Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh In vitro trên cây LiLy Sibberia và bước đầu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP I ---------
--------- NGUYỄN THỊ HƯƠNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO CHO CÂY LILY SIBBERIA VÀ BƯỚC ðẦU CHUYỂN GEN NHỜ VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Trồng trọt Mã số: 606201 Người hướng dẫn : PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH HÀ NỘI - 2007 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- i LỜI CAM ðOAN T«i xin cam ®oan ®©y lµ c«ng tr×nh nghiªn cøu cña riªng t«i. C¸c sè liÖu, kÕt qu¶ nªu trong luËn v¨n lµ trung thùc vµ ch−a tõng ®−îc ai c«ng bè trong bÊt k× c«ng tr×nh nµo kh¸c. T«i xin cam ®oan r»ng c¸c th«ng tin trÝch dÉn trong luËn v¨n ®Òu ®2 ®−îc chØ râ nguån gèc. Hà Nội, ngày 10 tháng 9 năm 2007 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hương Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- ii LỜI CẢM ƠN Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS.Nguyễn Thị Lý Anh, người ñã trực tiếp hướng dẫn và giúp ñỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian tôi thực hiện ñề tài tốt nghiệp, cũng như trong thời gian tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới GS.TS.Nguyễn Quang Thạch, Viện trưởng Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội, ñã tạo ñiều kiện về vất chất cũng như tinh thần tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian tôi làm việc cũng như thời gian tôi thực hiện ñề tài tốt nghiệp tại Viện. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths. ðinh Trường Sơn, và toàn thể anh chị em của Viên Sinh học Nông nghiệp ñã giúp ñỡ tôi rất nhiều trong thời gian tôi thực hiện ñề tài. Hà Nội, ngày 10 tháng 9 năm 2007 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hương Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- iii MỤC LỤC Trang 1. më ®Çu 1 1.1. ðặt vấn ñề 1 1.2. Mục ñích, yêu cầu của ñề tài 2 1.2.1. Mục ñích 2 1.2.2. Yêu cầu 3 1.2.3. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của ñề tài 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 2.1. Giới thiệu chung về cây hoa lily 5 2.1.1. Nguồn gốc 5 2.1.2. Vị trí phân loại thực vật 5 2.1.3. ðặc tính sinh vật học 6 2.1.4. Tình hình phát triển hoa lily 7 2.1.4.1. Tình hình phát triển hoa lily trên thế giới 7 2.1.4.2. Tình hình phát triển hoa lily ở Việt Nam 8 2.2. Chuyển gen ở thực vật 9 2.2.1. Khái niệm về kỹ thuật chuyển gen 9 2.2.2. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật 9 2.3. Cơ sở khoa học của phương pháp chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 10 2.3.1. Cơ sở khoa học về khả năng tái sinh ở thực vật 10 2.3.1.1. Tính toàn năng của tế bào. 10 2.3.1.2. Sự phân hoá, phản phân hoá và tái phân hoá của tế bào 11 2.3.1.3. Vai trò của hệ thống tái sinh in vitro trong chuyển gen ở thực vật. 13 2.3.2. Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 14 2.3.2.1. Ti-plasmid 15 2.3.2.2. Chức năng của T-ADN 15 2.3.2.3. Chức năng của gen Vir 16 2.3.2.4. Cơ chế lây nhiễm 19 2.3.2.5. Kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium 22 2.4. Tình hình phát triển cây trồng chuyển gen 23 2.4.1. Những hướng chuyển gen chính ở thực vật 23 2.4.2. Tình hình chung về phát triển cây trồng biến ñổi gen trên toàn cầu 25 2.5. Nghiên cứu chuyển gen trên cây hoa lily 26 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- iv 3. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1. ðối tượng nghiên cứu 29 3.2. Nội dung nghiên cứu 30 3.2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh tạo nguyên liệu chuyển gen 30 3.2.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ ñường saccaroza 30 3.2.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của nhóm chất cytokinin 30 3.2.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của nhóm chất auxin 31 3.2.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng 32 3.2.1.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng và ñường saccaroza 33 3.2.2. Các thí nghiệm chuyển gen. 33 3.3. Phương pháp nghiên cứu 34 3.3.1. Phương pháp nuôi cấy tái sinh mô vẩy củ tạo mẫu cho chuyển gen. 34 3.3.2. Phương pháp nuôi cấy và lây nhiễm vi khuẩn. 34 3.3.3. Cách bố trí thí nghiệm 35 3.3.4. Chỉ tiêu theo dõi 35 3.3.5. ðịa ñiểm và thời gian thực hiện 36 3.3.6. Phương pháp xử lý số liệu 36 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro 37 4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ saccaroza 38 4.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của chất ñiều tiết sinh trưởng 41 4.1.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin 41 4.1.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất auxin 46 4.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng 52 4.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng và ñường sacaroza 60 4.2. Nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens 63 4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của cefotaxime 64 4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy 66 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 74 5.1. Kết luận 74 5.2. ðề nghị 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 PHỤ LỤC 1 80 PHỤ LỤC 2 81 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4 D Dichlorophenoxyacetic acid BA Benzyl adenin αNAA α-Naphthylacetic acid IAA Indol acetic acid MS Murashige and Skoog, 1962 ðC ðối chứng psht Phát sinh hình thái ðNC ðồng nuôi cấy GFP Green fluoresence protein AS Acetosyringone Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1. Ảnh hưởng của saccaroza ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 38 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của kinetin ñến sự phát sinh hình tháicủa mẫu cấy 42 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của BA ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 43 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của IAA ñến sự phát sinh hình tháicủa mẫu cấy 46 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của αNAA ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 47 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của 2,4D ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 49 Bảng 4.7. Ảnh hưởng tổ hợp kinetin + 2,4D ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 53 Bảng 4.8. Ảnh hưởng tổ hợp BA + 2,4D ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 56 Bảng 4.9. Ảnh hưởng của tổ hợp BA + 2,4D + saccaroza ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 60 Bảng 4.10. Ảnh hưởng của cefotaxime ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy lát mỏng vẩy củ 64 Bảng 4.11. Ảnh hưởng của nồng ñộ cefotaxime ñến khả năng diệt khuẩn 66 Bảng 4.12. Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ mẫu mọc khuẩn 67 Bảng 4.13. Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ mẫu sạch và mẫu sống sau khi diệt khuẩn 70 Bảng 4.14. Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ mẫu mang gen chỉ thị GFP 71 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra 14 Hình 2.2. Quá trình tạo phức hợp sợi ñơn T-ADN 20 Hình 2.3. Mô hình chuyển nạp T-ADN từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây 21 Hình 3.1. Giống Lilium Oriental hybrid “Siberia” 29 Hình 3.2. Sơ ñồ Plasmid mang gen GFP 29 Hình 4.1. Mẫu tái sinh tạo callus, chồi và rễ trên môi trường 30g/l sacaroza 40 Hình 4.2. Ảnh hưởng của sacaroza ñến sự phát sinh hình thái của lát mỏng vẩy củ 40 Hình 4.3. Mẫu tái sinh tạo callus và chồi trên môi trường 1mg/l kinetin 45 Hình 4.4. Mẫu tái sinh tạo callus và chồi trên môi trường 1mg/l BA 45 Hình 4.5. Ảnh hưởng của BA và kinetin ñến sự phát sinh hình thái của mô vẩy củ 45 Hình 4.6. Mẫu tái sinh tạo callus, rễ trên môi trường 2mg/l αNAA 51 Hình 4.7. Mẫu tái sinh tạo callus và rễ trên môi trường 1mg/l 2,4D 51 Hình 4.8. Ảnh hưởng của IAA, αNAA và 2,4D ñến sự phát sinh hình thái của mô vẩy củ 51 Hình 4.9. Mẫu tái sinh tạo chồi, callus và rễ trên môi trường 1mg/l 2,4D + 0,2mg/l kinetin 59 Hình 4.10. Mẫu tái sinh tạo chồi, callus và rễ trên môi trường 1mg/l 2,4D + 0,2mg/l BA 59 Hình 4.11. Ảnh hưởng của tổ hợp auxin và cytokinin ñến sự phát sinh hình thái của mô vẩy củ. Trên môi trường 1mg/l 2,4D + 0,2 mg/l kinetin và 1mg/l2,4D + 0,2mg/l BA 59 Hình 4.12. Mẫu tái sinh trên môi trường 1mg/l 2,4D +0,2mg/l BA + 9% saccaroza 62 Hình 4.13. Mẫu tạo callus trên môi trường 1mg/l 2,4D +0,2mg/l BA + 9% saccaroza 62 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- viii Hình 4.14. Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + BA + saccaroza ñến sự phát sinh hình thái của lát mỏng vẩy củ 62 Hình 4.15. Khuẩn lạc trên môi trường ðNC - Công thức 3 ngày ðNC 69 Hình 4.16. Khuẩn lạc trên môi trường ðNC - Công thức 5ngày ðNC 69 Hình 4.17. Khuẩn lạc trên môi trường ðNC - Công thức 7 ngày ðNC 69 Hình 4.18. Khuẩn lạc trên môi trường ðNC - Công thức 10ngày ðNC 69 Hình 4.19. Khuẩn lạc trên môi trường ðNC - Công thức 15 ngày ðNC 69 Hình 4.20. ðối chứng 69 Hình 4.21. Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ mẫu mang gen GFP 72 Hình 4.22. Mẫu mang gen GFP (1 ngày ðNC) 73 Hình 4.23. Mẫu mang gen GFP (3 ngày ðNC) 73 Hình 4.24. Mẫu mang gen GFP (5 ngày ðNC) 73 Hình 4.25. Mẫu mang gen GFP (7 ngày ðNC) 73 Hình 4.26. Mẫu mang gen GFP (10 ngày ðNC) 73 Hình 4.27. Mẫu ñối chứng (không mang gen GFP) 73 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 1 1. më ®Çu 1.1. ðẶT VẤN ðỀ Lily là loại hoa cắt rất quan trọng trên thế giới và ở Việt Nam. Trong nhiều năm qua, hoa lily luôn ñược ñánh giá là một loại hoa cao cấp, có giá trị kinh tế cũng như giá trị xuất khẩu cao. Nhu cầu về loại hoa này trên thị trường hoa trong nước và trên thế giới là rất lớn. Vì thế, loại hoa này hiện ñang rất ñược quan tâm và trú trọng phát triển. ðể phát triển loại hoa này ở Việt Nam, nhiều cơ quan và nhà nghiên cứu ñã tập trung nghiên cứu nhân giống bằng cả phương pháp truyền thống (nhân giống bằng củ) và phương pháp nuôi cấy mô, tế bào. ðã có rất nhiều thành công trong việc nhân giống hoa lily bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào, như: Nhân giống lily bằng phương pháp tạo củ in vitro; nhân giống lily bằng phương pháp tạo cây in vitro,…(Viện Sinh học Nông nghiệp, Viện Di truyền Nông nghiệp). Tuy nhiên, chúng ta mới chỉ thành công trong việc nghiên cứu nhân giống, còn việc nghiên cứu tạo giống vẫn còn là vấn ñề mới mẻ và chưa ñược tập trung nghiên cứu cụ thể. ðến nay, việc nghiên cứu tạo giống hoa lily thích ứng với ñiều kiện khí hậu Việt Nam vẫn chưa ñược ñề cập ñến. Trong tạo giống hoa nói chung và hoa lily nói riêng thì phương pháp chuyển gen ñược coi là phương pháp có hiệu quả. Việc chuyển gen cho cây hoa lily nhằm mục ñích tạo sự ña dạng về màu sắc hoa hay tăng khả năng thích nghi cho cây ở các ñiều kiện trồng trọt khác nhau là nội dung rất ñược quan tâm của nhiều nhà khoa học nông nghiệp trên thế giới và cả trong nước. