Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số giống Ngô (Zea Mays L.)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM -------------------------------- TRẦN THỊ NGỌC DIỆP NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (ZEA MAYS L.) luËn v¨n th¹c sÜ sinh häc Thái Nguyên: 2009 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------------------------------ TRẦN THỊ NGỌC DIỆP NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (ZEA MAYS L.) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ng•êi h•íng dÉn khoa häc: PGS.TS CHU HOÀNG MẬU Thái Nguyên: 2009 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, chưa có ai công bố. Tác giả Trần Thị Ngọc Diệp LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS. TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh - Bộ môn Khoa học sự sống - Trường Đại học khoa học – Đại học Thái nguyên đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu của đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh – KTNN và các thầy cô giáo, cán bộ trong khoa đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện của Ban giám hiệu Trường Đại học Hùng Vương, Ban chủ nhiệm khoa Nông – Lâm – Ngư, cùng các đồng nghiệp, gia đình và bạn bè đã tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn. Tác giả Trần Thị Ngọc Diệp MỤC LỤC Trang Lời cam đoan………………………………………………………......... i Lời cảm ơn……………………………………………………………… ii Mục lục………………………………………………………………..... iii Những chữ viết tắt………………………………………………………. vi Danh mục các bảng………………………………………………........... vii Danh mục các hình………………………………………………........... viii MỞ ĐẦU………………………………………………………….......... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………….... 3 1.1.CÂY NGÔ………………………………………………….............. 3 1.1.1.Nguồn gốc và phân loại cây ngô………………………………….. 3 1.1.2.Đặc điểm nông sinh học của cây ngô……………………............... 3 1.1.3.Vai trò cây ngô trong nền kinh tế…………………………………. 5 1.1.4.Đặc điểm hóa sinh hạt ngô………………………………............... 7 1.1.5.Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và ở Việt Nam………............ 8 1.1.5.1.Tình hình sản xuất ngô trên thế giới………………………......... 8 1.1.5.2.Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam…………………………...... 12 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT…………………………………......................................... 13 1.2.1.Một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền thực vật………………………………......................... 13 1.2.1.1.Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms – đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn)…………………………………… 14 1.2.1.2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – đa hình độ dài các đoạn được nhân bản chọn lọc)……………………………. 14 1.2.1.3. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat – trình tự lặp lại đơn giản)…………………………………………………………………….. 15 1.2.1.4.Bản đồ QTL (Quantiative Trait loci)………………………… 17 1.2.1.5. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)……... 17 1.2.2. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở thực vật bằng kỹ thuật RAPD............... 20 1.2.3.Tình hình nghiên cứu sự đa dạng di truyền của ngô bằng kỹ thuật RAPD....... 22 1.3. NHẬN XÉT CHUNG……………………………………............... 24 Chƣơng 2 . VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP………………………...... 25 2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU……………………………………….. 25 2.1.1.Vật liệu thực vật…………………………………………………... 25 2.1.2.Hoá chất…………………………………………………............... 25 2.1.3.Thiết bị………………………………………………………......... 26 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………... 26 2.2.1.Phương pháp hóa sinh…………………………………………….. 26 2.2.1.1.Xác định hàm lượng lipid……………………………………….. 26 2.2.1.2.Xác định hàm lượng protein……………………………............. 26 2.2.1.3.Xác định hàm lượng đường tan..................................................... 27 2.2.2.Phương pháp sinh học phân tử......................................................... 27 2.2.2.1.Phương pháp tách DNA từ lá non của ngô................................... 27 2.2.2.2.Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA tổng số............. 28 2.2.2.3.Phản ứng RAPD............................................................................ 29 2.2.2.4.Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu............................ 30 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................. 31 3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HÓA SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU.................................................................................... 31 3.1.1.Đặc điểm hình thái của 14 giống ngô nghiên cứu................................ 31 3.1.2.Hàm lượng protein, lipid, đường của 14 giống ngô nghiên cứu.......... 32 3. 2. PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH DNA BẰNG KỸ THUẬT RAPD... 35 3.2.1.Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá ngô....................................... 35 3.2.2.Kết quả nghiên cứu đa hình DNA bằng kỹ thuật RAPD................. 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.......................................................................... 50 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN.............. 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................... 