Nghiên cứu ứng dụng một số kỹ tbuật chẩn đoán nhanh vibrio cholerae gây dịch tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2008

SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐỐN NHANH VIBRIO CHOLERAE GÂY DỊCH TIÊU CHẢY CẤP TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN NĂM 2008 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LƢU THỊ KIM THANH THÁI NGUYÊN - 2009 Lời cam đoan Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa cĩ ai cơng bố trong một cơng trình nào khác. Tác giả Phạm Thế Vũ Lời cảm ơn Để hồn thành luận văn này tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới các thầy cơ: Khoa Sau đại học, Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương, Viện Khoa học – Cơng nghệ Việt Nam. - TS. Lưu Thị Kim Thanh đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ giao đề tài, trực tiếp hướng dẫn tơi hồn thành luận văn này. - Bs. Nguyễn Lê Minh giám đốc Trung tâm Y tế Dự phịng Thái Nguyên đã giúp đỡ động viên và tạo mọi điều kiện cho tơi về tinh thần cũng như vật chất trong quá trình học tập. - NCVC.Ts. Nghiêm Ngọc Minh Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận văn Tơi xin cảm ơn tới : - Cán bộ khoa xét nghiệm Trung tâm Y tế Dự phịng Thái Nguyên, đặc biệt nhĩm cán bộ xét nghiệm vi sinh đã khơng quản ngày, đêm cũng như các ngày nghỉ giúp đỡ tơi thu thập mẫu bệnh phẩm, phân lập vi khuẩn tả, pha chế các loại mơi trường, xử lý sấy hấp dụng cụ ... - Các Bác sỹ, kỹ thuật viên khoa lây, khoa xét nghiệm của các bệnh viện trực thuộc tỉnh Thái Nguyên (Bệnh viện Đa khoa Trung Ương, Bệnh viện A, Bệnh viện C, Bệnh viện Gang thép, Trung tâm y tế các huyện thành) đã cùng tham gia thu phập mẫu khi cĩ bệnh nhân nhập viện. Thái nguyên, ngày 30 tháng 9 năm 2009 Tác giả Phạm thế Vũ MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 3 3. Những đĩng gĩp mới của đề tài 3 4. Giới hạn nghiên cứu 3 5. Cấu trúc của luận văn 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình dịch tả trên thế giới và Việt Nam 4 1.1.1. Tình hình dịch tả trên Thế giới 4 1.1.2. Tình hình bệnh tả ở Việt Nam 8 1.2. Căn nguyên gây bệnh 11 1.2.1. Ổ chứa và nguồn bệnh 11 1.2.2. Tác nhân gây bệnh 11 1.2.3. Phương thức lây truyền 12 1.2.4. Tính cảm nhiễm 13 1.2.5. Diễn biến bệnh 13 1.2.6. Kháng nguyên và cấu trucas lớp vi khuẩn 14 1.2.7. Độc tố của vi khuẩn tả 16 1.2.8. Một số phương pháp phát hiện Vibrio cholerrae trong phịng thí nghiệm 18 Chƣơng 2. ĐĨI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu 19 2.2. Nguyên liệu nghiên cứu 19 2.3. Hĩa chất thiết bị 20 2.4. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.4.1. Đối tượng nghiên cứu 21 2.4.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu 21 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.3.1. Các kỹ thuật lấy mẫu và vận chuyển bệnh phẩm 22 2.4.3.2. Các phương pháp chẩn đốn Vibrio cholerrae 24 2.4.3.3. Tiêu chuẩn đánh giá Vibrio cholerrae dương tính trong nghiên cứu 27 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đặc điểm chung của các đối tƣợng nghiên cứu 29 3.1.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, tuổi 29 3.1.2. Phân bố lấy mẫu bệnh phẩm theo địa điểm lấy mẫu 33 3.2. Đánh giá phƣơng pháp nghiên cứu phát hiện Vibrio cholerae O1 35 3.2.1. Nhận biết vi khuẩn di động bằng kỹ thuật soi tươi 34 3.2.2. Nhận biết hình thể và tính chất bắt maufcuar vi khuẩn bằng kỹ thuật nhuộm Gram 37 3.2.3. Phát hiện Vibrio cholerrae bằng kỹ thuật nuơi cấy 38 3.2.4. Nhận biết Vibio cholerrae bằng phương pháp test nhanh 52 3.2.5. Chẩn đốn Vibio cholerrae bằng kỹ thuật PCR 54 3.3. Đánh giá các kỹ thuật chẩn đốn Vibrio cholerae O1 3.3.1. Kỹ thuật soi tươi với kháng huyết thanh đặc hiệu 56 3.3.2. Kỹ thuật soi tươi và kỹ thuật nhuộm Gram 57 3.3.3. Kỹ thuật soi tươi với kỹ thuật nuơi cấy 58 3.3.4. Kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuơi cấy 58 3.3.5. Phương pháp test nhanh với kỹ thuật nuơi cấy 59 3.3.6. Kỹ thuật nuơi cấy với phương pháp PCR 60 3.4. Tổng hợp kết quả các phƣơng pháp và thời gian 61 KẾT LUẬN 66 ĐỀ NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CT Cholerae Toxi ( Độc tố tả ) RNA Acid deroxy ribonucleic DNA Acid deoxy nucleic E.coli Escherichia coli (Vi khuẩn Ecoli ) KIA Kligler Iron Agar ( Mơi trường song đường ) N.A.G Non Aglutinable Vibrios PCR Polymerase Chain Reaction ( Phát hiện độc tố V.cholerae) RAPD Random Amplified Polymorphic DNA TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose ( Mơi trường chọn lọc nuơi cấy vi khuẩn tả ) V.cholerae Vibriocholerae (Vi khuẩn tả ) DANH MỤC CÁC BẢNG 1 Bảng 1.1 Tình hình dịch tả ở Việt Nam từ tháng 10/2007 đến tháng 5/2008 9 2 Bảng 1.2 Phân lập V.cholerae typ cổ điển và typ Eltor 15 3 Bảng 2.1 Danh mục một số dụng cụ, hĩa chất 20 4 Bảng 3.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, tuổi 29 5 Bảng 3.2 Tỷ lệ bệnh nhân theo tuổi 31 6 Bảng 3.3 Phân bố bệnh nhân dương tính Vibrio cholerrae theo giới tính 33 7 Bảng 3.4 Tỷ lên thu thập mẫu các địa điểm nghiên cứu 34 8 Bảng 3.5 Tỷ lệ vi khuẩn di động quan sát trên lam kính 36 9 Bảng 3.6 Tỷ lệ vi khuẩn Gram âm quan sát dưới kính hiển vi 37 10 Bảng 3.7 Phần đánh giá chung trong việc xác định các vi khuẩn 38 11 Bảng 3.8 Tỷ lệ Vbrio cholerrae dương tính bàng kỹ thuật nuơi cấy 39 12 Bảng 3.9 Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên mơi trường TCBS 41 13 Bảng 3.10 Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên mơi trường thạch kiềm 43 14 Bảng 3.11 Thời gian mọc khuẩn lạc trên 2 loại mơi trường nuơi cấy 44 15 Bảng 3.12 Bảng đọc kết quả trên mơi trường sinh vật hĩa học 45 16 Bảng 3.13 Phản ứng Oxidase 47 17 Bảng 3.14 Đặc điểm nuơi cấy trên mơi trường peptone kiềm 49 18 Bảng 3.15 Phân biệt vi khuẩn tả với các phẩy khuẩn khác thuộc nhĩm N.A.G trên 3 loại đường 51 19 Bảng 3.16 Kết quả ngưng kết kháng huyết thanh đa giá và đơn giá 52 20 Bảng 3.17 Phát hiện Vibrio cholerrae O1 bằng kỹ thuật test nhanh 54 21 Bảng 3.18 Tỷ lệ Vibrio cholerrae O1 bằng kỹ thuật PCR 55 22 Bảng 3.19 Đánh giá kỹ thuật soi tươi với kháng huyết thanh đặc hiệu 57 23 Bảng 3.20 So sánh kỹ thuật soi tươi và kỹ thuật nhuộm Gram 57 24 Bảng 3.21 Bảng so sánh kỹ thuật soi tươi với kỹ thuật nuơi cấy 58 25 Bảng 3.22 Bảng so sánh kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuơi cấy 59 26 Bảng 3.23 Bảng so sánh phương pháp test nhanh với kỹ thuật nuơi cấy 59 27 Bảng 3.24 Đánh giá kết quả của phương pháp thử Oxidase với kỹ thuật soi tươi 60 28 Bảng 3.25 Bảng so sánh phương pháp nuơi cấy và PCR 61 29 Bảng 3.26 Tổng hợp kết quả các phương pháp và thời gian được áp dụng 61 30 Bảng 3.27 Một số phương pháp cĩ thể áp dụng chẩn đốn nhanh Vibrio cholerrae 62 31 Bảng 3.28 Bảng so sánh kỹ thuật nuơi cấy với (bảng 3.27) 64 DANH MỤC CÁC HÌNH 1 Hình 1.1 Biểu đồ khu trú vi khuẩn tả ở ruột non 17 2 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập chẩn đốn Vibrio cholerrae O1 24 3 Biểu đồ 3.1 Đánh giá độ tuổi trong thu thập mẫu 30 4 Biểu đồ 3.2 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới tính 32 5 Biểu đồ 3.3 Số mẫu thu thập tại 6 bệnh viện trong quá trình thu thập mẫu 35 7 Hình 3.4 Hình thể Vibrio cholerrae soi tươi 36 8 Hình 3.5 Hình thể vi khuẩn nhuộm Gram 37 9 Biểu đồ 3.6 Tỷ lệ dương tính Vibrio cholerrae bằng kỹ thuật nuơi cấy 40 10 Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc Vparaheamoliticus và Vibrio cholerrae 42 11 Hình 3.8 Hình ảnh khuẩn lạc Vibrio cholerrae trên mơi