Nghiên cứu tính độc cấp của N-NH4, N-NO2 và N-NO3 đối với ấu trùng cá giò (Rachycentron canadum) trước và sau biến thái

sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đ−ợc cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đ−ợc chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả Bùi Thị Ngọc Hoa iii Lời cảm ơn Lời đầu tiên, tôi chân thành cảm ơn các tổ chức trong và ngoài n−ớc: - Tr−ờng Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội - Ban giám đốc - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I - Dự án NORAD - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I - Phòng Đào tạo - Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I đã ủng hộ và giúp đỡ để tôi hoàn thành khóa học này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Đức Cự đã tận tình định h−ớng, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin cảm ơn các cán bộ, công nhân viên của Trạm nghiên cứu Biển Đồ Sơn - Viện Tài Nguyên và Môi tr−ờng biển Hải Phòng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện luận văn này. Lời cảm ơn chân thành cho bạn bè, đồng nghiệp đã luôn giúp đỡ, động viên, cổ vũ, tiếp thêm sức mạnh để tôi có niềm tin trong học tập và cuộc sống. Cuối cùng, từ sâu thẳm lòng mình con cảm ơn Bố mẹ đã có công sinh thành, nuôi dạy và luôn mong con thành đạt. Bắc Ninh, ngày 10/9/2005 Tác giả Bùi Thị Ngọc Hoa iv Mục lục Lời cam đoan i Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục các từ viết tắt vi Danh mục các bảng vii Danh mục các hình vii 1. Mở đầu 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích 2 1.3. Nội dung 3 2. Tổng quan tài liệu 4 2.1. Một số đặc điểm sinh học của cá Giò (Rachycentron canadum) 4 2.2. Khái quát về hệ thống lọc sinh học 6 2.3. Hợp chất của Nitơ trong nuôi trồng thuỷ sản 14 2.5. ảnh h−ởng của độc tố đối với động vật thuỷ sản 22 2.6. Các thí nghiệm về độc tố 25 3. Đối t−ợng, thời gian, địa điểm và ph−ơng pháp nghiên cứu 29 3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm 29 3.2. Vật liệu thí nghiệm 29 3.3. Ph−ơng pháp thí nghiệm 30 3.4. Ph−ơng pháp xác định nồng độ gây chết 50% (LC50), nồng độ tác động (EC50) và nồng độ không tác động (NOEC) 33 3.5. Ph−ơng pháp theo dõi và đo các yếu tố môi tr−ờng 38 4. Kết quả và thảo luận 40 4.1. Kết quả theo dõi các yếu tố môi tr−ờng 40 4.2. Xác định LC50 ở 96h của N - NH4 +, N - NO2 - và N - NO3 - đối với ấu trùng cá Giò giai đoạn tr−ớc và sau biến thái 42 4.2.1. Cá Giò giai đoạn tr−ớc biến thái 42 v 4.2.2. Cá Giò giai đoạn sau biến thái 46 4.3. Xác định EC50 ở 96h của N - NH4 +, N - NO2 - và N - NO3 - đối với ấu trùng cá Giò giai đoạn tr−ớc và sau biến thái 51 4.3.1. Cá Giò giai đoạn tr−ớc biến thái 51 4.3.2. Cá Giò giai đoạn sau biến thái 55 4.4. Xác định nồng độ không gây tác động (NOEC) 59 5. Kết luận và đề nghị 61 5.1. Kết luận 61 5.2. Đề nghị 62 Tài liệu tham khảo 63 Phụ lục 67 vi Danh mục các từ viết tắt STT Viết tắt Tiếng Anh Viết bình th−ờng 1 ĐVTS Động vật thủy sản 2 EC50 Effective concentration 50 Nồng độ tác động 50% 3 LC50 Lethal concentration 50 Nồng độ gây chết 50% 4 NOEC No observed effect concentration Nồng độ không tác động 5 UNEP United Nations Environment Programme Tr−ơng trình môi tr−ờng quốc tế 6 USEPA United States Enviroment Protection Agency Cục bảo vệ môi tr−ờng Mỹ vii Danh mục các bảng Bảng 2.1. Sự phát triển hình thái, tập tính ăn và nhu cầu dinh d−ỡng của cá Giò 5 Bảng 2.2. Nhu cầu sử dụng n−ớc trong nuôi trồng thuỷ sản ở một số quốc gia 8 Bảng 2.3. Kết quả −ơng nuôi cá Giò ở một số trại tôm thuộc khu vực Hải Phòng - Quảng Ninh - Nghệ An 12 Bảng 2.4. Giá trị trung bình các thông số khoáng dinh d−ỡng của n−ớc thải từ hệ thống nuôi và n−ớc sau khi lọc sinh học theo thời gian nuôi 14 Bảng 2.5. Chỉ tiêu chất l−ợng n−ớc của các dinh d−ỡng khoáng cho nuôi cá n−ớc mặn 15 Bảng 2.6.Tỷ lệ % của NH3 trong tổng hàm l−ợng amonia ở các giá trị pH và nhiệt độ khác nhau 17 Bảng 2.7. Giá trị LC50 và NOEC của nitrite đối với một số loài cá 20 Bảng 2.8. Giá trị NOEC của một số đối t−ợng thủy sản đối với độc tố của nitrate 20 Bảng 3.1. Điều kiện thí nghiệm xác định dãy giới hạn nồng độ 31 Bảng 3.2. Nồng độ hoá chất trong thí nghiệm thử 31 Bảng 3.3. Điều kiện thí nghiệm xác định LC50, EC50 và NOEC 32 Bảng 3.4. Nồng độ hoá chất trong thí nghiệm xác định LC50, EC50, NOEC 32 Bảng 4.1. Biến động của các yếu tố môi tr−ờng trong thí nghiệm 40 Bảng 4.2. Biến đổi nồng độ của dinh d−ỡng khoáng tr−ớc và sau khi thay n−ớc trong thí nghiệm LC50 96h 40 Bảng 4.3. Tỷ lệ chết trung bình của cá Giò tr−ớc biến thái trong 3 lô thí nghiệm xác định dãy giới hạn nồng độ ở 48h 43 Bảng 4.4. Tỷ lệ chết của cá Giò tr−ớc biến thái trong thí nghiệm xác định LC50 ở 96h 44 Bảng 4.5. Giá trị LC50 96h và khoảng tin cậy 95% của các độc tố thí nghiệm đối với cá Giò tr−ớc biến thái 46 Bảng 4.6. Tỷ lệ chết trung bình của cá Giò sau biến thái trong 3 lô thí nghiệm xác định dãy giới hạn nồng độ ở 48h 47 Bảng 4.7. Tỷ lệ chết của cá Giò sau biến thái trong thí nghiệm xác định LC5096h 48 viii Bảng 4.8. Giá trị LC50 96h và khoảng tin cậy 95% của các độc tố thí nghiệm đối với cá Giò sau biến thái 50 Bảng 4.9. Giá trị LC50 96h của các dinh d−ỡng khoáng đối với ấu trùng cá Giò tr−ớc và sau biến thái 50 Bảng 4.10. Tỷ lệ cá tr−ớc biến thái bị tác động ở 96h 52 Bảng 4.11. Giá trị EC50 96h và khoảng giới hạn tin cậy 95% của cá Giò giai đoạn tr−ớc biến thái đối với độc tố dinh d−ỡng ở 96h thí nghiệm 55 Bảng 4.12. Tỷ lệ cá sau biến thái bị tác động ở 96h 56 Bảng 4.13. Giá trị EC50 ở 96h và khoảng giới hạn tin cậy 95% của độc tố dinh d−ỡng đối với cá Giò sau biến thái 58 Bảng 4.14. Giá trị EC50 96h của các dinh d−ỡng khoáng đối với ấu trùng cá Giò tr−ớc và sau biến thái 59 Bảng 4.15. Giá trị NOEC 96h của độc tố dinh d−ỡng đối với cá Giò 59 ix Danh mục các hình Hình 2.1. Chu trình nitơ trong môi tr−ờng n−ớc 15 Hình 2.2. Sự hấp thụ, l−u thông và bài tiết hoá chất trong động vật thuỷ sản 22 Hình 2.3. ảnh h−ởng của hoá chất tới ĐVTS gây biến đổi vật chất di truyền 24 Hình 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 30 Hình 3.2. Sơ đồ xác định LC50/EC50 cho thí nghiệm độc tố cấp tính 34 Hình 3.3. Sơ đồ xác định NOEC khi sử dụng phần mềm Toxsat 38 Hình 4.1. Tỷ lệ chết trung bình của cá tr−ớc biến thái ở 96h theo nồng độ N-NH4+ 45 Hình 4. 2. Tỷ lệ chết trung bình của cá tr−ớc biến thái ở 96h theo nồng độ N-NO2- 45 Hình 4. 3. Tỷ lệ chết trung bình của cá tr−ớc biến thái ở 96h 45 Hình 4.4. Tỷ lệ chết trung bình của cá sau biến thái ở 96h 49 Hình 4.5. Tỷ lệ chết trung bình của cá sau biến thái ở 96h theo nồng độ N-NO-2 49 Hình 4.6. Tỷ lệ chết trung bình của cá sau biến thái ở 96h theo nồng độ N-NO-2 49 Hình 4.7. Biến đổi LC50 ở 96h của cá Giò giai đoạn tr−ớc và sau biến thái 51 Hình 4.8. Tỷ lệ trung bình của cá tr−ớc biến thái bị tác động theo nồng độ N-NH4+ ở 96h 53 Hình 4.9. Tỷ lệ trung bình của cá tr−ớc biến thái bị tác động 54 Hình 4.10. Tỷ lệ trung bình của cá tr−ớc biến thái bị tác động 54 Hình 4.11. Tỷ lệ trung bình của cá sau biến thái bị tác động theo nồng độ N-NH4 + ở 96h 57 Hình 4.12. Tỷ lệ trung bình của cá sau biến thái bị tác động theo nồng độ N-NO2 - ở 96h 57 Hình 4.13. Tỷ lệ trung bình của cá sau biến thái bị tác động theo nồng độ N-NO3 - ở 96h 57 Hình 4.14. Biến đổi EC50 ở 96h của các độc tố dinh d−ỡng khoáng với cá tr−ớc và sau biến thái 59 1 1. Mở đầu 1.1. Đặt vấn đề Đối với nghề nuôi biển của Việt Nam, cá Giò (Rachycentron canadum) là loài nuôi th−ơng phẩm mới nh−ng với nhiều −u điểm để phát triển thành đối t−ợng nuôi công nghiệp có giá trị th−ơng phẩm cao nh− cá hồi ở Châu âu (Nguyễn Quang Huy và ctv, 2003) [5]. ở Đài Loan, cá Giò bắt đầu đ−ợc nuôi vào năm 1992 đến năm 1998 đã sản xuất đ−ợc khoảng 1,4 triệu cá Giò giống, năm 1999 đ−ợc 3 triệu con, trong đó 2 triệu con xuất khẩu sang Nhật Bản, Trung Quốc và Việt Nam. Từ năm 1995, Việt Nam bắt đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất cá Giò và b−ớc đầu đạt đ−ợc một số thành công. Đến nay một số trại sản xuất giống phía bắc đã ứng dụng công nghệ để chủ động sản xuất hàng loạt con giống đáp ứng một phần nhu cầu cho ng−ời nuôi. Trong quá trình sản xuất giống còn gặp một số khó khăn nh−: giá thành con giống cao, tỷ lệ sống đến giai đoạn giống ch−a ổn định (tỷ lệ sống đến giai đoạn giống đạt 1 – 4%, thậm chí < 1%). Sản xuất giống cá biển truyền thống đòi hỏi cung cấp một l−ợng n−ớc rất lớn (10 – 500% thể tích/ngày tuỳ thuộc vào kích th−ớc của cá), gây khó khăn cho các trại sản xuất giống có nguồn n−ớc cấp không thuận lợi. Để hạn chế điều này hệ thống lọc sinh học hoàn l−u đã đ−ợc áp dụng vào sản xuất giống cá biển trong vài thập kỷ gần đây. Hệ thống lọc sinh học hoàn l−u có thể loại bỏ những chất thải hữu cơ lơ lửng và lắng đọng, CO2, amonia, nitrite… bởi các vi khuẩn sống dính bám trên vật liệu lọc, ổn định môi tr−ờng −ơng nuôi, giảm các chi phí về nhân công, tránh đ−ợc các rủi ro về ô nhiễm môi tr−ờng, dịch bệnh và đảm bảo con giống sạch bệnh (Nguyễn Đức Cự và ctv, 2004) [1]. Tuy nhiên, khi áp dụng lọc sinh học hoàn l−u trong xử lý n−ớc cho sản xuất giống thủy sản gặp phải một số bất cập: Theo thời gian −ơng nuôi các dinh d−ỡng khoáng từ thức ăn thừa và chất thải từ bài tiết tăng lên. Khi hàm l−ợng dinh d−ỡng 2 khoáng quá cao và kéo dài sẽ ảnh h−ởng đến sinh tr−ởng thậm chí có thể gây chết động vật thủy sinh. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về ảnh h−ởng của dinh d−ỡng khoáng đến các loài cá khác nhau: cá hồi, cá chép (M. P. Kokureva, 1969), cá rô sông, tôm rằn (V. F. Burtia, 1968), các thuỷ sinh vật khác (giun nhiều tơ, …) và ảnh h−ởng của chúng lên đối t−ợng ở những vùng sinh thái khác nhau cũng khác nhau (Z.P. Pogoda, 1968) - (trích Olivier và Michel, 1999) [20] . ở Việt Nam ch−a có nghiên cứu ảnh h−ởng của các khoáng dinh d−ỡng đến ấu trùng cá Giò. Các thí nghiệm xác định nồng độ độc tố thấp nhất và cao nhất của các dinh d−ỡng khoáng gây ảnh h−ởng đến ấu trùng cá biển nói chung và cá Giò nói riêng cũng ch−a đ−ợc tiến hành. Để góp phần nâng cao hiệu quả của sản xuất giống cá Giò thì việc tìm ra mức gây độc thấp nhất và cao nhất của hàm l−ợng các dinh d−ỡng khoáng trong môi tr−ờng −ơng nuôi giai đoạn ấu trùng rất cần thiết. Kết quả nghiên cứu là cơ sở giúp cho ng−ời nuôi quản lý, vận hành hệ thống lọc sinh học, giảm thiểu chi phí sản xuất và nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá. Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tính độc cấp của N - NH4 +, N - NO2 - và N - NO3 - đối với ấu trùng cá Giò (Rachycentron canadum) giai đoạn tr−ớc và sau biến thái”. 1.2. Mục đích B−ớc đầu góp phần xây dựng tiêu chí chất l−ợng môi tr−ờng cho −ơng nuôi cá Giò của Việt Nam bằng công nghệ lọc sinh học qua việc xác định ng−ỡng gây chết 50% và nồng độ tác động 50% của N - NH4 +, N -NO2 - và N - NO3 - đối với ấu trùng cá Giò tr−ớc và sau biến thái. 3 1.3. Nội dung Để đạt đ−ợc mục đích trên chúng tôi thực hiện các nội dung sau: - Thí nghiệm xác định LC50 (nồng độ gây chết 50%) của N - NH4+, N - NO2- và N - NO3 - đối với ấu trùng cá Giò tr−ớc và sau biến thái ở 96h. - Xác định EC50 (nồng độ tác động 50%) của N - NH4+, N - NO2- và N - NO3- đối với ấu trùng cá Giò tr−ớc và sau biến thái. - Xác định NOEC (nồng độ không gây tác động) của N - NH4+, N - NO2- và N - NO3 - đối với ấu trùng cá Giò tr−ớc và sau biến thái. 4 2. Tổng quan tài liệu 2.1. Một số đặc điểm sinh học của cá Giò (Rachycentron canadum) 2.1.1. Phân loại FAO (1974) (trích Đỗ Văn Minh, 2003) [5], cá Giò đ−ợc phân loại nh− sau: Ngành: Chordata Lớp: Pices Bộ: Perciformes Họ: Rachycentridae Giống: Rachycentron Loài: Rachycentron canadum Tên tiếng Anh: Blacking Fish hay Cobia. 2.1.2. Phân bố Theo địa lí: Chúng phân bố rộng, sống ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và vùng n−ớc ấm của biển nhiệt đới và ôn đới. Theo vùng sinh thái: Chúng sống nổi ở vùng ven bờ và các vịnh và các rạn san hô. Giai đoạn tr−ởng thành sống ở vùng biển khơi, có tập tính di c− vào mùa sinh sản. Cá Giò phân bố ở độ sâu 50 – 120m (Đỗ Minh, 2003) [5]. 2.1.3. Tính ăn Cá Giò là loài phàm ăn, ăn động vật. Thức ăn của chúng trong tự nhiên là giáp xác (cua, tôm), các động vật không x−ơng sống và các loài cá khác. Trong điều kiện nuôi, giai đoạn cá giống (khi kích th−ớc của cá không đồng đều nhau) có tính ăn đồng loại, mỗi giai đoạn phát triển khác nhau tập tính ăn của cá khác nhau (bảng 2.1). Tính ăn của cá giảm khi nhiệt độ giảm và ngừng ăn ở nhiệt độ 17 – 180C (Đỗ Minh, 2003) [5]. 5 Bảng 2.1. Sự phát triển hình thái, tập tính ăn và nhu cầu dinh d−ỡng của cá Giò Ngày tuổi Chiều dài (mm) Phát triển hình thái và tính ăn 15 1,5 – 1,7 Cá b−ớc vào giai đoạn biến thái. Một số cá đã ăn thức ăn hỗn hợp (Artemia và thức ăn tổng hợp cỡ 250 – 300 àm) 20 – 25 2,5 – 3,0 cm Cá ăn Artemia + Copepod và thức ăn hỗn hợp (bio – optimal cỡ 300 à m). 27 – 30 Cá có thể ăn thức ăn hỗn hợp cỡ 0,6 – 0,8mm, ngừng cho ăn artemia. 40 – 49 7 – 9cm Cá ăn thức ăn hỗn hợp cỡ 1,2 – 1,5mm, tép moi nguyên con cỡ nhỏ. Giai đoạn này, cá có thể chuyển ra −ơng nuôi ở lồng l−ới hay ao đất. 50 10 – 12cm Cá ăn thức ăn hỗn hợp cỡ 1,5 – 2mm, tép moi, thịt tôm cá xay. Cá đã hoàn thành giai đoạn biến thái. Cá ở giai đoạn này có thể đ−a ra nuôi th−ơng phẩm. Nguồn: Đỗ Minh, 2003 [5] Trong quá trình phát triển của ấu trùng cá Giò, giai đoạn chuyển thức ăn và giai đoạn chuyển biến thái nhạy cảm đặc biệt với biến đổi của môi tr−ờng. ấu trùng giai đoạn này, nếu không đ−ợc cung cấp đầy đủ thức ăn và môi tr−ờng sống không đảm bảo và ổn định dẫn đến tỷ lệ sống của ấu trùng rất thấp. Vì vậy, chúng tôi chọn cá ở giai đoạn tr−ớc và sau biến thái làm thí nghiệm. 2.1.4. Sinh tr−ởng và sinh sản * Sinh tr−ởng: Trong điều kiện nuôi, cá có thể đạt 5 – 7kg sau 1 năm, sau 2 năm nuôi đạt 10 – 15kg và sau 4 năm nuôi đạt 20 –30kg. Trong tự nhiên cá có thể đạt 68kg và dài 2m. * Tuổi sinh sản: Cá Giò thành thục và tham gia sinh sản sau 2 tuổi với cỡ 7 – 9kg. - Mùa vụ sinh sản: cá sinh sản từ tháng 4 đến tháng 6 hàng năm (Việt Nam). ở Đài Loan, cá đẻ từ tháng 3 đến tháng 10. - Sức sinh sản của cá Giò đạt 1,9 – 5,4 triệu trứng/con. 6 2.2. Khái quát về hệ thống lọc sinh học 2.2.1. Lọc sinh học là gì Khái niệm: Math Smith (2003) [24], Thomas M. L. và M. P. Masser & Racoky (1992 và 1998) [17], [18] đã định nghĩa về lọc sinh học phục vụ cho nuôi trồng thủy sản là quá trình nuôi các vi sinh vật, chủ yếu là vi khuẩn hiếu khí sống bám ở các màng lọc sinh học trên bề mặt vật liệu lọc, sinh tr−ởng và phát triển do các chất dinh d−ỡng trong n−ớc thải từ hệ thống bể nuôi. N−ớc thải qua hệ thống lọc này sẽ đ−ợc loại trừ các chất hữu cơ hoà tan và muối dinh d−ỡng vô cơ (NH4+, NH3, NO2-, NO3- và PO4-3) bởi các vi khuẩn nitrite và nitrate, sau đó n−ớc sạch đ−ợc cấp trở lại hệ thống bể nuôi (Math Smith, 2003) [28]. Nguyên lý: Lọc sinh học dựa vào quá trình hoạt động của vi sinh vật (vi khuẩn hiếu khí) ở màng sinh học dính bám trên bề mặt vật liệu lọc để phân huỷ các chất hữu cơ có trong n−ớc thải (Fred W., 2003 [32] và Math Smith, 2003 [24]). Các chất hữu cơ trong n−ớc thải bị oxy hoá bởi quần thể vi sinh vật trong màng lọc sinh học, tr−ớc hết xảy ra phân huỷ hiếu khí ở phần ngoài của màng lọc sinh học. Tại đây chất hữu cơ sẽ bị oxy hoá đến NO3 - theo các b−ớc sau: Quá trình nitrate hoá sinh học đ−ợc thực hiện bởi hai chủng vi khuẩn tự d−ỡng hoá năng là Nitrosomonas sp. và Nitrobacter sp. Các phản ứng này diễn ra thuận lợi trong điều kiện nhiệt độ 20 – 300C và pH khoảng 7 – 9. Trong các phản ứng này, CO2 sinh ra sẽ thoát ra ngoài qua lớp màng lọc. N−ớc tiếp tục thấm sâu vào trong, tại đây n−ớc hết oxy hoà tan và sẽ đ−ợc chuyển sang phân huỷ bởi vi sinh vật kị khí. Đây là quá trình phản nitrate, đ−ợc thực hiện bởi nhóm vi khuẩn Denitroficans. Nitrobacter Vi sinh vật Nitrosomomas Chất hữu cơ + O2 NH3 + CO2 + H2O (1) (2) (3) 2H+ + NO2 - + H2O NO3 - NH4 + + 3/2O2 NO2 - + 1/2O2 7 Khi n−ớc thải đã hết các chất hữu cơ, vi sinh vật ở màng sinh học sẽ chuyển sang hô hấp nội bào và khả năng kết dính của màng lọc sinh học giảm, dần dần bị phá vỡ và cuốn theo n−ớc lọc, đây gọi là hiện t−ợng “tróc màng”. Sau đó lớp màng mới sẽ xuất hiện lại và màng lọc đ−ợc tróc ra sẽ là cơ chất cho vi khuẩn phát triển thành màng lọc mới. Điều kiện để n−ớc thải đ−ợc đ−a vào lọc sinh học: Ph−ơng pháp xử lý n−ớc thải bằng lọc sinh học dựa trên hoạt động của vi khuẩn phân huỷ các chất hữu cơ, do vậy điều kiện đầu tiên và quan trọng nhất của n−ớc thải phải phù hợp với môi tr−ờng sống và phát triển của quần thể vi sinh vật. Muốn đảm bảo điều kiện này n−ớc thải cần có các đặc điểm sau (Math Smith, 2003) [24]: - Không chứa các chất độc làm chết hay ức chế hoàn toàn vi sinh vật phát triển trong n−ớc thải. N−ớc thải giàu chất hữu cơ và vô cơ. Nếu n−ớc thải nghèo chất hữu cơ cần đ−ợc bổ sung dinh d−ỡng tr−ớc khi đ−a vào xử lý. - N−ớc thải đ−a vào xử lý sinh học có hai chỉ tiêu đặc tr−ng là COD và BOD. Tỷ số của 2 thông số này là: 1 > BOD/COD ≥ 0,5 mới có thể đ−a vào xử lý sinh học (hiếu khí). Nếu COD lớn hơn BOD nhiều lần, chứng tỏ trong n−ớc thải có nhiều chất hữu cơ khó phân huỷ nh−: xenlulo, tinh bột ch−a tan, protein… và các chất hữu cơ hóa tan khó phân hủy thì phải lọc cơ học tr−ớc khi đ−a vào bể lọc sinh học hoặc thay n−ớc và bổ sung n−ớc mới hàng ngày trong tr−ờng hợp các chất hữu cơ hoà tan khó phân hủy tăng cao. 2.2.2. Lọc sinh học trong nuôi trồng thuỷ sản • Trên thế giới Phần lớn các loài cá có giá trị kinh tế ở n−ớc lạnh và n−ớc ấm đều nuôi trong ao hồ, bể hoặc lồng. Với hệ thống nuôi cá giống truyền thống đòi hỏi cung cấp một l−ợng n−ớc sạch rất lớn. Tổng số l−ợng n−ớc đòi hỏi cung cấp cho sản xuất phụ thuộc vào tỷ lệ l−u chuyển n−ớc, l−ợng m−a, sự bốc hơi và c−ờng độ nuôi. nuôi cá nheo trong bể ở Mỹ, đòi hỏi cung cấp một l−ợng n−ớc từ 2,5 – 600% tổng thể tích NO3 - NO2 - NO N2 8 của một năm. ở Hawai, l−ợng n−ớc thay cho hệ thống nuôi siêu thâm canh tôm với tỷ lệ cao (80% của thể tích ao/ngày). Trong bể nuôi cá n−ớc chảy, l−ợng n−ớc đ−ợc sử dụng lớn hơn để loại bỏ hết các sản phẩm thải của cá ra môi tr−ờng nuôi, th−ờng là 100% hoặc nhiều hơn thể tích n−ớc của bể nuôi cá trong một ngày (bảng 2.2.). Phillips và ctv (1991) (trích Boyd,1992) [10], đã cho rằng: “Nuôi trồng thuỷ sản sẽ phải đối mặt với những vấn đề khó khăn khi phát triển rộng khắp trên thế giới, gia tăng tác động bất lợi đến môi tr−ờng thuỷ sinh và cạnh tranh với nguồn lợi tài nguyên n−ớc và đất ”. Một vấn đề đặt ra là: N−ớc thải từ nuôi trồng thuỷ sản cần đ−ợc xử lý sao cho khi thải ra môi tr−ờng không tác động trở lại hoạt động nuôi. N−ớc thải th−ờng tồn tại ở hai dạng: dạng lơ lửng và dạng hoà tan. Các chất dinh d−ỡng vô cơ và hữu cơ phần lớn ở dạng lơ lửng (Michael B. Timmons và Thomas M. Losordo, 1994) [18, 21]. Bảng 2.2. Nhu cầu sử dụng n−ớc trong nuôi trồng thuỷ sản ở một số quốc gia Loài và hệ thống nuôi Quốc gia Năng suất (kg/ha/năm) Nhu cầu n−ớc (l/kg) Nuôi rô phi trong ao Đài Loan 17.400 21.000 Nuôi cá rô phi trong ao Đài Loan 30 – 50 3.000 – 5.000 Nuôi cá nheo trong ao Mỹ 3.000 6.470 Nuôi cá nheo n−ớc chảy Mỹ - 14.500 –29.900 Nuôi cá hồi vân n−ớc chảy Mỹ 150.000 210.000 Nuôi cá hồi trong bể và ao Anh - 252.000 Nuôi tôm he trong ao Đài Loan 4.200 – 11.000 11.000 – 21.340 Nguồn: Phillips và ctv, 1991 trích Boyd, 1992 [10] Phần lớn các công nghệ xử lý n−ớc tập trung vào n−ớc thải công nghiệp và n−ớc thải dân dụng. Các công nghệ xử lý n−ớc này có thể áp dụng cho xử lý n−ớc thải trong nuôi trồng thuỷ sản. Hệ thống lọc sinh học đầu tiên đ−ợc thiết lập để xử lý n−ớc thải dân sự tại Trại thực nghiệm Lawrence của Mỹ vào năm 1891 và 1893 ở Anh. Đến năm 1940, Mỹ đã có 60% hệ thống xử lý n−ớc thải áp dụng công nghệ lọc sinh học. Nhiều n−ớc trên thế giới, hệ thống lọc sinh học đ−ợc áp dụng rộng rãi để xử lý n−ớc thải sinh 9 hoạt và công nghiệp nh−ng ứng dụng của hệ thống tuần hoàn n−ớc cho nuôi và l−u giữ cá mới đ−ợc nghiên cứu trong ba thập kỷ gần đây (Masser M. P., Rakocy J., Losordo T. M., 1992) [18]. Hiện nay, lọc n−ớc biển bằng bể lọc sinh học và tháp lọc sinh học đang đ−ợc quan tâm nghiên cứu ở nhiều n−ớc. Kết quả nghiên cứu đã đ−ợc áp dụng phổ biến tại các cơ sở sản xuất giống cá biển và sinh vật cảnh biển. Các loại hệ thống lọc sinh học: nuôi cá biển và sinh vật cảnh biển có 4 loại hệ thống lọc sinh học đ−ợc áp dụng (Fred W. 2003) [32]: - Lọc ngập n−ớc (Suberged filters): Lọc chìm có vật liệu lọc (sỏi, đá, cát và nhựa) ngập hoàn toàn d−ới bề mặt n−ớc. N−ớc vào bể lọc, qua những vật liệu lọc mà ở đó có vi khuẩn nitrite sinh tr−ởng. - Lọc nhỏ giọt (Trickling filters): Lọc phun là lớp vật liệu lọc đ−ợc giữ ẩm nh−ng không ngập n−ớc. N−ớc thải phun xuống hệ thống lọc đ−ợc duy trì ở mức thấp không làm cho vật liệu lọc bị ngập n−ớc. Hệ thống lọc theo ph−ơng pháp này có thể tăng hàm l−ợng oxy trong hệ thống lọc. - Lọc đĩa (Biodisks) : Hệ thống lọc này gồm hàng loạt các đĩa tròn có trục xuyên qua. Khoảng