Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh đốm là, khô cành ngọn keo lai do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. gây hại tại lâm trường Tam Thắng, huyện Thanh Sơn tỉnh Phú Thọ

U ỨNG DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH ĐỂ PHÒNG TRỪ BỆNH ĐỐM LÁ, KHÔ CÀNH NGỌN KEO LAI (Acacia auriculiformis x Acacia mangium) DO NẤM COLLETOTRICHUM GLOEOSPORIOIDES (PENZ.) SACC. GÂY HẠI TẠI LÂM TRƢỜNG TAM THẮNG , HUYỆN THANH SƠN TỈNH PHÚ THỌ Chuyên ngành: Lâm học Mã số: 60. 62. 60 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP NGƢỜI HƢỚNG DẪN: PGS. TS. PHẠM QUANG THU Thái Nguyên, 2008 MỤC LỤC Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các bảng ...................................................................................i Danh mục các hình ...................................................................................ii Kí hiệu, chữ viết tắt .................................................................................iii Đặt vấn đề .................................................................................................1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ..................................3 1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới...............................................................3 1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước………………………………………..6 Chƣơng 2. ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN - KINH TẾ - XÃ HỘI KHU VỰC NGHIÊN CỨU………………………………………………………………..10 2.1. Điều kiện tự nhiên khu vực nghiên cứu…………………………………...10 2.2. Địa hình, thổ nhưỡng............................................................................. .......10 2.3. Khí hậu thuỷ văn..........................................................................................10 2.4. Điều kiện kinh tế - xã hội.............................................................................11 2.4.1. Điều kiện kinh tế.......................................................................................11 2.4.2. Điều kiện xã hội........................................................................................13 Chƣơng 3. MỤC TIÊU - ĐỐI TƢỢNG - THỜI GIAN - ĐỊA ĐIỂM - NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................14 3.1. Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………………14 3.2. Địa điểm nghiên cứu………………………………………………………14 3.2.2. Thời gian nghiên cứu……………………………………………………14 3.2.3. Đối tượng nghiên cứu……………………………………………………14 3.3. Nội dung nghiên cứu………………………………………………………15 3.3.1. Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh hưởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu.....................................15 3.3.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp bệnh....15 3.3.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập được. ............................................................................................................. ......15 3.3.4. Đánh giá mối quan hệ giữa vi khuẩn nội sinh với cây chủ ở các cấp bị bệnh khác nhau để tìm hiểu về cơ chế.................................................................15 3.3.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai.........................................................................................................15 3.4. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................16 3.4.1. Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh hưởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu.....................................16 3.4.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp bệnh…………………………………………………………………………….23 3.4.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập được............................................................................................................... ...25 3.4.4. Đánh giá mối quan hệ giữa vi khuẩn nội sinh với cây chủ ở các cấp bị bệnh khác nhau để tìm hiểu về cơ chế.................................................................26 3.3.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai........................................................................... ..............................27 Chương 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...............................................................31 4.1. Xác định nấm gây bệnh khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh hưởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu.......................................................31 4.1.1. Triệu chứng bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai.....................................31 4.1.2. Kết quả phân lập nấm bệnh……………………………………………...32 4.1.3. Kết quả thí nghiệm gây bệnh nhân tạo…………………………………..33 4.1.4. Giám định nguyên nhân gây bệnh.............................................................34 4.1.5. Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides trên môi trường dinh dưỡng PDA......................................................................................36 4.1.6. Đánh giá ảnh hưởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu.......................................................................................................................36 4.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp hại………………………………………………………………………………38 4.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập được…………………………………………………………………………….40 4.3.1. Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội sinh…………………………………………………………………………......40 4.3.2. Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn có hiệu lực cao………………….42 4.3.3. Một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn có hiệu lực cao…………………………………………………………………………........42 4.4. Đánh giá mối quan hệ giữa vi khuẩn nội sinh với cây chủ ở các cấp bị bệnh khác nhau để tìm hiểu về cơ chế ………………………………………………47 4.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai…………………………………………………………………………..48 4.5.1. Nhân sinh khối sản xuất chế phẩm ………………………………….......48 4.5.2. Hiệu lực kháng nấm bệnh của khuẩn nội sinh trong phòng thí nghiệm………………………………………………………………………….49 4.5.3. Thử nghiệm hiệu lực của vi khuẩn nội sinh trong giai đoạn vườn ươm……………………………………………………………………………..52 4.5.4. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh đến cây keo lai ở giai đoạn rừng non (1 tuổi).......................................................................................................... ...........56 Chương 5. KẾT LUẬN - TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ………………………60 5.1. Kết luận……………………………………………………………………60 5.2. Tồn tại và kiến nghị………………………………………………………..62 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................63 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 4.01 Kết quả gây bệnh nhân tạo keo lai 33 4.02 Sinh trưởng của hệ sợi nấm trên môi trường PDA. 36 4.03 Ảnh hưởng của bệnh đối với keo lai ở Lâm trường Tam Thắng huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ 37 4.04 Số lượng chủng khuẩn ở các mức độ bị bệnh 38 4.05 Khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides của các chủng khuẩn nội sinh 41 4.06 Kết quả gây bệnh nhân tạo của các chủng khuẩn nội sinh đối kháng nấm bệnh 49 4.07 Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến tỷ lệ bị bệnh và mức độ bị bệnh của keo lai ở giai đoạn vườn ươm 50 4.08 Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến sinh trưởng của keo lai trong giai đoạn vườn ươm 54 4.09 Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh đến keo lai 1 tuổi 57 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 3.01 Cây bị bệnh cấp 0 20 3.02 Cây bị bệnh cấp 1 21 3.03 Cây bị bệnh cấp 2 21 3.04 Cây bị bệnh cấp 3 21 3.05 Cây bị bệnh cấp 4 21 4.01 Thân cành keo lai bị bệnh 31 4.02 Rừng trồng keo lai b ị bệnh đốm lá, khô cành ngọn 32 4.03 Thể quả nấm gây bệnh 32 4.04 Sự sinh trưởng của sợi nấm trên môi trường PDA 33 4.05 Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo 34 4.06 Bào tử vô tính của nấm gây bệnh 35 4.07 Tỷ lệ các chủng khuẩn phân lập được trên các vị trí khác nhau của cây chủ 49 4.08(a,b) Khuẩn và bào tử B01 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides 42 4.09(a,b) Khuẩn và bào tử B02 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides 43 4.10(a,b) Khuẩn và bào tử B03 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides 44 4.11(a,b) Khuẩn và bào tử P01 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides 45 4.12(a,b) Khuẩn và bào tử X01 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides 45 4.13(a,b) Khuẩn và bào tử X02 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides 46 4.14 Khuẩn và bào tử X1.1 đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides 47 4.15 Mức độ bị kháng bệnh của các chủng khuẩn 51 4.16 (a,b,c,d) Khả năng kháng nấm của các chủng khuẩn B01, B02, B03 51 4.17(a,b) Khả năng kháng nấm của các chủng khuẩn P01 và X1.1 52 4.18 Khả năng ứcc chế nấm của các chủng khuẩn X01 và X02 52 4.19 Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến tỷ lệ bị bệnh và mức độ bị bệnh của keo lai ở giai đoạn vườn ươm 54 4.20 Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến đường kính gốc của keo lai trong giai đoạn vườn ươm 54 4.21 Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến keo lai ở giai đoạn vườn ươm 56 4.22 Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến tỷ lệ bị bệnh và mức độ bị bệnh của keo lai ở giai đoạn rừng tuổi 1 bị bệnh của keo lai ở giai đoạn rừng tuổi 1 độ 58 4.23 Ảnh hưởng của thể tích dịch khuẩn B03 khi tiêm vào cây keo lai trong giai đoạn rừng non 1 tuổi 58 KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu, chữ viết tắt Chữ đầy đủ HVN Chiều cao vút ngọn D1.3 Đường kính ngang ngực Dg Đường kính cổ rễ CT1 Công thức 1 CT2 Công thức 2 CT3 Công thức 3 CT4 Công thức 4 CT5 Công thức 5 ĐC Công thức đối chứng M Trọng lượng của cây B Bark P Phloem X Xylem LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, khoa Sau Đại học, thầy giáo hướng dẫn Phạm Quang Thu tác giả đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai (Acacia auriculiformis x Acacia mangium) do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. gây hại tại lâm trƣờng Tam Thắng, huyện Thanh Sơn, Phú Thọ”. Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, tác giả đã nhận được sự hướng dẫn tận tình của thầy giáo Phạm Quang Thu và sự giúp đỡ của các cơ quan, ban ngành và sự góp ý chân tình của các bạn bè đồng nghiệp. Nhân dịp này, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Phạm Quang Thu thầy giáo trực tiếp hướng dẫn khoa học cùng toàn thể các cán bộ, công nhân viên của Viện nghiên cứu khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam, các thầy, cô giáo trong khoa Sau đại học, khoa Lâm nghiệp trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban giám hiệu trường Trung cấp Kinh tế - Kỹ thuật tỉnh Lào Cai nơi tôi công tác. Tác giả xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng nghiên cứu bảo vệ rừng Viện Khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam, các bạn sinh viên trường Đại học Lâm Nghiệp, Xuân Mai, Hà Nội và các cán bộ, công nhân viên lâm trường Tam Thắng (huyện Thanh Sơn - Phú Thọ), các bạn bè đồng nghiệp và những người thân trong gia đình đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tác giả hoàn thành luận văn. Thái Nguyên, ngày 10 tháng10 năm 2008 Vũ Văn Định Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong dự án trồng mới 5 triệu hecta rừng, có 2 triệu hecta rừng phòng hộ, 3 triệu hecta rừng sản xuất (trong đó có gần 2 triệu hecta rừng nguyên liệu). Loài cây dùng để trồng rừng nguyên liệu là loài cây có giá trị kinh tế, sinh trưởng nhanh, năng xuất cao, chu kỳ kinh doanh ngắn mau cho thu hoạch sản phẩm. Những loài cây này cần có khả năng thích ứng cao với hoàn cảnh có thể trồng trên đất trống đồi núi trọc, dễ gây trồng, sản phẩm phong phú và đa dạng, thích hợp với quy trình công nghệ chế biến và thị trường tiêu thụ. Mặt khác cũng cần phải đề cập đến khía cạnh vừa phải đáp ứng về mặt kinh tế nhưng vẫn đảm bảo tác dụng phòng hộ, cải tạo cảnh quan môi trường và có khả năng chống chịu được các loài sâu bệnh hại [1]. Các loài keo sinh trưởng nhanh, chu kỳ kinh doanh ngắn có thể dùng làm gỗ củi, làm giấy, làm đồ xây dựng, đồ gỗ và đồ mỹ nghệ. Điều đó chứng tỏ gỗ keo đang được dùng rộng rãi và được người dân chấp nhận khi gỗ của một số loài như Đinh, Lim, Lát … ngày càng hiếm và đắt [3]. Ngoài ra keo là loài cây có khả năng tổng hợp nitơ tự do trong khi quyển rất cao (Dart, và C.S, 1991), có khả năng thích ứng với điều kiện khí hậu đất đai ở nước ta từ vùng cát ven biển tương đối khô hạn đến vùng núi thấp dưới 400m, đây là loài cây cải tạo đất, tăng độ phì, độ xốp và các tính chất lý, hóa khác của đất. Do nhu cầu sử dụng vào các mục đích khác nhau của gỗ keo như làm bột giấy, dăm xuất khẩu, gỗ xây dựng, gỗ củi và cả chế biến đồ mộc xuất khẩu mà nhiều năm nay, một số loài keo Acacia đã được gây trồng rộng rãi trên khắp cả nước ở quy mô rừng trồng tập trung và trồng cây phân tán. Theo thống kê đến tháng 12 năm 2005, diện tích rừng trồng cả nước ta là 2.333.000 ha, trong đó diện tích rừng trồng các loài keo chiếm tỷ lệ lớn nhất [2] Trước sự gia tăng nhanh về mặt diện tích, các rừng trồng keo đã xuất hiện nhiều bệnh gây khó khăn không nhỏ cho một số địa phương trong cả nước. Tại Bầu Bàng, Bình Dương một số dòng keo lai đã bị mắc bệnh phấn hồng (pink disease) với tỷ lệ và mức độ bị bệnh khá cao, gây nhiều thiệt hại cho sản xuất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 Tại Đạ Tẻh, tỉnh Lâm Đồng, Keo tai tượng trồng thuần loài với tổng diện tích hơn 400 ha đã có 118,5 ha bị bệnh với tỷ lệ từ 7 đến 59 % trong đó có một số diện tích bị hại rất nặng. Tại Kon Tum, năm 2001 có khoảng 1000 ha rừng keo lai 2 tuổi bị nhiễm bệnh loét thân, thối vỏ và dẫn đến khô ngọn, với tỷ lệ bị bệnh khác nhau ở các địa phương. Tỷ lệ bị bệnh nặng nhất ở Ngọc Tụ, Ngọc Hồi, Kon Tum lên đến 90% cây b ị chết ngọn. Trong đó, nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc là một loài nấm gây bệnh khá phổ biến ở các vùng trồng keo lai của cả nước, với triệu chứng đốm lá, khô cành ngọn đã ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và năng suất của rừng trồng [18], [21]. Áp dụng biện pháp hóa học để phòng trừ bệnh cho rừng trồng là không khả thi khi diện tích rừng trồng lớn và gây ảnh hưởng đến môi trường sinh thái. Nghiên cứu giảm thiểu ảnh hưởng của bệnh bằng biện pháp chọn giống và sinh học đã được các nhà khoa học quan tâm. Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn tiền nhân, sống trong mô của thực vật mà không gây bệnh cho cây chủ (Willson 1995) Một số vi sinh vật nội sinh có hoạt tính sinh học tạo ra các chất kháng sinh đối kháng với các sinh vật gây bệnh cho cây chủ cũng đã được nghiên cứu (Phạm Quang Thu và Trần Thanh Trăng năm 2002) [20]. Để góp phần quản lý dịch bệnh hại keo Acacia có hiệu quả, trong khuôn khổ của một luận văn tốt nghiệp tôi đã tiến hành nghiên cứu, điều tra về chủng loại và mật độ của các vi khuẩn nội sinh có hoạt tính đối kháng với nấm gây bệnh trên các cây chủ ở các cấp bệnh hại khác nhau từ đó làm sáng tỏ vai trò của vi khuẩn nội sinh trong việc bảo vệ cây chủ từ sự xâm nhiễm của sinh vật gây bệnh và ứng dụng chúng trong phòng trừ bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. gây hại. Trên cơ sở đó tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai (Acacia auriculiformis x Acacia mangium) do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. gây hại tại Lâm trƣờng Tam Thắng, huyện Thanh Sơn, Phú Thọ” Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Bệnh cây rừng đã được bắt đầu nghiên cứu trên 150 năm nay, là một môn khoa học có nhiều cống hiến cho công tác nghiên cứu, phục vụ cho đời sống sản xuất thực tiễn. Những năm ở thập kỷ 50 của thế kỷ XX, nhiều nhà bệnh cây đã tập trung vào việc xác định loài, mô tả nguyên nhân gây bệnh và điều kiện phát sinh, phát triển của bệnh. Đặc biệt ở các nước nhiệt đới, Roger L. (1953) [36] đã nghiên cứu các loại bệnh hại cây rừng được mô tả trong cuốn sách bệnh cây rừng các nước nhiệt đới (Phytopathologie des pays chauds). Trong đó có một số bệnh hại lá của thông, keo, bạch đàn …. John Boyce (1961) [30] xuất bản sách Bệnh cây rừng (Forest pathology) đã mô tả một số bệnh hại cây rừng. Cuốn sách này được xuất bản ở nhiều nước như: Anh, Mỹ, Canada. 1.1.1. Nghiên cứu về bệnh hại keo Roger L. (1954) [36] đã nghiên cứu một số bệnh hại trên cây keo. Cây keo khô héo làm lá rụng và tàn lụi từ trên xuống dưới (chết ngược) do loài nấm hại lá Glomerella cingulata (giai đoạn vô tính là Collectotrichum gloeosporioides) đó là nguyên nhân chủ yếu của sự thiệt hại với loài Keo tai tượng Acacia mangium trong vườn giống ở Papua New Guinea (FAO, 1981). Tại Malaysia, theo nghiên cứu của Lee (1993) [33] loài nấm này còn gây hại với các loài keo khác. Nhiều nhà nghiên cứu của Ấn Độ, Malaysia, Philipin, Trung Quốc cũng công bố nhiều loại nấm bệnh hại keo. Roger L. (1953) [36] Tại hội nghị lần thứ III nhóm tư vấn nghiên cứu và phát triển của các loài Acacia, họp tại Đài Loan Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 cuối tháng 6 năm 1964 nhiều đại biểu kể cả các tổ chức Quốc tế như CIFOR cũng như đã đề cập đến các vấn đề sâu bệnh hại các loài keo Acacia. Các nghiên cứu về các loại bệnh ở keo Acacia cũng đã được tập hợp khá đầy đủ vào cuốn sách “Cẩm nang bệnh keo nhiệt đới ở Ôxtrâylia, Đông Nam Á và Ấn Độ” bản tiếng Anh có tên là A Manual of Diseases of Tropical Acacias in Australia, South-east Asia and India (Old, K.M. et al, 2000) [35]. Cuốn sách đã đề cập đến các bệnh khá quen thuộc đã từng gặp ở nước ta như bệnh phấn trắng (powdery mildew), bệnh đốm lá, bệnh phấn hồng (pink disease) và rỗng ruột (heart rot). 1.1.2. Nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh Đã có rất nhiều nhà khoa học đi sâu nghiên cứu về vi khuẩn và đặc biệt là vi khuẩn sống nội sinh trong mô của thực vật. Phần lớn các loài vi khuẩn nội sinh có hoạt tính sinh học, tạo ra chất kháng sinh quan trọng để ngăn chặn sự xâm nhập của sinh vật gây bệnh gây ra đối với cây chủ, trong đó có cây lâm nghiệp và nông nghiệp. Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng các chủng vi khuẩn nội sinh để bảo vệ cây trồng là vấn đề rất quan trọng và đã được nhiều nước trên thế giới quan tâm. Năm 1955 trên thế giới chỉ tìm ra được 500 chất kháng sinh thì 20 năm sau, năm 1975 đã tìm ra được 5.000 chất kháng sinh. Hiện nay nói chung trên thế giới đã biết được hơn 13.000 chất kháng sinh được sản xuất từ thiên nhiên (Berdy 1984). Sau đây là một số công trình nghiên cứu tiêu biểu về vi khuẩn nội sinh có khả năng sản sinh ra chất kháng sinh trong quá trình trao đổi chất được dùng để phòng trừ bệnh hại cây trồng. Theo Willson (1995) vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn tiền nhân sống trong mô của thực vật mà không gây bệnh cho cây chủ. Vi khuẩn nội sinh tìm thấy ở nhiều loài cây và cũng giống như các loài vi khuẩn sống trong đất, nước như: Pseudomonas, Bacillus và Azospirillum. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Chanway (1996) [31] tiến hành phân lập và định danh các loài vi khuẩn sống ở trong mô của thực vật của 2 loài thông: thông (Pinus radiata) và thông đỏ (Thuija plicata). L. Araujo và cộng sự (2002) đã tiến hành biện pháp phòng trừ sinh học bằng việc sử dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Bacillus sp., được phân lập từ mô thực vật. Ông và cộng sự đã đi sâu vào nghiên cứu các loài vi khuẩn sống trong mô của thực vật để tìm ra các chất kháng sinh có khả năng kiềm chế các nguồn gây bệnh ở cây trồng bằng phương pháp sinh học nhằm làm giảm bớt tác động đến môi trường, bởi hiện nay con người đang sử dụng rất nhiều chất hoá học để phòng trừ bệnh cây và côn trùng gây hại trên các cánh đồng. Với phương pháp này nhóm của ông đã phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn nội sinh được lựa chọn trong các giống cam, quýt nghiên cứu để tìm ra các chất kháng sinh mới có hiệu lực cao trong việc phòng trừ nấm bệnh. Jinwi Kim (2000) [32] tách chất ức chế B-lactamase từ vi khuẩn sống trong mô thực vật. Tác giả đã phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sống trong mô của 25 loài thực vật khác nhau và phân lập được 600 chủng vi khuẩn. Trong đó đã tìm ra được 10 chủng có hiệu lực cao, đó là KJ3, Z3, PQ, RV2, HL2, CL21, PG5, GB5, GB18, AS3, S21 có khả năng chống lại hoạt động của nấm Candida albicans, trong đó lựa chọn được 2 chủng vi khuẩn Z3, RV2 có khả năng sinh ra chất kháng sinh -lactamase. Chủng vi khuẩn Z3 được lựa chọn để sản xuất với quy mô lớn. Chủng Z3 được phân lập từ rễ của cây gừng chống lại nấm C. albicans, nhưng không chống lại được nấm Aspergillus và nấm Fusarium. Miss Yuparet Puangmali (1999) [34] đã phân lập và tuyển chọn một số loài vi khuẩn sống trong mô của cây cỏ có khả năng sản xuất ra chất kháng sinh L- sparaginase. Tác giả đã phân lập được 657 loài vi khuẩn từ những cây thân thảo để sản xuất ra L-sparaginase. Trong đó ông tìm ra được 220 loài vi khuẩn có hiệu lực mạnh để thử nghiệm. Nhóm vi khuẩn CMU - HB - 63, tạo ra chất kháng sinh lớn nhất trong môi trường; CMC 0.6% (w/v), KH2PO4 0.3% (w/v), Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 NaCl 0.05% (w/v), 1M MgSO4.7 H2O 0.2% (w/v), 0.1M CaCl2.2 H2O 0.1% với pH = 7. Sử dụng 0.2% số lượng vi khuẩn để trong tủ lắc ở nhiệt độ 45 o C với tốc độ 175 vòng/phút trong vòng 48 giờ. Vi khuẩn này hoạt động để sinh ra chất kháng sinh L - Asparaginase ở 50.24 mU/ml và hoạt động có hiệu quả ở 202.58 mU/ml. Đã ứng dụng bằng cách tiêm chủng vi khuẩn vào cây để cây xúc tiến sinh trưởng và kiểm soát bệnh. Các thí nghiệm của ông với 2 cây là cà chua và cây dưa chuột đã đem lại hiệu quả ức chế một số loại mầm bệnh và giảm mức độ bị bệnh. Mầm bệnh ông sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Pythium ultimum, Rhizoctonia, Fusarium oxysporum, Pseuodomonas syringe, Colletotrichum orbiculore, Erwinia teracheiphila và thể khảm do virus ở cây dưa chuột. Nhận xét: Việc sử dụng vi sinh vật để phòng trừ bệnh cây ở trên thế giới đã nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất đạt hiệu quả cao. Đã có rất nhiều nhà khoa học