Nghiên cứu tình hình nhiễm, vai trò của vi khuẩn Clostridium Perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở bò, lợn nuôi tại Hà Nội và một số vùng phụ cận

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ i BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI HUỲNH THỊ MỸ LỆ NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH NHIỄM, VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÒ, LỢN NUÔI TẠI HÀ NỘI VÀ MỘT SỐ VÙNG PHỤ CẬN LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Dịch tễ học Thú y Mã số : 62 62 50 15 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Bá Hiên 2. TS. ðỗ Ngọc Thuý HÀ NỘI – 2010 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan: công trình khoa học này là của tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan: mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện ñề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án ñều ñã ñược cảm ơn. Các thông tin trích dẫn trong luận án ñều chính xác và ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 15 tháng 3 năm 2010 Tác giả Huỳnh Thị Mỹ Lệ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ iii LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành bản luận án, tôi luôn nhận ñược sự giúp ñỡ của nhiều tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Viện ðào tạo Sau ðại học, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y - trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện cho tôi ñược theo học chương trình ñào tạo Nghiên cứu sinh tại trường. Tôi xin chân thành cảm ơn ban ñiều hành dự án Việt - Bỉ, trường ðHNN Hà Nội ñã hỗ trợ kinh phí ñể tôi thực hiện ñề tài nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ thuộc bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, khoa Thú y - Trường ðHNN Hà Nội; bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia và Trung tâm Cúm Quốc Gia - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương ñã nhiệt tình giúp ñỡ, tạo ñiều kiện thuận lợi nhất ñể tôi hoàn thành ñề tài nghiên cứu. ðặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến các thầy hướng dẫn khoa học là TS. Nguyễn Bá Hiên - bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, khoa Thú y - trường ðHNN Hà Nội và TS. ðỗ Ngọc Thuý - bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia ñã trực tiếp hướng dẫn, giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn ñến Giáo sư Jacques Mainil, Giáo sư Annick Linden - khoa Thú y - trường ðại học Liège, Vương quốc Bỉ và PGS.TS. Trương Quang, TS. Trần Thị Lan Hương, GVC. Lê Văn Lãnh - khoa Thú y - trường ðHNN Hà Nội ñã cung cấp tài liệu và những ý kiến quý báu ñể tôi hoàn thiện ñề tài nghiên cứu. Tôi luôn biết ơn gia ñình, bạn bè và các em sinh viên ñã ñóng góp công sức, ñộng viên, giúp ñỡ tôi hoàn thành ñề tài nghiên cứu và luận án. Hà Nội, ngày 15 tháng 3 năm 2010 Tác giả Huỳnh Thị Mỹ Lệ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ iv MỤC LỤC Trang LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ðẦU 1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS VÀ BỆNH DO CLOSTRIDIUM PERFRINGENS GÂY RA 4 1.1.1. Giới thiệu chung về genus (giống, chi) Clostridium 4 1.1.2. Vi khuẩn Clostridium perfringens 11 1.1.3. Hiểu biết về một số bệnh ñường tiêu hoá chủ yếu ở bò và lợn do vi khuẩn C. perfringens gây ra 22 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM VỀ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS VÀ BỆNH DO CLOSTRIDIUM PERFRINGENS GÂY RA 31 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 31 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 31 1.3. MỘT SỐ BIỆN PHÁP PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH DO VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS GÂY RA 34 1.3.1. Biện pháp phòng bệnh 34 1.3.2. Biện pháp ñiều trị 38 Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 40 2.1.1. Nghiên cứu tình hình nhiễm vi khuẩn C. perfringens ở bò và lợn mắc hội chứng tiêu chảy 40 2.1.2. Nghiên cứu vai trò của vi khuẩn C. perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở bò và lợn 40 2.1.3. Bước ñầu nghiên cứu dịch tễ học phân tử vi khuẩn C. perfringens gây hội chứng tiêu chảy ở bò và lợn 40 2.2. NGUYÊN LIỆU 41 2.2.1. ðối tượng nghiên cứu 41 2.2.2. ðộng vật thí nghiệm 41 2.2.3. Môi trường, hoá chất 41 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu 42 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ v 2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn hiếu khí và yếm khí 43 2.3.3. Phương pháp giám ñịnh một số ñặc tính sinh học của vi khuẩn C. perfringens phân lập ñược 46 2.3.4. Phương pháp xác ñịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng C. perfringens phân lập ñược 49 2.3.5. Phương pháp xác ñịnh gen mã hóa ñộc tố và ñịnh typ bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 51 2.3.6. Phương pháp giải trình tự gen 53 2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu 56 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 57 3.1. TÌNH HÌNH NHIỄM VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Ở BÒ VÀ LỢN MẮC HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY 57 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens ở bò 57 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens ở lợn 62 3.2. NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÒ VÀ LỢN 72 3.2.1. Số lượng của vi khuẩn C. perfringens trong phân bò, lợn bị tiêu chảy và khoẻ mạnh 72 3.2.2. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens trong môi trường chuồng nuôi, sữa bò và bệnh phẩm của bò, lợn bị tiêu chảy 77 3.2.3. Kết quả giám ñịnh ñặc tính sinh học và khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng C. perfringens ñã phân lập ñược 84 3.3. BƯỚC ðẦU NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGRENS GÂY HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÒ VÀ LỢN 100 3.3.1. Kết quả xác ñịnh gen mã hóa yếu tố ñộc lực và ñịnh typ các chủng C. perfringens phân lập ñược 100 3.3.2. Kết quả giải trình tự gen các chủng C. perfringens 117 Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 123 4.1. KẾT LUẬN 123 4.2. ðỀ NGHỊ 124 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 125 TÀI LIỆU THAM KHẢO 126 PHỤ LỤC Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ vi CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN A : Adenin ADP : adenosine diphosphate AMP : Amplification buffer API : Analytical Profile Index ATCC : American Type Culture Collection BHI : Brain Heart Infusion bp : base pair C : Cytosin CAMP : Christie Atkins Munch-Petersen CDC : Centers for Disease Control and Prevention CFU : Colony Forming Unit CI : Confidence interval CPE : Clostridium perfringens enterotoxin CW : Clostridium welchii C. perfringens : Clostridium perfringens DNA : Deoxyribonucleic Acid dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate E. coli : Escherichia coli ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EYA : Egg Yolk Agar FAO : Food and Agriculture Organization G : Guanin HBS : Haemorrhagic bowel syndrome kDa : kilo Dalton KM : Khoẻ mạnh LD : Lethal dose µl : microlitre NCCLS : National Committee of Clinical Laboratory Standards OR : Odds Ratio RNA : Ribonucleic Acid rRNA : Ribosomal Ribonucleic Acid PCR : Polymerase Chain Reaction SIM : Sulfide – Indole - Motility T : Thymin TAE : Tris - Acetate - EDTA TE : Tris - EDTA TC : Tiêu chảy TGC : Thioglycollate TGE : Transmissible gastroenteritis TSC : Tryptose Sulphite Cycloserine Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ vii DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 1.1 Bệnh do vi khuẩn Clostridium gây ra ở người và ñộng vật 5 1.2 ðiều kiện nuôi cấy thích hợp của vi khuẩn C. perfringens 12 1.3 Các loại ñộc tố do vi khuẩn C. perfringens sản sinh ra 13 1.4 Bệnh gây ra bởi các ñộc tố chính của vi khuẩn C. perfringens 20 2.1 Tiêu chuẩn ñánh giá mức ñộ mẫn cảm và kháng kháng sinh theo NCCLS (1999) 50 2.2 Trình tự mồi của phản ứng Multiplex PCR dùng ñể xác ñịnh gen mã hoá ñộc tố của các chủng C. perfringens 52 2.3 Thành phần các chất trong phản ứng Multiplex PCR dùng ñể xác ñịnh gen mã hoá ñộc tố của các chủng C. perfringens 52 2.4 Chu kỳ nhiệt của phản ứng Multiplex PCR dùng ñể xác ñịnh gen mã hoá ñộc tố của các chủng C. perfringens 53 2.5 Trình tự cặp mồi ñể giải trình tự gen 54 2.6 Thành phần phản ứng PCR ñể giải trình tự gen 54 2.7 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR ñể giải trình tự gen 54 2.8 Chu kỳ nhiệt của phản ứng giải trình tự gen 55 3.1 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân bò bị tiêu chảy và bò khỏe mạnh 57 3.2 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân bò bị tiêu chảy tại các ñịa phương 58 3.3 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân bò bị tiêu chảy theo lứa tuổi 60 3.4 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy và lợn khỏe mạnh 64 3.5 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy tại các ñịa phương 67 3.6 Số lượng vi khuẩn C. perfringens và E. coli trong mẫu phân bò bị tiêu chảy và bò khỏe mạnh 73 3.7 Số lượng vi khuẩn C. perfringens và E. coli trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy và lợn khỏe mạnh 75 3.8 Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens trong mẫu môi trường chuồng nuôi và sữa của bò bị tiêu chảy 78 3.9 Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens trong bệnh phẩm của bò và lợn bị tiêu chảy 82 3.10 Một số ñặc tính sinh học của các chủng C. perfringens phân lập ñược từ mẫu phân bò, lợn bị tiêu chảy và khỏe mạnh 85 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ viii 3.11 Một số ñặc tính sinh học của các chủng C. perfringens phân lập ñược từ môi trường chuồng nuôi, sữa và phủ tạng 86 3.12 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính sinh hóa và ñịnh danh các chủng C. perfringens phân lập ñược bằng hệ thống API 20A 87 3.13 Kết quả kiểm tra ñộc tố trong chất lọc từ một số mẫu phân bò bị tiêu chảy 89 3.14 Kết quả kiểm tra ñộc lực của một số chủng C. perfringens phân lập ñược từ bò bằng phương pháp tiêm truyền trên chuột 91 3.15 Kết quả kiểm tra ñộc lực của một số chủng C. perfringens phân lập ñược từ lợn bằng phương pháp tiêm truyền trên chuột 93 3.16 Khả năng mẫn cảm của các chủng C. perfringens phân lập ñược từ bò và lợn bị tiêu chảy với 12 loại kháng sinh 97 3.17 Kết quả ñịnh typ các chủng C. perfringens phân lập ñược từ mẫu phân và phủ tạng bò bị tiêu chảy 102 3.18 Kết quả xác ñịnh gen cpe và cpb2 của các typ vi khuẩn C. perfringens phân lập từ bò 109 3.19 Kết quả xác ñịnh gen cpe và cpb2 của các typ vi khuẩn C. perfringens phân lập từ lợn 113 3.20 Kết quả xác ñịnh gen cpe và cpb2 của các typ vi khuẩn C. perfringens phân lập từ môi trường chuồng nuôi và sữa 117 3.21 Một vài ñặc tính sinh học của những chủng C. perfringens ñược lựa chọn ñể giải trình tự gen 118 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ ix DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang 2.1 Sơ ñồ quy trình phân lập vi khuẩn hiếu khí và yếm khí từ các mẫu phân của gia súc bị tiêu chảy 44 2.2 Sơ ñồ quy trình phân lập và giám ñịnh vi khuẩn C. perfringens 45 3.1 Biểu ñồ so sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân bò bị tiêu chảy và bò khỏe mạnh 58 3.2 Biểu ñồ so sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân bò bị tiêu chảy theo lứa tuổi 61 3.3 Biểu ñồ so sánh tỷ lệ lợn bị tiêu chảy có các trạng thái phân khác nhau 63 3.4 Biểu ñồ so sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy và lợn khỏe mạnh 65 3.5 Biểu ñồ so sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy theo lứa tuổi 65 3.6 Bò bị tiêu chảy nặng, gầy còm 69 3.7 Phân bò bị tiêu chảy (màu ñen, nhiều nước, mùi thối khắm) 69 3.8 Lợn bị chết vì tiêu chảy (ruột ñầy hơi, xuất huyết) 69 3.9 Các thiết bị dùng ñể tạo môi trường nuôi yếm khí vi khuẩn C. perfringens 70 3.10 Vi khuẩn C. perfringens trong môi trường nước thịt gan yếm khí 70 3.11 Vi khuẩn C. perfringens trong môi trường Cooked meat 71 3.12 Vi khuẩn C. perfringens trong môi trường Thioglycollate 71 3.13 Vi khuẩn C. perfringens dưới kính hiển vi với ñộ phóng ñại 1000 lần 71 3.14 Vi khuẩn C. perfringens trên môi trường CW (+ 4% lòng ñỏ trứng) 71 3.15 Khuẩn lạc C. perfringens gây dung huyết kép trên môi trường thạch máu 72 3.16 Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường TSC 72 3.17 Biểu ñồ biến ñộng số lượng vi khuẩn C. perfringens và E. coli trong mẫu phân bò bị tiêu chảy và bò khỏe mạnh 74 3.18 Biểu ñồ biến ñộng số lượng vi khuẩn C. perfringens và E. coli trong mẫu phân lợn bị tiêu chảy và lợn khỏe mạnh 76 3.19 Bò bị tiêu chảy, toàn bộ bầu vú sưng, ñỏ ửng 81 3.20 Phản ứng CAMP ngược của vi khuẩn C. perfringens trên môi trường thạch máu 88 3.21 ðặc tính mọc của vi khuẩn C. perfringens trên môi trường SIM 88 3.22 Vi khuẩn C. perfringens trên môi trường Litmus Milk 88 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ x 3.23 Giám ñịnh các ñặc tính sinh hoá và ñịnh danh vi khuẩn C. perfringens bằng hệ thống API 20A 88 3.24 Tính chất mọc của C. perfringens trên môi trường thạch lòng ñỏ trứng 89 3.25 Chuột thí nghiệm chết do ñộc tố của vi khuẩn C. perfringens 95 3.26 Mổ khám kiểm tra bệnh tích của chuột thí nghiệm chết do ñộc tố của vi khuẩn C. perfringens 96 3.27 Kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn C. perfringens 100 3.28 Sản phẩm của phản ứng PCR sau quá trình ñiện di ñể xác ñịnh các loại gen mã hóa ñộc tố của vi khuẩn C. perfringens phân lập từ bò 104 3.29 Sản phẩm của phản ứng PCR sau quá trình ñiện di ñể xác ñịnh các loại gen mã hóa ñộc tố của vi khuẩn C. perfringens phân lập từ lợn 107 3.30 Không có tín hiệu A tại vị trí 54 của cả 5 chủng T1, T2, T3, T4 và T5 119 3.31a Tín hiệu C/T tại vị trí 172 của chủng T4 119 3.31b Tín hiệu A/G tại vị trí 319 của chủng T4 120 3.31c Tín hiệu T/G tại vị trí 438 của chủng T4 120 3.32a Tín hiệu A tại vị trí 508 của chủng T2 120 3.32b Tín hiệu A tại vị trí 552 của chủng T2 và T3 121 3.33 Tín hiệu C tại vị trí 608, C tại vị trí 609 và G tại vị trí 615 của chủng T2 121 3.34 Tín hiệu A tại vị trí 676 của 5 chủng T1, T2, T3, T4 và T5 122 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 1 MỞ ðẦU Việt Nam là một nước nông nghiệp, khoảng hơn 70% dân số sống ở các vùng nông thôn có ñời sống gắn liền với các hoạt ñộng sản xuất nông nghiệp, bao gồm trồng trọt và chăn nuôi. Thống kê hàng năm cho thấy ñàn trâu, bò và lợn của cả nước không chỉ tăng mạnh về số lượng mà còn ñược cải thiện rõ rệt về chất lượng con giống, góp phần ñáp ứng nhu cầu thực phẩm trong nước cũng như phục vụ xuất khẩu. Mục tiêu phấn ñấu trong chiến lược phát triển chăn nuôi ñến năm 2010, cả nước sẽ có tổng số bò là 7 triệu con, lợn 33 triệu con. ðịnh hướng ñến năm 2020, tổng bò sẽ ñạt khoảng 13 triệu con và lợn ñạt khoảng 35 triệu con [140]. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển trên, ngành chăn nuôi luôn phải ñối mặt với tình hình dịch bệnh diễn biến rất phức tạp ở ñàn gia súc, trong ñó phải kể ñến hội chứng tiêu chảy. Nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước ñã ñược tiến hành ñể tìm hiểu vai trò gây bệnh ở ñường tiêu hoá của những vi khuẩn hệ ñường ruột ñối với vật nuôi, trong ñó các tác giả ñặc biệt quan tâm ñến một số loại vi khuẩn thường gặp như Escherichia coli (E. coli), Salmonella, Clostridium perfringens (C. perfringens). Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu ñầy ñủ về Hội chứng tiêu chảy ở bò và lợn thường tập trung vào vi khuẩn E. coli và Salmonella; trong khi ñó, nghiên cứu về vai trò gây bệnh của vi khuẩn yếm khí C. perfringens chưa nhiều và chưa có hệ thống. ðặc biệt, từ năm 1997 trở về ñây, ở nước ta xuất hiện hiện tượng trâu, bò chết ñột ngột tại một số tỉnh phía Bắc và Bắc Trung Bộ mà nguyên nhân chính gây bệnh ñược xác ñịnh là do vi khuẩn C. perfringens, với tên gọi của bệnh là “Bệnh nhiễm ñộc tố ruột huyết” (Enterotoxaemia) (Lê Văn Tạo, 2006) [19], do ñó vấn ñề nghiên cứu về vi khuẩn C. perfringens càng trở nên cấp thiết. C. perfringens ñược xác ñịnh là một trong những vi khuẩn gây bệnh ở Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 2 gia súc bằng cách sản sinh ñộc tố; việc phân lập, ñịnh typ, xác ñịnh ñộc lực vi khuẩn có ý nghĩa quan trọng, sẽ là cơ sở khoa học trong công tác phòng và trị bệnh do vi khuẩn này gây ra. Vì C. perfringens là vi khuẩn yếm khí nên khi nuôi cấy, phân lập gặp khó khăn hơn so với các vi khuẩn hiếu khí; ñể nghiên cứu cần trang thiết bị và môi trường chuyên biệt. ðiều này cũng lý giải tại sao trong nước chưa có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn C. perfringens và bệnh do chúng gây ra. Hơn nữa, vì C. perfringens là vi khuẩn yếm khí nên việc phòng bệnh và ñiều trị cũng gặp nhiều khó khăn. Hiện tại, các chế phẩm sử dụng ñể phòng, trị bệnh do C. perfringens gây ra chưa khẳng ñịnh ñược hiệu quả, luôn gặp phải vấn ñề vi khuẩn kháng thuốc; vì vậy, cần có những nghiên cứu ñầy ñủ hơn về bệnh cũng như vi khuẩn gây bệnh này. Trên thế giới, Clostridium là nguyên nhân gây rất nhiều vụ dịch trên người và gia súc. Trong thời gian từ 1/10/2001 ñến 31/12/2004, EU ñã có chương trình QLK2-2001-01267 “Nghiên cứu bệnh lý học và mối quan hệ của giống Clostridium ở người, ñộng vật và thực phẩm - nguyên nhân gây bệnh, dịch tễ học và cách phòng bệnh”. Kết quả nghiên cứu ñã nêu rõ những ñặc ñiểm dịch tễ bệnh do Clostridium gây ra, xác ñịnh các ñặc tính của vi khuẩn gây bệnh và ñề xuất biện pháp phòng chống có hiệu quả (Mainil và cs, 2006) [84]. Nhằm góp phần ñể có ñược những hiểu biết ñầy ñủ hơn về vi khuẩn C. perfringens và bệnh do chúng gây ra, từ ñó ñề xuất những biện pháp giảm thiểu dịch bệnh ñường tiêu hoá ở ñàn gia súc tại khu vực Hà Nội, chúng tôi tiến hành ñề tài: “Nghiên cứu tình hình nhiễm, vai trò của vi khuẩn Clostridium perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở bò, lợn nuôi tại Hà Nội và một số vùng phụ cận”
MỤC TIÊU CỦA ðỀ TÀI Bước ñầu ñánh giá ñược vai trò của vi khuẩn C. perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở bò, lợn nuôi tại Hà Nội và một số vùng phụ cận, làm cơ sở khoa học cho việc ñề xuất biện pháp phòng trị bệnh. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 3
Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI - ðây là tài liệu nghiên cứu khá ñầy ñủ về ñặc tính sinh học và vai trò của vi khuẩn C. perfringens gây hội chứng tiêu chảy ở bò và lợn tại Việt Nam. - Là nghiên cứu ñầu tiên ở Việt Nam về ñộc tố của vi khuẩn C. perfringens và cấu trúc phân tử của vi khuẩn C. perfringens có ñộc tố gây bệnh. - Kết quả nghiên cứu và thông tin sử dụng trong luận án có thể là tài liệu tham khảo cho giảng dạy và nghiên cứu về vi khuẩn C. perfringens. - Mặc dù phạm vi nghiên cứu chỉ giới hạn ở một số vùng chăn nuôi nhất ñịnh, nhưng kết quả có thể là cơ sở ñể xác ñịnh nguyên nhân cũng như phương pháp chẩn ñoán và phòng chống bệnh do vi khuẩn C. perfringens gây ra.
Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ðỀ TÀI - Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học ñể chẩn ñoán bệnh ñường tiêu hoá do C. perfringens gây ra ở bò và lợn tại Việt Nam. - Dựa vào kết quả nghiên cứu giúp ñề xuất các phương pháp có hiệu quả cao trong phòng và trị bệnh ñường tiêu hoá do vi khuẩn C. perfringens gây ra. - Trên cơ sở kết quả giải trình tự gen của vi khuẩn, có thể xây dựng phương pháp chẩn ñoán chính xác và chế tạo vacxin phòng bệnh có hiệu quả.