cách giữa các đĩa nhỏ nhất đủ để duy trì khoảng trống cho n−ớc thải chảy tuần hoàn qua các đĩa (2 mặt của các đĩa đã có vi khuẩn sống). Các đĩa đ−ợc đặt chìm 1/2 đ−ờng kính trong n−ớc thải. Trục và các đĩa đ−ợc quay tròn bởi động cơ th−ờng là mô tơ điện. - Trống lọc (Biodrum): Trống lọc có cấu tạo t−ơng tự nh− đĩa lọc ngoại trừ các đĩa đ−ợc thay bằng một trống hình trụ. Trống hình trụ có bề mặt xốp, th−ờng dùng l−ới, và trống đ−ợc làm căng bởi một số vật liệu rắn có diện tích tiếp xúc lớn. vật liệu lọc trong kiểu lọc này đ−ợc làm bằng nhựa (vòng nhựa, hạt nhựa) để giảm trọng l−ợng l−ợng của trống lọc. 10 • Việt Nam Việt Nam đ−ợc coi là n−ớc đứng “ hàng thứ 3” trên thế giới về sản xuất giống và nuôi cá Giò (Nguyễn Quang Huy, ctv, 2003) [3]. Những năm gần đây, bên cạnh các đối t−ợng nuôi biển nh−: cá Song (Epineplus spp.), cá Hồng (Lutjanus spp), cá Cam (Seriola dummerili), tôm Hùm (Panurilus spp), Trai ngọc (Pinctada spp)…. cá Giò là một trong những đối t−ợng nuôi biển hấp dẫn và đ−ợc nuôi khá phổ biến trong các vùng kín sóng gió ở các tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng, Nghệ An (phía Bắc) và các tỉnh Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu và Kiên Giang (phía Nam). Sản xuất giống cá biển (cá Giò, cá Song, cá Hồng mỹ…) b−ớc đầu đã cung cấp một phần giống cho ng−ời nuôi giảm bớt việc nhập khẩu từ Đài Loan, Trung Quốc. Việc sản xuất giống cá biển của Việt Nam tập trung chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc và hiệu suất −ơng rất thấp khoảng 1 – 4%, thậm chí có nhiều cơ sở chỉ đạt d−ới 1% (Nguyễn Quang Huy và ctv, 2003) [3]. ở n−ớc ta, hầu hết các cơ sở sản xuất và −ơng nuôi giống cá biển hiện nay đều sử dụng nguồn n−ớc biển tự nhiên. N−ớc đ−ợc xử lý qua các b−ớc sau: bơm n−ớc từ biển (hay cửa sông), lọc cơ học, đ−a vào bể chứa xử lý hoá chất (chủ yếu bằng chlorin) để loại bỏ vi khuẩn gây bệnh và vi sinh vật, sau đó đ−a vào bể −ơng nuôi. Với tần suất thay n−ớc 200 – 500%/ngày thì việc chi phí cho sản xuất cao, chất l−ợng n−ớc không ổn định. Việc thay n−ớc sẽ gây khó khăn cho những vùng thiếu n−ớc, ng−ời sản xuất khó quản lý môi tr−ờng của bể −ơng do đó làm giảm tỷ lệ sống của ấu trùng ảnh h−ởng đến hiệu quả kinh tế (Nguyễn Đức Cự và ctv, 2004) [1]. Nguyễn Đức Cự và ctv (2004) [1] cho rằng: “Hệ thống lọc sinh học sẽ tạo ra nguồn n−ớc đảm bảo chất l−ợng (nằm trong giới hạn cho phép đối với động vật thuỷ sản), ổn định môi tr−ờng (oxy hoà tan, pH, nhiệt độ và độ mặn) góp phần quan trọng vào quản lý môi tr−ờng trong −ơng nuôi cá giống nói chung và giống cá biển nói riêng đạt tỷ lệ sống cao”. Ngoài ra, khi áp dụng lọc sinh học trong sản xuất giống cá biển còn cho phép nâng cao đ−ợc mật độ −ơng, giảm chi phí nhân công và nhiên liệu, giá thành con giống thấp, mang lại hiệu quả kinh tế cao cho ng−ời sản xuất. 11 hệ thống lọc sinh học ch−a đ−ợc áp dụng rộng rãi trong sản xuất giống hải sản ở n−ớc ta. một vài Trạm nghiên cứu xây dựng hệ thống lọc sinh học để nuôi sinh vật cảnh biển nh−: Viện Hải D−ơng học Nha Trang, Viện Tài nguyên và Môi tr−ờng Biển. 12 Bảng 2.3. Kết quả −ơng nuôi cá Giò ở một số trại tôm thuộc khu vực Hải Phòng - Quảng Ninh - Nghệ An Năm 2002 Năm 2003 Năm 2004 Năm 2005 Địa điểm −ơng Ph−ơng pháp −ơng Số cá giống 8 - 10cm (1000con) Tỷ lệ sống (%) Số cá giống 8 - 10cm (1000con) Tỷ lệ sống (%) Số cá giống 8 - 10cm (1000con) Tỷ lệ sống (%) Số cá giống 8 - 10cm (1000con) Tỷ lệ sống (%) Cát Bà (Viện I) Thâm canh 5,3 7 Cửa Lò (Viện I) Thâm canh 20 22 Trại Thực nghiệm - Viện TN và MT biển Bán thâm canh - áp dụng lọc sinh học 10 1,43 6.34 9 8,5 11* Trạm NCNTTS n−ớc lợ (Viện I) Bán thâm canh 6,5 1,86 8,5 0,85 2 Trại Hạ Long (Quảng Ninh) Bán thâm canh 17 1,7 Tổng cộng 20 56 6.34 8,7 Nguồn: Nguyễn Quang Huy, 2003 [3] và Nguyễn Đức Cự, 2005 Ghi chú: (Viện TN và MT biển) - Viện Tài nguyên và Môi tr−ờng biển Viện 1- Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1 (Trạm NCNTTS n−ớc lợ) - Trạm Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản n−ớc lợ (*) - Số liệu ch−a công bố 13 Trần Văn Nhị và Ninh Hoàng Oanh (2004) [4] cho biết: “Thiết bị lọc sinh học NIREF.M đã thử nghiệm thành công cho hệ nuôi cá cảnh bằng n−ớc biển tái sử dụng toàn bộ ở Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh, cho bể trên ph−ơng tiện vận chuyển đ−ờng dài và bể giữ cá t−ơi sống ở các cơ sở kinh doanh hải sản”. hệ thống lọc sinh học này có tải l−ợng t−ơng đối nhỏ, di động đ−ợc, chỉ áp dụng cho nuôi sinh vật cảnh biển với mật độ nuôi thấp nên không đ−ợc áp dụng vào sản xuất giống hải sản. Trạm Nghiên cứu giống hải sản Nam Cửa Lò, Nghệ An thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản I là một trong những cơ sở sản xuất giống hải sản đầu tiên ở Việt Nam đã sử dụng hệ thống lọc sinh học cho −ơng nuôi giống cá biển. Đây là quy trình nhập ngoại, giá thành cao, công suất lớn, nếu áp dụng trong một trại sản xuất nhỏ sẽ không phù hợp. Viện Tài nguyên và Môi tr−ờng Biển b−ớc đầu nghiên cứu thử nghiệm hệ thống lọc sinh học (thiết kế và chế tạo bằng các vật liệu và thiết bị lọc có sẵn ở Việt Nam) để nuôi sinh vật biển và −ơng giống thành công một số loài cá biển. Năm 2003, bằng việc thử nghiệm áp dụng hệ thống lọc sinh học trong −ơng nuôi cá Giò đã sản xuất thành công 10.000 cá Giò giống với tỷ lệ sống đến giai đoạn cá giống là 1,43% và 120.000 cá hồng mỹ, năm 2004 tỷ lệ này đã đạt 9% cao hơn rất nhiều so với các quy trình −ơng nuôi thí nghiệm cá Giò giống đã công bố ở Việt Nam (Nguyễn Đức Cự, 2004). Đến năm 2005, tỷ lệ sống của cá Giò giống đã lên tới 12% trở thành Trại giống đạt hiệu quả cao nhất về sản xuất giống cá biển so với cả n−ớc. Tuy nhiên, khi áp dụng hệ thống lọc sinh học trong −ơng nuôi giống hải sản nói chung và giống cá Giò nói riêng đã gặp một số bất cập nh−: Hàm l−ợng các khoáng dinh d−ỡng trong n−ớc thải từ hệ thống nuôi tăng lên tỷ lệ thuận với số l−ợng cá −ơng nuôi, mật độ −ơng và thời gian −ơng (với hiệu suất lọc sạch trung bình khá cao 60 – 66%). Điều này đ−ợc thể hiện trong bảng sau. 14 Bảng 2.4. Giá trị trung bình các thông số khoáng dinh d−ỡng của n−ớc thải từ hệ thống nuôi và n−ớc sau khi lọc sinh học theo thời gian nuôi Thời gian nuôi (ngày) 1 – 10 10 – 20 20 – 30 30 – 40 40 - 60 Thông số (mg/) T L T L T L T L T L Tiêu chuẩn N-NH4 + 0,014 0,002 0,022 0,006 0,023 0,007 0,039 0,021 0,391 0,179 0,5+ N-NO2 - 0,009 0,001 0,013 0,003 0,016 0,005 0,053 0,034 0,051 0,036 0,05+ N-NO3 - 0,042 0,026 0,055 0,041 0,108 0,054 1,517 1,520 2,085 2,255 100* Nguồn: Nguyễn Đức Cự, 2004 [1] Ghi chú: T: N−ớc thải từ hệ thống nuôi L: N−ớc sau khi qua hệ thống lọc sinh học (+): Theo Tiêu chuẩn Việt Nam về chất l−ợng n−ớc trong nuôi trồng thuỷ sản. (*): Theo Tiêu chuẩn lọc sinh học. Vì vậy, để giảm thiểu việc thay n−ớc trong hệ thống nuôi khi áp dụng công nghệ lọc sinh học thì việc tìm ra giới hạn gây chết của dinh d−ỡng khoáng là cần thiết trong quản lý môi tr−ờng −ơng nuôi. 2.3. Hợp chất của Nitơ trong nuôi trồng thuỷ sản 2.3.1. Tiêu chuẩn chất l−ợng của các dinh d−ỡng khoáng trong nuôi trồng thủy sản Dinh d−ỡng khoáng là một trong những yếu tố không thể thiếu để kích thích sự sinh tr−ởng và phát triển của thực vật phù du trong ao nuôi. Tuy nhiên, khi hàm l−ợng dinh d−ỡng khoáng quá cao sẽ làm chậm quá trình sinh tr−ởng thậm chí gây chết sinh vật thủy sinh. Vì thế, các dinh d−ỡng khoáng luôn đ−ợc kiểm soát trong hệ thống nuôi. 15 Bảng 2.5. Chỉ tiêu chất l−ợng n−ớc của các dinh d−ỡng khoáng cho nuôi cá n−ớc mặn Thông số Nồng độ (mg/L) N-NH3 < 0,04 N-NO2 - 1,0 N-NO3 - < 50 Nguồn: Boyd, 1992 [10] 2.3.2. Sự biến đổi của hợp chất nitơ trong môi tr−ờng n−ớc Nitơ là khí chủ yếu trong thành phần khí quyển (chiếm 78,08% tổng số khí trong không khí). Nitơ hoà tan trong n−ớc phụ thuộc vào nhiệt độ và áp suất. Nồng độ cân bằng của nitơ cao hơn oxy ở cùng nhiệt độ và độ muối. Nồng độ cân bằng của nitơ giảm khi nhiệt độ và độ muối tăng. Chu trình nitơ trong ao nuôi đều trải qua các pha giống nhau. Phần lớn sự biến đổi trong chu trình là các phản ứng sinh hoá, nitơ biến đổi từ -3 (dạng NH3) sang +5 (ở dạng NO3 -). Điều này đ−ợc thể hiện trong hình 2.1. Hình 2.1. Chu trình nitơ trong môi tr−ờng n−ớc (Ruth Francis-Floyd và Craig Watson, 1990) [23] 2.3.3. Tính độc của hợp chất nitơ đối với động vật thuỷ sinh Losodor (1998) [17] cho rằng: “Thức ăn thừa và các chất thải của cá ra môi tr−ờng nuôi đ−ợc vi sinh vật phân huỷ thành amoniac (tồn tại ở dạng NH3 và NH4+)”. NH3 th−ờng đ−ợc giải phóng trực tiếp ra môi tr−ờng n−ớc từ mang cá, hàm l−ợng NH3 cao hơn rất nhiều sau mùa sản xuất vì khi đó l−ợng thức ăn thừa và sản phẩm Vi khuẩn Nitrosomas Vi khuẩn Nitrobacte O2 Cỏ và thức ăn NH3 và NH4 + NO2 - Thực v._.ật hấp thụ hoặc bay hơi ra không khí NO3 - O2 16 bài tiết của cá nhiều nhất (William A. Wurts, 2005) [33]. Khi hàm l−ợng amonia cao gây độc cho sinh vật, các khoáng dinh d−ỡng trong môi tr−ờng n−ớc chứa nitơ vô cơ hoà tan d−ới dạng khác nhau: NH4+, NO2- và NO3-. Trong đó dạng NH4+ và NO2 - rất độc với cá, kém bền vững và nhanh chóng bị chuyển hoá thành NO3 -. Dạng còn lại ít có hại với thuỷ sinh vật nh−ng khi hàm l−ợng cao cũng gây độc, chúng cần đ−ợc kiểm soát trong bể −ơng. Trong thuỷ vực tự nhiên, NH4+ và NO3- th−ờng xuyên đ−ợc thực vật thuỷ sinh hấp thụ (Losordo Thomas M., 1998) [17]. Amoni (NH4+): Sự tồn tại của NH4 + trong n−ớc phụ thuộc vào pH: pH =7,0 hầu hết các nitrogen tổng số đều ở dạng ion NH4 +, nh−ng khi pH = 8,75, có tới 30% các nitrogen tổng số ở dạng phức (NH3) bền vững và rất độc với cá. Tuy nhiên, khi hàm l−ợng NH4+ cao quá ng−ỡng cho phép cũng gây độc cho động vật thuỷ sinh. Nồng độ gây chết của NH4 + ở dạng phức đã đ−ợc xác định cho nhiều loài và ng−ỡng d−ới mức gây chết ch−a đ−ợc xác định và ở mức này nó có thể làm giảm tốc độ sinh tr−ởng của cá thể (William A. Wurts, 2005) [33]. Trong môi tr−ờng n−ớc tự nhiên gồm có CO2, sinh vật thuỷ sinh, và các hợp chất khác ngoài H2O, giá trị pH luôn duy trì ở 7,0 hoặc trung tính. Tuy nhiên, trong điều kiện ao nuôi có sự kết hợp của các yếu tố khác, pH của n−ớc tự nhiên là acid bởi vì trong khí quyển có chứa đựng CO2 đ−ợc hoà tan vào môi tr−ờng n−ớc từ m−a và các nguồn khác từ không khí (tạo thành các dạng H2CO3, carbonic acid) làm biến đổi pH trong ao nuôi. Ngoài ra, pH và hàm l−ợng CO2 trong môi tr−ờng n−ớc còn liên quan đến quá trình quang hợp và hô hấp của động - thực vật thủy sinh. CO2 đ−ợc giải phóng trong quá trình hô hấp của động vật và đ−ợc thực vật thuỷ sinh hấp thụ cho quang hợp làm cho giá trị pH biến đổi liên tục trong ngày (William A. Wurts, 2005) [33]. 