chất ñiều tiết sinh trưởng thực vật thuộc nhóm cytokinin (Ki, BAP). Bảng 2. Ảnh hưởng phối hợp của auxin và cytokinin tới khả năng tạo mô sẹo từ lá non mía Nång ®é (mg/l) Cytokinin 0 1 2 3 4 BAP §C CT1 CT2 CT3 CT4 Ki §C CT5 CT6 CT7 CT8 • Giai ñoạn nhân mô sẹo: Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của 2,4-D tới khả năng nhân mô sẹo trên hai nền môi trường MS và N6 Thí nghiệm sử dụng mô sẹo ở giai ñoạn khởi tạo nuôi cấy trên hai nền môi trường MS và N6 ñược bổ sung chất ðTST 2,4D ở các nồng ñộ sau: CT1: MS + 0mg/l 2,4D CT4: N6 + 0mg/l 2,4D CT2: MS + 1mg/l 2,4D CT5: N6 + 1mg/l 2,4D CT3: MS + 2mg/l 2,4D CT6: N6 + 2mg/l 2,4D Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của 2,4-D lên khả năng nhân mô sẹo trên nền môi trường tối ưu của thí nghiệm 5 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 28 Sau khi xác ñịnh ñược nền môi trường thích hợp ở thí nghiệm 5, bổ sung 2,4D với các nồng ñộ khác nhau nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D tới khả năng nhân mô sẹo. Thí nghiệm ñược tiến hành theo các công thức sau: ðối chứng (ð/C): 0 mg/l 2,4-D Công thức 1: 0,5 mg/l 2,4-D Công thức 5: 2,5 mg/l 2,4-D Công thức 2: 1,0 mg/l 2,4-D Công thức 6: 3,0 mg/l 2,4-D Công thức 3: 1,5 mg/l 2,4-D Công thức 7: 3,5 mg/l 2,4-D Công thức 4: 2,0 mg/l 2,4-D Công thức 8: 4,0 mg/l 2,4-D 3.3.3.2.2 Giai ñoạn tái sinh, nhân chồi và ra rễ Bố trí thí nghiệm: mỗi công thức gồm 3 bình tam giác dung tích 250ml, mỗi bình chứa 50ml môi trường nuôi cấy Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại Thời gian theo dõi: 10 ngày/lần. ðiều kiện nuôi cấy: bình thí nghiệm ñược ñặt trong tủ nuôi ổn nhiệt của hãng Rumed (CHLB ðức), nhiệt ñộ 28 oC, cường ñộ ánh sáng 2000 lux, ñộ ẩm 90%, chiếu sáng 10-14 giờ/ngày • Giai ñoạn tái sinh Nền môi trường: MS + 30 g/l sucrose + 1 g/l than hoạt tính + 7,5 g/l agar; pH=5,8 Toàn bộ thí nghiệm, mỗi bình cấy 9 mẫu mô sẹo (2x2mm) ðánh giá kết quả sau 40 ngày Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của cytokinin tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo Môi trường nuôi cấy có bổ sung cytokynin (Ki, BAP) ở các nồng ñộ khác nhau như sau: Bảng 3. Ảnh hưởng của cytokinin tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 29 Nồng ñộ (mg/l) Cytokinin 0 1 2 3 4 Ki ðC CT1 CT2 CT3 CT4 BAP ðC CT5 CT6 CT7 CT8 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng phối hợp của auxin và cytokinin tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo Môi trường nuôi cấy bổ sung cytokinin với nồng ñộ thích hợp ñược lựa chọn ở thí nghiệm 7, kết hợp với α-NAA ở các nồng ñộ khác nhau. ðối chứng (ð/C): 0 mg/l α-NAA Công thức 1: 0,25 mg/l α-NAA Công thức 2: 0,50 mg/l α-NAA Công thức 3: 0,75 mg/l α-NAA Công thức 4: 1,00 mg/l α-NAA • Giai ñoạn nhân nhanh Nền môi trường: MS + 30 g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH=5,8. Mẫu cấy: mỗi bình cấy 6 cụm, mỗi cụm 3 chồi ñược tạo thành từ giai ñoạn tái sinh. Mỗi chồi có chiều cao khoảng 2 cm. Hệ số nhân chồi ñược ñánh giá sau 30 ngày nuôi cấy. Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của cytokinin ñến khả năng nhân nhanh chồi mía Môi trường nuôi cấy có bổ sung cytokynin (Ki) ở các nồng ñộ khác nhau như sau: Bảng 4. Ảnh hưởng của cytokinin ñến khả năng nhân nhanh chồi mía Nồng ñộ (mg/l) Cytokinin 0 1 2 3 4 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 30 Ki ðC CT1 CT2 CT3 CT4 Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng phối hợp của cytokinin và auxin ñến khả năng nhân nhanh chồi mía Môi trường nuôi cấy bổ sung Kinetin với nồng ñộ thích hợp ñã xác ñịnh ñược ở thí nghiệm 9 kết hợp với α-NAA, IAA ở các nồng ñộ khác nhau. ðối chứng (ð/C): không bổ sung auxin Công thức 1: 0,5 mg/l α-NAA Công thức 2: 1,0 mg/l α-NAA Công thức 3: 0,5 mg/l IAA Công thức 4: 1,0 mg/l IAA • Giai ñoạn ra rễ Nền môi trường: MS + 30 g/l sucrose +7,5 g/l agar + 0,5 g/l than hoạt tính, pH=5,8. Thí nghiệm 11: Ảnh hưởng của α-NAA tới khả năng phát sinh rễ của chồi mía Mỗi công thức thí nghiệm cấy 30 chồi mía có chiều cao 5cm Thí nghiệm bổ sung α-NAA với các nồng ñộ như sau: ðối chứng (ð/C): 0,00 mg/l α-NAA Công thức 1: 0,25 mg/l α-NAA Công thức 2: 0,50 mg/l α-NAA Công thức 3: 0,75 mg/l α-NAA Công thức 4: 1,00 mg/l α-NAA 3.3.3.2.3 Giai ñoạn vườn ươm Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể ñến khả năng sống của cây mía in vitro khi ñưa cây ra ngoài vườn ươm Thí nghiệm ñược chúng tôi thực hiện trên các khay nhựa có kích thước 30cm x 50cm x 7cm. Mỗi công thức gồm 50 cây. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 31 Các cây mía in vitro ñược trồng trên các giá thể khác nhau với chế ñộ chăm sóc như nhau trong nhà ươm Theo dõi và ñánh giá kết quả sau 30 ngày Các giá thể ñược dùng trong thí nghiệm: Giá thể 1: ðất Giá thể 2: Cát Giá thể 3: ðất +cát (1:1) 3.3.3.3 Thử nghiệm chuyển gen chỉ thị vào mô sẹo của cây mía thông qua Agrobacterium tumefaciens. Quy trình biến nạp gen vào callus mía thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ñược xây dựng dựa trên quy trình của Arencibia và cộng sự (1997) như sau: A. tumefaciens nuôi trên YEB ñặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc thích hợp (Nuôi ở 28oC, 2 ngày) A. tumefaciens nuôi trên YEB lỏng có bổ sung kháng sinh thích hợp (Nuôi qua ñêm ở 28oC, lắc140vòng/phút) ðo mật ñộ vi khuẩn (OD600) Bổ sung AS 1 giờ trước khi biến nạp Huyền phù mô sẹo mía và vi khuẩn A. tumefaciens (lây nhiễm) (Ly tâm chân không 1400 vòng/phút trong 10 phút, ñể 10 phút ở nhiệt ñộ phòng) Chuyển mẫu callus sang môi trường ñồng nuôi cấy (Trộn ñều) Quan sát biểu hiện tạm thời của gen gus Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 32 (nuôi ở 270C, trong tối, 5 ngày) Chuyển mẫu callus sang môi trường nuôi phục hồi Chuyển mẫu callus sang môi trường tái sinh và chọn lọc Cây tái sinh ñã ñược chuyển gen Các chủng vi khuẩn Agrobacterium ñược bảo quản trong glycerol ( ở - 200C) hay trong ñĩa thạch (ở 40C) ñược nuôi cấy phục hồi trên ñĩa môi trường YEB thạch có bổ sung kháng sinh thích hợp với từng chủng, nuôi ở 28oC, thời gian 2 ngày. Sau ñó, cấy chuyển mẫu vi khuẩn sang 50 ml môi trường YEB lỏng, nuôi lắc 140 vòng/ phút, ở 280C qua ñêm ñể tạo dịch huyền phù vi khuẩn. Mỗi công thức thí nghiệm sử dụng 0,5 g mô sẹo ñể tiến hành quá trình lây nhiễm trong môi trường YEB lỏng. Môi trường ñồng nuôi cấy mô sẹo là môi trường cho khả năng tạo mô sẹo phôi hóa tốt nhất ñã lựa chọn ñược trong quá trình xây dựng hệ thống tái sinh. Mật ñộ vi khuẩn ñược xác ñịnh bằng máy quang phổ khả kiến DUR-800 (hãng BECKMAN COULTER) ở bước sóng 600 nm (OD600). Ly tâm chân không trên máy EPPENDORF CONCENTRATOR 5310, tốc ñộ 1400 vòng/phút, trong thời gian 10 phút. Sau thời gian ñồng nuôi cấy 5 ngày, mẫu ñược lấy ra và nhuộm bằng dung dịch X-gluc, ủ mẫu ở 370C trong 2 ngày. Biểu hiện tạm thời của gen gus ñược quan sát bằng sự xuất hiện các ñốm hay các vùng xanh chàm ở các mẫu ñã ñược biến nạp. Thí nghiệm 13: Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào mô sẹo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 33 Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng 3 chủng vi khuẩn là EHA105, AGL-1 và GV3101 mang vectơ pCAMBIA 1301 ñể lây nhiễm với mô sẹo mía Thí nghiệm 14: Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn ñến mức ñộ biểu hiện tạm thời của gen gus ở mô sẹo mía Các giá trị OD600 ñược nghiên cứu trong thí nghiệm lần lượt là 0; 0,5; 1,0; 1;5 và 2,0. Thí nghiệm 15: Ảnh hưởng của AS ñến khả năng biển hiện tạm thời của gen gus ở mô sẹo AS ñược bổ sung vào môi trường lây nhiễm và môi trường ñồng nuôi cấy ở các nồng ñộ như sau: 0 µM, 100 µM, 200 µM, 300 µM. Thí nghiệm 16: Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới khả năng biểu hiện tạm thời của gen gus ở mô sẹo mía Tổng thời gian lây nhiễm: 20 phút, trong ñó: CT1: 0 ly tâm + 20 phút ñể nhiệt ñộ phòng CT2: 5 phút ly tâm + 15 phút ñể nhiệt ñộ phòng CT3: 10 phút ly tâm + 10 phút ñể nhiệt ñộ phòng CT4: 15 phút ly tâm + 5 phút ñể nhiệt ñộ phòng CT5: 20 phút ly tâm + 0 phút ñể nhiệt ñộ phòng 3.3.4 Chỉ tiêu theo dõi Tỉ lệ mẫu tái sinh (%) = Tổng số mẫu tái sinh Tổng số mẫu nghiên cứu x 100 Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) = Tổng số mẫu tạo mô sẹo Tổng số mẫu nghiên cứu x 100 Hệ số nhân callus (lần) = Khối lượng mô sẹo sau thời gian nuôi cấy trên một ñĩa (mg) Khối lượng mô sẹo ban ñầu trên một ñĩa (mg) Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi tạo thành sau thời gian nuôi cấy Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 34 Tổng số chồi ban._. 60: pp.197-214. 44. Liu, M.C. (1984), Handbook of plant culture, vol 2. NewYork: Macmillan; pp 572-605 45. Manickavasagam M., Ganapathi A. (2004), Agrobacterium-mediated genetic transformation and development of herbicide-resistant sugarcane (Saccharum species hybrids) using axillary buds, Plant Cell Rep, 23, pp. 134 – 143 46. Saharan V, Yadav RC, Yadav RN, Chapagain BP (2004), High frequency plant regeneration from desiccated calli of indica rice (Oryza Sativa L.), Afr.J. Biotechnol. 3(5): pp. 256-259 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 79 47. Taylor Paul W. J. (1997), Conservation of plant genetic resources in vitro science publishers, In C. USA, pp. 247-256 48. Taylor Paul W. J. (1997), Micropropagation of Sugarcane (Sacharrum ssp. Hybrid), Biotechnology in Agriculture and forestry, Vol ,39 hightech and Micropâgtion V (ed.by Y.P.S Bjaj) Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp. 257-271 49. Taylor Paul W. J. (1994), Tissue culture techniques for developing disease resistance in sugarcane, International book & periodicals supply service, Pitampura. Delhi 110034 (India), pp. 311-331 50. Vázquez MD, Delos Santos A, Lencona GK, Súmano MO, Velásquez MM, Rincón RR. et al.(2005) Sugarcane bud as an efficient explant for palntlet regeneration. Biologia Plantarum; 49: pp. 481-5 51. www.bannhanong.com/home.php?cat_id=22&id=2378&kh= 52. www.itds.treas/ gov /ITDS/ITTA/Sugar_Industry.htm, 2000 53. www.tempointeraktif.com/hg/mbmtempo/arsip/2007/12/31/INO/ 54. www.xttm.agroviet.gov.vn/loadasp/hang/duong-spec- detail.asp?tn=tn&id=1741271 55. www. Vnast.gov.vn PHỤ LỤC 1. Thành phần môi trường nuôi khuẩn YEB Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 80 Beef-extract : 5 g/l Yeast-extract : 1 g/l Peptone : 5 g/l Sucrose : 5 g/l pH=7 Agar : 15 g/l Sau khi khử trùng, thêm 5 ml/l MgSO4.7H2O 1M ñã lọc vô trùng. 