đi sâu nghiên cứu về vi khuẩn và đặc biệt là vi khuẩn sống nội sinh trong mô của thực vật. Các nhà khoa học đã tìm thấy một số loài vi khuẩn nội sinh có hoạt tính sinh học cao, tạo ra chất kháng sinh quan trọng để ngăn chặn sự xâm nhập của sinh vật gây bệnh gây ra đối với cây chủ, trong đó có cây lâm nghiệp, nông nghiệp và cây ăn quả. Bằng phương pháp sinh học này đã làm giảm bớt tác động xấu đến môi trường, bởi hiện nay con người đang sử dụng rất nhiều chất hoá học để phòng trừ bệnh cây và côn trùng gây hại. 1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nƣớc 1.2.1. Nghiên cứu về bệnh hại cây rừng Vào cuối những năm 1980 đầu những năm 1990, bệnh dịch cháy lá, chết ngọn bạch đàn (die - back) đã xuất hiện trên diện rộng và là mối đe dọa lớn cho các nhà trồng rừng trên khắp cả nước, đặc biệt là vùng Đông Nam Bộ và miền Trung (Quảng Nam, Đà Nẵng và Huế). Nguyễn Hoàng Nghĩa (1997) [12] cho thấy diện tích rừng bạch đàn bị nấm lá tấn công đã lên tới 50% tổng diện tích, với các mức độ hại khác nhau và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 đều cảnh báo nguy cơ gây hại lớn của bệnh đối với các rừng trồng tập trung và đề xuất các định hướng nghiên cứu. Dự án mang tên “Giảm thiểu tác động của bệnh bạch đàn ở vùng Đông Nam Á” ACIAR PN 9441 do Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế của Ôxtrâylia (ACIAR) tài trợ đã bắt đầu được triển khai tại Việt Nam, Thái Lan và Ôxtrâylia. Dự án được Viện Khoa học Lâm nghiệp triển khai tại Việt Nam. Cho tới khi kết thúc dự án vào cuối năm 2000, dự án đã đặt nền móng cho định hướng nghiên cứu về bệnh và mở đầu các nghiên cứu về chọn giống bạch đàn kháng bệnh ở nước ta. Bước đầu dự án đã tìm hiểu được các loài nấm hại, điều tra đánh giá mức độ nhiễm bệnh và ảnh hưởng của loài, xuất xứ cũng như các gia đình đối với nấm hại. Tuy nhiên việc xác định, tuyển chọn được các loài, xuất xứ kháng bệnh mới chỉ là bước đi đầu tiên trong khi tuyển chọn các gia đình và các dòng kháng bệnh mới là mục tiêu lâu dài cần được đầu tư. Các kết quả bước đầu của dự án đã được thông báo tại Hội thảo dự án bệnh bạch đàn được tổ chức vào tháng 11 năm 2000 tại TP Hồ Chí Minh (Nguyễn Hoàng Nghĩa (2000); Phạm Quang Thu (2000). Cho tới giữa những năm 1980, Keo lá tràm là loài keo được trồng rộng rãi nhất ở các tỉnh phía Nam. Hiện nay trong Vườn thực vật của Trung tâm Khoa học Sản xuất Lâm nghiệp Đông Nam Bộ nằm trên địa phận thị trấn Trảng Bom, huyện Thống Nhất, tỉnh Đồng Nai còn tồn tại hai hàng Keo lá tràm được trồng từ đầu những năm 1960, thuộc loại lớn tuổi nhất của nước ta (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1992). Cây có chiều cao khoảng trên dưới 20 m và đường kính 40 - 60 cm. Cây to nhất có đường kính đạt tới 80 cm, thậm chí có cây hai thân, mỗi thân có đường kính 50 cm. Sau này, loài keo này cũng đã trở nên quen thuộc trong các chương trình trồng rừng ở các tỉnh phía Bắc. Từ đầu những năm 1980 trở lại đây, nhiều loài keo đã được nhập về thử nghiệm ở nước ta như Keo tai tượng (A. mangium), Keo lá liềm (A. crassicarpa), Keo đa thân (A. aulacocarpa), Keo bụi (A. cincinnata), Keo lá sim Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 (A. holosericea) và sau này là keo lai tự nhiên được phát hiện và chủ động lai tạo (Sedgley et al., 1992) Mùa xuân năm 1990, các xuất xứ Keo tai tượng và Keo lá tràm gieo tại vườn ươm Chèm, Từ Liêm, Hà Nội đã bị bệnh phấn trắng lá với các mức độ khác nhau. Nhìn bề ngoài, lá keo như bị rắc một lớp phấn trắng hay vôi bột. Mức độ bệnh đã được đánh giá qua quan sát bằng mắt thường và được xếp theo thứ tự nặng hay nhẹ. Nhìn chung bệnh đã chưa gây nên ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng của cây con tại vườm ươm và khi đó cũng không có điều kiện để tìm hiểu sâu hơn về nguồn gốc bệnh và các vấn đề có liên quan (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1997) [12]. Một vài năm gần đây khi diện tích gây trồng keo đã tăng lên đáng kể (gần 230.000 ha vào cuối năm 1999) thì cũng đã xuất hiện bệnh ở rừng trồng. Tại Đạ Tẻh (Lâm Đồng) Keo tai tượng trồng thuần loài trên diện tích 400 ha đã có 118,5 ha bị bệnh với tỷ lệ từ 7 - 59% trong đó có một số diện tích bị khá nặng (Phạm Quang Thu, 2002) [21]. Tại Bầu Bàng, Bình Dương một số dòng keo lai đã bị mắc bệnh phấn hồng (Pink Disease) với tỷ lệ mắc và mức độ bệnh khá cao gây thiệt hại cho sản xuất. Tại Kon Tum năm 2001 có khoảng 1000 ha rừng keo lai 2 tuổi bị nhiễm bệnh loét thân, thối vỏ và dẫn đến khô ngọn. Tỷ lệ nặng nhất là ở Ngọc Tụ, Ngọc Hồi (Kon Tum) lên đến 90% số cây bị chết ngọn [18] 1.2.2. Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bằng sinh học Biện pháp phòng trừ các loại nấm bệnh bằng các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ nấm và vi khuẩn đã được rất nhiều nhà khoa học trong nước nghiên cứu và áp dụng. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty và Lê Mai Hương (1998) [5] đã sử dụng xạ khuẩn để phòng chống bệnh thối cổ rễ cây thông con ở vườn ươm do nấm Fusarium oxysporum gây ra. Phạm Văn Mạch (1991) [8] trong công trình nghiên cứu của mình đã sử dụng các chủng Tricoderma spp., xạ khuẩn Streptomyces spp. để phòng chống bệnh thối cổ rễ cây thông con vườn ươm. Tuy nhiên những nghiên cứu này mới dừng lại ở những thí nghiệm các chủng nấm và xạ khuẩn đều được phân lập từ đất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 Phạm Quang Thu (2002) [19], [20] sử dụng vi sinh vật nội sinh thực vật có khả năng ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh cây rừng đã được nghiên cứu ở Việt Nam từ năm 2002, tác giả đã đi sâu vào nghiên cứu khả năng tương tác của các vi sinh vật có khả năng ức chế sinh vật gây bệnh với các loài sinh vật đặc thù khác nhau như vi sinh vật phân giải lân, vi sinh vật kích thích sinh trưởng, vi sinh vật cố định đạm hội sinh và cộng sinh, vi sinh vật đối kháng với nấm gây bệnh...để tạo ra chế phẩm hỗn hợp được gọi là “phân vi sinh chức năng”. Phân vi sinh chức năng này đã được nghiên cứu và sản xuất thử cho từng đối tượng cây trồng như: cây Bông, cây Đậu, cây Cà chua, cây Điều và một số cây khác như cây keo, cây Thông nhựa, Thông mã vĩ. Phạm Quang Thu, Trần Thanh Trăng (2002) [20] đã phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng với nấm gây bệnh cây thông con ở vườn ươm, với 12 loài cây dùng làm mẫu để phân lập vi khuẩn đã phân lập được 70 chủng vi khuẩn khác nhau và đã tuyển chọn được 11 chủng vi khuẩn có hiệu lực đối kháng với nấm gây bệnh thối cổ rễ Fusarium oxysporum. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Phạm Quang Thu, 2006 [13] Vai trò của vi khuẩn nội sinh trong cơ chế kháng bệnh loét thân, cành do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. gây bệnh hại đối với keo lai. Nhận xét: Việc sử dụng vi sinh vật để phòng trừ bệnh cây trồng ở Việt Nam cũng đã được nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất trong hệ thống các biện pháp phòng trừ tổng hợp. Việc phân lập, tuyển chọn chủng có hiệu lực cao và sử dụng chúng trong phòng trừ bệnh cây rừng đã được nghiên cứu và áp dụng vào sản xuất. Nghiên cứu này đi sâu vào việc phân lập và xác định vi khuẩn nội sinh cây keo lai trồng tại Phú Thọ và thí nghiệm sử dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng trừ bệnh đốm lá, khô cành ngọn do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. gây hại. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Chương 2 ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN - KINH TẾ - XÃ HỘI KHU VỰC NGHIÊN CỨU 2.1. Điều kiện tự nhiên khu vực nghiên cứu - Thanh Sơn diện đất tích tự nhiên 62063 ha chiếm tới 37,8% diện tích của toàn tỉnh, trong đó có 31000 ha đất rừng tự nhiên, gần 6000 ha đất trồng trọt nông nghiệp còn lại là đất lâm nghiệp và rừng phòng hộ. 2.2. Địa hình, thổ nhƣỡng - Là huyện miền núi có địa hình phức tạp bị chia cắt bởi nhiều sông suối và những dẫy núi cao. - Nhóm đất phát triển tại chỗ: Các loại đất feralit phát triển trên một số loại đá mẹ như đá biến chất, sa thạch, gran._.it, đá vôi phù hợp cho trồng cây lâm nghiệp, nông nghiệp. 2.3. Khí hậu thuỷ văn Khí hậu: Theo số liệu của trạm khí tượng thuỷ văn tỉnh Phú Thọ từ năm (1995- 2006) bình quân về nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa trong năm (Bảng 2.1) cho biết khu vực Thanh Sơn, Phú Thọ thuộc tiểu vùng khí hậu 3 của miền Bắc Việt Nam, có 2 mùa rõ rệt. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Bảng 2.1: Tài liệu khí tượng thuỷ văn khu vực nghiên cứu Các tháng trong năm Nhiệt độ ( o C) Độ ẩm (%) Lượng mưa (mm) Gió (m/s) 1 15,3 85,3 20,9 6,7 2 18,9 88,0 35,1 7,0 3 19,4 87,0 42,4 6,7 4 24,1 86,7 139,2 8,3 5 26,8 85,3 243,4 8,3 6 27,6 88,0 242,5 8,0 7 28,2 88,3 350,7 8,0 8 28,3 89,7 368,9 8,0 9 27,0 88,7 93,0 7,0 10 21,8 87,3 28,1 6,3 11 22,8 88,0 43,1 6,3 12 18,4 85,7 17,8 6.7 TB 23,44 87,42 135,81 7,28 (Nguồn phòng nông nghiệp huyện Thanh Sơn năm 2006) 2.4. Điều kiện kinh tế - xã hội 2.4.1. Điều kiện kinh tế Ngay từ Đại hội Đảng bộ huyện lần thứ 22 đã xác định cơ cấu kinh tế của Thanh Sơn là Lâm - Nông nghiệp và thương mại, dịch vụ. Đại hội Đảng bộ huyện lần thứ 23 tiếp tục khẳng định: Phát huy nội lực, lợi thế, tiềm năng, đẩy nhanh phát triển KT-XH với nhịp độ cao và vững chắc; chuyển dịch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 cơ cấu kinh tế, cơ cấu lao động theo hướng công nghiệp hóa, hiện đại hóa; Phát triển nông lâm nghiệp toàn diện, tạo vùng kinh tế tập trung, đưa chăn nuôi trở thành ngành sản xuất chính, coi trọng phát triển công nghiệp, tiểu thủ công nghiệp; tạo bước phát triển vượt bậc về dịch vụ, du lịch, xây dựng kết cấu hạ tầng. Bám sát định hướng đúng đắn đó, bằng những nỗ lực trong chỉ đạo thực hiện các chương trình kinh tế, kết thúc năm 2007, Huyện Thanh Sơn đã đạt giá trị sản xuất gần 550 tỷ đồng. Nông lâm thủy sản chiếm 40%; công nghiệp - xây dựng chiếm 39,5%; dịch vụ chiếm 20,5% trong cơ cấu kinh tế. Đáng chú ý là có cấu kinh tế đã có bước chuyển hết sức tích cực. So với năm 2006, giá trị sản xuất nông lâm nghiệp, thủy sản tăng 2,7%; công nghiệp - xây dựng tăng 13,1%. Đặc biệt, dịch vụ thương mại tăng tới 16%. Tỷ lệ hộ nghèo còn 37,87%, giảm 5,76%/năm. Sản xuất nông - lâm nghiệp Huyện Thanh Sơn có rất ít diện tích canh tác nông nghiệp lại phân tán, rất khó cho tưới tiêu. Toàn huyện có trên 148 công trình thủy lợi với trên hai trăm km kênh mương, song hàng năm luôn bị thiên tai đe dọa. Khâu thủy lợi chưa thể chủ động tưới tiêu trên toàn bộ diện tích. Hàng năm huyện tập trung chỉ đạo nông dân cố gắng làm mùa hết diện tích và mở rộng trồng ngô vụ đông. Tuy nhiên, do thiên tai nên sản lượng lương thực không ổn định. Như vậy vấn đề an ninh lương thực, đảm bảo đời sống người dân không thể trông chờ hoàn toàn vào nông nghiệp mà phải cả từ việc khai thác nguồn lực dồi dào từ đất rừng, trồng cây đặc dụng phòng hộ kết hợp cây kinh tế, cây công nghiệp dài ngày và chăn nuôi. Những năm qua, lợi ích từ nghề rừng đối với Thanh Sơn đã quá rõ ràng. Đất rừng đã được giao cho các hộ công nhân, nông dân, bởi vậy cho dù là khu vực do các Nông lâm trường, các xã, bản, động vùng sâu vùng xa, đất và rừng đều đã có chủ - đương nhiên chủ rừng được hưởng lợi từ kinh tế rừng. Tuy nhiên làm gì để khai thác tốt nhất hiệu quả tài nguyên đất thì cần phải có những giải pháp tích cực phù hợp. Trước hết, huyện chỉ đạo chuyển mục đích sử dụng đất theo hướng xác định các diện tích rừng phòng hộ ít xung yếu, không xung yếu chuyển sang trồng rừng kinh tế. Qua kết quả điều tra khảo sát, huyện có sự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 chỉ đạo tích cực với từng xã để chuyển sang trồng rừng kinh tế với các cây bản địa có lợi ích kinh tế lâu dài như trám, chò, lát trên những diện tích có thể. Cây chè - cây công nghiệp dài ngày được xác định là cây xóa đói giảm nghèo và làm giầu cho người nông dân được chỉ đạo phát triển cả về diện tích và chất lượng. Diện tích chè hiện có trên 1.400 ha, trong đó gần 1/3 của công ty chè Phú Đa cho năng suất, chất lượng cao. Người nông dân đã và sẽ tiếp tục được hỗ trợ bằng nguồn tiền dự án để trồng cây chè lai cho năng suất, chất lượng tốt hơn thay cho giống chè cũ năm 2008, bằng các nguồn. Thanh Sơn có trên 62000 ha đất tự nhiên thì phần nhiều là diện tích rừng phòng hộ cần giữ bảo vệ. Chính trên diện tích này lại có thế mạnh phát triển chăn nuôi đại gia súc. Huyện ủy đã ra nghị quyết chuyên đề về thực hiện đề án phát triển chăn nuôi đại gia súc, trong đó tăng số lượng và chất lượng đàn bò, giữ ổn định đồng thời cải tạo đàn trâu. Việc phát triển đàn gia súc được huyện chỉ đạo thực hiện bằng cách khoanh vùng chăn nuôi, trâu, bò và dê. Riêng đàn bò sẽ có những giải pháp tích cực để cải tạo nâng cao chất lượng theo hướng sinh hóa. Mục tiêu tới năm 2010, toàn huyện sẽ có khoảng 8-10 vạn trâu. 2.4.2. Điều kiện xã hội Thanh Sơn là huyện miền núi có rất nhiều khó khăn hiện có 10 dân tộc anh em cùng sinh sống, trong đó có tới gần 60% số khẩu là dân tộc ít người. Tư tưởng trông chờ ỉ lại vào Nhà nước còn nặng nề; hạn chế về trình độ, năng lực của đội ngũ cán bộ khiến cho việc tiếp thu, ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật chăn nuôi, trồng trọt ở cơ sở chưa được phát huy tối đa. Bên cạnh những khó khăn, Thanh Sơn cũng có những lợi thế nhất định. Huyện có các tuyến quốc lộ đi qua, nối liền Thủ đô Hà Nội với các tỉnh phía Tây Bắc tạo lợi thế hơn hẳn nhiều địa phương trong tỉnh về phát triển kinh tế hàng hóa. Thanh Sơn cũng là địa phương tập trung nhiều mỏ khoáng sản đã được cấp phép khai thác. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 Chương 3 MỤC TIÊU - ĐỐI TƢỢNG - THỜI GIAN - ĐỊA ĐIỂM - NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Mục tiêu nghiên cứu - Bước đầu tìm hiểu cơ chế chống chịu bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội sinh có khả năng ức chế, tiêu diệt nấm gây bệnh. - Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh cho cây keo lai. 3.2. Địa điểm nghiên cứu - Lấy mẫu bệnh ở rừng trồng keo lai tại Lâm trường Tam Thắng, huyện Thanh Sơn, Phú Thọ. - Phân lập vi khuẩn nội sinh được tiến hành tại phòng Nghiên cứu Bảo vệ thực vật rừng Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam. - Thí nghiệm sử dụng vi khuẩn nội sinh phân lập được để phòng trừ bệnh tại vườn ươm Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam. 3.2.2. Thời gian nghiên cứu - Luận văn được thực hiện từ 13/3/2007 đến ngày 15/9/2008. 3.2.3. Đối tƣợng nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu là các loài vi khuẩn nội sinh trong mô thực vật ở keo lai (Acacia auriculiformis x Acacia mangium) - Nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 3.3. Nội dung nghiên cứu 3.3.1. Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh hƣởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu - Thu thập mẫu bệnh và mô tả triệu chứng bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai - Phân lập mẫu bệnh - Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm - Giám định nguyên nhân gây bệnh - Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. trên môi trường dinh dưỡng PDA - Đánh giá ảnh hưởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu. 3.3.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp bệnh 3.3.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc - Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội sinh - Mô tả đặc điểm của các chủng vi khuẩn nội sinh có hiệu lực. 3.3.4. Đánh giá mối quan hệ giữa vi khuẩn nội sinh với cây chủ ở các cấp bị bệnh khác nhau 3.3.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai - Nhân sinh khối sản xuất chế phẩm - Thử nghiệm hiệu lực của khuẩn nội sinh trong phòng thí nghiệm - Thử nghiệm hiệu lực của khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh ngoài vườn ươm. - Ứng dụng hiệu lực khuẩn đối với rừng non keo lai 1 tuổi - Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh đến sinh trưởng của cây keo lai ở vườn ươm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 - Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh đến sinh trưởng của cây keo lai ở giai đoạn rừng trồng non (1 tuổi). 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh hƣởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu 3.4.1.1. Thu thập mẫu bệnh và mô tả triệu chứng bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai Chọn các cây keo lai có triệu trứng bệnh, thể hiện về mặt hình thái đầu tiên lá đốm nhỏ sau vết đốm to dần lên, lá bị cháy và chết từ trên ngọn xuống. Cây vừa mới bị bệnh càng tốt. Lấy 15 mẫu, bọc mẫu bằng giấy báo cho vào túi ni lông để đem về phòng thí nghiệm. Quan sát triệu chứng bằng mắt thường hoặc kính lúp các đặc điểm bên ngoài của thân, cành, lá bị bệnh như biến đổi về màu sắc chỗ thân cành bị bệnh, bệnh trạng, sự phân bố bệnh trạng trên thân cành. Mô tả và chụp ảnh thân, cành, lá bị bệnh. Trong trường hợp cơ quan sinh sản của vật gây bệnh chưa xuất hiện thì có thể dùng phương pháp giữ ẩm của Naumov, mẫu thân cành bị bệnh để trong hộp petri có giấy hút ẩm để vật gây bệnh hình thành cơ quan sinh sản. Đối với trường hợp trên thân cành, lá xuất hiện cơ quan sinh sản có thể lấy trực tiếp vật gây bệnh trên mẫu bệnh. 3.4.1.2. Phân lập mẫu bệnh Có 2 phương pháp phân lập: Phương pháp 1: Phân lập trực tiếp trên môi trường PDA. Lấy phần thân b ị bệnh của cây keo, tiến hành rửa sạch bằng nước cất vô trùng, sau đó khử trùng bề mặt bằng cồn 70 0 rồi rửa lại 2 - 3 lần bằng nước cất vô trùng. Sau khi đã khử trùng mẫu bệnh xong thì cắt thành từng đoạn nhỏ 5 - Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 7(cm) rồi cấy trên môi trường PDA được đựng trong hộp lồng. Đặt các hộp lồng đã cấy mẫu bệnh này trong tủ định ôn ở nhiệt độ 28 0 C trong khoảng 2 - 3 ngày để cho sợi nấm phát triển mọc trên môi trường. Khi nấm đã mọc ra ngoài môi trường PDA ta tiến hành cấy chuyển nấm này sang các hộp lồng khác có chứa PDA để thuần khiết nấm bệnh. Phương pháp 2: Để trong hộp lồng ẩm. Lấy cành bị bệnh cắt thành các đoạn nhỏ khoảng 5 - 7 cm cho vào hộp lồng đã được làm ẩm (dùng hộp lồng đã được khử trùng, sau đó để giấy ẩm vào trong) hộp lồng cần có độ ẩm thích hợp không được ẩm quá cũng như khô quá (để tạo môi trường thích hợp cho sự phát triển của nấm bệnh), tiếp theo dùng băng keo quấn 2 đến 3 vòng, để hộp lồng trong vòng 2 - 3 ngày thấy trên cành được làm ẩm, xuất hiện các vết bệnh màu đen, để hộp lồng càng lâu ngày thì cành làm ẩm càng đen là do sự phát triển của nấm bệnh (lưu ý cành được làm ẩm phải là cành có vết bệnh, nếu vết bệnh càng mới thì càng tốt, thường ta lấy cành làm ẩm ở cấp bệnh từ II - IV. Khi đã thấy sự phát triển của nấm bệnh thì tiến hành cấy nấm trên môi trường PDA, cách cấy như sau: Trước tiên đưa hộp lồng có chứa cành làm ẩm lên kính hiển vi soi để tìm sợi nấm bào tử, dùng kim nhọn bằng sắt đã qua khử trùng hớt nhẹ phần sợi bào tử trên cành làm ẩm, cho đầu kim sắt đã dính nấm bệnh đó vào hộp lồng có chứa môi trường PDA và dùng băng keo quấn hộp lồng lại, để hộp lồng vào tủ bảo quản và theo dõi sự phát triển của nấm bệnh. Khi sợi nấm bắt đầu mọc, cấy truyền sang môi trường dinh dưỡng mới. 3.4.1.3. Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo là phương pháp kiểm tra và khẳng định được loài nấm phân lập từ các tổ chức bị bệnh trên thân, cành có chính xác hay không. Phương pháp thí nghiệm: Lấy bào tử từ cơ quan sinh sản của nấm bằng que cấy inox được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, cho bào tử nấm vào cốc nước vô trùng pha loãng tới hạn đến mật độ khoảng 1.10 6 tế bào/ml. Rồi tiến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 hành nhúng các mẫu lá keo vào cốc nước bào tử đó, sau đó để lá vào trong hộp lồng petri giữ ẩm, mỗi hộp để 3 lá và băng keo lại xung quanh hộp. Theo dõi thời gian bệnh xuất hiện và kiểm tra bào tử nấm trên các lá gây bệnh nhân tạo. 3.4.1.4. Giám định nguyên nhân gây bệnh Căn cứ vào nhữmg triệu chứng bệnh đã mô tả, đặc điểm hình thái bào tử quan sát trên kính hiển vi và tham khảo, đối chiếu với các tài liệu phân loại Zhao Liping (1983), F.G. Brown (1968) và Sutton B. (1980) để xác định loại nấm gây bệnh. 3.4.1.5. Sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. trên môi trƣờng dinh dƣỡng PDA Nghiên cứu sự sinh trưởng của sợi nấm được tiến hành trên môi trường dinh dưỡng PDA. Sau khi cấy nấm, nuôi nấm trong tủ định ôn với nhiệt độ 28 0 C. Đo đường kính phát triển nấm sau 24 giờ; 48 giờ và 72 giờ theo 2 chiều vuông góc. 3.4.1.6. Đánh giá ảnh hƣởng mức độ của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu Mục đích là để nắm vững tình hình phân bố, mức độ bị hại đồng thời nghiên cứu mối quan hệ giữa vật gây bệnh và cây chủ. Trong khu vực nghiên cứu tại các vị trí địa hình như chân, sườn, đỉnh, hướng phơi khác nhau... lập các ô tiêu chuẩn đại diện để điều tra, diện tích mỗi ô tiêu chuẩn là 1000 m 2 (40 m x 25 m), (dung lượng mẫu điều tra n 30). Sau khi điều tra trên ô tiêu chuẩn tỷ lệ và mức độ bị bệnh được tính toán như sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 * Điều tra tỷ lệ bị bệnh (P%) Trong mỗi ô tiêu chuẩn, đếm tổng số cây điều tra và số cây bị bệnh thân, cành hoặc lá trong ô. Tỷ lệ bị bệnh trong ô tiêu chuẩn được tính theo công thức như sau: P = 100x N n [3.01] Trong đó: P là tỷ lệ bị bệnh (%). n là số cây bị bệnh N là tổng số cây điều tra trong ô tiêu chuẩn Nếu : 0 < P < 5% Phân bố cá thể 5% ≤ P < 25% Phân bố cụm 25% ≤ P <50% Phân bố đám P ≥ 50% Phân bố đều * Mức độ bị bệnh: Điều tra toàn bộ số cây trong ô tiêu chuẩn (dung lượng mẫu n 30). Sau đó tiến hành điều tra ở toàn bộ thân, cành và tán của cây. Căn cứ vào diện tích bị hại ở thân, cành và lá để phân cấp bệnh, tiến hành phân cấp mức độ bị hại theo 5 cấp được đánh số từ 0 đến 4. Chỉ tiêu phân cấp mức độ bị hại theo Nguyễn Hoàng Nghĩa và Phạm Quang Thu năm 2006 [13]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 Mức độ bị hại Cấp bệnh Biểu hiện bên ngoài Không bị bệnh 0 Cây khoẻ, tán lá phát triển bình thường (Hình 3.01) Hại nhẹ 1 Dưới 25% tán lá b ị bệnh hoặc dưới 10% cành bị bệnh. (Hình 3.02) Hại trung bình 2 25 - 50% tán lá bị bệnh hoặc 10 - 25% cành bị bệnh. (Hình 3.03) Hại nặng 3 > 50 - 75% tán lá b ị bệnh hoặc > 25 - 50% cành bị bệnh. (Hình 3.04) Hại rất nặng 4 > 75% tán lá b ị bệnh hoặc trên 50% cành b ị bệnh. (Hình 3.05) Hình 3.01: Cây bị bệnh cấp 0 (cây