Nghiên cứu và thu nhận enzym protease từ các chủng nấm sợi ở rừng ngập mặn Cần Giờ

còn có vai trò rất lớn trong công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, kĩ thuật phân tích, công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Do có khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực mà ngành công nghiệp enzyme đã đem lại lợi nhuận to lớn cho nhiều nước. Ở Việt Nam, ngành công nghệ enzyme vẫn chưa thật sự phát triển. Mỗi năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn các enzyme để ứng dụng vào sản xuất công, nông nghiệp, giải quyết ô nhiễm MT… Trong các loại enzyme, protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất. Năm 1995, tổng doanh thu từ enzyme này ở các nước châu Âu lên đến 187,2 triệu USD, cao nhất trong các loại enzyme. Protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, nông nghiệp…Nguồn protease chủ yếu hiện nay thu được từ VSV, đặc biệt là các chủng NS thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces, Mucor. Việc nghiên cứu và phân lập các chủng NS trong tự nhiên để thu nguồn protease mới có giá trị là vấn đề đang được khoa học quan tâm nghiên cứu. Để thu được nguồn protease mới có giá trị cần phải phân lập các chủng mới có trong tự nhiên. Một trong những hướng nghiên cứu mà khoa học đang quan tâm là tìm các chủng VSV mới có đặc tính ưu việt từ RNM. Chính điều kiện sống khắc nghiệt ở RNM tạo ra nhiều cơ hội tìm thấy các nguồn gen VSV quí hiếm, trong đó có NS sinh protease. Ở nước ta, RNM Cần Giờ là nơi HST phong phú, đa dạng. Tuy nhiên, những nghiên cứu về đa dạng sinh thái của RNM Cần Giờ chủ yếu tiến hành ở hệ động thực vật. VSV, trong đó NS là một đối tượng được phân bố rộng rãi và có giá trị kinh tế chỉ mới được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây. NS ở RNM Cần Giờ có nhiều đặc tính quí báu như khả năng chịu đựng được điều kiện sống khắc nghiệt, khả năng sinh nhiều enzyme ngoại bào, trong đó có protease. Do RNM Cần Giờ có thảm TV dày đặc, xác động thực vật bị phân hủy tạo thành nguồn cơ chất cho các chủng NS sinh các enzyme ngoại bào. Cho đến hiện nay, các công trình nghiên cứu về NS ở RNM Cần Giờ vẫn còn thưa thớt, trong đó vẫn chưa có công trình nghiên cứu về khả năng sinh protease của các chủng NS. Chính vì những lí do trên mà tôi chọn đề tài “Nghiên cứu và thu nhận enzyme protease từ các chủng NS ở RNM Cần Giờ”. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: các chủng NS phân lập tại 5 xã Long Hòa, Lí Nhơn, Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Bình Khánh ở RNM Cần Giờ. Địa điểm nghiên cứu: PTN Vi sinh-Trường Đại học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh. Mục tiêu của đề tài: Tìm ra một số chủng NS có khả năng sinh protease mạnh từ RNM Cần Giờ và nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu nhận protease. Nhiệm vụ của đề tài:  Phân lập các chủng NS từ RNM Cần Giờ.  Tuyển chọn các chủng NS có khả năng sinh protease cao.  Nghiên cứu đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh học của các chủng NS tuyển chọn.  Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện MT đến ST và hoạt độ protease của các chủng NS được tuyển chọn, từ đó tìm ra MT tối ưu để nuôi cấy NS thu protease.  Thu nhận các chế phẩm enzyme bán tinh khiết. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. RNM Cần Giờ. 1.1.1. Đặc điểm của RNM Cần Giờ. 1.1.1.1. Vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên. Về vị trí địa lý: RNM Cần Giờ có tọa độ 10°22’ – 10°40’ vĩ độ Bắc và 106°46’ – 107°01’ kinh độ Đông. Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha và vùng chuyển tiếp 29.880 ha [43]. Hình 1.1. RNM Cần Giờ [43] Nằm cách trung tâm thành phố Hồ Chí Minh khoảng 70km, RNM Cần Giờ giáp tỉnh Đồng Nai ở phía Bắc, giáp biển Đông ở phía Nam, giáp tỉnh Tiền Giang và Long An ở phía Tây, giáp tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu ở phía Đông [43]. RNM Cần Giờ phát triển trên một nền đất đầm mặn mới, do phù sa sông mang đến và lắng đọng tạo thành nền đất. Đất được tạo ra bởi tổng hợp các quá trình lắng tụ trầm tích đất sét, phèn hóa và nhiễm mặn. Cho đến nay các lớp đất sâu chưa kết chặt nên không có khả năng tạo thành đất nền rắn chắc, hàm lượng lưu huỳnh dạng khử khá cao với một lượng muối cao không có lợi cho nông nghiệp[17]. Địa hình: huyện Cần Giờ có địa hình thấp trũng, không bằng phẳng, phân cắt bởi mạng lưới sông ngòi uốn khúc. Nhìn chung, địa hình huyện Cần Giờ có 6 dạng: dạng cao 2- 10 m, dạng chỉ ngập vào những tháng có nước lớn (tháng 11, 12) trong năm và 4 dạng còn lại đều ngập triều ở các mức độ khác nhau [9]. Cần Giờ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới xích đạo, hướng gió chính là Tây Nam, mùa mưa bắt đầu muộn và kết thúc sớm hơn so với các địa phương khác trong vùng (từ tháng 5 đến tháng 10), mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau [30]. Nhiệt độ trung bình khoảng 250C - 290C, nhiệt độ thấp nhất là 18,8oC, cao nhất là 35oC. Biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5-7oC [30]. Độ ẩm trung bình từ 73% đến 85%. Lượng mưa trung bình hàng năm từ 1.000 – 1.402 mm [66]. Độ mặn dao động từ 1,8%-3% [2]. Độ mặn cũng thay đổi tùy theo mùa. Vào mùa khô có độ mặn cao hơn vào mùa mưa. Độ mặn có ảnh hưởng rất lớn đến sự phân bố khu hệ SV ở RNM nói chung và NS nói riêng. Chế độ thủy triều: Cần Giờ chịu tác động của chế độ bán nhật triều không đều của biển Đông. Mỗi tháng có khoảng 2 ngày nhật triều không đều xuất hiện 2-3 ngày trước, giữa và cuối tháng âm lịch. Biên độ triều tương đối lớn từ 3- 4m. Thời gian có biên độ triều lớn từ tháng 6- 8. Mực nước trung bình cao nhất thường xuất hiện vào tháng 10, 11 và thấp nhất vào tháng 6, 7 [9]. Đất đai: toàn bộ huyện Cần Giờ thuộc loại đất phèn mặn gồm hai loại: đất phèn mặn theo mùa và đất phèn mặn thường xuyên. Đất phèn mặn theo mùa nằm ở phía Bắc huyện Cần Giờ. Đất thịt, giàu mùn, chứa nhiều xác hữu cơ dưới môi truờng yếm khí, chất dinh dưỡng khá, phản ứng của đất từ chua đến rất chua, pH ở độ sâu của tầng sinh phèn xuống tới 2,4-2,7. Tuy nhiên vào mùa lũ, mặn được đẩy ra xa, nước được pha loãng trong thời gian dài 4-5 tháng. Đất phèn mặn thường xuyên chiếm phần lớn diện tích Cần Giờ. Đất thịt trung bình, nhiều mùn nhão lẫn xác hữu cơ bán phân giải, bị ngập triều thường ngày, giàu dinh dưỡng, độ pH từ 5,8-6,5 [66]. 