52 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Tính đa hình chiều dài các phân đoạn được nhân bản) ASTT Áp suất thẩm thấu CS Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotit triphotphat EDTA Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid ISSR Inter Simple Sequence Repeats Kb Kilobase LEA Late Embryogeneis Abundant protein (Protein tổng hợp với lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình phát triển phôi) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RAPD Random Amplified Polymorphism DNA (Phân tích ADN đa hình được nhân bản ngẫu nhiên) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Phân tích chiều dài các phân đoạn ADN cắt hạn chế) SDS Sodium Dodecyl Sulphat SDS-PAGE Phương pháp điện di trên gel polyacrylamid có chứa SDS SSR Simple Sequence Repeats STS Sequense Tagged Site TBE Tris - Boric acid - EDTA TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA Tris Trioxymetylaminometan DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Thành phần hoá học của hạt ngô và gạo (Phân tích trên 100)… 8 1.2 Dự báo nhu cầu ngô thế giới đến năm 2020……………….. 9 1.3 Tình hình sản xuất ngô của một số khu vực trên thế giới giai đoạn 2005 – 2007……………………………………... 10 1.4 Tình hình sản xuất ngô của một số quốc gia trên thế giới năm 2007………………………………………………… 11 1.5 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ năm 2004 đến năm 2006 13 2.1 Đặc điểm 14 giống ngô nghiên cứu………………………... 25 2.2 Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu…………………………………………………. 29 2.3 Thành phần phản ứng RAPD………………………………. 30 3.1 Đặc điểm của 14 giống ngô nếp địa phương………………. 31 3.2 Hàm lượng protein, lipid, đường trong hạt của 14 giống ngô... 33 3.3 Phổ hấp thu DNA ở bước sóng 260nm và 280nm…………. 36 3.4 Số phân đoạn DNA xuất hiện ở từng giống ngô nghiên cứu….. 38 3.5 Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 10 mồi RAPD………. 47 3.6 Hệ số tương đồng di truyền của 14 giống ngô nếp………… 48 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 3.1 Hình dạng hạt của 14 giống ngô………………………….. 32 3.2 Hình ảnh điện di DNA tổng số của 14 giống ngô………… 35 3.3 Phổ hấp thụ DNA của giống SLV đo ở bước sóng 260 nm. 37 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M1 của 14 giống ngô…………………………………………………. 39 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M2 của 14 giống ngô…………………………………………………. 40 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M4 của 14 giống ngô…………………………………………………. 41 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M6 của 14 giống ngô…………………………………………………. 42 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M8 của 14 giống ngô…………………………………………………. 43 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M9 của 14 giống ngô…………………………………………………. 43 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi RA159 của 14 giống ngô…………………………………………………. 44 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi UBC23 của 14 giống ngô…………………………………………………. 46 3.12 Biểu đồ mô tả quan hệ di truyền của 14 giống ngô……… 49 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L. và có nguồn gốc từ Trung Mỹ. Ngô là cây lương thực quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu. Ở các nước thuộc Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi, người ta sử dụng ngô làm lương thực chính. Không những thế, ngô còn là cây cung cấp thức ăn chăn nuôi quan trọng nhất hiện nay: 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp của gia súc là từ ngô (Ngô Hữu Tình, 2003) [18]. Ngô không chỉ cung cấp lương thực cho con người, phát triển chăn nuôi, ngô còn là nguyên liệu cho ngành công nghiệp chế biến trên toàn thế giới. Hiện nay, diện tích ngô trên thế giới vào khoảng 135 - 140 triệu ha, với sản lượng trung bình là 600 - 700 triệu tấn. Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa của nông dân vùng trung du và miền núi phía Bắc nói chung và cây lương thực chính của đồng bào dân tộc thiểu số vùng cao nói riêng [1]. Trong những năm gần đây sản xuất ngô ở Việt Nam tăng lên nhanh nhờ sự thúc đẩy của ngành chăn nuôi và công nghiệp chế biến. Đặc biệt từ những năm 1990 trở lại đây, diện tích, năng suất và sản lượng ngô tăng liên tục là nhờ ứng dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật mới vào sản xuất mà tiêu biểu là đưa ngô lai vào trồng trên diện tích rộng. Các giống ngô ở nước ta hiện nay rất phong phú gồm các giống ngô nhập nội, giống lai tạo, giống tổng hợp, giống đột biến và các giống ngô địa phương [20]. Bên cạnh các giống ngô lai có năng suất cao đang được trồng phổ biến ở nhiều vùng trong cả nước, thì các giống ngô địa phương tuy có năng suất thấp nhưng chất lượng hạt cao, chất lượng ngô dẻo, thơm, ngon và chống chịu sâu bệnh tốt. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống cây trồng nói chung và cây ngô nói riêng như RFLP, AFLP, 2 SSR, STS, RAPD,... Các phương pháp này khắc phục được nhược điểm của các phương pháp chọn giống truyền thống bởi đánh giá được hệ gen của cây trồng. Những năm gần đây, diện tích trồng các giống ngô địa phương ngày càng có xu hướng giảm, nhiều giống ngô nếp quý hiếm sẽ bị mất dần. Như vậy, việc sưu tập và nghiên cứu các giống ngô nếp địa phương góp phần bảo tồn nguồn gen cây ngô là rất cần thiết. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở mức DNA và đặc điểm hóa sinh ở giai đoạn hạt là cơ sở khoa học để đề xuất việc chọn những giống ngô có năng suất cao và chất lượng tốt góp phần bảo tồn, phát triển nguồn gen cây ngô. Từ đó tuyển chọn giống ngô thích hợp làm vật liệu chọn giống là những vấn đề rất được quan tâm nghiên cứu. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số giống ngô (Zea mays L.)” 2. Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá chất lượng hạt của một số giống ngô nếp địa phương (Zea mays L.) - Khảo sát sự đa dạng và mối quan hệ di truyền của 14 giống ngô bằng kỹ thuật RAPD. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân tích đặc điểm hình thái, khối lượng và kích thước hạt của một số giống ngô nếp địa phương. - Xác định hàm lượng lipid, protein, đường trong hạt của các giống ngô nghiên cứu. - Phân tích sự đa hình DNA được nhân bản ngẫu nhiên, xác định mức sai khác trong cấu trúc DNA hệ gen của các giống ngô nghiên cứu. - Thiết lập mối quan hệ di truyền của 14 giống ngô. 