khỏe, không bị bệnh) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Hình 3.02: Cây bị bệnh cấp 1 Hình 3.03: Cây bị bệnh cấp 2 Hình 3.04: Cây bị bệnh cấp 3 Hình 3.05: Cây bị bệnh cấp 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Mức độ bị bệnh được tính bình quân gia quyền theo số cây ở các chỉ số bệnh trong ô tiêu chuẩn. Chỉ tiêu phân cấp mức độ bị hại trong phòng thí nghiệm Ghi chú: Cấp 0: Không bị bệnh Cấp 1: < 10% diện tích lá bị bệnh Cấp 2: > 10 - 20% diện tích lá bị bệnh Cấp 3: > 20 - 30% diện tích lá bị bệnh Cấp 4: > 30% diện tích lá bị bệnh. - Tính mức độ bị bệnh chung cho mỗi chủng khuẩn. R = 1 . . i ni vi N V x100% [3.02] Trong đó: R: Là mức độ bị bệnh (Severity of attack) ni: Là số cây bị bệnh theo cấp bệnh i. vi: Là chỉ số của cấp bệnh i. n: Là tổng số cây điều tra trong ô tiêu chuẩn. V = 4. - Mức độ bị bệnh của toàn khu vực điều tra được tính theo công thức: Rtb = Ri n [3.03] Trong đó: Rtb là mức độ bị hại của toàn khu vực điều tra. Ri là mức độ bị hại của từng ô tiêu chuẩn. n là tổng số ô tiêu chuẩn. - Chỉ số tổn thất được xác định thông qua công thức sau: DI (%) = R% x P% [3.04] Trong đó: R (%) mức độ bị bệnh P (%) tỷ lệ bị bệnh Căn cứ vào trị số DI xác định được biện pháp phòng trừ: DI < 0,1 không cần phun thuốc phòng trừ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 0,1 ≤ DI < 0,25 cần loại bỏ lá, thân cành bệnh và phun thuốc phòng trừ 0,25 ≤ DI < 0,5 cần cắt bỏ lá và thân cành bệnh, loại bỏ cây bệnh nặng và phun thuốc phòng trừ DI ≥ 0,5 chặt bỏ cây bệnh 3.4.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp bệnh Trên các khu rừng trồng keo lai tại Lâm trường Tam Thắng, Thanh Sơn, Phú Thọ tiến hành phân cấp mức độ bị hại theo 5 cấp được đánh số từ 0 đến 4. Ở mỗi cấp bệnh khác nhau cần phải chọn ra 3 cây đặc trưng và tiêu biểu, mỗi cây lấy một mẫu (một cành) có đường kính 1 - 1,5 cm. Các cành được chọn có vị trí cành ít được chiếu sáng và đánh ký hiệu riêng cho từng cành. Phƣơng pháp phân lập Bƣớc 1: Chuẩn bị dụng cụ Rửa hộp lồng cho sạch sau đó để khô bọc kín bằng giấy báo và cho vào nồi hấp khử trùng ở 121 0 C tương đương với áp suất 1 atm trong thời gian 30 phút. Sau đó cho vào tủ sấy đặt ở nhiệt độ 110 0 C để qua đêm. Bƣớc 2: Chuẩn bị môi trƣờng Để phân lập vi khuẩn nội sinh cần chuẩn bị một số loại môi trường sau: Môi trƣờng PBS: NaCl : 8,5 gam KH2PO4 : 6,8 gam NaOH : 1,16 gam Nước cất : 1000 ml Điều chỉnh pH : 7 Sau khi pha được môi trường cho vào các ống nghiệm, các ống nghiệm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 cần phải nút bông chặt và miệng ống nghiệm được quấn bằng giấy, mỗi ống nghiệm là 9ml: hấp khử trùng ở 121 0 C trong thời gian 30 phút . Môi trƣờng PDA: Khoai tây : 200 gam D-Glucose : 20 gam Agar : 15-18 gam Nước cất :1000ml Khoai tây rửa sạch cắt thành miếng có kích thước 1x1x1cm cho vào nồi và đổ nước 1000 ml đun sôi, để 30 phút tính từ lúc sôi, lọc lấy nước trong, sau đó cho thêm nước cho đủ 1000 ml. Cho D-glucose và agar vào các bình tam giác 500 ml nút bông, quấn giấy đầu cổ bình (3 bình, mỗi bình 330 ml). Hấp khử trùng ở môi trường 121 0 C trong 30 phút rồi đổ ra hộp lồng để trong tủ cấy. Môi trƣờng nƣớc cất Rửa sạch các ống nghệm cho 9 ml nước vào các ống nghiệm nút bông vào miệng ống nghiệm được quấn bằng giấy. Cho vào nồi hấp khử trùng ở môi trường 121 0 C (tương đương với 1atm) trong 30 phút. Bƣớc 3: Cắt mẫu Lấy cành mẫu đã được chọn cắt thành từng đoạn nhỏ khoảng 7- 8 cm, khử trùng bằng cồn 75% trong 1 phút. Lấy ra hơ nhanh qua đèn cồn, sau đó cắt thành các lát mỏng có kích thước 0,5 - 1,0 (mm) ở 3 vị trí : phần vỏ (Bark) ký hiệu là B; phần tượng tầng (Phloem) ký hiệu là P; phần gỗ (Xylem) ký hiệu là X. Sau khi cắt xong cân mỗi phần 1 gam rồi cho vào ống nghiệm có chứa môi trường PBS nút bông và b ịt miệng ống nghiệm bằng giấy để qua đêm. Nếu phần tượng tầng của mẫu bệnh quá ít ta có thể lấy 0,5 gam của phần tượng tầng cho vào ống nghiệm chứa 4,5 ml môi trường PBS. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Bƣớc 4: Phân lập vi khuẩn nội sinh Phân lập vi khuẩn theo phương pháp pha loãng tới hạn. Dùng pipet lấy 0,1ml cho vào hộp lồng có chứa môi trường PDA, dùng que trang đều trên mặt thạch và ghi rõ ngày cấy và ký hiệu mẫu bệnh. Để các hộp lồng đã cấy vi khuẩn trong tủ định ôn với nhiệt độ 28 0 C, theo dõi sự xuất hiện của các khuẩn lạc đếm số lượng vi khuẩn có trong hộp lồng, có bao nhiêu chủng khác nhau, mô tả đặc điểm của mỗi chủng. Nếu mật độ vi khuẩn quá nhiều trên mỗi hộp lồng cần pha loãng đến 10 5 , 10 6 . Dùng que cấy tách ra từng chủng vi khuẩn khác nhau rồi cho ra một hộp lồng khác có chứa môi trường PDA (mỗi hộp một loại vi khuẩn), mỗi chủng cấy 2 hộp lồng, sau đó dùng băng keo quấn chặt. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn và đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn, mô tả đặc điểm của vi khuẩn khi nó được tách ra. Dựa vào hình thái, màu sắc, kích thước để nhận biết các loại vi khuẩn khác nhau và được thống kê các chủng phân lập được từ các mẫu thí nghiệm. 3.4.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 3.4.3.1. Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội sinh - Xác định các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm gây bệnh Sau phân lập được vi khuẩn thuần khiết chúng ta cấy nấm gây bệnh ở 3 góc của hộp lồng và cuốn kín hộp lồng rồi ghi rõ ngày tháng trên nắp hộp lồng giữ mẫu ở tủ định ôn. Sau 5 - 7 ngày thì tiến hành đánh giá hiệu lực của vi khuẩn đối với nấm gây bệnh trên môi trường PDA bằng việc đo đường kính vòng ức chế. Công thức đo đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm bệnh được tính bằng công thức: V (mm) = D (mm) - d (mm) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Trong đó: V (mm): đường kính trung bình vòng ức chế. D (mm): đường kính tính theo hai chiều từ tâm của hộp lồng đến mép trong của khuẩn lạc nấm bệnh. d (mm): đường kính trung bình của khuẩn lạc vi khuẩn tính theo hai chiều vuông góc. Căn cứ vào trị số V, xác định được chủng vi khuẩn có hiệu lực kháng nấm gây bệnh loét thân cành keo lai. Trị số V càng lớn, chủng vi khuẩn càng có hiệu lực mạnh. Những chủng khuẩn có hiệu lực đường kính trung bình vòng ức chế (V ≥ 20 mm). - Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn có hiệu lực cao Lấy 1ml dung d ịch khuẩn của các chủng có hiệu lực kháng nấm cao pha loãng với 9 ml nước cất đã hấp khử trùng theo phương pháp pha loãng tới hạn. Lấy 0,1 ml d ịch khuẩn đã pha loãng trang trên các hộp lồng chứa môi trường PDA. Đặt các hộp lồng đã cấy trong tủ định ôn ở 28 0 C trong 48 giờ. Đếm số lượng khuẩn lạc thu được trên các hộp lồng tính theo CFU/ml. Từ đó làm cơ sở cho việc xác định mật độ tối ưu để phòng trừ bệnh. 3.4.3.2. Mô tả đặc điểm của các chủng vi khuẩn nội sinh có hiệu lực Mô tả hình dạng, màu sắc, kích thước, các chủng khuẩn (bào tử và các thể quả). Khả năng sinh trưởng, phát triển của từng loại khuẩn trên môi trường PDA, khả năng kháng nấm của các chủng khuẩn có hiệu lực. 3.4.4. Đánh giá mối quan hệ giữa vi khuẩn nội sinh với cây chủ ở các cấp bị bệnh khác nhau để tìm hiểu về cơ chế Thu thập mẫu bệnh theo các cấp độ bị bệnh khác nhau. Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội sinh. So sánh và đánh giá hiệu lực các chủng khuẩn, mật độ khuẩn đối với các cây ở các cấp độ bệnh khác nhau. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 3.3.