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 2 Hiện nay trên thế giới, việc tạo giống cây trồng chuyển gen ngày càng phát triển và thu ñược nhiều thành tựu. Năm 2006 diện tích cây trồng chuyển gen ñạt trên 100 triệu ha, với 22 nước trồng cây biến ñổi gen. Các loại cây trồng chuyển gen chủ yếu ñược chuyển nạp ñặc tính kháng thuốc trừ cỏ và kháng sâu, bệnh. Các nỗ lực chính trong nghiên cứu chuyển gen vào cây lily ñã ñược thực hiện bởi các phương pháp chuyển gen trực tiếp như bắn gen (Nishihara và cộng sự, 1993; Sanford và cộng sự, 1993; Wilmink và cộng sự, 1995; Tsuchiya và cộng sự, 1996), sử dụng xung ñiện (Miyoshi và cộng sự, 1995). Trong những năm gần ñây, sự thành công trong nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ñã ñược công bố trên một số loài thuộc họ liliaceae bao gồm: Asparagus officinalis (Kiasaka và Kameya, 1998), Allium sativum (Kondo và cộng sự, 2000), và Muscari armeniacum (Suzuki và Nakano, 2002). Gần ñây nhất, tác giả Y. Hoshi và cộng sự ñã nghiên cứu thành công quy trình tạo cây chuyển gen cho cây Oriental hybrid lily, Lilium Oriental hybrid “Acapulco” bằng vi khuẩn Agrobacterium. Tuy nhiên cho ñến nay việc nghiên cứu chuyển gen cho cây lily còn hoàn toàn chưa ñược ñề cập ở Việt Nam. Xuất phát từ thực tế ñó, chúng tôi tiến hành ñề tài: "Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro trên cây lily Sibberia và bước ñầu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens". 1.2. MỤC ðÍCH, YÊU CẦU CỦA ðỀ TÀI 1.2.1. Mục ñích + Nghiên cứu các ñường hướng tái sinh in vitro nhằm tạo nguyên liệu cho công tác chuyển gen cho cây hoa lily. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 3 + Bước ñầu nghiên cứu một số khâu kỹ thuật ñể chuyển gen cho cây hoa lily nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm cơ sở cho việc xây dựng quy trình chuyển gen. 1.2.2. Yêu cầu a. Xây dựng hệ thống tái sinh * Xác ñịnh ñược ảnh hưởng của ñường saccaroza tới sự phát sinh hình thái của mẫu cấy. * Xác ñịnh ñược ảnh hưởng riêng rẽ và tổ hợp của một số chất ñiều tiết sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin tới sự phát sinh hình thái của mẫu cấy. * Xác ñịnh ñược ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng và ñường saccaroza tới sự phát sinh hình thái của mẫu cấy. b. Các thí nghiệm chuyển gen * Xác ñịnh ñược ảnh hưởng của một số nồng ñộ chất kháng sinh cefotaxim tới khả năng sống và tái sinh của mẫu thí nghiệm. * Xác ñịnh ñược ảnh hưởng của một số nồng ñộ chất kháng sinh cefotaxim tới sự sống sót của vi khuẩn A. tumefaciens sau quá trình ñồng nuôi cấy . * Bước ñầu thử nghiệm chuyển gen GFP (gen chỉ thị) vào cây hoa lily nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 1.3. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của ñề tài 1.3.1. Ý nghĩa khoa học ðề tài sẽ cung cấp thêm nhưng dẫn liệu cơ bản góp phần xây dựng hệ thống tái sinh in vitro ở cây hoa lily, ñặc biệt là ñường hướng tái sinh tạo callus từ mô vẩy củ tạo nguyên liệu phù hợp cho quá trình chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn. Kết quả nghiên cứu của ñề tài chứng minh khả năng có thể chuyển gen vào cây hoa lily một loại cây thuộc nhóm một lá mầm bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 4 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn Trong nghiên cứu chọn tạo giống hoa nói chung và ñặc biệt là chọn tạo giống hoa lily ở nước ta còn rất hạn chế. Kết quả nghiên cứu của ñề tài làm tiền ñề và thúc ñẩy việc ứng dụng một phương pháp mới trong chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây hoa lily nói riêng ở Việt Nam là tạo giống cây trồng chuyển gen. 1.3.3. Tính mới của ñề tài ðề tài là một trong những công trình ñầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu chuyển gen cho cây lily nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Việc chuyển nạp thành công gen chỉ thị GFP (green fluoresence protein) cho mô vẩy củ của cây hoa lily Sibberia là những kết quả ñầu tiên rất có ý nghĩa của hướng nghiên cứu hoàn toàn mới nêu trên. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 5 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY HOA LILY 2.1.1. Nguồn gốc Cây hoa lily có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Nam Triều Tiên, Mỹ và một số nước khác. Hoa lily ñã ñược nghiên cứu và thuần hóa gần 100 năm nay từ các loài hoang dại phân bố ở hầu hết các châu lục từ 100 ñến 600 vĩ bắc, ñặc biệt là những vùng có khí hậu ôn ñới và lạnh, hoặc ở những vùng núi cao từ 1200m trở lên của các vùng nhiệt ñới như Trung Quốc, Ấn ðộ, Indonexia, Việt Nam ...[7]. 2.1.2. Vị trí phân loại thực vật Trong hệ thống phân loại thực vật cây hoa lily ñược xếp vào nhóm cây một lá mầm (Monocotyledones), phân lớp hành (Lilidae), bộ hành (Liliales), họ hành (Liliaceae), chi Lilium.[14]. Chi Lilium có tới hơn một trăm loài, ở châu Á có khoảng 50 ñến 60 loài (Nhật, Trung Quốc, Triều Tiên, Việt Nam ...), Bắc Mỹ có tới 24 loài (Mỹ, Canada, Argentina), châu Âu có 12 loài (Hà Lan,Ý, Pháp) [7]. Ở Việt Nam mới chỉ phát hiện thấy 2 loài cây là cây bách hợp (L.brownii F.E Brow war oldiesteriwils), mọc hoang dại trên các ñồi cỏ ở Bắc Giang, Thái Nguyên, Cao Bằng, Lạng Sơn, có vẩy củ của thân dùng làm thuốc và loài Lilium poilanei Ganep có ở ñồi cỏ Sa Pa, Hoàng Liên Sơn. Ngoài ra, hiện nay có rất nhiều giống lai ñược tạo ra bằng phương pháp lai hữu tính giữa các loài hoa loa kèn với nhau. Các giống loài này có sức sinh trưởng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 6 khỏe, có khả năng chống sâu bệnh, mang lại các ñặc trưng hình thái, dạng hoa trung gian của bố và mẹ với các màu sắc hết sức ñộc ñáo và lạ mắt [11]. 2.1.3. ðặc tính sinh vật học Cây hoa lily là loại cây thân thảo, thân cao từ 50-200cm. Bộ phận trên mặt ñất là thân, lá, hoa và quả, là phần thương phẩm của lily. Bộ phận dưới mặt ñất là rễ và thân vẩy (củ) là bộ phận làm giống của cây lily. Thân cây lily thường mọc ñơn có lá. Lá luôn có hình mũi mác hay hình vạch ít khi rộng, hình tim và mọc xung quanh thân, không có cuống hoặc cuống rất ngắn, một số ít giống ở nách lá có mầm, có thể dùng nhân giống. Hoa lưỡng tính, kích thước lớn mọc ở nách lá hay ở ngọn. Hoa có hình loa kèn, hình phễu, hình sao, hình cái chén nông. Màu sắc hoa rất phong phú: màu trắng, màu vàng lục, màu phấn hồng, màu cam, màu ñỏ, màu tím ... Màu cánh hoa thường là ñơn sắc hoặc có ñốm màu nâu, màu tím một số có hương thơm. Hoa có thể mọc riêng lẻ hay thành cụm gồm nhiều hoa, bao hoa 6 mảnh dạng cánh, nhị 6, bầu hình trụ, ñầu nhụy hình ñầu, chia 3 thùy. Quả nang có 3 góc và 3 nang, quả nang có nhiều hạt, ñộ lớn, trọng lượng hạt tùy theo giống. Trong ñiều kiện khô, lạnh, hạt có thể bảo quản ñược ba năm. Rễ lily có hai tầng, rễ mọc ở gốc của thân vẩy gọi là rễ gốc, to, mềm, có ngay trên củ giống hoặc mọc ra ngay sau khi trồng. Rễ mọc ở nơi tiếp giáp giữa củ và thân trên mặt ñất gọi là rễ thân. Phần thân vẩy là phần phình to của thân tạo thành, có màu trắng hoặc màu hồng nhạt, phía ngoài không có màng bao bọc, nên gọi là thân vẩy trần. Trên ñĩa thân vẩy có vài chục vẩy hợp lại, chất ñất, kỹ thuật trồng và tuổi của thân vẩy ảnh hưởng rất lớn ñến hình thái thân. Màu sắc, kích thước của thân vẩy tùy thuộc vào loài, giống khác nhau. ðộ lớn của thân Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 7 vẩy tương quan chặt chẽ với số nụ hoa. Thân vẩy chứa 70% nước, 23% chất bột, một lượng nhỏ protein, chất khoáng và chất béo. Theo Linline (1970) [4], số thân vẩy cũng tỷ lệ thuận với số lá và số nụ hoa, số vẩy càng nhiều thì số lá và số nụ hoa càng nhiều. Nếu bóc bỏ lớp vẩy củ ngoài thì tốc ñộ nảy mầm của của củ nhanh hơn, nhưng tốc ñộ hình thành của các cơ quan sinh sản giảm, ra hoa muộn hơn. 2.1.4. Tình hình phát triển hoa lily 2.1.4.1. Tình hình phát triển hoa lily trên thế giới Trên thế giới, lily cùng với tuylip, freesia là ba loại hoa dạng thân củ chủ yếu quan trọng trong ngành sản xuất hoa, chiếm 24% giá trị sản phẩm hoa thương mại. Những vùng sản xuất hoa lớn trên thế giới gồm các nước Châu Âu như Hà Lan, Pháp, Bỉ, ðức, Ý,...; các nước Bắc Mỹ như Mỹ, Canada...; một số nước ở Châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan,...[4]. Năm 1997, Hà Lan có 356 ha lily, ñứng thứ hai trong tổng diện tích hoa cắt trồng bằng củ ở ñất nước này (sau tuylip). Sở dĩ hoa lily ñược phát triển mạnh trong những năm gần ñây là do người Hà Lan ñã tạo ra rất nhiều giống mới có hoa ñẹp, chống chịu sâu bệnh tốt, năng suất cao. Hiện nay, Hà Lan mỗi năm trồng khoảng 18.000 ha hoa lily trong ñó xuất khẩu 70%. Hà Lan còn là nước có công nghệ tạo giống và trồng lily tiên tiến nhất hiện nay. Mỗi năm Hà Lan tạo ra từ 15 ñến 20 giống mới, sản xuất 1,315 triệu củ giống lily, cung cấp cho 35 nước khác nhau trên thế giới [4]. Ở Italia, tổng diện tích trồng hoa chiếm 8000ha, tổng giá trị hàng năm khoảng 1,1tỷ ñôla, trong ñó hoa lily là một trong những loại hoa cắt quan trọng chiếm 280 – 300ha với tổng giá trị thu ñược hang năm là 71 triệu ñôla [34]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 8 Kenia là nước sản xuất hoa tươi chủ yếu của Châu Phi và là nước xuất khẩu hoa tươi lớn nhất châu lục này. Mỗi năm nước này xuất khẩu sang Châu Âu là 65 triệu USD, trong ñó riêng lily chiếm 35% [4]. Ở Canada, hoa lily ñược sử dụng chủ yếu ở các dạng hoa cắt và hoa chậu. Sản lượng hoa lily cắt cành tăng lên qua các năm. Năm 1998, sản lượng hoa cắt cành là 11,28 triệu cành, hoa chậu là 4,2 triệu chậu; tăng lên 17,13 triệu cành và 4,39 triệu chậu vào năm 2000 [4]. Từ năm 1999 ñến năm 2003, tỷ lệ hoa cắt tăng 6-9% so với những năm trước ñó, ñem lại lợi nhuận trên 35tỷ ñôla, tập trung chủ yếu ở các nước như Hungari, Trung Quốc, Nhật Bản, Hà Lan [4]. Nhật Bản có 1558 ha trồng các loại hoa có củ cho sản lượng hàng năm là 33,047 triệu yên Nhật trong ñó diện tích trồng hoa lily chiếm khoảng 508 ha cho sản lượng hàng năm khoảng 15,068 triệu yên Nhật [34]. 