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY NGÔ 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây ngô Cây ngô (Zea mays L.) thuộc chi Maydeae, họ hòa thảo Gramineae, có nguồn gốc từ Trung Mỹ. Ngô có bộ nhiễm sắc thể (2n=20). Có nhiều cách để người ta phân loại ngô, một trong các cách đó là dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt và hình thái bên ngoài của hạt. Ngô được phân thành các loài phụ: ngô đá rắn, ngô răng ngựa, ngô nếp, ngô đường, ngô nổ, ngô bột, ngô nửa răng ngựa. Từ các loài phụ dựa vào màu hạt và màu lõi ngô được phân chia thành các thứ. Ngoài ra ngô còn được phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh trưởng và thương phẩm [12]. Có rất nhiều giả thuyết về nguồn gốc của ngô tại châu Mỹ như ngô là sản phẩm thuần dưỡng trực tiếp từ cỏ ngô (Zea mays ssp. parviglumis) một năm ở Trung Mỹ, có nguồn gốc từ khu vực thung lũng sông Balsas ở miền nam Mexico. Cũng có giả thuyết khác cho rằng ngô sinh ra từ quá trình lai ghép giữa ngô đã thuần hóa nhỏ (dạng thay đổi không đáng kể của ngô dại) với cỏ ngô thuộc đoạn Luxuriantes. Song điều quan trọng nhất nó đã hình thành vô số loài phụ, các thứ và nguồn dị hợp thể của cây ngô, các dạng cây và biến dạng của chúng đã tạo cho nhân loại một loài ngũ cốc có giá trị đứng cạnh lúa mì và lúa nước [12]. 1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây ngô Cơ quan sinh dưỡng của ngô gồm rễ, thân và lá làm nhiệm vụ duy trì đời sống cá thể. Hạt được coi là cơ quan khởi đầu của cây. Sau khi gieo hạt, ngô phát triển thành mầm. Cây mầm chủ yếu sử dụng nguồn dinh dưỡng chứa trong nội nhũ hạt. Bộ phân phía trên hạt phát triển lên mặt đất gồm có trụ giữa lá mầm. Phần đỉnh trụ lá mầm có mấu bao 4 lá mầm, từ đó phát sinh bao lá mầm và bên trong bao lá mầm là thân lá mầm. Trên trục của cây mầm, một đầu hình thành rễ cây mầm, sau đó phát triển thành rễ chính, từ rễ chính hình thành các rễ phụ. Ngô là cây có rễ chùm tiêu biểu cho bộ rễ cây hòa thảo. Hệ rễ có ba loại: rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng. Rễ đốt giúp cho cây hút nước và các chất dinh dưỡng. Rễ chân kiềng mọc xung quanh các đốt phần thân sát gốc trên mặt đất, rễ này giúp cây chống đổ, đồng thời cũng tham gia vào hút nước và thức ăn cho cây. Số lượng rễ, số lông rễ và chiều dài rễ khác nhau ở mỗi giống. Thân ngô thường phát triển mạnh, thẳng cứng dạng bền chắc. Thân chia làm nhiều gióng, các gióng nằm giữa các đốt, các gióng dài và to dần từ dưới lên. Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và mọc đối xứng xen kẽ nhau. Độ lớn và số lá ngô dao động từ 6 đến 22 là tùy thuộc vào giống và điều kiện tự nhiên. Lá ngô trưởng thành bao gồm các bộ phận: bẹ lá, phiến lá và thìa lá. Bắp ngô phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm nách lá trên cây ngô nhiều, nhưng chỉ 1-3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp. Tuỳ thuộc vào giống, điều kiện sinh thái, chăm bón, mật độ, mùa vụ… mà tỷ lệ cây 2-3 bắp, số hạt trên bắp, vị trí đóng bắp, thời gian phun râu, trỗ cờ…có khác nhau. Hạt ngô thuộc loại quả dĩnh gồm 4 bộ phân chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi và nội nhũ. Phía dưới hạt có gốc hạt gắn liền với lõi ngô. Vỏ hạt bao bọc xung quanh, màu sắc vỏ hạt tùy thuộc vào từng giống, nằm sau lớp vỏ hạt là lớp alơron bao bọc lấy nội nhũ và phôi. Nội nhũ là thành phần chính 70-78% trọng lượng hạt, thành phần chủ yếu là tinh bột, ngoài ra còn có protein, lipid, vitamin, khoáng và enzyme để nuôi phôi phát triển. Phôi ngô lớn (chiếm 8-15%) nên cần chú trọng bảo quản [12] 5 Mỗi một giai đoạn sinh trưởng, cây ngô yêu cầu về điều kiện sinh thái khác nhau. Trong điều kiện đảm bảo về ẩm độ, ôxy và nhiệt độ thích hợp cho ngô nảy mầm nhanh sau khi gieo. Nhiệt độ tối thiểu cho hạt nảy mầm từ 8 – 120C, nhiệt độ tối đa cho hạt nảy mầm từ 40 – 450C, nhiệt độ tối thích từ 25 – 280C. Ở các thời kỳ sinh trưởng khác nhau thì sự hút chất dinh dưỡng cũng như yêu cầu về dinh dưỡng của ngô cũng khác nhau: Ở thời kỳ đầu cây ngô hút chất dinh dưỡng chậm, thời kỳ từ 7 - 8 lá đến sau trỗ 15 ngày toàn bộ các bộ phận trên mặt đất cũng như các bộ phận dưới mặt đất của cây ngô tăng trưởng nhanh, các cơ quan sinh trưởng phát triển mạnh, lượng tinh bột và chất khô tăng nhanh. Đây là giai đoạn cây ngô hấp thu chất dinh dưỡng tối đa (bằng 70 - 90% dinh dưỡng cả vòng đời cây hút). Ở thời kỳ này nếu cây thiếu nước và chất dinh dưỡng sẽ làm giảm năng suất từ 10 - 20%. Trong các yếu tố dinh dưỡng thì đạm là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng bậc nhất của cây ngô (Lê Đức Biên,1986) [2]. 1.1.3. Vai trò cây ngô trong nền kinh tế Ngô làm lương thực cho con người: Ngô là cây lương thực nuôi sống gần 1/3 dân số trên toàn thế giới, tất cả các nước trồng ngô nói chung đều ăn ngô ở mức độ khác nhau. Toàn thế giới sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực cho người. Các nước ở Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng ngô làm lương thực chính. Các nước Đông Nam Phi sử dụng 85% sản lượng ngô làm lương thực cho người, Tây Trung Phi 80%, Bắc Phi 42%, Tây Á 27%, Nam Á 75%, Đông Nam Á và Thái Bình Dương 39%, Đông Á 30%, Trung Mỹ và các vùng Caribe 61%... Nếu như ở Châu Âu khẩu phần ăn cơ bản là: bánh mỳ, khoai tây, sữa; Châu Á: cơm (gạo), cá, rau xanh (canh) thì châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt. Vì vậy, trên phạm vi thế giới, ngô vẫn còn là cây lương thực rất quan trọng, vì ngô rất phong phú các chất dinh dưỡng hơn lúa mỳ và gạo. 6 Ngô làm thức ăn gia súc: Ngô là thức ăn gia súc quan trọng nhất hiện nay. Hầu như 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp là từ ngô, điều đó phổ biến trên toàn thế giới. Ngoài việc cung cấp chất tinh, cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lí tưởng cho đại gia súc. Những năm gần đây cây ngô còn là cây thực phẩm, người ta dùng bắp ngô bao tử làm rau cao cấp. Sở dĩ, ngô rau được dùng vì nó sạch và có hàm lượng dinh dưỡng cao. Các thể loại ngô nếp, ngô đường (ngô ngọt) được dùng làm thức ăn tươi (luộc, nướng) hoặc đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu. Ngô là nguyên liệu chính cho các nhà máy thức ăn gia súc tổng hợp, ngô còn là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất rượu, tinh bột, bánh kẹo… Người ta đã sản xuất ra các mặt hàng khác nhau cho các ngành công nghiệp lương thực - thực phẩm, công nghiệp dược và công nghiệp nhẹ. Ngô cũng là hàng hoá xuất khẩu. Hàng năm lượng ngô xuất khẩu khoảng 70 triệu tấn. Đó là nguồn lợi lớn của các nước xuất khẩu. Các nước xuất khẩu chính là Mỹ, Pháp, Argentina, Trung Quốc, Thái Lan. Các nước nhập chính là Nhật Bản, Hàn Quốc, Liên Xô cũ, Châu Phi, Mexico… [13]. Ngô vừa là cây lương thực, vừa là cây thức ăn cho gia súc. Chính vì vậy diện tích trồng ngô trên thế giới tăng không ngừng. Năm 1979 diện tích trồng ngô chỉ đạt khoảng 127 triệu ha với tổng sản lượng là 475,4 triệu tấn, đến năm 2007 diện tích trồng ngô đạt 145,1 triệu ha với sản lượng 705,3 triệu tấn (theo số liệu thống kê của FAO, 2008). Ở Việt Nam, cây ngô đã được trồng cách đây khoảng 300 năm và được trồng trên những điều kiện sinh thái khác nhau của cả nước. Hàm lượng chất dinh dưỡng của ngô tùy thuộc vào từng giống, đặc biệt là các giống ngô nếp địa phương tuy năng suất không cao nhưng chất lượng của hạt ngô tốt phù hợp với thị hiếu của người tiêu dùng. Vì vậy, việc nghiên 7 cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh của các giống ngô giúp chọn được các giống ngô có năng suất cao và chất lượng tốt đáp ứng cho công tác giống và nhu cầu sử dụng của con người. 1.1.4. Đặc điểm hóa sinh hạt ngô Các chất trong hạt ngô dễ bị đồng hóa nên có giá trị dinh dưỡng cao. Hạt ngô chứa tinh bột, lipid, protein, đường (chiếm khoảng 3,5%), chất khoáng (chiếm khoảng 1 – 2,4%), vitamin (gồm vitamin A, B1, B2, B6, C và một lượng rất nhỏ xenlulo (2,2%). Hạt ngô chứa phần lớn tinh bột, hàm lượng tinh bột trong hạt thay đổi trong giới hạn 60 - 70%. Hàm lượng tinh bột ở ngô tẻ nhiều hơn ngô nếp (68% so với 65%). Tinh bột tập trung chủ yếu ở nội nhũ và được chia thành hai dạng tinh bột là tinh bột mềm (tinh bột bột) và tinh bột cứng (tinh bột sừng hay tinh bột phalê). Hàm lượng lipid cao thứ hai trong các loại ngũ cốc sau lúa mạch, nó chiếm khoảng (3,5 – 7%) và phụ thuộc vào từng giống, điều kiện tự nhiên. Lipid được tập trung nhiều ở phôi và màng alơron. Dầu ngô chứa đến 50% acid linoleic liên kết với glyxerit, acid oleic, panmitic, ricinic. Hàm lượng lipid là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng hạt [9]. Protein của ngô được chia thành 3 dạng chính: protein hoạt tính (chủ yếu là emzyme), protein cấu tạo và protein dự trữ, trong đó protein dự trữ chiếm tỉ lệ cao nhất. Hàm lượng protein dao động từ 4,8 đến 16,6,% tùy vào mỗi giống. Lợi dụng tính chất hòa tan của protein trong các dung môi, người ta có thể tách triết protein tan từ ngô phục vụ cho nhiều mục đích nghiên cứu như đánh giá chất lượng hạt, khả năng chịu hạn… Thành phần hoá học của hạt ngô vàng đều cao hơn so với gạo trắng. Ngoài thành phần tinh bột, protein, lipid, ở ngô còn chứa nhiều loại vitamin, trong đó vitamin C cao nhất. Về nhiệt lượng của ngô cao hơn gạo 8 trắng là 10%. Qua đó cho thấy, ngô là cây lương thực có giá trị dinh dưỡng tương đối cao (bảng 1.1). Bảng 1.1. Thành phần hoá học của hạt ngô và gạo (Phân tích trên 100g) Thành phần hóa học Gạo trắng Ngô vàng Tinh bột (g) 65,00 68,20 Protein (g) 8,00 9,60 Lipid (g) 2,50 5,20 Vitamin A (mg) 0 0,03 Vitamin B1 (mg) 0,20 0,28 Vitamin B2 (mg) 0 0,08 Vitamin C (mg) 0 7,70 Nhiệt lượng (Kalo) 340 350 (Cao Đắc Điểm, 1988) [8] 1.1.5. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.5.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới Trong những năm gần đây diện tích ngô trên toàn thế giới đã tăng lên gấp rưỡi, năng suất tăng gấp 2,5 lần. Diện tích ngô hàng năm khoảng 139 triệu ha, năng suất bình quân khoảng 3,8 triệu tấn/ha, tổng sản lượng ngô trên 525 triệu tấn/ ha. Ngô là cây có địa bàn phân bố vào loại rộng nhất thế giới, trải rộng hơn 90 vĩ tuyến: Từ 400N lên gần đến 550B, từ độ cao 1 - 2 m đến 400 m so với mực nước biển [13]. Do đó, ngô được trồng ở hầu hết các nơi trên thế giới như Châu Mỹ, Châu Âu, Châu Úc, Châu Phi. Theo dự báo của Viện nghiên cứu chương trình lương thực thế giới (IPRI, 2003), vào năm 2020 tổng nhu cầu ngô thế giới là 852 triệu tấn, trong đó 15% dùng làm lương thực, 69% dùng làm thức ăn chăn nuôi, 16% dùng làm nguyên liệu cho công nghiệp. Ở các nước phát triển chỉ dùng 5% ngô làm lương thực nhưng ở các nước đang phát triển sử dụng 22% ngô làm lương thực (IPRI, 2003) Đến năm 2020, nhu cầu ngô thế giới tăng 45% so với nhu cầu năm 1997, chủ yếu tăng cao ở các nước đang phát triển 9 (72%), riêng Đông Nam Á nhu cầu tăng 70% so với năm 1997 (Bảng 1.2), sở dĩ nhu cầu ngô tăng mạnh là do dân số thế giới tăng, thu nhập bình quân đầu người tăng, nên nhu cầu thịt, cá, trứng, sữa tăng mạnh, dẫn đến đòi hỏi lượng ngô dùng cho chăn nuôi tăng. Nhưng thách thức lớn nhất là 80% nhu cầu ngô thế giới tăng (266 triệu tấn), lại tập trung ở các nước đang phát triển. Hơn nữa chỉ khoảng 10% sản lượng ngô từ các nước công nghiệp có thể xuất sang các nước đang phát triển. Vì vậy, các nước đang phát triển phải tự đáp ứng nhu cầu của mình (IPRI, 2003). Bảng 1.2. Dự báo nhu cầu ngô thế giới đến năm 2020 Vùng Năm 1977 (Triệu tấn) Năm 2020 ( Triệu tấn) % thay