NHỮNG ðÓNG GÓP MỚI CỦA ðỀ TÀI - Lần ñầu tiên ñã phân lập ñược vi khuẩn C. perfringens typ D và C ở ñàn bò tại Việt Nam, cho thấy sự tồn tại và gây bệnh của chúng. - Là nghiên cứu ñầu tiên về khả năng sản sinh ñộc tố ruột và ñộc tố β-2 của các chủng C. perfringens phân lập ñược từ bò và lợn tại Việt Nam - ðã giải trình tự gen một số chủng ñại diện cho vi khuẩn C. perfringens có ñộc tính gây bệnh ở ñàn bò và lợn. Kết quả thu ñược ñem lại những hiểu biết ñầu tiên về dịch tễ học phân tử của vi khuẩn C. perfringens tại Việt Nam và nghiên cứu ứng dụng phòng bệnh do vi khuẩn này gây ra. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS VÀ BỆNH DO CLOSTRIDIUM PERFRINGENS GÂY RA 1.1.1. Giới thiệu chung về genus (giống, chi) Clostridium Giống Clostridium gồm những trực khuẩn yếm khí, bắt màu Gram dương, có kích thước 0,3 - 1,3 x 3 - 10 µm (Quinn và cs, 1999) [106]. Vi khuẩn có khả năng hình thành nha bào và nha bào thường lớn hơn bề ngang của vi khuẩn. Chỉ riêng loài C. spiroform có hình hơi cong hoặc hình xoắn ốc còn tất cả các loài gây bệnh trong giống Clostridium ñều có dạng trực khuẩn thẳng. Vi khuẩn sau khi hình thành nha bào hoặc trong canh trùng nuôi cấy lâu thường có xu hướng khó bắt màu. Trong khi hầu hết các loài trong giống Clostridium ñều có khả năng di ñộng nhờ lông rung thì C. perfringens là loài duy nhất không di ñộng. Vi khuẩn Clostridium có khả năng lên men ñường, phản ứng oxidase và catalase âm tính. Yêu cầu mức ñộ yếm khí tuyệt ñối thay ñổi tuỳ theo loài, nhưng hầu hết ñều thích hợp phát triển trong ñiều kiện môi trường có 2 - 10% CO2, pH gần trung tính và nhiệt ñộ nuôi cấy thích hợp là 370C. Các môi trường nuôi cấy vi khuẩn Clostridium thường ñược bổ sung amino acid, carbohydrate, vitamin và máu hoặc huyết thanh. Vi khuẩn Clostridium phân bố rộng rãi khắp nơi trên thế giới, thường có mặt trong ñất, nước và cát; một số loài hoặc một số chủng chỉ có ở các vùng ñịa lý nhất ñịnh. Nhiều loài gây bệnh tồn tại trong ñường tiêu hoá của người và ñộng vật, chúng thường gây nhiễm trùng từ trong. Các loài khác phân bố trong ñất và gây nhiễm trùng từ ngoài qua các vết thương hoặc qua ñường tiêu hoá. Hiện ñã có trên 40 loài Clostridium ñược công bố là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh ở người, gia súc và gia cầm. Có thể tóm tắt các bệnh do vi khuẩn Clostridium gây ra như trong bảng 1.1 (Quinn và cs, 1999) [106]: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 5 Bảng 1.1. Bệnh do vi khuẩn Clostridium gây ra ở người và ñộng vật Loài Clostridium Loài vật mắc bệnh Tên bệnh CLOSTRIDIUM GÂY ðỘC TỐ THẦN KINH Clostridium tetani Ngựa, loài nhai lại và các ñộng vật khác Uốn ván (tetanus) Clostridium botulinum (typ A - F) Nhiều loài ñộng vật và người Trúng ñộc thịt Clostridium argentinense (C. botulinum typ G) Người (Argentina) Trúng ñộc thịt CLOSTRIDIUM GÂY ðỘC MÔ BÀO Clostridium chauvoei Bò, cừu (lợn) Ung khí thán (blackleg) Bò, cừu và lợn Phù thũng ác tính Cừu Braxy Clostridium septicum Gia cầm Chứng viêm da hoại tử Clostridium novyi Cừu Chứng Cừu con ñầu to typ A Bò và cừu Hoại thư sinh hơi typ B Cừu, (bò) Bệnh ñen (Viêm gan hoại tử) typ C Trâu Viêm tuỷ xương Clostridium haemolyticum (C. novyi typ D) Bò, (cừu) Chứng ñái ra huyết sắc tố Clostridium sordellii Bò, cừu, ngựa Hoại thư sinh hơi Clostridium colinum Chim cảnh, gà con và gà tây Viêm loét ruột BỆNH NHIỄM ðỘC TỐ RUỘT HUYẾT Clostridium perfringens typ A Người Trúng ñộc thức ăn, hoại thư sinh hơi Cừu Chứng vàng da do nhiễm ñộc tố ruột huyết typ B Cừu (dưới 3 tuần tuổi) Bệnh lỵ Bê non và ngựa non Nhiễm ñộc tố ruột huyết typ C Lợn choai, cừu, bê, ngựa con Nhiễm ñộc tố ruột huyết Cừu trưởng thành Run cơ Gà Viêm ruột hoại tử typ D Cừu (trừ con sơ sinh), dê, bê Bệnh nhũn thận typ E Bê và cừu (ít gặp) Nhiễm ñộc tố ruột huyết Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 6 Loài Clostridium Loài vật mắc bệnh Tên bệnh BỆNH DO CLOSTRIDIUM GÂY RA SAU KHI SỬ DỤNG KHÁNG SINH Thỏ Viêm ruột có màng nhày Clostridium spiroform Thỏ và chuột lang Tiêu chảy sau khi sử dụng kháng sinh Ngựa con và lợn Viêm ruột non kết Người, chuột hamster, thỏ, chuột lang Viêm ruột non kết do sử dụng kháng sinh Clostridium difficile Chó, ngựa con, lợn, ñộng vật thí nghiệm Tiêu chảy 1.1.1.1. Tính chất nuôi cấy Trong giống Clostridium, khi nuôi cấy yêu cầu ñiều kiện yếm khí của các loài cũng có sự khác nhau: một số loài yếm khí triệt ñể và không thể phát triển ñược nếu như có dấu vết của O2; một số loài tương ñối tuỳ tiện (C. histolyticum, C. tertium) có thể phát triển ñược trong ñiều kiện hỗn hợp khí: 5% O2, 10% CO2, 85% N2, hoặc thậm chí trong môi trường không khí bình thường. Ngược lại với Bacillus, Clostridium chỉ hình thành nha bào khi không có O2 (Peck và cs, 2004) [104] và có thể dễ dàng phân biệt với các vi khuẩn giống Bacillus (Mainil và cs, 2004) [83]. Hầu hết các loài của Clostridium gây bệnh cho ñộng vật ñều chỉ phát triển trong ñiều kiện yếm khí tuyệt ñối, riêng C. perfringens có thể sinh trưởng trong ñiều kiện yếm khí không triệt ñể. Clostridium có thể phát triển tốt trên một số môi trường thạch máu như thạch CDC (của trung tâm phòng chống dịch bệnh Hoa Kỳ - Centers for Disease Control and Prevention) hoặc thạch Schaedler, có bổ sung thêm 5% máu cừu và tiến hành nuôi trong ñiều kiện yếm khí. Các loại môi trường thạch cổ ñiển có 5% máu cừu như Columbia, Brucella và BHI (Brain Heart Infusion) thì cần bổ sung thêm chiết xuất nấm, vitamin K1 và heamin ñể tối ưu hóa cho sự phát triển của vi khuẩn yếm khí (Bisping và Amtsberg, 1988 [35]; Quinn và cs., 1999) [106]. ðiều ñáng lưu ý là các loại môi trường trên rất dễ hấp thu oxy vì vậy môi trường chế xong tốt nhất nên nuôi cấy vi khuẩn ngay; nếu chưa dùng ñến phải bảo quản môi trường trong ñiều kiện yếm khí. Việc bảo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 7 quản các ñĩa thạch trong ñiều kiện yếm khí hoặc trước khi cấy vài giờ ñể thạch trong ñiều kiện yếm khí sẽ làm tăng khả năng phân lập ñược vi khuẩn Clostridium. Khi nuôi cấy vi khuẩn Clostridium trên các môi trường khác nhau, hình thái khuẩn lạc và vùng dung huyết của chúng khác nhau nên có thể sử dụng là tiêu chuẩn ñể ñịnh danh vi khuẩn. Loại máu sử dụng ñể chế môi trường thạch máu cũng rất quan trọng. Khi nuôi cấy trên thạch máu bò, vùng dung huyết của các chủng C. perfringens phân lập từ bò mang ñộc tố typ A rộng hơn và rõ hơn so với khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu cừu (Mainil và cs, 2006) [84]. Các loại môi trường lỏng hoặc bán cố thể có khả năng oxy hoá khử thấp như môi trường nước thịt ñã qua xử lý (Cooked Meat Broth) và môi trường Thioglycollate thường ñược sử dụng ñể nuôi cấy và giữ giống vi khuẩn Clostridium. Các môi trường này cần phải ñược ñun sôi cách thủy trong vòng 5 - 10 phút nhằm loại bỏ khí O2, sau ñó làm nguội thật nhanh ñến nhiệt ñộ phòng rồi mới tiến hành cấy vi khuẩn (Quinn và cs, 1999) [106]. 1.1.1.2. Vai trò của phân tử 16s rRNA trong chẩn ñoán và phân loại vi khuẩn Clostridium a) Phân tử 16s rRNA: Ribosom là một tổ hợp các ñại phân tử. ðây là bộ máy sinh tổng hợp protein trong mọi tế bào sống, trong ñó các rRNA (ribosomal Ribonucleic Acid) là thành phần trung tâm của ribosom và giữ chức năng như yếu tố chính tổng hợp nên protein của tế bào. Ở vi khuẩn, ribosom ñược cấu tạo từ 3 loại phân tử rRNA là 16S, 23S và 5S (Brown, 1998 [36]; Lewin, 1997 [80]). ðể thực hiện cùng một chức năng ở mọi cơ thể sống, cũng như ñảm bảo sự khác biệt tinh tế về cấu trúc và chức năng giữa các loài, cấu trúc phân tử của các phân tử rRNA gồm các vùng bảo tồn (bất biến) U (Universal – là các vùng có sự biến ñổi rất ít giữa các loài), các vùng biến ñổi V (Variable), ngoài ra, còn có các vùng biến ñổi ít và gọi là vùng bán bảo tồn S (Semi-conserved) (Johanson, 1993) [69]. Trình tự gen mã hóa các rRNA thay ñổi chậm theo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 8 thời gian và ñược coi như một cái “ñồng hồ” ghi chép sự tiến hóa của các loài (Woese, 1987) [135]. Trong số các phân tử rRNA, phân tử 16s rRNA ñược coi là công cụ quan trọng và có ý nghĩa nhất trong việc ñánh giá các tiến hóa di truyền, rất hữu ích cho việc giám ñịnh và phân loại vi khuẩn. ðiều này ñược thể hiện rõ qua một số ñặc tính sau ñây: i) Gen mã hóa 16s rRNA có mặt ở tất cả các loại vi khuẩn, vì vậy nó là mục tiêu quan trọng cho việc nhận biết vi khuẩn; ii) Chức năng của 16s rRNA ñược bảo tồn qua thời gian dài, bởi vậy sự thay ñổi của chuỗi cũng sẽ phản ánh những thay ñổi ngẫu nhiên hơn là những thay ñổi có tính chọn lọc; iii) Chuỗi gen mã hoá cho phân tử 16s rRNA có kích thước vừa phải (khoảng 1550 bp) - ñủ ñộ lớn ñể có thể chứa các thông tin có tính thống kê về chuỗi có liên quan, và quan trọng là phân tử này có chứa khoảng 50 vùng (domain) có các chức năng nhất ñịnh (Patel, 2001) [103]. Số lượng các bản sao của phân tử 16s rRNA ở mỗi chủng là khác nhau giữa các loài vi khuẩn. Chẳng hạn, E. coli có mang 7 bản sao của 16s rRNA, C. perfringens có 10 bản sao, còn Mycobacterium chỉ có 1 hoặc 2 bản sao (Patel, 2001 [103], Takeshi và cs, 2001 [124]). b) Vai trò 16s rRNA trong chẩn ñoán và phân loại vi khuẩn Carl Woese là người ñầu tiên tiến hành phân tích và giải mã trình tự các gen mã hoá phân tử 16s rRNA của các loại vi khuẩn (Woo và cs, 2008) [136]. Ông ñã mô tả phương pháp này như là “công nghệ của ñồ họa” và sử dụng các chuỗi ñược giải mã trong các nghiên cứu về thông tin ña hình sinh học. Các chuỗi gen rRNA ñược bảo tồn chặt chẽ trong các vi sinh vật của cùng một giống hoặc một loài, nhưng lại khác nhau với các vi sinh vật của giống và loài khác. Ngày nay, việc sử dụng các thông tin thu ñược từ giải mã trình tự gen của 16s rRNA ñang ñược ứng dụng rộng rãi tại nhiều phòng thí nghiệm trên toàn thế giới. Theo các phương pháp truyền thống, việc xác ñịnh một loại vi khuẩn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 9 