Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch Lợn dạng cọng rạ phục vụ tạo và nhân giống Lợn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------ NGUYỄN THỊ HẬU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH LỢN DẠNG CỌNG RẠ PHỤC VỤ TẠO VÀ NHÂN GIỐNG LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------ NGUYỄN THỊ HẬU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH LỢN DẠNG CỌNG RẠ PHỤC VỤ TẠO VÀ NHÂN GIỐNG LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Chăn nuôi Mã số: 606240 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : 1. TS. Nguyễn Mạnh Hà 2. TS. Đào Đức Thà THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Lời cảm ơn Để hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu của bản thân, tôi còn nhận đƣợc sự giúp đỡ, hƣớng dẫn tận tình của nhiều cá nhân, đơn vị và tập thể khác. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Nguyễn Mạnh Hà Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên và TS. Đào Đức Thà Phó Bộ môn Sinh lý sinh hóa và tập tính vật nuôi Viện Chăn nuôi Quốc gia, những ngƣời đã dành nhiều thời gian, tâm huyết chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập. Tôi xin gửi tới các thầy giáo, cô giáo trong trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên nói chung, khoa Chăn nuôi nói riêng những ngƣời đã giúp đỡ, giảng dạy tôi trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Chăn nuôi và toàn thể cán bộ công nhân viên của Viện, đặc biệt các anh, các chị là cán bộ trong Bộ môn Sinh lý sinh hóa và tập tính vật nuôi Viên chăn nuôi, Trung tâm thực nghiệm và bảo tồn vật nuôi Viện chăn nuôi và Phòng thí nghiệm công nghệ tế bào động vật Viện Chăn nuôi, những ngƣời luôn hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài này. Xin bày tỏ lòng biết ơn tới ngƣời thân, bạn bè và đồng nghiệp luôn ở bên tôi, luôn giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên và thực tập tại Viện Chăn nuôi! Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2009 Sinh viên Nguyễn Thị Hậu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 LỜI CAM ĐOAN T«i xin cam ®oan ®©y lµ c«ng tr×nh nghiªn cøu cña riªng t«i. C¸c sè liÖu, kÕt qu¶ nªu trong luËn v¨n lµ trung thùc vµ ch•a tõng ®•îc ai c«ng bè trong bÊt k× c«ng tr×nh nµo kh¸c. T«i xin cam ®oan r»ng c¸c th«ng tin trÝch dÉn trong luËn v¨n ®Òu ®· ®•îc chØ râ nguån gèc. Tác giả Nguyễn Thị Hậu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A ( Progressive. Motility ) ASTT C cs ctv DAP DCL DSL I ( Immotile) Motility NST L ( Local motility ) TTNT TTON V VAC VCL VAP VSL : Hoạt lực của tinh trùng : Áp suất thẩm thấu : Nồng độ tinh trùng : Cộng sự : Cộng tác viên : Độ dài đƣờng trung bình : Độ dài đƣờng ziczăc : Độ dài đƣờng thẳng : Tinh trùng không hoạt động : Hoạt động của tinh trùng : Nhiễm sắc thể : Tinh trùng hoạt động tại chỗ : Thụ tinh nhân tạo : Thụ tinh ống nghiệm : Lƣợng tinh dịch trong một lần lấy tinh : Tổng số timh trùng tiến thẳng : Tốc độ chuyển động theo đƣờng ziczăc : Tốc độ chuyển động theo đƣờng trung bình : Tốc độ chuyển động theo đƣờng thẳng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Một số chỉ tiêu chất lƣợng tinh nguyên trƣớc đông lạnh ............... 52 Bảng 3.2. Khoảng cách và vận tốc của tinh trùng ở các giống lợn ................ 58 Bảng 3.3. Đặc điểm của môi trƣờng ly tâm (n=60) ....................................... 59 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của hai môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng ..... 60 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng của giống lợn Landrace. ...................................................................................... 62 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng của giống lợn Yorkshire...................................................................................... 62 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng của ... 63 giống lợn Duroc ........................................................................................... 63 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của tốc độ ly tâm đến sức sống của tinh trùng……….65 Bảng 3.9. Sức sống tinh trùng sau ly tâm của các giống lợn ......................... 67 Bảng 3.10. Đặc điểm môi trƣờng cân bằng (n= 60) ...................................... 68 Bảng 3.11. Chất lƣợng tinh dịch sau cân bằng của giống Landrace .............. 69 Bảng 3.12. Chất lƣợng tinh dịch sau cân bằng của giống Yorkshire ............. 70 Bảng 3.13. Chất lƣợng tinh dịch sau cân bằng của giống Duroc ................... 70 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của thời gian đông lạnh đến sức sống của tinh trùng 71 (n= 70) ......................................................................................................... 71 Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của thời gian giải đông đến sức sống tinh trùng ..... 73 (n=70) .......................................................................................................... 73 Bảng 3.16. Chất lƣợng tinh dịch đông lạnh sau giải đông của các giống lợn 75 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Biểu đồ 3.1: Biểu đồ so sánh thể tích tinh dịch của các giống lợn................ 53 Biểu đồ 3.2: Biểu đồ so sánh hoạt lực tinh trùng của các giống .................. 54 Biểu đồ 3.3: Biểu đồ so sánh nồng độ C (tr/ml) của các giống..................... 55 Biểu đồ 3.4: Biểu đồ so sánh VAC (tỷ) trong một lần lấy tinh ...................... 56 Biêủ đồ 3.5: Biêủ đồ so sánh Motility (%), A (Progressive.Motility %) tinh trùng trong 2 môi trƣờng ly tâm ................................................................... 61 Biêủ đồ 3.6: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng ở tinh nguyên và tinh pha trong môi trƣờng ly tâm (VCN). ............................................................ 64 Biêủ đồ 3.7: Biểu đồ so sánh hoạt lƣc (A ) tinh trùng ở các chế độ ly tâm .... 66 Biêủ đồ 3.8: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng trƣớc, và sau đông lạnh ở thời gian đông lạnh 10 phút và 20 phút......................................................... 72 Biêủ đồ 3.5: Biểu đồ so sánh hoạt lƣc (A) tinh trùng ở thời gian giải đông 30 giây và 45 giây ............................................................................................. 74 Biêủ đồ 3.10: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng sau giải đông ở các giống lợn ...................................................................................................... 76 Biêủ đồ 3.11: Biểu đồ so sánh độ dài các chuyển động của tinh trùng ........ 77 Biêủ đồ 3.12: Biểu đồ so sánh vận tốc chuyển động của tinh trùng ở các dạng vận động ....................................................................................................... 77 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 10 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ............................................................ 10 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ..................................................................... 11 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ........................ 11 CHƢƠNG 1 ................................................................................................. 12 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 12 1.1. Vai trò của lợn đực giống và thụ tinh nhân tạo trong chăn nuôi lợn ở nƣớc ta ....................................................................................................................... 12 1.2. Cơ sở của những nghiên cứu về tinh dịch và tinh trùng lợn ....................... 13 1.2.3. Một số đặc tính sinh lý của tinh trùng lợn ............................................... 18 1.2.4. Một số chỉ tiêu chất lƣợng tinh dịch lợn ................................................. 24 1.2.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh dịch ...................................... 27 1.3. Cơ sở khoa học của kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn ................................ 31 1.3.1. Một số nguyên lý cơ bản về đông lạnh tinh dịch .................................... 32 1.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng tới sức sống tinh trùng trong đông lạnh ............... 35 1.3.3. Cơ sở khoa học của môi trƣờng đông lạnh tinh dịch lợn ........................ 37 1.3.4. Cơ sở khoa học về quy trình đông lạnh tinh dịch lợn .............................. 41 1.4. Tình hình nghiên cứu đông lạnh tinh dịch lợn trong nƣớc và ngoài nƣớc . 42 1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc ........................................................... 42 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ............................................................ 44 CHƢƠNG 2 ................................................................................................. 45 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG ...................................................... 45 VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 45 2.1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu................................................................... 45 2.1.1. Tinh dịch lợn đực .................................................................................... 45 2.1.2. Hoá chất và các dụng cụ thí nghiệm. ...................................................... 45 2.2. Yêu cầu ...................................................................................................... 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.............................................................. 45 2.4. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................... 46 2.4.1. Nghiên cứu một số chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng của tinh dịch lợn trƣớc khi đông lạnh .................................................................................................... 47 2.4.3. Nghiên cứu sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh .......................................... 51 2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ......................................................................... 51 CHƢƠNG 3 ................................................................................................. 52 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................. 52 3.1. Kết quả nghiên cứu về một số chỉ tiêu chất lƣợng tinh dịch lợn trƣớc khi đông lạnh. ......................................................................................................... 52 3.2. Kết quả nghiên cứu về kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn ............................ 59 3.2.1.Kết quả nghiên cứu kỹ thuật ly tâm ......................................................... 59 3.2.2. Kết quả nghiên cứu kỹ thuật cân bằng tinh dịch .................................... 68 3.2.3. Kết quả nghiên cứu đông lạnh tinh dịch trong hơi nitơ. .......................... 