đổi Thế giới 586 852 45 Các nước đang phát triển 295 508 72 Đông Á 136 252 85 Nam Á 14 19 36 Cận Sahara – Châu Phi 29 52 79 Mỹ Latinh 75 118 57 Tây và Bắc Phi 18 28 56 (Nguồn: Viện nghiên cứu chương trình lương thực thế giới IPRI, 2003) Theo Đại học Tổng hợp Iowa (2006), trong những năm gần đây khi thế giới cảnh báo nguồn dầu mỏ đang cạn kiệt, thì ngô đã và đang được chế biến ethanol, thay thế một phần nhiên liệu xăng dầu chạy ô tô tại Mỹ, Braxin, Trung Quốc,... Riêng ở Mỹ, năm 2002 - 2003 đã dùng 25,2 triệu tấn ngô để chế biến ethanol, năm 2005 - 2006 dùng 40,6 triệu tấn và dự kiến năm 2012 dùng 190,5 triệu tấn ngô (Oxfarm, 2004). Diện tích, năng suất, sản lượng ngô giữa các châu lục trên thế giới có sự chênh lệch tương đối lớn được thể hiện bảng 1.3 10 Bảng 1.3. Tình hình sản xuất ngô của một số khu vực trên thế giới giai đoạn 2005 – 2007 Khu vực Diện tích (Triệu ha) Năng suất (Tạ/ha) Sản lƣợng (Triệu tấn) 2005 2006 2007 2005 2006 2007 2005 2006 2007 Châu Âu 11,9 15,6 13,9 46,5 61,3 59,1 69,1 96,1 82,6 Châu Á 43,7 45,0 46,4 38,3 40,7 39,9 167,3 183,3 185,4 Bắc và Trung Mỹ 39,9 40,9 41,3 72,6 81,6 75,7 289,6 333,7 312,0 Thế giới 144,3 146,9 147,0 44,5 49,9 41,7 642,5 724,2 692,0 (Nguồn: Số liệu thống kê của FAOSTAT, 2008) Qua bảng 1.3 cho thấy: Diện tích trồng ngô giữa các Châu lục có sự chênh lệch nhau trong đó Châu Á là khu vực có diện tích trồng ngô lớn nhất, năm 2005 là 43,7 triệu ha đến năm 2007 là 46,4 triệu ha, chiếm khoảng 31,6% diện tích ngô toàn thế giới. Đứng ở vị trí thứ hai là khu vực Bắc và Trung Mỹ chiếm khoảng 28% diện tích trồng ngô thế giới. Châu Âu là khu vực có diện tích trồng ngô thấp, chiếm khoảng 9,5% diện tích trồng ngô thế giới. Nhìn chung diện tích trồng ngô của các khu vực trên thế giới biến động giữa các năm không đáng kể, nếu lấy 2007 làm mốc so sánh thì Châu Âu có giảm về mặt diện tích, còn Châu Á cùng với Bắc và Trung Mỹ thì diện tích tăng. Bắc và Trung Mỹ là khu vực có năng suất cao nhất đạt 75,70 tạ/ha, đứng thứ hai là khu vực Châu Âu: 59,10 tạ/ha, và thấp nhất là Châu Á 39,91 tạ/ha (năm 2007). Sở dĩ Châu Á có năng suất thấp chủ yếu là do khu vực này có điều kiện thời tiết bất thuận như: hạn hán, lũ lụt, đất canh tác chưa thuận lợi. Giai đoạn 2005 - 2007, Châu Á và khu vực Bắc và Trung Mỹ năng suất tăng mạnh, Châu 11 Á tăng 2,4 tạ/ha, Bắc và Trung Mỹ tăng 9 tạ/ha, đến năm 2007 do nhiều lý do khác nhau hai khu vực này đều có năng suất giảm. Bắc và Trung Mỹ là khu vực dẫn đầu về sản lượng ngô trên toàn thế giới, năm 2005 đạt 289,6 triệu tấn, chiếm 44,45% tổng sản lượng ngô toàn thế giới. Đứng thứ hai là khu vực Châu Á đạt 167,3 triệu tấn, chiếm 25,87%% tổng sản lượng ngô toàn thế giới. Năm 2007 khu vực Bắc và Trung Mỹ đạt 312,0 triệu tấn, chiếm 45,08% tổng sản lượng ngô toàn thế giới, Khu vực Châu Á đạt 185,43 triệu tấn, chiếm 26,79% tổng sản lượng ngô toàn thế giới. Như vậy, trong giai đoạn từ năm 2005 đến 2007 diện tích trồng ngô trên thế giới tăng không đáng kể, nhưng do áp dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật tiên tiến đặc biệt là việc mở rộng diện tích trồng ngô lai nên thế giới có sự nhảy vọt về năng suất và sản lượng ngô, nhất là các nước có nền kinh tế phát triển có điều kiện thâm canh cao và sử dụng 100% giống ngô lai trong sản xuất. Trên thế giới có một số nước như Trung Quốc, Mỹ, Braxin chủ yếu là sử dụng ngô lai trong gieo trồng và cũng là những nước có diện tích trồng ngô lớn. Tình hình sản xuất ngô của một số quốc gia trên thế giới được thể hiện qua bảng 1.4. Bảng 1.4. Tình hình sản xuất ngô của một số quốc gia trên thế giới năm 2007 Tên nƣớc Diện tích (Triệu ha) Năng suất (Tạ/ha) Sản lƣợng (triệu tấn) Italy 1,06 93,15 10,62 Mỹ 30,08 100,64 280,22 Hy lạp 0,84 80,95 6,80 Canada 1,08 77,43 8,39 Trung Quốc 26,22 50,01 131,15 Ấn Độ 7,40 19,60 14,50 (Nguồn: Số liệu thống kê của FAO, 2008) 12 Qua bảng 1.4 cho thấy, Mỹ là nước có diện tích, năng suất, sản lượng lớn nhất đạt 30,08 triệu ha, với tổng sản lượng đạt 280,22 triệu tấn, năng suất bình quân đạt 100,64 tạ/ha. Có thể nói, Mỹ và Trung Quốc là hai cường quốc có diện tích trồng ngô lớn nhất và cao gấp nhiều lần so với các quốc gia khác. Theo số liệu của tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên hợp quốc (FAO) việc sản xuất và tiêu thụ ngô trên thế giới đang có sự mất cân đối giữa cung và cầu dẫn đến tình trạng các nước nhập khẩu ngô tăng dần, còn các nước xuất khẩu ngô thì lại có xu hướng giảm. Nước xuất khẩu ngô nhiều là Mỹ, Trung Quốc, Braxin,... các nước nhập khẩu ngô chính là Nhật Bản, Nam Triều Tiên, Malayxia,... Đối với các nước chậm phát triển, do điều kiện kinh tế còn gặp nhiều khó khăn, đầu tư thấp, sử dụng các giống ngô địa phương, ngô thụ phấn tự do là chính, cho nên mặc dù trồng với diện tích lớn (trên 93,5 triệu ha) gấp 2 lần các nước phát triển nhưng sản lượng lại thấp hơn nhiều, hiện nay chỉ có 20 nước năng suất ngô vượt mức bình quân của thế giới. Sản lượng ngô trên thế giới trong những năm gần đây có chiều hướng giảm nhẹ, do diện tích ngô có phần bị thu hẹp nhưng sản lượng chỉ giảm ở những nước phát triển, còn đối với những nước đang phát triển sản lượng ngô lại tăng. Như vậy, trên thế giới trong những năm qua về năng suất ngô đã tăng nhanh ở một số nước phát triển và các nước đang phát triển. Hiện nay, thị trường ngô trên thế giới được đánh giá là một thị trường tương đối khả quan. Chính vì vậy mà sản xuất ngô trên toàn cầu sẽ tăng trưởng mạnh trong những năm tới (theo USDA 1/2003). 1.1.5.