2. Các bước chuẩn bị dịch nhuộm X-Gluc Chuẩn bị cho 100 ml dung dịch X-Gluc: -Cân: K3(Fe(CN)6 : 0,0165 g K4(Fe(CN)6 : 0,211 g X-Gluc : 100 mg -Thêm 2 ml EDTA 0,5M, pH=7 - 8 -Thêm dung dịch Na3PO4 115M, pH=7 tới 100 ml -Chuẩn bằng CH3COOH về pH=7 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 81 3. Thành phần các môi trường khoáng (ñơn vị: g/l) STT Tên hoá chất MS (Murashige & Skoog, 1962) N6 (Chu & CS., 1962) I Các nguyên tố ña lượng 1 NH4NO3 1650 - 2 KNO3 1900 2830 3 CaCl2.2H2O 440 166 4 MgSO4.7H2O 370 185 5 KH2PO4 170 400 6 (NH4)2SO4 - 463 II Các nguyên tố vi lượng 1 Na2EDTA 37,25 37,25 2 FeSO4.7H2O 27,85 27,85 3 H3BO3 6,20 1,60 4 MnSO4.4H2O 22,30 3,30 5 ZnSO4.7H2O 8,60 1,50 6 KI 0,83 0,80 7 Na2MoO4.2H2O 0,25 0,25 8 CoCl2.6H2O 0,025 0,025 9 CuSO4.5H2O 0,025 0,025 III Các vitamin 1 Glycine 2,0 2,0 2 Thiamine HCl 0,1 1,0 3 Pyridocine HCl 0,5 0,5 4 Nicotinic acid 0,5 0,5 5 Myo-Inositol 100 - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 82 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 83 4. Kết quả xử lý số liệu thống kê sinh học TN1: DANH GIA KHA NANG TAO MO SEO CUA 4 GIONG MIA BALANCED ANOVA FOR VARIATE TYLE FILE TN1 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Thiet ke hoan toan ngau nhien VARIATE V003 TYLE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 GIONG 3 1839.17 613.056 76.14 0.000 3 2 NL 2 69.0316 34.5158 4.29 0.070 3 * RESIDUAL 6 48.3085 8.05142 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 1956.51 177.864 ----------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Thiet ke hoan toan ngau nhien MEANS FOR EFFECT GIONG ------------------------------------------------------------------------------- GIONG NOS TY LE% 1 3 70.0000 2 3 81.6667 3 3 84.9667 4 3 53.3333 SE(N= 3) 1.63823 5%LSD 6DF 5.66691 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT NL ------------------------------------------------------------------------------- LL NOS TY LE% 1 4 75.8500 2 4 70.4000 3 4 71.2250 SE(N= 4) 1.41875 5%LSD 6DF 4.90769 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN1 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Thiet ke hoan toan ngau nhien F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |GIONG |NL | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TYLE% 12 72.492 13.337 2.8375 3.9 0.0001 0.0697 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 84 TN2: DANH GIA KHA NANG TAI SINH CUA 4 GIONG MIA BALANCED ANOVA FOR VARIATE TYLE% FILE TN2 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 TYLE% LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 3 8362.50 2787.50 411.68 0.000 3 2 LL 2 9.37500 4.68750 0.69 0.539 3 * RESIDUAL 6 40.6263 6.77104 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 8412.50 764.773 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE TN2 9/ 9/** 9:13 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 VARIATE V004 CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 3 8370.00 2790.00 403.37 0.000 3 2 LL 2 43.1667 21.5833 3.12 0.117 3 * RESIDUAL 6 41.5001 6.91669 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 8454.67 768.606 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN2 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS TYLE% CHOI 1 3 30.0000 66.0000 2 3 22.5000 45.0000 3 3 77.5000 98.0000 4 3 80.0000 112.333 SE(N= 3) 1.50234 1.51841 5%LSD 6DF 5.19682 5.25242 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT LL ------------------------------------------------------------------------------- LL NOS TYLE% CHOI 1 4 53.1250 78.7500 2 4 53.1250 83.0000 3 4 51.2500 79.2500 SE(N= 4) 1.30106 1.31498 5%LSD 6DF 4.50058 4.54872 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN2 