17 Bảng 2.6.Tỷ lệ % của NH3 trong tổng hàm l−ợng amonia ở các giá trị pH và nhiệt độ khác nhau Nhiệt độ (0C) pH 26 28 30 32 7,0 0,60 0,70 0.81 0,95 7,2 0.95 1,10 1,27 1,50 7,4 1,50 1,73 2,00 2,36 7,6 2,35 2,72 3,13 3,69 7,8 3,68 4,24 1,88 5,72 8,0 5,71 6,55 7,52 8,77 8,2 8,75 10,00 11,41 13,22 8,4 13,20 14,98 16,96 19,46 8,6 19,42 21,83 24,45 27,68 8,8 27,64 30,68 33,90 37,76 Nguồn: Boyd C. E. và Turker C.S., 1992 [10] Nitrite (N-NO2-): Das P. C. và ctv (2003) [12], William A. Wurts (2005) [32] và Thomas M. L. (1998) [17] đã chỉ ra rằng: “Nitrite đ−ợc sinh ra từ đạm amonia trong môi tr−ờng n−ớc. Hàm l−ợng N-NO2- th−ờng ít thấy trong môi tr−ờng ao nuôi trừ khi hàm l−ợng oxy hoà tan trong n−ớc thấp”. Trong thuỷ vực tự nhiên cũng nh− trong hệ thống lọc sinh học, N-NH4+ và NH3 đ−ợc vi khuẩn Nitơ sử dụng nh− là nguồn năng l−ợng cho sinh tr−ởng để chuyển hoá thành N-NO2 -, N-NO3 - (Boyd, 1990) [9]. Cá có thể hấp thụ cả hai dạng HNO2 và NO2 -. Sự phân ly của axit HNO2 nh− sau: HNO2 = H + + NO2 - Sự điện li của axit HNO2 thành NO2 - phụ thuộc vào giá trị pH. Trong hệ thống nuôi thuỷ sản, nitrit chiếm chủ yếu và đ−ợc động vật hấp thụ. N-NO2- đ−ợc hấp thụ rất nhanh qua mang bởi các tế bào lá chloride (Trích Boyd, 1990) [9]. Robert M. Durborow, David M. Crosby và Martin W. Brunson (1997a,b) [21, 22] cho rằng: “Nếu môi tr−ờng thiếu O2 thì quá trình chuyển hoá chỉ đến nitrite (NO2-). Khi động vật thuỷ sản hấp thu nitrite và phản ứng với Hemoglobin trong máu tạo thành Methemoglobin”. Hb + NO2 - = Met- Hb Phản ứng này đã làm Fe trong nhân Hb của máu cá bị oxy hoá thành 18 Methemoglobin không có khả năng vận chuyển oxy làm cho máu của cá chuyển sang màu nâu và gây độc cho cá (Boyd, 1990) [9] và Jane Frances và ctv (1998) [16]. Boyd (1990) cho rằng: “Một vài loài cá có thể làm giảm hàm l−ợng Methemoglobin để trở lại Hemoglobin qua hoạt động khử của Methemoglobin. Khi nồng độ nitrite trong n−ớc giảm hoặc cá chuyển sang môi tr−ờng sống có nồng độ thấp, chúng sẽ loại bỏ đ−ợc độc tố của nitrite sau 24h”. Trong n−ớc mặn và n−ớc lợ, hàm l−ợng của ion Ca+ và Cl- cao. hai ion này có xu h−ớng làm giảm tính độc của NO2- (Tomassco và ctv, 1979, trích từ Michael B. T. và Losordo T. M. 1994) [19], Nguyễn Đình Trung (2002) [7] cho rằng: Các nhân tố ảnh h−ởng đến tính độc của N-NO2- là hàm l−ợng chloride trong n−ớc, pH, tình trạng sức khỏe của động vật, tình trạng dinh d−ỡng và hàm l−ợng oxy hoà tan. Vì thế, những yếu tố này ảnh h−ởng đến nồng độ an toàn hay nồng độ gây chết của nitrite đối với động vật thuỷ sản. ao nuôi n−ớc chảy hay ao thay n−ớc cũng làm giảm nồng độ nitrite. Mặc dù N-NO2 - không độc bằng N-NH4 + và N-NH3 nh−ng nó cũng gây hại tới động vật thuỷ sản vì thế chúng cần kiểm soát trong bể −ơng. Trong hệ thống lọc sinh học, hàm l−ợng nitrite không v−ợt quá 10 mg/L trong thời gian dài và nhiều tr−ờng hợp duy trì d−ới 1 mg/L (Losordo Thomas M., 1998) [17]. Nitrate (N- NO-3): Nitrate th−ờng không gây độc cho động vật thủy sản, nh−ng khi nồng độ nitrate trong môi tr−ờng n−ớc quá cao gây tác động đến động vật thủy sinh (Nguyễn Đình Trung, 2002) [7]. Điều này cũng đ−ợc Thomas M. L. (1998) [17] nhận định: “Khi hàm l−ợng nitrate trong môi tr−ờng nuôi cao sẽ không có lợi cho nuôi trồng thuỷ sản”. Độ mặn càng cao tính độc của nitrate giảm từ 300 - 400 lần (Nguyễn Đình Trung, 2002 [7] và Su - Jun Tsai và ctv, 2002 [26]). Các nghiên cứu chỉ ra rằng: “Trong hệ thống nuôi, các loài thuỷ sinh vật có thể chịu đựng N-NO3 - ở nồng độ cao (>100 - 300 mg/L tùy thuộc theo loài)”. 19 2.3.4. Các nghiên cứu về tính độc của hợp chất nitơ đối với động vật thuỷ sản Amonia(N- NH4+): Trong môi tr−ờng n−ớc, amonia tổng số luôn tồn tại ở 2 dạng: NH3và NH4+ tuỳ thuộc vào nhiệt độ và pH của môi tr−ờng n−ớc. Khi hàm l−ợng NH3 < 0,06mg/L làm chậm quá trình sinh tr−ởng và thay đổi mô của cá da trơn. NH4+ th−ờng ít độc hơn NH3 nh−ng khi nồng độ cao cũng gây độc cho động vật thuỷ sinh [20, 25]. Vì vậy, amonia th−ờng xuyên đ−ợc quản lý trong hệ thống nuôi. Các nghiên cứu về tính độc của monia chủ yếu tập trung vào ảnh h−ởng của NH3 còn các nghiên cứu về nồng độ tác động của NH4 + đến động vật thuỷ sinh rất ít, mới chỉ dừng lại ở các nghiên cứu tác động đến sinh tr−ởng của thực vật phù du trong môi tr−ờng n−ớc. Nitrite (N- NO2-): Tính độc của nitrite biến đổi rất rộng giữa các loài, thậm chí trong cùng một loài (Jane Frances và ctv, 1998) [16]. Giá trị LC50 96h của nitrite với giáp xác, nhuyễn thể và cá, đã đ−ợc Colt và Armstrong (1981) xác định nằm trong khoảng 27,88 – 50,51 mg N–NO2/lít, và nồng độ an toàn từ 2,79 – 5,05 mg N–NO2/lít. Nhiều nghiên cứu về tính độc của nitrrite đối với giáp xác và nhuyễn thể đ−ợc thể hiện trong bảng sau: 20 Bảng 2.7. Giá trị NOEC của nitrite đối với một số loài cá Qua bảng trên cho thấy: Giới hạn an toàn cho bào ng− (Haliotis tuberculata) lớn hơn cho cầu gai. Giá trị an toàn cho tôm giống P. penicillatus với độ mặn khác nhau: Độ mặn cao tính độc của nitrite giảm. Daniels và ctv (1987 - trích Boyd, 1990) [9], ở nồng độ 1,8 mg/L N–NO2 tỷ lệ tăng tr−ởng của tôm M. rosenbergii giảm 35% so với lô đối chứng sau 8 ngày theo dõi . Nitrate (N-NO3 -): Colt và Tchobanoglous (1976) (trích Su - Jun Tsai và ctv, 2002) [26] đã kết luận: “Độc tố của nitrate phụ thuộc vào loài, giai đoạn phát triển. Tuy nhiên, mức an toàn của nitrate đối với các loài hải sản ở giai đoạn tr−ởng thành t−ơng tự nhau”. Bảng 2.8. Giá trị NOEC của một số đối t−ợng thủy sản đối với độc tố nitrate Loài thí nghiệm NOEC (mg/L) Nguồn Cá hồi chấm (n−ớc ngọt) 10,56 Daniels và ctv, 1987 (trích Boyd, 1990) [9] ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon) 4,46 Sprague, 1971 trích Su - Jun Tsai (2002) [26] 14,76 Daniels và ctv, 1987 (trích Boyd, 1990) [9] ấu trùng tôm Penaeus lividis 3,28 - 6,56 Armstrong và ctv, 1976 trích Su - Jun Tsai (2002) [26] ấu trùng tôm P. indicus 0,59 Jayasankar và Muthu 1983 trích Su - Jun Tsai (2002) [26] Tôm giống P. penicillatus S ‰ = 34 S ‰ = 25 13,41 11,74 Chen và Lin, 1992 trích Su - Jun Tsai (2002) [26] Cầu gai (Paracentrotus lividus) 3,28 - 6,56 Oliver và Michel, 1999 [20] Bào ng− (Haliotis tuberculata) 16,40 Oliver và Michel, 1999 [20] Loài thí nghiệm NOEC (mg/L) Nguồn Cá da trơn (n−ớc ngọt) 443,00 Colt và Armstrong, 1981 trích Su - Jun Tsai (2002) [26] Cầu gai (Paracentrontus lividus) 443,00 Florenda I. và ctv, 1995 [14] Bào ng− (Haliotis tuberculata) 443,00 – 1107,50 Florenda I. và ctv, 1995 [14] 21 Nhiều tác giả khác đã cho rằng nitrate th−ờng không gây độc. Nh−ng trong hệ thống nuôi bán kín hoặc kín, nitrate th−ờng ở mức cao hơn trong n−ớc biển tự nhiên (Kinne, 1976). Phần lớn các phân tích về mức gây độc của nitrate với hàm l−ợng khá cao, Colt và Armstrong (1981) trích Florenda I. và ctv, 1995 [14] đ−a ra giá trị LC50 dao động quanh 1000mg N–NO3 -/lít, t−ơng đ−ơng với mức an toàn là 100mg N– NO3 -/lít đối với cá da trơn. Mức an toàn cho cầu gai (P. lividus) đã đ−ợc xác định trong khoảng 100mg N–NO3 -/lít và 100 – 250mg N–NO3 -/lít cho bào ng− (H. tuberculata). Su - Ju Tsai và ctv (2002) [26], đã công bố kết quả nghiên cứu về tính độc cấp của nitrate đối với ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon) ở cùng một giai đoạn phát triển với các độ mặn khác nhau nh− sau: giá trị LC50 ở 96h với các độ mặn 15‰, 25‰ và 35‰ lần l−ợt là 1449 mg/L, 1575 mg/L và 2316 mg/L. Điều này chứng tỏ: “Độ mặn càng cao tính độc của nitrate trên cùng một đối t−ợng, cùng một giai đoạn phát triển của cá thể càng giảm”. Điều này đ−ợc minh chứng bằng các kết quả của Grabda và ctv (1974) trích Su - Ju Tsai và ctv (2002) [26] : “Hàm l−ợng NO-3 ở mức 5 mg/L đã gây độc với các loài cá n−ớc ngọt trong khi đó với cá hồi mức gây độc của NO3- cao hơn”. ấu trùng tôm sú (P. monodon) dễ bị ảnh h−ởng ở nồng độ cao từ 2 - 20mg NO3-/lít (Muir, 1991) trích Florenda I. và ctv (1995) [14]. Trên thế giới, các nghiên cứu về tính độc của dinh d−ỡng khoáng mới chỉ tiến hành trên giáp xác, và một số loài cá n−ớc ngọt còn đối với cá n−ớc mặn ch−a đ−ợc thí nghiệm hoặc thí nghiệm rất ít đặc biệt với các đối t−ợng cá kinh tế. ở Việt Nam, ch−a có thí nghiệm nào để xác định tính độc của các dinh d−ỡng khoáng. Ng−ỡng gây chết của độc tố về dinh d−ỡng khoáng đ−ợc áp dụng cho quản lý môi tr−ờng −ơng nuôi chủ yếu dựa vào kết quả của n−ớc ngoài và đối t−ợng nuôi thủy sản khác, không phù hợp với điều kiện sinh thái và điều kiện nuôi của n−ớc ta. Vì vậy, việc tiến hành thí nghiệm độc tố của các dinh d−ỡng khoáng (N-NH4+, N-NO2- và N-NO3 -) đối với cá biển nói chung và cá Giò nói riêng là cần thiết. Góp phần quan trọng trong quản lý môi tr−ờng −ơng nuôi cá biển khi áp dụng công nghệ lọc 22 sinh học để chủ động sản xuất giống nhân tạo, không phụ thuộc vào con giống tự nhiên và hạn chế nhập giống từ n−ớc ngoài. Tạo ra l−ợng con giống đủ về số l−ợng và đảm bảo về chất l−ợng (sạch bệnh). 