trường thạch kiềm 42 12 Hình 3.9 Các mơi trường sinh vật hĩa học trong chẩn đốn Vibrio cholerrae 45 13 Hình 3.10 Hình ảnh phản ứng oxidase 47 14 Hình 3.11 Hình ảnh test nhanh Crystan VC 53 15 Hình 3.12 Phản ứng PCR 56 16 Biểu đồ 3.13 Tổng hợp các phương pháp chẩn đốn Vibrio cholerrae 63 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỞ ĐẦU 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Dịch tiêu chảy cấp đang cĩ chiều hướng gia tăng ở các địa phương, tính từ 23/10/2007 miền Bắc đã xảy ra ba đợt dịch tiêu chảy cấp nguy hiểm, số bệnh nhân tiêu chảy cấp đã lên đến 1.335 người, cĩ 136 trường hợp dương tính với phẩy khuẩn tả tại 18 tỉnh / thành phố trong cả nước trong đĩ cĩ tỉnh Thái Nguyên [13]. Khống chế dịch tả là mục tiêu lớn trong chương trình quốc gia phịng chống bệnh tiêu chảy của Việt Nam. Với những thành tựu và kinh nghiệm phịng chống dịch tả trong nhiều năm qua, ngày nay bệnh tả khơng cịn là nỗi khiếp đảm của mỗi người dân, của các tổ chức chính quyền và xã hội. Các điều kiện chuẩn mực về kiểm sốt mơi trường ở nước ta cịn lạc hậu. Các vấn đề cung cấp nước, vệ sinh thực phẩm, dinh dưỡng an tồn và vấn đề xử lý vệ sinh chất thải chưa làm được bao nhiêu, nhiều nơi cịn bị buơng lỏng hoặc quên lãng. Trong thời kỳ giao lưu phát triển kinh tế và ngoại giao trong quan hệ hợp tác giữa các nước trong khu vực và tồn cầu ngày càng được mở rộng thì bên cạnh đĩ là những điều kiện rất dễ bùng phát các vụ dịch nĩi chung, trong đĩ cĩ dịch tả nĩi riêng [30]. Thái Nguyên là tỉnh miền núi phía Bắc tiếp giáp với các tỉnh: Lạng Sơn, Bắc Giang, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Hà Nội, là cửa ngõ giao lưu Kinh tế - Văn hố – Xã hội thuận lợi giữa các tỉnh miền núi phía Bắc với đồng bằng Bắc Bộ, là trung tâm đào tạo quan trọng đứng thứ 3 trong cả nước. Trường Đại học Thái Nguyên với 6 trường đại học thành viên và trên 20 trường cao đẳng trung học dạy nghề. Tồn tỉnh hiện cĩ gần 4000 cơ sở sản xuất kinh doanh và chế biến dịch vụ phục vụ, trong số 1.150 cơ sở sản xuất kinh doanh cơng nghiệp cĩ hàng ngàn bếp ăn tập thể của cơng nhân, học sinh, sinh viên… Hội tụ nhiều điều kiện thuận lợi như vậy tuy nhiên vẫn cịn rất Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên nhiều khĩ khăn nếu khơng được quản lý chặt chẽ đĩ sẽ là nguồn lây nhiễm gây ngộ độc thực phẩm hoặc nguồn chứa mầm gây nên bệnh dịch. Thực hiện cơng điện khẩn của Cục Y tế dự phịng và Mơi trường, Bộ y tế gửi các Trung tâm y tế Dự phịng các tỉnh thành trong cả nước “Tăng cường giám sát vệ sinh an tồn thực phẩm trên địa bàn, giám sát chặt chẽ và phát hiện sớm nhất căn nguyên gây tiêu chảy, xử lý khoanh vùng ổ dịch và triển khai điều trị kịp thời, khơng để bệnh nhân tử vong” [30]. Cần phải báo cáo khẩn cấp khi cĩ ít nhất một ca bệnh (kể cả ca đã xác định hoặc nghi ngờ), dù ở khu vực dịch xâm nhập hay bệnh lưu hành, y tế cơ sở nơi phát hiện phải báo cáo ngay theo chế độ báo cáo khẩn cấp của Bộ Y tế. Bệnh nhân mắc bệnh tả nếu khơng được phát hiện sớm và điều trị kịp thời sẽ bị mất nước và chất điện giải dẫn đến tử vong. Bệnh tả lây truyền rất nhanh qua đường tiêu hố và mơi trường (nước, chất nơn, phân, rác...) do vậy việc phát hiện sàng lọc mẫu âm tính ngay tại cơ sở cĩ ý nghĩa hết sức quan trọng, khơng những giúp đỡ bệnh nhân cĩ ngay phác đồ điều trị mà cịn giúp các nhà dịch tễ cĩ hướng xử lý khoanh vùng, chủ động trong phịng chống dịch, khơng để dịch lây lan rộng trong cộng đồng [4], [6]. Đáp ứng với tình hình thực tiễn kể trên, chúng tơi tiến hành đề tài: " Nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đốn nhanh Vibrio cholerae gây dịch tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2008" Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định tỷ lệ bệnh nhân dương tính với Vibrio cholerae (V. cholerae ) trong giai đoạn từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 7 năm 2008. - Đánh giá hiệu quả các kỹ thuật phát hiện Vibrio cholerae (soi tươi, nhuộm soi, test nhanh, nuơi cấy, PCR) - Lựa chọn những kỹ thuật phù hợp để áp dụng sàng lọc chẩn đốn nhanh Vibrio cholerae tại labo tuyến huyện khi cĩ dịch tiêu chảy cấp. 3. NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Đề tài nghiên cứu đã đánh giá các kỹ thuật phát hiện Vibrio cholerae trên mẫu phân của bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên. - Đáp ứng tính ứng dụng và hiệu quả tại labo tuyến huyện. 4. GIỚI HẠN NGHIÊN CỨU - Thời gian nghiên cứu ngắn nên ứng dụng đánh giá hiệu quả sau phân tích chưa cĩ số liệu đánh giá cụ thể. 5. CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN Ngồi phần mở đầu và kết luận, luận văn cĩ 3 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và bàn luận Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tình hình dịch tả trên thế giới và Việt Nam 1.1.1. Tình hình dịch tả trên thế giới Bệnh tả được cho là xuất hiện cách đây hàng thế kỷ tại đồng bằng sơng Hằng của các tiểu lục địa Ấn Độ. Thế kỷ thứ XI những đợt dịch tả đã lan tràn tới nhiều vùng trên thế giới từ Nam Á theo con đường buơn bán, hành hương và di tản. Trong thời gian cĩ đại dịch, nhiều vụ dịch lớn cĩ tỷ lệ tử vong cao đã xảy ra ở khắp thành thị châu Âu, châu Mỹ. Năm 1849, cĩ một cuộc điều tra nổi tiếng của John Snow (Bác sỹ người Anh) đã chứng minh nước là mơi trường truyền bệnh tả [48], [51]. Năm 1817 bệnh xuất hiện tại Châu Âu và Mỹ. Đến đầu thế kỷ 20 đã cĩ 6 "làn sĩng bệnh tả" lan khắp thế giới, tiếp đĩ đến những năm 60 phạm vi "tung hồnh" của vi khuẩn tả đã được "khoanh vùng" và cho đến những năm gần đây chủ yếu bệnh xuất hiện ở Đơng nam Á. Năm 1961 týp "El Tor" gây dịch tại Philippin và tạo "làn sĩng thứ bảy". Từ đĩ trở đi týp vi khuẩn này tiếp tục gây những vụ dịch tại châu Á, vùng Trung Đơng, châu Phi và một phần châu Âu [2], [5], [10], [57]. Năm 1883, Robert Koch (nhà vi sinh vật người Đức) phân lập thành cơng vi khuẩn từ phân của bệnh nhân biểu hiện các triệu chứng của bệnh này. Cĩ tài liệu cho rằng trước đĩ 30 năm nhà giải phẫu học người Ý đã phát hiện ra phẩy khuẩn là nguyên nhân gây bệnh [43]. Các vụ đại dịch đều bắt nguồn từ châu Á, sau đĩ lan tới các châu lục khác ở nhiều nước, trong nhiều năm. Qua các vụ dịch, cĩ một số ghi nhận đáng chú ý về dịch tễ học, sinh bệnh học, điều trị và phịng chống bệnh tả được tĩm tắt như sau: Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - Vụ đại dịch thứ nhất: Lần đầu tiên ghi nhận bệnh tả xảy ra dưới dạng một đại dịch, vụ đại dịch này bắt đầu vào năm 1817 tại khu vực châu thổ sơng Hằng, sau đĩ lan tới nhiều nước thuộc châu Á vá châu Phi [5]. - Vụ đại dịch thứ hai: Lần đầu tiên bệnh tả gây dịch ở Bắc Mỹ năm 1832 tại khu vực Quebec ( Canada), New York, Philadelphia, Washington. Trong vụ đại dịch này, đầu những năm 1930, O’Shaughnessy là người đầu tiên chứng minh phân của bệnh nhân bị bệnh tả cĩ tính kiềm và cĩ nồng độ điện giải rất cao. sau phát hiện cĩ ý nghĩa này, Latta đã điều trị thành cơng một số bệnh nhân tả mất nước nặng bằng phương pháp tiêm tĩnh mạch dung dịch chứa muối và điện giải [5], [47]. - Vụ đại dịch thứ 3: Dịch tả lan tới nước Anh, tại Luân Đơn, John Snow đã phát hiện rất quan trọng về dịch tễ học là bệnh tả lan truyền theo đường nước sinh hoạt bị ơ nhiễm và từ đĩ đã đề ra biện pháp chống dịch hiệu quả là loại bỏ nguồn nước sinh hoạt khơng hợp vệ sinh [17], [27], [61]. - Vụ đại dịch thứ 4: Dịch tả hồnh hành dữ dội ở New Orleans và các thành phố, thị trấn dọc theo triền sơng