nào ñó chủ yếu ñược tiến hành dựa trên kết quả làm tiêu bản nhuộm Gram và các phản ứng sinh hóa, ñặc tính phát triển trên các môi trường. Tuy nhiên, các phương pháp này có một số nhược ñiểm nhất ñịnh như: i) Có những loại vi khuẩn, ñôi khi, mang các ñặc tính sinh hóa bất thường hoặc không hề trùng lặp với các mẫu sinh hóa của các loại vi khuẩn ñã ñược công bố trước ñó; ii) Một số loại vi khuẩn không thể tiến hành nuôi cấy ñược (Treponema pallidum) hoặc phát triển rất chậm như Mycobacterium; iii) Việc giám ñịnh một số nhóm vi khuẩn (ví dụ như các vi khuẩn yếm khí và Mycobacterium), ñòi hỏi phải có thiết bị chuyên dùng ñặc biệt, cũng như hiểu biết sâu về chuyên môn của cá._.c chuyên gia mà không phải phòng thí nghiệm lâm sàng nào cũng ñáp ứng ñược. Do vậy, sử dụng kỹ thuật giải mã trình tự gen của 16s rRNA sẽ khắc phục ñược các nhược ñiểm này (Woo và cs, 2008) [136]. Từ việc phân tích thông tin trình tự gen 16s rRNA của một loài vi khuẩn cần nghiên cứu có thể ñưa ra các bằng chứng ñể kết luận về giống hoặc loài, cũng như xác ñịnh ñược vị trí của vi khuẩn này trong bảng phân loại và quan hệ họ hàng với các vi khuẩn khác. ðến nay, trình tự gen 16s rRNA của hầu hết các loài vi khuẩn ñều ñã ñược giải mã. GenBank [139] là ngân hàng dữ liệu lớn nhất hiện ñang lưu giữ khoảng hơn 20 triệu chuỗi gen, trong ñó hơn 90.000 là các gen 16s rRNA (Clarridge, 2004) [41]. Bằng cách giải mã trình tự gen của 16s rRNA, rất nhiều giống và loài khác nhau của vi khuẩn ñã ñược phân loại và ñặt tên lại, các vi khuẩn không thể nuôi cấy cũng có thể tiến hành phân loại ñược, mối quan hệ ña hình về kiểu gen cũng ñược xác ñịnh, các loài vi khuẩn mới cũng ñược phát hiện và phân loại nhanh hơn. ðối với hầu hết các loại vi khuẩn, ñể có thể nhận dạng ñược vi khuẩn ở mức ñộ loài, không nhất thiết phải tiến hành giải mã toàn bộ chuỗi gen của 16s rRNA (~1500 bp) vì mặc dù các vị trí mang tính quyết ñịnh trong sự ña dạng thông tin di truyền có mặt xuyên suốt trong cả ñoạn gen, nhưng vùng dị Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 10 chủng rõ rệt nhất nằm trong khoảng 500 bp ñầu tiên của ñầu 5’ (Rogall và cs, 1990 [109]; Tang và cs, 1998 [125]; Woese và cs, 1983 [134]). Do ñó, chỉ cần giải mã khoảng 500 bp ñầu tiên cũng ñủ ñể nhận biết một chủng vi khuẩn nào ñó; nhưng việc giải mã toàn bộ gen thì sẽ giúp ích tốt hơn cho việc xác ñịnh ñặc tính của các chủng vi khuẩn mới (Patel, 2001) [103]. c) Sử dụng thông tin trên phân tử 16s rRNA trong phân loại vi khuẩn Clostridium Các vi khuẩn thuộc giống Clostridium ñược xác ñịnh dựa vào một số ñặc ñiểm như có dạng trực khuẩn, phát triển trong môi trường yếm khí, hình thành nha bào. Tính dị chủng của các vi khuẩn thuộc giống Clostridium là rất lớn, ñược thể hiện bằng các ñặc tính sinh lý và sinh hóa ña dạng của chúng như tính chất bắt màu Gram không ổn ñịnh, và thành phần của tổng số các nucleotid G + C có thể dao ñộng từ 24 ñến 58 mol% (Finegold, 1977 [54], ; Hippe, 1991 [66]). Garnier và cs (1991) [57] ñã tiến hành dòng hóa và giải mã trình tự gen rRNA của 4 (rrnA, rrnB, rrnE và rrnH) trong số 10 operon của C. perfringens chủng CPN50. Gần ñây nhất, Takeshi và cs (2001) [124] ñã tiến hành giải mã trình tự gen rRNA của cả 10 operon của C. perfringens chủng 13, trong ñó có 9 operon (rrnA, rrnB, rrnC, rrnD, rrnE, rrnF, rrnG, rrnH, rrnI) ñược cấu trúc gồm cả 3 loại 16s, 23s và 5s, còn operon rrnJ chỉ gồm 2 loại 16s và 23s. Nghiên cứu ñã cho thấy: ñộ dài của các gen của 16s, 23s và 5s trên cả 10 operon là giống nhau, chỉ khác nhau ở vùng ñệm giữa 16s-23s hoặc 23s-5s; so với các gen của 23s và 5s, trình tự gen của 16s rRNA tương ñối ñồng nhất giữa các operon. Trên cơ sở tiến hành các phân tích ña hình về kiểu gen của 16s rRNA của Clostridium, rất nhiều tác giả ñã tiến hành nghiên cứu và phân loại các chủng Clostridium mới phát hiện, từ ñó xác ñịnh vị trí của chúng trong cây tiến hóa và mối quan hệ họ hàng giữa các loài trong cùng một giống hoặc lớp. Collins và cs (1994) [43] ñã tiến hành giải mã, phân tích so sánh thông tin trình tự gen 16s rRNA của 34 loài Clostridium. Từ thông tin thu ñược, tác giả ñã Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 11 xây dựng cây phát sinh, mối quan hệ họ hàng giữa các loài, tính toán khoảng cách tiến hóa, ñồng thời xác ñịnh mối quan hệ về kiểu gen của chúng so với 80 loài ñã ñược xác ñịnh trước ñó. Gần một nửa số loài Clostridium ñã ñược nghiên cứu thuộc về một nhóm ñã ñược xác ñịnh kiểu hình một cách rõ ràng và ký hiệu là Cluster Ia (trong ñó có C. perfringens). Số còn lại, dựa vào sự ña dạng về mức ñộ của kiểu gen ñược xếp theo 19 Cluster khác (ký hiệu từ II ñến XIX và XIVa, XIVb). Năm 1996, Kuhnert và cs [77] cũng ñã phân tích và phân loại hai loài C. chauvoei và C. septicum vào Cluster I với mức ñộ tương ñồng là 99,3%. 1.1.2. Vi khuẩn Clostridium perfringens Vi khuẩn Clostridium perfringens (thuộc giống Clostridium) ñược Welch và Nuttall phát hiện ñầu tiên vào năm 1892, với tên gọi lúc ñầu là Bacillus aerogenes capsulatus. Sau này, vi khuẩn ñược ñổi tên thành Bacillus enteritidis sporogenes, Bacillus perfringens, Bacterium welchii và Clostridium welchii. Mặc dù tên gọi không chính thức là C. welchii, nhưng ñược sử dụng từ năm 1939 và hiện nay vẫn có thể tìm thấy trong cách viết của người Anh. Từ năm 1980, tên khoa học chính thức của vi khuẩn là Clostridium perfringens (C. perfringens) (Hatheway, 1990) [65]. Vi khuẩn phân bố rộng rãi trong ñường tiêu hoá của người và gia súc, môi trường (ñất, nước, phân, thức ăn...), và là nguyên nhân gây nhiều bệnh như hoại thư sinh hơi, ngộ ñộc thực phẩm, bệnh nhiễm ñộc tố ruột huyết, viêm ruột hoại tử và hội chứng ñột tử. 1.1.2.1. Hình thái và tính chất nuôi cấy C. perfringens là vi khuẩn yếm khí không triệt ñể (thường phải bổ sung 2 - 10% CO2), không di ñộng, hình thành giáp mô trong mô bào; là trực khuẩn to, thẳng, hai ñầu tròn, ñứng riêng lẻ hoặc thành ñôi, có kích thước từ 0,6 - 0,8 x 2 - 4 µm, bắt màu Gram dương (Quinn và cs, 1999) [106]. Một số ñiều kiện nuôi cấy thích hợp của vi khuẩn này ñược tóm tắt trong bảng 1.2. (trích theo Annamari Heikinheimo, 2008) [30]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 12 Bảng 1.2. ðiều kiện nuôi cấy thích hợp của vi khuẩn C. perfringens ðiều kiện nuôi cấy Tối thiểu Thích hợp Tối ña Nhiệt ñộ (0C) 10 - 12 43 - 47 50 - 55 pH 5,0 – 5,5 6,0 – 7,2 8,0 – 9,0 NaCl (%) - 5,0 – 8,0 - NaNO3 (ppm) - 60 - 2560 - aw (water activity) 0,93 0,95 – 0,96 0,97 Khi nuôi cấy trên các môi trường, tính chất mọc của vi khuẩn có ñặc ñiểm: - Môi trường nước thịt gan yếm khí: sau 24 giờ nuôi cấy trong ñiều kiện yếm khí ở 370C, vi khuẩn phát triển mạnh, làm ñục môi trường và sinh hơi. - Môi trường thạch máu trong ñiều kiện yếm khí ở 370C: sau khi nuôi cấy C. perfringens từ 18-24 giờ, lấy ñĩa ra khỏi tủ ấm và ñể ở nhiệt ñộ phòng trong 2 giờ ñể có thể quan sát ñầy ñủ ñặc tính dung huyết của vi khuẩn. Hình thái ñặc trưng của vi khuẩn C. perfringens trên môi trường thạch máu là hình thành các khuẩn lạc tròn, trơn bóng, lấp lánh, mờ ñục, có vùng dung huyết ñôi ñặc trưng (quan sát rõ hơn khi dùng máu cừu hoặc thỏ). - Môi trường thạch lòng ñỏ trứng (Egg Yolk Agar - EYA): vi khuẩn C. perfringens với hoạt tính của men lecithinase sẽ tạo thành một vùng trắng ñục xung quanh khuẩn lạc do men này tác ñộng lên chất lecithin có trong môi trường. Những chủng vi khuẩn C. perfringens sản sinh men lipase sẽ tạo nên một lớp sáng như ngọc trai hoặc óng ánh nhiều màu xung quanh khuẩn lạc; trong một số trường hợp còn lan ra cả phần thạch ở xung quanh. - Môi trường Litmus milk: Litmus milk là môi trường dùng ñể giữ và nuôi cấy vi khuẩn sinh acid lactic. ðây là môi trường ñặc biệt dùng ñể xác ñịnh một số ñặc tính của vi khuẩn: lên men ñường lactose, phân giải casein và ñông vón casein. Chất chỉ thị pH là Litmus ñược bổ sung vào môi trường. Sữa có ñường lactose và 3 loại protein chính: casein, lactalbumin và lactoglobulin. Vi khuẩn C. perfringens có khả năng lên men ñường lactose trong môi trường, sinh acid làm ñông vón casein, màu môi trường chuyển sang màu hồng. Khi sinh hơi, cục ñông vón sẽ bị tan ra. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 13 1.1.2.2. ðộc tố của vi khuẩn C. perfringens Vi khuẩn C. perfringens có khả năng sản sinh ñộc tố. ðến nay, người ta ñã xác ñịnh ñược chính xác 14 loại ñộc tố của vi khuẩn có thể gây nên 25 loại bệnh khác nhau (Bảng 1.3) (Frey và Vilei, 2002 [55]; Hatheway, 1990 [65]; Niilo, 1980 [99]). Tuy nhiên, một số công trình nghiên cứu công bố ñã phát hiện ñược ít nhất 20 loại ñộc tố của vi khuẩn C. perfringens [145]. Có bốn loại ñộc tố chính thường gặp phổ biến nhất là alpha (α, cpa), beta (β, cpb), epsilon (ε, etx) và iota (ι, iA). Bảng 1.3: Các loại ñộc tố do vi khuẩn C. perfringens sản sinh ra (Hatheway, 1990) [65] Typ vi khuẩn ðộc tố Hoạt tính sinh học A B C D E ðộc tố chính (gây chết) Alpha Gây chết, hoạt tính men lecithinase (phospholipase C) + + + + + Beta Gây chết, hoại tử, không bền với trypsin - + + - - Epsilon Gây chết, hoạt hoá bởi trypsin - + - + - Iota Gây chết, hoạt hoá bởi trypsin - - - - + ðộc tố phụ Gamma Chưa xác ñịnh rõ - ± ± - - Delta Gây dung huyết - ± + - - Eta Chưa xác ñịnh rõ ± - - - - Theta Gây dung huyết (không bền với oxy), dung giải tế bào ± + + + + Kappa Collagenase, gelatinase + + + + + Lambda Protease - + - + + Mu Hyaluronidase ± + ± ± ± Nu DNase ± + + ± ± Neuraminidase N-Acetylneuraminic acid glycohydrolase + + + + + ðộc tố khác ðộc tố ruột Gây ñộc tố ruột, ñộc tố tế bào + NT + + NT Ghi chú: (+): sản sinh bởi tất cả các chủng; (±): sản sinh bởi một số chủng; (-): không chủng nào của typ sản sinh ñộc tố; (NT): chưa nghiên cứu ñầy ñủ với các chủng sản sinh ñộc tố - ðộc tố Alpha (α toxin): có bản chất là một