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam Ở Việt Nam, cây ngô đã được trồng cách đây khoảng 300 năm và được trồng trên những điều kiện sinh thái khác nhau của cả nước. Là cây lương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa, là cây trồng chính để phát triển ngành chăn nuôi. Năng suất ngô ở nước ta trước đây rất thấp so với năng suất ngô 13 thế giới, do sử dụng giống ngô địa phương và áp dụng khoa học kỹ thuật vào sản xuất còn hạn chế. Phải tới năm 1991 cây ngô lai mới bắt đầu được đưa vào sản xuất ở nước ta, tỷ lệ trồng giống lai từ 0,1% năm 1990, năm 2006 đã tăng lên 80% và đưa Việt Nam trở thành nước sử dụng giống lai nhiều và có năng suất cao của khu vực Đông Nam Á. Bảng 1.5. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ năm 2004 đến năm 2006 Năm Diện tích (1000 ha) Năng suất (Tạ/ha) Sản lƣợng (1000 tấn) 2004 991,10 34,6171 343,09 2005 1052,60 35,6859 375,63 2006 1031,60 37,024 381,94 Ở nước ta ngô được trồng ở hầu hết các địa phương có đất cao dễ thoát hơi nước. Những vùng trồng ngô lớn là Đông Nam Bộ, Tây Nguyên, miền núi phía Bắc, Trung du đồng bằng Sông Hồng, Duyên hải Miền Trung [7]. Trong đó, khu vực miền núi phía Bắc trồng chủ yếu là các giống ngô địa phương. Năng suất của các giống ngô địa phương thường thấp, tuy nhiên các giống ngô địa phương vẫn tiếp tục được quan tâm nghiên cứu vì các ưu điểm như khả năng chịu hạn, kháng sâu bệnh tốt và có thể gieo trồng trên nhiều loại đất khác nhau. Đặc biệt, những năm gần đây do kỹ thuật canh tác, do môi trường, do sự xuất hiện các giống ngô lai và nhiều nguyên nhân khác dẫn đến sự cạn kiệt về nguồn gen giống ngô địa phương. Vì vậy việc sưu tập, nghiên cứu và đánh giá nguồn gen các giống ngô địa phương là hết sức cần thiết. 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT 1.2.1. Một số phƣơn._.g pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền thực vật 14 1.2.1.1. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms – đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn) Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt DNA hệ gen ở trình tự nhận biết đặc trưng tạo ra hàng loạt đoạn DNA có độ dài xác định, số lượng các đoạn này phụ thuộc vào số điểm nhận biết trong hệ gen. Đa hình độ dài này được phát hiện bởi đánh dấu phóng xạ các mẫu dò DNA bổ sung tạo ra từ cùng một locus. RFLP là chỉ thị đồng trội. Ưu điểm của RFLP là: chỉ thị tin cậy trong phân tích liên kết và chọn giống vì chúng có thể xác định được một tính trạng ở trạng thái đồng hợp hoặc dị hợp trong một cá thể, tận dụng được biến dị tự nhiên, phát hiện tính biến dị của DNA trong các giai đoạn phát triển ở cơ quan khác nhau và xây dựng quan hệ di truyền, nghiên cứu quan hệ họ hàng. Nhược điểm của RFLP là kỹ thuật phức tạp, tốn kém và mất thời gian. Phương pháp này đòi hỏi một lượng DNA lớn (50 – 200ng từ mỗi cá thể) [6]. Ignjatovic-Micic D. và cs (2003) đã sử dụng kỹ thuật RFLP kết hợp với kỹ thuật RAPD để xác định quan hệ di truyền của 2178 giống ngô địa phương. Kết quả xác định khoảng cách di truyền dao động từ 0,1311 đến 0,5075. Tác giả kết luận, dữ liệu phân tích RAPD và RFLP đều cho kết quả giống nhau nên có thể dùng cả hai phương pháp này để xác định đa hình di truyền [33]. Moretti A và cs (2008) đã sử dụng RFLP để xác định quan hệ di truyền của Fusarium subglutinans gây bệnh ở ngô [37]. 1.2.1.2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – đa hình độ dài các đoạn đƣợc nhân bản chọn lọc) Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR. AFLP phát hiện một cách có chọn lọc các đoạn DNA hệ gen được cắt bởi enzyme giới hạn và gắn với adaptor (đoạn tiếp hợp). AFLP hoạt động dựa trên nhiều nguyên tắc 15 tương tự như RAPD, tuy nhiên có điểm khác biệt là mồi bao gồm hai phần: phần cố định dài khoảng 15 bp chứa điểm nhận biết của enzyme giới hạn, phần thay đổi dài khoảng 2-4 bp. Phân tích sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacryamide có độ phân giải cao. Sự đa hình được xác định bởi sự có mặt hay không có mặt của một phân đoạn DNA. AFLP rất có hiệu quả trong xác định quan hệ di truyền và lập bản đồ. Hiện nay, phân tích AFLP sử dụng phương pháp nhuộm bạc nên dễ áp dụng, tuy giá thành cao hơn với phương pháp RAPD. Kỹ thuật AFLP có ưu điểm là phân tích đa hình trong khoảng thời gian ngắn, đòi hỏi lượng DNA ít, cho sự đa hình cao, tuy nhiên việc thiết kế mồi rất phức tạp. Kỹ thuật AFLP được Miranda Oliverira K. và cs, (2004) sử dụng để đánh giá mối quan hệ di truyền của 96 dòng ngô lai cùng dòng, kết quả thu được 638 băng DNA trong đó có 569 băng DNA đa hình, hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng 0.345 tới 0.891, sơ đồ quan hệ di truyền chia 96 dòng ngô nghiên cứu thành 17 nhóm [36]. Hartings H. và cs (2008) cũng sử dụng kỹ thuật này để xác định khoảng cách di truyền của 54 giống ngô Italy [32]. Garcia và cs (2004) đã kết hợp các kỹ thuật RAPD, RFLP, AFLP và SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền của 18 dòng ngô lai. Sử dụng kỹ thuật AFLP thu được 774 băng đa hình, kỹ thuật RAPD khuếch đại được 262 băng DNA, kỹ thuật RFLP thu được 185 băng và SSR nhận được 68 băng đa hình [30]. Thomas Lübberstedt và cs (2000) đã xác định quan hệ di truyền của một số giống ngô lai bằng kỹ thuật AFLP với việc sử dụng 8 mồi AFLP thu được 462 băng DNA đa hình [48]. 1.2.1.3. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat – trình tự lặp lại đơn giản) Kỹ thuật SSR còn được gọi là kỹ thuật microsatellies (vi vệ tinh). Kỹ thuật này được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc của PCR [36]. 