Missippi, Missouri và Ohio của nước Mỹ [1], [5], [62]. - Vụ đại dịch thứ 5: Dịch tả lan tới vùng trung cận đơng, sau đĩ lan tới Nam Mỹ, gây ra các vụ dịch lớn với tỷ lệ tử vong cao ở các nước Argentina, Chilê và Peru. Tại Ai Cập và Calcutta (Ấn Độ), Robert Koch đã phân lập được vi khuẩn tả từ phân của bệnh nhân bị bệnh tả , chỉ một năm sau khi Koch phân lập được vi khuẩn tả, Ferran là người đầu tiên đã gây miễn dịch dự phịng tả bằng vaccin [12], [45]. - Vụ đại dịch 6: Gây ra các vụ dịch lớn ở vùng Trung Cận Đơng và bán đảo Ban Căng, từ năm 1921 đến năm 1961, ngồi một vụ dịch tả lớn xảy ra ở Ai Cập năm 1961 với 32.978 trường hợp tả, gây tử vong 20.472 người, dịch tả chủ yếu lưu hành ở các nước thuộc khu vực Đơng Nam Á và châu Á, trong 6 vụ đại dịch đầu tiên tác nhân gây bệnh là V. cholerae O1, typ sinh học cổ điển Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên do Pacini mơ tả đầu tiên phân lập được năm 1854 và được nhà vi trùng học người Đức Robert Koch khảng định lại năm 1883[5], [46], [59]. - Vụ đại dịch thứ 7: Tác nhân gây bệnh là V. cholerae O1, týp sinh học El Tor, do Goschlich lần đầu tiên phân lập được năm 1905 được chia làm 4 giai đoạn sau: Từ năm 1961-1962 dịch tả khu trú ở các đảo thuộc Indonesia và các nước Đơng Nam Á, với tổng số 13.393 người mắc, tử vong 1.977 người [49], [55]. Năm 1963-1969 chỉ trong thời gian ngắn dịch xuất hiện nhiều nước châu Á: Ấn Độ, Pakistan, Liên Xơ cũ, I-Rắc, Việt Nam bắt đầu cĩ dịch tả El Tor vào tháng 1 năm 1964. Giai đoạn tiếp theo từ năm 1970-1990 theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới cĩ 36 nước cĩ dịch tả, điều đáng chú ý là tại Li Băng, Syri chủng gây dịch là El Tor Ogawa, trong khi đĩ ở các nước liền kề như Ả rập-Xê út, Israel chủng gây dịch lại là El Tor Inaba.Tiếp theo những năm 1991 đến nay điều đáng chú ý ở nước Trung Mỹ và Nam Mỹ 21/23 nước cĩ bệnh tả, năm 1994 châu Mỹ La Tinh chiếm 50% số bệnh nhân tả trên tồn thế giới.Tháng 7/1994 xảy ra một vụ dịch tả thảm khốc tại trại tỵ nạn ở Uganda với 58.057 trường hợp bị bệnh tả, tử vong 23.800 người, năm 1996 số người mắc tả ở châu Phi chiếm 60% tổng số các trường hợp mắc tả trên thế giới [58], [60]. Tháng 12 năm 1992 một vụ dịch lớn lại sảy ra ở nước này. Vi khuẩn gây bệnh được xác định là V. cholerae O139 "Bengal". Về mặt di truyền, O139 "Bengal" hình thành từ El Tor nhưng cấu trúc kháng nguyên của chúng cũng biến đổi. Tất cả mọi lứa tuổi (kể cả trong vùng đã cĩ dịch ) đều cĩ thể bị nhiễm. Chủng O139 đã gây bệnh tại ít nhất 11 nước ở Đơng nam Á (tính đến năm 2005). Khơng cĩ số liệu chính xác số người bị bệnh do O139 vì các nước khơng thơng báo cụ thể các trường hợp bệnh do O1 hay O139 riêng rẽ. Trong những năm cuối thế kỷ 20 dịch tả ngày càng trở nên nghiêm trọng, bệnh tả xảy ra ở tất cả các châu lục, tập trung chủ yếu ở những nước đang phát triển, mặc dù y học cĩ những hiểu biết đáng kể về sinh bệnh học và điều Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên trị bệnh tả nhưng tỷ lệ tử vong do bệnh tả vẫn ở mức độ cao, đặc biệt là khu vực châu Phi [3], [8], [53]. Những đặc điểm của týp El Tor giúp nĩ khẳng định khả năng "tiếp tục gây nguy hiểm" bao gồm: Tỷ lệ nhiễm El Tor thấp hơn nhiều so với tỷ lệ nhiễm týp cổ điển, thời gian mang trùng sau khi bị bệnh do El Tor dài hơn so với trường hợp nhiễm týp cổ điển, El Tor cĩ khả năng tồn tại ngồi mơi trường tốt hơn, dài hơn týp cổ điển. Chính vì vậy El Tor cĩ khả năng gây dịch tại cả những nơi Týp cổ điển từng "tung hồnh" [7], [36], [50]. Tháng 4 năm 1997, dịch bùng phát trong cộng đồng 90 ngàn người tị nạn Ruanđa ở Cộng Hồ Cơng gơ. Chỉ trong 22 ngày đầu đã cĩ 1.521 người chết. Đa số các trường hợp chết đều do khơng được can thiệp kịp thời. Tại Mỹ, dịch tả xuất hiện vào những năm 1800 sau đĩ được khống chế do đảm bảo vệ sinh nguồn nước sinh hoạt. Tuy vậy, giao thơng và du lịch tạo điều kiện để bệnh xuất hiện lẻ tẻ. Đa số trường hợp do đi du lịch tại các nước Mỹ La tinh, châu Phi, châu Á. Một số trường hợp nhiễm bệnh do ăn thức ăn mang về từ các quốc gia cịn lưu hành bệnh [44], [52]. Theo Nguyễn Anh Dũng, tính đến năm 1991, đại dịch tả lần thứ 7 đã cĩ 91 nước cĩ dịch [6], đến năm 1992 theo Tổ chức Y tế thế giới đã cĩ ít nhất 98 nước cĩ dịch tả. Nhờ những hiểu biết đáng kể về căn nguyên gây bệnh, về điều trị và cơ chế miễn dịch bệnh tả mà tỷ lệ tử vong do tả đã giảm xuống một cách đáng kể chỉ cịn 1% - 3% [6]. Phẩy khuẩn V. cholerae O1 bao gồm hơn 60 nhĩm huyết thanh, nhưng chỉ cĩ một nhĩm huyết thanh O1 là gây được bệnh tả, V. cholerae O1 lại gồm 2 sinh týp là sinh týp cổ điển và sinh týp El-Tor, mỗi sinh týp lại gồm 2 týp huyết thanh (Ogawa và Inaba) [8], [22]. Sinh týp El-Tor gây nên hầu hết các vụ dịch tả gần đây, tuy vẫn cịn nhiều vụ dịch xảy ra ở tiểu lục địa Ấn Độ là do sinh týp cổ điển. Sinh týp El- Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tor cĩ thể sống kết hợp với một sinh vật dưới nước, làm cho nước trở thành một kho tàng lưu trữ gây nhiễm [31], [54]. Từ cuối năm 1992, dịch tả do V. cholerae O139 đã xuất hiện ở một số nơi thuộc Đơng nam Ấn Độ, sau đĩ nhanh chĩng lan tới Đơng Bắc nước này thuộc vịnh Belgan.Tháng 3/1993 dịch lớn sảy ra ở Bangladesh, tiếp đĩ xuất hiện ở Miama, Trung Quốc (Tân Cương,7/1993), Thailand (8/1993) đến tháng 9 cùng năm đã cĩ nhiều trường hợp mắc tả V. cholerae O139 ở Malaysia [34]. Người ta đã phân lập được V. cholerae non O1 ở các bệnh nhân tiêu chảy nặng thuộc 2 cộng đồng ở Florida.Tính gây bệnh đường tiêu hố ở người và sự đồng nhất hố của những chủng này làm nảy sinh những câu hỏi về sự tương quan của những chủng V. cholerae O1 độc và khơng độc dọc bờ biển Gulf của hoa Kỳ [39], [56]. Một đánh giá khảo sát trên tất cả các bệnh viện tư nhân ở Recife cho kết quả trong 1.435 mẫu chỉ cĩ 1 mẫu dương tính với V. chlerae El-Tor Inaba (0.07%), 17 mẫu dương tính (1.2%) gồm V. cholerae non O1, V. fluvialis, V. fumissii, V. parahaemolyticus, V. spp. và rất ít gặp ở những người cĩ điều kiện xã hội khá, ngay cả khi dịch đang xảy ra [49]. 1.1.2.Tình hình bệnh tả ở Việt Nam Bệnh tả là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy cấp ở Việt Nam từ hơn một thế kỷ qua với 2 triệu trường hợp mắc bệnh tả được thơng báo. Năm 1937-1938 dịch tả từ Hồng Kơng theo đường biển xâm nhập vào các tỉnh miền Bắc là Hải Phịng, Mĩng Cái, từ đĩ dịch lan sang theo đường sắt và đường bộ tới nhiều tỉnh đồng bằng Bắc Bộ và Trung Bộ. Số người mắc lên tới 20.678 người, trong đĩ số chết là 14.992 người, tỷ lệ tử vong tới 70%. Bệnh tả Eltor lần đầu tiên xuất hiện ở miền Nam năm 1964 với 20.009 người mắc bệnh, trong đĩ 821 người tử vong. Từ đĩ đến nay, ở miền Trung và miền Nam bệnh tả xảy ra dưới dạng lưu hành, hàng năm cĩ hàng trăm bệnh nhân bị bệnh tả được thơng báo. Năm 1994 sau hàng chục năm vắng bĩng, bệnh tả xuất Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên hiện lại ở khu vực Tây Nguyên ( các tỉnh Đắc Lắc, Lâm Đồng, Gia Lai ) với 1.459 bệnh nhân mắc bệnh tả được thơng báo [5], [11], [16]. Dịch tả hiện nay vẫn là gánh nặng đối với ngành y tế và tồn xã hội. năm 1993 dịch xảy ra ở 21 tỉnh với 3.460 người mắc bệnh. Năm 1994 dịch xuất hiện ở cả miền Bắc, Trung, Nam và Tây Nguyên với 4.123 trường hợp bị bệnh. Năm 1995 cĩ 29 tỉnh, thành phố báo cáo cĩ bệnh nhân mắc tả với 6.088 trường hợp mắc bệnh tả. Năm 1996, cả nước cĩ 630 trường hợp mắc bệnh tả ElTor ở 19 tỉnh, thành phố. Vài năm gần đây từ 2001-2002 nước ta vẫn cĩ các trường hợp tả xảy ra, tuy nhiên bệnh khơng bùng phát thành các dịch lớn mà chủ yếu là những ca lẻ tẻ ở khắp cả nước [5]. Bảng 1.1. Tình hình dịch tả ở Việt Nam từ 10/2007 - 5/2008 Đợt 1 Đợt 2 Đợt 3 Tổng Ngày xuất hiện 23/10/2007 24/12/2007 5/3/2008 Tổng số mắc 1.907 58 3.480 5.445 Số dương tính (+) với tả 295 32 581 908 Số tỉnh/thành cĩ tả (+) 14 1 18 Tập trung nhiều nhất tại Hà Nội Hà Nội Hà Nội Số tử vong 0 0 0 0 Ngày kết thúc 06/12/2007 5/2/2008 22/5/2008 (Nguồn số liệu: Cục Y tế Dự phịng và Mơi trường Việt Nam) Nguyễn Phú Quý (1993) đã thơng báo về những đặc điểm sinh học của V. cholerae O139 và quy trình kỹ thuật phân lập xác định mầm bệnh với kháng huyết thanh đặc hiệu của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương [36]. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Kết quả xét nghiệm phân lập được V. cholerae El-Tor cĩ sự dao động lớn giữa các tác giả, thấp nhất là 1,52 % và cao nhất là 45,70 %. Phan Đạo và cộng sự cho rằng thời gian đỉnh của vụ dịch tỷ lệ phân lập cao trên 50% [9]. Một số tác giả cịn đưa ra tỷ lệ phân lập theo nhĩm tuổi, tỷ lệ phân lập vi khuẩn tả dương tính ở nhĩm tuổi 6-16 tuổi là 15,08 %, 17-50 tuổi là 44,56 %, điều này càng chứng tỏ dưới 50 tuổi cĩ tỷ lệ mắc tả cao [6], [7]. Tỷ lệ người lành mang trùng, khi phân lập vi khuẩn tả ở những người lành trong các vụ dịch, các tác giả trong nước cho thấy rất thấp là 1% và cao nhất là 15% [9], [14]. So với nhiều dịch bệnh mới xuất hiện và đang diễn biến phức tạp hiện nay, bệnh tiêu chảy cấp nguy hiểm khơng phải là bệnh khĩ kiểm sốt, dịch bệnh cĩ thể bùng phát khi cĩ đủ ba mắt xích liên kết với nhau (nguồn bệnh, đường lây, sức cảm thụ), cả 3 mắt xích này đã được xác định rất rõ bởi các nhà dịch tễ học. Mặc dù chưa khẳng định được nguyên nhân gây bệnh, nhưng qua số liệu nghiên cứu của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, cĩ thể khẳng định vi khuẩn tả xuất phát từ thực phẩm. Chưa bao giờ cĩ một vụ dịch nào phức tạp như bây giờ, gần như đồng loạt tất cả các Quận huyện của Hà Nội đều cĩ dịch. Trong khi đĩ các ổ dịch lại khơng liên quan đến nhau, các bệnh nhân khơng sống cùng nhau, khơng ăn cùng nhau [13]. Tại tỉnh Thái Nguyên, sau nhiều năm khơng xuất hiện bệnh tả, đến ngày 13/11/2007 cĩ 23 bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp trong đĩ cĩ 01 bệnh nhân dương tính với V. cholerae O1. Dịch bệnh xuất hiện sau khi đã được phát hiện tại nhiều tỉnh lân cận, hầu hết các trường hợp mắc bệnh là do đến các vùng cĩ dịch ăn uống phải thức ăn nhiễm khuẩn sau đĩ về địa phương và phát bệnh, tuy vậy dịch đã được khống chế thành cơng khơng lan rộng thêm và khơng truờng hợp nào tử vong. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1.2. Căn nguyên gây bệnh 1.2.1. Ổ chứa và nguồn bệnh Người là ổ chứa vi khuẩn tả quan trọng và cũng là nguồn bệnh, bao gồm người mắc bệnh thể điển hình hoặc các thể nhẹ, khơng điển hình và người mang mầm bệnh khơng triệu chứng (cịn gọi là người lành mang trùng). Sau vụ dịch tả cĩ một tỷ lệ nhỏ (khoảng 3-5%) bệnh nhân các thể cĩ khả năng mang vi khuẩn tả kéo dài một vài tháng, đơi khi kéo dài hàng năm nếu khơng được điều trị đặc hiệu đúng quy định. Vi khuẩn tả cĩ thể tồn tại lâu dài ở một số lồi nhuyễn thể (trai, sị, ngao...) vùng cửa sơng hay ven biển. Đây là ổ chứa thiên nhiên của vi khuẩn tả ngồi ổ chứa quan trọng là người [15], [24]. 1.2.2. Tác nhân gây bệnh Tác nhân gây bệnh tả là V. cholerae lần đầu tiên được Pacini người Ý mơ tả năm 1854 khi ơng tìm thấy rất nhiều vi khuẩn hình cong trong ruột của bệnh nhân bị tả. Năm 1883 Robert Koch cũng tìm thấy tác nhân cĩ hình thể tương tự khi ơng nghiên cứu bệnh tả ở Ai Cập, ơng mơ tả vi khuẩn cĩ hình dấu phẩy và Koch đặt tên là Vibrio comma, tên này được dùng mấy chục năm trước khi người ta đổi tên là V. cholerae, để tưởng nhớ ơng Pacini, V. cholerae được xác định rất rõ thơng qua các tính chất sinh vật, hố học và sự đồng nhất của DNA, tuy nhiên chúng khơng đồng nhất về khả năng gây bệnh, điều này đặc biệt quan trọng vì các chủng gây bệnh mới cĩ khả năng sinh độc tố ruột và gây dịch. Một sự phân biệt đơn giản trong y tế cộng đồng là V. cholerae thuộc nhĩm huyết thanh O1 cĩ khả năng sinh được độc tố, cịn lại tất cả các nhĩm khác thì khơng cĩ khả năng gây bệnh hoặc rất hiếm khi gây bệnh. V. cholerae O1 thuộc nhĩm huyết thanh O1 cĩ khả năng sinh độc tố và gây thành đại dịch tả, tuy nhiên cĩ một số ít chủng khơng sinh ra độc tố và khơng cĩ gen mã hố độc tố. Các chủng ở mơi sinh khơng cĩ khả năng sinh độc tố và khơng gây bệnh, ngoại lệ cĩ một sĩ chủng V. cholerae O1 phân lập được ở một số bệnh nhân tiêu chảy hoặc nhiễm trùng ngồi đường tiêu hĩa, Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên V. cholerae O1 gồm 3 týp huyết thanh là Inaba, Ogawa và Hikojima và bao gồm hai sinh týp khác nhau là sinh typ cổ điển và sinh týp El tor [23], [35]. Những năm gần đây, khi các vụ dịch tả do V.cholerae O139 gây ra, việc định danh tất cả các chủng V. cholerae đều dựa trên tính chất sinh vật hố học, sau đĩ nếu chủng nào khơng ngưng kết với O1 thì được gọi là “Vibrio cholerae - khơng O1”, sau này được đổi thành Vibrio khơng gây tả hoặc “nhĩm Vibrio khơng ngưng kết”. Hiện nay các nhĩm này thuộc các nhĩm huyết thanh từ O2 - O138, khơng cĩ khả năng gây dịch tả. Nhĩm Vibrio này đơi khi gây tiêu chảy do liên quan đến ăn hải sản, hoặc các nhiễm trùng ngồi đường tiêu hố như vết thương... Vụ dịch tả xảy ra vào đầu năm 1993 tại Ấn Độ và Bangladaesh do một loại Vibrio non O1 gây ra, đĩ là V. cholerae O139 cịn gọi là Vibrio Bengal. Nhìn chung đây là một chủng lai giữa V. cholerae O1 và Vibrio cholerae - non O1 và điều quan trọng là độc lực của nĩ là độc tố ruột và kháng nguyên nhung mao đồng điều hồ độc tố, tuy nhiên chủng O139 giống với sinh týp ElTor hơn [38], [41]. Dựa vào độc tính vi khuẩn V. cholerae O1 cĩ thể chia thành 2 nhĩm chính theo huyết thanh (serogroups) đĩ là O1 và O139. Nhĩm O1 cĩ hai týp sinh học (biotype) ElTor và cổ điển, El Tor là tên của một trạm y tế ở Ai cập nơi mà týp vi khuẩn này được phát hiện trong đại dịch năm 1907, hiện nay Eltor là thủ phạm chính của các trận dịch tả trên thế giới. Mỗi týp sinh học Eltor hay cổ điển cĩ thể chia thành 3 nhĩm nhỏ theo huyết thanh là Ogawa, Inaba, Hikojima, mỗi nhĩm cịn cĩ thể chia thành nhĩm nhỏ hơn dựa vào kháng nguyên (antigen) A, B hay C [21], [33], [40]. 1.2.3. Phƣơng thức lây truyền Bệnh tả lây theo đường tiêu hĩa, chủ yếu qua ăn uống. Vi khuẩn tả xâm nhập vào đường tiêu hĩa của người lành từ 2 nguồn chính: Thức ăn, nước Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên uống ơ nhiễm phân cĩ vi khuẩn tả và thức ăn cĩ nguồn gốc thủy hải sản cửa sơng, ven biển cĩ chứa các thể tiềm sinh lâu dài của vi khuẩn tả. Bệnh tả lây mạnh nhất ở giai đoạn tồn phát của bệnh. Thời gian thải vi khuẩn thường kéo dài khoảng 1 tuần sau khi hết tiêu chảy cấp. Một số ít bệnh nhân cĩ thể gây nhiễm sau mắc bệnh nhiều tuần, thậm chí nhiều tháng do khả năng đào thải vi khuẩn tả từng đợt theo phân. Các yếu tố lây truyền vi khuẩn tả là nước, thực phẩm tươi sống, thực phẩm đã qua chế biến, bàn tay, dụng cụ ăn uống, đồ dùng cá nhân và ruồi nhặng bị nhiễm phẩy khuẩn tả. Những yếu tố nguy cơ làm tăng khả năng lan truyền bệnh tả là mật độ dân cư đơng đúc, đời sống kinh tế, xã hội và dân trí thấp, điều kiện vệ sinh an tồn thực phẩm khơng đảm bảo, nguồn nước sinh hoạt khan._. hiếm, thiếu nhà vệ sinh hợp tiêu chuẩn, vệ sinh mơi trường khơng tốt, thực hành vệ sinh cá nhân kém, khu vực bị lũ lụt và sau lũ lụt [32], [41]. 