71 3.2.4. Kết quả nghiên cứu nhiệt độ và thời gian giải đông tinh dịch đông lạnh .......................................................................................................................... 73 Nhƣ vậy kết quả sử dụng tinh đông lạnh phối giống cho lợn nái trong sản xuất cần phải nghiên cứu sâu hơn nhằm nâng cao hiệu quả. Tuy nhiên với kết quả bƣớc đầu nhƣ trên cũng đã khẳng định đƣợc thành công của kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn.......................................................................................... 80 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 81 1. KẾT LUẬN .............................................................................................. 81 2. ĐỀ NGHỊ ................................................................................................. 82 I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ........................................................................... 83 II. TÀI LIỆU TIẾNG ANH .......................................................................... 84 III. TÀI LIỆU TIẾNG PHÁP ....................................................................... 87 IV. TÀI LIỆU TIẾNG ĐỨC......................................................................... 87 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Hiện nay, kỹ thuật thụ tinh nhân tạo gia súc nói chung và kỹ thuật thụ tinh nhân tạo lợn nói riêng đã đƣợc nghiên cứu và áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới. Để có vật liệu cung cấp cho thụ tinh nhân tạo, trƣớc hết phải có một quy trình bảo quản nhằm giữ cho tinh trùng vẫn đảm bảo chất lƣợng khi ở ngoài cơ thể. Quy trình đó bao gồm các kỹ thuật nhƣ: kỹ thuật pha loãng, kỹ thuật bảo tồn và kỹ thuật đông lạnh tinh dịch. Trên thế giới, kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất, thành công kỳ diệu về đông lạnh tinh dịch lợn đã đƣa kỹ thuật thụ tinh nhân tạo (TTNT) lên một vị trí mới, đã có những ngân hàng tinh dịch đông lạnh năng suất cao. Sự hiện diện của các ngân hàng tinh dịch đông lạnh đã giúp cho việc vận chuyển, trao đổi, mua bán giống trên thế giới trở nên thuận tiện và giảm nguy cơ lan truyền mầm bệnh. Đồng thời kỹ thuật đông lạnh tinh dịch sẽ góp phần bảo tồn lâu dài tinh dịch của một số giống địa phƣơng quý hiếm. Ở nƣớc ta kỹ thuật đông lạnh tinh dịch bò đã đƣợc nghiên cứu, sản xuất, áp dụng rộng rãi trong sản xuất, tuy nhiên kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn mới bƣớc đầu đƣợc nghiên cứu. Một số nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn theo công nghệ Nhật Bản và Mỹ đã đƣợc tiến hành, bƣớc đầu có kết quả nhƣng chƣa áp dụng trong sản xuất. Để góp phần làm phong phú thêm các kỹ thuật và công nghệ mới trong sinh sản và thụ tinh nhân tạo lợn, đồng thời áp dụng những kết quả nghiên cứu vào sản xuất, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ phục vụ tạo và nhân giống lợn”. Thuộc đề tài công nghệ sinh học cấp nhà nước: “Nghiên cứu ứng dụng tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo và nhân giống lợn”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định đƣợc kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ. - Sử dụng tinh dịch đông lạnh dạng cọng rạ trong sản xuất và thụ tinh trong ống nghiệm. 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Đề tài sẽ đề xuất đƣợc một kỹ thuật mới trong kỹ thuật thụ tinh nhân tạo - công nghệ đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ. - Phục vụ chƣơng trình tạo và nhân giống lợn, làm cơ sở và góp phần trong bảo tồn quỹ gen (bảo tồn tinh dịch những giống lợn quý hiếm). - Bổ sung vào tài liệu và nghiên cứu khoa học. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vai trò của lợn đực giống và thụ tinh nhân tạo trong chăn nuôi lợn ở nƣớc ta Lợn đực giống có vai trò quan trọng trong việc đƣa nhanh tiến bộ di truyền. Một con đực giống sử dụng trong thụ tinh nhân tạo cho số con đời sau gấp trên 355 lần so với một con nái, và sử dụng phối giống trực tiếp chỉ cho số con đời sau gấp 40,5 lần so với lợn nái. Ảnh hƣởng của đực giống đến đời sau không chỉ ở phạm vi số lƣợng mà cả ở chất lƣợng, nhiều tính trạng trội của đực giống thƣờng đƣợc biểu hiện ở đời con nhƣ: màu sắc lông, da, thể chất khoẻ mạnh, tính cao sản, sức miễn kháng với bệnh tật. Một số tác giả đã chứng minh sức sống của đời sau cũng phụ thuộc vào sức sống của tinh trùng. Do đó chăn nuôi tốt lợn đực giống là một trong những nhân tố quan trọng trong việc phát triển nâng cao năng suất, chất lƣợng sản phẩm của ngành chăn nuôi lợn. Hiện nay, với sự kế thừa thành tựu của các lĩnh vực sinh lý học, di truyền học, dinh dƣỡng gia súc…… và kết hợp với thực tế chăn nuôi lợn nói chung, chăn nuôi lợn đực giống nói riêng đã không ngừng đƣợc cải thiện và hoàn thiện. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo có những ƣu điểm vƣợt trội sau: - An toàn dịch bệnh: ngăn ngừa bệnh từ con đực truyền sang con cái và ngƣợc lại. - Giảm số lƣợng đực giống phải nuôi - Nâng cao nhanh tiến bộ di truyền cho đời sau, cho phép sử dụng rộng rãi và phát huy tiềm năng di truyền của những đực giống tốt (sử dụng tinh dịch bảo tồn nhiều ngày hoặc tinh dịch đông lạnh) - Theo dõi quản lý giống chính xác và rõ ràng - Rất cần thiết khi áp dụng phƣơng pháp gây động dục hàng loạt. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 1.2. Cơ sở của những nghiên cứu về tinh dịch và tinh trùng lợn 1.2.1. Sinh lý sinh dục gia súc đực 1.2.1.1. Sự thành thục tính dục Sự thành thục về tính dục thƣờng biểu hiện sớm hơn sự thành thục về thể vóc. Lợn đực thành thục tính dục vào khoảng 8 tháng tuổi trở lên khi đó khối lƣợng cơ thể đạt 90- 100kg (đối với lợn đực ngoại), từ 6 tháng tuổi trở lên và khối lƣợng cơ thể đạt từ 70- 80kg (đối với lợn lai), từ 5 tháng tuổi trở lên và khối lƣợng cơ thể đạt 45- 50kg (đối với lợn nội). 1.2.1.2. Cấu tạo bộ máy sinh dục lợn đực Hệ sinh dục lợn đực gồm các bộ phận chủ yếu sau: - Bao dịch hoàn: mỗi dịch hoàn đƣợc bao bọc bởi một bao sợi (màng trắng), bên ngoài đƣợc phủ bằng một tinh mạc, bên trong đƣợc phủ bởi một màng mạch máu. - Dịch hoàn (testis) hay còn gọi tinh hoàn: vừa là tuyến nội tiết vừa là tuyến ngoại tiết. Dịch hoàn sản sinh tinh trùng và tiết hormon sinh dục testosteron có tác dụng phát triển đặc điểm giới tính. Cấu tạo của dịch hoàn gồm: + Giáp mạc riêng (tunica vaginalis propria): cấu tạo bởi 1 lớp sợi bền, là phần kéo dài của phúc mạc. + Màng trắng (tunica ablugine a): từ đây phát ra nhiều bức ngăn hình tia, chia dịch hoàn thành nhiều múi. Mỗi múi đều chứa những ống sinh tinh uốn khúc (tubuli abluginea) trong đó tinh trùng đƣợc hình thành. Tất cả các ống sinh tinh đều hƣớng về vách giữa của dịch hoàn. + Mạng tinh (rate testis) và thể Haimo (Highmor): khi đi vào vách giữa của dịch hoàn, những ống sinh tinh uốn khúc biến thành những ống sinh tinh thẳng và đan chéo vào nhau tạo thành mạng tinh. Mạng tinh cùng với vách giữa của dịch hoàn tạo thành thể Haimo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 - Dịch hoàn phụ (Epididymis): ở lợn đực dịch hoàn phụ rất phát triển, có thể đạt tới 150 – 200 gam ở lợn trƣởng thành, dịch hoàn phụ là cái kho để chứa tinh trùng, có cấu tạo đơn giản: ngoài cùng là một lớp màu trắng, bên trong là một hệ thống ống uốn lƣợn ngoằn ngoèo, tất cả các ống đó tập trung lại đổ vào một cái ống đi ra khỏi đầu dƣới của dịch hoàn phụ gọi là ống dẫn tinh. Tinh trùng không ngừng đƣợc sinh ra ở ống sinh tinh sau đó đi vào dịch hoàn phụ và lƣu lại đó một thời gian. Khi vào dịch hoàn phụ tinh trùng không vận động, không có khả năng thụ tinh. Trong đầu dịch hoàn phụ đuôi tinh trùng có sự rung động nhẹ, tại thân dịch hoàn phụ tinh trùng có tiềm năng chuyển động tiến thẳng nhƣng bị ức chế (môi trƣờng trong dịch hoàn phụ có tính axit yếu, áp suất thẩm thấu cao), trong đuôi dịch hoàn phụ sự trao đổi chất của tinh trùng tăng lên, tinh trùng xuất hiện khả năng hoạt động. Tinh trùng lợn di chuyển qua dịch hoàn phụ quãng 9 - 14 ngày, chia ra đầu dịch hoàn phụ: 3 ngày; thân dịch hoàn phụ: 2 ngày; đuôi dịch hoàn phụ: 4 - 9 ngày. Biến đổi của tinh trùng trong dịch hoàn phụ nhƣ sau: giọt bào tƣơng trƣợt từ vị trí gần tâm xuống vị trí xa tâm trên đoạn giữa của tinh trùng. Hiện tƣợng này xảy ra khi tinh trùng di chuyển từ đầu xuống thân dịch hoàn phụ. Trong đuôi dịch hoàn các giọt bào tƣơng đều ở xa tâm và không còn bám theo tinh trùng khi tinh dịch đƣợc xuất ra ngoài. Khi vào đến dịch hoàn phụ, một số tinh trùng có thể bị kỳ hình, số này giảm xuống khi đi qua vùng gần tâm đến vùng xa tâm của đầu dịch hoàn phụ. Đuôi dịch hoàn phụ làm nhiệm vụ lọc đặc biệt góp phần cải thiện chất lƣợng tinh dịch khi tinh dịch đƣợc xuất ra ngoài. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 Nếu có nhiều tinh trùng kỳ hình trong tinh dịch xuất ra, thể hiện chức năng của dịch hoàn phụ kém. Tinh trùng tại đuôi dịch hoàn phụ mới có khả năng gắn chặt vào vùng trong suốt của tế bào trứng để thực hiện quá trình thụ tinh. - Thừng dịch hoàn: thừng dịch hoàn gồm các động mạch và thần kinh đi vào dịch hoàn, chúng cấu tạo bởi các mô liên kết, các hệ cơ vòng và cơ dọc liên kết với nhau. - Dƣơng vật: dƣơng vật nằm ở dƣới vách bụng, đƣợc bắt đầu bằng một trụ, hai đầu bám vào hai mẩu xƣơng ngồi, hƣớng ra phía trƣớc. Dƣơng vật lợn đực có một đoạn cong hình chữ S, nằm kín trong da, khi giao phối mới thò ra ngoài. Đầu dƣơng vật có hình xoắn nhƣ mũi khoan, cách đầu mút 0,5 - 0,7cm có lỗ để phóng tinh ra ngoài. Khi giao phối hay lấy tinh, dƣơng vật thò ra ngoài 20 - 40 cm. 1.2.1.3. Các tuyến sinh dục phụ - Tuyến tinh nang (Tiểu nang, vesicular semen gland): tuyến tinh nang là một cái túi rỗng để chứa tinh trùng, gồm hai tuyến hình trứng, màu vàng nhạt, nằm trong xoang chậu, trên bàng quang và ống dẫn tinh. Tuyến tinh nang tiết ra một chất keo màu trắng hoặc vàng. Chất keo này gặp dịch tiết của tuyến tiền liệt thì kết lại tạo thành một cái nút đóng cổ tử cung sau giao phối, mục đích không cho tinh trùng chảy ngƣợc ra ngoài. Chất keo này còn có thành phần glucoza, axit béo tăng cƣờng dinh dƣỡng, hoạt lực cho tinh trùng. Tuyến này ở lợn có kích thƣớc lớn nhƣng kém đặc chắc. Ở lợn tuyến tiểu nang dài tới 15 - 20 cm, nặng xấp xỉ 850 gam. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 - Tuyến tiền liệt (Prostate gland): động vật nói chung và gia súc đực nói riêng đều có chung tuyến tiền liêt. Tuyến tiền liệt nằm ở phần cuối của ống dẫn tinh và phần đầu của niệu đạo. Tuyến tiền liệt có nhiều lỗ đổ vào niệu đạo, dịch tiết của tuyến không trong suốt, có tính kiềm nhằm tác dụng trung hòa độ axit trong lòng niệu đạo và H2CO3 (axit cacbonic) do tinh trùng sản sinh ra trong quá trình hoạt động. Tuyến tiền liệt phát triển theo lứa tuổi của gia súc. Gia súc non thì tuyến tiên liệt bé, gia súc trƣởng thành thì tuyến tiền liệt phát triển to đồng thời cũng teo đi khi gia súc đã già. Tuyến cầu liệu đạo (Cowper, Glandula bulborethrales): còn có tên gọi là tuyến củ hành, là một tuyến lớn, thon dài 18 cm, nặng khoảng 400 gam, nằm dọc theo đƣờng niệu sinh dục phần xoang chậu. Mặt trên của tuyến Cowper đƣợc bao bọc bởi phần cơ dày, chất bài tiết của tuyến này chính là keo phèn, chất này đặc, keo dính, có tác dụng nút cổ tử cung sau khi lợn đực phóng tinh xong. Tuy nhiên, keo phèn là chất không có lợi cho tinh trùng, vì khi tinh trùng ra ngoài cơ thể, nếu trong tinh dịch có lẫn keo phèn, tinh trùng thƣờng tụ lại nên rất chóng chết. Do đó, khi làm TTNT ngƣời ta lọc bỏ keo phèn ngay sau khi lấy tinh, hoặc lọc bỏ ngay trên phễu khi đang lấy tinh. 1.2.2. Sự tiết tinh dịch ở lợn đực Khi đã thành thục về tính dục (8 - 9 tháng tuổi và khối lƣợng cơ thể đạt 90 - 100 kg), ở lợn đực ngoại ngƣời ta có thể cho phối giống trực tiếp hay lấy tinh bằng tay qua phƣơng pháp nhảy giá. Theo Nguyễn Thiện, Nguyễn Tấn Anh (1993) [12] có thể quan sát thấy lợn đực có 3 giai đoạn xuất tinh rõ rệt nhƣ sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 - Giai đoạn đầu tiết ra 10 - 20 ml dịch trong suốt không có tinh trùng, chất này có tác dụng rửa đƣờng niệu sinh dục. - Giai đoạn thứ 2 kéo dài 1 - 2 phút, tiết ra khoảng 100 - 120 ml, chất này gồm tinh trùng và các chất phân tiết của các tuyến sinh dục nhƣ tiền liệt, cowper, tinh nang. - Giai đoạn thứ 3: là giai đoạn bài tiết chủ yếu của các tuyến sinh dục phụ (150 - 200 ml). Số lƣợng tinh trùng ở giai đoạn này ít, giai đoạn này kéo dài 4 - 5 phút. Tinh dịch của lợn đực là một hỗn hợp bao gồm tinh trùng đƣợc sản sinh ra từ dịch hoàn và các chất tiết của các tuyến sinh dục phụ nhƣ tuyến tinh nang, tuyến cowper, tuyến tiền liệt và tuyến urethra của vùng bụng. Trong tinh dịch, phần quan trọng nhất là tinh trùng, đây là yếu tố chính làm cho lợn cái có thể thụ thai. Phần quan trọng thứ hai là tinh thanh, tinh thanh là một hỗn hợp chất lỏng do các tuyến sinh dục phụ bài tiết ra. Ở các loài gia súc khác nhau tuyến này phát triển không giống nhau. Ở lợn tuyến tinh nang và tuyến cowper bài tiết nhiều, cho nên tinh dịch lợn thƣờng nghèo tinh trùng và fructose. Ở lợn tinh thanh gồm 56 - 70% do tuyến tinh nang tiết ra, 15 - 18% do tuyến cowper tiết ra, 2 - 3% do dịch hoàn phụ tiết ra. Tinh trùng trong tinh dịch chỉ chiếm 2 - 7%. Theo Ogiƣn f.v (1977) và Levin K.L (1980)( dẫn theo Nguyễn Tấn Anh (1984) [1]. Thành phần hoá học của tinh dịch lợn: tinh dịch lợn là một hỗn hợp các chất lỏng phức tạp, cho nên một số chất chỉ đƣợc xác định ở mức định tính. Các loài khác nhau thì thành phần hoá học của tinh dịch cũng khác nhau. Tác dụng chủ yếu của tinh dịch là rửa đƣờng niệu sinh dục, là môi trƣờng để nuôi sống tinh trùng ngoài cơ thể, kích thích tinh trùng hoạt động trong đƣờng sinh dục của con cái. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 1.2.3. Một số đặc tính sinh lý của tinh trùng lợn 1.2.3.1. Sự hình thành và cấu tạo của tinh trùng lợn Tinh trùng lợn chỉ chiếm 2 - 7% trong tổng số tinh dịch tiết ra. Tinh trùng là tế bào sinh dục đã hoàn chỉnh về hình thái, cấu tạo và đặc điểm sinh lý sinh hóa có khả năng thụ thai. Quá trình hình thành tinh trùng đƣợc chia làm nhiều giai đoạn:  Giai đoạn sinh sản: từ một tế bào tinh nguyên nó sinh sản bằng cách nhân đôi mục đích là tăng số lƣợng tế bào, nhƣng số lƣợng nhiễm sắc thể không thay đổi.  Giai đoạn sinh trƣởng: tế bào tinh nguyên tăng cƣờng quá trình đồng hóa, làm cho kích thƣớc tế bào to ra. Đến cuối giai đoạn sinh trƣởng tế bào phôi đƣợc gọi là tinh bào cấp I (cyt 1).  Giai đoạn thành thục: đây là lần phân chia giảm nhiễm, từ một tế bào lƣỡng bội ( 2n NST) tạo thành hai tế bào đơn bội ( n NST) ( Cyt I) với hai loại mang nhiễm sắc thể giới tính khác nhau: NST X và NST Y.  Giai đoạn hoàn chỉnh cấu tạo: tinh trùng phát triển đuôi, phía ngoài tinh trùng đƣợc bao bọc bởi lớp màng lipoprotein có chức năng bảo vệ và dinh dƣỡng cho tinh trùng. + Nhân tế bào thu nhỏ lại và biến thành đầu tinh trùng, phần lớn tế bào chất dồn về một phía tạo thành cổ, thân. Một số thể Golgi tập trung ở đầu mút phía trƣớc của tiền tinh trùng tạo thành acrosome. + Các ty thể chuyển tới vùng cổ thân, phần lớn các tế bào chất biến đi chỉ còn lại một lớp mỏng bao quanh miền ty thể và đuôi. + Qúa trình biến thái xảy ra trên tế bào dinh dƣỡng Sectoli trong lòng ống sinh tinh, trong khoảng thời gian 14-15 ngày. Sau đó chúng trở thành tinh trùng non và rơi vào ống sinh tinh, đƣợc đẩy về phía phụ dịch hoàn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19  Giai đoạn phát dục: ở phụ dịch hoàn, tinh trùng non tiếp tục phát dục và thành thục. Trong quá trình di chuyển từ đây đến cuối dịch hoàn phụ, tinh trùng phải di chuyển với đoạn đƣờng khá dài khoảng trên 100m nằm uốn khúc quanh co. Trong quá trình này nhiều tinh trùng non bị phân hủy. Về hình thái, tinh trùng có ba phần chính: - Đầu tinh trùng là phần chứa các vật chất di truyền. - Cổ thân. - Đuôi tinh trùng là phần có liên quan đến chức năng vận động. Đầu có hai phần cơ bản: nhân và acrosome Nhân chiếm 87% thể tích của đầu và đƣợc nén chặt lại gần nhƣ tinh thể. Trong nhân có chứa Chromatin đậm đặc cao độ gồm AND liên kết với một protein đặc biệt. Số lƣợng nhiễm sắc thể trong nhân tinh trùng là đơn bội. Nhân của tinh trùng không có ARN. Phần trƣớc nhân đƣợc bao bọc bằng một acrosome, giống cái túi có hai lớp màng và bọc sát vào nhân. Acrosome là một lyzosome đặc biệt. Trong acrosome của tinh trùng có chứa enzym thuỷ phân Hyaluronidaza có tác dụng phân giải axit Hyaluronic là chất keo gắn các tế bào màng phóng xạ, làm cho chúng rời ra để lộ trứng ra ngoài cho tinh trùng có thể dễ dàng tiếp cận với noãn hoàng trong quá trình thụ thai. Cổ thân: là phần rất ngắn, hơi eo lại, cắm vào hốc ở đáy phía sau của nhân. Phần cổ thân có hai loại cặp hạt là: cặp hạt trung tâm và chín cặp hạt bên. Từ cặp hạt trung tâm xuất phát hai sợi trục chính đi về phía đuôi. Từ chín cặp hạt bên xuất phát ra chín cặp sợi bên đi theo hình xoắn ốc về phía đuôi. Phần cổ thân chứa nhiều loại enzym oxy hoá khử giúp cho các phản ứng trao đổi chất của tinh trùng. Đuôi đƣợc chia ra các phần: đoạn giữa, đoạn chính, đoạn thân: Đoạn giữa có 9 cặp vi ống ngoài, 2 vi ống trung tâm và đƣợc bọc quanh bằng 9 sợi ƣa osmi, tất cả tạo thành bó trục. Bó trục đƣợc phủ bên ngoài bằng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 một bọc ty thể xếp theo đƣờng xoắn ốc (lò xo ty thể) và kết thúc ở vòng nhẫn gensen. Ty thể có chứa các enzym oxy hoá và photphoryl hoá, ty thể đƣợc coi là nguồn phát sinh năng lƣợng cần thiết cho sự hoạt động của tinh trùng. Đoạn chính không đƣợc bao bọc bằng ty thể mà chỉ có bó trục ở giữa và những sợi ƣa osmi vây bên ngoài. Hệ thống này đƣợc bao phủ bởi một vỏ bọc bằng những sợi chắc, vỏ bọc này duy trì khả năng ổn định cho các yếu tố co rút của đuôi. Bó trục của đuôi chịu trách nhiệm cho sự chuyển động của tinh trùng. Bọc ty thể cung cấp năng lƣợng dƣới dạng ATP cho các tay dynein của các cặp vi ống (các tay dynein có khả năng phân huỷ ATP, giải phóng năng lƣợng để chuyển động đuôi tinh trùng). Mỗi cặp vi ống ngoài có hai dãy dynein (ngoài và trong) chĩa về phía cặp vi ống kề bên. Khi đƣợc kích thích bởi ATP, các tay này hoạt động nhƣ một cá líp, đi dọc theo cặp kề bên, làm cho các cặp này trƣợt lên cặp khác. Sự hình thành cầu nối hình tia giữa các cặp vi ống ngoài với vi ống trung tâm chống lại hiện tƣợng trƣợt vừa nêu, làm cho đuôi tinh trùng uốn lƣợn. Do các cặp vi ống ngoài trƣợt liên tục nên sự uốn lƣợn đƣợc hình thành liên tục, đƣợc lan truyền tạo nên sự chuyển động đặc trƣng của đuôi tinh trùng (chuyển động làn sóng). Đây là hiện tƣợng trƣợt theo vi ống. - Theo I.I xôcôlôpskaya (1962) (dẫn theo Nguyễn Tấn Anh) [1] thì thân tinh trùng lợn có 25% vật chất khô, 75% là nƣớc. Trong vật chất khô: protein 82%, lipit._. 13%. Trong đuôi tinh trùng có: 76% protein, 23% lipit, 1% muối. 1.2.3.2. Hoạt động của tinh trùng Khi còn trong dịch hoàn phụ, tinh trùng hoạt động rất yếu hoặc không hoạt động. Khi đƣợc giải phóng ra ngoài, tinh trùng trở nên hoạt động mạnh do tác động của dịch tiết do các tuyến sinh dục phụ tiết ra. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Trạng thái hoạt động của tinh trùng thể hiện chất lƣợng tinh dịch. Nếu tinh trùng hoạt động càng mạnh thì chất lƣợng càng tốt. Tinh trùng có 3 hình thức vận động cơ bản (Nguyễn Tấn Anh, 1985) [2]: + Vận động tiến thẳng: đây là những tinh trùng có khả năng thụ thai. + Vận động xoay tròn: những tinh trùng có dạng vận động này thƣờng là không có khả năng thụ thai. + Vận động tại chỗ: thƣờng là những tinh trùng non hoặc bị dị tật, những tinh trùng này không có khả năng thụ thai. Với công nghệ kỹ thuật số (Phân tích theo phần mềm Sperm vision 3.0) ngƣời ta có thể xác định đƣợc các dạng chuyển động, tốc độ chuyển động của tinh trùng và xác định đƣợc khoảng cách tinh trùng chuyển động trong khoảng thời gian nhất định đó là khoảng cách, vận tốc chuyển động theo đƣờng ziczăc, theo đƣờng trung bình và theo đƣờng thẳng. + DCL (Distance Curve Line): độ dài đƣờng ziczăc (µm). + DAP (Distance Average Path): độ dài đƣờng trung bình (µm). + DSL (Distance Straight Line): độ dài đƣờng thẳng (µm). Tƣơng ứng với mỗi dạng chuyển động trên, ngƣời ta cũng đã xác định đƣợc tốc độ chuyển động của tinh trùng ở 3 dạng đƣờng đi là: + VCL (Velocity Curve Line): tốc độ chuyển động theo đƣờng ziczăc (µm/giây). + VAP (Velocity Average Path): tốc độ chuyển động theo đƣờng trung bình (µm/giây). + VSL (Velocity Straight Line): tốc độ chuyển động theo đƣờng thẳng (µm/giây). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 1.2.3.3. Trao đổi chất và năng lƣợng của tinh trùng lợn Quá trình trao đổi chất và năng lƣợng ở tinh trùng gồm có: năng lƣợng tiêu hao do sự co rút của phần đuôi tinh trùng trong quá trình vận động và năng lƣợng tạo ra do sự phân giải các hợp chất dự trữ trong tinh trùng. Sự phân giải các hợp chất cao năng ADP và ATP để cung cấp năng lƣợng cho các hoạt động của tinh trùng nhƣ sau: ATP + H2O => ADP + Axit Photphoric + 8 Kcalo ADP + H2O => AMP + Axit Photphoric + 8 Kcalo Ngoài ra năng lƣợng của tinh trùng đƣợc tạo ra do quá trình đƣờng phân và hô hấp. Quá trình đƣờng phân giúp cho tinh trùng có thể sống và hoạt động trong điều kiện không có oxy nhƣng có đƣờng glucose. Quá trình đƣờng phân xảy ra theo phản ứng: C6H12O6 => 2C3H6O3 + 27,7 Kcalo Quá trình này chỉ xảy ra khi có đƣờng. Khi còn ở trong dịch hoàn phụ hầu nhƣ không có đƣờng nên tinh trùng ở trạng thái bất động. Khi xuất tinh ra ngoài tinh trùng nhận đƣợc đƣờng từ chất phân tiết của tuyến tinh nang thì chất đƣờng nhanh chóng thấm qua màng của tinh trùng. Quá trình hô hấp xảy ra nhƣ sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 C6H12O6 + 6 O2 => 6CO2 + 6H2O + 679 Kcalo Quá trình hô hấp xảy ra trong điều kiện có oxy và giải phóng nhiều năng lƣợng hơn. Trong môi trƣờng có oxy, quá trình hô hấp của tinh trùng diễn ra mạnh mẽ hơn. Tuy nhiên lƣợng các chất dự trữ có trong tinh trùng không nhiều vì vậy làm cho thời gian sống của tinh trùng ngắn. Do đó, muốn kéo dài thời gian sống của tinh trùng ngoài cơ thể thì cần bảo quản tinh dịch trong môi trƣờng yếm khí. Tinh dịch ở trâu, bò, dê rất đậm đặc, lƣợng oxy rất ít nên quá trình hô hấp đƣợc thay bằng quá trình đƣờng phân. Còn ở lợn, tinh dịch loãng, lƣợng oxy đủ nên hô hấp là quá trình giải phóng năng lƣợng chủ yếu. Khi hô hấp, không những chất đƣờng đƣợc oxy hoá mà cả chất béo, các axit amin cũng đƣợc oxy hoá. Quá trình hô hấp đƣợc tăng lên bởi nhiệt độ. Cứ tăng lên 10oC thì quá trình hô hấp tăng lên 2 – 2,5 lần. Điều này có liên quan đến việc bảo quản tinh dịch ở nhiệt độ phù hợp. Nếu nhiệt độ tăng quá cao, sự hô hấp của tinh trùng tăng lên và làm chúng nhanh bị chết do đó không bảo quản đƣợc lâu. Trao đổi chất của tinh trùng luôn luôn biến động theo sự biến thiên của môi trƣờng ngoại cảnh, theo thời gian lƣợng Fructo giảm dần, axit lăctic tích tụ lại rồi CO2 làm giảm pH. Từ đó tác động xấu đến quá trình trao đổi chất của tinh trùng, làm tinh trùng già cỗi, sự tiêu thụ O2 chỉ đạt tối đa khi tinh trùng còn tƣơi. Sự già cỗi của tinh trùng dần tạo lên nguy cơ về hình thái tinh trùng, acrosome biến dạng và biến mất. Tinh trùng có thể mất khả năng vận động và chết sau khi acrosome nổi lên những mụn nƣớc, làm vỡ màng sinh chất và chất liệu acrosome trào ra ngoài. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 1.2.4. Một số chỉ tiêu chất lượng tinh dịch lợn 1.2.4.1. Thể tích tinh dịch (V ml) Thể tích tinh dịch là số ml tinh dịch sau khi lọc bỏ keo phèn trong một lần thực hiện thành công phản xạ xuất tinh. Thể tích tinh dịch phụ thuộc vào yếu tố: giống, loài, độ tuổi, cá thể, kỹ thuật khai thác tinh, tần xuất lấy tinh và mùa vụ lấy tinh... Trong tinh dịch lợn có chứa một lƣợng khá lớn hạt thể selatin, chiếm tỷ lệ 20 - 30% lƣợng tinh dịch, chúng là sản phẩm của tuyến Cowper. Khi xuất tinh, những hạt thể selatin gặp enzim vegikinaza của tuyến tinh nang rồi đọng lại thành những tinh thể lớn hơn. Sau đó các thể này hấp phụ nƣớc và tăng lên về thể tích, ngƣời ta gọi đó là keo phèn (Trần Tiến Dũng và cs, 2002) [7]. Trong giao phối tự nhiên, keo phèn có tác dụng bịt lỗ tử cung không cho tinh dịch chảy ra ngoài. Trong TTNT cần phải nhanh chóng loại bỏ keo phèn, nếu không nó sẽ hấp phụ một phần nƣớc trong tinh dịch và một số lƣợng lớn tinh trùng. Vào mùa giao phối trong tinh dịch lợn có lƣợng selatin lớn hơn mùa không giao phối. Do đó khi xác định thể tích tinh dịch cần phải loại bỏ keo phèn bằng cách lọc qua nhiều lớp vải gạc. 1.2.4.2. Hoạt động của tinh trùng Hoạt động của tinh trùng: M (Motility %) là tỷ lệ phần trăm số tinh trùng có hoạt động, bao gồm: hoạt động tiến thẳng và hoạt động tại chỗ. - Hoạt động tiến thẳng của tinh trùng: hoạt lực A ( Progessive motility %) Là tỷ lệ phần trăm số tinh trùng có hoạt động tiến thẳng. Hoạt lực tinh trùng càng cao chất lƣợng tinh trùng càng tốt và khả năng thụ thai càng lớn, sức sống của tinh trùng có ảnh hƣởng đến sức sống của đời sau. Hoạt lực tinh trùng càng cao thì khả năng thụ thai càng cao, Theo Eliasson (trích theo Nguyễn Tấn Anh, 1996) [3], hoạt lực và sức sống của tinh trùng phụ thuộc vào tỷ lệ thích hợp giữa các dịch tiết của tuyến tiền liệt và tiểu nang. Thành Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 phần hóa sinh của tinh thanh rất ổn định cho mỗi lần xuất tinh và không phụ thuộc vào tần số xuất tinh. Chất tiết của tiểu nang có chứa một vài nhân tố không có lợi cho hoạt lực và sức sống của tinh trùng. Nhƣng chất tiết của tuyến tiền liệt lại kích thích sức hoạt động tinh trùng. Khi tiếp xúc với chất tiết tuyến tiền liệt, tinh trùng đƣợc bảo vệ để tránh ảnh hƣởng không có lợi của chất tiết tuyến tiểu nang. - Hoạt động tại chỗ: L (Local motility %) là tỷ lệ phần trăm số tinh trùng có hoạt động vòng tròn, lắc lƣ tại chỗ. 1.2.4.3. Tinh trùng không hoạt động I (Immotile %): là tỷ lệ phần trăm số tinh trùng không hoạt động (đã chết). 1.2.4.4. Nồng độ tinh trùng: C (triệu/ml) Nồng độ tinh trùng là số tinh trùng có trong 1 ml tinh nguyên. Nồng độ tinh trùng là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lƣợng tinh dịch, là cơ sở để tính toán liều tinh sản xuất. 1.2.4.5. Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong tinh dịch: VAC ( tỷ/lần) Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Tấn Anh (1984) [1] ở lợn Yorkshire có chỉ số VAC là 45,1 ± 1,73 tỷ/lần, ở lợn Landrace có chỉ số VAC là 36,05 ± 1,24 tỷ/lần. 1.2.4.6. Độ pH của tinh dịch pH đƣợc xác định bởi nồng độ ion H+ trong tinh dịch. pH của tinh dịch liên quan đến khả năng sống và thụ tinh của tinh trùng. pH của tinh dịch toan tính thì tinh trùng hoạt động yếu, thời gian sống kéo dài. Ngƣợc lại, pH của tinh dịch kiềm tính thì tinh trùng hoạt động mạnh, thời gian sống bị rút ngắn. pH của tinh dịch giữa các loài gia súc khác nhau thì khác nhau. pH của dịch tiết từ dịch hoàn phụ ở các loài gia súc luôn có tính chất toan tính, có tác Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 dụng ức chế tới mức thấp nhất sự trao đổi chất của tinh trùng và kéo dài thời gian sống của tinh trùng. pH của dịch tiết từ các tuyến sinh dục phụ trung tính hoặc kiềm tính. Vì vậy, pH tinh dịch của những động vật có lƣợng tinh nhiều, trong đó có dịch tiết của tuyến tinh nang chiếm tỷ lệ cao thì thƣờng có giá trị kiềm tính. Theo Nguyễn Tấn Anh (1996) [3], pH tinh dịch lợn có tính kiềm yếu (7,2 - 7,5). 1.2.4.7. Áp suất thẩm thấu: (Posm, mosmol) ASTT của một chất lỏng phụ thuộc vào nồng độ hòa tan các phân tử, các ion trong đó và đƣợc tính trên một đơn vị thể tích. ASTT có ảnh hƣởng đến quá trình hô hấp của tinh trùng trong các môi trƣờng khác nhau. Trong môi trƣờng có Cl - với ASTT là 7 atm, tinh trùng đạt mức tiêu thụ oxy cao nhất (13 µl O2/100 triệu tinh trùng) khi ASTT là 13 atm, sự tiêu hao oxy giảm xuống (7,8 µl O2/100 triệu tinh trùng). ASTT là chỉ tiêu cần thiết làm cơ sở cho việc nghiên cứu xây dựng môi trƣờng bảo tồn đông lạnh tinh dịch. Theo Joaquín Gadea (2003) [29] thì tinh dịch lợn có ASTT là 290 - 300 mosm, tinh trùng có thể chịu đƣợc giới hạn ASTT từ 240 - 380 mosm. Theo Fraser và cs (2001) [22] thì ASTT của tinh dịch là 250 - 290 mosm. Nếu ASTT thấp hơn 200 mosm thì khả năng hoạt động và sức sống của tinh trùng bị suy giảm (Gilmore và cs, (1996) [23]; Fraser và cộng sự,(2001) [22]). 1.2.4.8. Acrosome tinh trùng Acrosome nằm trong phần đầu của tinh trùng. Acrosome có vai trò rất quan trọng đối với quá trình thụ tinh, là một chỉ tiêu để đánh giá chất lƣợng tinh dịch. Chỉ có các tinh trùng có acrosome nguyên vẹn mới có thể tham gia thụ tinh. Cũng giống nhƣ các phần cấu tạo khác của tinh trùng, acrosome rất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 dễ bị phá huỷ bởi các yếu tố vật lí, hoá học của môi trƣờng. Ngoài ra, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình ở acrosome còn phụ thuộc vào yếu tố di truyền. 1.2.4.9. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình: K (%) Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình là số tinh trùng có hình dạng bất thƣờng so với tổng số tinh trùng đếm đƣợc trong quá trình kiểm tra. Theo Milovanov (1962) [32], nhận thấy có hai thời kỳ có thể gây nên tình trạng kỳ hình ở tinh trùng: - Kỳ hình ngay trong quá trình sinh tinh - tinh trùng kỳ hình sơ cấp, bắt nguồn từ nguyên nhân có liên quan đến bệnh lý ở cơ quan sinh tinh. - Sau khi tinh trùng đƣợc bài tiết ra - tinh trùng kỳ hình thứ cấp, bắt nguồn từ nguyên nhân có liên quan đến ngoại cảnh hoặc kỹ thuật không đúng trong khâu xử lý tinh dịch. 1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tinh dịch 1.2.5.1. Giống và độ tuổi Đến một độ tuổi nhất định thì lợn đực thành thục về tính, tuỳ theo từng giống khác nhau, tầm vóc to hay nhỏ, cƣờng độ trao đổi chất mạnh hay yếu, khả năng thích nghi với điều kiện thời tiết, khí hậu mà có số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng tinh dịch khác nhau. Các giống lợn nguyên thuỷ chƣa đƣợc cải tiến thì số lƣợng và chất lƣợng tinh dịch đều kém hơn các giống lợn đã đƣợc cải tiến chọn lọc. Các giống lợn nội nhƣ: Móng Cái, Mƣờng Khƣơng chỉ đạt 1- 6 tỷ tinh trùng tiến thẳng (VAC) trong một lần xuất tinh, trong khi đó các giống lợn ngoại nuôi tại Việt Nam nhƣ : Yorkshire, Landrace, Duroc trắng thì tổng số tinh trùng tiến thẳng (VAC) đạt từ 16 đến 90 tỷ trong một lần xuất tinh. Trong các nhân tố cấu thành chỉ tiêu tổng số tinh trùng tiến thẳng (VAC) thì sự khác nhau cơ bản giữa các giống lợn nhập ngoại là nồng độ tinh trùng và khối lƣợng tinh dịch. Các giống lợn nội có nồng độ tinh trùng từ 20 - 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 triệu/ml tinh dịch, còn các giống lợn ngoại đạt 170 - 500 triệu /ml (Nguyễn Tấn Anh, (1985) [2] và Lƣu Kỷ (1995) [8]; Lê Xuân Cƣơng (1987) [6]). Tuổi thành thục của lợn đực tuỳ thuộc vào giống, các điều kiện khí hậu, dinh dƣỡng….. Một số giống lợn nội nhƣ: Ỉ, Móng Cái….thƣờng thành thục về tính sớm từ tháng tuổi thứ 3. Các giống lợn ngoại, lợn lai có tuổi thành thục về tính muộn hơn thƣờng từ 4 - 6 tháng tuổi. Tuy nhiên đến 6 - 8 tháng tuổi lợn đực mới hoàn thiện về phản xạ sinh dục, nhƣng lúc này lƣợng tinh dịch sản xuất ra còn rất thấp so với lúc cơ thể trƣởng thành. Lợn đực ngoại hậu bị một lần xuất tinh đạt 80- 100ml, lợn đực ngoại trƣởng thành đạt 250- 400ml. Theo tác giả Feredeen (1971), trích Lê Xuân Cƣơng (1987) [6] thì lƣợng xuất tinh lợn đực lúc 8 tháng tuổi đạt 70- 80ml với nồng độ tinh trùng đạt 180-200 triệu tinh trùng/ml các tinh trùng kỳ hình chiếm 5-10%. Từ 8 tháng tuổi trở lên thể tích xuất tinh và nồng độ tinh trùng tăng lên. Theo kết quả nghiên cứu của Hafez (1960), trích theo Lê Xuân Cƣơng (1986) [6] thể tích xuất tinh của một lợn đực trƣởng thành là từ 150- 300ml, tổng số tinh trùng tiến thẳng là 30 - 60 tỷ tinh trùng, nồng độ tinh trùng đạt từ 200-300 triệu/ml. Trong công tác giống lợn của Việt Nam hiện nay quy định : tuổi bắt đầu huấn luyện sử dụng đối với lợn đực nội là 5 - 6 tháng tuổi, lợn đực ngoại là 7 - 8 tháng tuổi. Thời gian sử dụng trong vòng 3 - 4 năm. Nói chung những giống lợn màu trắng (Yorkshire, Landrace, Duroc trắng) hăng về tính dục và lúc còn non tỏ ra thành thục hơn về phản xạ sinh dục so với một số giống lợn sẫm mầu nhƣ Hampshire, Pietrain và Duroc đỏ Zimmerman và cs (1986) [47]. Ngoài các yếu tố trên thì kiểu gen Halothan cũng ảnh hƣởng đến chỉ tiêu phẩm chất tinh dịch. Nhiều nghiên cứu cho thấy số và chất lƣợng tinh dịch ở lợn đực có kiểu gen Halothan NN là tốt nhất, sau đó đến Nn và cuối cùng là nn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 1.2.5.2.Yếu tố ngoại cảnh - Dinh dưỡng Một lợn đực giống tốt là nó có phẩm chất tinh dịch tốt, khả năng giao phối cao, năng suất chất lƣợng sinh sản tốt. Muốn đƣợc nhƣ vậy chắc chắn lợn đực giống phải có thân hình khoẻ mạnh, rắn chắc, không béo quá, không gầy quá, đặc biệt cơ năng về tính dục phải bình thƣờng. Do đó lợn đực giống cần đƣợc nuôi dƣỡng đúng đắn, cho vận động đầy đủ và có chế độ sử dụng hợp lý. Dinh dƣỡng là yếu tố quan trọng thứ hai sau phẩm giống. Thức ăn đầy đủ sẽ phát huy đƣợc tiềm năng di truyền của giống. Nếu lợn ăn thức ăn không đủ tiêu chuẩn dinh dƣỡng thì sẽ giảm tính hăng rõ rệt, nồng độ tinh trùng thấp, tỷ lệ kỳ hình cao, phẩm chất tinh dịch kém. Nếu bổ sung thức ăn đạm vào khẩu phần để đạt đƣợc 120-130g protein/đơn vị thức ăn (protein thực vật) thì mật độ tinh trùng tăng 37,9%. Tỷ lệ protein dƣới 100 g/đơn vị thức ăn thì thể tích tinh dịch chỉ đạt 50 - 60 ml, mật độ tinh trùng đạt 20 - 25 triệu (Lê Xuân Cƣơng, 1985[5]). Khoáng: Chủ yếu là: Ca, P có ảnh hƣởng rõ rệt đến phẩm chất tinh dịch. Nếu trong khẩu phần thức ăn thiếu Ca thì tinh trùng phát dục không hoàn toàn, sức hoạt động yếu và tuyến sinh dục dễ bị bệnh. Khẩu phần của đực giống cần phải đảm bảo 14 - 18g Ca, 8 - 10g P cho 100kg thể trọng trong thời kỳ sử dụng cũng nhƣ chuẩn bị phối giống. Vitamin: Quan trọng nhất là vitamin A, D, E. Vitamin A giúp cơ quan sinh dục phát triển bình thƣờng, nếu thiếu thì tinh hoàn có thể bị teo, ống dẫn tinh bị thoái hóa gây cản trở cho sự sản sinh tinh trùng, nhu cầu vitamin A: 200UI/kg thức ăn. Nếu thiếu vitamin D thì ảnh hƣởng xấu đến sự hấp thụ Ca, P ảnh hƣởng gián tiếp đến chất lƣợng tinh dịch. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 Vitamin E chống oxy hoá mỡ, kích thích tuyến yên tiết ra kích dục tố. Thiếu vitamin E ở mức độ nhất định thì quá trình sinh tinh trùng bị ngừng trệ và khả năng thụ thai rất kém. Nếu thiếu trong thời gian dài sẽ làm dịch hoàn bị teo và không có khả năng phục hồi trở lại nếu bổ sung vitamin E. Vitamin E có nhiều trong thức ăn non và thức ăn mầm, vì vậy đối với đực giống trong khẩu phần ăn phải có thóc mầm, ngô mầm, giá đỗ…(là những loại thức ăn có chứa nhiều vitamin E) hoặc bổ sung vitamin E công nghiệp. - Chăm sóc Ngoài việc đảm bảo chuồng trại khô ráo sạch sẽ, thoáng mát về mùa hè, ấm về mùa đông, đầy đủ ánh sáng, ngƣời ta rất quan tâm đến chế độ vận động, tắm trải cho lợn đực giống. Các cơ sở chăn nuôi đánh giá cao tác dụng của chế độ vận động hợp lý đối với việc rèn luyện thể chất, nâng cao phẩm chất tinh tinh dịch. Nếu cho lợn đực giống vận động không đầy đủ nó sẽ ngủ nhiều hơn, mau béo, bụng to, sệ, giảm tính hăng, làm chân sau yếu ảnh hƣởng đến việc giao phối. Hàng ngày cho đực giống vận động tự do trong sân chơi từ 1 - 2 giờ, hoặc cho lợn vận động cƣỡng bức, cho lợn vận động vào thời điểm thích hợp: mùa hè vào lúc sáng sớm, mùa đông vào lúc chiều và cho vận động dƣới ánh nắng mặt trời giúp lợn dễ dàng tổng hợp vitamin D. Thƣờng xuyên tắm trải sạch sẽ cho lợn đực giống có ảnh hƣởng tích cực đến quá trình bài tiết, tránh đƣợc một số bệnh ngoài da, tăng cƣờng hoạt động tính dục, tăng tính thèm ăn, thông qua việc tắm trải tạo điều kiện làm quen giữa ngƣời chăn nuôi với đực giống, hỗ trợ cho công tác phối giống và khai thác tinh. -Thời tiết khí hậu, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, lứa tuổi Các yếu tố trên có ảnh hƣởng đến phẩm chất tinh dịch. Theo Nguyễn Tấn Anh vào mùa Đông Xuân (tháng 10, 11, 12, 1, 2, 3, 4) tổng số tinh trùng trong một lần xuất tinh của lợn Landrace (nuôi tại Hà Nội) cao hơn các tháng Hè Thu (tháng 5, 6, 7, 8, 9). Nhiệt độ không khí từ 17 - 180C thuận lợi cho quá trình sinh tinh của lợn đực giống. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Lứa tuổi cũng ảnh hƣởng đến khả năng sản xuất tinh của lợn. Lợn đực ngoại từ 2 - 3 năm tuổi là thời kỳ có khả năng khai thác tinh tốt nhất. Theo Torahiko II D.A (1994) [43] cho biết ảnh hƣởng của từng mùa vụ trong năm đến chất lƣợng tinh dịch nhƣ sau: Bảng 1.1. Ảnh hƣởng của mùa vụ đến sự tiết tinh dịch lợn Chỉ tiêu Mùa vụ Mùa Xuân Mùa Hè Mùa Thu Mùa Đông Thể tích tinh dịch (ml) 173±63,6 151±46,7 211±76,6 199±76,0 Số lƣợng tinh trùng/ml 4,50.10 8 ±1,58 4,96.10 8 ±1,30 4,40.10 8 ±1,3 4,86.10 8 ±1,90 Tổng số tinh trùng 727.10 8 ±287,5 723,9.10 8 ±240,8 850,3.10 8 ±249,4 896,7.10 8 ±349 Fructose mg/100ml 8,3±8,76 8,5±5,32 21,0±14,33 14,4±10,1 - Tần số khai thác tinh dịch ảnh hưởng đến lượng xuất tinh Tần số này ảnh hƣởng tới lƣợng tinh xuất, nồng độ và tổng số tinh trùng hoạt động. Phần lớn đực giống đƣợc khai thác tinh với khoảng cách từ 3 - 5 ngày/lần (Nguyễn Văn Thƣởng ,1998) [16]. - Tác động cơ học Do đặc điểm cấu tạo Acrosome của tinh trùng liên kết rất lỏng lẻo với đầu, đầu tinh trùng liên kết lỏng lẻo với phần cổ - thân. Vì vậy, các phần của tinh trùng rất dễ bị bong ra. Từ đặc điểm này cần chú ý trong quá trình sản xuất và vận chuyển tinh dịch lợn cần tránh những tác động cơ học nhằm hạn chế ảnh hƣởng của tác động cơ học lên tinh trùng. 1.3. Cơ sở khoa học của kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn Tinh dịch lợn sau khi ra ngoài cơ thể thì rất dễ bị sốc hoặc choáng do tiếp xúc với điều kiện ngoại cảnh nhƣ nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, môi trƣờng, xóc lắc... Theo I.I.Ivanov (1908) trích theo Nguyễn Thiện và ctv [13], bảo tồn tinh dịch gia súc ở điều kiện bình thƣờng, nhiệt độ tốt nhất ở khoảng 5 - 150C. Khả năng hoạt động của tinh trùng tỷ lệ thuận với nhiệt độ. Nhiệt độ ở 50C Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 tinh trùng hầu nhƣ không hoạt động và chúng hoạt động tích cực đạt ở mức tối đa 38 - 410C. Ở 00C và 460C tinh trùng sẽ chết (ở 00C nƣớc nội bào và nƣớc ngoại bào đóng băng, ở 460C protein của tinh trùng bị biến tính và không có khả năng hồi phục đƣợc). Nếu đƣợc bảo tồn bằng các kỹ thuật đặc biệt nhƣ kỹ thuật đông lạnh, tinh trùng có thể sống trong khoảng thời gian rất dài. Theo MaJur (1989) [31] dùng phƣơng pháp bức xạ dự đoán, tinh trùng bảo tồn ở nhiệt độ -196o C có thể bảo tồn đƣợc khoảng 400 năm (trạng thái tiềm sinh). 1.3.1. Một số nguyên lý cơ bản về đông lạnh tinh dịch 1.3.1.1. Hiện tƣợng đóng băng chất lỏng Khi chất lỏng bị làm lạnh xuống nhiệt độ quá thấp sẽ xảy ra hiện tƣợng đóng băng. Quá trình này xảy ra qua các giai đoạn sau: - Tiền đóng băng - Tạo nhân tinh thể - Giãn nở của tinh thể băng - Kết tinh hoàn thiện tại một nhiệt độ nhất định (EP/Entectic point) EP EP Pha lỏng Pha lỏng Pha tinh Pha tinh thể và pha tinh thể thể và pha lỏng Sơ đồ : Quá trình làm lạnh và đóng băng của một dung dịch (Ditto, 1992) [21] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 * Tiền đóng băng Là quá trình khi làm lạnh một chất lỏng, nếu tốc độ làm lạnh chậm, nhiệt độ của chất lỏng hạ xuống điểm đóng băng mà chất lỏng vẫn giữ nguyên trạng thái và chƣa có tinh thể đóng băng. Trạng thái của chất lỏng lúc này không ổn định, chỉ cần một tác động nhẹ là xảy ra hiện tƣợng tạo nhân hoặc phá vỡ hiện tƣợng tạo nhân tinh thể thay vào đó là hiện tƣợng kết hạt (Ditto, 1992) [21] ; (Weize, 1991) [46]. * Hiện tƣợng tạo tinh thể Một chất lỏng đóng băng phải có một hạt nhỏ làm nhân cho các phân tử nƣớc lần lƣợt bám vào để hình thành tinh thể. Hiện tƣợng tạo nhân tinh thể có hai hình thái: + Nƣớc nguyên chất: việc tạo nhân từ hạt tinh thể nƣớc + Dung dịch: các hạt chất tan làm nhân cho các phân tử nƣớc bao quanh tạo tinh thể. Việc tạo tinh thể ở trƣờng hợp này xảy ra ở nhiệt độ cao hơn trƣờng hợp nƣớc nguyên chất. * Sự giãn nở của tinh thể băng Khi đóng băng các tinh thể hình thành, thể tích của chúng sẽ tăng, sự giãn nở thể tích này giải phóng năng lƣợng tiềm ẩn trong các phân tử nƣớc làm cho nhiệt độ của dung dịch tăng đến điểm đóng băng mặc dù quá trình làm lạnh vẫn tiếp tục (Iritani, 1989) [27]. Tại thời điểm đóng băng nhiệt độ của dung dịch không đổi trong một giai đoạn nhất định và giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tốc độ đóng băng. Nếu tốc độ đóng băng nhanh thì giai đoạn trên sẽ ngắn lại và sự giãn nở của tinh thể sẽ bị loại trừ và thay vào đó là hiện tƣợng tinh thể hoá. * Điểm đóng băng hoàn chỉnh và sự kết tinh tinh thể của dung dịch Khi hiện tƣợng làm lạnh tiếp tục, lƣợng tinh thể nƣớc tăng lên và pha lỏng giảm dần, nồng độ dung dịch tăng và dung dịch sẽ tách ra làm 2 phần: pha tinh thể và pha lỏng. Nếu hiện tƣợng làm lạnh tiếp tục thì pha lỏng sẽ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 biến mất ở một nhiệt độ nhất định. Điểm đó gọi là điểm đóng băng hoàn chỉnh của một dung dịch (Weize, 1991) [46]. 1.3.1.2. Ảnh hƣởng của đóng băng lên tế bào tinh trùng Tinh trùng là một loại tế bào đặc biệt rất mẫn cảm với các yếu tố ngoại cảnh. Khi đông lạnh tinh trùng chịu ảnh hƣởng bởi các hiện tƣợng sau: - Hiện tượng đóng băng nội bào Tinh trùng bị chết hoặc mất năng lƣợng hoạt động khi cấu tạo nội bào bị phá vỡ do việc hình thành tinh thể nƣớc nội bào. Nếu tinh trùng nằm trong dung dịch nƣớc muối sinh lý có thể loại trừ hiện tƣợng này vì đƣợc các phân tử nƣớc ở dạng lỏng bao quanh mặc dù dung dịch ngoại bào bắt đầu đóng băng ở nhiệt độ -20C đến -50C. Khi đông lạnh tinh dịch, sự tạo thành nhân tinh thể và giãn nở của tinh thể băng chỉ xảy ra trong điều kiện đông lạnh chậm, còn khi đông lạnh cực nhanh thì hai hiện tƣợng trên không xảy ra mà xảy ra hiện tƣợng tinh thể hoá (vitrification) tạo ra các hạt băng nhỏ li ti, loại trừ đƣợc hiện tƣợng giãn nở tinh thể (Iritani, 1989) [27]. Do vậy, quá trình đóng băng không ảnh hƣởng tới tinh trùng. -Sự mất nước của tế bào tinh trùng Trong quá trình làm lạnh tinh dịch, nƣớc ngoại bào đóng băng làm ASTT chênh lệch, nƣớc nội bào thoát khỏi tinh trùng và tiếp tục đóng băng ở phần ngoại bào. Ở nhiệt độ 00C đến 50C, nƣớc nội bào và ngoại bào vẫn chƣa đóng băng mà ở trạng thái không bị đông lại, ổn định nên không làm ảnh hƣởng đến cấu trúc tế bào tinh trùng. Ở khoảng nhiệt độ -20C đến -50C, tinh thể đã đƣợc hình thành trong môi trƣờng ngoại bào, trong khi nƣớc nội bào không bị đông lại kéo theo sự chênh lệch cân bằng hoá học gây hiện tƣợng mất nƣớc tế bào, tế bào bị teo lại. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Ở khoảng nhiệt độ -150C, tế bào tinh trùng có tới 80% nƣớc nội bào thoát ra ngoài dẫn đến hiện tƣợng đóng băng nội bào bị ngăn cản. Ở khoảng nhiệt độ -300C, phần lớn nƣớc nội bào thoát ra khỏi tinh trùng. Vậy tinh trùng có thể chịu lạnh -300C và có thể tồn tại ở -1960C. Vấn đề đặt ra là tốc độ làm lạnh phải đủ chậm cho sự mất nƣớc tế bào, tránh đóng băng nƣớc nội bào, nhƣng quá trình này cũng phải đủ nhanh để tránh gây ra hiện tƣợng chênh lệch ASTT giữa môi trƣờng ngoại bào và nội bào, dễ dẫn đến hiện tƣợng mất nƣớc nghiêm trọng. Tuy nhiên, cũng có tinh trùng không có khả năng chịu lạnh do các thay đổi lý hoá sinh xảy ra ở nhiệt độ thấp, nhƣ biến đổi cấu trúc nội bào, sự thay đổi các nguyên tử hydro trong các hợp chất hữu cơ và sự kết tủa protein (Iritani, 1989) [27]. -Hiện tượng đóng băng ngoại bào Trong quá trình đông lạnh, hiện tƣợng đóng băng nƣớc ngoại bào sẽ xảy ra làm nồng độ dung dịch tăng lên và ASTT ngoại bào cao hơn ASTT nội bào, pH cũng thay đổi (Iritani, 1989) [27]. - Chuyển động của nước và sự giãn nở tinh thể nước gây ra huỷ hoại cơ học đối với tinh trùng Quá trình giải đông cũng nhƣ đông lạnh đều có tác dụng cơ học huỷ hoại tinh trùng do sự chênh lệch áp suất tinh thể, sự di chuyển của nƣớc qua màng tế bào tinh trùng và sự giãn nở của các tinh thể nƣớc đá hay các bọt khí giữa các phân tử nƣớc đá gây ra hiện tƣợng bất thƣờng: méo mó, vỡ màng... Các tổn thƣơng cơ học này có thể loại trừ bằng cách hạn chế việc hình thành các tinh thể với kích thƣớc nhỏ nhờ kỹ thuật đóng băng hoặc tan băng với tốc độ nhanh. 