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |LL | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TYLE% 12 52.500 27.655 2.6021 5.0 0.0000 0.5394 CHOI 12 80.333 27.724 2.6300 3.3 0.0000 0.1173 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 85 TN3: ANH HUONG CUA AUXIN TOI KHA NANG TAO MO SEO BALANCED ANOVA FOR VARIATE TYLE% FILE TN3 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 TYLE% LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 9 32503.2 3611.46 ****** 0.000 3 2 LL 2 22.8682 11.4341 4.04 0.035 3 * RESIDUAL 18 50.9275 2.82931 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 29 32577.0 1123.34 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN3 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------ CT NOS TYLE% 0 3 0.000000 1 3 76.6700 2 3 93.3333 3 3 50.0000 4 3 0.000000 5 3 0.000000 6 3 0.000000 7 3 19.9900 8 3 16.6700 9 3 7.78000 SE(N= 3) 0.971135 5%LSD 18DF 2.88538 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT LL ------------------------------------------------------------------------------- LL NOS TYLE% 1 10 27.6640 2 10 25.6680 3 10 26.0010 SE(N= 10) 0.531912 5%LSD 18DF 1.58039 ------------------------------------------------------------------------------ ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN3 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |LL | (N= 30) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TYLE% 30 26.444 33.516 1.6821 6.4 0.0000 0.0349 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 86 TN4: ANH HUONG PHOI HOP CUA AUXIN & CYTOKININ TOI KHA NANG TAO M« SÑO BALANCED ANOVA FOR VARIATE TYLE% FILE TN4 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 TYLE% LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 8 11140.8 1392.60 220.17 0.000 3 2 LL 2 9.88643 4.94321 0.78 0.478 3 * RESIDUAL 16 101.204 6.32524 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 26 11251.9 432.765 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN4 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS TYLE% 1 3 90.0000 2 3 46.6667 3 3 33.3300 4 3 30.0000 5 3 23.3300 6 3 43.3333 7 3 33.3300 8 3 26.6667 9 3 16.6700 SE(N= 3) 1.45204 5%LSD 16DF 4.35323 ------------------------------------------------------------------------------ MEANS FOR EFFECT LL ------------------------------------------------------------------------------ LL NOS TYLE% 1 9 37.4067 2 9 38.8889 3 9 38.1467 SE(N= 9) 0.838335 5%LSD 16DF 2.51334 ------------------------------------------------------------------------------ ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN4 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |LL | (N= 27) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TYLE% 27 38.147 20.803 2.5150 6.6 0.0000 0.4779 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 87 TN5: ANH HUONG 2,4D TOI KHA NANG NHAN M« SÑO TREN 2 NEN MOI TRUONG MS & N6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HÖ SÈ NH©N FILE TN5 ------------------------------------------------------------------ Thiet ke kieu khoi ngau nhien day du VARIATE V003 HÖ SÈ NH©N He so nhan m« sÑo sau 4 tuan LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 1.32694 .265388 121.95 0.000 3 2 LL$ 2 .422880E-02 .211440E-02 0.97 0.414 3 * RESIDUAL 10 .217616E-01 .217616E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 1.35293 .795842E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN5 ------------------------------------------------------------------ Thiet ke kieu khoi