lecithinase (phospholipase C), tấn công vào màng tế bào, làm cho tế bào bị phá huỷ và chết. ðộc tố α là ñộc tố Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 14 gây chết, hoại tử (ñược coi là nguyên nhân gây hoại tử cơ trong bệnh hoại thư sinh hơi), có khả năng dung huyết, ảnh hưởng ñến chức năng tim (gây giảm huyết áp và rối loạn nhịp tim làm cho con vật bị shock). ðộc tố α có kích thước phân tử 43 kDa, ñược mã hoá bởi gen plc (hay cpa) gồm 399 axit amin, ñiểm ñẳng ñiện pH 5,4 (Jolivet - Reynaud và cs, 1988) [71]. ðộc tố α ñược sản sinh bởi tất cả các typ C. perfringens, hình thành vùng dung huyết không hoàn toàn khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu. Sau khi nuôi cấy vi khuẩn ở 370C trong môi trường thạch lòng ñỏ trứng, thường sau 18 giờ, xuất hiện một vùng ñục xung quanh khuẩn lạc của vi khuẩn, ñiều này chứng tỏ có sự hoạt ñộng của men phospholipase C; có thể sử dụng như phương pháp chẩn ñoán vi khuẩn (gọi là phản ứng Nagler) (trích theo Mainil và cs, 2006) [84]. Men phospholipase C ñược sản sinh nhiều nhất trong giai ñoạn cuối của pha phát triển logarit của vi khuẩn; canh trùng nuôi cấy ở ñầu giai ñoạn ổn ñịnh thường ñược dùng ñể phân lập protein (Jolivet-Reynaud và cs, 1988) [71]. Hoạt tính của men phospholipase C còn phụ thuộc vào ion Canxi (cần thiết cho sự gắn với cơ chất) (Mainil và cs, 2006) [84]. Khi tiêm cho chuột vào xoang phúc mạc, ñộc tố α của C. perfringens có LD50 dao ñộng từ 0,1 - 1,0 µg, chuột thường chết sau 24 giờ gây nhiễm (Titball và cs, 1989) [128]. - ðộc tố Beta (β toxin) (còn ñược gọi là ñộc tố β-1): là một trong số 4 ñộc tố chính có khả năng gây chết và hoại tử ñược sản sinh bởi vi khuẩn C. perfringens typ B và C. Bằng thực nghiệm, người ta ñã chứng minh ñược ñộc tố β là nguyên nhân gây viêm ruột hoại tử xuất huyết. ðộc tố β có kích thước phân tử 40 kDa, ñược mã hoá bởi gen cpb, ñiểm ñẳng ñiện pH 5,6 (Sakurai và Fujii, 1987) [111]. Các thông số của ñộc tố β gần giống với các thông số của ñộc tố α nên việc phân biệt và tách riêng hai ñộc tố này rất khó. Khi tiêm vào tĩnh mạch chuột, ñộc tố β gây tăng huyết áp và giảm nhịp tim do thúc ñẩy sự giải phóng catecholine (là chất ñóng vai trò làm tăng huyết áp). Nếu tiêm nội bì chuột lang với liều tối thiểu 2 ng sẽ hình thành vùng hoại tử màu tím quanh vị trí Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 15 tiêm (Hatheway, 1990) [65]. Khi tiêm ñộc tố β vào tĩnh mạch và xoang bụng chuột trưởng thành, LD50 có giá trị tương ứng là 310 và 4.500 ng/kg. ðộc tố β bị phá huỷ bởi trypsin; ñiều này giải thích tại sao con non dễ mắc bệnh do typ B và typ C vì trong sữa ñầu có anti - trypsin (làm vô hoạt trypsin của dịch tuỵ) khiến cho ñộc tố không bị phá huỷ và gây nên bệnh. Hiện nay, người ta quan tâm nhiều ñến vai trò gây bệnh của ñộc tố β-2 có kích thước phân tử 28 kDa, ñiểm ñẳng ñiện pH từ 5,2 - 5,4; ñược mã hoá bởi gen cpb2 và phát hiện lần ñầu tiên năm 1997 từ chủng C. perfringens CWC245 thuộc typ C gây bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn con (Gibert và cs, 1997) [58]. Tất cả 5 typ C. perfringens ñều có khả năng sản sinh ñộc tố này. Cũng giống như ñộc tố β, ñộc tố β-2 gây hoại tử, xuất huyết. Người ta ñã chứng minh ñược C. perfringens mang ñộc tố β-2 là nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn con (Gibert và cs, 1997 [58]; Johansson và cs, 2006 [70]; Petit và cs, 1999 [105]; Songer và Uzal, 2005 [119]; Waters và cs, 2003 [133]) . Ngoài ra, ñã có nhiều nghiên cứu chứng tỏ vai trò của ñộc tố β-2 gây nhiễm ñộc tố ruột huyết ở bò (Lebrun và cs, 2007a [78], ; Manteca và cs, 2002 [86]), cừu (Gkiourtzidis và cs, 2001) [60], chó (Thiede và cs, 2001) [127], ngựa (Gibert và cs, 1997 [58]; Johansson và cs, 2006 [70]; Vilei và cs, 2005 [132]), voi Châu Phi (Bacciarini và cs, 2001) [32], gà (Chalmers và cs, 2008 [40]; Crespo Rocio và cs, 2007 [44]). Vai trò gây bệnh của ñộc tố β-2 tuy chưa ñược hiểu biết ñầy ñủ, nhưng chắc chắn rằng sự xuất hiện của ñộc tố sẽ khiến cho bệnh tích của bệnh thêm trầm trọng; ñó có thể do hậu quả của sự kết hợp gây bệnh giữa hai ñộc tố α và β-2 (Ceci và cs, 2006) [39]. - ðộc tố Epsilon (ε toxin): do vi khuẩn C. perfringens typ B và D sản sinh ra, là một protein kích thước phân tử 34,25 kDa, ñược mã hoá bởi gen etx, gồm 311 axit amin (trích theo Hatheway, 1990) [65]. ðộc tố ε ñược hình thành là một tiền ñộc tố (prototoxin) tương ñối không ñộc và ñược hoạt hoá bởi các protease. Khi xử lý ñộc tố ε của C. perfringens với protease (ví dụ trypsin, chymotrypsin), sẽ cắt ñứt liên kết peptit tại ñầu carboxyl và amino, khiến cho ñộc tố ñược hoạt hoá (tuy nhiên, người ta cho rằng việc cắt bỏ peptit ñầu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 16 carboxyl có vai trò chính cho sự hoạt hoá ñộc tố (Minami và cs, 1997) [91]. ðộc tố ε tác ñộng trước tiên ñến hệ tiêu hoá làm tăng tính thấm thành mạch, khiến cho sự hấp thu ñộc tố vào máu tốt hơn. Sau khi xâm nhập vào hệ thống tuần hoàn, ñộc tố tác ñộng làm thận bị sưng, xung huyết; phổi bị phù thũng; màng bao tim có nhiều dịch; ngoài ra còn gây tổn thương hệ thần kinh trung ương. Do ñó, ñộc tố ε có thể ñược coi là một ñộc tố ñường ruột và ñộc tố thần kinh (McDonel, 1980) [89]. Những biến ñổi bệnh lý quan sát ñược ở não bao gồm: xung huyết và phù màng não, phù xung quanh mạch quản và trong tế bào, có các ñiểm hoại tử ở mô thần kinh, hậu quả là gây rối loạn thần kinh trung ương như: ñầu rụt lại, tư thế uốn mình ra sau (opisthotonus), co giật, lồng lộn… ðộc tố ε của C. perfringens có ñộc tính cao nhất sau khi tiêm tĩnh mạch chuột với liều LD50 thay ñổi từ 16 - 50 ng/kg (Miyata và cs, 2001) [94]. - ðộc tố Iota (ι toxin): ñộc tố ñược phát hiện lần ñầu tiên từ một con bê bị chết sau 12 giờ có biểu hiện viêm ruột và trúng ñộc. ðộc tố ι không chỉ ñược sản sinh bởi C. perfringens typ E mà còn do C. spiroforme và C. difficile. Cấu trúc của ñộc tố gồm hai tiểu phần protein ñộc lập gắn với nhau bởi liên kết ñồng hoá trị hoặc cầu nối disulfide: một là tiểu phần kết gắn (iota b - Ib) và tiểu phần kia mang hoạt tính men ADP - ribosylase (iota a - Ia). Cả hai tiểu phần này ñều cần cho hoạt tính sinh học của ñộc tố. Tiểu phần Ia ñược mã hoá bởi gen iap, kích thước phân tử 47,5 kDa, ñiểm ñẳng ñiện pH 5,2; tiểu phần Ib ñược mã hoá bởi gen ibp, kích thước phân tử ~ 100 kDa, ñiểm ñẳng ñiện pH 4,2 (Stiles và Wilkins, 1986) [123]. ðộc tố ι ñược hoạt hoá bởi trypsin trong canh trùng chỉ sau khi nuôi cấy 5 - 7 giờ, trong canh trùng nuôi cấy lâu thì không còn khả năng này. Các tiểu phần của họ Iota ñược tổng hợp trong giai ñoạn phát triển logarit và ñược tiết ra dưới dạng các protein bất hoạt với một peptit tín hiệu. Chúng ñược hoạt hoá kiểu thuỷ phân bằng cách chuyển peptit ñầu N kích thước 20 kDa ra khỏi tiểu phần kết gắn (dạng hoạt ñộng là 80 kDa) và tách 9 ñến 11 gốc axit amin ñầu N ra khỏi tiểu phần men (Gibert và cs, 2000) [59]. ðộc tố ι gây ñộc tế bào, làm cho các tế bào bị co tròn lại và biến ñổi hoàn toàn hệ vi sợi actin của Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 17 xương tế bào (cytoskeleton). Khi tiêm trong da chuột lang, ñộc tố ι gây hoại tử trắng tròn, bị trung hoà bởi huyết thanh chống lại C. perfringens typ E. Kháng thể kháng ñộc tố ι có phản ứng chéo với ñộc tố của C. spiroforme (Stiles và Wilkins, 1986) [123]. - ðộc tố ruột (enterotoxin): ñộc tố ruột của C. perfringens là một protein ñược mã hoá bởi gen cpe, kích thước phân tử 35 kDa, gồm 309 axit amin, ñiểm ñẳng ñiện pH 4,3 (Richardson và Granum, 1985) [107]. ðộc tố ruột của C. perfringens (C. perfringens enterotoxin - CPE) chỉ ñược sản sinh trong quá trình vi khuẩn hình thành nha bào. Hoạt tính của ñộc tố ruột sẽ tăng lên gấp 3 lần nếu như ñược xử lý với trypsin. Trypsin cắt tại 2 vị trí, liên quan ñến gốc lysine, cắt 15 hoặc thêm 10 axit amin vào ñầu amino của ñộc tố. ðộc tố sau khi xử lý trypsin có 284 axit amin (Granum và cs, 1981) [61]. ðộc tố ruột ñược sản sinh nhiều nhất ở các chủng C. perfringens typ A; ngoài ra còn có các chủng typ C và typ D. Chỉ một số ít các chủng thuộc typ B và E có khả năng sản sinh ñộc tố ruột, còn hầu hết âm tính (McDonel, 1980 [89]; Songer và Glock, 1998 [117]). Cơ chế tác ñộng của ñộc tố ruột có liên quan ñến sự kết gắn của ñộc tố với các receptor trên bề mặt tế bào biểu mô ruột. Sự gắn kết này giúp cho phân tử ñộc tố gắn vào màng tế bào (nhưng không xâm nhập vào tế bào). Sự thay ñổi các ion sẽ ảnh hưởng ñến sự trao ñổi chất và sinh tổng hợp của tế bào. Nồng ñộ ion Ca2+ nội bào tăng lên, làm cho tính thấm thành mạch tăng, nước và các ion khác thoát ra gây ỉa chảy (McClane và cs, 1996) [88]. Khi nghiên cứu trên thỏ thấy ñộc tố ruột tác ñộng mạnh nhất ñến hồi tràng, không tràng bị ảnh hưởng vừa và tá tràng bị ảnh hưởng không nhiều (McDonel, 1980) [89]. - Các ñộc tố phụ của C. perfringens: + ðộc tố Delta (δ toxin): là ñộc tố dung huyết sản sinh bởi các chủng C. perfringens typ B và C. Kích thước phân tử 42 kDa, ñiểm ñẳng ñiện pH = 9,1. ðộc tố có khả năng dung huyết mạnh hồng cầu cừu, dê và lợn; hầu như không gây dung huyết hồng cầu người, ngựa, thỏ, chuột và các loài ñộng vật có vú khác. Hoạt tính này bị ức chế bởi ganglioside, nhưng không bị ức Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 18 chế bởi các hợp chất lipid khác như sphingomyelin, lecithin hay cholesterol (Alouf và Jolivet-Reynaud, 1981) [28]. + ðộc tố Theta (θ toxin): hay còn gọi là perfringolysin O, là một ñộc tố dung giải tế bào phụ thuộc cholesterol (cholesterol - dependent cytolysin), ñược mã hoá bởi gen pfoA, kích thước phân tử 51kDa. Các nhà khoa học ñã chứng minh ñược khả năng của ñộc tố này gây nên một vùng dung huyết dạng β xung quanh khuẩn lạc khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch máu (Hatheway, 1990) [65]. ðộc tố θ gây chết chuột, thông thường có LD50 khoảng 1µg/chuột. Nguyên nhân gây chết có thể ñược giải thích là do suy tim vì ñộc tố có khả năng sản sinh ra các chất như yếu tố ñông máu (Stevens và cs, 1988) [122]. ðồng thời, người ta cũng chứng minh ñược ñộc tố này là nguyên nhân gây tắc mạch, ñông máu, giảm oxy mô bào [144]. + Neuraminidase: ñược coi là yếu tố gây bệnh của nhiều loại vi sinh vật. Nees và cs (1975) ñã phát hiện ñộc tố neuraminidase từ chủng C. perfringens ATCC 10543, do các gen nanH và nanI mã hoá. Kích thước phân tử của ñộc tố neuraminidase là 64 kDa, ñiểm ñẳng ñiện pH dao ñộng từ 4,7 - 5,4. ðộc tố có tác dụng gây ngưng kết hồng cầu, làm tăng ñộ nhớt của máu, dẫn ñến ñông máu trong mao mạch (Mainil và cs, 2006) [84]. + Ngoài các ñộc tố ñã trình bày ở trên, C. perfringens còn có khả năng sản sinh ra một số loại ñộc tố khác như: lamda-toxin (protease, do gen lam mã hoá); kappa-toxin (collagenase, do gen colA mã hoá); mu-toxin (hyaluronidase, do gen nag mã hoá); các ñộc tố nu-toxin, eta-toxin, phi-toxin và urease...