1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới sức sống tinh trùng trong đông lạnh Khi đông lạnh và giải đông, do các hiện tƣợng trên sẽ đe dọa đến sự sống của tinh trùng. Các nhân tố giúp tinh trùng tồn tại sau khi đông lạnh và giải đông: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 -Khả năng chịu lạnh của tinh trùng Khả năng chịu lạnh của tinh trùng là tỷ lệ sống sót của tinh trùng sau khi giải đông. Điều này phụ thuộc vào: giống, độ tuổi lấy tinh, mùa vụ lấy tinh... -Thành phần môi trường pha loãng Môi trƣờng pha loãng bao gồm: chất có năng lƣợng, chất đệm, chất chống đông, chất điện giải... Tỷ lệ tinh trùng sau đông lạnh và giải đông phụ thuộc vào các thành phần trên, nếu việc pha chế môi trƣờng không hợp lý sẽ làm giảm hoạt lực, tăng tỷ lệ chết của tinh trùng. - Thời gian cân bằng Tinh trùng sau khi ra ngoài cơ thể rất dễ bị sốc nhiệt do sự chênh lệch giữa nhiệt độ trong cơ thể và nhiệt độ môi trƣờng ngoài cơ thể. Chính vì vậy cần thiết phải hạ nhiệt độ từ từ để tinh trùng làm quen với nhiệt độ thấp. Theo Ditto (1992) [21] cho biết: thời gian cân bằng khoảng 3 - 5h ở nhiệt độ 50C để tinh trùng làm quen với nhiệt độ thấp. -Tốc độ đông lạnh Khi đông lạnh sâu để tinh trùng đóng băng, tốc độ đông lạnh nhanh hay chậm quyết định đến hoạt lực tinh trùng sau giải đông. Ở nhiệt độ -20C, nƣớc nội bào và ngoại bào vẫn giữ nguyên pha lỏng, chƣa đóng băng thành dạng tinh thể, tế bào tinh trùng chƣa bị ảnh hƣởng. Ở nhiệt độ -50C, nƣớc ngoại bào bắt đầu đóng băng, nồng độ chất tan ngoại bào tăng lên, áp suất tinh thể chênh lệch, một phần nƣớc nội bào thoát ra ngoài và tiếp tục biến thành tinh thể băng. Ở nhiệt độ -100C xảy ra 3 trƣờng hợp phụ thuộc tốc độ đông lạnh (Iritani, 1989) [27]: + Đông lạnh chậm: nƣớc ngoại bào đóng băng, nƣớc nội bào thoát ra ngoài, tế bào tinh trùng mất nhiều nƣớc và teo lại. + Đông lạnh nhanh: khi không đủ thời gian để nƣớc nội bào thoát ra khỏi tinh trùng, nên nƣớc ngoại bào và nƣớc nội bào cùng đóng băng ở dạng tinh thể, các tinh thể nƣớc giãn nở sẽ làm méo hoặc vỡ màng tế bào tinh trùng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 + Đông lạnh rất nhanh: khi nƣớc nội bào không kịp thoát ra ngoài và do tốc độ đóng băng rất nhanh, nƣớc nội bào và nƣớc ngoại bào không kịp kết tinh dạng tinh thể mà xảy ra hiện tƣợng thuỷ tinh hoá. Kích thƣớc của tất cả các tinh thể nƣớc nội bào và ngoại bào đều rất nhỏ ở dạng li ti nên không có sự giãn nở về thể tích, giữ đƣợc áp suất thể tích đẳng trƣơng. Do đó, tinh trùng vẫn giữ nguyên hình thái và cấu trúc. -Giải đông Tinh cọng rạ đƣợc giải đông trong nƣớc ấm. Nhiệt độ và thời gian giải đông phải đồng thời đáp ứng đƣợc hai yêu cầu là “đánh thức” tinh trùng đang ở trạng thái tiềm sinh chuyển sang trạng thái hoạt động và không làm ảnh hƣởng đến hoạt lực của tinh trùng. Do đó, cần phải giải đông nhanh, nhiệt độ giải đông phải đảm bảo để tinh trùng không phải chịu đựng pha kết tinh hoá đồng thời không phá vỡ cấu trúc của tinh trùng. - Bảo quản Tinh trùng sau đông lạnh luôn phải đƣợc bảo quản trong nitơ lỏng (-196 0 C). Nếu bảo quản tốt, tinh trùng sau bảo quản hàng chục năm khi giải đông vẫn có khả năng thụ thai. Ở Thụy Sĩ: tinh trùng bò bảo quản 20 năm vẫn có khả năng thụ thai. Ở Nhật Bản: tinh cọng rạ gia súc bảo quản sau 4 - 13 năm, sức hoạt động 45 - 55%, tỷ lệ thụ thai 54% (Hiroshi Masuda, 1994) [26]. Bằng phƣơng pháp bức xạ thì tinh trùng có thể tồn tại đến 400 năm (Majur, 1989) [31]. 1.3.3. Cơ sở khoa học của môi trường đông lạnh tinh dịch lợn Kỹ thuật đông lạnh đƣợc tiến hành trong thời gian dài, điều kiện nhiệt độ rất thấp. Vì vậy, các môi trƣờng sử dụng trong đông lạnh cần phải đáp ứng đƣợc các yêu cầu nhƣ: cung cấp năng lƣợng cho tinh trùng; độ pH, ASTT phải cân bằng tƣơng đối với pH và ASTT của tinh trùng; tăng cƣờng các chất đệm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 để duy trì pH; có các chất có tác dụng bảo vệ tinh trùng trong điều kiện nhiệt độ thấp và tránh cho._. (maxi - straw ). Và tiến hành đông lạnh tinh dịch trong hơi nitơ (-79 oC) trong thời gian 10 phút và 20 phút nhằm chọn thời gian đông lạnh thích hợp. Sau đó tinh dịch đƣợc ngâm trong nitơ lỏng (-196oC) và bảo quản lâu dài. Sau khi bảo quản phải đánh giá sức sống tinh trùng ở những thời gian đông lạnh nhằm tìm ra thời gian đông lạnh thích hợp. Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của thời gian đông lạnh đến sức sống của tinh trùng (n= 70) Chỉ tiêu Tinh dịch sau cân bằng bƣớc 2 (Mean±SE mean) Thời gian đông lạnh 10 phút (Mean±SE mean) 20 phút (Mean±SE mean) Motility (%) 91,29±1,02*** 73,16±1,02** 66,23±1,24** A (ProgressiveMotility %) 74,74±1,07*** 43,80±1,07** 38,80±1,17** Ghi chú: Trong cùng 1 dòng, sự sai khác giữa các giá trị trung bình có ** là có ý nghĩa thống kê (p<0,01);*** có ý nghĩa thống kê (p<0,001). Kết quả bảng 3.14 cho thấy: sức sống tinh trùng ở tinh pha trƣớc đông lạnh chỉ tiêu Motility (%): 91,29±1,02; A (Progressive.Motility %): 74,74±1,07. Ở thời gian đông lạnh 10 phút các chỉ tiêu tƣơng ứng là: 73,16±1,02; 43,80±1,07 và ở thời gian đông lạnh 20 phút là: 66,23±1,24; 38,80±1,17. Sức sống tinh trùng sau khi đông lạnh giảm đi rất rõ rệt. Sự sai khác giữa các giá trị trung bình của các chỉ tiêu có ý nghĩa thống kê (p < 0,001). Kết quả trên đƣợc lý giải là trong quá trình đông lạnh ở nhiệt độ -79oC, tuy trong môi trƣờng đông lạnh có các chất làm giảm các tác Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 72 nhân bất lợi cho tinh trùng, nhƣng ở một điều kiện nhƣ vậy tinh trùng vẫn phải chịu những tác động về vật lý, hóa học làm cho sức sống bị giảm rõ rệt. Tuy nhiên những tinh trùng vƣợt qua đƣợc giai đoạn này và đƣợc bảo quản trong nitơ lỏng (-196oC) sẽ tồn tại ở dạng tiềm sinh, khi có điều kiện thuận lợi lại hoạt động bình thƣờng trở lại. Kết quả bảng 3.14 cũng cho thấy, với hai thời gian đông lạnh khác nhau thì ở thời gian đông lạnh 10 phút có kết quả cao hơn (p < 0,01). Kết quả nghiên cứu đông lạnh tinh dịch lợn địa phƣơng ở trạm thực nghiệm Ibaragi thuộc Trung tâm giống quốc gia Nhật Bản: sau khi giải đông hoạt lực tinh trùng đạt 30% - 40 %. Johnson và Pursel (1975) [36] hoạt lực tinh trùng đông lạnh phải đạt trên 30 %. Nhƣ vậy kết quả của chúng tôi đạt yêu cầu và phù hợp với các tác giả khác. Căn cứ vào kết quả trên chúng tôi áp dụng thời gian đông lạnh 10 phút để tiến hành đông lạnh tinh dịch của các giống lợn. 74.74 43.8 38.8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Trƣớc đông lạnh 10 phút 20 phút Hoạt lực A(%) Biêủ đồ 3.8: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng trƣớc, và sau đông lạnh ở thời gian đông lạnh 10 phút và 20 phút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 73 3.2.4. Kết quả nghiên cứu nhiệt độ và thời gian giải đông tinh dịch đông lạnh 3.2.4.1. Ảnh hƣởng của thời gian giải đông đến sức sống tinh trùng Tinh dịch sau khi đông lạnh và bảo quản cần đƣợc giải đông để đánh giá sức sống tinh trùng. Kỹ thuật giải đông có vai trò quan trọng trong việc đánh giá kết quả đông lạnh. Nếu kỹ thuật đông lạnh và chất lƣợng tinh đông lạnh tốt, nhƣng kỹ thuật giải đông không phù hợp sẽ dẫn đến kết luận sai. Có rất nhiều quy trình giải đông khác nhau, căn cứ vào một số kết quả của các tác giả và ứng dụng kỹ thuật giả đông của Kim In Cheul ( Hàn Quốc) (2007) [30] để nghiên cứu kỹ thuật giải đông ở nhiệt độ 52oC và thời gian 45 giây và 30 giây. Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của thời gian giải đông đến sức sống tinh trùng (n=70) Chỉ tiêu Nhiệt độ giải đông Thời gian giải đông 45 giây (Mean±SE mean) 30 giây (Mean±SE mean) Motility (%) 52oC 72,46 ± 1,08** 65,56 ± 1,18** A (ProgressiveMotility %) 52 o C 44,57 ± 1,14 ** 40,51 ± 1,04 ** Ghi chú: Trong cùng một dòng, sự sai khác giữa các giá trị trung bình có ** là có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Qua bảng 3.15 chúng tôi thấy, sức sống tinh trùng đƣợc giải đông ở nhiệt độ 52oC trong thời gian 30 giây có Motility (%): 65,56±1,18; A (Progressive.Motility %): 40,51±1,04 và trong thời gian 45 giây tƣơng ứng là: 72,46±1,08; 44,57±1,14. Sự sai khác giữa các giá trị trung bình có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Nhƣ vậy tinh dịch đông lạnh đƣợc giải đông ở cùng nhiệt độ 52oC trong thời gian 45 giây tốt hơn. Các tác giả Johnson và Pursel (1975) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 74 [36] đề xuất giải đông ở 50oC trong thời gian 20 giây; Sellés và cs (2003) [41] nhiệt độ giải đông là 52oC thời gian 12 giây. 38 39 40 41 42 43 44 45 30 s 45 s Hoạt lực A (%) Biêủ đồ 3.5: Biểu đồ so sánh hoạt lƣc (A) tinh trùng ở thời gian giải đông 30 giây và 45 giây 3.2.4.2.Chất lƣợng tinh dịch đông lạnh sau giải đông của các giống lợn. Tinh dịch các giống lợn Landrace, Yorkshire, Duroc đƣợc đông lạnh theo quy trình dựa trên các kết quả nghiên cứu trên: tinh nguyên đƣợc pha với môi trƣờng VCN; ly tâm ở nhiệt độ 220C trong thời gian 15 phút với tốc độ ly tâm 1500 v/phút; cân bằng theo phƣơng pháp 2 bƣớc với môi trƣờng L.Y.E 1 và L.Y.E 2; tinh dịch đƣợc đóng gói trong cọng rạ có thể tích 5ml (maxi - straw), thời gian đông lạnh trên hơi nitơ lỏng là 10 phút; bảo quản trong nitơ lỏng ( -196oC) và đƣợc giải đông ở nhiệt độ 52oC trong thời gian 45giây. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.16. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 75 Bảng 3.16. Chất lƣợng tinh dịch đông lạnh sau giải đông của các giống lợn Chỉ tiêu Giống Landrace(n=84) (Mean ±SEmean) Yorkshire(n=60) (Mean ±SEmean) Duroc(n=68) (Mean ±SEmean) C (10 9 /ml) 1,05±0,03a 1,02±0,03b 1,09±0,03c Motility (%) 77,66±0,92a 66,46±1,08b 73,16±1,02c A(Progressvie.Motility %) 44,99±0,96a 44,57±1,14b 37,80±1,07c V (ml)/cọng rạ 5,0 5,0 5,0 VAC (10 9 ) /cọng rạ 2,35±0,05a 2,27±0,08b 2,06±0,12c DCL (µm) 23,26±1,43a 35,21±1,69b 33,32±1,59c DAP (µm) 15,72±0,90a 21,35±1,07b 19,72±1,00c DSL (µm) 11,14±0,78a 15,67±0,92b 13,65±0,86c VCL (µm/giây) 55,81±3,34a 80,23±3,95b 78,58±3,71c VAP (µm/giây) 37,77±2,17a 48,78±2,57b 46,79±2,42c VSL (µm/giây) 26,86±1,92a 35,87±2,28b 32,60±2,14c Ghi chú: Trong cùng một dòng, sự sai khác giữa các giá trị trung bình có các chữ cái khác nhau là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05); Kết quả bảng 3.16 cho thấy: các chỉ tiêu chất lƣợng tinh dịch đông lạnh sau giải đông của giống lợn Landrace: Motility (%): 77,66±0,92, A (Progressvie Motility %): 44,99±0,96; VAC(10 9/cọng rạ): 2,35±0,05; Lợn Yorkshire các chỉ tiêu tƣơng ứng là: 66,46±1,08; 44,57±1,14; 2,27±0,08 và lợn Duroc là 73,16±1,02; 37,80±1,07; 2,06±0,12. Trong các chỉ tiêu trên, A (Progressvie Motile %) là chỉ tiêu quan trọng nhất đánh giá kết quả của kỹ thuật đông lạnh đó chính là chất lƣợng tinh đông lạnh. Sức sống tinh trùng của tinh đông lạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 76 sau giải đông của 3 giống lợn trên đều đạt kết quả cao từ 37,8% đến trên 44%. Kết quả trên bằng và cao hơn kết quả của một số tác giả nhƣ: trạm thực nghiệm Ibaragi thuộc Trung tâm giống quốc gia Nhật Bản sau khi giải đông hoạt lực tinh trùng đạt 30% - 40%; Westendorf và cs (1975) [50]; Johnson và Pursel (1975) [36] hoạt lực tinh trùng đông lạnh phải đạt trên 30 %. 