1.1.1.2. Khu hệ SV ở RNM Cần Giờ. RNM Cần Giờ là HST trung gian giữa HST thủy vực với HST trên cạn, HST nước ngọt và HST nước mặn. Rừng Cần Giờ nhận một lượng lớn phù sa từ sông Đồng Nai, cùng với ảnh hưởng của biển kế cận và các đợt thủy triều nhờ đó hệ TV nơi đây rất phong phú với trên 150 loài và trở thành nguồn cung cấp thức ăn, nơi trú ngụ cho rất nhiều loài thủy sinh, cá cùng với các ĐV có xương sống khác. Hệ ĐV cũng rất đa dạng gồm khu hệ chim có khoảng 120 loài, ĐV thủy sinh không xương sống với trên 700 loài, khu hệ cá trên 130 loài, khu hệ ĐV có xương sống có 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài có vú [44]. Chính hệ động thực vật đa dạng ở RNM Cần Giờ trở thành nguồn thức ăn phong phú cho các VSV bao gồm nấm men, NS, VK và xạ khuẩn. Nhờ vào khả năng tiết ra các enzyme ngoại bào như amylase, protease, kitinase, cellulase,…chúng phân hủy tinh bột protein, kitin,…. có trong xác động thực vật và giáp xác làm nguồn thức ăn. Và bản thân xác động thực vật bị phân hủy trở thành nguồn mùn là lượng thức ăn dồi dào cho hệ TV và các SV phù du. Trung tâm MERD đã nghiên cứu khu hệ VSV ở RNM thuộc các tỉnh Nam Định và Thái Bình (2001). Kết quả phân lập được 69 chủng nấm men, 55 chủng xạ khuẩn. Nhiều chủng có hoạt tính enzyme ngoại bào cao, có khả năng sinh KS và phân giải dầu mạnh [13]. Riêng ở RNM Cần Giờ chưa có nhiều công trình nghiên cứu về nấm men và xạ khuẩn. Qua phân tích các mẫu đất ở RNM Cần Giờ, các nhà khoa học đã phát hiện có vi khuẩn Bacillus thuringiensis sinh nhiều tinh thể hình cầu có tác dụng tiêu diệt ấu trùng muỗi rất cao. Kết quả thí nghiệm của nhóm nghiên cứu Mai Thị Hằng và Trần Thị Mỹ Hạnh cho thấy các chủng VSV này có khả năng diệt các loại ấu trùng muỗi từ 60-100% sau 36 giờ, có chủng diệt được 100% ấu trùng muỗi sốt rét Anopheles minimus, muỗi gây sốt xuất huyết Aedes aegypti và muỗi Culex quinquefasciatus gây bệnh chân voi [61]. NS ở RNM chiếm số lượng lớn, rất phong phú và đa dạng. Khi lá còn ở trên cây đã có một số loài nấm sống trên đó, một số chui sâu vào biểu bì, một số sống trên mặt lá. Khi lá rụng xuống, sau 24 giờ ngập nước triều đầu tiên, lá đã bị các VSV phân hủy, lúc đầu là chi Phytophora thuộc lớp Nấm tảo, rồi đến Fusarium và Penicillium thuộc lớp Nấm bất toàn. Sau tuần thứ 2 và thứ 3, các nấm tảo nhường chỗ cho các loài VSV khác. Tất cả các mô xốp được phân huỷ nhanh nhất, còn các hợp chất cellulose và lignin bị phân hủy cuối cùng. Trong quá trình phân hủy, lượng đạm trên các mẩu lá tăng 2 – 3 lần so với ban đầu (Kaushik và Hynes, 1971). Khi phân tích, so sánh các loại acid amin có trong lá tươi và lá phân huỷ, Casagrade (1970) đã thấy sự tăng tổng số các acid amin trên bề mặt lá và trong thành phần lá phân hủy cao hơn hẳn lá tươi. Một số acid amin như α – aminobyturic, α, γ diaminnobutyric và α, ε diamino pimonic cùng các loại acid citruline, ortrithine, cystein là các sản phẩm được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của VSV [51]. Các nghiên cứu VSV trong RNM ven biển đồng bằng sông Hồng và Cần Giờ (2001-2003) đã chứng minh được một điều: ở các hệ sinh thái RNM này có tới 83/199 chủng nấm có khả năng phân giải dầu mỏ ở các mức độ khác nhau. Nghiên cứu về RNM ở Nam Định và Thái Bình của trung tâm MERD cũng phân lập được 605 chủng NS [13]. Ở RNM Cần Giờ, tác giả Khưu Phương Yến Anh đã phân lập được 312 chủng NS, trong đó bao gồm các loài nấm thuộc các chi Penicillum, Aspergilus, Mucor, Tricoderma (2007) [1]. Tác giả Võ Thị Bích Viên đã phân lập được 476 chủng NS trong đó có 266 chủng thuộc chi Aspergillus và Penicillium (2009) [32]. 1.1.2. Vai trò của RNM Cần Giờ. RNM Cần Giờ được mệnh danh là "lá phổi xanh" của TP.HCM với vai trò quan trọng trong điều hòa khí hậu. Nhờ những đặc trưng riêng như tầng tán dày, hệ thống rễ chằng chịt... RNM được đánh giá là một “bức tường xanh” vững chắc chống gió bão, sóng thần, xói lở, làm sạch MT ven biển, hạn chế xâm nhập mặn, bảo vệ nước ngầm, tích lũy cacbon, giảm khí CO2,... [51]. RNM có vai trò trong vấn đề giảm ô nhiễm từ chất thải rắn. Trong những năm qua, Trung tâm nghiên cứu hệ sinh thái RNM đã phát hiện nhiều VSV có khả năng phân giải các chất thải khó phân hủy có trong nước, làm sạch nước và biến thành thức ăn cho tôm cá. Nhờ đó phát hiện thêm khả năng ngăn ngừa ô nhiễm môi trường của RNM. Khi có rừng, dưới tán rừng nhiệt độ thấp, lá cây rụng tạo thành mùn, vi sinh vật hoạt động rất tốt, quá trình phân giải chất hữu cơ diễn ra hiệu quả. Nhưng khi rừng mất đi thì ánh nắng chiếu thẳng vào, nhiệt độ sẽ tăng cao và thiếu nước vào mùa khô, làm cho đất phèn tiềm tàng trước được ém sẽ hoạt động trở lại, làm cho đất chua, nhiều acid [53]. Bên cạnh đó, những chất thải rắn trong sinh hoạt, y tế, công nghiệp, nông nghiệp cùng với các hóa chất dư thừa từ nội địa theo sông ra RNM được giữ lại và nhờ VSV phân hủy, biến chúng thành thức ăn cho hệ SV ở đây và làm trong sạch nước biển [51]. RNM Cần Giờ có vai trò nhất định đối với nền kinh tế. Theo Giáo sư Phan Nguyên Hồng, hiện nay người dân Việt Nam mới chỉ biết tận dụng một phần rất nhỏ lợi ích từ RNM mang lại. Nếu biết cách khai thác hợp lý đi đôi với bảo vệ rừng, đây quả thực là một nguồn tài nguyên không phải quốc gia nào cũng có được [54]. 1.2. Đặc điểm của NS sinh protease. 1.2.1. Đặc điểm hình thái. NS là VSV nhân thực, tế bào không có diệp lục tố, sống dị dưỡng, vách tế bào cấu tạo chủ yếu là kitin, có hay không có cellulose và một số thành phần khác có hàm lượng thấp [55]. Sợi nấm có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào). Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 3- 5µm, có khi đến 10µm thậm chí đến 1mm. Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục cm. Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn. Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm khí sinh xù xì như bông. Trên MT đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là KL nấm [55]. Hình 1.2. Sợi nấm có vách ngăn [55] Hình 1.3. Sợi nấm không có vách ngăn [55] Hệ sợi của NS một số ăn sâu vào cơ chất gọi là khuẩn ty cơ chất hay khuẩn ty dinh dưỡng, một số mọc ra ngoài bề mặt cơ chất gọi là khuẩn ty khí sinh. Những khuẩn ty khí sinh là những lông tơ màu trắng, mọc thành lớp sợi mềm và dần dần sẽ có một số sợi phát triển thành cơ quan sinh sản đặc biệt mang bào tử. Màu sắc bào tử sẽ đặc trưng cho màu sắc NS khi già [23]. 1.2.2. Cấu tạo của tế bào NS  Thành tế bào NS Thành tế bào NS có cấu tạo bản mỏng và cấu tạo sợi [7]. Thành tế bào NS dày khoảng 2 μm, nhưng rất chắc chắn [7]. Thành sợi nấm gồm nhiều bản mỏng chồng chất lên nhau nhờ đó mà vững và chịu được sức ép các chất lỏng và rắn ở bên trong mà không bị rách hay nứt vỡ [7]. Mỗi bản mỏng gồm có phần nền không có cấu tạo đặc biệt, trên phần nền có các sợi nhỏ xếp sát vào nhau và song song nhau. Điều đặc biệt là các sợi ở một bản mỏng song song với nhau nhưng các sợi trên hai bản mỏng liên tiếp lại xếp chéo nhau, do đó làm cho vách sợi nấm rất mỏng nhưng rất vững chắc [7]. Về thành phần hóa học, các hợp chất hóa học có chủ yếu ở vách sợi nấm cũng là những phân tử có dạng sợi. Thảnh phần quan trọng ở vách sợi nấm là kitin. Một hợp chất gluxit khác cũng phổ biến ở nhiều NS là glucan. Có thể coi kitin và glucan là khung của vách sợi nấm [7]. Vách sợi nấm không những che chở và bảo vệ, mà còn đảm đương một loạt các chức năng khác: nhận thức ăn, chế biến thức ăn, thải chất bã, trao đổi khí,…. Để hoàn thành nhiệm vụ đó, ngoài kitin, glucan, còn có hàng rào lipit, protit và một loạt các enzyme. Ngay trong vách sợi nấm còn có các sản phẩm trao đổi chất khác nhau của sợi nấm, các chất thải như acid oxalit, acid xitric, các chất độc hại đối với các VSV khác ở xung quanh như các KS, các độc tố. Mặt ngoài của vách sợi vi nấm còn có phủ chất dính, chất dính này sẵn sàng dính chặt vào những con amip, những con giun tròn bé tẹo, sau đó các vi nấm này ăn thịt con mồi bằng cách mọc ra các sợi nấm đặc biệt xuyên qua vỏ con mồi và hút dần các chất dinh dưỡng trong con mồi [7].  