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai 3.4.5.1. Nhân sinh khối sản xuất chế phẩm Chuẩn bị môi trường PD để nhân sinh khối vi khuẩn sản xuất chế phẩm theo Nguyễn Lân Dũng (2002) [7]. Thành phần gồm: Khoai tây: 200 gam D- Glucose: 20 gam Nước : 1000 ml Khoai tây rửa sạch để cả vỏ, cắt thành khối có kích thước 1x1x1cm, cho vào đun cùng 1000 ml nước, đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nước trong, cho thêm nước để đủ 1000 ml. Sau đó cho D-glucose vào khuấy cho tan đều, cho vào mỗi bình tam giác nút bông và quấn giấy ở miệng bình. Hấp khử trùng ở 121 o C trong thời gian 20 phút. Sau khi hấp khử trùng để các bình môi trường vào trong tủ cấy, khử trùng các dụng cụ cần thiết và tiến hành trước ngọn lửa đèn cồn. Lấy từng loại chủng có hiệu lực, dùng que cấy khuẩn khử trùng lấy từng loại khuẩn cho vào mỗi bình môi trường. Với mỗi loại lấy 3 - 5 lần để đảm bảo lượng khuẩn đưa vào môi trường không quá ít. Nút bông lại và ghi rõ ký hiệu của từng loại. Cho các bình vào máy lắc, lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở 28 o C trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Sau khi lấy các bình đã lắc, lấy ở mỗi loại ra một ít làm mẫu đếm số bào tử hữu hiệu bằng cách: lấy 1ml dịch khuẩn pha loãng với 9 ml nước cất đã hấp khử trùng theo phương pháp pha loãng tới hạn. Lấy 1ml d ịch khuẩn đã pha loãng trên các hộp lồng chứa môi trường PDA. Đặt các hộp lồng đã cấy trong tủ định ôn ở 28 0 C trong 48 giờ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Đếm số lượng khuẩn lạc thu được trên các hộp lồng tính theo CFU/ ml. Từ đó biết được loại khuẩn nào sinh trưởng nhanh trên môi trường nuôi cấy thuần khiết. 3.4.5.2. Thử nghiệm hiệu lực phòng chống bệnh trong phòng thí nghiệm Phương pháp thí nghiệm: Lấy cành, lá non không bị bệnh lần lượt nhúng vào các cốc đựng dung dịch khuẩn trong vòng 30 phút, công thức đối chứng không nhúng mỗi một công thức có 3 hộp lồng. Lấy bào tử từ cơ quan sinh sản của nấm đã nuôi cấy trên môi trường PDA bằng que cấy inox được khử trùng trên ngọn đèn cồn, cho bào tử nấm vào cốc nước vô trùng tới khi mật độ đạt khoảng 1.10 6 tế bào/ml. Rồi tiến hành nhúng các mẫu lá keo nhiễm khuẩn vào cốc nước bào tử đó, sau đó để lá vào trong hộp lồng petri giữ ẩm, mỗi hộp để 3 lá và băng keo lại xung quanh hộp. Theo dõi và đánh giá mức độ bị bệnh ở mỗi công thức. Chỉ tiêu phân cấp mức độ bị hại trong phòng thí nghiệm Ghi chú: Cấp 0: Không bị bệnh Cấp 1: < 10% diện tích lá bị bệnh Cấp 2: >10 - 20% diện tích lá bị bệnh Cấp 3: >20 - 30% diện tích lá bị bệnh Cấp 4: > 30% diện tích lá bị bệnh. - Tính mức độ bị bệnh trung bình cho mỗi chủng khuẩn theo công thức Rtb = n Ri [3.05] Ri là tổng các cấp hại của một chủng khuẩn n là số mẫu thí nghiệm 3.4.5.3. Thử nghiệm hiệu lực phòng chống bệnh ngoài vƣờn ƣơm Thử nghiệm với 3 chủng khuẩn có hiệu lực cao trong phòng thí nghiệm, mỗi chủng khuẩn được tiến hành với 4 công thức ở các nồng độ khác nhau và 1 công thức đối chứng, mỗi công thức 30 cây, 3 lần lặp. Công thức 1: tiêm 05 ml dịch vi khuẩn mỗi loại, mật độ 10 5 tế bào/1ml Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Công thức 2: tiêm 10 ml dịch vi khuẩn mỗi loại, mật độ 10 5 tế bào/1ml Công thức 3: tiêm 15 ml dịch vi khuẩn mỗi loại, mật độ 10 5 tế bào/1ml Công thức 4: tiêm 20 ml dịch vi khuẩn mỗi loại, mật độ 10 5 tế bào/1ml Công thức 5: tiêm 10 ml nước cất vô trùng Sau 2 tuần phun ướt toàn bộ cây thí nghiệm ở các công thức bằng dung dịch nấm gây bệnh có mật độ 10 5 tế bào/1 ml. Theo dõi sau một thời gian đánh giá mức độ bị bệnh theo công thức [3.02] và sinh trưởng của cây keo lai như chiều cao vút ngọn (Hvn), đường kính cổ rễ (Dg) ... 3.4.5.4. Thử nghiệm hiệu lực phòng chống bệnh ở rừng non keo lai 1 tuổi Thí nghiệm được tiến hành tại vườn rừng của Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam với 5 công thức, mỗi công thức 30 cây, 3 lần lặp thời gian theo dõi trong vòng 60 ngày. Công thức 1: tiêm 20 ml dịch vi khuẩn, mật độ 10 5 tế bào/1ml Công thức 2: tiêm 30 ml dịch vi khuẩn, mật độ 10 5 tế bào/1ml Công thức 3: tiêm 40 ml dịch vi khuẩn, mật độ 10 5 tế bào/1ml Công thức 4: tiêm 50 ml dịch vi khuẩn, mật độ 10 5 tế bào/1ml Công thức 5: tiêm 20 ml nước cất vô trùng Sau 4 tuần nhiễm vi khuẩn nội sinh, phun ướt toàn bộ cây thí nghiệm ở các công thức bằng dung dịch nấm gây bệnh có mật độ 10 5 tế bào/1ml. Sau 4 tuần đánh giá mức độ bị bệnh ở các công thức thí nghiệm. Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến sinh trưởng (chiều cao, khối lượng tươi, khối lượng khô) của cây keo lai ở các công thức thí nghiệm. 3.4.5.5. Ảnh hƣởng của vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng của cây keo lai ở vƣờn ƣơm Tiến hành đo Hvn, Dg ở tất cả các cây có trong công thức sau đó tính toán và xử lý số liệu trên Excel để lấy các giá trị trung bình của lần lượt từng công thức và so sánh với công thức đối chứng. Tìm ra những chủng khuẩn có tác dụng cho sự sinh trưởng của cây keo lai trong giai đoạn vườn ươm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 3.4.6.5. Ảnh hƣởng của vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng của cây keo lai ở giai đoạn rừng non (1 tuổi) Thí nghiệm được tiến hành tại vườn rừng của Viện khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam (Đông Ngạc, Từ Liêm, Hà Nội) với số lượng 30 cây cho mỗi công thức. - Tiến hành đo Hvn bằng thước chuyên dùng, đường kính D1.3 cây có trong công thức sau đó tính toán và xử lý số liệu trên Exel 7.0. - Thu 30 cây keo lai một năm tuổi gồm (rễ, thân, cành, lá) ở lần lượt từng công thức đem cân các bộ phận ngay tại chỗ được sinh khối tươi. Sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 75 0 C trong khoảng thời gian từ 6 - 8 giờ. Trong quá trình sấy, kiểm tra trọng lượng của mẫu sau 2, 4, 6 và 8 giờ sấy. Nếu sau 3 lần kiểm tra thấy trọng lượng không đổi thì đó chính là trọng lượng khô của mẫu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Chương 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh hƣởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu 4.1.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh và triệu chứng bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai Bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai mới đầu trên lá keo thấy xuất hiện những vết đốm nhỏ màu nâu hoặc đen trên lá sau đó chúng lan dần ra gây khô cành ngọn những cây bị nặng dẫn đến chết. Trên mặt vỏ xuất hiện các đoạn đen nứt dọc. Chỗ vết bệnh thường xuất hiện các sợi nấm dọc tạo ra các vân đen. Cành bị bệnh thường có màu sắc không tươi như màu của cây khoẻ (Hình 4.01). Hình 4.01: Thân cành keo lai bị bệnh Khi bệnh nặng, vỏ khô dần, co thắt, nhăn nheo, mô vỏ bị bệnh thối mềm làm lá và cả ngọn cây bị héo (Hình 4.02). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Hình 4.02: Rừng trồng keo lai bị bệnh đốm lá, khô cành ngọn 4.1.2. Kết quả phân lập nấm bệnh Để ẩm cành bị bệnh từ 3 - 5 ngày và trên kính hiển vi quang học ta thấy thể quả nấm xuất hiện khối bào tử vô tính hình tròn màu da cam. Hình 4.03: Thể quả nấm gây bệnh Dùng kim nhọn bằng sắt đã qua khử trùng hớt nhẹ phần sợi bào tử trên cành làm ẩm, cho đầu kim sắt đã dính nấm bệnh đó vào hộp lồng có chứa môi trường PDA và dùng băng keo quấn hộp lồng lại, để hộp lồng vào tủ bảo quản ở nhiệt độ 28 0 C và theo dõi sự phát triển của nấm bệnh. Khi sợi nấm bắt đầu mọc, cấy truyền sang môi trường dinh dưỡng mới. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái N._.