2.1.4.2. Tình hình phát triển hoa lily ở Việt Nam Ở Việt Nam, hoa lily ñã ñược trồng thành công ở nhiều tỉnh nước ta như ðà Lạt - Lâm ðồng, Sapa – Lào Cai, Mộc Châu – Sơn La, Hà Nội với hiệu quả kinh tế rất cao. Hoa lily ở nước ta ñược xem là một trong bốn loại hoa quan trọng ñang ñược nghiên cứu, nhằm ñưa loại hoa này thành mặt hàng xuất khẩu mũi nhọn của ngành trồng hoa trong tương lai. ðà Lạt là nơi hiện ñang có diện tích trồng hoa lily lớn nhất trong cả nước (chiếm 8% diện tích trồng hoa trong cả nước). Tình hình phát triển hoa lily ở ðà Lạt khá thuận lợi, một phần do thiên nhiên ưu ñãi cho sự phát triển của các giống hoa nói chung và cho hoa lily nói riêng, một phần do kỹ thuật trồng hoa lily ở ðà Lạt tương ñối cao nên hoa sinh trưởng phát triển khá tốt. Hiện nay, lily trong những loại hoa ñem lại hiệu quả kinh tế cao nhất cho một số công ty ở ðà Lạt như: Công ty Hasfarm, công ty Bonifarm, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 9 công ty Thanh Sơn,… Phân viện sinh học nhiệt ñới ðà Lạt. Trong ñó, công ty Hasfarm ñã áp dụng công nghệ trồng hoa mới trên 28 ha với 60% sản lượng hoa xuất khẩu sang Singapo, Nhật Bản, Thái Lan, Úc. Hoa lily là một trong số những loại hoa ñược sản xuất nhiều nhất của công ty này [32]. 2.2. CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 2.2.1. Khái niệm về kỹ thuật chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ñưa một hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, ñộng vật…) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein ñặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các ñặc tính mới ở cơ thể chuyển gen. 2.2.2. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: + Nhóm phương pháp chuyển gen gián tiếp gồm: Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium và phương pháp chuyển gen nhờ virus. + Nhóm phương pháp chuyển gen trực tiếp gồm: Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm (Mild sonication); chuyển gen nhờ kỹ thuật ñiện xung (electroporation); kỹ thuật chuyển gen nhờ silicon carbide; chuyển gen bằng phương pháp súng bắn gen; phương pháp trực tiếp chuyển gen thông qua ống phấn (pollen tube). Trong các phương pháp chuyển gen nói trên thì phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium là phương pháp ñược sử dụng nhiều nhất Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 10 hiện nay. ðây là phương pháp khá ñơn giản, dễ dàng thực hiện và hiệu quả thành công tương ñối cao. Dựa vào cơ chế chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens, người ta ñã dùng vi khuẩn ñể chuyển các gen mong muốn trên cơ sở thiết kế lại hệ thống Ti-plasmid của vi khuẩn sao cho vẫn ñảm bảo ñược chức năng chuyển gen nhưng không mang các gen gây ñộc cho cây. Người ta ñã tạo ra các dạng vectơ mới ñể chuyển gen là những vectơ liên hợp và vectơ nhị thể. Các hệ thống vectơ mới ñược tạo thành này ñều ñược dựa trên cơ sở cải tiến Ti-plasmid. Phần T-ADN của Ti-plasmid sẽ bị cắt bỏ những gen gây u và gen tổng hợp opine, thay thế vào ñấy là các gen mong muốn kèm theo gen chỉ thị và gen khởi ñộng. Ngoài ra, phương pháp chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn (pollen tube) cũng là phương pháp ñược sử dụng rộng rãi. Phương pháp chuyển gen này còn ñược xem là phương pháp chuyển gen không qua nuôi cấy mô. Phương pháp này ñược nhóm Ray Wu ñại học Cornell (Mỹ) ñề xuất năm 1988 trên ñối tượng cây lúa. Theo phương pháp này thì ADN chuyển vào có thể theo ñường ống phấn chui vào bầu nhuỵ cái và chuyển gen ngay sau khi hạt phấn mọc qua vòi nhụy và bắt ñầu ñưa tinh tử vào thụ tinh. Theo tác giả thì chuyển gen qua bao phấn tốt nhất ngay sau khi quá trình thụ tinh sảy ra ở noãn nhưng tế bào sinh dục cái chưa phân chia. Như vậy, sự chuyển gen chỉ xảy ra ñối với một tế bào sinh sản cái (trứng) duy nhất và khi tái sinh cây sẽ không xuất hiện thể khảm. ở Việt Nam, phương pháp này ñang ñược Viện nghiên cứu cây bông và Viện Công nghệ sinh học thử nghiệm ở quy mô lớn trên cây bông [13]. 2.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens 2.3.1. Cơ sở khoa học về khả năng tái sinh ở thực vật 2.3.1.1. Tính toàn năng của tế bào. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 11 Haberlandt (1902), lần ñầu tiên ñã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật ña bào ñều có khả năng tiềm tàng ñể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện ñại thì mỗi tế bào riêng rẽ ñã phân hoá ñều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và ñủ của cả cơ thể sinh vật ñó. Khi gặp ñiều kiện thích hợp, mỗi tế bào ñều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. ðó là tính toàn năng của tế bào. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho ñến nay con người ñã hoàn toàn chứng minh ñược khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [13], [24]. 2.3.1.2. Sự phân hoá, phản phân hoá và tái phân hoá của tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, ñược hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào ñó ñều bắt nguồn từ một tế bào ñầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai ñoạn ñầu, tế bào hợp tử liên tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau ñó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục ñược biến ñổi thành các tế bào chuyên hóa ñặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau. ðó là quá trình phân hoá tế bào ở cơ thể thực vật [13]. Tuy nhiên, khi tế bào ñã phân hoá thành các tế bào có chức năng riêng biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến ñổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở ñiều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình ñó gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 12 Quá trình phân hoá tế bào có thể biểu thị: Trong ñiều kiện nuôi cấy nhân tạo (nuôi cấy in vitro), các tế bào phôi sinh (mô sẹo) có thể tái sinh thành các dạng tế bào chuyên hoá như chồi, rễ và có thể thành cây hoàn chỉnh dưới sự tác ñộng của một số chất ñiều tiết sinh trưởng. ðây chính là quá trình tái phân hoá tế bào thực vật, quá trình này chỉ xảy ra trong nuôi cấy in vitro. Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, ức chế các gen. Tại một thời ñiểm nào ñó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen ñược hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) ñể cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị ñình chỉ hoạt ñộng. ðiều này xảy ra theo một chương trình ñã ñược mã hoá trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn ñược hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá, phản phân hoá và tái phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho ñến cùng là kỹ thuật ñiều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong ñiều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách ñịnh hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn của tế bào thực vật. ðể ñiều khiển sự phát sinh Tế bào phôi sinh (hợp tử) Tế bào chuyên hoá Tế bào phôi sinh (mô sẹo) Quá trình phân hoá Quá trình phản phân hoá Quá trình tái phân hoá Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 13 hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất ñiều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. Tuỳ theo mục ñích nghiên cứu ñặt ra như tạo mô sẹo, tạo chồi phụ, tạo rễ, tạo phôi vô tính hay cho mọc chồi trực tiếp từ mô nuôi cấy, mà môi trường thích hợp là rất cần thiết [13]. 2.3.1.3. Vai trò của hệ thống tái sinh in vitro trong chuyển gen ở thực vật. Trong kỹ thuật chuyển gen vào cơ thể thực vật, thì nguồn vật liệu thường ñược sử dụng ñể chuyển gen là: mô lá, mô thân, mẩu callus, phôi, những tế bào tách rời… Những vật liệu này sau khi ñã ñược biến nạp thành công, các tế bào ñã dung nạp những gen ngoại lai, ta phải tìm cách làm cho những tế bào này tái sinh ñược thành một cơ thể hoàn chỉnh bằng cách ñặt nó vào một môi trường tái sinh thích hợp. Nếu như, sự tái sinh thành cây hoàn chỉnh không thành công thì tất cả những vật liệu ñã ñược biến nạp ñó sẽ trở nên vô nghĩa. Chính vì vậy, sự thành công của kỹ thuật chuyển gen phụ thuộc vào sự tái sinh của tế bào. Do vậy, việc lựa chọn và ñiều chỉnh môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật ñóng ._.vai trò hết sức quan trọng, mang tính quyết ñịnh tới thành công hay thất bại của thí nghiệm biến nạp, bên cạnh ñó, vấn ñề sử dụng mô hay tế bào thích hợp ñể biến nạp cũng là mục tiêu nghiên cứu không kém phần quan trọng [9]. James F. Hutchinson, Daniel Isenegger, Savitri Nadesan, Neil Smith and Peter Waterhouse, năm 2000 [26] nhận thấy: ñể có thể tạo ñược giống mới nhờ cải biến di truyền một cách hiệu quả thì phải ñảm bảo 4 yêu cầu sau: - Hệ thống tái sinh thích hợp ñể tái sinh ñược cây ñã chuyển gen. - Hệ thống vectơ thích hợp ñể có thể ñưa các gen lạ vào bộ gen của ñối tượng ñược chuyển gen. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 14 - Có các gen thích hợp ñã ñược nhân dòng và ñã xác ñịnh ñược các ñặc tính - Các phương pháp ñể ñánh giá các cây chuyển gen trong phòng thí nghiệm, nhà kính và ñồng ruộng. 2.3.2. Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens là loài vi khuẩn ñược sử dụng phổ biến nhất trong chuyển nạp gen. Agrobacterium tumefaciens thuộc vi khuẩn ñất, gram âm, hình que, có khả năng di ñộng (có 5-11 lông roi), không sinh bào tử và cùng họ với vi khuẩn cố ñịnh ñạm Rhizobium. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, phát triển tối ưu ở nhiệt ñộ 290C [10]. Agrobacterium tumefaciens là tác nhân gây bệnh cho cây do nó có khả năng chuyển T-ADN vào tế bào cây chủ, sau ñó T-ADN này hợp nhất vào bộ gen của tế bào cây chủ dẫn ñến hình thành khối u. Khối u ñược hình thành trên rễ (phần nằm trên mặt ñất) và ñỉnh của nhiều loài cây hai lá mầm, một số loài cây ăn quả như táo, lê, ñào, nho và những cây cảnh như hoa hồng [15]. Hình 2.1. Khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra (nguồn Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có kiến trúc vòng, kích thước 2,6 Mb. Ngoài ra vi khuẩn còn mang plasmid lớn có kích thước 200- 800 kbp, phần lớn những gen có liên quan ñến sự hình thành khối u ở thực vật ñều nằm trong plasmid này nên ñược gọi là Ti-plasmid [15]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 15 2.3.2.1. Ti-plasmid Ti-plasmid là một phân tử ADN sợi ñôi mạch vòng nằm tách biệt với nhiễm sắc thể và có khả năng nhân lên một cách ñộc lập trong tế bào vi khuẩn. Cấu trúc chung của một Ti-plasmid gồm: vùng T-ADN - trình tự mã hoá ñược chuyển vào trong cây; vùng mang các gen vir - vùng trực tiếp tham gia tạo T- ADN sợi ñơn và chuyển T-ADN này vào tế bào cây; vùng rep - cần cho sự tái bản của Ti-plasmid, vị trí tra và trb - tham gia vào quá trình chuyển tiếp hợp của Ti- plasmid, các gen cần cho việc hấp thu và chuyển hoá các opine. Hai yếu tố quan trọng trong cấu trúc của Ti-plasmid cần cho sự chuyển gen vào cây là ñoạn T- ADN bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai bờ của ñoạn T- ADN và gen vir [13], [15]. 2.3.2.2. Chức năng của T-DNA T-ADN là một ñoạn ADN có kích thước từ 10-30 kbp, có mang các gen mã hoá cho việc tổng hợp auxins, cytokinins, opines và các gen gây khối u. Trong Ti-plasmid, vị trí của T-ADN ñược giới hạn bởi các trình tự lập lại có chiều dài khoảng 25 bp nằm ở 2 ñầu gọi là bờ phải và bờ trái. Tuy nhiên, bờ trái của T-ADN bị mất không ảnh hưởng ñến tính ñộc nhiều, trong khi ñó bờ phải lại cần thiết và ñược ñề nghị rằng tiến trình chuyển nạp diễn ra với bờ phải trước rồi tiến dần về phía trái. Việc ñảo ngược bờ phải sẽ làm yếu ñi khả năng tạo khối u [13]. T-ADN mã hóa một vài protein, protein này biểu hiện trong tế bào cây ñược chuyển gen sẽ làm thay ñổi hình thái của cây. Theo Binns và Costantino (1998) [15], T-ADN mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của các gen ñược chuyển mang nhiều ñặc ñiểm của các gen trong nhân của thực vật, thí dụ như kiểu hộp TATA (TATA box) và hộp CAAT (CAAT box). Một nhóm các gen của T-ADN ñiều khiển tổng hợp các hormon sinh trưởng của Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 16 cây, những hormon này làm các tế bào tăng trưởng và làm thay ñổi hình dạng bên ngoài. Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH ñiều khiển sự chuyển hoá tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin). Sản phẩm của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP và các enzyme trong cây ñược cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP thành cytokinin zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử hydro của một nhóm methyl của isopentenyl. Hai gen trên T-ADN khác ñược cho là có chức năng trong tạo khối u là 5 và tml (cũng còn gọi là 6b). Sản phẩm của gen 5 ñiều khiển sinh tổng hợp indole-3-lactate, ñó là một chất ñồng ñẳng với auxin. Trong khi ñó gen tml (cũng còn gọi là 6b) làm tăng mức ñộ nhạy cảm của các tế bào cây với phytohormon bằng một cơ chế chưa ñược giải thích. Gen tml có thể kích thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u khác. Một nhóm gen ñược chuyển vào tế bào ñể ñiều khiển sản xuất nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn Agrobacteriu tumefaciens phát triển, ñó là các opines. ðây là một dạng kết hợp giữa một amino axit với một ceto (keto) axit hoặc với một ñường. Các tế bào chuyển gen tổng hợp và tiết ra một số lượng lớn các opines. Các opines này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên ngoài vùng T-ADN và thường trên plasmid ñộc) cần cho việc phân giải các opines ñược tổng hợp từ khối u [13], [15]. 2.3.2.3. Chức năng của gen Vir Quá trình chuyển T-ADN từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sang tế bào cây chủ ñược thực hiện bởi hoạt ñộng của các gen vir. Có ít nhất 25 gen ñược nhận biết trong 7 ñơn vị phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF và vùng này có kích thước khoảng 30- 40 kbp. Theo Stachel và ctv. (1987) [15] vùng này có 20 gen nằm trên 6 operon, các gen ñó là: virA, virB, virC, virD, virE và virG. Những gen vir này có vai trò trong việc tạo sợi ñơn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 17 T-ADN trong vi khuẩn và chuyển nó vào tế bào cây chủ rồi gắn vào nhiễm sắc thể cây chủ. Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông qua tín hiệu hoá học là chất acetosyringone (AS) tiết từ vết thương. Các tín hiệu hoá học từ vết thương ở tế bào cây chủ tạo ra ñược nhận biết trước tiên bởi protein virA, rồi ñến protein virG ñể làm kích hoạt các gen ñộc khác ở vùng vir, tạo ra các protein cần thiết. Sự cảm ứng gen vir phụ thuộc vào nhiệt ñộ thấp và ñiều kiện pH axit. Hệ thống ñiều hoà gen vir hoạt ñộng thông qua hai gen ñộc: virA và virG. Biểu hiện cơ bản của gen virA tổng hợp nên protein nằm trong màng tế bào. Protein virA ñáp ứng với sự trao ñổi chất của vết thương của cây và có thể ñáp ứng nhạy cảm với sự thay ñổi của môi trường. Với một nồng ñộ AS thích hợp virA có thể ñược kích thích bởi ñường, các opine khối u hoặc amino axit. Protein virA sẽ tự phosphoryl hoá, sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào virG ñược phosphoryl hoá bởi aspartic axit còn lại sau khi virA tự phosphoryl hoá và kích hoạt sao mã cho tất cả các gen vir. Các promoter của gen vir có kích thước khoảng 12 bp trong trình tự “vir box”. Sự phosphoryl hoá làm cho protein virG gắn kết vào “vir boxes” và kích hoạt sự sao mã của các gen virBCDEFGH [15]. Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi ñơn T-ADN trong vi khuẩn và ñưa sợi ñơn T-ADN vào trong tế bào cây. Các protein ñược mã hoá bởi gen virD và virE thực hiện chức năng tạo ra phức hợp T-ADN. Protein virD2 là một endonucleaz, protein này có chức năng xúc tác cắt sợi T-ADN ở vị trí 5’của bờ phải sau ñó virD1 cắt rời sợi T-ADN tại vị trí ñầu 3’ của bờ trái tạo thành một sợi ñơn. Ngoài chức năng cắt sợi T-ADN virD2 còn có chức năng khác như bám dính vào ñầu 5’ ñể tránh sự tác ñộng của enzim nucleaza và chuyển sợi ñơn T-ADN vào nhân tế bào thực vật vì trong Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 18 virD2 còn chứa một tín hiệu gọi là tín hiệu ñịnh vị trong nhân (nuclear locolization signal). Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự kết nạp T-ADN ñã ñược ñề nghị: virD2 vừa làm nhiệm vụ của một enzim integraza vừa làm nhiệm vụ của một enzim ligaza [15]. VirE2 là một protein nối kết vào sợi ñơn T-ADN, nó sẽ bảo vệ T-ADN khỏi sự phân giải của các enzim nucleaz trong tế bào cây giống như virD2, virE2 cũng có chứa một tín hiệu ñịnh vị trong nhân. VirB có chức năng hình thành một cái kênh xuyên qua vách tế bào thực vật, giúp chuyển sợi ñơn T- ADN vượt xuyên qua tế bào vi khuẩn ñến vách, màng tế bào thực vật và sau ñó vượt qua các lỗ nhân ñể vào nhân tế bào. Hai sản phẩm của gen vir cũng ñược cho là có chức năng trong việc tạo T-ADN sợi ñơn là: virC1 và virC2. virC1 ñã ñược thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cường sự cắt T-ADN ở vị trí bờ vai của virD1/virD2 endonucleaz . Một số tác giả khác cho rằng virC1 và virC2 không cần cho tạo T-ADN sợi ñơn. Nhưng khi vắng mặt hai protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-ADN vào cây khá thấp. Do ñó ñề nghị rằng chúng có chức năng trong việc tăng cường sản xuất sợi ñơn T-ADN. Cùng với protein virD4, mười một protein virB, virE2 và virF tham gia ñưa T-ADN vào nhân. Hệ thống chuyển nạp T-ADN ñược mã hóa bởi operon virB, operon này mang 11 gen. Sự chuyển phức hợp T-ADN dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và ñột biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này ñều làm mất khả năng tạo pili và tạo khối u. Các protein virB ñiều khiển tạo chiên mao này (chiên mao này tương tự như chiên mao tiếp hợp) và virB2 là tiểu phần chính của chiên mao này. Hai protein virB là virB4 và virB11 có hoạt tính ATPaz và ñược cho là cung cấp năng lượng cho việc xuất các tiểu phần protein khác, cho vận chuyển T-ADN, hoặc cả hai. Hệ thống virB ñưa T-ADN tới tế bào chất của tế bào cây, nơi ñây các bước cần cho chuyển T-ADN vào nhân và kết Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 19 nạp với ADN của cây ñược thực hiện. Cầu nối virB có thể gắn kết với phức hợp T-ADN bởi protein virD4, protein này nằm trong màng và rất cần cho việc chuyển nạp. Hệ thống virB/virD4 ñưa phức hợp T-ADN–virD2 và protein virE2 vào tế bào chất của tế bào cây, phức hợp T-ADN cuối cùng ñược tạo ra bằng cách phủ T-ADN với protein virE2 [15]. 2.3.2.4. Cơ chế lây nhiễm Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ñược tìm thấy ở trên và xung quanh bề mặt rễ. Nhưng vi khuẩn chỉ xâm nhiễm ñược vào cây khi cây bị tổn thương do nhiều nguyên nhân. ðiều này có thể dễ dàng ñược chứng minh bằng các thí nghiệm. Trong ñiều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn ñược dẫn dụ ñến vết thương nhờ các tín hiệu hoá học. Tuy nhiên, chủng vi khuẩn có mang Ti-plasmid sẽ ñáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng nhận diện ñược các hợp chất phenolic tiết ra từ vết thương như acetosyringone (AS). Chất này có tác dụng rất mạnh dù ở nồng ñộ thấp (10-7 M). Bởi vậy, một trong những chức năng của Ti-plasmid là mã hoá cho các thụ thể (receptor) nhận biết các hợp chất hoá học. Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và có thể giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thương. Acetosyringone ñóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm. ở nồng ñộ cao (10-5 – 10-4 M) hơn nó sẽ kích hoạt các gen vir trên Ti-plasmid. Các gen vir ñược kích hoạt tốt nhất ở nhiệt ñộ 25-270C. Tuy nhiên, hầu hết các chủng Agrobacterium hoạt ñộng ổn ñịnh ở nhiệt ñộ 18-200C [15]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 20 Hình 2.2. Quá trình tạo phức hợp sợi ñơn T-DNA (nguồn Valentine, 2003). Sau khi ñược kích hoạt, các gen vir sẽ ñiều khiển quá trình tạo T-ADN sợi ñơn trong tế bào vi khuẩn (hình 2.2). Quá trình tạo T-ADN sợi ñơn ñược thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein virD1 và virD2 thực hiện. Sau ñó protein virD2 gắn vào sợi ñơn T-ADN ñể tạo thành phức hợp T-ADN. Ngoài virD1, virD2 người ta còn cho rằng virC1 và virC2 cũng tham gia vào quá trình tạo T-ADN sợi ñơn. Phức hợp T-ADN-virD2 cùng với protein virE2 ñược chuyển vào trong tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp ñược mã hoá bởi các gen virB. Cùng với một số thành phần trong tế bào chất của tế bào cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục ñưa phức hợp T-ADN vào trong nhân tế bào. Trong nhân tế bào cây, T-ADN ñược kết nạp vào bộ gen của cây không theo một quy luật tái tổ hợp nào cả. Mô hình cơ sở cho sự kết nạp T-ADN vào bộ gen của cây ñã ñược ñề nghị. Theo mô hình này, ñầu tiên ñầu 3’ của T-ADN nhận diện các ñoạn tương ñồng với ADN của cây và gắn vào. Cả việc tách sợi ADN của cây và overhang ñầu 3’ của T-ADN ñều ñược enzyme nucleaza thực hiện. Cuối cùng nucleotide gắn với virD2 tìm các ñoạn vi tương ñồng (microhomology) trên ADN của cây và gắn vào. Sự gắn kết này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực ñiện tử của ñầu 5’ ñến gần ñầu 3’ nucleophilic của ADN cây mà bị tách ra. Cuối cùng sự gắn kết trên sợi ADN của cây ñược hoàn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 21 thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp ñoạn T-ADN dẫn ñến sự kết nạp của T-ADN hoàn thành. Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên T-ADN hoạt ñộng tổng hợp nên các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn. Các opines ñược tạo ra từ các khối u do vi khuẩn Agrobacterium nhiễm vào ñược vi khuẩn biến dưỡng nhờ vào các gen ở vùng phân giải opine trên Ti-plasmid. Tùy theo kiểu opine mà ñược chuyển hóa bởi các gen khác nhau [15]. Khả năng chuyển nạp ñoạn ADN của Agrobacterium vào trong tế bào cây cung cấp một công cụ mạnh cho công nghệ sinh học thực vật, chuyển nạp gen thông qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium ngày càng ñược ứng dụng rộng rãi ñể chuyển một hay nhiều gen vào cây trồng do có nhiều ưu ñiểm so với các phương pháp chuyển nạp gen khác: gen ñược chuyển nạp gắn vào hệ gen cây một cách ñơn giản, hiện tượng tái sắp xếp lại của các gen ít xảy ra, có ít bản bản sao của gen ñược biến nạp tạo thuận lợi trong việc phân tích cũng như biểu hiện gen mới trong cây chuyển gen, các gen chuyển nạp duy trì bền vững qua các thế hệ sau. Trước ñây, phương pháp này bị hạn chế chỉ thực hiện trên cây hai lá mầm do Hình 2.3. Mô hình chuyển nạp T-ADN từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây (nguồn Zhu và ctv, 2000). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 22 tin rằng Agrobacterium chỉ có thể nhiễm vào cây hai lá mầm. Sau này, người ta tìm ra rằng mặc dù Agrobacterium chỉ tạo khối u trên cây hai lá mầm nhưng nó có thể nhiễm vào cây một lá mầm. Trước ñây ñối với cây một lá mầm như lúa, phương pháp chuyển nạp gen nhờ vào vi khuẩn Agrobacterium rất khó thành công. Tuy nhiên gần ñây công trình nghiên cứu của Hiei và Komari (1996) [3] ñã minh chứng ñược hiệu quả chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium vào cây một lá mầm (lúa) cũng cao như ñối với cây hai lá mầm. 2.3.2.5. Kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium Kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ñã ñược áp dụng thành công trên nhiều ñối tượng cây trồng, ñặc biệt là cây hai lá mần như: khoai tây, cà chua, thuốclá, ñu ñủ,....việc chuyển gen vào cây một lá mầm khó thành công hơn. Nhưng gần ñây, người ta cũng ñã thành công trong việc chuyển gen cho cây một lá mầm nhờ vi khuẩn Agrobacterium như: lúa, ngô. ðể thực hiện thành công việc chuyên gen nhờ vi khuẩn người ta thường sử dụng kỹ thuật ñĩa lá. Các bước của kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn gồm: * Bước 1: Tạo các ñĩa lá và ngâm trong dịch khuẩn. ðối tượng sử dụng ñể chuyển gen ñược cắt ra thành những mảnh nhỏ, sau ñó xử lý chúng trong dung dịch có chứa vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid chứa gen mong muốn ñã ñược thiết kế trong vài chục phút. * Bước 2: Tiến hành ñồng nuôi cấy ñĩa lá và vi khuẩn. ðĩa lá sau khi ñược xử lý trong dung dịch khuẩn, chúng ñược cấy lên môi trường ñồng nuôi cấy. Quá trình ñồng nuôi cấy này ñược thực hiện trong ñiều kiện tối hoàn toàn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào ñối tượng chuyển gen. Trong môi trường ñồng nuôi cấy có bổ sung acetosyrigone ñể tăng cường khả năng hoạt hoá gen vùng Vir qua ñó thúc ñẩy thêm quá trình Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 23 chuyển gen. ðây là giai ñoạn quyết ñịnh hiệu quả của công tác chuyển gen. * Bước 3: Làm sạch khuẩn trên ñĩa lá và cấy lên môi trường tái sinh. Quá trình làm sạch ñĩa lá ñược thực hiện nhờ phương pháp rửa sạch bằng dung dịch kháng sinh Cefotaxime ñể diệt hết khuẩn. Sau khi rửa sạch các ñĩa lá tiến hành thấm khô chúng bằng giấy thấm vô trùng, sau ñó ñặt chúng lên môi trường tái sinh tạo cây hoàn chỉnh. * Bước 4: Nuôi cấy tái sinh ñĩa lá. Quá trình này ñược thực hiện trong ñiều kiện nhiệt ñộ, ánh sáng thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái của ñĩa lá. * Bước 5: Chọn lọc các cây mang gen chuyển vào. Quá trình này ñược thực hiện qua sự phát hiện các gen chỉ thị. Việc phát hiện các gen chuyển vào có thể ñược thực hiện thông qua việc phân tích ADN và ñánh giá biểu hiện của gen thông qua biotest. * Bước 6: Nhân dòng và ñánh giá sinh trưởng của cây chuyển gen. Quá trình này trước tiên ñược thực hiện trong ñiều kiện nuôi cấy nhân tạo (in vitro), sau ñó ñánh giá sự sinh trưởng của chúng ở ñiều kiện in vivo (vườn ươm), và cuối cùng là ñánh giá sự sinh trưởng phát triển của chúng trong ñiều kiện tự nhiên (ñồng ruộng). 2.4. TÌNH HÌNH PHÁT TRIỂN CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN 2.4.1. Những hướng chuyển gen chính ở thực vật * Trên thế giới, Hịên nay, các nhà khoa học trên thế giới ñang hướng tới tạo những cây chuyển gen thế hệ thứ 2 có ñặc ñiểm tăng giá trị dinh dưỡng hoặc có những tính trạng thích hợp cho công nghiệp chế biến. Những lợi ích này hướng trực tiếp vào người tiêu dùng như: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 24 - Lúa gạo giàu vitamin A và sắt - Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột - Vacxin ăn ñược ở ngô và khoai tây - Những giống ngô trồng ñược trong ñiều kiện nghèo dinh dưỡng - Dầu ăn có lợi cho sức khoẻ từ ñậu nành và cải dầu. Bên cạnh ñó, các thành tựu của biến nạp gen ở thực vật còn tập trung vào một số hướng khác nữa như: - Tạo giống cây trồng chịu chất diệt cỏ - Tạo giống cây trồng kháng bệnh virus - Tạo giống cây trồng kháng các loài gây hại - Tạo giống cây trồng chống chịu các bệnh nấm - Thay ñổi thành các axit béo - Làm chậm chín quả ở cà chua - ðiều chỉnh sinh tổng hợp tinh bột ñể làm chủ mức tinh bột trong sản phẩm. - Cải thiện chất lượng ñạm tích lũy trong hạt. - Tăng hàm lượng vitamin A trong hạt gạo. * Ở nước ta, một số phòng thí nghiệm lớn ñã và ñang ñi sâu vào công tác cải thiện giống cây trồng bằng kỹ thuật chuyển gen. Các nghiên cứu ñã ñược thực hiện ñó là: (1)- Thu thập và cất giữ các nguồn gen có giá trị như gen CryIA(b), CryIA(c), gen ức chế tryspin ñể trừ sâu, gen Xa21 chống bạc lá vi khuẩn, gen chịu lạnh, gen protein giàu tryptophan. (2)- Thiết kế các vector mang gen chuyển và thử nghiệm thành công các kỹ thuật chuyển gen: gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, trực tiếp bằng súng bắn gen. ðến nay, nhiều dòng lúa chuyển gen Xa21, CryIA(c), ñu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 25 ñủ chuyển gen chín chậm và kháng virus ñốm vòng ñã ñược tạo ra. Các dòng cây chuyển gen này sẽ ñược ñưa vào phân tích phân tử. (3)- Chuẩn bị thiết bị ñể tiến hành các kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ việc ñánh giá theo dõi cây chuyển gen như PCR, lai Southern, RFLP, AFPD. 2.4.2. Tình hình chung về phát triển cây trồng biến ñổi gen trên toàn cầu Năm 2006 trên thế giới ñã có 22 nước trồng cây trồng biến ñổi gen, bao gồm 11 nước ñang phát triển và 11 nước công nghiệp. Xếp theo thứ tự từ lớn ñến bé là Mỹ, Achentina, Braxin, Canada, Ấn ðộ, Trung Quốc, Paraguay, Nam Phi, Uruguay, Phillipine, Australia, Rumani, Mexico, Tâybannha, Colombia, Pháp, Iran, Honduras, Cộng hòa Czech, Bồ ðào Nha, ðức và Sloavakia. Mỹ, Achentina, Braxin, Canada, Trung Quốc, Ấn ðộ tiếp tục là những nước chính trên thế giới trồng cây biến ñổi gen. Mỹ vẫn giữ vị trí dẫn ñầu với diện tích trồng 54,6 triệu ha (chiếm 53% diện tích trồng cây biến ñổi gen trên toàn cầu), tiếp theo là Achentia với 18,0 triệu ha, Braxin trồng 11,5 triệu ha, Ấn ðộ trồng 3,8 triệu ha, Trung Quốc trồng 3,5 triệu ha. ðậu tương biến ñổi gen tiếp tục là loại cây trồng có diện tích gieo trồng lớn nhất với 54,4 triệu ha năm 2005 (chiếm 60% diện tích cây trồng biến ñổi gen trên toàn cầu) tăng lên 58,6 triệu ha năm 2006 (chiếm 57% diện tích cây trồng biến ñổi gen trên toàn cầu). Tiếp theo là cây cải bắp (25,2 triệu ha, chiếm 25%), cây bông (13,4 triệu ha, chiếm 13%), và cây cải dầu (4,8 triệu ha, chiếm 5%). Trong vòng 11 năm từ 1996 ñến 2006, tính trạng chịu ñược thuốc diệt cỏ liên tục là tính trạng nổi bật, chiếm ưu thế với 68% (69,9 triệu ha), tiếp ñến là tính trạng kháng sâu BT với 19% (19 triệu ha) và các gen xếp chồng mang cả 2 ñặc tính trên (13,1 triệu ha, chiếm 13%). Các giống chuyển gen xếp chồng là nhóm giống tăng trưởng nhanh nhất tới 30% giữa năm 2005 và Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 26 2006, còn các nhóm giống khác sự tăng trưởng chỉ ñạt 17% (nhóm kháng sâu) và 10% (nhóm kháng thuốc trừ cỏ). Theo ước tính của hãng phân tích thị trường Cropnosis, năm 2005, thị trường cây trồng biến ñổi gen trên toàn cầu trị giá khoảng 5,25 tỉ ñôla, chiếm 15% trong tổng giá trị thị trường cây trồng ñược bảo hộ trên toàn cầu trong năm 2005 (34,02 tỉ ñôla), và chiếm 18% trong tổng giá trị thị trường hạt giống toàn cầu (khoảng 30 tỉ ñôla). Trong số 5,25 tỉ ñôla trị giá thị trường cây trồng biến ñổi gen toàn cầu thì 2,42 tỉ ñôla từ ñậu tương biến ñổi gen (tương ñương 46% thị trường cây trồng biến ñổi gen trên toàn cầu), 1,9 tỉ ñôla từ ngô biến ñổi gen (chiếm 36%), 0,72 tỉ ñôla từ bông biến ñổi gen (chiếm 14%) và 0,21 tỉ ñôla từ cải dầu canola (chiếm 4%). Năm 2006, thị trường cây trồng biến ñổi gen trên toàn cầu tiếp tục phát triển, ñem lại lợi nhuận to lớn cho nông dân trồng cây chuyển gen (27 tỷ ñôla, trong ñó 13 tỷ ñôla ñối với các nước ñang phát triển và 14 tỷ ñôla ñối với các nước công nghiệp). Việc phát triển cây trồng chuyển gen ñã làm giảm ñáng kể tổng lượng thuốc trừ sâu từ năm 1996 - 2005 là 224.000 tấn hoạt chất, tương ñương với việc giảm 15% trong tác ñộng môi trường xung quanh của việc sử dụng thuốc trừ sâu ñối với các loại cây trồng nói trên [33]. 