2.5. ảnh h−ởng của độc tố đối với động vật thuỷ sản Mỗi loại hoá chất khác nhau ảnh h−ởng đến động vật thuỷ sản (ĐVTS) rất khác nhau. Loài nào có tính mẫn cảm cao, sức chịu đựng yếu thì chịu tác động của hoá chất mạnh và ng−ợc lại. Cá có vẩy chịu đựng cao hơn cá da trơn. Trong cùng một loài, các giai đoạn phát triển khác nhau chịu ảnh h−ởng bởi cùng một loại hoá chất là khác nhau. Cá ở giai đoạn ch−a tr−ởng thành mẫn cảm với hoá chất mạnh hơn cá ở giai đoạn tr−ởng thành. Mặc dù cùng loài, cùng tuổi, cùng môi tr−ờng sống nh−ng sức chịu đựng của từng cá thể cũng khác nhau, con khoẻ mạnh bị ảnh h−ởng ít hơn con yếu (Bùi Quang Tề, 1997) [6]. Hoá chất vào cơ thể bằng nhiều con đ−ờng khác nhau, có thể vào hệ tuần hoàn qua cơ quan hô hấp hay thẩm thấu qua da từ môi tr−ờng ngoài (Waiker, Hopkin & Peakall, 1996) [31]. Hình 2.2. Sự hấp thụ, l−u thông và bài tiết hoá chất trong động vật thuỷ sản (Guthrie & Perry, 1980 - Trích Waiker, Hopkin, Sibly & Peakall, 1996) [31] Môi tr−ờng ngoài Mang Ruột Gan/Hệ tiêu hoá N−ớc Thức ăn Máu/Hệ tuần hoàn Thận Môi tr−ờng 23 2.5.1. ảnh h−ởng trực tiếp Gây chết: Hầu hết các loại hoá chất đều gây độc đối với ĐVTS, nếu v−ợt quá giới hạn cho phép thì ĐVTS bị ngộ độc và nếu kéo dài sẽ chết hàng loạt. Trao đổi chất: Khi môi tr−ờng n−ớc bị ô nhiễm hoá chất, quá trình trao đổi chất của ĐVTS tăng do phản ứng của cơ thể nhằm bài tiết các chất độc: khi đó c−ờng độ hô hấp của sinh vật tăng, vận động mạnh, máu l−u thông nhanh, hệ bài tiết hoạt động mạnh, cá ngừng ăn và hoạt động của hệ tiêu hoá giảm. Nếu môi tr−ờng có hoá chất kéo dài và v−ợt quá nồng độ cho phép thì quá trình trao đổi chất giảm dần và ngừng hẳn. Quá trình trao đổi chất tỷ lệ nghịch với tỷ lệ chết của động vật thuỷ sinh (Waiker & Hopkin, 1996) [31]. Cấu trúc mô: Trong môi tr−ờng n−ớc có hoá chất làm cho sinh vật bị biến đổi nh− sự thay đổi áp suất thẩm thấu trong và ngoài màng tế bào biểu mô làm tế bào biểu mô biến dạng. Tuy nhiên, ảnh h−ởng của hoá chất tới cấu trúc mô mang của cá thể hiện rõ nhất ngay sau khi bắt đầu thí nghiệm. Vì mang cá là cơ quan hô hấp chủ yếu - nơi tiếp xúc trực tiếp với hoá chất nên có thể gây các hiện t−ợng: sợi mang co lại và dính với nhau, tế bào dịch nhờn ở mang cá tăng lên, kích th−ớc tế bào biểu mô phình to, các vi động mạch ly tâm và h−ớng tâm bị phá vỡ làm cho các tế bào máu tập trung lại một chỗ. nếu cá bị nhiễm độc kéo dài sẽ gây hoại tử mô mang (Kanchanakhan, 1991 - trích [31]). Cruz & Pitogo (1989) [11], cho rằng: “Từng phần mô của sinh vật đ−ợc phục hồi dần sau 10 ngày sống trong môi tr−ờng không có hoá chất” 2.5.2. ảnh h−ởng gián tiếp Enzym: Một số hoá chất có tác dụng xúc tác một số enzym hoạt động mạnh nh−ng lại ức chế hoạt động của một số enzym khác. Nếu hoá chất v−ợt quá giới hạn cho phép sẽ gây ra nhiều hậu quả khác nhau: sự biến đổi của các enzym O6 – methylguanine – 24 DNA – methyltransferase gây sửa chữa AND. Hoạt động của enzym này có thể thấy trong gan nh−ng nó chỉ xuất hiện khi có sự biến đổi của O6 – alkyguanie enzym (Alexander, 1994) trích [31]. Hình 2.3. ảnh h−ởng của hoá chất tới ĐVTS gây biến đổi vật chất di truyền (Waiker, Hopkin, Sibly & Peakall, 1996) [31] Hệ thần kinh: Hệ thần kinh là một trong những cơ quan chịu ảnh h−ởng nhiều nhất ngay sau khi môi tr−ờng bị ô nhiễm vì động vật thủy sản có hệ thần kinh cảm giác nằm d−ới da và mang. Nếu môi tr−ờng ô nhiễm kéo dài sẽ ức chế dẫn truyền xung thần kinh, làm tê liệt sự chỉ đạo của thần kinh trung −ơng, dẫn tới quá trình trao đổi chất bị rối loạn và cơ thể ngừng hoạt động. Theo Donald & Gary (1996) trích [11], cơ chế tác dụng của hoá chất tới hệ thần kinh gồm: - ức chế hoạt động của enzym AchE: enzym này nằm tiếp giáp giữa hai tế bào thần kinh (synap), có tác dụng truyền xung thần kinh từ tế bào này sang tế bào kế tiếp. Vì vậy, khi enzym này bị ức chế thì quá trình truyền xung thần kinh bị ngừng. - Khi môi tr−ờng ô nhiễm có chứa ion kim loại nặng, các ion này vào tế bào nhờ thẩm thấu làm thay đổi áp suất thẩm thấu giữa trong và ngoài màng tế bào thần kinh làm quá trình truyền tín hiệu bị rối loạn. Sinh vật phù du: Trong ao nuôi thuỷ sản, thực vật phù du là tác nhân sinh học trong quá trình tự làm sạch môi tr−ờng do sự hấp thụ mạnh các muối dinh d−ỡng đặc biệt là amonia, Giải độc Hệ enzym Monoygenese Hoá chất Hoạt tính của enzym Tác dụng ADN Ung th−Sửa chữa ADN Trạng thái đầu Biến đổi ADN 25 sản phẩm của qúa trình phân huỷ chất hữu cơ, thức ăn thừa và sản phẩm thải của động vật thuỷ sản, hạn chế mức độ gây độc của các dinh d−ỡng khoáng này. Nh−ng ở các thuỷ vực bị ô nhiễm bởi các dinh d−ỡng khoáng, sinh vật phù du phát triển mạnh làm giảm l−ợng oxy vào sáng sớm, gây biến động pH trong ngày. Khi thực vật phù du đạt sinh khối cao, một số loài tảo bị tàn lụi do thiếu ánh sáng sinh ra các khí độc do quá trình phân huỷ của vi sinh vật, gây thiếu hụt oxy, làm chết cá và các động vật thuỷ sinh khác (Nguyễn Đình Trung, 2002) [7]. 2.6. Các thí nghiệm về độc tố Tuan P. A. (1992) [27], cho rằng: “Mục đích của thí nghiệm độc tố là xác định giới hạn chịu đựng, mức độ ảnh h−ởng tới động vật thuỷ sinh của các loại độc tố và các chất gây ô nhiễm. Từ đó đ−a ra tiêu chuẩn giới hạn về tính độc cho động vật thuỷ sinh”. Thí nghiệm cấp tính hay mãn tính về hoá chất là một trong những ph−ơng thức th−ờng đ−ợc dùng để −ớc l−ợng tính độc của hoá chất đó (Murty, 1986) trích [27]. Độc tố có thể đánh giá bằng hai loại thí nghiệm: tính độc cấp và tính độc mãn (APHA, 1985) [8]. - Thí nghiệm tính độc cấp: Xác định ảnh h−ởng của chất ô nhiễm tới động vật thuỷ sinh dựa vào tỷ lệ chết, các biến đổi sinh lý, sinh hoá và hoạt động sống của sinh vật. - Thí nghiệm tính độc mãn: Tìm ra ảnh h−ởng của chất gây ô nhiễm tới sinh tr−ởng, sinh sản, sự biến đổi các cấu trúc mô và sự tích tụ hoá chất trong cơ thể sinh vật. Mỗi loại thí nghiệm độc tố khác nhau mục đích sử dụng cũng khác nhau. Thí nghiệm tính độc cấp và tính độc mãn là thí nghiệm xác định nồng độ gây chết trung bình hay LC50 (nồng độ gây chết 50% cá thí nghiệm theo thời gian t−ơng ứng). 2.6.1. Điều kiện của thí nghiệm độc tố Theo APHA (1985) [8] và USEPA (2002a) [29] thí nghiệm về độc tố dựa trên các điều kiện cơ bản sau: 26 - Nguồn n−ớc đ−ợc đảm bảo đủ về số l−ợng, tốt về chất l−ợng, các yếu tố môi tr−ờng đảm bảo chất l−ợng: pH, nhiệt độ, độ mặn, l−ợng ôxy hoà tan …, hàm l−ợng một số chất khác nằm trong giới hạn cho phép để sinh vật thí nghiệm tồn tại và phát triển. - Mật độ nuôi, cách thuần hoá, điều kiện nuôi d−ỡng tốt, đảm bảo cho sinh vật khoẻ mạnh đ−ợc so sánh với lô thí nghiệm đối chứng (lô không có độc tố). - Có các trang thiết bị cần thiết đảm bảo tiêu chuẩn. - Thí nghiệm đ−ợc bố trí ngẫu nhiên, các yếu tố phi thí nghiệm đồng đều nhau. - Thời gian thí nghiệm cấp tính ít nhất là 96h hay ít nhất là một giai đoạn phát triển của sinh vật. - Trong thí nghiệm độc tố phải đảm bảo tỷ lệ chết ở lô đối chứng luôn <10%. Nhiệt độ ở đầu và cuối thí nghiệm dao động trong khoảng ± 0,50C (không thay đổi quá 10C). 2.6.2. Các loại thí nghiệm độc tố Theo USEPA (2002a) [29], thí nghiệm về độc tố th−ờng sử dụng các dạng sau: • Thí nghiệm tĩnh: Trong thí nghiệm tĩnh có hai loại: thí nghiệm tĩnh thay n−ớc và thí nghiệm tĩnh không thay n−ớc trong suốt quá trình thí nghiệm. - Thí nghiệm tĩnh không thay n−ớc: Ưu điểm: Đơn giản rẻ tiền, phù hợp với điều kiện cho phép, có hiệu quả. Hạn chế đ−ợc các yêu cầu về không gian, nhân lực… cho phép các thành viên tiến hành nhiều thí nghiệm trong cùng một thời gian. Thí nghiệm đòi hỏi cung cấp một l−ợng n−ớc và hóa chất ít hơn thí nghiệm thay n−ớc và thí nghiệm dòng chảy. Nh−ợc điểm: Thiếu hụt oxy hòa tan do nhu cầu cao về COD và BOD hay do sự chuyển hóa của các sản phẩm bài tiết. Độc tố có thể bị giảm hay mất do bay hơi và hấp thụ. 27 - Thí nghiệm tĩnh có thay n−ớc: Ưu điểm: Thí nghiệm này giảm đ−ợc sự thiếu hụt oxy do nhu cầu về BOD, COD hay ít bị tác động từ sự phân hủy các sản phẩm bài tiết từ sinh vật thí nghiệm. sự mất đi của độc tố qua bay hơi và hấp thu (bám) vào thành của bể thí nghiệm có thể đ−ợc hạn chế. Tr−ớc khi thay n−ớc sinh vật thí nghiệm đ−ợc cho ăn nên có thể tăng năng l−ợng dự trữ và duy trì ở trạng thái khỏe hơn. Nh−ợc điểm: Đòi hỏi một l−ợng n−ớc lớn hơn thí nghiệm không thay n−ớc. Th−ờng ít đ−ợc sử dụng hơn thí nghiệm dòng chảy bởi vì độc tố có thể bị chuyển hóa hay hấp thụ, do đó hàm l−ợng độc tố bị giảm hoặc tăng do thay n−ớc. • Thí nghiệm dòng liên tục: Thí nghiệm dòng liên tục có n−ớc đ−ợc thay tuần hoàn, loại thí nghiệm này áp dụng cho thí nghiệm có nồng độ thí nghiệm nh− nhau và th−ờng đ−ợc sử dụng cho đối t−ợng thí nghiệm là các sinh vật nhỏ hay sinh vật ở giai đoạn ít tuổi. Bố trí thí nghiệm dòng phải đảm bảo: Nhiệt độ, dòng chảy thích hợp và dòng n−ớc mới ít nhất là 90% trong ngày, bổ sung 5% nồng độ độc tố so với ban đầu sau mỗi ngày thí nghiệm. - Ưu điểm: Cung cấp cho thí nghiệm tính độc cấp đánh giá đại diện hơn do nồng độ độc tố bị mất đi trong quá trình thí nghiệm. Thí nghiệm này có thể giảm đ−ợc sự mất đi của độc tố qua bay hơi, hấp thu và chuyển hóa. Hàm l−ợng oxy hòa tan dễ đ−ợc duy trì hơn và chất l−ợng n−ớc luôn đ−ợc duy trì tốt trong thời gian thí nghiệm. - Nh−ợc điểm: Thể tích n−ớc và l−ợng độc tố (hóa chất) lớn. Thí nghiệm tốn kém, phức tạp, đòi hỏi sự chăm sóc và nuôi d−ỡng nhiều. Thí nghiệm đòi hỏi không gian cho thiết kế lớn và các trang thiết bị phục vụ thí nghiệm tốn kém. 28 thí nghiệm khó có thể áp dụng một cách chính xác hay liên tục vì nó liên quan đến nhiều phần khác nhau của hệ thống thí nghiệm. Trong điều kiện của Việt Nam ch−a áp dụng đ−ợc thí nghiệm này vì thí nghiệm theo ph−ơng pháp trên đòi hỏi chi phí cao và phải có hệ thống thiết bị đo các yếu tố gây độc (thiết bị thí nghiệm) đi kèm. Vì vậy, trong thí nghiệm của chúng tôi áp dụng thí nghiệm tĩnh có thay n−ớc. 29 3. Đối t−ợng, Thời gian, địa điểm và Ph−ơng pháp nghiên cứu 3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm - Thời gian: Tháng 5 - 8/2005 - Địa điểm: Trạm nghiên cứu Biển, Viện Tài Nguyên và Môi Tr−ờng biển Hải Phòng 3.2. Vật liệu thí nghiệm • Đối t−ợng: - Cá: Cá Giò 20 và 40 ngày tuổi lấy từ Trại sản xuất giống Ngọc Hải - Đồ Sơn, Hải Phòng. - Hoá chất: Hoá chất thí nghiệm: NH4Cl, NaNO2 và NaNO3 tinh khiết nhập từ Trung Quốc, hóa chất đ−ợc sấy khô bằng tủ sấy tr−ớc khi sử dụng. Dung dịch gốc cho thí nghiệm độc tố: N- NH4 +: 50mg/ml Trong đó: 3,819g NH4Cl có 1g N- NH4 + N- NO2 -: 100mg/ml Trong đó: 4,925g NaNO2 có 1g N- NO2 - N- NO3 -: Hóa chất tinh khiết Trong đó: 6,0681g NaNO3 có 1g N- NO3 - Dung dịch gốc đ−ợc bảo quản ở nhiệt độ 40C. Hóa chất/dung dịch gốc đ−ợc hoà tan vào n−ớc thí nghiệm rồi mới cho vào bể. Dùng micropipet để lấy hóa chất vào bể thí nghiệm. • Dụng cụ: - Bể kính 30 lít, máy sục khí, cân phân tích, cân tiểu li với độ chính xác 0,02g, th−ớc kẹp (độ chính xác 0,01cm), dây khí… • N−ớc thí nghiệm: 30 N−ớc đ−ợc bơm từ cửa sông vào bể lắng, lọc qua cát và đ−a vào bể chiếu đèn cực tím (12h), sau đó đ−ợc chuyển tới các bể thí nghiệm. N−ớc tr−ớc khi sử dụng đ−ợc kiểm soát chất l−ợng qua phân tích đánh giá theo các tiêu chuẩn cho phép, đặc biệt là các chất thí nghiệm có sẵn trong n−ớc. 3.3. Ph−ơng pháp thí nghiệm Ph−ơng pháp thí nghiệm dựa theo APHA (1985) [8] và UNEP (1989) [28]. 