44.99 44.57 37.8 34 36 38 40 42 44 46 Landrace Yorkshire Duroc Hoạt lực A (%) Biêủ đồ 3.10: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng sau giải đông ở các giống lợn Qua biểu đồ ở hình 3.10 cho thấy: hoạt lực A (%) ở lợn Landrace cao nhất, tiếp đó là Yorkshire và thấp nhất ở lợn Duroc. Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu đánh giá sự vận động của tinh trùng nhƣ: DCL(µm), DAP (µm), DSL (µm), VCL(µm/giây), VAP(µm/giây), VSL(µm/giây) cũng đạt tiêu chuẩn của tinh đông lạnh. Kết quả này cũng tƣơng tự kết quả của các tác giả: Teresa Cremades và cs (2005) [42] thì VCL là 73,38±0,32µm/giây; VAP: 55,43±0,25µm/giây; VSL: 43,54±0,22µm/giây. Các giá trị trung bình của các chỉ tiêu chất lƣợng tinh dịch đông lạnh của 3 giống lợn sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 77 23.26 35.21 33.32 15.72 21.35 19.72 11.14 15.67 13.65 0 5 10 15 20 25 30 35 40 DCL DAP DSL Landrace Yorkshire Duroc Độ dài (µm) Dạng chuyển động Biêủ đồ 3.11: Biểu đồ so sánh độ dài các chuyển động của tinh trùng 55.8 80.23 78.58 37.77 48.78 46.79 26.86 35.87 32.6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 VCL VAP VSL Dạng vận động Landrace Yorkshire Duroc Vận tốc (µm/s) Biêủ đồ 3.12: Biểu đồ so sánh vận tốc chuyển động của tinh trùng ở các dạng vận động Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 78 Qua biểu đồ ở hình 3.11; 3.12, các chỉ tiêu vận động của tinh trùng ở Landrace thấp nhất, Yorkshire cao nhất và Duroc ở mức trung bình so với hai giống lợn trên. Để tiếp tục đánh giá chất lƣợng tinh dịch đông lạnh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thử nghiệm sử dụng tinh đông lạnh để tạo phôi trong thụ tinh ống nghiệm, phối giống cho lợn nái để tạo phôi phục vụ kỹ thuật di thực phôi trên lợn và phối giống trực tiếp cho lợn nái trong sản xuất. 3.3. Kết quả nghiên cứu sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh. Trong khuôn khổ của đề tài cấp bộ, nên chúng tôi đã kết hợp với các tác giả TS Đào Đức Thà (chủ nhiệm đề tài), Ths Nguyễn Thị Thoa (chủ trì đề tài nhánh) và các cộng sự thực hiện nội dung này. 3.3.1.Kết quả sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro) Tinh dịch đông lạnh sau khi giải đông đƣợc dùng trong kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm để tạo phôi. Bảng 3.17. Kết quả tạo phôi trong thụ tinh ống nghiệm. Đợt TN Trứng cho TTON Phôi 2-4 tế bào (Ngày 0-2) Phôi ngày 6 sau thụ tinh (n) (n) % Phôi dâu (n) % Phôi nang (n) % 1 120 55 45,83 12 21,81 0 0 2 82 36 43,90 10 27,77 0 0 3 125 89 71,20 22 17,60 15 16,85 4 165 112 67,87 22 18,03 11 9,82 5 105 75 71,42 21 28,00 9 12.00 6 152 99 65,13 24 24.24 15 15,15 7 166 115 69,27 27 23,47 29 25,21 Tổng 915 581 63,49 138 23,75 79 13,59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 79 Kết quả bảng 3.17 cho thấy, những tế bào trứng loại 1 dùng cho thụ tinh ống nghiệm sau 7 đợt thí nghiệm, thu đƣợc 581 phôi 2 - 4 tế bào chiếm 63,49% và đến ngày thứ 6 thu đƣợc 138 phôi dâu (23,75%); 79 phôi nang (đạt tỉ lệ 13,59%). Kết quả trên cho thấy tinh dịch lợn đông lạnh có thể sử dụng trong thụ tinh ống nghiệm. 3.3.2.Kết quả sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh phối giống cho lợn nái để lấy phôi và trong sản xuất. 3.3.2.1.Kết quả sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh phối giống cho lợn nái để lấy phôi và cấy phôi cho lợn nái . Sử dụng tinh dịch đông lạnh phối giống cho lợn nái Móng cái, sau 7 ngày thu phôi để cấy cho lợn ngoại. Bảng 3. 18 .Kết quả nghiên cứu tạo và cấy phôi ở lợn nái. Chỉ tiêu Kết quả Số nái phối giống đẻ lấy phôi( con) 4 Số nái cho phôi (con) 4 Tỷ lệ cho phôi (%) 100 Số phôi /1 con ( phôi) 20-32 Số nái nhận phôi (con) 9 Số nái có chửa (con) 4 Tỷ lệ có chửa (%) 44,44 Số nái đã đẻ (con) 2 Số con trong 1 ổ (con) 9-10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 80 Kết quả bảng 3.18 cho thấy, tỷ lệ cho phôi của lợn nái khi đƣợc phối giống bằng tinh đông lạnh rất cao (100 %), số lƣợng phôi thu đƣợc trên một nái cũng tƣơng đối cao (20-32). Số lƣợng thử nghiệm còn ít do vậy kết quả tuy cao nhƣng mới chỉ là bƣớc đầu chỉ có giá trị tham khảo. Tuy nhiên với kết quả trên bƣớc đầu có thể khẳng định đƣợc kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn đã có kết quả. 3.3.2.2.Kết quả sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh phối giống cho lợn nái trong sản xuất. Chúng tôi tiến hành sử dụng tinh đông lạnh phối giống cho lợn nái tại trại chăn nuôi. Bảng 3.19. Kết quả phối giống trong sản xuất. Chỉ tiêu Kết quả Số nái đƣợc phối giống ( con) 17 Số nái có chửa ( con) 10 Tỷ lệ thụ thai ( %) 58,33 Số con đã đẻ ( con) 8 Số con sơ sinh /1 ổ ( con) 7,37 Kết quả bảng 3.19 cho thấy: Sử dụng tinh đông lạnh phối giống cho lợn nái, tỷ lệ thụ thai đạt 58,33 %, số con sơ sinh trên một ổ 7,37 con. Trong khi đó sử dụng tinh tƣơi trong sản xuất tỷ lệ thụ thai trên 80 %, số con sơ sinh/ổ: 10-14 con. Theo Kim In Cheul (Viện chăn nuôi Hàn Quốc) (2007) [30]: thụ tinh nhân tạo bằng tinh đông lạnh (5 ml/cọng) tỷ lệ thụ thai đạt từ 61,7% đến 74,2%, số con sơ sinh/ ổ từ 8,1-8,7 . Nhƣ vậy kết quả sử dụng tinh đông lạnh phối giống cho lợn nái trong sản xuất cần phải nghiên cứu sâu hơn nhằm nâng cao hiệu quả. Tuy nhiên với kết quả bƣớc đầu nhƣ trên cũng đã khẳng định đƣợc thành công của kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 81 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN - Chất lƣợng tinh dịch 3 giống lợn Landrace, Yorkshire, Duroc nuôi tại Viện chăn nuôi đạt tiêu chuẩn để đông lạnh: Thể tích tinh dịch ở lợn Landrace là 215ml, ở lợn Yorkshire là 275ml và ở lợn Duroc là 285ml.Nồng độ tinh trùng ở lợn Landrace là 259,12 triệu/ml, ở lợn Yorkshire là 274,15 triệu/ml và ở lợn Duroc là 214,24 triệu/ml.VAC ở lợn Landrace là 47,35 tỷ, ở lợn Yorkshire là 64,78 tỷ và ở lợn Duroc là 51,21 tỷ. pH tinh dịch ở lợn Landrace là 7,34, ở lợn Yorkshire là 7,35 và ở lợn Duroc là 7,41. Tỷ lệ kỳ hình ở lợn Landrace là 6,87, ở lợn Yorkshire là 6,4 và ở lợn Duroc là 7,17. ASTT tinh dịch ở lợn Landrace là 312,05, ở l ợn Yorkshire là 308,8 và ở lợn Duroc là 320,65. Acrosome nguyên vẹn ở các giống đều đạt trên 90%. - Sử dụng môi trƣờng VCN (Viện chăn nuôi) làm môi trƣờng ly tâm. Môi trƣờng VCN có pH là: 7,2 và ASTT là 302 - Chế độ ly tâm tinh dịch ở nhiệt độ 220C trong thời gian 15 phút với tốc độ ly tâm 1500 v/phút là thích hợp. - Dùng môi trƣờng đông lạnh L.Y.E 1 và L.Y.E 2; cân bằng ở chế độ 2 bƣớc - Thời gian đông lạnh tinh dịch trong hơi nitơ lỏng (- 79oC) trong thời gian 10 phút tốt hơn ở thời gian 20 phút. Ở thời gian đông lạnh 10 phút Motility(%) là: 73,16; hoạt lực A (Progressive.Motility %): 43,80; ở thời gian đông lạnh 20 phút Motility (%): 66,23; hoạt lực A (Progressive.Motility): 38,80. - Giải đông tinh đông lạnh ở 52oC trong vòng 45 giây tốt hơn ở thời gian 30 giây.Ở thời gian giải đông 45 giây Motility (%): 74,46; hoạt lực A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 82 (Progressive.Motility %): 44,57; ở thời gian giải đông 30 giây Motility (%) là: 65,56; Hoạt lực A (Progressive. Motility): 40,51. - Chất lƣợng tinh dịch đông lạnh đạt tiêu chuẩn: Hoạt lực A (Progressvie Motility %) của các giống lợn Landrace: 44,985; Yorkshire: 44,568; Duroc: 37,801. Các chỉ tiêu vận động của tinh trùng sau giải đông cũng đạt yêu cầu. - Bƣớc đầu sử dụng tinh đông lạnh trong thụ tinh ống nghiệm, tạo phôi, phối giống trong sản xuất có kết quả. 2. ĐỀ NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện và xây dựng quy trình đông lạnh tinh dịch lợn, áp dụng đông lạnh tinh dịch các giống lợn quý hiếm. - Sử dụng tinh dịch đã đông lạnh trong sản xuất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Tấn Anh (1984), Nghiên cứu môi trường tổng hợp để pha loãng bảo tồn tinh dịch 1 số giống lợn ngoại nuôi tại Miền Bắc Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ khoa học Nông nghiệp, tr. 15-20, 59-65. 2. Nguyễn Tấn Anh (1985), “Một vài đặc điểm sinh vật học của tinh trùng”, Tạp chí Khoa học Kỹ Thuật Nông nghiệp, (278), tr. 376 - 377. 3. Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Quốc Đạt (1996), Thụ tinh nhân tạo gia súc gia cầm, Nxb Nông nghiệp. 4. Nguyễn Tấn Anh (2003), Thụ tinh nhân tạo cho gia súc gia cầm, Nxb Lao động - Xã hội, Hà Nội. tr. 82-88. 5. Lê Xuân Cƣơng (6-1985), “Truyền tinh nhân tạo góp phần tăng nhanh tiến bộ di truyền các giống lợn”, Thông tin Kinh tế Kĩ thuật Hà Nội, tr. 1–23. 6. Lê Xuân Cƣơng, Vũ Đình Hiền (2-1987), “Kết quả theo dõi thụ tinh nhân tạo lợn ở Quận Gò Vấp TP. Hồ Chí Minh”, Tạp Chí Khoa học Kỹ Thuật Nông nghiệp, tr.76-78. 7. Trần Tiến Dũng, Dƣơng Đình Long, Nguyễn Văn Thanh (2002), Giáo trình sinh sản gia súc, Nxb Nông nghiệp. 8. Lƣu Kỷ, Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Thiện (1995), “Một số kết quả nghiên cứu về sinh sản và thụ tinh nhân tạo gia súc, gia cầm”, Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật chăn nuôi - Viện chăn nuôi, Nxb Nông nghiệp. 9. Lê Quang Long (1976), “ Góp phần kiểm tra chất lƣợng tinh dịch giống lợn Nam Hà”, Báo cáo khoa học Viện chăn nuôi. 10. Lƣơng Tất Nhợ ( 1980), “Khảo sát đánh giá chất lƣợng tinh dịch 3 giống lợn Yorkshire, Duroc, Landrace”, Báo cáo khoa học Viện chăn nuôi. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 84 11. Nguyễn Thiện, Lƣu Kỷ, Nguyễn Tấn Anh (1976), “Phẩm chất tinh dịch và khả năng truyền giống của lợn F3 ( ĐB-I )”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật nông nghiệp - Bộ NN, tr. 690 – 691. 12. Nguyễn Thiện, Nguyễn Tấn Anh (1993), Thụ Tinh Nhân Tạo cho lợn ở Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, tr: 93; 102 – 103. 13. Nguyễn Thiện, Trần Đình Miên, Võ Trọng Hốt (2005), Con lợn ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, tr. 584-586. 14. Nguyễn Thiện, Nguyễn Tấn Anh, Đỗ Hữu Hoan ( 2006), Kĩ thuật thụ tinh nhân tạo cho lợn ở Việt Nam, Nxb Nông nghiệp. 15. Đỗ Văn Thu (2005), “ Đông lạnh tinh dịch cừu”, Thông tin Khoa học Kỹ thuật Chăn nuôi. Viện Chăn Nuôi, (1- 2005). tr 57- 63. 16. Nguyễn Văn Thƣởng (1998), “Truyền giống và Thụ tinh nhân tạo”, Hội chăn nuôi Việt Nam, tr. 26. 17. Uỷ ban khoa học kỹ thuật nhà nƣớc, Tiêu chuẩn nhà nước về tinh dịch lợn, TCVN (1959 – 76) (Nhóm N). II. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 18. AI and free semen in goat. The new technique in Viet Nam. www.mekarn.org/procsr/tha.pdf 19. Almlid T, Hofmo P.O. (1996), A brief review of frozen semen applications under Norwegian AI swine conditions, Reprod Domest Anim 31, pp.169-173. 20. Crabo, B.G. and S. Einarsson. (1971), Fertility of deep frozen boar spermatozoa. Acta vet. Scand 12, pp. 125-127. 21. Ditto (1992), Theory of spermatozoa freezing - artifial insemination for cattle-association of livestock technology, Tokyo. 22. Fraser L., Gorszczaruk K., Strzezek J.( 2001), Relationship between motility and membrane integrity of boar spermatozoa in media varying in osmolality, Reprod Domest Anim 36, pp. 325-329. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 85 23. Gilmore J.A., Du J., Tao J., Peter A.T., Critser J.K.( 1996), Osmotic properties of boar spermatozoa and their relevance to cryopreservation, J Reprod Fertil 107, pp. 87-95. 24. Gottardi .L.L., Brend and l. Zanelli.