2.5. NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN TRÊN CÂY HOA LILY Năm 2002, Sakae Suzuki and Masaru Nakano [32] công bố kết quả nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn A.tumefaciens cho 3 giống cây thuộc họ Liliace là Lilium formosanum, Agapanthus praecox ssp. Orientalis và Muscarri armeniacum. Kết quả nghiên cứu ñã không thu ñược mô hoặc cây chuyển gen trên giống Lilium formosanum mặc dù có sự biểu hiện tạm của gen gus trong callus trong quá trình ñồng nuôi cấy. Tuy nhiên, ñã thu ñược một số cụm tế bào có khả năng kháng hygromycin của giống Agapanthus Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 27 praecox ssp. Orientalis và Muscarri armeniacum trên môi trường có bổ sung hygromycin. Callus kháng hygromycin ñã tái sinh tạo cây hoàn chỉnh qua phôi soma, hầu hết trong số chúng ñược xác ñịnh là cây chuyển gen dựa trên phép thử GUS histochemical assay và phân tích PCR. Bằng lai Southern ñã phát hiện ñược 1 – 5 copy của gen trong bộ gen của cây chuyển gen của 2 giống trong ñó hầu hết là có 1 hoặc 2 copy. Hệ thống chuyển gen vào Muscarri armeniacum và Agapanthus praecox ssp. Orientalis có thể là một công cụ ñể phát triển trong các nghiên cứu về sinh học phân tử. Năm 2004, các tác giả Byung Joon Ahn, Young Hee Joung, Kathryn K. Kamo [22] cũng ñã nghiên cứu chuyển gen bằng súng bắn gen cho huyền phù tế bào của hoa Easter lily, Lilium longiflorum và ñưa ra kết luận: Sử dụng hạt vàng cho sự biểu hiện của gen uidA cao hơn so với hạt ñạn bằng tungsten. Tiền xử lý dung dịch huyền phù tế bào trước 3 giờ bằng osmoticum (0,125M) cho hiệu quả biểu hiện của uidA tăng 1,5 lần. Sử dụng áp lực 1550psi, khoảng cách 6cm có kết quả tốt nhất so với các áp lực 1100, 1200, 1800 psi. Sự biểu hiện tạm của uidA xuất hiện ở 493 tế bào/ñĩa petri. ðể chuyển gen bền vững, huyền phù tế bào của Lilium longiflorum ñược bắn với plasmid bao gồm cucumber mosaic virus (CMV) replicase ñược ñiều khiển bởi Act1 promoter và gen bar ñược ñiều khiển bởi CaMV promoter. 10 cây tái sinh ñã ñược phân tích bởi PCR, 2 trong 10 cây ñã ñược khẳng ñịnh chuyển gen nhờ lai Southern. 2 cây chuyển gen ñược chuyển ñộc lập trong ñó có 1 cây mang gen bar một cây mang cả hai gen bao gồm CMV replicase và gen bar. Các cây này ñã ñược xác ñịnh là có khả năng kháng PPT ở nồng ñộ 1000mg/l ở giai ñoạn nở hoa chứng tỏ gen bar ñã ñược biểu hiện ở toàn bộ lá khi ñược ñiểu khiển bởi CaMV 35S promoter. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 28 Tiếp ñó, cũng năm 2004, các tác giả Y.Hoshi, M.Kondo, S.Mori, Y.Adachi, M.Nakano, H.Kobayashib [25] ñã nghiên cứu hệ thống tạo cây chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium cho cây Oriental hybrid lily Lilium Oriental hybrid “Acapulco” và ñã thu ñược 6 dòng lily kháng hygromixin (Hyg) từ hơn 200 callus bằng cách làm tổn thương callus với giấy ráp (sandpaper) trước khi ñồng nuôi cấy, callus ñược ñồng nuôi cấy trên môi trường MS không có NH4NO3, sử dụng hygromixin trong môi trường chọn lọc. Các dòng tái sinh kháng Hyg tạo chồi sau ñó phát triển thành cây khi chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất ñiều tiết sinh trưởng. Tất cả các cây ñược kết luận chuyển gen nhờ phân tích hoá học mô gen GUS (gen chỉ thị) và phân tích PCR ñảo. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu chuyển gen cho cây lily, ñặc biệt là bằng vi khuẩn A.tumefaciens chưa ñược ñề cập. Do ñó nghiên cứu phương pháp ñể xây dựng ñược quy trình chuyển gen vào hoa lily bằng vi khuẩn A.tumefaciens là hoàn toàn cần thiết. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 29 3. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - ðối tượng nghiên cứu là Giống Lilium Oriental hybrid “Siberia” hoa trắng, thơm - Vật liệu nghiên cứu là mô vẩy củ in vitro. - Vectơ sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen: là chủng vi khuẩn Agrobacteriumm tumefaciens dòng AA16 mang plasmid pBIN m- gfp5- ER. Hình 3.1. Giống Lilium Oriental hybrid “Siberia” Hình 3.2. Sơ ñồ Plasmid mang gen GFP Siberia Hình 3.1. Giống Lilium Oriental hybrid “Siberia” Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 30 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh tạo nguyên liệu chuyển gen 3.2.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ ñường saccaroza * Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của ñường saccaroza ñến khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng vẩy củ Siberria CTTN gồm: CT1: MS + 2% saccaroza (ñ/c) CT2: MS + 3% saccaroza CT3: MS + 4% saccaroza CT4: MS + 5% saccaroza 3.2.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của nhóm chất cytokinin * Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin ñến khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng vẩy củ Siberria CTTN gồm: CT1: MS + 3% saccaroza (ñc) CT2: MS + 1mg/l kinetin + 3% saccaroza CT3: MS + 2mg/l kinetin + 3% saccaroza CT4: MS + 3mg/l kinetin + 3% saccaroza CT5: MS + 4mg/l kinetin + 3% saccaroza * Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA ñến khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng vẩy củ Siberria . CTTN gồm: CT1: MS + 3% saccaroza (ñc) CT2: MS + 1mg/l BA + 3% saccaroza CT3: MS + 2mg/l BA + 3% saccaroza CT4: MS + 3mg/l BA + 3% saccaroza CT5: MS + 4mg/l BA + 3% saccaroza Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 31 3.2.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của nhóm chất auxin * Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA ñến khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng vẩy củ Siberria CTTN gồm: CT1: MS + 3% saccaroza (ñc) CT2: MS + 1mg/l IAA + 3% saccaroza CT3: MS + 2mg/l IAA + 3% saccaroza CT4: MS + 3mg/l IAA + 3% saccaroza CT5: MS + 4mg/l IAA + 3% saccaroza * Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA ñến khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng vẩy củ Siberria CTTN gồm: CT1: MS + 3% saccaroza (ñc) CT2: MS + 1mg/l αNAA + 3% saccaroza CT3: MS + 2mg/l αNAA + 3% saccaroza CT4: MS + 3mg/l αNAA + 3% saccaroza CT5: MS + 4mg/l αNAA + 3% saccaroza * Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D ñến khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng vẩy củ Siberria CTTN gồm: CT1: MS + 3% saccaroza (ñc) CT2: MS + 1mg/l 2,4D + 3% saccaroza CT3: MS + 2mg/l 2,4D + 3% saccaroza CT4: MS + 3mg/l 2,4D + 3% saccaroza CT5: MS + 4mg/l 2,4D + 3% saccaroza Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 32 3.2.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng * Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp kinetin + 2,4D ñến khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng vẩy củ Siberria . CTTN gồm: CT1: MS + 3% saccaroza (ñc) CT2: MS + 1mg/l 2,4D + 0,2mg/l kinetin + 3% saccaroza CT3: MS + 2mg/l 2,4D + 0,2mg/l kinetin + 3% saccaroza CT4: MS + 3mg/l 2,4D + 0,2mg/l kinetin + 3% saccaroza CT5: MS + 4mg/l 2,4D + 0,2mg/l kinetin + 3% saccaroza CT6: MS + 1mg/l 2,4D + 0,4mg/l kinetin + 3% saccaroza CT7: MS + 2mg/l 2,4D + 0,4mg/l kinetin + 3% saccaroza CT8: MS + ._.ệ mẫu sống sau ñồng nuôi cấy, vì thời gian ñồng nuôi cấy càng dài thì vi khuẩn phát triển càng mạnh trùm lên mẫu cẫy làm mẫu cấy chết nhiều. Qua thí nghiệm này chúng tôi nhận ñịnh rằng: Thời gian ñồng nuôi cấy thích hợp nhất cho việc chuyển gen vào lát cắt mỏng vẩy củ lily Siberia là 3ngày, với tỷ lệ mẫu sạch và sống sau ñông nuôi cấy là 100%, tỷ lệ mẫu mang gen GFP sau quá trình chuyển gen là 90%. Tiếp ñó là 5 ngày ñồng nuôi cấy cũng cho kết quả chuyển gen khá cao 83,3%. Như vậy, với kết quả thử nghiệm chuyển gen GFP (gen chỉ thị phát huỳng quang) cho mẫu lát cắt mỏng vẩy củ lily nêu trên, chúng ta có thể tin tưởng rằng việc chuyển gen mong muốn khác cho cây lily là có thể thực hiện ñược, chúng ta hoàn toàn có thể thành công trong việc chuyển gen cho cây lily nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0ngày 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày 10 ngày 15 ngày Công thức Tỷ lệ (% ) Hình 4.21. Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ mẫu mang gen GFP Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 73 Hình 4.22. Mẫu mang gen GFP (1 ngày ðNC) Hình 4.23. Mẫu mang gen GFP (3 ngày ðNC) Hình 4.24. Mẫu mang gen GFP (5 ngày ðNC) Hình 4.25. Mẫu mang gen GFP (7 ngày ðNC) Hình 4.26. Mẫu mang gen GFP (10 ngày ðNC) Hình 4.27. Mẫu ñối chứng (không mang gen GFP) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 74 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN 1. Trên môi trường MS không có chất ñiều tiết sinh trưởng thì nồng ñộ ñường saccaroza 30g/l là nồng ñộ tốt nhất cho sự phát sinh hình thái của mô vẩy củ, với tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái ñạt 95,0%, tỷ lệ mẫu tạo chồi ñạt 46,7% và tỷ lệ mẫu tạo callus ñạt 48,3%. 2. Trên môi trường bổ sung riêng rẽ chất cytokinin thì mẫu cấy chỉ phát sinh chồi và BA kích thích sự tạo chồi mạnh hơn kinetin ở cùng nồng ñộ, với môi trường có BA thì tỷ lệ tạo chồi ñạt cao nhất là 100% (4mg/l) và thấp nhất là 95% BA (1mg/l), còn với môi trường có kinetin thì tỷ lệ này cao nhất là 85% (3mg/l) và thấp nhất là 67,5% (4mg/l). 3. Trên môi trường bổ sung riêng rẽ chất auxin thì IAA kích thích mẫu cấy tạo chồi và rễ với tỷ lệ cao, còn αNAA và 2,4D kích thích tạo cả chồi, rễ và callus. Tác dụng của 2,4D ñến sự hình thành callus mạnh hơn αNAA, còn αNAA lại có tác ñộng tạo rễ mạnh hơn 2,4D. 4. Tổ hợp giữa 2,4D + BA có hiệu quả hơn tổ hợp giữa 2,4D+ kinetin khi kích thích tạo callus, chồi và rễ từ mẫu cấy. Tổ hợp 1mg/l 2,4D + 0,2mg/l BA là tổ hợp tốt nhất trong các tổ hợp 2,4D + BA ñã ñược thử nghiệm, với tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái là 89,6%, tỷ lệ mẫu tạo callus là 37,5%, tỷ lệ mẫu tạo chồi trực tiếp là 85,7% và tỷ lệ mẫu tao rễ là 83,5%. 5. Sự kết hợp của tổ hợp 1mg/l 2,4D + 0,2mg/l BA với môi trường có nồng ñộ saccaroza cao (90g/l) có tác dụng tốt cho việc tạo callus, với tỷ lệ mẫu tạo callus ñạt cao nhất 66,7%; 6. Nồng ñộ cefotaxime dùng ñể diệt khuẩn sau khi ñồng nuôi cấy là Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 75 600mg/l. Ở nồng ñộ này tỷ lệ mẫu sạch ñạt 100%, ñồng thời sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy vẫn ñược ñảm bảo. 7. Thời gian ñồng nuôi cấy giữa mô vẩy củ và vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dòng AA16 mang vectơ pBIN m- gfp5- ER phù hợp nhất cho sự chuyển gen là 3 ngày với tỷ lệ mẫu có biểu hiện tạm thời của gen GFP ñạt 90%. 