3.3.1. Chuẩn bị thí nghiệm • Thuần hoá cá Thí nghiệm đ−ợc tiến hành ngay trong Trại sản xuất nên không cần thời gian thuần hoá cá, do cùng nguồn n−ớc và điều kiện môi tr−ờng. Chọn cá khoẻ mạnh, không dị hình và bị bệnh đ−a vào bể thí nghiệm tr−ớc hai ngày để làm quen với điều kiện thí nghiệm sau đó mới tiến hành cho hoá chất. • Bố trí Thí nghiệm đ−ợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức gồm 5 nồng độ khác nhau (nồng độ sau gấp đôi nồng độ tr−ớc) và một lô đối chứng (sơ đồ). Mỗi công thức lặp lại 3 lần và mỗi thí nghiệm lặp lại 2 lần (với thí nghiệm xác định LC50) còn với thí nghiệm xác định dãy giới hạn nồng độ mỗi công thức lặp lại 2 lần. Các yếu tố phi thí nghiệm đồng đều nhau. Lần lặp 1 ĐC C1 C2 C3 C4 C5 Lần lặp 2 ĐC C1 C2 C3 C4 C5 Lần lặp 3 ĐC C1 C2 C3 C4 C5 Hình 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3.3.2. Tiến hành thí nghiệm 31 • Thí nghiệm tìm d∙y giới hạn nồng độ gây chết (Thí nghiệm thử) Mục đích: Tìm ra nồng độ hoá chất thấp nhất gây chết 100% cá thí nghiệm và nồng độ hoá chất cao nhất không gây chết cá thể nào. Thí nghiệm tiến hành trong 48h, giờ đầu theo dõi 15 phút một lần, giờ tiếp theo mỗi giờ theo dõi hai lần, sáu giờ tiếp theo theo dõi hai lần, thời gian còn lại cứ 6 giờ theo dõi một lần cho tới khi kết thúc thí nghiệm. Tr−ớc khi cho hoá chất vào bể thí nghiệm, thay 50% (10lít) n−ớc trong bể, hoà tan hoá chất vào 10 lít n−ớc, dùng máy bơm chìm (dùng cho nuôi cá cảnh) hút vào bể thí nghiệm. Thức ăn cho sinh vật thí nghiệm (artemia và tép đã bóc vỏ) đ−ợc rửa lại bằng n−ớc thí nghiệm tr−ớc khi cho ăn để loại bỏ vi sinh vật. Bảng 3.1. Điều kiện thí nghiệm xác định dãy giới hạn nồng độ Các yếu tố Cá tr−ớc biến thái Cá sau biến thái Thời gian thí nghiệm (h) 48 48 Tuổi cá (ngày) - Chiều dài trungbình (cm) - Trọng l−ợng trung bình (g) 20 4,0 0,24 40 7,9 – 9,2 2,57 Số l−ợng cá thí nghiệm (con) 20 10 Thể tích n−ớc thí nghiệm (l) 20 20 Thức ăn Artemia (mật độ 5 - 7con/ml) Tép (cỡ 0,6 – 0,8mm) S‰ 25 20 Chế độ thay n−ớc (%/ngày) 100 100 Thời gian chiếu sáng (h/ngày) 13 (từ 7 - 20h) 13 (từ 7 - 20h) Dãy nồng độ của thí nghiệm này đ−ợc ghi trong bảng 3.2. Bảng 3.2. Nồng độ hoá chất trong thí nghiệm thử Nồng độ hoá chất (mg/L) N-NH4 + N-NO2 - N-NO3 - Công thức thí nghiệm Cá tr−ớc biến thái Cá sau biến thái Cá tr−ớc biến thái Cá sau biến thái Cá tr−ớc biến thái Cá sau biến thái Đối chứng 0 0 0 0 0 0 CT 1 5 10 5 10 100 800 CT 2 10 20 10 30 200 1200 CT 3 30 40 30 60 400 2400 CT 4 50 60 50 90 800 3800 CT 5 100 80 100 120 1600 4000 32 • Thí nghiệm: Xác định LC50, EC50 và NOEC ở 96h Mục đích: Xác định nồng độ hoá chất gây chết 50% cá thí nghiệm theo thời gian t−ơng ứng. Những cơ thể yếu (chết) và thức ăn thừa đ−ợc vớt ra ngay sau khi cho cá ăn để tránh quá trình phân huỷ của vi sinh vật ảnh h−ởng tới chất l−ợng n−ớc (yếu tố thí nghiệm) và các cá thể khác trong thí nghiệm (bảng 3.3). Bảng 3.3. Điều kiện thí nghiệm xác định LC50, EC50 và NOEC Các yếu tố Cá tr−ớc biến thái Cá sau biến thái Thời gian thí nghiệm (h) 96 96 Tuổi cá (ngày) - Chiều dài trung bình (cm) - Trọng l−ợng trung bình (g) 22 4,5 0,28 42 8,0 - 9,0 1,6 – 2,7 Số l−ợng cá thí nghiệm (con) 20 10 Thể tích n−ớc thí nghiệm (l) 20 20 Thức ăn Artemia (mật độ 5 - 7con/ml) Tép (cỡ 0.6 - 0.8mm) S‰ 25 20 Chế độ thay n−ớc (%/ngày) 100 200 Thời gian chiếu sáng (h/ngày) 13 (từ 7 - 20h) 13 (từ 7 - 20h) Dựa vào kết quả của thí nghiệm xác định dãy giới hạn nồng độ chúng tôi đ−a ra dãy nồng độ để tiến hành bố trí thí nghiệm tìm nồng độ gây chết 50% (LC50%) ở 24, 48, 72 và 96h (Bảng 3.4). Số cá chết trong thí nghiệm đ−ợc ghi lại ở 1, 3, 6, 12, 24, 48, 72 và 96h sau thời gian bắt đầu thí nghiệm. Bảng 3.4. Nồng độ hoá chất trong thí nghiệm xác định LC50, EC50, NOEC Nồng độ hoá chất (mg/L) N-NH4 + N-NO2 - N-NO3 - Công thức thí nghiệm Cá tr−ớc biến thái Cá sau biến thái Cá tr−ớc biến thái Cá sau biến thái Cá tr−ớc biến thái Cá sau biến thái Đối chứng 0 0 0 0 0 0 CT 1 5 20 5 10 200 800 CT 2 15 25 15 20 400 1200 CT 3 25 35 30 40 800 1600 CT 4 35 40 60 50 1200 1800 CT 5 50 45 90 60 1400 2400 33 • Theo dõi sinh vật bị tác động: Mục đích: Xác định nồng độ hoá chất tác động 50% sinh vật thí nghiệm. Sinh vật trong thí nghiệm bị tác động độc tố th−ờng có biểu hiện sau: + Sinh vật nằm sát đáy, hô hấp yếu, thân cá chuyển màu từ sắc sáng sang sẫm đen. + Sinh vật bơi lội không bình th−ờng, lao lên mặt n−ớc, bơi nghiêng không định h−ớng, mất thăng bằng. + Sinh vật bắt mồi kém, bài tiết ít hay không bài tiết. + Giảm tính h−ớng quang. + Sinh vật chết. 3.4. Ph−ơng pháp xác định nồng độ gây chết 50% (LC50), nồng độ tác động (EC50) và nồng độ không tác động (NOEC) Kết quả thí nghiệm đ−ợc xử lý trên phần mềm Exel và các phần mềm chuyên dụng sau: Probit Program version 1.5; Trimmed Spearman - Karber (TSK) program version 1.5 và Toxstat version 2.1. 3.4.1. Xác định nồng độ gây chết 50% (LC50) và nồng độ tác động 50% (EC50) Dựa vào số liệu cá chết và số liệu sinh vật bị tác động trong thời gian thí nghiệm để xác định các chỉ tiêu: LC50 và EC50 theo ph−ơng pháp của USPA (2002a, 2002b). Tuỳ thuộc dạng số liệu thu đ−ợc mà áp dụng ph−ơng pháp xử lý số liệu cho phù hợp (hình 3.1.). 34 Hình 3.2. Sơ đồ xác định LC50/EC50 cho thí nghiệm độc tố cấp tính • Hiệu chỉnh tỷ lệ chết: a) Tr−ờng hợp: Tỷ lệ sinh vật chết/bị tác động không đồng đều (tỷ lệ sinh vật chết/bị tác động ở nồng độ độc tố cao < tỷ lệ sinh vật chết/bị tác động ở nồng độ độc tố thấp) theo công thức sau: Có Số cá chết/ bị tác động trong thí nghiệm ít nhất 2 hoặc nhiều hơn 2 nồng độ có tỷ lệ chết/bị tác động hoàn toàn? Phần mềm Propit có phù hợp không? (Kiểm định bằng χ2) ít nhất một hoặc nhiều hơn 1 nồng độ có tỷ lệ chết/bị tác động hoàn toàn? Xác định LC50/EC50 bằng đồ thị Ph−ơng pháp Probit Tỷ lệ chết/bị tác động ở nồng độ thấp nhất bằng 0 và nồng độ cao nhất là 100%? Ph−ơng pháp Trimmed Sperman – Karber Ph−ơng pháp Sperman – Karber LC50/EC50 và khoảng tin cậy 95% Có Không Có Có Không Không Không 35 ( ) 2 P+P =P=P i1iis1is (1) Trong đó: Pis -1: Tỷ lệ sinh vật chết/bị tác động ở nồng độ độc tố thứ i- 1 sau khi hiệu chỉnh. Pis: Tỷ lệ sinh vật chết/bị tác động ở nồng độ độc tố thứ i sau khi hiệu chỉnh. Pi – 1: Tỷ lệ sinh vật chết/bị tác động ở nồng độ độc tố thứ i-1 tr−ớc khi hiệu chỉnh. Pi: Tỷ lệ sinh vật chết/ bị tác động ở nồng độ độc tố thứ i tr−ớc khi hiệu chỉnh. b) Tr−ờng hợp: Lô đối chứng có sinh vật chết/bị tác động, số liệu đ−ợc hiệu chỉnh theo công thức của Abbott (Finney, 1971) [trích 29, 30]. ( ) os osis ia P PP P − −= 1 (2) Trong đó: Pia: Số liệu đã đ−ợc hiệu chỉnh. Pos: Tỷ lệ sinh vật chết/ bị tác động quan sát ở lô đối chứng Pis: Tỷ lệ sinh vật chết/ bị tác động ở lô đối chứng sau khi hiệu chỉnh theo công thức 1. • Ph−ơng pháp Probit (Finney, 1978) [trích 29, 30] Điều kiện sử dụng: - Thí nghiệm có ít nhất 2 tỷ lệ sinh vật chết/ bị tác động hoàn toàn. - Trong thí nghiệm, tỷ lệ sinh vật chết/ bị tác động đồng đều nhau, tuân theo quy luật phân phối chuẩn Kiểm định bằng tiêu chuẩn χ2: Nếu χ2tính toán < χ2lý thuyết thì sử dụng mô hình Probit phù hợp. Ph−ơng pháp tính: - Tính χ2 theo công thức sau: ( ._.5% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 18.459 10.020 23.167 LC/EC 5.00 22.161 14.146 26.410 LC/EC 10.00 24.429 16.956 28.397 LC/EC 15.00 26.090 19.124 29.881 LC/EC 50.00 34.450 30.148 39.088 LC/EC 85.00 45.490 39.906 60.897 LC/EC 90.00 48.582 42.026 68.626 LC/EC 95.00 53.555 45.220 82.197 LC/EC 99.00 64.294 51.583 115.972 Bảng 12. Kết quả tính LC50 96h của N-NH4- c Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 20.0000 10 0 0.0000 0.0000 0.0048 25.0000 10 1 0.1000 0.1000 0.0615 35.0000 10 5 0.5000 0.5000 0.5167 40.0000 10 6 0.6000 0.6000 0.7488 45.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.8898 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 2.732 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits for N-NH4c Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper 84 LC/EC 1.00 21.167 12.490 25.663 LC/EC 5.00 24.463 16.479 28.455 LC/EC 10.00 26.425 19.065 30.124 LC/EC 15.00 27.837 21.007 31.350 LC/EC 50.00 34.689 30.574 38.416 LC/EC 85.00 43.229 38.948 53.783 LC/EC 90.00 45.539 40.651 59.088 LC/EC 95.00 49.192 43.150 68.182 LC/EC 99.00 56.850 47.959 89.739 Bảng 13. Kết quả tính LC50 96h của N-NO2- a Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 10 0 0.0000 0.0000 0.0022 20.0000 10 2 0.2000 0.2000 0.1053 40.0000 10 3 0.3000 0.3000 0.6340 50.0000 10 9 0.9000 0.9000 0.8040 60.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.8989 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 7.493 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits for N-NO2a Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 12.539 3.875 18.998 LC/EC 5.00 16.862 6.919 23.408 LC/EC 10.00 19.746 9.394 26.253 LC/EC 15.00 21.967 11.519 28.433 LC/EC 50.00 34.467 25.741 42.221 LC/EC 85.00 54.080 43.956 82.045 LC/EC 90.00 60.161 48.117 99.543 LC/EC 95.00 70.453 54.483 133.860 LC/EC 99.00 94.737 67.707 237.003 Bảng 14. Kết quả tính LC50 96h của N-NO2 -b Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion 85 Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 10 0 0.0000 0.0000 0.0048 20.0000 10 2 0.2000 0.2000 0.1194 40.0000 10 4 0.4000 0.4000 0.5931 50.0000 10 7 0.7000 0.7000 0.7551 60.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.8560 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 4.057 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits for N-NO2b Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 11.390 3.009 17.959 LC/EC 5.00 15.908 5.883 22.683 LC/EC 10.00 19.010 8.377 25.795 LC/EC 15.00 21.439 10.603 28.216 LC/EC 50.00 35.639 26.527 44.600 LC/EC 85.00 59.243 46.931 99.695 LC/EC 90.00 66.812 51.718 125.246 LC/EC 95.00 79.840 59.198 177.176 LC/EC 99.00 111.515 75.205 344.390 Bảng 15. Kết quả tính LC50 96h của N-NO2- c Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 10 0 0.0000 0.0000 0.0001 20.0000 10 1 0.1000 0.1000 0.0382 40.0000 10 3 0.3000 0.3000 0.5501 50.0000 10 8 0.8000 0.8000 0.7694 60.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.8918 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 4.835 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits for N-NO2c Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 16.337 4.821 23.716 LC/EC 5.00 20.952 8.317 28.095 LC/EC 10.00 23.925 11.093 30.836 LC/EC 15.00 26.166 13.448 32.900 86 LC/EC 50.00 38.203 28.805 45.559 LC/EC 85.00 55.777 46.647 83.447 LC/EC 90.00 61.002 50.295 100.096 LC/EC 95.00 69.656 55.707 132.299 LC/EC 99.00 89.335 66.514 226.466 Bảng 16. Kết quả tính LC50 96h của N-NO3- a- Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 800.0000 10 0 0.0000 0.0000 0.0017 1200.0000 10 2 0.2000 0.2000 0.1310 1600.0000 10 4 0.4000 0.4000 0.5636 1800.0000 10 8 0.8000 0.8000 0.7533 2400.