ngau nhien day du MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HÖ SÈ NH©N 1 3 2.16653 2 3 2.34393 3 3 2.11696 4 3 1.97070 5 3 2.36643 6 3 2.82558 SE(N= 3) 0.269330E-01 5%LSD 10DF 0.848669E-01 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT LL$ ------------------------------------------------------------------------------- LL$ NOS HÖ SÈ NH©N 1 6 2.30929 2 6 2.27668 3 6 2.30910 SE(N= 6) 0.190445E-01 5%LSD 10DF 0.600100E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN5 ------------------------------------------------------------------ Thiet ke kieu khoi ngau nhien day du F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |LL$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | HÖ SÈ NH©N 18 2.2984 0.28211 0.46649E-01 2.0 0.0000 0.4136 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 88 TN6: ANH HUONG 2,4D TOI KHA NANG NHAN M« SÑO TREN 2 NEN MOI TRUONG N6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HÖ SÈ NH©N FILE TN6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 HÖ SÈ NH©N He so nhan m« sÑo sau 4 tuan LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 8 3.10537 .388171 76.83 0.000 3 2 LL$ 2 .117195E-01 .585977E-02 1.16 0.339 3 * RESIDUAL 16 .808416E-01 .505260E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 26 3.19793 .122997 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HÖ SÈ NH©N 1 3 2.19634 2 3 2.36787 3 3 2.39220 4 3 3.08870 5 3 2.89373 6 3 2.85820 7 3 2.32560 8 3 2.31620 9 3 2.03113 SE(N= 3) 0.410390E-01 5%LSD 16DF 0.123036 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT LL$ ------------------------------------------------------------------------------- LL$ NOS HÖ SÈ NH©N 1 9 2.49107 2 9 2.52451 3 9 2.47441 SE(N= 9) 0.236939E-01 5%LSD 16DF 0.710347E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |LL$ | (N= 27) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | HÖ SÈ NH©N 27 2.4967 0.35071 0.71082E-01 2.8 0.0000 0.3395 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 89 TN7: ANH HUONG CYTOKININ TOI KHA NANG TAI SINH CAY TU M« SÑO BALANCED ANOVA FOR VARIATE TILE% FILE TN7 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 TILE% Ti le mau tai sinh LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 8 14715.1 1839.38 264.70 0.000 3 2 LL$ 2 12.9292 6.46458 0.93 0.417 3 * RESIDUAL 16 111.183 6.94893 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 26 14839.2 570.738 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCHOI FILE TN7 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 VARIATE V004 SOCHOI So choi/diem cay LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 8 44.9870 5.62338 324.84 0.000 3 2 LL$ 2 .334544E-01 .167272E-01 0.97 0.404 3 * RESIDUAL 16 .276980 .173112E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 26 45.2975 1.74221 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN7 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TILE% SOCHOI dc 3 8.89000 1.11111 1 3 70.3704 4.02167 2 3 85.1852 5.45067 3 3 59.2592 3.76333 4 3 51.8519 1.96467 5 3 56.7901 2.77033 6 3 53.0864 2.45033 7 3 49.8573 2.02600 8 3 12.3457 1.67000 SE(N= 3) 1.52194 0.759632E-01 5%LSD 16DF 4.56281 0.227739 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT LL$ ------------------------------------------------------------------------------- LL$ NOS TILE% SOCHOI 1 9 48.8477 2.77415 2 9 49.8290 2.85267 3 9 50.5353 2.78256 SE(N= 9) 0.878694 0.438574E-01 5%LSD 16DF 2.63434 0.131485 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN7 