1.2.4. Tính cảm nhiễm Mọi người đều cĩ thể nhiễm vi khuẩn tả. Cơ thể sau khi mắc bệnh tả hoặc nhiễm khuẩn khơng triệu chứng cĩ miễn dịch đặc hiệu với chủng tả gây nhiễm nhưng thời gian miễn dịch thường ngắn, trung bình 6 tháng, khơng cĩ miễn dịch chéo giữa nhĩm V. cholerae O1 với nhĩm O139. Những nhĩm người cĩ nguy cơ cao với tả là những người tiếp xúc gần gũi (cùng ăn, uống, sinh hoạt) với bệnh nhân tả, dân cư tại vùng cĩ tập quán ăn uống khơng hợp vệ sinh, sử dụng thức ăn đường phố, hải sản chưa chín, nước chưa qua khử trùng, dùng phân tươi trong trồng trọt, khu vực đồng bằng cửa sơng, ven biển, vùng bị ngập lụt [31]. 1.2.5. Diễn biến bệnh Thời kỳ ủ bệnh từ vài giờ tới 5 ngày, thường từ 2-3 ngày, thời kỳ khởi phát rất ngắn, bệnh nhân bắt đầu cảm thấy đầy bụng và sơi bụng; tiếp theo đĩ tiêu chảy, lúc đầu cĩ phân, sau chỉ tồn nước và kiệt sức nhanh chĩng. Bệnh nhân thường chỉ nơn sau khi đã tiêu chảy nhiều lần, thời kỳ tồn phát thường Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên cĩ các triệu chứng tiêu chảy liên tục, nhiều lần, phân tồn nước, nước phân lờ lờ đục như nước vo gạo, trong đĩ cĩ những vẩy màng màu trắng (là mảnh tế bào thượng bì niêm mạc ruột lẫn phẩy khuẩn tả). Bệnh nhân khơng đau bụng, mĩt rặn và khơng cĩ nhày máu mũi. Số lần tiêu chảy và số lượng nước mất thay đổi tùy từng trường hợp nặng nhẹ khác nhau như nơn dễ dàng, lúc đầu nơn ra thức ăn, sau chỉ tồn nước trong hoặc vàng nhạt, tiếp theo các triệu chứng khác bệnh nhân khơng sốt, người mệt lả, cĩ thể bị chuột rút, biểu hiện tình trạng mất nước từ độ I đến độ III như khát nước, da khơ, nhăn nheo, hốc hác, mắt trũng, mạch nhanh, huyết áp hạ, cĩ khi khơng đo được, tiểu tiện ít hoặc vơ niệu, chân tay lạnh... Ngồi ra bệnh nhân cĩ thể bị rối loạn thăng bằng điện giải như hạ kali máu [5], [19]. 1.2.6. Kháng nguyên và cấu trúc lớp vỏ vi khuẩn Sự thay đổi tính chất kháng nguyên là yếu tố quan trọng trong nghiên cứu dịch tễ và độc lực của vi khuẩn. Đối với vi khuẩn tả, khả năng gây thành dịch của chủng Bengal nĩi trên là mơt ví dụ minh hoạ. Nhiều loại vi khuẩn khác trong mơi trường nước cũng cĩ kháng nguyên roi như vi khuẩn tả vì vậy khơng thể căn cứ vào loại kháng nguyên này để phân biệt. Týp huyết thanh phẩy khuẩn đã được phân biệt dựa trên đặc điểm vào kháng nguyên O ( kháng nguyên vỏ). Hầu hết các chủng vi khuẩn tả đều khơng cĩ độc tính. Chủng Bengal gây thành dịch được định danh là O1. Tuy vậy cĩ tới 3 týp sinh học của O1 được gọi tên Ogawa, Inaba và Hikojima. Mỗi chủng trong 3 loại này cĩ khả năng thể hiện đặc tính của chủng cổ điển hay của El Tor. Chủng Bengal O139 là chủng huyết thanh mới cĩ kháng nguyên O đặc thù. Đặc tính kháng nguyên đặc thù của Bengal O139 cĩ thể giúp chúng ta giải thích vì sao cơ thể khơng cĩ miễn dịch sau khi bị bệnh [5]. Các kháng nguyên vỏ của phẩy khuẩn gồm: Týp Ogawa cĩ kháng nguyên A và B; Týp Inaba cĩ kháng nguyên A và C; Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Týp Hikojima cĩ kháng nguyên A, B, C. Týp sinh vật: Chủng V. cholerae O1 được chia thành 2 týp sinh vật là týp cổ điển và týp ElTor. Bảng 1.2. Phân lập V. cholerrae týp cổ điển và týp Eltor Tính chất V. cholerae týp cổ điển V. cholerae týp Eltor Làm tan hồng cầu cừu Nhậy Kháng Ngưng kết hồng cầu gà - + Polymixin B 50đv - + Phage IV Nhậy Kháng Nội độc tố cĩ mặt trong phẩy khuẩn cũng như trong các vi khuẩn Gram âm khác. Chúng ta cịn biết ít về cấu trúc lớp vỏ liposaccharide của phẩy khuẩn. Tuy nhiên, một số đặc điểm đặc thù của lớp vỏ phẩy khuẩn cũng đã được nghiên cứu. Điều quan trọng nhất là sự thay đổi cấu trúc lớp vỏ cĩ thể xảy ra trong cả điều kiện in vitro lẫn in vivo. Đây cĩ thể là một nguyên nhân dẫn đến sự biến đổi của các chủng khơng cĩ độc lực trong tự nhiên thành chủng cổ điển cĩ khả năng gây thành dịch và ngược lại. Phân nhĩm V. cholerae O1 là các vi khuẩn gây dịch tả và V. cholerae khơng phải nhĩm O1 / khơng phải O139 ( gọi tắt V. cholerae non – O1 / non - O139) hay nhĩm N.A.G ( Non Aglutinable Vibrios ) các phẩy khuẩn khơng ngưng kết, gồm các vi khuẩn cĩ tính chất sinh vật hố học giống V. cholerae nhĩm O1, nhưng khơng ngưng kết với kháng huyết thanh O1, nhĩm này cĩ thể gây bệnh nhẹ khơng thành dịch. Đặc điểm chủ yếu của những chủng này là khơng sản xuất độc tố tả và khơng liên quan tới dịch tiêu chảy. Những chủng này được phân lập tình cờ từ những trường hợp tiêu chảy do ăn tơm cua hoặc từ những nhiễm trùng ngồi ruột khác như: Vết thương, tai, đờm, Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên nước tiểu, dịch não tuỷ. Phẩy khuẩn thuộc nhĩm này được tìm thấy ở cửa sơng, các nhiễm trùng do các chủng này thường bắt nguồn từ ngoại cảnh, V. cholerae O139 ( chủng Bengal ) lúc đầu, vi khuẩn gây vụ dịch này liên quan tới vi khuẩn tả non-O1 vì nĩ khơng ngưng kết với kháng huyết thanh O1 nhưng triệu chứng lâm sàng rất dữ dội và giống tả. Chủng V. cholerae O139 được cho là chủng lai của chủng V. cholerae O1 và chủng non ( cĩ tính chất sinh vật hố học giống V.cholerae nhĩm O1, nhưng khơng ngưng kết với kháng huyết thanh O1). CácVibrio khác: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, các Vibrio nhĩm F.V. parahaemolyticus được coi là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ngộ độc thực phẩm do ăn hải sản sống hoặc chưa được nấu kỹ với các triệu chứng viêm ruột và tiêu chảy cấp tính [5], [44]. 1.2.7. Độc tố của vi khuẩn tả V. cholerae sinh ra rất nhiều sản phẩm ngoại tế bào. Đặc điểm tiêu chảy mất nhiều nước là do độc tố ruột gây ra được gọi là độc tố tả cholerae toxin (CT). Những nghiên cứu trên người tình nguyện cho thấy CT là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh tả, tuy nhiên các chủng tả nếu loại bỏ gen mã hố CT vẫn cĩ thể xảy ra tiêu chảy nhẹ hoặc vừa ở nhiều cá thể. Điều này cĩ thể suy ra cịn cĩ những yếu tố nào đĩ hay loại độc tố nào khác ngồi CT. Độc tố tả được Robert Koch mơ tả từ năm 1884 khi ơng cho đĩ là một chất độc đặc biệt tác động lên tế bào biểu mơ ruột. Năm 1959 cĩ hai nhà khoa học nghiên cứu độc lập tại Ấn Độ là De và Dutta đã đưa canh khuẩn tả vào ruột thỏ và 10 năm sau Finkelstein và LoSpalluto đã tinh chế được độc tố này cho phép nhiều nhà khoa học nghiên cứu về lĩnh vực cấu trúc, thụ thể bám và cơ chế tác dụng của CT [43]. Cấu trúc độc tố tả bao gồm hai tiểu phần A và B, tiểu phần B cĩ tác dụng bám dính vào thụ thể đặc hiệu của tế bào biểu mơ ruột, tiểu phần A cĩ chức năng enzym đặc hiệu cĩ khả năng chui vào tế bào chủ. Độc tố CT bao Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên gồm 5 tiểu phần B và một tiểu phần A, tiểu phần B trưởng thành cĩ 103 acid amin và cĩ trọng lượng phân tử 11.5 KDa, tiểu phần A cĩ trọng lượng phân tử 29 KDa gồm 2 chuỗi polypeptide (A1 cĩ trọng lượng phân tử 23.5.KDa và A2 cĩ trọng lượng phân tử 5.5 Kda), hai tiểu phần nối với nhau bằng cầu disulfit. Bản chất miễn dịch học của độc tố tả CT giống hệt độc tố ruột khơng chịu nhiệt của E.coli sinh độc tố [5]. Hình 1.1. Biểu đồ khu trú của vi khuẩn trong ruột non (Phẩy khuẩn tả tiếp xúc và gắn với các tế bào niêm mạc ruột thỏ qua thí nghiệm quan sát dưới kính hiển vi điện tử). Khi theo nước uống hay thức ăn vào trong dạ dày, vi khuẩn chịu tác động của dịch dạ dày cĩ độ pH thấp ( mơi trường axit ). Những vi khuẩn sống xĩt sẽ tiếp tục xuống ruột non. Ở ruột non, vi khuẩn