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.9754 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 1.895 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits for N-NO3a Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 915.734 493.109 1128.067 LC/EC 5.00 1067.057 673.563 1255.919 LC/EC 10.00 1157.710 793.610 1332.911 LC/EC 15.00 1223.208 885.068 1389.781 LC/EC 50.00 1543.553 1344.632 1730.739 LC/EC 85.00 1947.795 1736.072 2536.183 LC/EC 90.00 2057.992 1814.702 2821.351 LC/EC 95.00 2232.830 1930.269 3316.758 LC/EC 99.00 2601.802 2153.375 4521.403 Bảng 17. Kết quả tính LC50 96h của N-NO3- b Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 800.0000 10 0 0.0000 0.0000 0.0001 1200.0000 10 1 0.1000 0.1000 0.0498 1600.0000 10 3 0.3000 0.3000 0.4358 1800.0000 10 7 0.7000 0.7000 0.6723 2400.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.9733 87 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 1.592 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits for N-NO3b Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 1051.909 599.272 1258.501 LC/EC 5.00 1200.363 794.498 1380.010 LC/EC 10.00 1287.899 921.248 1452.906 LC/EC 15.00 1350.558 1016.280 1506.864 LC/EC 50.00 1650.890 1468.478 1842.370 LC/EC 85.00 2018.009 1815.153 2633.220 LC/EC 90.00 2116.191 1883.940 2902.741 LC/EC 95.00 2270.511 1984.735 3363.651 LC/EC 99.00 2590.946 2177.626 4456.851 Bảng 18. Kết quả tính LC50 96h của N-NO3- c Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 800.0000 10 0 0.0000 0.0000 0.0013 1200.0000 10 2 0.2000 0.2000 0.1136 1600.0000 10 3 0.3000 0.3000 0.5271 1800.0000 10 8 0.8000 0.8000 0.7225 2400.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.9690 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 3.445 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits for N-NO3c Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 932.507 502.212 1147.526 LC/EC 5.00 1087.381 687.844 1278.183 LC/EC 10.00 1180.212 811.530 1357.001 LC/EC 15.00 1247.305 905.802 1415.335 LC/EC 50.00 1575.678 1377.090 1769.828 LC/EC 85.00 1990.501 1771.733 2615.139 LC/EC 90.00 2103.657 1851.488 2913.267 LC/EC 95.00 2283.249 1969.052 3431.194 LC/EC 99.00 2662.459 2196.646 4692.197 88 89 Phụ lục 4. Kết quả EC50 xử lý bằng phần mềm probit(Version 1.5) Phụ lục 4. 1. cá tr−ớc biến tháI Bảng 19. Kết quả tính EC50 96h của N-NH4- a Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 5.0000 20 0 0.0000 0.0000 0.0138 15.0000 20 9 0.4500 0.4500 0.3112 25.0000 20 10 0.5000 0.5000 0.6192 35.0000 20 14 0.7000 0.7000 0.7961 50.0000 20 20 1.0000 1.0000 0.9167 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 6.235 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits N-NH4a Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 4.622 1.720 7.431 LC/EC 5.00 7.158 3.396 10.340 LC/EC 10.00 9.038 4.864 12.371 LC/EC 15.00 10.579 6.184 13.995 LC/EC 50.00 20.575 16.094 25.002 LC/EC 85.00 40.018 32.111 58.259 LC/EC 90.00 46.839 36.613 73.497 LC/EC 95.00 59.141 44.112 104.542 LC/EC 99.00 91.588 61.762 205.069 Bảng 20. Kết quả tính EC50 96h của N-NH4- b Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls 90 Responding 5.0000 20 0 0.0000 0.0000 0.0114 15.0000 20 8 0.4000 0.4000 0.2933 25.0000 20 11 0.5500 0.5500 0.6033 35.0000 20 13 0.6500 0.6500 0.7860 50.0000 20 20 1.0000 1.0000 0.9123 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 5.687 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits N-NH4b Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 4.844 1.807 7.747 LC/EC 5.00 7.462 3.551 10.727 LC/EC 10.00 9.395 5.075 12.801 LC/EC 15.00 10.975 6.444 14.456 LC/EC 50.00 21.174 16.641 25.673 LC/EC 85.00 40.853 32.808 59.727 LC/EC 90.00 47.725 37.320 75.283 LC/EC 95.00 60.089 44.823 106.907 LC/EC 99.00 92.564 62.421 208.963 Bảng 21. Kết quả tính EC50 96h của N-NH4- c Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 5.0000 20 0 0.0000 0.0000 0.0072 15.0000 20 8 0.4000 0.4000 0.3180 25.0000 20 12 0.6000 0.6000 0.6718 35.0000 20 16 0.8000 0.8000 0.8531 50.0000 20 20 1.0000 1.0000 0.9546 91 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 2.633 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits N-NH4c Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 5.351 2.194 8.209 LC/EC 5.00 7.817 3.957 10.931 LC/EC 10.00 9.568 5.405 12.769 LC/EC 15.00 10.967 6.659 14.207 LC/EC 50.00 19.520 15.374 23.335 LC/EC 85.00 34.744 28.679 47.436 LC/EC 90.00 39.822 32.234 57.851 LC/EC 95.00 48.741 37.997 78.308 LC/EC 99.00 71.208 51.009 140.119 Bảng 22. Kết quả tính EC50 96h của N-NO2- a Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 5.0000 20 0 0.0000 0.0000 0.0041 15.0000 20 6 0.3000 0.3000 0.1901 30.0000 20 8 0.4000 0.4000 0.5940 60.0000 20 19 0.9500 0.9500 0.9120 90.0000 20 20 1.0000 1.0000 0.9775 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 5.589 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits for N-NO2a Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper 92 LC/EC 1.00 6.095 2.627 9.454 LC/EC 5.00 9.309 4.905 13.162 LC/EC 10.00 11.667 6.815 15.769 LC/EC 15.00 13.588 8.483 17.865 LC/EC 50.00 25.878 20.134 32.198 LC/EC 85.00 49.285 38.920 71.244 LC/EC 90.00 57.400 44.387 88.104 LC/EC 95.00 71.942 53.515 121.628 LC/EC 99.00 109.883 74.959 225.769 Bảng 23. Kết quả tính EC50 96h của N-NO2- b Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 5.0000 20 0 0.0000 0.0000 0.0261 15.0000 20 9 0.4500 0.4500 0.2843 30.0000 20 9 0.4500 0.4500 0.6159 60.0000 20 17 0.8500 0.8500 0.8769 90.0000 20 20 1.0000 1.0000 0.9521 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 6.702 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits for N-NO2b Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 3.671 1.324 6.321 LC/EC 5.00 6.339 2.925 9.699 LC/EC 10.00 8.481 4.442 12.245 LC/EC 15.00 10.323 5.869 14.379 LC/EC 50.00 23.689 17.679 30.562 LC/EC 85.00 54.360 40.986 84.399 LC/EC 90.00 66.165 48.501 110.661 LC/EC 95.00 88.528 61.675 166.832 93 LC/EC 99.00 152.845 95.276 366.047 Bảng 24. Kết quả tính EC50 96h của N-NO2-c Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 5.0000 20 0 0.0000 0.0000 0.0280 15.0000 20 9 0.4500 0.4500 0.2971 30.0000 20 10 0.5000 0.5000 0.6319 60.0000 20 17 0.8500 0.8500 0.8862 90.0000 20 20 1.0000 1.0000 0.9569 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 5.472 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits for N-NO2c Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 3.591 1.302 6.173 LC/EC 5.00 6.182 2.861 9.453 LC/EC 10.00 8.258 4.331 11.921 LC/EC 15.00 10.040 5.712 13.987 LC/EC 50.00 22.933 17.095 29.578 LC/EC 85.00 52.385 39.562 80.891 LC/EC 90.00 63.692 46.796 105.817 LC/EC 95.00 85.082 59.464 159.008 LC/EC 99.00 146.453 91.708 346.835 Bảng 25. Kết quả tính EC50 96h của N-NO3-a Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion 94 Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 200.0000 20 6 0.3000 0.3000 0.2419 400.0000 20 6 0.3000 0.3000 0.3756 800.0000 20 10 0.5000 0.5000 0.5263 1200.0000 20 11 0.5500 0.5500 0.6141 1400.0000 20 15 0.7500 0.7500 0.6463 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 2.199 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits for N-NO3a Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 10.553 0.005 55.812 LC/EC 5.00 36.208 0.164 119.865 LC/EC 10.00 69.866 1.041 181.449 LC/EC 15.00 108.875 3.610 241.521 LC/EC 50.00 710.030 407.942 1370.851 LC/EC 85.00 4630.468 1985.296 180684.656 LC/EC 90.00 7215.895 2637.109 627710.000 LC/EC 95.00 13923.618 3985.646 4003241.000 LC/EC 99.00 47770.535 8549.009 130801128.000 Bảng 26. Kết quả tính EC50 96h của N-NO3- b Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 200.0000 20 6 0.3000 0.3000 0.2145 400.0000 20 5 0.2500 0.2500 0.3797 800.0000 20 11 0.5500 0.5500 0.5708 95 1200.0000 20 13 0.6500 0.6500 0.6780 1400.0000 20 16 0.8000 0.8000 0.7156 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 3.104 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits for N-NO3 b Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 22.266 0.513 74.089 LC/EC 5.00 58.992 3.921 142.495 LC/EC 10.00 99.175 11.531 203.152 LC/EC 15.00 140.824 23.763 259.346 LC/EC 50.00 619.855 392.850 935.782 LC/EC 85.00 2728.382 1532.636 14308.445 LC/EC 90.00 3874.155 1960.426 29428.887 LC/EC 95.00 6513.131 2799.286 86398.703 LC/EC 99.00 17256.256 5390.685 659677.438 Bảng 27. Kết quả tính EC50 96h của N-NO3- c Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 200.0000 20 5 0.2500 0.2500 0.2035 400.0000 20 5 0.2500 0.2500 0.3048 800.0000 20 8 0.4000 0.4000 0.4238 1200.0000 20 10 0.5000 0.5000 0.4977 2400.0000 20 13 0.6500 0.6500 0.6228 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 0.660 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 96 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits for NO3 1c Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 7.699 0.001 50.554 LC/EC 5.00 33.909 0.068 126.193 LC/EC 10.00 74.747 0.699 207.970 LC/EC 15.00 127.434 3.320 294.710 LC/EC 50.00 1215.016 695.316 4444.814 LC/EC 85.00 11584.559 3592.406 2717045.000 LC/EC 90.00 19750.127 5017.913 13088430.000 LC/EC 95.00 43536.457 8180.621 135307216.000 LC/EC 99.00 191739.047 20249.203 %10926371840.000 Phụ lục 4.2. cá Giai đoạn sau biến tháI Bảng 28. Kết quả tính EC50 96h của N-NH4-a NH4a Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 20.0000 10 4 0.4000 0.4000 0.4119 25.0000 10 8 0.8000 0.8000 0.7612 30.0000 10 9 0.9000 0.9000 0.9295 40.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.9963 45.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.9992 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 0.267 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Mu = 1.324156 Sigma = 0.103895 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------- Intercept -7.745148 4.597412 ( -16.756075, 1.265779) Slope 9.625112 3.330987 ( 3.096377, 16.153847) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits 97 Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 12.091 2.834 16.175 LC/EC 5.00 14.232 4.681 17.913 LC/EC 10.00 15.524 6.108 18.941 LC/EC 15.00 16.462 7.303 19.688 LC/EC 50.00 21.094 15.114 23.834 LC/EC 85.00 27.029 23.922 37.727 LC/EC 90.00 28.662 25.227 44.459 LC/EC 95.00 31.265 26.976 57.366 LC/EC 99.00 36.800 30.139 93.919 Bảng 29. Kết quả tính EC50 96h của N-NH4- b NH4b Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 20.0000 10 4 0.4000 0.4000 0.4024 25.0000 10 7 0.7000 0.7000 0.6508 35.0000 10 8 0.8000 0.8000 0.9106 40.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.9577 45.