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |LL$ | (N= 27) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TILE% 27 49.737 23.890 2.6361 5.3 0.0000 0.4172 SOCHOI 27 2.8031 1.3199 0.13157 4.7 0.0000 0.4038 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 90 TN8: ANH HUONG PHOI HOP AUXIN & CYTOKININ TOI KHA NANG TAI SINH CAY TU MO SEO BALANCED ANOVA FOR VARIATE TILE% FILE TN8 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 TILE% Ti le tai sinh choi tu m« sÑo LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 321.277 80.3192 34.39 0.000 3 2 LL$ 2 32.9599 16.4799 7.06 0.017 3 * RESIDUAL 8 18.6868 2.33585 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 372.923 26.6374 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCHOI FILE TN8 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 VARIATE V004 SOCHOI So choi/diem cay LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 8.35665 2.08916 164.89 0.000 3 2 LL$ 2 .441640E-02 .220820E-02 0.17 0.844 3 * RESIDUAL 8 .101360 .126700E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 8.46242 .604459 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN8 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TILE% SOCHOI dc 3 85.0242 5.36033 1 3 82.6915 6.08000 2 3 93.8041 6.41833 3 3 92.5582 7.32967 4 3 83.9545 5.30967 SE(N= 3) 0.882392 0.649871E-01 5%LSD 8DF 2.87739 0.211916 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT LL$ ------------------------------------------------------------------------------- LL$ NOS TILE% SOCHOI 1 5 87.3782 6.12260 2 5 89.5253 6.08140 3 5 85.9160 6.09480 SE(N= 5) 0.683498 0.503388E-01 5%LSD 8DF 2.22882 0.164150 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN8 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |LL$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TILE% 15 87.607 5.1611 1.5283 1.7 0.0001 0.0173 SOCHOI 15 6.0996 0.77747 0.11256 1.8 0.0000 0.8436 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 91 TN9: ANH HUONG CYTOKIN TOI KHA NANG NHAN NHANH BALANCED ANOVA FOR VARIATE HÖ SÈ NH©N FILE TN9 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 HÖ SÈ NH©N LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 4 2.51244 .628110 565.87 0.000 3 2 LL 2 .652001E-02 .326000E-02 2.94 0.110 3 * RESIDUAL 8 .887995E-02 .110999E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 2.52784 .180560 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCAO FILE TN9 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 VARIATE V004 CCAO LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 4 2.63733 .659333 3.89 0.049 3 2 LL 2 .253333E-01 .126667E-01 0.07 0.928 3 * RESIDUAL 8 1.35467 .169333 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 4.01733 .286952 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN9 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------ CT NOS HÖ SÈ NH©N CCAO 1 3 1.74000 10.4000 2 3 2.53667 9.50000 3 3 2.37000 10.2667 4 3 2.16667 9.33333 5 3 1.42667 9.73333 SE(N= 3) 0.192353E-01 0.237580 5%LSD 8DF 0.627245E-01 0.774726 ------------------------------------------------------------------------------ MEANS FOR EFFECT LL ------------------------------------------------------------------------------ LL NOS HÖ SÈ NH©N CCAO 1 5 2.07600 9.90000 2 5 2.02600 9.80000 3 5 2.04200 9.84000 SE(N= 5) 0.148996E-01 0.184029 5%LSD 8DF 0.485862E-01 0.600100 ------------------------------------------------------------------------------ ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN9 