(1980), Proceedings of congress on animal reproduction and artificial insemination,Vol.(5-1980), pp. 53. 25. Graham, E.F., A.H.J. Rajamannan, M.K.L. Schmehl. M. Maki-Laurila, and R.E. Bower.( 1971), Preliminary report on procedure and rationale for freezing boar semen. A.I. Digest 19,pp. 12. 26. Hirosi Masuda. (1994), Artificial insemination for Swine, manual of feeding management for pigs, National institute of animal husbandry, pp. 4-8. 27. Iritani A.( 1989), “Problems of freezing spermatozoal different species”. 9 th international congress on animal reproduction and artificial insemination, Madrrid. 28. Ito, Niwa, Kudo. ( 1984), Artificial insemination. 29. Joaquín Gadea. (2003), Semen extenders used in theartificial insemination of swine, Spanish Journal of Agricultural Research, 1(2), pp. 17-27 30. Kim In Cheul (2007), Artificial insemination of swine, National livestock research institute, Korea,. 31. Majur (1989), Fundamental aspects of the freezing of cells with emphasis on mammalian ova and embryos, 9 th international congress on animal reproduction and artificial insemination, Madrrid. 32. Milovanov V.K.(1962), Biology Vosporoizvedenija. Iskustvennoe Osemenenie Zhivotnykh. Izdatel'stvo Sel'skokhozjzjstvennoj. Literatury, Zhurnalov I Plakatov. Moskva, Russian. 33. Paquignon M, Courot M (1976), Fertilizing capacity of frozen boar spermatozoa, 8 th International Congress on Animal Reproductive Artificial Insemination, Cracow, Poland 4, pp. 1041- 1044. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 86 34. Polge, C. Salamon, S. and I. Wilmut (1970), Fertilizing capacity of frozen boar semen following surgical insemination,Vet. Rec 87, pp. 424-428. 35. Pursel, V.G. and L.A. Johnson (1971), Fertility with frozen boar semen. J. Anim. Sci 33, pp. 265. 36. Pursel, V.G. and L.A. Johnson (1975). Freezing of boar spermatozoa: Fertilizing capacity with concentrated semen and a new thawing procedure. J. Anim. Sci 40, pp. 99-102. 37. Pursel, Schulman and Johnson, Effect of Orvus ES Paste on Acrosomee Morphology, Motility and Fertilizing Capacity of Frozen-Thawed Boar Sperm. J. Anim Sci 47, pp. 198-202. 38. Pursel and Johnson (2004), Boar semen cryopreservation protocol, J Anim Sci, 40(1), pp. 99-102. 39. Rigau T., Piedrafita J., Reverter J., Canal M., Rodríguez-Gil J.E (1996). The rate of L-lactate production: a feasible parameter for the fresh diluted boar semen quality analysis. Anim Reprod Sci 43, pp. 161-172. 40. Sanada and saito (1978), Artificial insemination of livestock. The fourth edition, Niwa et al, Tokyo, pp. 154. 41. Sellés E, Gadea J, Romar R, Mators C, Ruiz S (2003). Analysis of in vitro fertilizing capacity to evaluate the freezing procedures of boar semen and to predict the subsequent fertility. Reprod Domest Anim 38, pp. 66 -72. 42. Teresa Cremades, Jordi Roca, Heriberto Rodriguez-Martinez, Teresa Abaigar, Juan M. Vazquez and Emilio A. Martinez.( 2005), Kinematic changes during the cryopreservation of boar spermatozoa. J Androl 26, pp. 610-618. 43. Torahiko IIDA (1994), Artificial insemination, pp. 153 - 162. 44. Tsutsui, Hori, Komoriya, Shimizu, Nagakubo, Kawakami (2000), Effect of Addition of Orvus ES Paste to Frozen Canine Semen Extender on Sperm Acrosomees. J Vet Med Sci,; Vol.62; No.5, pp. 537-538. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 87 45. Wagner, H.G., and M. Thibier (2000), World statistics for artificial insemination in small ruminants and swine, Proc. 14th ICAR, 2(15), pp. 3. 46. Weize. K.F.( 1991), Cryobiological aspect of sperm conservation, Gusta ficher, Verlag, Jena. 47. Zimmerman. DR (1986), Role of subtherapentic antimicrobial in big production, J.Anim.Sci.62, (supple 3) : 6. III. TÀI LIỆU TIẾNG PHÁP 48. P. Thilmant (2001), Congélation du sperme de verrat en paillettes fines de 0,25 ml. Porcine en France 33, pp. 151-156. IV. TÀI LIỆU TIẾNG ĐỨC 49. Telesforo Bonadonna (1967), Fisiopatologia de la reproduccion y de la fecundacion artificial de los animales domesticos, Redicion revolucionaria, La Habana 8, pp. 249. 50. Westendorf. P, Ritcher.L, Treu H, (1975). Zur Tiefgefrierung von Ebersperma. Labor-und Besamungsergebnisse mit dem Hỹlsenberger Paillettenverfahren. DtschTierojrztl Wschr 82, pp. 261–267. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 88 PHỤ LỤC Phƣơng pháp nghiên cứu một số chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng của tinh dịch lợn trƣớc khi đông lạnh Các chỉ tiêu chất lƣợng tinh dịch lợn đƣợc nghiên cứu theo phƣơng pháp thƣờng quy và phần mềm Spermvision 3.0. 1. Phƣơng pháp nghiên cứu hoạt lực tinh trùng (A, %) Hoạt lực tinh trùng đƣợc nghiên cứu dựa trên việc sử dụng phần mềm Sperm Vision 3.0. - Phần mềm Sperm Vision giúp phân tích các chỉ tiêu về tinh dịch trực tiếp và chính xác. Hệ thống Sperm Vision có cấu tạo gồm: + Kính hiển vi phản pha + Camera kỹ thuật số tốc độ cao + Máy tính có hệ thống Graphics PC card chuyên dụng + Bộ phận sƣởi ấm tự động + Phiến kính chuyên dụng dùng một lần + Micro pipet 10 – 100µl + Phần mềm chạy trên chƣơng trình Window XP Cách tiến hành : Bật máy. Nhấn chuột vào biểu tƣợng Sperm Vision Màn hình hiển thị trang Sample ( mẫu ). Khai báo các yêu cầu: + Time ( Thời gian : ngày, tháng, giờ ) tự động hiển thị. + Donor ID ( Đặc điểm của gia súc lấy mẫu ). + Donor name ( Tên của gia súc lấy mẫu ). + Breed ( Giống ). + Tech ( Kỹ thuật viên ). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 89 + Evat. Tech ( Kỹ thuật đánh giá ). + Extender ( MôI trƣờng sử dụng để pha loãng ). Bấm chuột vào ô New sample ( Mẫu mới ). Màn hình hiển thị lên trang: New sample entry ( Khai báo các yêu cầu của mẫu mới ). Phải khai báo các mục: + Ngày kiểm tra ( tự động ). + Giờ kiểm tra ( tự động ). + Donor ID : số hiệu gia súc kiểm tra. + Tech : kỹ thuật viên + Eval. Tech : kỹ thuật đánh giá + Đơn vị lƣợng tinh kiểm tra + Extender use : môi trƣờng pha loãng khi kiểm tra Nếu không khai báo đầy đủ phần mềm sẽ không chạy và có câu hỏi đƣợc đƣa ra. Bấm vào ô “ OK” Màn hình hiển thị trang : Mobility Analysis ( phân tích hoạt lực ). + Nhấn chuột vào cửa sổ giống ( Breed ). Chọn mục con giống nào sẽ kiểm tra ( phần này đã đƣợc cài đặt sẵn trong trƣơng trình từng con giống ). + Nhấn chuột vào ô Dilution radio để chọn tỉ lệ pha loãng phù hợp với tỉ lệ đã pha mẫu kiểm tra. Màn hình hiển thị hình ảnh sẽ hiện khi kiểm tra và một bảng các chỉ tiêu kiểm tra. Chuẩn bị tiêu bản : Nhỏ một lƣợng 20 microlit mẫu vào phiến kính đã có sẵn. Đƣa phiến kính đã chuẩn bị sẵn lên kính hiển vi. Điều chỉnh độ nét Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 90 Nháy chuột vào ô cửa sổ Analyze kết quả sẽ đƣợc tự động hiển thị trên màn hình cả về hình ảnh và số liệu. Di chuyển sang vị trí khác để kiểm tra bằng cách nhấn chuột vào ô field và tiếp tục nhấn chuột vào ô Analyze để phân tích tiếp. Đối với lợn mỗi mẫu làm 3 lần ( 3 field ). Các số liệu sẽ đƣợc tự động tính toán theo từng field và trung bình. Các số liệu và hình ảnh sẽ đƣợc lƣu giữ lại và chuyển về một field dữ liệu. Field này có thể chuyển sang phần Exel để tính toán . Hết 3 Field thì tự động hiển thị lên phần kiểm tra kì hình trực tiếp trên một Field và cho kết quả. Những số liệu và những vấn đề liên quan đến gia súc kiểm tra đƣợc khai báo vào thƣ mục tƣơng ứng. Các chỉ tiêu kì hình và tỉ lệ tinh trùng sống, chết kỹ thuật viên phải trực tiếp quan sát trên màn hình và nhấn chuột vào vị trí của từng tinh trùng và máy tính sẽ tự động ghi lại và tính toán. Những tinh trùng chết đƣợc đánh dấu một chấm đỏ ở đầu, những tinh trùng kỳ hình kỹ thuật viên phải phân loại và nhận biết chính xác. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu nồng độ tinh trùng (C, triệu/ml) Nồng độ tinh trùng đƣợc đánh giá bằng máy so màu SDM-S của hãng Minitub (Đức). Cách đánh giá nhƣ sau: - Bƣớc 1: đặt phƣơng pháp đo Sử dụng phƣơng pháp 3 để đo nồng độ tinh trùng của lợn - Bƣớc 2: đo mật độ quang của nƣớc muối sinh lý Cho vào cuvet 3,5ml nƣớc muối sinh lý để đo - Bƣớc 3: so màu để tìm nồng độ tinh trùng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 91 Lấy một cuvet sạch khác, cho vào đó 3,5ml nƣớc muối sinh lý và 70μl tinh dịch. Lắc nhẹ cho đều mẫu rồi đƣa vào máy để so màu. - Bƣớc 4: đọc kết quả trên màn hình 3. Phƣơng pháp nghiên cứu áp suất thẩm thấu Đo ASTT của tinh dịch lợn trên máy đo tự động Osmometer Type 5 của hãng Minitub (Đức). Cách tiến hành: bật máy lên, máy khởi động 3 – 5 phút, trên màn hình hiển thị dãy số 9999, cho 0,1ml tinh dịch cần khảo sát vào tuýp nhựa chuyên dụng của máy, sau đó lắp vào đầu đo và đặt vào vị trí đo, lúc này máy tự hoạt động theo chƣơng trình, trên màn hình của máy hiển thị các dãy số giảm dần từ số (+) đến số (-). Khi dãy số chỉ – 800 máy tự động phát tín hiệu tút…tút…tút…liên tục báo hiệu cho kỹ thuật viên chuẩn bị thao tác nâng kim kích đông lên vị trí quy định. Khi màn hình hiện số – 1000 nhanh chóng thao tác đƣa kim kích đông vào vị trí và sau đó nhấc kim ra vị trí ban đầu, thời gian kích đông là 0,5 giây. Sau thời gian kích đông, màn hình sẽ hiển thị các dãy số, các dãy số này có giá trị (+) và giảm dần, khi dãy số dừng hoặc dao động xung quanh một giá trị nào đó, ta xác định đƣợc kết quả. Dãy số trên màn hình lúc này chính là giá trị áp lực thẩm thấu của dung dịch. Chú ý: trƣớc mỗi lần đo cần chỉnh máy bằng cách đo áp suất thẩm thấu của nƣớc cất. Nƣớc cất có ( ASTT ) là 0 và chỉnh về vị trí 0 trên máy. 1miniosmol = 0,00186 0 C = 0,0224 atm. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu tỷ lệ tinh trùng kỳ hình - Phƣơng pháp: làm tiêu bản cố định và quan sát trực tiếp trên màn hình vi tính của phần mềm Sperm Vision. Lấy hai phiến kính rửa sạch, sấy khô, nhỏ một giọt tinh dịch lên một phiến kính, dùng phiến kính kia gạt cho tinh dịch dàn đều và mỏng. Để hong khô ngoài không khí khoảng 5 phút. Sau đó đƣa lên kính hiển vi của hệ thống Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 92 máy Sperm Vision. Quan sát và đếm tổng số tinh trùng, số tinh trùng kỳ hình trên mỗi vi trƣờng. Sau đó xử lý thống kê để đánh giá tỷ lệ tinh trùng kỳ hình. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 93 Bình nitơ dùng trong kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn Tủ bảo ôn dùng trong kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 94 Máy đo áp suất thẩm thấu tinh dịch lợn Máy ly tâm tinh dịch lợn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 95 Hệ thống phần mềm Spermvision dùng đánh giá các chỉ tiêu của tinh trùng Một số hóa chất dùng trong kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 96 Môi trƣờng đông lạnh dùng trong kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 97 Kiểm tra chất lƣợng tinh dịch trƣớc và sau đông lạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 98 Tinh dịch sau cân bằng đƣợc đóng vào cọng rạ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 99 Tinh dịch sau khi đã đƣợc đóng vào cọng rạ Đông lạnh tinh dịch trong Nitơ lỏng (- 1960C) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 100 Giải đông tinh cọng rạ Đàn lợn con đƣợc sinh ra bằng TTNT tinh cọng rạ đông lạnh ._.