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.9803 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 2.252 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Mu = 1.338787 Sigma = 0.152700 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------- Intercept -3.767414 2.759825 ( -9.176672, 1.641844) Slope 6.548774 1.924602 ( 2.776554, 10.320994) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper 98 LC/EC 1.00 9.629 2.340 14.308 LC/EC 5.00 12.235 4.092 16.762 LC/EC 10.00 13.902 5.503 18.270 LC/EC 15.00 15.154 6.713 19.386 LC/EC 50.00 21.817 15.102 25.646 LC/EC 85.00 31.408 26.776 43.053 LC/EC 90.00 34.236 29.009 51.438 LC/EC 95.00 38.901 32.156 68.014 LC/EC 99.00 49.433 38.186 117.325 Bảng 30. Kết quả tính EC50 96h của N-NH4-c Số cá bị tác động giống số cá bị tác động ở lô thí nghiệm với N-NH4 +a Bảng 31. Kết quả tính EC50 của N-NO2-a NO2a Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 10 0 0.0000 0.0000 0.0058 20.0000 10 3 0.3000 0.3000 0.2555 40.0000 10 8 0.8000 0.8000 0.8872 50.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.9651 60.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.9894 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 1.390 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Mu = 1.406894 Sigma = 0.161051 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------- Intercept -3.735729 2.125273 ( -7.901265, 0.429806) Slope 6.209231 1.434096 ( 3.398403, 9.020059) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 99 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 10.771 4.482 15.425 LC/EC 5.00 13.867 7.014 18.611 LC/EC 10.00 15.867 8.873 20.647 LC/EC 15.00 17.377 10.375 22.197 LC/EC 50.00 25.521 19.203 31.533 LC/EC 85.00 37.481 30.390 52.391 LC/EC 90.00 41.048 33.079 60.504 LC/EC 95.00 46.968 37.152 75.602 LC/EC 99.00 60.471 45.383 116.860 Bảng 32. Kết quả tính EC50 của N-NO2- b NO2b Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 10 0 0.0000 0.0000 0.0333 20.0000 10 5 0.5000 0.5000 0.3622 40.0000 10 7 0.7000 0.7000 0.8704 50.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.9458 60.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.9770 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 4.552 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Mu = 1.372705 Sigma = 0.203237 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------- Intercept -1.754221 1.579314 ( -4.849677, 1.341235) Slope 4.920373 1.077548 ( 2.808379, 7.032368) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 7.942 2.936 12.168 LC/EC 5.00 10.924 5.057 15.436 LC/EC 10.00 12.949 6.731 17.596 LC/EC 15.00 14.523 8.142 19.272 LC/EC 50.00 23.589 17.267 29.844 100 LC/EC 85.00 38.312 30.259 55.930 LC/EC 90.00 42.971 33.585 66.762 LC/EC 95.00 50.934 38.783 87.711 LC/EC 99.00 70.064 49.833 149.179 Bảng 33. Kết quả tính EC50 96h của N-NO2- c NO2c Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 10 0 0.0000 0.0000 0.0102 20.0000 10 4 0.4000 0.4000 0.3555 40.0000 10 9 0.9000 0.9000 0.9426 50.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.9862 60.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.9967 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 0.697 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Mu = 1.358299 Sigma = 0.154595 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------- Intercept -3.786155 2.231362 ( -8.159624, 0.587314) Slope 6.468497 1.579507 ( 3.372663, 9.564330) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 9.969 4.066 14.133 LC/EC 5.00 12.706 6.373 16.918 LC/EC 10.00 14.460 8.062 18.704 LC/EC 15.00 15.779 9.422 20.071 LC/EC 50.00 22.819 17.237 28.570 LC/EC 85.00 33.001 26.547 48.308 LC/EC 90.00 36.010 28.739 55.964 LC/EC 95.00 40.982 32.050 70.187 LC/EC 99.00 52.232 38.704 109.044 Bảng 34. Kết quả tính EC50 96h của N-NO3-a Proportion Observed Responding Predicted 101 Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 800.0000 10 0 0.0000 0.0000 0.0033 1200.0000 10 3 0.3000 0.3000 0.2184 1600.0000 10 5 0.5000 0.5000 0.7257 1800.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.8777 2400.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.9945 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 4.430 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits for N-NO3a Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 868.314 474.586 1065.358 LC/EC 5.00 1001.132 633.860 1177.399 LC/EC 10.00 1080.062 738.182 1244.271 LC/EC 15.00 1136.822 817.042 1293.261 LC/EC 50.00 1411.599 1214.754 1572.717 LC/EC 85.00 1752.792 1573.168 2195.695 LC/EC 90.00 1844.905 1643.245 2418.229 LC/EC 95.00 1990.359 1744.382 2803.626 LC/EC 99.00 2294.806 1935.706 3729.311 Bảng 35. Kết quả tính EC50 96h của N-NO3- b Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 800.0000 10 0 0.0000 0.0000 0.0004 1200.0000 10 2 0.2000 0.2000 0.1422 1600.0000 10 5 0.5000 0.5000 0.7028 1800.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.8827 102 2400.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.9974 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 3.601 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits N-NO3b Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 957.841 549.998 1145.993 LC/EC 5.00 1082.445 712.078 1248.107 LC/EC 10.00 1155.377 815.741 1308.565 LC/EC 15.00 1207.358 892.995 1352.699 LC/EC 50.00 1454.185 1269.755 1604.413 LC/EC 85.00 1751.472 1589.550 2161.471 LC/EC 90.00 1830.272 1650.104 2356.213 LC/EC 95.00 1953.590 1736.636 2688.967 LC/EC 99.00 2207.730 1897.939 3469.352 Bảng 36. Kết quả tính EC50 96h của N-NO3- c NO3c Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 800.0000 10 0 0.0000 0.0000 0.0104 1200.0000 10 4 0.4000 0.4000 0.2841 1600.0000 10 5 0.5000 0.5000 0.7465 1800.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.8787 2400.0000 10 10 1.0000 1.0000 0.9919 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 5.436 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Mu = 3.136953 Sigma = 0.101247 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------- Intercept -25.983173 7.912545 ( -41.491760, -10.474586) Slope 9.876837 2.498355 ( 4.980060, 14.773614) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits 103 Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 796.934 429.230 995.394 LC/EC 5.00 934.140 584.204 1114.470 LC/EC 10.00 1016.705 687.142 1186.120 LC/EC 15.00 1076.516 765.599 1238.817 LC/EC 50.00 1370.734 1169.192 1539.519 LC/EC 85.00 1745.362 1552.510 2200.383 LC/EC 90.00 1848.039 1630.340 2438.308 LC/EC 95.00 2011.380 1743.789 2853.741 LC/EC 99.00 2357.675 1961.293 3866.470 104 Phụ lục 5. Kết quả NOEC xử lý bằng phần mềm Toxsat Bảng 37. Kết quả tính NOEC 96h của N-NH4+ , N-NO2- và N-NO3- cho giai đoạn tr−ớc biến thái File: N-NH4+ nho Transform: NO TRANSFORMATION STEELS MANY-ONE RANK TEST - Ho:Control<Treatment ------------------------------------------------------------------ ------- TRANSFORMED RANK CRIT. GROUP IDENTIFICATION MEAN SUM VALUE df SIG ----- -------------------- ----------- ------- ------ --- -- --- 1 0 2 5 1.000 3 15 0.963 12.00 10.00 4.00 * 4 25 0.913 10.00 10.00 4.00 * 5 35 0.700 10.00 10.00 4.00 * 6 50 0.063 10.00 10.00 4.00 * ------------------------------------------------------------------ ------- Critical values use k = 4, are 1 tailed, and alpha = 0.05 File: N-NO-2 nho Transform: ARC SINE(SQUARE ROOT(Y)) STEELS MANY-ONE RANK TEST - Ho:Control<Treatment ------------------------------------------------------------------ ------- TRANSFORMED RANK CRIT. GROUP IDENTIFICATION MEAN SUM VALUE df SIG ----- -------------------- ----------- ------- ------ --- -- --- 1 0 1.459 2 5 1.459 3 15 1.459 18.00 10.00 4.00 4 30 1.093 10.00 10.00 4.00 * 5 60 0.785 10.00 10.00 4.00 * 105 6 90 0.352 10.00 10.00 4.00 * ------------------------------------------------------------------ ------- Critical values use k = 4, are 1 tailed, and alpha = 0.05 File: N-NO3- nho Transform: ARC SINE(SQUARE ROOT(Y)) STEELS MANY-ONE RANK TEST - Ho:Control<Treatment ------------------------------------------------------------------ ------- TRANSFORMED RANK CRIT. GROUP IDENTIFICATION MEAN SUM VALUE df SIG ----- -------------------- ----------- ------- ------ --- -- --- 1 0 1.459 2 200 1.459 18.00 10.00 4.00 3 400 1.297 10.00 10.00 4.00 * 4 800 0.978 10.00 10.00 4.00 * 5 1200 0.798 10.00 10.00 4.00 * 6 1400 0.462 10.00 10.00 4.00 * ------------------------------------------------------------------ ------- Critical values use k = 5, are 1 tailed, and alpha = 0.05 Bảng 38. Kết quả tính NOEC50 96h của N-NH4+. N-NO2- và N-NO3- cho giai đoạn sau biến thái File: N-NH4+ to Transform: ARC SINE(SQUARE ROOT(Y)) STEELS MANY-ONE RANK TEST - Ho:Control<Treatment ------------------------------------------------------------------ ------- TRANSFORMED RANK CRIT. GROUP IDENTIFICATION MEAN SUM VALUE df SIG ----- -------------------- ----------- ------- ------ --- -- --- 1 0 1.412 2 20 1.412 18.00 10.00 4.00 106 3 25 1.178 10.00 10.00 4.00 * 4 35 0.836 10.00 10.00 4.00 * 5 40 0.632 10.00 10.00 4.00 * 6 45 0.276 10.00 10.00 4.00 * ------------------------------------------------------------------ ------- Critical values use k = 5, are 1 tailed, and alpha = 0.05 File: N-NO2- to Transform: ARC SINE(SQUARE ROOT(Y)) STEELS MANY-ONE RANK TEST - Ho:Control<Treatment ------------------------------------------------------------------ ------- TRANSFORMED RANK CRIT. GROUP IDENTIFICATION MEAN SUM VALUE df SIG ----- -------------------- ----------- ------- ------ --- -- --- 1 0 1.412 2 10 1.412 18.00 10.00 4.00 3 20 1.178 10.00 10.00 4.00 * 4 40 0.939 10.00 10.00 4.00 * 5 50 0.486 10.00 10.00 4.00 * 6 60 0.200 10.00 10.00 4.00 * ------------------------------------------------------------------ ------- Critical values use k = 5, are 1 tailed, and alpha = 0.05 File: N-NO3-to Transform: ARC SINE(SQUARE ROOT(Y)) STEELS MANY-ONE RANK TEST - Ho:Control<Treatment ------------------------------------------------------------------ ------- TRANSFORMED RANK CRIT. GROUP IDENTIFICATION MEAN SUM VALUE df SIG ----- -------------------- ----------- ------- ------ --- -- --- 107 1 0 1.412 2 800 1.412 18.00 10.00 4.00 3 1200 1.178 10.00 10.00 4.00 * 4 1600 0.939 10.00 10.00 4.00 * 5 1800 0.457 10.00 10.00 4.00 * 6 2400 0.159 10.00 10.00 4.00 * ------------------------------------------------------------------ ------- Critical values use k = 5, are 1 tailed, and alpha = 0.05 ._.