Màng nguyên sinh, chất nguyên sinh. Chất nguyên sinh là một dung dịch keo, thường trong suốt không màu, luôn chuyển động từ phần sợi nấm già đến phần non, hoặc từ sợi nấm sinh dưỡng đến các sợi nấm phân hóa làm nhiệm vụ sinh sản [6]. Chất nguyên sinh được bao bọc bởi màng nguyên sinh. Màng dày trung bình 7.10-3 μm, cấu tạo chủ yếu bởi các phân tử lipit và protein. Thành phần lipit có thể chiếm tới 40% và protein chiếm 38% trọng lượng khô của màng [6].  Các bào quan. Mạng lưới nội chất. Có dạng bọng đài nối liền với màng nhân của tế bào. Người ta cũng tìm thấy mạng nội sinh chất có dạng bản mỏng đồng tâm dính vào màng chất nguyên sinh hay tự do trong chất nguyên sinh hoặc dính vào bộ máy Golgi [7]. Bộ máy Golgi Bộ máy Golgi có dạng một cái túi nhỏ gấp nếp với các bọng nhỏ hình cầu ở xung quang thành túi. Kiểu cấu tạo bộ máy Golgi này giống như ở các TV bậc cao[7]. Ty thể Ty thể của tế bào vi nấm tương tự như ty thể của TV và ĐV. Tuy nhiên, số lượng ty thể ở nấm ít hơn, ty thể dẹt hơn và gồ ghề hơn ở TV [7]. Không bào và các thể ẩn nhập. Không bào thường có hình cầu, hình trứng. Ở ngọn các sợi nấm hầu như không có không bào, càng xa phần ngọn, số lượng không bào càng giảm nhưng kích thước càng lớn, ép chặt chất nguyên sinh và nhân tế bào vào sát thành tế bào. Dịch không bào thay đổi tùy theo tuổi và trạng thái sinh lý của tế bào. Dịch không bào chứa các chất điện giải hòa tan: Na, K…một số chất hữu cơ ở trạng thái hòa tan hoặc trạng thái keo (protein, glucid,….), các sắc tố và một số vật thể ẩn nhập [7]. Nhân tế bào NS Nhân tế bào NS nói chung có kích thước rất nhỏ, phần lớn có đường kính 2-3 μm, hình cầu hoặc hình trứng [6]. Số lượng nhân trong tế bào không ổn định. Ở các sợi nấm ngăn vách số lượng nhân ở mỗi đoạn sợi nấm giữa 2 vách ngăn có thể là 1,2 hoặc nhiều hơn. Số lượng nhân ở mỗi tế bào còn thay đổi tùy điều kiện sống [7]. Nhân của tế bào NS là nhân thực. Nhân có vai trò chủ yếu là mang thông tin di truyền chứa trong ADN, điều khiển tổng hợp các protein đặc trưng ở mỗi loài, điều khiển tổng hợp enzyme, các hoạt động của enzyme và nhiều hoạt động khác của tế bào [7]. 1.2.3. Các hình thức sinh sản. NS sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính.  Sinh sản vô tính Hình thức sinh sản vô tính đơn giản nhất là bằng mẩu sợi: một đoạn sợi nấm rơi vào cơ chất mới gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành hệ sợi nấm mới [23]. Ngoài sinh sản vô tính bằng mẩu sợi, NS còn sinh sản bằng bào tử (bào tử kín, bào tử trần). Đây là hình thức sinh sản vô tính phổ biến ở NS [23]. Có hai dạng bào tử vô tính là bào tử kín và bào tử trần [23].  Sinh sản hữu tính Sinh sản hữu tính xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái có trải qua giai đoạn giảm phân. Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai đoạn: • Tiếp hợp tế bào chất với sự hòa hợp 2 tế bào trần của 2 giao tử. • Tiếp hợp nhân với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao tử để tạo một nhân nhị bội. • Giảm phân: giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội qua sự giảm phân từ 2n NST (nhị bội) thành n NST (đơn bội) [55]. 1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến ST và hoạt độ protease của NS. 1.2.4.1. Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến nồng độ các chất hòa tan trong MT nuôi cấy, MT lên men và hoạt động xúc tác các phản ứng sinh hóa trong mỗi tế bào VSV, các phản ứng này chỉ xảy ra ở nhiệt độ nhất định [18]. Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển của NS là từ 2oC đến 5oC, tối ưu từ 22oC đến 27oC và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35oC đến 40oC, cá biệt có một số loài có thể sống sót ở 0oC và ở 60oC [55]. Để thu protease từ NS, nhiệt độ nuôi cấy được giữ ở 29-31oC trong khoảng thời gian 10-18 giờ, sau đó giảm nhiệt độ xuống 24 -25oC [21]. Với nhiệt độ trung bình là 25,8 oC, RNM Cần Giờ có điều kiện nhiệt độ thuận lợi cho sự phát triển của NS. 1.2.4.2. Độ ẩm. Hình 1.4. Bào tử kín [57] Hình 1.5. Bào tử trần Hình 1.6. Quá trình tiếp hợp [57] Mỗi loài NS thích ứng với một khoảng độ ẩm tương đối [6]. Độ ẩm tối ưu để nuôi cấy NS là 50-60%, nếu độ ẩm < 60%, hoạt tính enzyme sẽ giảm [6]. Độ ẩm môi trường cần duy trì trong quá trình sản xuất. Độ ẩm cao làm giảm độ thoáng khí của MT, độ ẩm thấp kìm hãm sự phát triển và sự tạo enzyme của VSV [19], [23]. Trong sản xuất protease, độ ẩm của MT nuôi cấy được duy trì khoảng 50-55% [21]. 1.2.4.3. pH pH ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và khả năng hoạt hóa của VSV, mỗi loài VSV chỉ thích hợp ở một khoảng pH nhất định [20]. Nói chung, NS có thể phát triển tốt ở MT acid (pH=6) nhưng pH tối ưu là 5 - 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH 9 (Ingold, 1967) [57]. pH của MT có ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa các protease được tổng hợp. Nếu giữ pH luôn có giá trị xác định trong suốt quá trình nuôi cấy, VSV sẽ tạo thành mạnh mẽ một dạng protease xác định chiếm ưu thế trong MT. pH của nước biển ở RNM Cần Giờ vào thời điểm thu mẫu là 7,02. pH đất trung bình 5,8-6,5. Ở tầng mặt, do ảnh hưởng của nước biển, pH có thể cao hơn giá trị trung bình. Nhìn chung pH ở đây thuận lợi cho sự phát triển của NS. 1.2.4.4. Nguồn dinh dưỡng NS không có diệp lục tố nên chúng cần được cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong cơ thể ĐV hay TV) hay hoại sinh trên xác bã hữu cơ. Cũng có một số nhóm nấm rễ hay địa y sống cộng sinh với nhóm TV nhất định [55]. Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca. Nếu các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản thì sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme ngoại bào thích hợp để cắt các đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vào trong tế bào [55]. +Ảnh hưởng của nguồn C. Nguồn C có vai trò quan trọng đối với VSV và là cơ chất cần thiết cho quá trình trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp [18]. NS có khả năng đồng hóa nhiều nguồn C khác nhau: các hidrat cacbon, các acid hữu cơ, lipit…Nhiều loại NS còn có khả năng đồng hóa các chất hữu cơ rất bền hoặc chất độc đối với nhiều SV khác [6]. Các loài NS thường không có những đòi hỏi nghiêm ngặt về các loại thức ăn cacbon. Tuy nhiên, có thể là loại hợp chất này đồng hóa tốt hơn loại hợp chất khác. Nhiều loài NS thuộc bộ Mucorales chỉ đồng hóa được sacarose sau khi đã thủy phân nó thành glucose. Trong khi đó, Chaethocladium hesseltinum lại có thể đồng hóa trực tiếp sacarose mà không cần thủy phân trước [6]. Nguồn C tự nhiên thường được dùng trong nuôi cấy NS là bột mì, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng. Nồng độ gluxit thích hợp cho quá trình tổng hợp protease cũng thay đổi tùy loài VSV. Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn C thích hợp đối với NS sinh protease có hoạt lực cao [64]. Các nguồn C có tác dụng đến sự tổng hợp protease của NS có thể theo thứ tự: Đối với A. flavus: fructose→ glucose→ sacarose→ ramnose→ manose→ galactose→ arabinora→ lactose. Đối với A. awamori: fructose→ manit→ sacarose→ arabinose→ manose→ galactose→ lactose. Đối với A. oryzae: fructose→ sacarose→ maltose→ glucose→ manit→ arabinose→ galactose. Thảm thực vật dày đặc là nguồn cacbon chủ yếu cho khu hệ NS ở RNM Cần Giờ. Theo Snedaker (1978), lượng lá rơi của cây RNM ở nam Florida là 10.000 – 14.000 kg khô/ha/năm. Kết quả nghiên cứu ở rừng đước Cà Mau cho thấy lượng rơi là 9.719,9 kg/ha/năm, riêng lá chiếm 79,71%. Hàng năm rừng đước Cà Mau cung cấp cho hệ sinh thái RNM ở đây 8.400 – 12.000 kg lá/ha/năm (tính theo trọng lượng khô) (Trí, Hồng, 1984) [13]. +Ảnh hưởng của nguồn N. Nguồn N ảnh hưởng rất lớn đến quá trình ST và ảnh hưởng đặc biệt đến quá trình sinh protease vì nguồn N đóng vai trò là chất cảm ứng của enzyme này. NS có thể sử dụng cả nguồn N vô cơ và hữu cơ. Các nguồn N hữu cơ thường dùng là pepton, casein, bột đậu nành, cao nấm men…Trong các nguyên liệu này đều có chứa acid amin tự do. Các acid amin làm tăng hoặc giảm quá trình tổng hợp protease như cystein kìm hãm khả năng sinh protease acid của Aspergillus. Khi sử dụng phối hợp nguồn N vô cơ và hữu cơ làm tăng đáng kể quá trình tổng hợp protease [27]. Đối với một số loài NS như A. oryzae, A. awamori, A. niger, A. flavus trên MT có các nguồn N hữu cơ hoạt độ protease acid cao. Trên môi trường Czapek (trong đó NaNO3 được thay bằng casein) thì hoạt lực protease của NS được tăng lên 3,5 lần. Khi thay tinh bột bằng glucose và bổ sung pepton hoạt lực enzyme tăng 6 lần. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt độ enzyme được nâng cao khi trong MT có đồng thời cả nguồn N hữu cơ và N vô cơ. Cho thêm vào MT có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo các nguồn N vô cơ và hữu cơ thì hoạt lực protease tăng 22- 74%. Còn trường hợp dùng các nguồn N vô cơ duy nhất trong MT sẽ dẫn đến ngừng hoạt độ protease nói chung [64]. Các acid amin có ảnh hưởng rõ rệt tới hoạt độ enzyme của VSV. Glyxin, alanin, metionin và lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của chủng đột biến A. oryzae 251- 90 từ 6- 9% và nguyên chủng A. oryzae 132- 63 tới 7- 24%. Nhiều acid amin có tác dụng ức chế hoạt độ enzyme như acid glutamic, izolơxin và valin ức chế tổng hợp enzyme ở B. megaterium tới 60% [62]. RNM Cần Giờ có nguồn N dồi dào từ các xác động thực vật bị phân hủy. Tất cả các mô xốp được phân huỷ nhanh nhất, còn các hợp chất cellulose và lignin bị phân huỷ cuối cùng. Trong quá trình phân huỷ, lượng đạm trên các mẩu lá tăng 2 – 3 lần so với ban đầu (Kaushik và Hynes, 1971). Năm 1977, Untawale ở Viện Hải dương học Ấn Độ đã nghiên cứu sự biến đổi của các thành phần hoá học của lá mấm lưỡi đòng (Avicennia officilalis) từ khi còn non cho tới khi lá bị phân huỷ, thấy hàm lượng protein tăng lên rất cao [13]. +Ảnh hưởng của các nguyên tố khoáng [6]. Photpho: thường chiếm tỉ lệ cao nhất trong thành phần khoáng của NS. Nguyên tố photpho tham gia vào cấu tạo của nhiều chất hữu cơ quan trọng trong tế bào NS: nucleotit, nucleoprotein…..Photpho còn có mặt trong nhiều coenzyme quan trọng như ADP, ATP, NAD, FAD… Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin (cystin, cystein….), lưu huỳnh cũng có mặt trong nhiều coenzyme quan trọng như CoA, biotin… Kali: tham gia vào quá trình trao đổi glucid và ảnh hưởng đến nhiều quá trình trao đổi khác. Magie: mang tính chất là một cofacto đối với nhiều enzyme. Magie tham gia vào quá trình hoạt hóa khoảng 80 enzyme trong tế bào. Canxi: đóng vai trò là cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng trong tế bào. Canxi còn ảnh hưởng đến sự hình thành cấu trúc không gian ổn định của ribosom, nhân. Sắt: tham gia vào kết cấu porphirin của các hệ thống enzyme chuyển vận electron. 1.2.5. Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận protease [19, 25, 64] 1.2.5.1. Nuôi cấy bề mặt. Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại NS thu nhận enzyme do khả năng phát triển nhanh, mạnh của NS nên ít bị tạp nhiễm. Trong MT này, NS phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng MT đã được tiệt trùng, làm ẩm. Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là trấu. Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của NS. Tỉ lệ các chất phụ gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20%. Có thể bổ sung thêm nguồn N vô cơ, N hữu cơ và các chất kích thích ST như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. + Ưu điểm: chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme. Tốn ít năng lượng. Thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện qui mô gia đình, trang trại cũng như ở qui mô lớn. Nuôi cấy trong điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễm trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó. + Nhược điểm: phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hóa, tự động hóa, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều. 1.2.5.2. Nuôi cấy chìm. VSV được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất chủ yếu trong đa số trường hợp là tinh bột. Chỉ có một số ít giống VSV dùng nguồn cơ chất cacbon là đường glucose, saccharose. Thực tế, trong một số trường hợp đường hóa sơ bộ tinh bột trước khi thanh trùng. Khi đó đường maltoza được tạo thành là chất cảm ứng tốt, môi trường thường giảm độ nhớt nên dễ dàng cho quá trình khuấy trộn và sục khí. Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu: MT dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy… + Ưu điểm: dễ cơ khí hóa, tự động hóa, năng suất cao, dễ tổ chức sản xuất. Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng VSV đột biến có hoạt độ enzyme cao, lựa chọn tối ưu thành phần MT, các điều kiện nuôi cấy tối ưu, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện vệ sinh, vô trùng. + Nhược điểm: do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt gây thiệt hại lớn. 1.2.5.3.Thu nhận protease. Cho canh trường sau nuôi cấy vào dung dịch muối hoặc dung môi hữu cơ theo tỉ lệ thích hợp, khuấy đều, lắc trên máy lắc trong một thời gian xác định, lọc hoặc ly tâm thu lấy dịch trong. Trong sản xuất thường dung nước máy để chiết rút với thể tích gấp hai lần thể tích MT, tiến hành chiết rút enzyme trong một giờ. Tiến hành theo phương pháp này cho kết quả rất tốt. Trong trường hợp nuôi cấy theo phương pháp bề sâu, trước hết cần làm lắng tế bào VSV hoặc ly tâm để tách sinh khối khỏi dung dịch enzyme. Quá trình này là một giai đoạn quan trọng nhất và khó nhất trong kĩ thuật sản xuất chế phẩm enzyme. 1.3. Protein và protease 1.3.1. Protein. 1.3.1.1. Khái niệm. Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axít amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide. Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein [63]. Hình 1.7. Hình mô phỏng cấu trúc không gian của myoglobin [63] 1.3.1.2. Cấu trúc của protein Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân là các acid amin. Acid amin được cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amin (-NH2), hai là nhóm cacboxyl (-COOH) và cuối cùng là nhóm R quyết định tính chất của acid amin [15]. Hình 1.8. Cấu trúc chung của acid amin. Có 4 bậc cấu trúc của protein Cấu trúc bậc một: Các acid amin nối với nhau bởi liên kết peptide hình thành nên chuỗi polypetide. Đầu mạch polypeptide là nhóm amin của acid amin thứ nhất và cuối mạch là nhóm cacboxyl của acid amin cuối cùng. Cấu trúc bậc một của protein thực chất là trình tự sắp xếp của các acid amin trên chuỗi polypeptide. Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình tự các acid amin trên chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi polypeptide, từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính chất cũng như vai trò của protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các acid amin có thể dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và tính chất của protein [15, 63]. Cấu trúc bậc hai: là sự._. sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong không gian. Chuỗi polypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp β, được cố định bởi các liên kết hyđro giữa những acid amin ở gần nhau [15, 63]. Cấu trúc bậc ba: Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành từng búi có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein. Cấu trúc không gian này có vai trò quyết định đối với hoạt tính và chức năng của protein. Cấu trúc này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính chất của nhóm - R trong các mạch polypeptide. Chẳng hạn nhóm -R của cystein có khả năng tạo cầu đisulfur (-S-S-), nhóm -R của prolin cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ xác định điểm gấp, hay những nhóm -R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các nhóm kị nước thì chui vào bên trong phân tử... Các liên kết yếu hơn như liên kết hyđro hay điện hóa trị có ở giữa các nhóm -R có điện tích trái dấu [15, 63]. Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với nhau thì tạo nên cấu trúc bậc bốn của protein. Các chuỗi polypeptide liên kết với nhau nhờ các liên kết yếu như liên kết hyđro [15]. 1.3.1.3. Sự biến tính của protein [29, 63] Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy cơ học... hay tác nhân hóa học như acid, kiềm mạnh, muối kim loại nặng,... các cấu trúc bậc hai, ba và bậc bốn của protein bị biến đổi nhưng không phá vỡ cấu trúc bậc một của nó, kèm theo đó là sự thay đổi các tính chất của protein so với ban đầu. Đó là hiện tượng biến tính protein. Sau khi bị biến tính, protein thường có các tính chất sau: - Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kỵ nước vốn đã chui vào bên trong phân tử protein - Khả năng giữ nước giảm - Mất hoạt tính sinh học ban đầu - Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzyme protease do làm xuất hiện các liên kết peptide ứng với trung tâm hoạt động của protease. - Tăng độ nhớt nội tại - Mất khả năng kết tinh. 1.3.2. Protease. 1.3.2.1. Khái niệm. Protease là loại enzyme tham gia phân giải protein để tạo thành các peptit ngắn và cuối cùng tạo các acid amin và NH3 [20]. protease Hình 1.9. Sơ đồ cơ chế tác động của protease Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển acid amin [57]. 1.3.2.2 Cấu trúc và cơ chế hoạt động của protease. a. Trung tâm hoạt động của protease [20, 64]. Trong trung tâm hoạt động của protease VSV ngoài gốc amino acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc amino acid khác. + Serin protease: chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động giữ vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. + Cysteine protease: chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. + Aspartic protease: chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. Trung tâm hoạt động của các protease VSV bao gồm một số gốc amino acid và trong một số trường hợp còn có cả cofactơ kim loại. Nhiều tác giả đã nghiên cứu trung tâm hoạt động của các tinh thể protease acid của Rhizopus chinenis cho thấy phân tử các protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở khoảng 20oA. Khe hở này là phần xúc tác của enzyme. Các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy. Đối với các protease không chứa cystein, trung tâm hoạt động của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide. Hình 1.10.Cấu trúc một số loại protease [58] H2N- CH- CO- NH- CH- CO- …- NH- CH- COOH R1 R2 RX H2N- CH- COOH + H2N- CH- CO … NH- CH- COOH + H2O R1 R2 RX b. Cơ chế hoạt động của protease [20, 64]. Các protease xúc tác phản ứng theo cơ chế chung: E + S → E-S →E-S’ + P1 → E+P2 E: enzyme, S: cơ chất, E-S: phức chất enzyme-cơ chất, P: sản phẩm. Theo các tác giả, cơ chế tác dụng của protease của VSV cũng giống với protease serine động vật, đều tiến hành theo kiểu xúc tác acid- bazơ. Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất. Những enzyme này đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính (Barrett, 1994): Bước 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử C trong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine. Bước 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O theo chiều ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme. 1.3.2.3. Phân loại protease [19,21]. Protease được chia ra làm một số loại dựa trên những đặc điểm riêng của chúng cũng như cấu tạo trung tâm hoạt động của enzyme. Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase. * Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại: + Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide. + Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide. * Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: + Serin protease: là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. + Cysteine protease: Các protease chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Các cystein protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. + Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. + Metallo protease: Metallo protease là nhóm protease được tìm thấy ở VK, NS cũng như các VSV bậc cao hơn. Các metallo protease thường hoạt động vùng pH trung tính. Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: - Protease acid : pH 2-4 - Protease trung tính : pH 7-8 - Protease kiềm : pH 9-11 1.3.2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease từ NS ở RNM. a. Tình hình nghiên cứu. Hầu như tất cả phản ứng trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của các enzyme - chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các nhà hóa sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế [64]. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về protease của NS. Các tác giả M. Kalpana Devi, A. Rasheedha Banu, G.R. Gnanaprabhal, B.V. Pradeep và M. Palaniswamy đã xác định đặc điểm protease của Aspergillus niger (2008), Hajji M, Kanoun S, Nasri M và Gharsallah N khảo sát protease của Aspergillus clavatus (2007), Agarwal D, Patidar P, Banerjee T nghiên cứu khả năng sinh protease của Penicillium sp. Từ 1950, khoa học bắt đầu quan tâm nghiên cứu NS ở RNM. Ở Macau và Hồng Kông tìm được 45 loài nấm mới từ RNM (1994). D. M. Alongi, B. F. Clough, A. I. Robertson đã khảo sát khu hệ NS ở RNM miền Tây Úc (2005). Chưa có nhiều nghiên cứu về protease từ NS ở RNM. Trên thế giới có công trình nghiên cứu của G.L. Maria, K.R. Sridhar và N.S. Raviraja về khả năng sinh enzyme ngoại bào của một số loại NS (Aspergillus sp, Fusarium sp, Penicillium sp, Trichoderma sp) ở RNM vùng Tây Nam Ấn Độ (2005), công trình nghiên cứu của K. Kathiresan cũng chứng tỏ khu hệ VSV ở RNM Pichavaram (thuộc miền Đông Nam Ấn Độ) có khả năng sinh nhiều loại enzyme ngoại bào như kitinase, L- asparaginase, cellulase, protease, phosphatase (2000). Ở Việt Nam, nghiên cứu và thu nhận protease từ NS ở RNM là một vấn đề còn bỏ ngỏ. Theo các công trình nghiên cứu của MERD về các chủng NS ở RNM Nam Định và Thái Bình cho thấy 60% các chủng NS có khả năng sinh protease, trong đó có 21 chủng có hoạt tính protease rất mạnh được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu và ứng dụng [13]. Riêng ở RNM Cần Giờ, kết quả nghiên cứu trên hai chủng Penicillium và Aspergillus của tác giả Võ Thị Bích Viên cho thấy trong cả ba đợt thu mẫu vào ba thời điểm khác nhau, trên 80% số NS có khả năng sinh protease [32]. b. Ứng dụng. [21, 25, 64]. Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp… Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt. Kết quả làm cho thịt có độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn. Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: Để thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của VK, NS, TV với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thủy phân. Ưu điểm của việc thủy phân protein bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thủy phân. Trong chế biến thủy sản: hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme TV (bromelain và papain) và VSV để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm. Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số VSV như A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus,… được dùng trong sản xuất phomat . Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo, độ nhuyễn của bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn cho sản phẩm. Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn . Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt, làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của ĐV. Hiện nay, việc đưa các protease tách từ VK (B. mesentericus, B. subtilis), NS (A. oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus...) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng . Trong công nghiệp dệt: protease VSV được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để sợi được được bóng, dễ nhuộm. Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như: - Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng. - Protease của NS và VK phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm. - Điều chế MT dinh dưỡng của VSV để sản xuất vacxin, KS,… - Sản xuất chất giặt tổng hợp, sản xuất mỹ phẩm,… 1.3.2.5. Một số chế phẩm của protease [19,21, 23].  Pepsin Pepsin được thu nhận từ màng nhầy dạ con của heo và bê. Pepsin thường được sử dụng chung với rennet trong sản xuất phomai và làm thuốc tiêu hóa. Hỗn hợp này hoạt động mạnh ở pH 2-4 và nhiệt độ 50oC.  Rennet Thường được sản xuất từ bao tử của cừu, bê, người ta thường phối hợp với pepsin để sử dụng trong công nghiệp chế biến sữa.  Papain Papain được thu nhận bằng cách sấy khô mủ cây đu đủ carica papaya. Trong mủ cây đu đủ có chứa papain, chymopapain, và một lượng nhỏ protease khác. Papain được ứng dụng nhiều trong sản xuất bánh và công nghiệp chế biến thịt. Ngoài ra, papain còn ứng dụng trong y học để làm lành các vết thương ngoài da.  Ficin Ficin có nhiều trong nhựa cây sung, được ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến sữa.  Protease của VK Có hai loại protease từ VK được bán trên thị trường thế giới. Hai loại này khác nhau về pH hoạt động, mức độ hoạt động và cấu trúc của trung tâm hoạt động. +Protease kiềm Chế phẩm này có tên thương mại là subtilisin, có khoảng pH hoạt động 7-11, trung tâm hoạt động có chứa serin. Chế phẩm này còn được gọi là enzyme tẩy rửa vì được ứng dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa. +Protease trung tính Protease trung tính là metalloenzyme, hoạt động ở pH 6-9. Chế phẩm này được ứng dụng trong công nghiệp da, bia và công nghiệp sản xuất protein thủy phân.  Protease từ NS. Nhiều chủng NS có khả năng sinh protease mạnh. Một số protease từ NS đã được sản xuất trên qui mô công nghiệp. Bảng 1.1. Một số loại NS có khả năng tổng hợp protease mạnh [21] Chủng nấm sợi Loại protease A. oryzae A. awamori A. niger A. fumigatus P. chrysogenum P. cyaneo fulvum R. nodous Protease trung tính, acid và kiềm Protease acid Protease acid và kiềm Nhiều loại nấm sợi có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum… Các loại NS này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Các loại NS đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3. Một số NS khác như A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomát. Protease từ NS gồm cả protease acid, kiềm và trung tính. Các protease acid và trung tính được ứng dụng để sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo. Protease kiềm được ứng dụng trong công nghệ thuộc da. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu. - Các chủng NS được phân lập tại 5 xã Long Hòa, Lý Nhơn, Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Bình Khánh ở RNM Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh. - Các chủng VSV kiểm định: E. coli, B. subtilis được cung cấp từ viện Pasteur. - Nguyên liệu làm MT thu protease: cám gạo, trấu, bột đậu nành mua từ chợ. 2.2. Hoá chất. - Các hóa chất có nguồn gốc từ Trung Quốc: K2HPO4, KH2PO4, KCl, NaCl, NaOH, NaNO3… - Các hóa chất có nguồn gốc từ Việt Nam: dầu DO, glucose, pepton, casein, agar, tinh bột, cồn, nước cất… - Các hóa chất có nguồn gốc từ Đức: Yeast extract, malt extract… - Các hoá chất có nguồn gốc từ Nhật Bản: CMC, muối seignet… 2.3. Thiết bị, dụng cụ. Thiết bị máy móc. Nồi hấp vô trùng Huxlex (Đài Loan). Tủ cấy vô trùng ( Việt Nam). Tủ sấy Memmert (Đức). Tủ ấm Binder (Đức) Kính hiển vi Olympus CHL (Nhật Bản). Tủ lạnh Hytachi (Nhật Bản). Máy đo pH Hana (Nhật Bản). Máy ly tâm Heraeus (Nhật Bản). Cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ). Máy đo quang phổ UV (Đức). Máy chụp hình kĩ thuật số Olympus 5.1 (Nhật Bản). Dụng cụ thí nghiệm: que cấy móc, qua cấy vòng, bình tam giác, ống nghiệm, ống đong, đèn cồn, que trang, đĩa petri, thước đo, giấy lọc, bông mỡ, bông thấm nước, giấy lọc, khăn lọc, lame, lammel,….. 