(Frey và Vilei, 2002) [55]. Gần ñây nhất, nhóm các nhà khoa học Nhật Bản ñã tìm ra ñộc tố TpeL (toxin C. perfringens large cytotoxin) do C. perfringens typ C sản sinh ra (Amimoto và cs, 2007) [29]. 1.1.2.3. Các typ của vi khuẩn C. perfringens Năm 1931, Wilson căn cứ vào khả năng trung hoà trên chuột của huyết thanh kháng ñộc tố với ñộc tố có trong chất lọc canh trùng nuôi cấy vi khuẩn, ñã chia C. perfringens thành 4 typ (toxinotyp) A, B, C và D (trích theo Hatheway, 1990) [65], trong ñó: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 19 Kháng huyết thanh typ A chỉ trung hoà ñộc tố typ A Kháng huyết thanh typ B trung hoà ñộc tố cả 4 typ A, B, C và D Kháng huyết thanh typ C chỉ trung hoà ñộc tố typ A, B và C Kháng huyết thanh typ D trung hoà ñộc tố typ A và D Năm 1943, typ thứ 5 (typ E) ñược Bosworth phát hiện khi chủng vi khuẩn phân lập từ bê sản sinh ñộc tố có khả năng gây chết nhưng không bị trung hoà bởi kháng ñộc tố của cả 4 typ trên. Kháng huyết thanh typ E có khả năng trung hoà ñộc tố typ A nhưng không trung hoà ñộc tố của typ B, C và D. Ông ñã ñề nghị gọi ñộc tố do typ E sản sinh là iota (trích theo Hatheway, 1990) [65]. Typ F (ñược coi là subtyp của typ C) cũng ñã ñược xác ñịnh từ chủng vi khuẩn phân lập tại ðức từ một vụ dịch viêm ruột hoại tử ở người. Vi khuẩn này sản sinh ñộc tố α và β; do ñó về căn bản có thể xếp loại vào typ C; tuy nhiên khác các chủng vi khuẩn thuộc typ C ở ñặc tính không bền với nhiệt (Vance, 1967) [131] và không sản sinh 3 loại ñộc tố phụ (delta, theta và kappa). Sự khác biệt này không thể giải thích ñược và do vậy cũng không ñược sử dụng ñể xác ñịnh một chủng mới (trích theo Hatheway, 1990) [65]. Ngoài ra, một nhóm vi khuẩn C. perfringens ñặc biệt có ñộc tố β-2 không ñược xếp vào một trong 5 typ trên (Gibert và cs, 1997) [58]. ðộc tố phát hiện ñược từ các chủng này có liên quan với ñộc tố α của typ A hoặc ñộc tố α và β của typ C. Các chủng ñộc mang ñộc tố β-2 có thể phân lập từ ngựa mắc bệnh viêm ruột tịt (typhlocolitis), từ lợn bị bệnh viêm ruột, từ bò bị nhiễm ñộc tố ruột huyết và từ lừa, voi, chó, người bị bệnh viêm dạ dày ruột (Bueschel và cs, 2003 [37]; Klaasen và cs, 1999 [75]; Lebrun và cs, 2007a [78]; Manteca và cs, 2002 [86]; Petit và cs, 1999 [105]). Các chủng vi khuẩn C. perfringens mang ñộc tố ruột là một nhóm vi khuẩn (pathovar) C. perfringens, chúng có khả năng sản sinh ñộc tố ruột, gây bệnh ñường tiêu hoá cho người (ñặc biệt là tiêu chảy) do ngộ ñộc thực phẩm (Augustynowicz và cs, 2002 [31]; Camacho và cs, 2008 [38]). Các vi khuẩn này cũng ñược tìm thấy ở ngựa con, lợn và cừu bị rối loạn tiêu hoá; nhưng kết Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 20 quả nghiên cứu của Kalender và cs (2005) [73] cho rằng ñộc tố ruột không ñóng vai trò quan trọng gây bệnh nhiễm ñộc tố ruột huyết ở cừu. Phần lớn các vi khuẩn C. perfringens mang ñộc tố ruột thuộc typ A, nhưng cũng có thể thấy ở typ B, C hoặc D. Tuy nhiên, do ñặc tính truyền lây, chúng ñược xếp riêng thành một nhóm (toxinotyp) ñặc biệt (Songer, 1996) [115]. Các typ vi khuẩn C. perfringens và bệnh do chúng gây ra ñược trình bày chi tiết ở bảng 1.4 (trích theo Frey và Vilei, 2002) [55]. Bảng 1.4: Bệnh gây ra bởi các ñộc tố chính của vi khuẩn C. perfringens Toxinotyp ðộc tố chính Gen ñộc tố Các gen ñộc tố khác Bệnh A α plc (cpa) cpe,cbp2, pfoA, colA Bệnh hoại thư ở người Bệnh viêm ruột hoại tử gia cầm B α, β, ε plc, cpb,etx cpe,pfoA Bệnh lỵ ở cừu non, viêm ruột xuất huyết ở bê và ngựa non; nhiễm ñộc tố ruột huyết ở cừu C α, β plc, cpb cpb2,cpe, pfoA,colA Viêm ruột hoại tử ở lợn, cừu non, bê và ngựa non Bệnh nhiễm ñộc tố ruột huyết ở cừu non và viêm ruột hoại tử ở người (Pig-bel) D α, ε plc, etx cpe,pfoA, colA Bệnh nhiễm ñộc tố ruột huyết ở cừu non và trưởng thành , bê và dê Gây chứng thận mềm nhuyễn (pulpy kidney) ở cừu non và cừu trưởng thành, dê và bê E α, ι plc, iap- ibp pfoA,colA, cpe Bệnh nhiễm ñộc tố ruột huyết ở bê β2 toxigenic α, β2 plc, cpb2 cpe Typhlocolitis ở ngựa, rối loạn tiêu hoá ở trâu, bò, ñộng vật nhai lại và chó Nhóm gây ñộc tố ruột (enterotoxigenic) α, CPE (C. perfringens enterotoxin) plc, cpe cpb, cpb2,etx, cpe Tiêu chảy ở người (trúng ñộc thức ăn) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 21 1.1.2.4. Phương pháp chẩn ñoán bệnh ñường tiêu hoá ở gia súc do vi khuẩn C. perfringens gây ra ðể chẩn ñoán bệnh do C. perfringens gây ra chủ yếu dựa vào: i) triệu chứng lâm sàng, các ñặc ñiểm dịch tễ học và bệnh tích ñặc trưng; ii) phân lập, xác ñịnh ñộc tố của vi khuẩn. Có thể tóm tắt các bước tiến hành trong phòng thí nghiệm ñể chẩn ñoán bệnh do C. perfringens gây ra như sau: * Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm thường lấy là chất chứa ở ruột của gia súc chết hoặc phân gia súc nghi mắc bệnh. Mẫu bệnh phẩm cần phải vận chuyển ngay ñến phòng thí nghiệm trong ñiều kiện yếm khí. - Nuôi cấy phân lập vi khuẩn trên các môi trường thích hợp: căn cứ vào tính chất mọc của vi khuẩn trên các môi trường ñể kết luận. - Làm tiêu bản, soi kính quan sát hình thái, tính chất bắt màu của vi khuẩn. - Giám ñịnh các ñặc tính sinh hoá của vi khuẩn bao gồm khả năng lên men ñường, phản ứng Catalase, Urease, khả năng sinh Indol, H2S... * Xác ñịnh ñộc tố của vi khuẩn: - Phương pháp thử trên chuột: ly tâm chất chứa trong ruột (20 - 30ml) với tốc ñộ 10.000 (v/ph) trong 20 phút ñể tách riêng vi khuẩn và các hạt nhỏ có trong chất chứa. Trong trường hợp chất chứa nhiều dịch nhớt, có thể cho một mẩu bông nhỏ ở trên bề mặt ống li tâm ñể giữ lại chất nhầy. ðể xác ñịnh ñộc tố của vi khuẩn, tiêm vào tĩnh mạch ñuôi cho mỗi chuột 0,3 ml (hoặc 0,5 ml nếu tiêm xoang phúc mạc) lớp dịch trên bề mặt ống ly tâm. Theo dõi chuột trong vòng 48 giờ. Thường các chủng C. perfringens gây chết chuột trong vòng 24 giờ sau khi tiêm (Quinn và cs, 1999) [106]. Người ta cũng thí nghiệm trên chuột với 2 loại dịch vi khuẩn ly tâm chưa xử lý và ñã xử lý với trypsin 1% (trộn 1 ml trypsin + 9 ml dịch ñã ly tâm, ñể 1 giờ ở 370C). Việc xử lý trypsin sẽ giúp xác ñịnh hai loại ñộc tố ε và Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 22 ι do ñã ñược hoạt hoá; tuy nhiên, quá trình trypsin này sẽ phá huỷ ñộc tố α và β (Alton và cs, 1994) [26]. - ðể xác ñịnh ñộc tố của C. perfringens trong bệnh ñường tiêu hoá có thể sử dụng phản ứng miễn dịch ñánh dấu enzym (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA), phản ứng kết tủa khuyếch tán kép trên thạch, phản ứng ñiện di miễn dịch, phản ứng ngưng kết hồng cầu, phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính, hoá miễn dịch…; trong ñó, phản ứng kết tủa có ñộ nhạy thấp hơn các phương pháp khác. Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính ñược sử dụng rộng rãi ñể xác ñịnh ñộc tố ruột của C. perfringens với ñộ nhạy từ 0,1 - 3 ng/ml. Phương pháp này tiến hành ñơn giản, cho kết quả sau vài phút, có thể trực tiếp kiểm tra với mẫu phân (Mainil và cs, 2006) [84]. - Hiện nay, kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ñược sử dụng rộng rãi ñể phân lập, xác ñịnh ñộc tố và ñịnh typ vi khuẩn C. perfringens bằng cách nuôi cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra trên môi trường tổng hợp, sau ñó chiết tách DNA và sử dụng các cặp mồi (primer) tương ứng với từng loại ñộc tố ñể tiến hành phương pháp nhân gen (Yamagishi, 1997) [137]. 