cĩ khả năng tồn tại rất Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên tốt. Phẩy khuẩn cĩ khả năng kháng tác động của muối mật, xâm nhập qua lớp màng nhầy trên niêm mạc ruột. Quá trình xâm nhập được hỗ trợ bởi men tan nhầy và các men phân cắt protein thành các peptide. Do khả năng "tự bơi", vi khuẩn cĩ thể chuyển động ngược chiều với nhu động ruột để tiếp cận với niêm mạc ruột nhờ đặc điểm hố hướng động của chúng. Khả năng gắn kết và cố định vào tế bào niêm mạc cĩ thể được hỗ trợ bởi các "sợi lơng" của chúng kết lại thành bĩ ở một đầu vi khuẩn. Các sợi này được gọi là toxin coregulated pili là các sợi phối hợp điều hồ độc tố. Biểu hiện các gene của các lơng này liên quan đến gene quyết định độc tố của vi khuẩn. Chúng ta chưa cĩ hiểu biết đầy đủ về tác động qua lại giữa các toxin coregulated pili với tế bào vật chủ. Các thụ quan trên về mặt tế bào tiếp nhận các sợi này cũng chưa được xác định. Chuỗi amino acid của coregulated pili tương tư như N-methylphenylalamine pili của Pseudomonas và Neisseria. Men tan nhầy của phẩy khuẩn giúp chúng phân giải các protein như fibronectin, lactoferrin và phân giải chính độc tố của nĩ. Vai trị của men trong cơ chế gây độc vẫn cịn là câu hỏi vì đột biến gene của men này vẫn khơng làm giảm độc lực của vi khuẩn. Cĩ giả thuyết cho rằng men tan nhầy cĩ tác dụng giúp vi khuẩn tách khỏi tế bào chứ khơng hỗ trợ quá trình gắn kết vì vi khuẩn cĩ xu hướng tách khỏi các tế bào trần để tìm đến những tế bào khác mới [26]. 1.2.8. Một số phƣơng pháp phát hiện V. cholerae trong phịng thí nghiệm Phương pháp soi kính hiển nền đen; Phương pháp nuơi cấy; Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang dùng kháng huyết thanh O1; Phản ứng đồng ngưng kết dùng kháng thể đơn dịng kháng kháng nguyên O1; Phản ứng ELISA dùng hạt nhiễm từ để tìm CT; Kít chẩn đốn nhanh Cholera Screen; Chẩn đốn bằng phương pháp sinh học phân tử ( PCR); Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phương pháp Real-time PCR. CHƢƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được tiến hành từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 9 năm 2009. Thu thập mẫu nghiên cứu từ những bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp nghi ngờ mắc tả tại các khoa lây của 6 bệnh viện trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên. Chẩn đốn xác định V. cholerae tại phịng thí nghiệm vi sinh Trung tâm Y tế Dự phịng Thái Nguyên. Thực hiện kỹ thuật PCR tại phịng vi khuẩn đường ruột Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. 2.2. Nguyên liệu nghiên cứu Gồm các chủng V. Cholerae phân lập được từ bệnh nhân trong quá trình nghiên cứu. Bao gồm các dụng cụ thơng thường được sử dụng trong phịng thí nghiệm vi sinh và sinh học phân tử (Đèn cồn, tăm bơng, que cấy, hộp petri, pipette pasteur, ống nghiệm, pipette man, đầu col các loại, ống eppendorf các cỡ, dung dịch glycerin, nước muối sinh lý, lọ đựng mẫu 100ml vơ trùng, găng tay cao su, khẩu trang, túi ninol các loại, hộp bảo quản mẫu, phích lạnh…) 2.3. Hĩa chất thiết bị Các loại hĩa chất sử dụng trong thí nghiệm khi thực hiện luận văn là các sản phẩm của các cơng ty hĩa chất cĩ uy tín trên thế giới và cĩ độ tinh khiết cao. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 2. 1. Danh mục một số dụng cụ, hĩa chất sử dụng trong nghiên cứu TT Tên hĩa chất, mơi trƣờng Hãng sản xuất (1) (2) (3) 1 Mơi trường Carry-blair Mecrk – Đức 2 Mơi trường TCBS Mecrk – Đức 3 Mơi trường Thạch kiềm pH 8,5-9,5 Mecrk – Đức 4 Kligler Iron Agar ( KIA) Mecrk – Đức 5 Mơi trường mannit - di động Mecrk – Đức 6 Mơi trường Ure - Indol Mecrk – Đức 7 Mơi trường basikow Mecrk – Đức 8 Thuốc thử Kovacs Mecrk – Đức 9 Kháng huyết thanh đa giá O1, O139 Anh 10 Kháng huyết thanh đơn giá (Ogawa, Inaba) Anh 11 Thuốc nhuộm Gram Mecrk – Đức 12 Kính hiển vi Đức 13 Máy PCR Mỹ 14 Máy đo pH Mettler – Thụy Sỹ 15 Bộ chạy điện di Đức 16 Máy chụp ảnh gel Mỹ 17 Máy trộn vortex Anh 18 Máy ly tâm Anh 19 Lị vi sĩng Sanyo 20 Máy lắc ổn nhiệt Anh Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Tủ lạnh sâu Sanyo 22 Cân phân tích Mettler – Thụy Sỹ 23 Tủ cấy vơ trùng Việt Nam 24 Nồi khử trùng Mỹ 25 Tủ ấm 37oC Memmect – Đức 2.4. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu. 2.4.1. Đối tƣợng nghiên cứu: Bệnh nhân tiêu chảy cấp nghi ngờ mắc bệnh tả được hệ thống giám sát bệnh truyền nhiễm ghi nhận trước khi tiến hành lấy mẫu. 2.4.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu Tính cỡ mẫu : Áp dụng cơng thức tính cỡ mẫu cho nghiên cứu mơ tả p x (1-p) n = Z(1-/2) -------------- d 2 n: cỡ mẫu α = 0,05 ; độ tin cậy 95% z1-α/2 : hệ số tin cậy. Với độ tin cậy là 95% thì hệ số tin cậy z(1-α/2) = 1,96 p = 0,5 : Tỷ lệ bệnh nhân bị tiêu chảy cấp phải nằm viện (giả định). d : sai số tuyệt đối chấp nhận = 6 % = 0,06 Thay vào cơng thức (1) cĩ n = 266 Cỡ mẫu thu thập được là: 270 Chọn mẫu cĩ chủ đích là những bệnh nhân bị bệnh tiêu chảy cấp cĩ triệu chứng lâm sàng nghi mắc bệnh tả. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 12.0 với các test thống kê thường dùng trong y tế, gồm: tần xuất, tỷ lệ %, tỷ suất chênh OR, so sánh sự khác nhau giữa các phương pháp bằng test 2. 2.4.3. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phương pháp dịch tễ học mơ tả cắt ngang: Nhằm đánh giá tình hình dịch tễ liên quan đến yếu tố mắc bệnh của bệnh nhân, mơ tả hiện tượng sức khỏe và các yếu tố nguy cơ cĩ liên quan đến sức khỏe đĩ một cách chính xác để tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm, điều tra cắt ngang sự phân bố tình trạng mắc bệnh tại thời điểm đang xảy ra dịch [37]. - Nghiên cứu thực nghiệm labo để đánh giá tỷ lệ phát hiện V.cholerae O1 đồng thời phân tích đánh giá hiệu quả của các phương pháp nghiên cứu để đưa ra tính ưu việt, phù hợp nhằm áp dụng thực tiễn tại cơ sở [37]. 2.4 3.1. Các kỹ thuật lấy mẫu và vận chuyển bệnh phẩm * Kỹ thuật lấy mẫu Thu thập và vận chuyển bệnh phẩm là một bước quan trọng trong quá trình phân lập và phát hiện các vi khuẩn gây bệnh đường ruột. Thu thập và vận chuyển bệnh phẩm khơng đúng cách sẽ ảnh hưởng đến kết quả chẩn đốn tác nhân gây bệnh và điều trị, mẫu bệnh phẩm là phân hoặc chất nơn, thức ăn, chất chứa trong ruột non, ruột già sau khi mổ tử thi, và người tiếp xúc với bệnh nhân, mẫu được thu thấp càng sớm càng tốt trước khi điều trị kháng sinh. Mẫu bệnh phẩm là phân phải được lấy càng sớm vì vi khuẩn ở trong phân rất nhiều trong những ngày đầu của bệnh và trước khi bắt đầu điều trị kháng sinh, sau khi lấy cho vào lọ khơng cĩ chất khử khuẩn hoặc chất tẩy rửa, nút lọ được đậy chặt chống rị rỉ, cĩ thể lấy phân bằng ống thơng trực tràng hoặc tăm bơng vơ trùng, bệnh phẩm cần được giữ nhiệt độ 4oC - 8oC và đưa ngay đến phịng xét nghiệm trong vịng 2 giờ, nếu ở ổ dịch xa phịng xét nghiệm, bệnh phẩm cần lấy bằng tăm bơng vơ trùng sau đĩ cho vào lọ cĩ Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên chứa mơi trường vận chuyển Carry - Blair và đưa về phịng xét nghiệm sớm trong điều kiện khơng cần giữ lạnh [4], [20]. Mẫu thực phẩm cần đảm bảo tính đại diện, thu thập mẫu tại nhiều vị trí trên thực phẩm, khối lượng mỗi mẫu khoảng 25 gam, mẫu được chuyển về phịng xét nghiệm sớm. Mẫu nước thu thập cĩ tính đại diện cho khối nước cần kiểm nghiệm, chọn nhiều vị trí mẫu khác nhau, tránh gây tạp nhiễm mẫu trong lúc thu thập, lấy nước vào bình thuỷ tinh vơ trùng 500-1000ml, nếu lấy ở sơng cần chọn nơi nước chảy giữa dịng độ sâu 20-30 cm. Giám sát người lành mang trùng trong một vụ dịch tả, tất cả những người tiếp xúc gần gũi với bệnh nhân tả đều được coi là cĩ thể mang mầm bệnh và vì vậy cần được theo dõi sức khỏe liên tục trong vịng 5 ngày kể từ lần tiếp xúc cuối cùng, để kịp thời phát hiện ca bệnh mới. Với những người tiếp xúc ở đầu vụ dịch cần được lấy phân xét nghiệm tìm vi khuẩn tả. Những người tiếp xúc gần và người lành mang vi khuẩn tả (phát hiện qua xét nghiệm phân) phải được điều trị dự phịng bằng kháng sinh. Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh được lấy 2 lần trong giai đoạn cấp tính và giai đoạn hồi phục. * Bảo quản bệnh phẩm Cần được giữ vào mơi trường bảo quản và vận chuyển khi ở xa phịng xét nghiệm và bệnh phẩm khơng được làm xét nghiệm sau 2 giờ (tính từ khi thu thập mẫu). Mơi trường vận chuyển Carry-Blair là mơi trường tốt nhất để bảo quản và vận chuyển, cĩ thể dùng dung dịch đệm glyxerin, mơi trường vận chuyển đã thu thập mẫu được chuyển sớm tới phịng xét nghiệm hoặc giữ ở tủ lạnh 4oC ( nếu chưa được xét nghiệm ngay ). Trong vụ dịch tả nguy hiểm mẫu bệnh phẩm cần được lưu giữ trong hộp sắt kín để tránh lây lan trong quá trình vận chuyển [34]. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.4.3.2. Các phƣơng pháp chẩn đốn V. cholerae Sơ đồ các phƣơng pháp chẩn đốn V. cholerae trong phịng thí nghiệm [13]. Hình 2.1. Sơ đồ phân lập chẩn đốn V. cholerae TCBS, Th¹ch KiỊm 370C/ 24 giê TÝnh chÊt sinh ho¸ 370C/3-6 giê Soi T•¬i Pepton kiỊm 370C/3-6 giê TCBS, Th¹ch KiỊm Oxidaza (+) KIA: Glucoza(+); Lactoza (-); H¬i(-); H2S (-) Mannit (+); di ®éng (+) Urea (-); Indol (+) LDC: (+) Saccaroza: (+) Arabinoza:(-) Mannoza: (+) Ng•ng kÕt kh¸ng huyÕt thanh §a gi¸ O1 §a gi¸ O139 §¬n gi¸ Ogawa §¬n gi¸ Inaba 370C/3-6 giê Pepton kiỊm BƯnh phÈm Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên * Kỹ thuật soi tƣơi trực tiếp Hịa mẫu phân vào nước muối sinh lý, nhỏ một giọt lên lam kính, đậy la men, soi tiêu bản trực tiếp bằng kính hiển vi ( Hình 3.4 ) kết quả cho thấy vi khuẩn di động rất nhanh theo những đường thẳng từ đầu đến cuối vi trường, soi tiêu bản trên kính hiển vi nền đen, phẩy khuẩn di động như sao đổi ngơi. Tiến hành soi tươi trực tiếp mẫu phân và chất nơn của bệnh nhân nhằm phát hiện vi khuẩn di động. Soi tiêu bản trên kính hiển vi nền đen vi khuẩn tả cĩ một lơng ở đầu nên khả năng di động rất mạnh như sao đổi ngơi. Trong quá trình nghiên cứu chúng tơi thực hiện các bước như sau: - Lam kính 1: Hồ mẫu phân vào nước muối sinh lý, nhỏ 1 giọt lên lam kính, đậy phiến kính mỏng (lamen) lên trên. Soi tiêu bản trực tiếp trên kinh hiển vi nếu nghi ngờ V. cholerae vi khuẩn di động rất nhanh theo những đường thẳng từ đầu đến cuối vi trường (tuy nhiên cĩ một số vi khuẩn đường ruột khác cũng di động khi soi tươi trên kính hiển vi). - Lam kính 2: Nhỏ một giọt huyền dịch phân lên lam kính, nhỏ một giọt kháng huyết thanh tả đa giá. Phương pháp soi tiêu bản trực tiếp trên kính hiển vi nền đen đã được sử dụng từ lâu, nhưng khơng được phù hợp với điều kiện của các phịng xét nghiệm tuyến huyện, trên kính hiển vi nền đen phẩy khuẩn tả di động như sao đổi ngơi. Hình 2.2. Hình vẽ lam kính và la men soi tƣơi bằng kính hiển vi Lam kính Lamen Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phương pháp soi tươi trên kính hiển vi nền đen hoặc phản pha dùng để phát hiện tính di động của V. cholerae, đặc biệt khi phân của bệnh nhân chứa >10 5 vi khuẩn/gam phân. Hơn nữa kỹ thuật này cịn dùng kết hợp kháng huyết thanh V. cholerrae để ức chế sự di động trên nền khi soi và chỉ trong vịng từ 3 - 5 phút khoảng 50% vi khuẩn V. cholerae bị tụ lại, vì vậy kỹ thuật này cĩ giá trị để chẩn đốn nhanh trong vùng cĩ dịch, độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật này tùy thuộc vào kinh nghiệm của kỹ thuật viên. * Kỹ thuật nhuộm Gram Kỹ thuật nhuộm Gram phát hiện hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn, với thành phần thuốc nhuộm gồm cĩ tím gentian, dung dịch lugol, Fucsin kiềm bằng cách cố định tiêu bản sau đĩ nhỏ thuốc nhuộm tím gentian lên trong 2 phút, rửa nước, sau đĩ nhỏ dung dịch lugol lên trong 2 phút, hất đi, tẩy mầu bằng cồn 90o tới khi bạc màu, rửa nước, nhỏ dung dịch Fucsin kiềm ( pha lỗng tỷ lệ 1/10 ) lên trong 1/2 phút, rửa nước, để tiêu bản khơ trong khơng khí hoặc dùng giấy thấm, soi tiêu bản bằng vật kính dầu. Nhận biết vi khuẩn Gram âm bắt màu đỏ, cĩ hình thể mảnh, cong, hình dấu phẩy, khơng cĩ vỏ, khơng sinh nha bào, khi nuơi cấy lâu ngày sẽ cĩ sự thay đổi về hình thể so với ban đầu. * Phƣơng pháp dùng kít nhanh Dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch, màng nitrocellulose được gắn với kháng thể đơn dịng đặc hiệu với V. cholerae O1 và O139 thành hai băng riêng biệt, khi mẫu thử đi qua màng nitrocellulose, Colloidal Gold (chất keo vàng) cặp đơi với kháng thể đơn dịng, cặp đơi này gắn với kháng nguyên của mẫu thử. Hỗn hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ thấm qua màng nitrocellulose và gắn với kháng thể kháng V. cholerae O1 và O139 và hình thành các băng màu đỏ. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên * Kỹ thuật nuơi cấy Chọn lọc những khuẩn lạc thuần khiết qua các bước cấy chuyển khác nhau do vậy tính chất mơi trường nuơi cấy phải cĩ tính chọn lọc ức chế loại vi khuẩn này nhưng lại phù hợp với loại vi khuẩn kia, phương pháp nuơi cấy được coi là “tiêu chuẩn vàng” tuy nhiên vẫn cĩ mặt hạn chế là thời gian trả lời kết quả khảng định lâu phải mất thời gian từ 24 giờ - 48 giờ và khơng phát hiện được V. cholerae nếu bệnh nhân đã dùng thuốc kháng sinh. * Kỹ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction ) Dùng để phát hiện gen ctx, kỹ thuật này cĩ độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn các kỹ thuật khác, ngồi ra áp dụng kỹ thuật PCR để tìm độc tố CT trong thực phẩm, PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong cơng nghệ sinh học hiện đại và đã đĩng gĩp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến vơ cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot. Kỹ thuật PCR dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ Taq polymerase để khếch đại in vitro các nucleic acid đặc trưng. PCR cho phép khếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA cĩ chiều dài từ 200 – 3000 bp. Đoạn DNA được khếch đại ( DNA đích ) được nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng thường cĩ chiều dài khoảng 20 nucleotide. Taq polymerase là một loại enzyme chịu nhiệt được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong mơi trường cĩ 4 loại deoxy nucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuơn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuơn mẫu. Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA nĩi trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy cĩ thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dịng [21], [25]. 2.4.3.3. Tiêu chuẩn đánh giá V. cholerae dƣơng tính trong nghiên cứu * Soi tươi : Hình thể nhỏ, di động nhanh trên lam kính; * Nhuộm Gram: Gram âm, hình cong dấu phẩy; Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên * Nuơi cấy: + Trên mơi trường pepton kiềm mặn, mọc đục 3-6 h, cĩ váng nổi mặt mơi trường; + Trên mơi trường thạch kiềm khuẩn lạc nhỏ, trong, trịn, bờ đều, vi khuẩn mọc sau 6-24 giờ; + Trên mơi trường thạchTCBS nếu nghi ngờ V. cholerae khuẩn lạc màu vàng, nhỏ, trong, thời gian mọc khuẩn lạc 12 – 24 giờ; + Phản ứng Oxidaza : Dương tính khi chuyển màu xanh tím; + Sinh vật hố học: Lên men đường Mannoza, Sacaroza, Arabinoza; + Ngưng kết KHT đa giá và đơn giá; * Test nhanh : Xuất hiện 2 vạch là vạch chứng và vạch mẫu thử; * Phương pháp PCR dương tính. CHƢƠNG III Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đặc điểm chung của đối tƣợng nghiên cứu 3.1.1. Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới, tuổi Giới tính và lứa tuổi là một trong những đặc điểm được chúng tơi quan tâm kết hợp với yếu tố dịch tễ khi tiến hành lấy mẫu xem khả năng bị mắc bệnh tả ở giới nào hoặc độ tuổi bao nhiêu. Nên trong quá trình tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm trên bệnh nhân, chúng tơi thu thập được một số thơng tin về sự phân bố theo giới tính và nhĩm tuổi như sau: Bảng 3.1. Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới, tuổi Giới n X ± SD Trung vị min - max Nữ 164 34,2±14,5 34(24-45) 8 - 67 P> 0,05 Nam 106 31,8±15,5 34(17-44) 5 - 68 Tổng 270 33,3±14,9 34(21-45) 5 - 68 Bảng phân bố đối tượng nghiên cứu ( Bảng 3.1; bảng 3.2; biểu đồ 3.1) cho thấy nhĩm tuổi thấp nhất đối với nữ là 8 và đối với nam là 5; độ tuổi cao nhất đối với nữ là 67 đối với nam là 68. Kết quả cho thấy sự khác biệt về tuổi giữa các bệnh nhân nam và nữ khơng cĩ ý nghĩa thống kê ( P > 0,05 ) Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 18 22 46 79 95 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 5-10 Tuổi > 50 Tuổi 11-20 Tuổi 41 - 50 Tuổi 31-40 Tuổi 21-30 Tuổi Số mẫu thu thập tính theo độ tuổi Biểu đồ 3.1. Đánh giá độ tuổi trong thu thập mẫu Nghiên cứu của Nguyễn Đăng Hiền và cộng sự (2008 ) cho kết quả trong tổng số 1.808 trẻ em nhập viện do tiêu chảy cĩ tới 1.018 trẻ tiêu chảy cấp do virut Rota và hầu hết các trường hợp này thường xuất hiện chủ yếu trong 3 năm đầu khi trẻ mới sinh [12]. Trong nghiên cứu chúng tơi khơng đánh giá tác nhân do virut Rota, chỉ tham khảo qua điều trị của thầy thuốc, chủ yếu dựa vào các biểu hiện lâm sàng để loại bỏ nguyên nhân gây tiêu chảy do vi rút nên lứa tuổi 5-10 thu thập được 10 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 3,6 % , Lứa tuổi này cĩ tỷ lệ nghi mắc tả thấp cũng phù hợp với các nghiên cứu khác vì sự biến động của lứa tuổi này khơng lớn mọi sinh hoạt phụ thuộc gia đình, nếu cĩ thời gian chúng tơi đánh giá thêm tác nhân do virut Rota ở lứa tuổi mới sinh đến 10 tuổi thì ý nghĩa nghiên cứu sẽ mở rộng hơn. Nghiên cứu của M.Ehara và cộng sự (2004) cho rằng nguy cơ mắc bệnh tả của trẻ em dưới 15 tuổi thường tăng vào đầu vụ dịch [55]. Nghiên cứu của Thẩm Chí Mục (1994) cho kết quả ngược lại cho rằng nhĩm tuổi này lại tăng vào cuối vụ dịch [28]. Tuy nhiên các kết quả trên cũng chỉ dừng lại đánh giá một vụ dịch nhưng cũng cĩ thể là những gợi mở cho các nghiên cứu tiếp theo trong chương trình phịng chống các bệnh tiêu chảy ở nhĩm tuổi này. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 3.2. Tỷ lệ bệnh nhân theo tuổi Tuổi Số mẫu Tỷ lệ (%) 5 -10 10 3,60 11-20 22 8,15 21 -30 95 35,17 31-40 79 29,15 41-50 46 17,36 >50 18 6,57 Tổng cộng 270 100 Lứa tuổi từ 21- 30 thu thập được 95 mẫu chiếm tỷ lệ 35,17 % lứa tuổi 31- 40 thu thập được 79 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 29,15 % sau đến lứa tuổi 41 – 50 chiếm tỷ lệ 17,36 % ( Bảng 3.2 ). Đây là những lứa tuổi lao động quan trọng trong xã hội và cĩ tỷ lệ mắc tả cao nhất so với các lứa tuổi khác, ở lứa tuổi này cĩ nhiều mối liên quan về yếu tố dịch tễ như đi học, đi cơng tác, đi làm…và điều đặc biệt sinh hoạt ăn uống ở quán cơm bình dân nên yếu tố vệ sinh khơng đảm bảo. Nghiên cứu Thẩm Chí Mục (1996) đã đánh giá vai trị của thực phẩm và vệ sinh của người phục vụ kết quả là 28,7 % số mẫu thực phẩm khơng đạt tiêu chuẩn vệ sinh và 20 % mẫu bàn tay nhân viên khơng đạt tiêu chuẩn [27]. Phan Đạo và cộng sự cho rằng trong thời gian đỉnh của vụ dịch tỷ lệ phân lập được vi khuẩn tả cao trên 50% [9]. Với nghiên cứu của chúng tơi tỷ lệ phân lập dương tính vi khuẩn tả là 5,93 %. Qua điều tra yếu tố dịch tễ của các bệnh nhân trước khi vào viện cĩ 11 bệnh nhân mắc bệnh tả cĩ nguồn lây nhiễm mầm bệnh từ Hà Nội chiếm tỷ lệ 68,75 %. Phải chăng tại tỉnh Thái Nguyên chưa đến điểm đỉnh của vụ dịch mà tỷ lệ mắc bệnh do yếu tố bên ngồi đưa đến sau đĩ được phát hiện. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phân bố nhĩm đối tượng theo giới tính 39.30% 60.70% Nữ Nam Biểu đồ 3.2. Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới tính Nhìn chung bệnh tả khơng phân biệt theo giới tính, mọi người đều cĩ thể mắc bệnh. Nghiên cứu của Vũ Minh Hương và cộng sự (1994 ) cho biết tỷ lệ dương tính ở nữ là 57,88 % và ở nam giới là 42,12 % [16]. Theo nghiên cứu của Dalsgaard A và cộng sự (1997) ở Peru đã xảy ra vụ dịch tả tác nhân do V. cholerae O1 đã cĩ 230 người mắc tiêu chảy cấp trong đĩ tỷ lệ nữ mắc bệnh là 59,24 % và nam giới mắc bệnh là 40,76 % [54]. Kết quả ( Biểu đồ 3.2) cho thấy tỷ lệ nữ mắc tiêu chảy cấp là 60,7 % và nam 39,3 % cũng phù hợp với nhận xét của các tác giả trên ( Biểu đồ 3.2 ). Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 3.3. Phân bố bệnh nhân dƣơng tính V. cholerae theo giới tính Giới tính Mắc tả Tỷ lệ % Nam 9 56,25 Nữ 7 43,75 Tổng 16 100 Phân bố bệnh nhân dương tính V. cholerae theo giới tính cho kết quả 9 bệnh nhân nam mắc chiếm tỷ lệ 56,25 % trong khi đĩ nữ cĩ 7 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 43,75 % ( Bảng 3.3 ) Tất cả các lứa tuổi đều cĩ thể mắc tả, nhưng cĩ tác giả cho rằng ở lứa tuổi trẻ và tuổi cao trên 50 tuổi cĩ tỷ lệ mắc cao [18], [45], nghiên cứu của CDC (2004) nhận xét khi khơng kiểm sốt yếu tố dịch tễ dịch sẽ lan rộng trong cộng đồng lúc đĩ lứa tuổi từ 26-50 tỷ lệ mắc sẽ thấp hơn so với lứa tuổi từ 1-18 tuổi hoặc tuổi trên 50 [49], phải chăng sức đề kháng của trẻ em và người cao tuổi yếu nên tỷ lệ mắc bệnh cao. Hiện nay chưa cĩ nghiên cứu nào đưa ra một thang tuổi nhất định cĩ tính chất mẫu về các trường hợp mắc tả. Nhận xét của chúng tơi cũng phù hợp với nhận xét nghiên cứu của Thẩm Chí Mục về đánh giá đặc điểm dịch tễ học bệnh tả qua các vụ dịch ở Nam Hà tỷ lệ nam giới chiếm tỷ lệ 54,38 % [27]. 3.1.2. Phân bố lấy mẫu bệnh nhân theo địa điểm lấy mẫu Các mẫu trong nghiên cứu được thu thập là lấy mẫu phân của những bệnh nhân đến điều trị tại 6 khoa lây của bệnh viện trên địa bàn tỉnh với tiêu chuẩn lựa chọn là những bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp, với các triệu chứng lâm sàng điển hình nghi mắc tả, khơng sốt. Kết quả được trình bày tại ( Bảng 3.4 ) Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 3.4. Tỷ lệ thu thập mẫu các địa điểm nghiên cứu Mã hĩa Địa điểm lấy mẫu Tỷ lệ (%) BV1 Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên 45,19 BV2 Bệnh viện Đa khoa huyện Đồng Hỷ 14,07 BV3 Bệnh viện C 12,59 BV4 Bệnh viện A 10,74 BV5 Bệnh viện Đa khoa huyện Đại Từ 8,89 BV6 Bệnh viện Đa khoa huyện Định Hĩa 8,52 Tổng: 100 Trên 6 bệnh viện lấy mẫu cho thấy: BV1 là bệnh viện trực thuộc Trung ương nằm trung tâm tỉnh Thái Nguyên, Thành phố Thái Nguyên cĩ diện tích 177 km 2, dân số 294.759 người với một trường Đại học Thái Nguyên gồm 6 trường Đại học thành viên và hơn 20 trường trung cấp, cao đẳng, số giường bệnh trên 500 giường do vậy số bệnh nhân nhân nghi mắc tả cũng chiếm tỷ lệ cao. Trong nghiên cứu của chúng tơi cho thấy số bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp nghi tả ở BV1 chiếm tỷ lệ cao nhất 45,19 %. Ngược lại ở BV6 là hu._.