2.4. Các MT sử dụng trong thí nghiệm. - MT phân lập, nuôi cấy, giữ giống và định danh NS MT1-MT Czapek_Dox cải tiến [19] NaNO3: 3,5g. K2HPO4: 1,5g. MgSO4.7H2O: 0.5g. KCl: 0.5g. FeSO4.7H2O: 0.01g. Glucoza: 20g. Agar: 20g. Nước biển: 1000ml. pH: 6.5. Khử trùng 1atm/30phút MT2- MT Zea [19] Cao nấm men: 4g. Glucoza: 20g. Agar: 20g. Nước biển: 1000ml. pH: 5,5-6. Khử trùng 1atm trong 30 phút. MT3-MT Malt Extra Agar (MEA) [4] Cao malt: 20g. Pepton: 1g. Glucoza: 20g. Agar: 20g. Nước biển: 1000ml. pH: 5,5-6,0. Khử trùng 1atm trong 30 phút. - MT nuôi cấy VK kiểm định. MT4- MT Meat Pepton Agar (MEA) [20] Pepton: 5g. NaCl: 5g. Cao thịt: 5g. Agar: 20g. Nước cất: 1000ml. pH: 7,5. Khử trùng 1atm, 30 phút. - MT thử hoạt tính enzyme ngoại bào. MT5- MT thử hoạt tính amylase [5] NaNO3: 3,5g. K2HPO4: 1,5g. MgSO4.7H2O: 0.5g. KCl: 0.5g. FeSO4.7H2O: 0.01g. Tinh bột tan: 15g. Agar: 20g. Nước biển: 1000ml. pH: 6.5. Khử trùng 1atm/30phút MT6- MT thử hoạt tính protease [5] K2HPO4: 1,5g. MgSO4.7H2O: 0.5g. KCl: 0.5g. FeSO4.7H2O: 0.01g. Casein: 15g Agar: 20g. Nước biển: 1000ml. pH: 6.5. Khử trùng 1atm/30phút MT7- MT thử hoạt tính cellulase [5] NaNO3: 3,5g. K2HPO4: 1,5g. MgSO4.7H2O: 0.5g. KCl: 0.5g. FeSO4.7H2O: 0.01g. CMC: 10g. Agar: 20g. Nước biển: 1000ml. pH: 6.5. Khử trùng 1atm/30phút MT8- MT thử hoạt tính kitinase [5] NaNO3: 3,5g. K2HPO4: 1,5g. MgSO4.7H2O: 0.5g. KCl: 0.5g. FeSO4.7H2O: 0.01g. Bột kitin: 10g Agar: 20g. Nước biển: 1000ml. pH: 6.5. Khử trùng 1atm/30phút MT9- MT bán rắn khảo sát hoạt độ protease [20]. Cám gạo: 7g.(70%) Trấu: 2.5g.(25%) Bột đậu nành: 0.5g. (5%) Độ ẩm :60%. pH 5-5,5. Khử trùng 1atm/30 phút. 2.5. Phương pháp nghiên cứu. 2.5.1. Phương pháp phân lập mẫu từ RNM (theo Fazzani 1975, Kuthubuthen, 1981, 1984) [32]. Thu mẫu tại 5 xã: An Thới Đông, Lý Nhơn, Bình Khánh, Long Hòa, Tam Thôn Hiệp. Mỗi xã thu mẫu ở 5 địa điểm khác nhau, các địa điểm cách nhau khoảng 200m. Tại mỗi địa điểm thu mẫu ở đất mặt, đất sâu, lá vàng, lá mục, cành khô, cành mục. Cách thu mẫu: dùng kéo, dao cắt khoảng 20g cành, lá cho vào túi nilon, cho vào thùng đá, chuyển về PTN, giữ lạnh ở 4o C. Các mẫu phân lập ngay, không giữ quá 24h. Các mẫu thu từ đất thì dùng muỗng xúc khoảng 20g đất và tiến hành tương tự trên. 2.5.2. Phương pháp phân lập mẫu trực tiếp và pha loãng mẫu (theo Uyenco, 1988) [28]. Lấy 10g mẫu, cho vào túi lọc có 90 ml nước biển Cần Giờ vô trùng. Dập mẫu bằng máy dập trong vòng 2 phút, tốc độ 230 vòng/phút. Thu dịch lọc ta được dung dịch pha loãng 10-1. Tiếp tục pha loãng 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. Nhỏ hai giọt dung dịch của mỗi nồng độ lên đĩa petri có MT 1, 2, 3. Dùng que trang dàn đều dung dịch khắp bề mặt đĩa. Lật ngược đĩa petri, gói giấy báo, để ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày. Chọn KL riêng rẽ cấy vào ống thạch nghiêng. Làm thuần [6] Lấy một KL riêng rẽ trong ống thạch nghiêng, hòa với nước biển vô trùng, cấy trang lên đĩa petri. Ủ mẫu ở 30oC cho đến khi xuất hiện KL. Nếu thấy các dạng KL đồng đều về hình dạng, màu sắc thì giống phân lập đã thuần khiết. Chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang ống thạch nghiêng. Nuôi cấy ở 30oC trong 7 ngày, sau đó bảo quản ở 4oC. Sau thời gian 2 tháng cấy truyền lại một lần. 2.5.3. Phương pháp bảo quản NS trên MT thạch có dầu khoáng. Chuẩn bị các ống thạch nghiêng nuôi NS đạt độ trưởng thành. Dầu khoáng chứa trong eppendoff đã hấp vô trùng ở 121oC trong 2 giờ rồi sấy khô ở 170oC trong 1-2 giờ, để nguội. Dùng que cấy lấy một ít bào tử NS cho vào eppendoff chứa dầu khoáng vô trùng. Hàn kín eppendoff bằng keo paraphin, bảo quản ở 4oC. Phương pháp này có thể bảo quản từ 1-3 năm. 2.5.4. Phương pháp quan sát đại thể NS [6] Cho vào ống nghiệm 5ml nước biển vô trùng. Dùng que cấy cho một ít bào tử từ ống giống vào ống nước biển, lắc đều tạo dung dịch huyền phù. Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi cấy chấm điểm vào giữa hộp petri. Ủ trong tủ ấm 1 tuần, mỗi ngày lấy ra quan sát các đặc điểm hình thái, sinh lý (kích thước KL, màu sắc KL mặt phải, mặt trái, hình dạng KL, đặc điểm mép khuẩn lạc, màu sắc MT, ….) 2.5.5. Phương pháp quan sát vi thể NS [4] Đổ một lớp mỏng MT nuôi cấy vào đĩa petri. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch. Chuẩn bị đĩa petri sạch, đặt vào giữa đĩa một ít bông có thấm nước để làm ẩm, đặt trên lớp bông một phiến kính, đem hấp vô trùng 121oC, 30 phút. Đặt một hoặc hai khối thạch lên phiến kính, cấy bào tử xung quanh mép khối thạch, đặt các lá kính vô trùng lên bề mặt khối thạch. Để các hộp petri này ở nhiệt độ phòng 3-4 ngày. Gỡ lá kính ra, úp một phiến kính sạch có nhỏ một giọt lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất. Gỡ bỏ lớp thạch để nguyên phần NS trên phiến kính, nhỏ vào một giọt lactophenol, đậy lá kính lên, ta được tiêu bản thứ hai. Quan sát dưới kính hiển vi và mô tả các đặc điểm: Hình dạng cuống sinh bào tử, hình dạng thể bình, sợi nấm có phân nhánh và có vách ngăn hay không, đặc điểm bào tử đính, màu sắc, kích thước bào tử…. 2.5.6. Phương pháp xác định hoạt tính của enzyme ngoại bào bằng đo đường kính vòng thủy phân Nguyên tắc. Cho enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành vòng trong suốt xung quanh KL. Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt động của enzyme. 2.5.6.1. Phương pháp cấy chấm điểm. Chuẩn bị các chủng NS cần nghiên cứu và các MT thử hoạt tính enzyme ngoại bào. Cấy chấm điểm các chủng NS lên bề mặt MT. Ủ ấm trong 30oC, để 3-4 ngày. Đo đường kính vòng phân giải. Phương pháp này chỉ định tính enzyme, chỉ đánh giá sơ bộ chứ chưa nghiên cứu sâu. 2.5.6.2. Phương pháp khoan lỗ thạch. Thu dịch nuôi cấy: Nuôi cấy NS trên MT xốp, ủ ba ngày ở 30oC, hòa 10g MT vào nước cất, đem lắc trong 1h tốc độ 200 vòng/phút. Đem lọc qua vải để thu dịch lọc. Ly tâm dịch lọc 15 phút, tốc độ 5000 vòng/phút. Thu được dịch enzyme thô. Chuẩn bị các đĩa petri có MT thử hoạt tính các enzyme ngoại bào cần nghiên cứu. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các lỗ thạch trên MT thử hoạt tính các enzyme ngoại bào. Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml vào các lỗ khoan. Giữ các hộp petri trong tủ lạnh 4oC trong 8h, sau đó chuyển ra nhiệt độ phòng 24h. Dùng thuốc thử nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải. Kiểm tra kết quả. Kiểm tra hoạt tính amylase, cellulase, kitinase, pectinase, dùng thuốc thử là lugol. NS có hoạt tính của các enzyme này sẽ tạo nên vòng trong suốt quanh KL hoặc lỗ khoan. Kiểm tra hoạt tính của protease: thuốc thử là dung dịch HgCl2. Nếu NS có sinh protease sẽ tạo ra một vòng trong suốt quanh KL hoặc lỗ khoan do protease đã phân huỷ chất cảm ứng casein, phần còn lại có màu trắng đục do phản ứng của casein với HgCl2. Cách pha dung dịch HgCl2: hòa 30g HgCl2 vào 100ml nước có pha với 15ml HCl. Cách đánh giá khả năng tạo enzyme: Dùng thước đo đường kính vòng phân giải tại mặt sau đĩa petri. D-d ≥ 25mm: hoạt tính enzyme rất mạnh. D-d ≥ 20mm: hoạt tính enzyme mạnh. D-d ≥ 10mm: hoạt tính enzyme trung bình. D-d ≤ 10mm: hoạt tính enzyme yếu. Trong đó: D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính KL hoặc là đường kính của khoan khối thạch (8mm) nếu làm bằng phương pháp khuếch tán trên MT thạch. 2.5.7. Phương pháp xác định hoạt độ protease (phương pháp Anson cải tiến). Nguyên tắc. Cho protease tác dụng với cơ chất casein, sản phẩm tạo thành là các peptit ngắn hay các acid amin. Trong các loại acid amin, tyrosin chiếm đa số. Xác định tyrosin bằng phản ứng màu với thuốc thử folin, từ đó xác định hoạt tính protease theo định nghĩa: hoạt tính protease được biểu thị là số micromol tyrosin sinh ra do thuỷ phân casein bởi 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (35,5oC, pH 7,6). Hoá chất. Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hoà tan 5,96g Na2HPO4 trong nước thành 250ml. Dung dịch KH2PO41/15M: hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành 100ml. Dung dịch đệm sorensen 1/15 M, pH 7,6: trộn 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4, đo và chỉnh lại pH cho đúng. Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong đệm sorence đến tan hoàn toàn rồi sau đó định mức bằng sorense cho đủ 100ml. Dung dịch TCA (tricloro acid) 10%: hòa tan 10g TCA trong nước cho đủ 100ml. Dung dịch NaOH 0,5N: hòa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml. Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4,25ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 100ml. Dung dịch tyrosin 20mM/l: khuấy nghiền 0,118g tyrosin trong dung dịch HCl 0,2N cho vừa đủ 50ml. Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM/l: pha loãng 5ml tyrosin 20mM/l trong HCl 0,2N thành 100ml. Tiến hành thí nghiệm. Dựng đường chuẩn tyrosin. Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Dung dịch tyrosin chuẩn 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Dung dịch HCl 0,2N 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Dung dịch NaOH 0,5N 2 2 2 2 2 2 Thuốc thử folin 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lượng tyrosin (micromol) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Lắc và để yên 10 phút đem đo mật độ quang ở bước sóng 660nm. Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (∆OD) theo lượng tyrosin ở các ống. Xác định lượng tyrosin trong dung dịch nghiên cứu. Cách tính: Hoạt tính protease: HT (UI) = X.V.K t.v (UI/ml) X: số micromol tyrosin suy ra từ đường chuẩn. V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (11ml). V: thể tích dịch lọc đem phân tích (1ml). K: độ pha loãng mẫu. t: thời gian phản ứng. 1UI (Anson) = 1 micromol tyrosin/ml/phút hoặc 1 micromol/mg/phút. Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Thử thật (3 ống) Thử không (3 ống) Casein 1% (ml) 5 5 TCA 10% (ml) 0 5 Dịch enzyme mẫu (ml ) 1 0 Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 30 phút TCA 10% (ml) 5 0 Dịch enzyme mẫu (ml) 0 1 Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu Dịch lọc (ml) 1 1 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 Lắc đều, để yên 10 phút, đo OD ở bước sóng 660nm 2.5.8. Phương pháp kiểm tra hoạt tính KS. Nguyên tắc. Chất KS do nấm tiết ra ức chế sự phát triển của VSV kiểm định làm cho VSV không phát triển được xung quanh lỗ khoan chứa dịch KS hay khối thạch tạo thành vòng vô khuẩn trong suốt. Cách tiến hành. Cấy NS trên môi trường MEA, nuôi 3 ngày. Dùng khoan nút chai đường kính 8mm khoan các khối KL nấm. Môi trường MPA sau khi hấp khử trùng, để nguội khoảng 45-50 độ, dùng que cấy vòng lấy một vòng VK kiểm định (B. subtilis hoặc E. coli) hòa vào MT, đổ MT vào đĩa petri. Khi môi trường MPA trong đĩa petri đã đông cứng lại, dùng kim mũi mác đặt khối thạch có KL nấm vào. Để vào tủ lạnh 4oC trong 8h để dịch KS khuyết tán vào trong thạch, sau đó chuyển sang nhiệt độ phòng để trong 24h. Kiểm tra kết quả. Khả năng sinh KS được đánh giá bằng hiệu số D-d (D: đường kính vòng vô khuẩn, d=8mm: đường kính của lỗ khoan nút chai. D-d ≥ 25mm: hoạt tính KS rất mạnh. D-d ≤ 20mm: mạnh. D-d ≥ 10: trung bình. D-d < 15mm: yếu. 2.5.9. Phương pháp xác định sự ảnh hưởng của các yếu tố MT lên khả năng ST của NS. Đánh giá khả năng ST của NS bằng cách đo đường kính KL Qui ước: d = 0mm: không mọc. d = 1-2mm: mọc yếu. d = 2,1-5: mọc trung bình. d = 5,5-10: mọc tốt. d = 11-30mm: mọc rất tốt. 2.5.9.1. Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian lên ST của NS. Cấy chấm điểm các chủng NS cần nghiên cứu vào MT1, mỗi ngày đo đường kính KL, đo trong 7 ngày. 2.5.9.2. Phương pháp xác định ảnh hưởng của độ mặn lên ST của NS. Chuẩn bị MT1 có pha NaCl để tạo các nồng độ muối: 1%, 3%, 5%, 10%, 20%. Cấy chấm điểm các chủng NS cần nghiên cứu lên MT. Nuôi nấm trong 3 ngày ở 30oC. Đo đường kính KL. 2.5.9.3. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên ST của NS. Cấy chấm điểm các chủng NS lên MT1 nuôi ở các nhiệt độ khác nhau: 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC trong 3 ngày. Đo đường kính KL. 2.5.9.4. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH lên ST của NS. Chuẩn bị MT1 được điều chỉnh pH bằng NaOH 10% và HCl 10% để tạo các giá trị pH = 3,4,5,6,7,8. Cấy chấm điểm các chủng NS cần nghiên cứu. Nuôi trong 3 ngày ở 30oC. Đo đường kính KL. 2.5.9.5. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nguồn N lên ST của NS. Sử dụng MT1. Nguồn NaNO3 lần lượt được thay thế bằng cao thịt, cao nấm men, casein, bột ĐN, (NH4)2SO4. Mẫu đối chứng là MT1. Cấy chấm điểm các chủng NS cần nghiên cứu. Nuôi trong 3 ngày ở 30oC. Đo đường kính KL. 2.5.10. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận protease. [6] Chuẩn bị MT lên men: cho vào bình tam giác 250ml 15g MT bán rắn, hấp khử trùng 121oC trong 30 phút. Chuẩn bị giống bào tử: Chuẩn bị ống nghiệm chứa 15ml nước cất vô trùng. Hoà lượng nước cất vô trùng này vào ống giống. Dùng que cấy mốc cà nhẹ lên bề mặt thạch để lấy bào tử, đánh nhẹ cho bào tử ở dạng huyền phù. Tiến hành đếm bào tử bằng phòng đếm hồng cầu. Nuôi cấy: Cho vào các erlen chứa MT một thể tích huyền phù sao cho mật độ bào tử là 105- 106 bào tử/gam MT (2ml). Nuôi cấy ở 30oC. Canh trường nuôi cấy được thu nhận sau 1 khoảng thời gian xác định. Thu dịch enzyme thô: Sau thời gian nuôi cấy NS, cho vào mỗi bình tam giác 100ml nước cất. Lắc 1h, sau đó lọc qua vải lọc thu lấy dịch lọc. Đem dịch lọc ly tâm 5000 vòng trong 10 phút. Thu lấy dịch ly tâm rồi định mức 100ml, ta được dung dịch enzyme thô. 2.5.11. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các yếu tố MT đến hoạt độ protease của NS. 2.5.11.1. Ảnh hưởng của độ mặn. Chuẩn bị MT9. Cho vào MT nuôi cấy 2 ml thể tích dịch huyền phù bào tử, dùng NaCl để thay đổi độ mặn: 0%, 1%, 3%, 5%, 10%, 20%. Nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC trong ba ngày. Thu dịch enzyme thô và đo hoạt độ protease để xác định độ mặn tối ưu. 2.5.11.2. Ảnh hưởng của nguồn N. - Chuẩn bị MT9, thay 5% bột ĐN bằng các nguồn N khác nhau: cao thịt, cao nấm men, casein, (NH4)2SO4. Nuôi cấy ở độ mặn tối ưu, nhiệt độ phòng, thời gian 3 ngày. Thu dịch enzyme thô và đo hoạt độ protease để xác định nguồn N thích hợp nhất. -Sau khi chọn được nguồn N thích hợp, tiến hành chọn tỉ lệ N tối ưu cho hoạt độ protease của các chủng NS nghiên cứu. Các tỉ lệ khảo sát: 0%, 1%, 3%, 5%, 7%, 10%. 2.5.11.3. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy. Chuẩn bị MT nuôi cấy thích hợp, độ mặn tối ưu. Cho vào MT nuôi cấy 2 ml thể tích dịch huyền phù bào tử. Nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau: 20oC, 25 oC, 30 oC, 35 oC, 40 oC. Sau ba ngày thu enzyme thô và xác định hoạt độ protease. Từ đó xác định giá trị nhiệt độ tối ưu để thu protease. 2.5.11.4. Ảnh hưởng của độ ẩm. Chuẩn bị MT thích hợp, độ mặn và nhiệt độ nuôi cấy tối ưu. Cho vào MT nuôi cấy 2 ml thể tích dịch huyền phù bào tử. Độ ẩm thay đổi 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%. Sau ba ngày, thu dịch enzyme thô và đo hoạt độ prot._.