1.1.3. Hiểu biết về một số bệnh ñường tiêu hoá chủ yếu ở bò và lợn do vi khuẩn C. perfringens gây ra 1.1.3.1. Bệnh do C. perfringens gây ra ở bò a) Bệnh viêm dạ múi khế ở bê (Clostridial abomasitis) Bệnh viêm dạ múi khế do vi khuẩn C. perfringens typ A, typ C hoặc typ B gây ra. Nguyên nhân có thể là do sữa ñầu bị nhiễm khuẩn. Bằng thực nghiệm, người ta ñã chứng minh ñược rằng nguy cơ trong sữa ñầu ñể ñông lạnh có liên quan ñến sự phát sinh bệnh, trong ñó có vai trò của ñộc tố β và β-2 (Songer và Miskimins, 2005) [120]. Triệu chứng lâm sàng quan sát ñược gồm: con vật có biểu hiện mệt mỏi, phù, thiếu máu, tiêu chảy nặng, phân lẫn máu trong thời gian ngắn hoặc chết Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 23 nhanh khi chưa có triệu chứng bệnh. Những con bê dưới 10 ngày tuổi ñang nhanh nhẹn, khỏe mạnh có biểu hiện ñau dạ múi khế dữ dội, ñôi khi có triệu chứng thần kinh như bệnh uốn ván và tư thế opisthotonus. Bệnh tích ñặc trưng là: xuất huyết ñường tiêu hoá; múi khế thường dãn rộng, xuất huyết và loét; thành túi khí và các nếp gấp sưng dầy, có khí thũng. Quan sát tiêu bản vi thể thấy hiện tượng hoại tử và xuất huyết niêm mạc ruột, có thể quan sát thấy cả các trực khuẩn to, bắt màu gram dương. b) Bệnh viêm ruột ở bò (bovine enteritis) và bệnh nhiễm ñộc tố ruột huyết (enterotoxaemia) (Songer, 2006) [116] Vi khuẩn C. perfringens với các ñộc tố có thể gây bệnh viêm ruột và nhiễm ñộc tố ruột huyết ở bò. Tuy nhiên, tỷ lệ mắc bệnh do các loại ñộc tố này thay ñổi tuỳ theo ñiều kiện ñịa lý; các giống bò khác nhau thì ñộ mẫn cảm ñối với bệnh cũng khác nhau. Bệnh viêm ruột do C. perfringens typ A gặp khá phổ biến ở bò và bê sữa. Một trong các nguy cơ mắc bệnh là do con vật ăn một lượng lớn sữa ñầu ñông lạnh, ñặc biệt trong trường hợp sữa bị nhiễm khuẩn. Bê bị bệnh thường mệt mỏi, kém ăn. Triệu chứng lâm sàng thường biểu hiện trong vòng 12 giờ, bệnh tích ñặc trưng: xuất huyết ñường tiêu hoá. Dạ múi khế thường giãn, có khí thũng ở thành và c._.T4 ------ T5 ------ Phụ lục 2a So sánh trình tự các Nucleotid một ñoạn gen của cpb2 giữa các chủng vi khuẩn phân lập và chủng vi khuẩn tham chiếu (ñã công bố trên GenBank) 10 20 30 40 50 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 ATTTGGGATATCTTAAATTTAGCACAGAAGAATGTTTAAATGAAATAAAG C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 ATAATAAAAAGATATATTAATTATATAGCTGAAAATTTATAATTATATGA C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TAAGTATAGTTAATAAATAAAAAGTGTTCTCGGGGGACACTTTTTTGTTT C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TAAAAAGGAAAATATAAATAAAATTTAGATAAAAGTGTAAAATAATTATT C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 210 220 230 240 250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TTTATTTTAAATTTGTTAAAAATTTGATATAATTGAATTGTAAAAAAAAT C-per-beta2-AJ537533.1 ------------------AAAATTTGATATAATTGAATTGTAAAAAAAAT T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TTCAGGGGGGAATATAAATGAAAAAAATTATTTCAAAGTTTACTGTAATT C-per-beta2-AJ537533.1 TTCAGGGGGGAATATAAATGAAAAAAATTATTTCAAAGTTTACTGTAATT T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TTTATGTTTTCATGTTTTCTTATTGTTGGAGCAATAAGTCCAATGAAAGC C-per-beta2-AJ537533.1 TTTATGTTTTCATGTTTTCTTATTGTTGGAGCAATAAGTCCAATGAAAGC T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 AAGTGCAAAAGAAATCGACGCTTATAGAAAGGTAATGGAGAATTATCTTA C-per-beta2-AJ537533.1 AAGTGCAAAAGAAATCGACGCTTATAGAAAGGTAATGGAGAATTATCTTA T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 410 420 430 440 450 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 ATGCTTTAAAAAACTACGATATTAATACAGTTGTAAACATTTCAGAAGAT C-per-beta2-AJ537533.1 ATGCTTTAAAAAACTACGATATTAATACAGTTGTAAACATTTCAGAAGAT T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 GAAAGAGTAAATAATGTTGAACAGTATAGAGAAATGTTAGAAGATTTTAA C-per-beta2-AJ537533.1 GAAAGAGTAAATAATGTTGAACAGTATAGAGAAATGTTAGAAGATTTTAA T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 510 520 530 540 550 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 ATATGATCCTAACCAACAACTGAAATCTTTTGAAATACTTAATTCACAAA C-per-beta2-AJ537533.1 ATATGATCCTAACCAACAACTGAAATCTTTTGAAATACTTAATTCACAAA T1 --------------AACAACTGAAATCTTTTGAAATACTTAATTCACAAA T2 ---------------------GAAATCTTTTGAAATACTTAATTCACAAA T3 ------------------ACTGAAATCTTTTGAAATACTTAATTCACAAA T4 ----------------CAACTGAAATCTTTTGAAATACTTAATTCACAAA T5 ------TCCTAACCAACAACTGAAATCTTTTGAAATACTTAATTCACAAA 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 AGAGCGATAATAAAGAAATATTTAATGTAAAAACTGAATTTTTAAATGGT C-per-beta2-AJ537533.1 AGAGCGATAATAAAGAAATATTTAATGTAAAAACTGAATTTTTAAATGGT T1 AGAGCGATAATAAAGAAATATTTAATGTAAAAACTGAATTTTTAAATGGT T2 AGAGCGATAATAAAGAAATATTTAATGTAAAAACTGAATTTTTAAATGGT T3 AGAGCGATAATAAAGAAATATTTAATGTAAAAACTGAATTTTTAAATGGT T4 AGAGCGATAATAAAGAAATATTTAATGTAAAAACTGAATTTTTAAATGGT T5 AGAGCGATAATAAAGAAATATTTAATGTAAAAACTGAATTTTTAAATGGT 610 620 630 640 650 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 GCAATTTATGATATGGAATTTACTGTATCATCTAAAGATGGAAAATTAAT C-per-beta2-AJ537533.1 GCAATTTATGATATGGAATTTACTGTATCATCTAAAGATGGAAAATTAAT T1 GCAATTTATGATATGGAATTTACTGTATCATCTAAAGATGGAAAATTAAT T2 GCAATTTATGATATGGAATTTACTGTATCATCTAAAGATGGAAAATTAAT T3 GCAATTTATGATATGGAATTTACTGTATCATCTAAAGATGGAAAATTAAT T4 GCAATTTATGATATGGAATTTACTGTATCATCTAAAGATGGAAAATTAAT T5 GCAATTTATGATATGGAATTTACTGTATCATCTAAAGATGGAAAATTAAT 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 AGTATCTGATATGGAAAGAACAAAAGTTGAGAATGAAGGAAAATATATTT C-per-beta2-AJ537533.1 AGTATCTGATATGGAAAGAACAAAAATTGAGAATGAAGGAAAATATATTT T1 AGTATCTGATATGGAAAGAACAAAAATTGAGAATGAAGGAAAATATATTT T2 AGTATCTGATATGGAAAGAACAAAAATTGAGAATGAAGGAAAATATATTT T3 AGTATCTGATATGGAAAGAACAAAAATTGAGAATGAAGGAAAATATATTT T4 AGTATCTGATATGGAAAGAACAAAAATTGAGAATGAAGGAAAATATATTT T5 AGTATCTGATATGGAAAGAACAAAAATTGAGAATGAAGGAAAATATATTT 710 720 730 740 750 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TAACACCATCATTTAGAACTCAAGTTTGTACATGGGATGATGAACTAGCA C-per-beta2-AJ537533.1 TAACACCATCATTTAGAACTCAAGTTTGTACATGGGATGATGAACTAGCA T1 TAACACCATCATTTAGAACTCAAGTTTGTACATGGGATGATGAACTAGCA T2 TAACACCATCATTTAGAACTCAAGTTTGTACATGGGATGATGAACTAGCA T3 TAACACCATCATTTAGAACTCAAGTTTGTACATGGGATGATGAACTAGCA T4 TAACACCATCATTTAGAACTCAAGTTTGTACATGGGATGATGAACTAGCA T5 TAACACCATCATTTAGAACTCAAGTTTGTACATGGGATGATGAACTAGCA 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 CAAGCAATTGGGGGAGTTTATCCACAAACATATTCTGATAGATTTACATA C-per-beta2-AJ537533.1 CAAGCAATTGGGGGAGTTTATCCACAAACATATTCTGATAGATTTACATA T1 CAAGCAATTGGGGGAGTTTATCCACAAACATATTCTGATAGATTTACATA T2 CAAGCAATTGGGGGAGTTTATCCACAAACATATTCTGATAGATTTACATA T3 CAAGCAATTGGGGGAGTTTATCCACAAACATATTCTGATAGATTTACATA T4 CAAGCAATTGGGGGAGTTTATCCACAAACATATTCTGATAGATTTACATA T5 CAAGCAATTGGGGGAGTTTATCCACAAACATATTCTGATAGATTTACATA 810 820 830 840 850 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TTATGCAGATAATATATTATTAAACTTCAGACAATATGCAACTTCAGGTT C-per-beta2-AJ537533.1 TTATGCAGATAATATATTATTAAACTTCAGACAATATGCAACTTCAGGTT T1 TTATGCAGATAATATATTATTAAACTTCAGACAATATGCAACTTCAGGTT T2 TTATGCAGATAATATATTATTAAACTTCAGACAATATGCAACTTCAGGTT T3 TTATGCAGATAATATATTATTAAACTTCAGACAATATGCAACTTCAGGTT T4 TTATGCAGATAATATATTATTAAACTTCAGACAATATGCAACTTCAGGTT T5 TTATGCAGATAATATATTATTAAACTTCAGACAATATGCAACTTCAGGTT 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 CAAGAGATTTAAAAGTAGAATATAGTGTTGTAGATCATTGGATGTGGAAA C-per-beta2-AJ537533.1 CAAGAGATTTAAAAGTAGAATATAGTGTTGTAGATCATTGGATGTGGAAA T1 CAAGAGATTTAAAAGTAGAATATAGTGTTGTAGATCATTGGATGTGGAAA T2 CAAGAGATTTAAAAGTAGAATATAGTGTTGTAGATCATTGGATGTGGAAA T3 CAAGAGATTTAAAAGTAGAATATAGTGTTGTAGATCATTGGATGTGGAAA T4 CAAGAGATTTAAAAGTAGAATATAGTGTTGTAGATCATTGGATGTGGAAA T5 CAAGAGATTTAAAAGTAGAATATAGTGTTGTAGATCATTGGATGTGGAAA 910 920 930 940 950 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 GATGATGTTAAAGCTTCTCAAATGGTATATGGTCAAAATCCTGATTCTGC C-per-beta2-AJ537533.1 GATGATGTTAAAGCTTCTCAAATGGTATATGGTCAAAATCCTGATTCTGC T1 GATGATGTTAAAGCTTCTCAAATGGTATATGGTCAAAATCCTGATTCTGC T2 GATGATGTTAAAGCTTCTCAAATGGTATATGGTCAAAATCCTGATTCTGC T3 GATGATGTTAAAGCTTCTCAAATGGTATATGGTCAAAATCCTGATTCTGC T4 GATGATGTTAAAGCTTCTCAAATGGTATATGGTCAAAATCCTGATTCTGC T5 GATGATGTTAAAGCTTCTCAAATGGTATATGGTCAAAATCCTGATTCTGC 960 970 980 990 1000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TAGACAAATAAGATTATATATAGAAAAAGGACAATCTTTCTATAAATATA C-per-beta2-AJ537533.1 TAGACAAATAAGATTATATATAGAAAAAGGACAATCTTTCTATAAATATA T1 TAGACAAATAAGATTATATATAGAAAAAGGACAATCTTTCTATAAATATA T2 TAGACAAATAAGATTATATATAGAAAAAGGACAATCTTTCTATAAATATA T3 TAGACAAATAAGATTATATATAGAAAAAGGACAATCTTTCTATAAATATA T4 TAGACAAATAAGATTATATATAGAAAAAGGACAATCTTTCTATAAATATA T5 TAGACAAATAAGATTATATATAGAAAAAGGACAATCTTTCTATAAATATA 1010 1020 1030 1040 1050 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 GAATAAGAATTAAAAACTTTACACCTGCATCAATTAGAGTATTTGGTGAA C-per-beta2-AJ537533.1 GAATAAGAATTAAAAACTTTACACCTGCATCAATTAGAGTATTTGGTGAA T1 GAATAAGAATTAAAAACTTT------------------------------ T2 GAATAAGAATTAAAAACTTTACA--------------------------- T3 GAATAAGAATTAAAAACTTTACACCTGCATCAATTAGAGTATTTGGTGAA T4 GAATAAGAATTAAAAACTTTACACCTGCATCAATTAGAGTATTTGGTGA- T5 GAATAAGAATTAAAAACTTTACACCTGCATCAATTAGAGTATTTGGTGAA 1060 1070 1080 1090 1100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 GGGTATTGTGCATAGAAAAAAATATGAAGTGACTTAGTCACTTCATATTT C-per-beta2-AJ537533.1 GGGTATTGTGCATAGAAAAAAATATGAAGTGACT---------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 GG------------------------------------------------ T4 -------------------------------------------------- T5 GGGTATTGTGCA-------------------------------------- 1110 1120 1130 1140 1150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TTTTTACTATTAATTTTATTATATAAAAACCTAACATACATGAAAGTATT C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 CTTAATACAGTTATATCAAAATTAAAGTAGGGGAAATAAAATAAAAGGCT C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 1210 1220 1230 1240 1250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 AAAAACTATATTAAAAACTATAAAAATTATTAAATTAGGTTTTAAGGTGT C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 1260 1270 1280 1290 1300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TATATTTATTTATGATTATAGGAATAAATATGCCAAATGGAATAAATAAA C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 1310 1320 1330 1340 1350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 AGTAATATTAATAATTGGTCTAAAAAGTATACATCATTGATAAAAGAAAA C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 1360 1370 1380 1390 ....|....|....|....|....|....|....|....|.. C-per-beta2-L77965.1 ATTACCAGTAAAAATTGAGCTTAAAAAATTAAATGTAAATTT C-per-beta2-AJ537533.1 ------------------------------------------ T1 ------------------------------------------ T2 ------------------------------------------ T3 ------------------------------------------ T4 ------------------------------------------ T5 ------------------------------------------ Phụ lục 2b So sánh trình tự các Nucleotid một ñoạn gen của cpb2 giữa các chủng vi khuẩn phân lập và chủng vi khuẩn tham chiếu (ñã công bố trên GenBank) 10 20 30 40 50 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 ATTTGGGATATCTTAAATTTAGCACAGAAGAATGTTTAAATGAAATAAAG C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 ATAATAAAAAGATATATTAATTATATAGCTGAAAATTTATAATTATATGA C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TAAGTATAGTTAATAAATAAAAAGTGTTCTCGGGGGACACTTTTTTGTTT C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TAAAAAGGAAAATATAAATAAAATTTAGATAAAAGTGTAAAATAATTATT C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 210 220 230 240 250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TTTATTTTAAATTTGTTAAAAATTTGATATAATTGAATTGTAAAAAAAAT C-per-beta2-AJ537533.1 ------------------................................ T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TTCAGGGGGGAATATAAATGAAAAAAATTATTTCAAAGTTTACTGTAATT C-per-beta2-AJ537533.1 .................................................. T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TTTATGTTTTCATGTTTTCTTATTGTTGGAGCAATAAGTCCAATGAAAGC C-per-beta2-AJ537533.1 .................................................. T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 AAGTGCAAAAGAAATCGACGCTTATAGAAAGGTAATGGAGAATTATCTTA C-per-beta2-AJ537533.1 .................................................. T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 410 420 430 440 450 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 ATGCTTTAAAAAACTACGATATTAATACAGTTGTAAACATTTCAGAAGAT C-per-beta2-AJ537533.1 .................................................. T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 GAAAGAGTAAATAATGTTGAACAGTATAGAGAAATGTTAGAAGATTTTAA C-per-beta2-AJ537533.1 .................................................. T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 510 520 530 540 550 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 ATATGATCCTAACCAACAACTGAAATCTTTTGAAATACTTAATTCACAAA C-per-beta2-AJ537533.1 .................................................. T1 --------------.................................... T2 ---------------------............................. T3 ------------------................................ T4 ----------------.................................. T5 ------............................................ 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 AGAGCGATAATAAAGAAATATTTAATGTAAAAACTGAATTTTTAAATGGT C-per-beta2-AJ537533.1 .................................................. T1 .................................................. T2 .................................................. T3 .................................................. T4 .................................................. T5 .................................................. 610 620 630 640 650 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 GCAATTTATGATATGGAATTTACTGTATCATCTAAAGATGGAAAATTAAT C-per-beta2-AJ537533.1 .................................................. T1 .................................................. T2 .................................................. T3 .................................................. T4 .................................................. T5 .................................................. 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 AGTATCTGATATGGAAAGAACAAAAGTTGAGAATGAAGGAAAATATATTT C-per-beta2-AJ537533.1 .........................A........................ T1 .........................A........................ T2 .........................A........................ T3 .........................A........................ T4 .........................A........................ T5 .........................A........................ 710 720 730 740 750 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TAACACCATCATTTAGAACTCAAGTTTGTACATGGGATGATGAACTAGCA C-per-beta2-AJ537533.1 .................................................. T1 .................................................. T2 .................................................. T3 .................................................. T4 .................................................. T5 .................................................. 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 CAAGCAATTGGGGGAGTTTATCCACAAACATATTCTGATAGATTTACATA C-per-beta2-AJ537533.1 .................................................. T1 .................................................. T2 .................................................. T3 .................................................. T4 .................................................. T5 .................................................. 810 820 830 840 850 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TTATGCAGATAATATATTATTAAACTTCAGACAATATGCAACTTCAGGTT C-per-beta2-AJ537533.1 .................................................. T1 .................................................. T2 .................................................. T3 .................................................. T4 .................................................. T5 .................................................. 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 CAAGAGATTTAAAAGTAGAATATAGTGTTGTAGATCATTGGATGTGGAAA C-per-beta2-AJ537533.1 .................................................. T1 .................................................. T2 .................................................. T3 .................................................. T4 .................................................. T5 .................................................. 910 920 930 940 950 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 GATGATGTTAAAGCTTCTCAAATGGTATATGGTCAAAATCCTGATTCTGC C-per-beta2-AJ537533.1 .................................................. T1 .................................................. T2 .................................................. T3 .................................................. T4 .................................................. T5 .................................................. 960 970 980 990 1000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TAGACAAATAAGATTATATATAGAAAAAGGACAATCTTTCTATAAATATA C-per-beta2-AJ537533.1 .................................................. T1 .................................................. T2 .................................................. T3 .................................................. T4 .................................................. T5 .................................................. 1010 1020 1030 1040 1050 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 GAATAAGAATTAAAAACTTTACACCTGCATCAATTAGAGTATTTGGTGAA C-per-beta2-AJ537533.1 .................................................. T1 ....................------------------------------ T2 .......................--------------------------- T3 .................................................. T4 .................................................- T5 .................................................. 1060 1070 1080 1090 1100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 GGGTATTGTGCATAGAAAAAAATATGAAGTGACTTAGTCACTTCATATTT C-per-beta2-AJ537533.1 ..................................---------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 ..------------------------------------------------ T4 -------------------------------------------------- T5 ............-------------------------------------- 1110 1120 1130 1140 1150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TTTTTACTATTAATTTTATTATATAAAAACCTAACATACATGAAAGTATT C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 CTTAATACAGTTATATCAAAATTAAAGTAGGGGAAATAAAATAAAAGGCT C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 1210 1220 1230 1240 1250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 AAAAACTATATTAAAAACTATAAAAATTATTAAATTAGGTTTTAAGGTGT C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 1260 1270 1280 1290 1300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 TATATTTATTTATGATTATAGGAATAAATATGCCAAATGGAATAAATAAA C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 1310 1320 1330 1340 1350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| C-per-beta2-L77965.1 AGTAATATTAATAATTGGTCTAAAAAGTATACATCATTGATAAAAGAAAA C-per-beta2-AJ537533.1 -------------------------------------------------- T1 -------------------------------------------------- T2 -------------------------------------------------- T3 -------------------------------------------------- T4 -------------------------------------------------- T5 -------------------------------------------------- 1360 1370 1380 1390 ....|....|....|....|....|....|....|....|.. C-per-beta2-L77965.1 ATTACCAGTAAAAATTGAGCTTAAAAAATTAAATGTAAATTT C-per-beta2-AJ537533.1 ------------------------------------------ T1 ------------------------------------------ T2 ------------------------------------------ T3 ------------------------------------------ T4 ------------------------------------------ T5 ------------------------------------------ Phụ lục 3a. Kết quả phân lập vi khuẩn hiếu khí và yếm khí từ các mẫu phân bò Số mẫu phân lập ñược vi khuẩn Nguồn gốc mẫu C. perfringens (Tỷ lệ %) E. coli (Tỷ lệ %) Salmonella sp. (Tỷ lệ %) Proteus sp. (Tỷ lệ %) Staphylococcus sp. (Tỷ lệ %) Streptoc /Enterococc (T Bò TC (n = 128) 75 (58,59) 109 (85,20) 2 (1,56) 3 (2,34) 52 (40,63) Bò KM (n = 42) 15 (35,71) 36 (85,71) 0 1 (2,38) 16 (38,10) P 0,01 0,93 1 0,99 0,86 Phụ lục 3b. Kết quả phân lập vi khuẩn hiếu khí và yếm khí từ các mẫu phân lợn Số mẫu phân lập ñược vi khuẩn Tuổi lợn (ngày) Nguồn gốc mẫu C. perfringens (Tỷ lệ %) E. coli (Tỷ lệ %) Salmonella sp. (Tỷ lệ %) Proteus sp. (Tỷ lệ %) Staphylococcus sp. (Tỷ lệ %) Streptococcus sp. /Enterococcus (Tỷ lệ %) Bacillus sp. (T Lợn TC (n = 250) 162 (64,80) 221 (88,40) 0 24 (9,60) 41 (16,40) 31 (12,40) 1 - 28 Lợn KH (n = 46) 14 (30,43) 38 (82,60) 0 4 (8,70) 8 (17,39) 5 (10,87) P 0,001 0,29 - 0,85 0,87 0,77 Lợn TC (n = 272) 142 (52,21) 246 (90,44) 18 (6,62) 9 (3,31) 40 (14,71) 51 (18,75) 29 - 90 Lợn KH (n = 36) 7 (19,44) 29 (80,55) 0 1 (2,78) 4 (11,11) 6 (16,67) P 0,001 0,08 0,14 0,87 0,56 0,76 ._.