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT |LL | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | HÖ SÈ NH©N 15 2.0480 0.42492 0.33317E-01 1.6 0.0000 0.1097 CCAO 15 9.8467 0.53568 0.41150 4.2 0.0485 0.9281 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 92 TN10: ANH HUONG PHOI HOP AUXIN & CYTOKIN TOI KHA NAG NHAN NHANH BALANCED ANOVA FOR VARIATE HÖ SÈ NH©N FILE TN10 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 HÖ SÈ NH©N He so nhan choi LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 .556256 .139064 13.63 0.001 3 2 LL$ 2 .105450E-01 .527252E-02 0.52 0.619 3 * RESIDUAL 8 .816464E-01 .102058E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 .648448 .463177E-01 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CC FILE TN10 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 VARIATE V004 CC Chieu cao choi LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 .416402 .104101 1.66 0.252 3 2 LL$ 2 .163462E-01 .817311E-02 0.13 0.880 3 * RESIDUAL 8 .503165 .628956E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 .935913 .668509E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN10 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HÖ SÈ NH©N CC §/C 3 2.51533 9.58400 1 3 2.57280 9.69900 2 3 2.68467 9.53137 3 3 3.06767 9.56133 4 3 2.72300 9.98553 SE(N= 3) 0.583261E-01 0.144794 5%LSD 8DF 0.190196 0.472157 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT LL$ ------------------------------------------------------------------------------- LL$ NOS HÖ SÈ NH©N CC 1 5 2.68588 9.67076 2 5 2.70340 9.63258 3 5 2.74880 9.71340 SE(N= 5) 0.451792E-01 0.112157 5%LSD 8DF 0.147325 0.365731 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN10 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |LL$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | HÖ SÈ NH©N 15 2.7127 0.21522 0.10102 3.7 0.0015 0.6190 CC 15 9.6722 0.25856 0.25079 2.6 0.2517 0.8797 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 93 TN11: ANH HUONG α-NAA TOI KHA NANG PHAT SINH RE BALANCED ANOVA FOR VARIATE SORE FILE TN11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 SORE So re/cay (cai) LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 51.2600 12.8150 387.61 0.000 3 2 LL$ 2 .542062E-01 .271031E-01 0.82 0.477 3 * RESIDUAL 8 .264492 .330615E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 51.5787 3.68420 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE DAIRE FILE TN11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 VARIATE V004 DAIRE Chieu dai re (cm) LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 4.73374 1.18344 289.63 0.000 3 2 LL$ 2 .189588E-01 .947940E-02 2.32 0.160 3 * RESIDUAL 8 .326878E-01 .408598E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 4.78539 .341813 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS SORE DAIRE d/c 3 1.45997 0.618667 1 3 4.69867 1.69233 2 3 6.61733 1.96967 3 3 5.15267 2.14933 4 3 2.57900 1.14900 SE(N= 3) 0.104979 0.369052E-01 5%LSD 8DF 0.342325 0.120344 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT LL$ ------------------------------------------------------------------------------- LL$ NOS SORE DAIRE 1 5 4.16900 1.55320 2 5 4.11258 1.52620 3 5 4.02300 1.46800 SE(N= 5) 0.813161E-01 0.285866E-01 5%LSD 8DF 0.265164 0.932181E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |LL$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | SORE 15 4.1015 1.9194 0.18183 4.4 0.0000 0.4772 DAIRE 15 1.5158 0.58465 0.63922E-01 4.2 0.0000 0.1596 ._.