5.2. ðỀ NGHỊ Dựa trên những kết quả ñạt ñược trong các nghiên cứu trên ñây, chúng tôi có một số ñề nghị sau: 1. Tiếp tục nghiên cứu hệ thống tái sinh cây hoa lily trên các giống khác. 2. Tiếp tục nghiên cứu ñánh giá sự có mặt của gen GFP ở các giai ñọan sau của mẫu tái sinh. 3. Tiếp tục nghiên cứu khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào ñối tượng mẫu là callus và chồi in vitro. 4. Có thể sử dụng phương pháp chuyển gen ñã ñề xuất cho việc chuyển các gen mong muốn khác cho cây hoa lily Siberia nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch (2006), ‘‘Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh cây hoa ñồng tiền và lily phục vụ tạo giống hoa mới bằng kỹ thuật chuyển gen’’, Báo cáo tổng kết ñề tài, Bộ Khoa học và Công nghệ. 2. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ Sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 3. Nguyễn Thị Hồng Châu, Nguyễn Phương Thảo, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (2003), “Chuyển gen t` qua Agrobacterium Tumefaciens vào giống lúa C71”, Tạp chí công nghệ sinh học, Tập 1, Số 2, trang 219 – 220. 4. ðặng Văn ðông, ðinh Thế Lộc (2004), Công nghệ mới trồng hoa cho thu nhập cao- Cây lily, NXB Lao ñộng – xã hội. 5. ðinh Ngọc Hạnh (2005), Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro trên cây lily phục vụ chuyển gen, Báo cáo tốt nghiệp, ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội. 6. Nguyễn Xuân Linh (1998), Hoa và kỹ thuật trồng hoa, Nhà xuất bản Nông nghiệp 7. Trần Duy Quý (1997), Các phương pháp mới trong chọn giống cây trồng, Nhà xuất bản Nông nghiệp. 8. Hoàng Thị Sản (1999), Phân loại thực vật, Nhà xuất bản Giáo dục. 9. ðinh Trường Sơn (2004), Nghiªn cøu x©y dùng hÖ thèng t¸i sinh in vitro trªn c©y khoai t©y phôc vô chuyÓn gen, Luận văn thạc sĩ Công nghệ Sinh học, Trường ðại học Bách khoa, Hà Nội. 10. Trần Thị Thanh (2000), Công nghệ vi sinh, NXB Giáo Dục, Hà Nội. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 77 11. Nguyễn Thị Phương Thảo (1998), Nghiên cứu nhân giống in vitro cây hoa loa kèn, Luận văn thạc sĩ Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội.. 12. Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn (2000), Giáo trình sinh lý thực vật, NXB Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội. 13. Nguyễn Quang Thạch (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Phương Thảo (2004), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội. 14. Dương ðức Tiến, Võ Văn Chi (1978), Phân loại thực vật, Nhà xuất bản ðại học và trung học chuyên nghiệp. 15. Nguyễn Thị Kiều Thu (2006), Nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào cây bông vải, Luận án thạc sĩ, Trường ðại học Cần Thơ. 16. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Phạm Minh Thợi, ðỗ Năng Vịnh (2003), Viện Di truyền nông nghiệp, ‘‘Nghiên Cứu xây dựng hệ thống tái sinh sử dụng cho biến nạp gen ở Ngô’’, Báo cáo khoa học, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2003 17. Mai Trường, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn ðức Minh Hùng, Lê Tấn ðức, Nguyễn Văn Uyển, Viện Sinh học nhiệt ñới, Trung tâm KHTN và CNQG (2003), ‘‘Nghiên cứu nuôi cấy tái sinh in vitro ở một số cây có giá trị kinh tế”, Báo cáo khoa học, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2003. 18. Nguyễn Văn Uyển (2000), Những phương pháp Công nghệ Sinh học Thực vật, Tập 1, NXB nông Nghiệp. 19. Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn ðức, Nguyễn Hữu Hổ (2003), Viện sinh học nhiệt ñới, ‘‘Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro cây Hông (Paulownia Fortunei) và ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc ñể tạo cây chuyển gen’’, Báo cáo khoa học, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2003. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 78 20. Viện Di Truyền Nông Nghiệp (2001), Kết quả nghiên cứu khoa học năm 1999-2000, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 21. Viện Di Truyền Nông Nghiệp (2003), Báo cáo kết quả thực hiện ñề tài năm 2000, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 22. Byung Joon Ahn, Young Hee Joung, Kathryn K. Kamo (2004), Transgenic Plants of Eastr lily (Lilium longiflorum) with Phosphinothricin, J.Plant Biotechnology , Vol. 6(1), pp.9-13. 23. .C. EADY (1995), Towords the transformation of onions (Allium cepa), New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, Vol.23, pp239-250. 24. O.l.Gamborg, G.C.Phillips (1997), Plant Cell, Tissue and Organ culture, Fundamental Methods cell spinger, Lab Manual. 25. Y.Hoshi, M.Kondo, S.Mori, Y.Adachi, M.Nakano, H.Kobayashi (2004), Production of transgenic lily plants by Agrobacterium-mediated 26. James F. Hutchinson, Daniel Isenegger, Savitri Nadesan, Neil Smith and Peter (2000), Waterhouse potato biotechnology - Achievements and Opportunities IHD at Potatoes, Linking research to practice. 27. V.Nagaraju, G.S.L.Srinivas và G.Lakshmi Sita (1998), Agrobacterium- mediiated genetic transformation in Gerbera hybrida, Current science, Vol.74, No.7,10 April 1998. 28. Teresa Orlikowska, Elzbieta Nowak, Agnieszka Marasek, Danuta Kucharska (1999), Effects of growth regulators and incubation period on in vitro regeneration of adventitious shoots from gerbera petiole, Plant Cell Tissue and Organ Culture Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 79 29. CIn-Har Park, Hee-Sung Park (2002), Lily pollen growth in vitro and Agrobacterium-mediated gus gen transformation via vacuum-infiltration, J.Plant Biotechnology , Vol. 4(4), pp.151-154. 30. Purnima Tyagi and S L Kothari (2004), Rapid in vitro regeneration of Gerbera jamesonii from different explants, Indian Journal of Biotechnology Vol 3, October 2004, pp 584-588. TÀI LIỆU INTERNET 31. http:/ www.google.com.vn/hoalily/ 32. Sakae SUZUKI and Masaru NAKANO (2002), Agrobacterium-Mediated transformation in Liliaceous ornamental plants, JARQ 36(3), pp.119-127, 33. Dương Hoa Xô (2006), Tình hình về cây trồng chuyển gen năm 2006 trên tòan thế giới, dịch ISAAA Brief, No.35, Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2006 by Clive James, Chair ISAAA Board, http:/ www.google.com.vn/cây trồng chuyển gen/ 34. http:/ www.google.com.vn/Actahor. org/ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 80 PHỤ LỤC 1 Thµnh phÇn m«i tr−êng MS (Murashige vµ Skoog, 1962) Thµnh phÇn Nång ®é cho 1 lÝt m«i tr−êng (mg/l) Nång ®é cho 1lÝt dung dÞch mÑ (mg/l) 1. Kho¸ng ®a l−îng 20X NH4NO3 1650 33000 KNO3 1900 38000 CaCl2.2H2O (pha riªng) 440 8800 MgSO4.7H2O 370 7 400 KH2PO4 170 3 400 2. Fe-EDTA 100X FeSO4.7H2O 27,85 2780 Na2-EDTA.2H2O 37,25 3725 3. Kho¸ng vi l−îng 100X MnSO4.4H2O 22,300 2230,0 ZnSO4.7H2O 8,600 860,0 H3PO4 6,200 620,0 KI 0,830 83,0 Na2MoO4.2H2O 0,250 25,0 CuSO4.7H2O 0,025 2,5 CoCl2.6 H2O 0,025 2,5 4. C¸c vitamin 100X Glycin 2,0 200 Acit nicotinic 0,5 50 Pyridoxin. HCl 0,5 50 Thiamin. HCl 1,0 100 5. Ionositol 100 mg/lÝt, pha riªng 6. Agar 6,5 g/l Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 81 PHỤ LỤC 2 Thµnh phÇn m«i tr−êng LB Lượng cho 1lít dung dịch • Cao nấm men 5g/l • Tripton 10g/l • NaCl 10g/l Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 82 PHỤ LỤC 3 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CALLUS FILE SACCARO 9/ 9/ 7 18:14 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 1 VARIATE V003 CALLUS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= 1 CT 3 271.342 90.4475 215.52 0.000 2 * RESIDUAL 8 3.35731 .419664 ---------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 274.700 24.9727 ---------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE SACCARO 9/ 9/ 7 18:14 ---------------------------------- LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= 1 CT 3 1701.78 567.260 885.77 0.000 2 * RESIDUAL 8 5.12329 .640412 ---------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 1706.90 155.173 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SACCARO 9/ 9/ 7 18:14 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 3 MEANS FOR EFFECT CT ---------------------------------------------------------------------- CT NOS CALLUS CHOI 1 3 36.7000 56.6000 2 3 48.3000 46.7000 3 3 46.7000 31.6000 4 3 40.0000 26.7000 SE(N= 3) 0.374016 0.462029 5%LSD 8DF 1.21963 1.50663 ---------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SACCARO 9/ 9/ 7 18:14 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 4 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CALLUS 12 42.925 4.9973 0.64781 1.5 0.0000 CHOI 12 40.400 12.457 0.80026 2.0 0.0000 ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE KI 11/ 9/ 7 18:40 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 1 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 83 anh huong cua nong do Kinetin toi su phat sinh hinh thai BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE NDIAA 10/ 9/ 7 20: 0 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 1 anh huong cua nong do IAA toi su phat sinh hinh thai VARIATE V003 CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= 1 CT 4 6524.68 1631.17 773.36 0.000 2 * RESIDUAL 10 21.0921 2.10921 ---------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 6545.77 467.555 ---------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NDIAA 10/ 9/ 7 20: 0 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 2 anh huong cua nong do IAA toi su phat sinh hinh thai MEANS FOR EFFECT CT ---------------------------------------------------------------------- CT NOS CHOI 1 3 46.7000 2 3 96.7000 3 3 98.3000 4 3 100.000 5 3 100.000 SE(N= 3) 0.838492 5%LSD 10DF 1.64212 ---------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NDIAA 10/ 9/ 7 20: 0 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 3 anh huong cua nong do IAA toi su phat sinh hinh thai F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CHOI 15 88.340 21.623 1.4523 2.0 0.0000 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 84 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CALLUS FILE NDNAA 9/ 9/ 7 18:42 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 1 anh huong cua nong do Naa toi su phat sinh hinh thai LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= 1 CT 4 3585.88 896.469 967.93 0.000 2 * RESIDUAL 10 9.26167 .926167 ---------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 3595.14 256.796 ---------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE NDNAA 9/ 9/ 7 18:42 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 2 VARIATE V004 CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= 1 CT 4 359.544 89.8860 66.22 0.000 2 * RESIDUAL 10 13.5735 1.35735 ---------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 373.118 26.6513 ---------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NDNAA 9/ 9/ 7 18:42 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 3 MEANS FOR EFFECT CT ---------------------------------------------------------------------- CT NOS CALLUS CHOI 1 3 48.3000 46.7000 2 3 13.3000 45.0000 3 3 10.0000 43.3000 4 3 10.0000 38.3000 5 3 6.70000 33.3000 SE(N= 3) 0.555628 0.672644 5%LSD 10DF 1.20080 1.11953 ---------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NDNAA 9/ 9/ 7 18:42 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 4 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CALLUS 15 17.660 16.025 0.96238 2.1 0.0000 CHOI 15 41.320 5.1625 1.1651 2.8 0.0000 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 85 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CALLUS FILE NONGDO 9/ 9/ 7 18:34 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 1 anh huong cua nong do 2.4d toi su phat sinh hinh thai VARIATE V003 CALLUS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ====================================================================== 1 CT 4 2535.08 633.771 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 10 3.65370 .365370 ---------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 2538.74 181.338 ---------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE NONGDO 9/ 9/ 7 18:34 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 2 anh huong cua nong do 2.4d toi su phat sinh hinh thai VARIATE V004 CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= 1 CT 4 4300.42 1075.10 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 10 4.27427 .427427 ---------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 4304.69 307.478 ---------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NONGDO 9/ 9/ 7 18:34 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 3 anh huong cua nong do 2.4d toi su phat sinh hinh thai MEANS FOR EFFECT CT ---------------------------------------------------------------------- CT NOS CALLUS CHOI 1 3 48.3000 46.7000 2 3 30.0000 36.7000 3 3 21.7000 8.30000 4 3 18.4000 8.30000 5 3 10.0000 6.70000 SE(N= 3) 0.348984 0.377460 5%LSD 10DF 1.09966 1.18939 ---------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NONGDO 9/ 9/ 7 18:34 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 4 anh huong cua nong do 2.4d toi su phat sinh hinh thai F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CALLUS 15 25.680 13.466 0.60446 2.4 0.0000 CHOI 15 21.340 17.535 0.65378 3.1 0.0000 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 86 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CALLUS FILE KI-24D 11/ 9/ 7 18:10 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 1 anh huong cua to hop kinetin + 2.4D den su phat sinh hinh thai VARIATE V003 CALLUS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= 1 CT 8 4620.51 577.563 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 18 1.58962 .883122E-01 ---------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 26 4622.10 177.773 ---------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE KI-24D 11/ 9/ 7 18:10 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 2 anh huong cua to hop kinetin + 2.4D den su phat sinh hinh thai VARIATE V004 CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= 1 CT 8 6213.89 776.736 345.28 0.000 2 * RESIDUAL 18 40.4931 2.24961 ---------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 26 6254.38 240.553 ---------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KI-24D 11/ 9/ 7 18:10 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 3 anh huong cua to hop kinetin + 2.4D den su phat sinh hinh thai MEANS FOR EFFECT CT ---------------------------------------------------------------------- CT NOS CALLUS CHOI 1 3 48.3000 46.7000 2 3 7.50000 85.0000 3 3 7.50000 82.5000 4 3 5.00000 72.5000 5 3 5.00000 52.5000 6 3 10.0000 52.5000 7 3 8.50000 72.5000 8 3 7.50000 66.6000 9 3 5.00000 40.0000 SE(N= 3) 0.171573 0.865951 5%LSD 18DF 0.509769 1.57287 ---------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KI-24D 11/ 9/ 7 18:10 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 4 anh huong cua to hop kinetin + 2.4D den su phat sinh hinh thai F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 27) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CALLUS 27 11.589 13.333 0.29717 2.6 0.0000 CHOI 27 63.422 15.510 1.4999 2.4 0.0000 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 87 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CALLUS FILE BA+24D 10/ 9/ 7 23:58 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 1 ANH HUONG CUA TO HOP BA + 2.4D TOI SU PHAT SINH HINH THAI VARIATE V003 CALLUS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= 1 CT 8 2877.91 359.738 606.81 0.000 2 * RESIDUAL 18 10.6711 .592837 ---------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 26 2888.58 111.099 ---------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE BA+24D 10/ 9/ 7 23:58 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 2 ANH HUONG CUA TO HOP BA + 2.4D TOI SU PHAT SINH HINH THAI VARIATE V004 CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= 1 CT 8 7247.01 905.876 498.16 0.000 2 * RESIDUAL 18 32.7322 1.81846 ---------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 26 7279.74 279.990 ---------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BA+24D 10/ 9/ 7 23:58 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 3 ANH HUONG CUA TO HOP BA + 2.4D TOI SU PHAT SINH HINH THAI MEANS FOR EFFECT CT ---------------------------------------------------------------------- CT NOS CALLUS CHOI 1 3 48.3000 46.7000 2 3 37.5000 85.7000 3 3 22.5000 58.5000 4 3 16.5000 54.0000 5 3 15.0000 38.4000 6 3 30.0000 85.5000 7 3 35.0000 80.0000 8 3 25.0000 57.5000 9 3 20.0000 52.5000 SE(N= 3) 0.444536 0.778558 5%LSD 18DF 1.32078 1.41321 ---------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BA+24D 10/ 9/ 7 23:58 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 ANH HUONG CUA TO HOP BA + 2.4D TOI SU PHAT SINH HINH THAI F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 27) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CALLUS 27 27.756 10.540 0.76996 2.8 0.0000 CHOI 27 62.089 16.733 1.3485 2.2 0.0000 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 88 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CALLUS FILE BA-24D-S 11/ 9/ 7 18:21 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 1 anh huong cua to hop BA+2.4D+sacaroza toi su phat sinh hinh thai VARIATE V003 CALLUS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= 1 CT 8 2171.17 271.396 145.43 0.000 2 * RESIDUAL 18 33.5914 1.86619 ---------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 26 2204.76 84.7984 ---------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE BA-24D-S 11/ 9/ 7 18:21 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 2 anh huong cua to hop BA+2.4D+sacaroza toi su phat sinh hinh thai VARIATE V004 CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= 1 CT 8 13899.7 1737.46 751.62 0.000 2 * RESIDUAL 18 41.6093 2.31163 ---------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 26 13941.3 536.204 ---------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BA-24D-S 11/ 9/ 7 18:21 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 3 anh huong cua to hop BA+2.4D+sacaroza toi su phat sinh hinh thai MEANS FOR EFFECT CT ----------------------------------------------------------------------- CT NOS CALLUS CHOI 1 3 33.3000 91.5000 2 3 37.5000 85.7000 3 3 39.5000 82.2000 4 3 41.5000 76.7000 5 3 45.6000 64.4000 6 3 47.2000 56.7000 7 3 47.8000 40.0000 8 3 66.7000 38.3000 9 3 42.7000 23.3000 SE(N= 3) 0.788710 0.877805 5%LSD 18DF 1.34337 1.60809 ---------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BA-24D-S 11/ 9/ 7 18:21 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 anh huong cua to hop BA+2.4D+sacaroza toi su phat sinh hinh thai F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 27) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CALLUS 27 44.644 9.2086 1.3661 3.1 0.0000 CHOI 27 62.089 23.156 1.5204 2.4 0.0000 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 89 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CALLUS FILE CEFOTA 11/ 9/ 7 18:36 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 1 anh huong cua Cefotaxime toi su phat sinh hinh thai LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= 1 CT 4 33.1560 8.28900 2.07 0.160 2 * RESIDUAL 10 40.0932 4.00932 ---------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 73.2492 5.23208 ---------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE CEFOTA 11/ 9/ 7 18:36 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 2 anh huong cua Cefotaxime toi su phat sinh hinh thai LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======================================================================= 1 CT 4 95363.7 23840.9 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 10 53.0504 5.30504 ---------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 95416.7 6815.48 ---------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CEFOTA 11/ 9/ 7 18:36 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 3 MEANS FOR EFFECT CT ---------------------------------------------------------------------- CT NOS CALLUS CHOI 1 3 64.4000 24.4000 2 3 66.0000 220.000 3 3 65.3000 20.4000 4 3 63.3000 19.4000 5 3 61.8000 18.7000 SE(N= 3) 1.15604 1.32979 5%LSD 10DF 0.64274 1.19022 ---------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CEFOTA 11/ 9/ 7 18:36 ------------------------------------------------------------------ : PAGE 4 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CALLUS 15 64.160 2.2874 2.0023 2.1 0.1599 CHOI 15 60.580 82.556 2.3033 2.8 0.0000 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- iii ._.