16 Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân chuẩn tồn tại một loạt các trình tự nucleotide lặp lại, chúng đặc trưng cho loài. SSR gồm 2 - 5 nucleotide lặp lại nhiều lần. Ví dụ: (AT)n, (AG)n, (AGTC)n. SSR nằm rải rác trong hệ gen của thực vật bậc cao. Đoạn mồi được thiết kế dựa trên vùng bảo thủ ở hai đầu của đoạn SSR. Số lần lặp lại nhiều lần làm cho các phân đoạn DNA được nhân có độ dài ngắn khác nhau. Các trình tự lặp lại thường có ở vùng dị nhiễm sắc trên mỗi nhiễm sắc thể. Chúng có vai trò điều hoà hoạt động của các gen, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong phân bào, nó có thể mang thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật. Do sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại mà số đơn vị lặp lại xuất hiện sự đa hình về độ dài của SSR được nhân bản. Mức độ đa hình được xác định sau khi điện di sản phẩm trên gel agarose và gel polyacrylamide. SSR được phân tích trên nhờ PCR nên chỉ cần đòi hỏi một lượng mẫu DNA rất nhỏ. SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống cây trồng vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao. Trong thực tế chỉ thị này đã được sử dụng nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất, bệnh dại, xác định giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lập bản đồ gen…Song nhược điểm của chỉ thị này là sự phức tạp trong thiết kế mồi và đánh giá thiết kế mồi cao. Kỹ thuật SSR được Qi-lun Yao và cs (2007) sử dụng để xác định khoảng cách di truyền của 54 giống ngô từ Tây Nam Trung Quốc dựa trên 42 cặp mồi SSR, tổng số alelle thu được là 256, trung bình mỗi locus có 6,1 alelle [44]. Legesse B.W. và cs (2007) cũng sử kỹ thuật này để nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền và đánh giá cấu trúc gen của các dòng ngô lai cận huyết. Kết quả thu được 104 alelle với khoảng cách di truyền xác định được từ 0,28 đến 0,73, giá trị PIC là 0,58 [35]. 17 Sharopova N. và cs (2002) đã sử dụng kỹ thuật SSR để lập bản đồ di truyền đối với các giống ngô nhằm phân lập, chỉ rõ các đặc điểm của chúng [46]. 1.2.1.4. Bản đồ QTL (Quantiative Trait loci) Bản đồ các locut tính trạng số lượng (QTL) xác định mối liên kết giữa các phân tử với một tính trạng hình thái đang được quan tâm. Qua biểu đồ QTL có thể xác định được những vùng nhiễm sắc thể có liên quan đến một trạng thái. Để lập bản đồ QTL, cần tiến hành: (1) Xác định cặp lai; (2) Lai và tạo quần thể cho bản đồ; (3) Theo dõi sự phân ly của các chỉ thị trong quần thể; (4) Xử lý thống kê và lập bản đồ. Lập bản đồ QTL nhằm xác định vị trí, hiệu quả gen và hoạt động của các locus liên quan trong tương tác gen và tương tác QTL với môi trường, từ đó chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS-Marker Assisted Selection). Kỹ thuật QTL cũng được Zhu J. và cs (2005) sử dụng để lập bản đồ cho cây ngô với mục đích nhận dạng, định lượng trạng thái locus, điều hoà độ dài của rễ phụ, xác định mức độ mềm dẻo của rễ nguyên thuỷ, xác định 6 bản đồ QTL có liên quan tới 53,1% các biến đổi phospho ở hạt [53]. 1.2.1. 5. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình các phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên, do hai nhóm nghiên cứu của Williams và CS (1990) [52] và Welsh và McClelland (1991) đồng thời xây dựng [51]. Đây là một kỹ thuật phát hiện chỉ thị di truyền dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR) [27]. PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích hệ gen thực vật, vì nó có khả năng tạo ra một lượng lớn các trình tự DNA đặc hiệu từ bất kỳ cơ thể nào. Hiện nay PCR được xem là phương pháp nhanh, chính xác, tương đối đơn giản để đánh giá sinh vật chuyển gen, phân tích nhanh chóng sự biến dị di truyền ở phạm vi quần thể và giữa các cá thể. 18 Sự hạn chế lớn nhất của kỹ thuật này là phải dựa trên một trình tự DNA đặc hiệu. Tuy nhiên, hạn chế này đã được các nhà sinh học phân tử cải tiến, khắc phục đó là kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi ngẫu nhiên hay còn gọi là kỹ thuật RAPD [34]. Các thành phần cần thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm: - DNA khuôn (DNA template) với nồng độ 5 - 50 ng trong 25µl. - Đoạn mồi (primer): Chỉ sử dụng một mồi đó là một oligonucleotide có trật tự nucleotide ngẫu nhiên và có chiều dài khoảng 10 nucleotide. - DNA polymerase: Hoạt động của DNA-polymerase phụ thuộc vào Mg 2+, nồng độ dNTP, pH, nhiệt độ biến tính DNA. DNA-polymerase thường dùng là Taq-polymerase. - Bốn loại deoxyribonucleotide triphotphat (dNTP). - Ion Mg2+ và dung dịch đệm. Phản ứng RAPD được tiến hành qua các giai đoạn giống như PCR: - Giai đoạn biến tính DNA: Ở nhiệt độ 950 C trong 30 - 60 giây làm cho hai mạch khuôn tách nhau. - Giai đoạn tiếp mồi: Khi hạ nhiệt độ xuống 32 - 400 C, mồi tiếp hợp và bám vào sợi DNA khuôn. - Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được nâng lên 720 C thì các đoạn mồi đã bắt cặp với các mạch đơn sẽ được kéo dài với sự tham gia của Taq- polymerase. Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân đoạn DNA khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn DNA được nhân bản trong mỗi chu kỳ lại được coi là DNA khuôn cho mỗi chu kỳ nhân bản tiếp theo. Vậy sau k chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2k các đoạn DNA giống đoạn DNA khuôn ban đầu. RAPD có thể thực hiện từ 40 - 45 chu kỳ. 19 Kỹ thuật RAPD có ưu điểm ở chỗ sử dụng các mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotide, quá trình nhân bản DNA là ngẫu nhiên. Đoạn mồi này có thể bám vào bất kỳ vị trí nào có trình tự nucleotide bổ sung trên phân tử DNA hệ gen. Với đặc điểm là ngắn nên xác suất đoạn mồi có được điểm gắn trên phân tử DNA khuôn là rất lớn. Tùy vào nhóm, loài thực vật hay vi sinh vật mà các đoạn mồi ngẫu nhiên được thiết kế chuyên dụng. Theo lý thuyết, số lượng các đoạn DNA được nhân bản phụ thuộc vào độ dài, vị trí của các đoạn mồi, kích thước và cấu trúc DNA genome. Thông thường mỗi đoạn mồi ngẫu nhiên sẽ tạo ra từ 2 - 10 sản phẩm nhân bản. Kết quả là sau khi điện di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện được sự khác nhau trong phổ các phân đoạn DNA được nhân bản. Sự khác nhau đó gọi là tính đa hình. Hiện tượng đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên xuất hiện là do có sự biến đổi trình tự nucleotide tại vị trí các đoạn mồi liên kết. Sản phẩm khuếch đại được phân tích bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và có thể quan sát được sau khi gel được nhuộm bằng hoá chất đặc trưng. Vì vậy, tính đa hình thường được nhận ra do sự có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản [49]. Trong những năm gần đây, kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, RAPD là một phương pháp có hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền [3]. Phương pháp này còn được ứng dụng trong việc đánh giá bộ gen của giống và khả năng phân tích. Kỹ thuật RAPD còn dùng để nhận biết, phân loại các giống cây trồng khác nhau như chuối, lúa mì, đu đủ, đậu tương...và phát hiện, bảo tồn sự đa dạng di truyền đặc biệt là các loài quí hiếm hay một số giống thực vật địa phương. 20 1.2.2. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở thực vật bằng kỹ thuật RAPD Hiện nay, kỹ thuật RAPD đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và xác định quan hệ di truyền ở thực vật. Kỹ thuật RAPD cũng được ứng dụng trong việc đánh giá đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài phân tích và đánh giá hệ gen thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức độ phân tử [40], [41]. Phương pháp này còn được ứng dụng trong việc đánh giá bộ gen của giống và khả năng phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài, nhóm các cá thể cùng một loài [11]. Muthusamy S. và cs (2008) sử dụng kỹ thuật RAPD với 74 mồi ngẫu nhiên và kỹ thuật ISSR với 37 cặp mồi để nghiên cứu quan hệ di truyền của 10 giống đậu gạo thu được 987 băng DNA (trong đó có 719 băng đa hình) từ kỹ thuật RAPD và 479 băng DNA (trong đó có 296 băng đa hình) từ kỹ thuật ISSR, mức độ đa hình RAPD là 70,3%, mức độ đa hình ISSR là 60,79% [39]. Afzal và cs (2004) nghiên cứu tính đa hình của tập đoàn giống đậu xanh nhằm chọn tạo giống đậu xanh có năng suất cao và chịu bệnh đốm vòng do virus. Các tác giả đã sử dụng 21 giống đậu xanh với 34 mồi ngẫu nhiên và thu được tổng số 204 phân đoạn DNA được nhân bản [23]. Moretzohn và CS đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của lạc và mối quan hệ với dạng dại của chúng trên cơ sở phân tích các vùng siêu biến của hệ gen [38]. Đánh giá tính đa dạng của một số giống lạc trong tập đoàn giống chống chịu bệnh gỉ sắt Yiwu Chen và cs (2006) đã sử dụng 11 mồi ngẫu nhiên, tác giả đã nhận được 109 phân đoạn DNA, trong đó có 66 phân đoạn đa hình, chiếm 60,6%. Điều này cho thấy, trong phạm vi của mỗi phản ứng RAPD giữa 33 giống lạc nghiên cứu khác nhau về cấu trúc DNA, mức sai khác từ 4% đến 18%. Kết quả phân tích DNA cho thấy các giống lạc ở cùng một vùng địa lý, sinh thái được tập trung thành từng nhóm, giữa các giống chống chịu bệnh gỉ sắt của tập đoàn giống ICRISAT và các giống năng suất trong 21 nước không nằm trong cùng một nhánh. Vì thế có thể lựa chọn các cặp bố mẹ mong muốn để phục vụ cho công tác lai giống [28]. Chu Hoàng Mậu và cs (2002) đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để so sánh hệ gen của các đậu tương đột biến bằng kỹ thuật RAPD cho thấy ba đoạn mồi có biểu hiện đa hình và 6 dòng đậu tương đột biến có mức độ sai khác về bộ gen [14]. Võ Thị Thương Lan và cs (1999), nghiên cứu tính đa dạng di truyền của loài rong câu biển đã cho thấy tổng số có 46 băng rõ nét được nhân ngẫu nhiên với 3 mồi (OPA4, PA10, OPL12) và đã phát hiện được sự sai khác về mặt di truyền ngay trong một loài rong câu sinh trưởng trong các điều kiện khác nhau [10]. Để đánh giá sự thay đổi di truyền của các dòng lúa tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước, Đinh Thị Phòng và cs (2001) đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để chỉ ra sự sai khác ở mức độ phân tử giữa các đối tượng này [15]. Nguyễn Thị Tâm (2003) sử dụng 5 mồi ngẫu nhiên để phân tích tính đa hình DNA trong bộ gen của dòng lúa được chọn lọc kết quả các dòng có sự sai khác ở mức độ phân tử, trong đó dòng HR128 có hệ số sai khác với giống gốc là lớn nhất [16]. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) nghiên cứu đa dạng di truyền của một số giống đậu xanh cho thấy trong 5 mồi ngẫu nhiên chỉ có 3 mồi RA31, RA45, RA46 cho kết quả đa hình, hệ số tương đồng giữa các giống dao động từ 0,41- 0,80 [17]. Kỹ thuật RAPD còn là một công cụ rất có hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các loài khác nhau. Raina và cs (2001) đã sử dụng chỉ thị RAPD – SSR để phân tích sự đa dạng hệ gen và xác định mối quan hệ họ hàng giữa các giống lạc trồng và lạc dại [45]. Kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây để phân tích di truyền hệ thống sinh học. Nó là phương pháp hiệu quả trong việc 22 xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền. 1.2.3. Tình hình nghiên cứu sự đa dạng di truyền của ngô bằng kỹ thuật RAPD Vasconcelos M.J.V.D và cs (2008) sử dụng kỹ thuật RAPD với 47 mồi ngẫu nhiên đã nhân được 221 băng DNA trong đó có 130 băng biểu hiện đa hình [50]. Souza S.G.H.D. và cs (2008) xác định quan hệ di truyền của 16 dòng ngô lai với sử dụng 22 mồi RAPD khuếch đại được 265 băng DNA và 16 cặp mồi SSR khuếch đại được 75 băng DNA, 16 dòng ngô được chia thành 3 nhóm [47]. Okumus A. (2007), 17 giống ngô của Turkey được sử dụng nghiên cứu với 14 mồi RAPD thu được 125 băng đa hình (chiếm 89%), hệ số sai khác giữa các giống ngô từ 0,08-0,2 [42]. Abdel - Mawgood A.L. và cs (2006) đã sử dụng một số các chỉ thị phân tử RAPD, SSR, 18S rRNA gen …để kiểm tra các dòng ngô, trong đó có ba giống ngô tự nhiên (L1, L2, L3) và hai giống lai F1 bắt nguồn từ họ H1 và H2. Hai trong 5 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu biểu hiện tính đa hình, một trong những mồi cho đa hình đã xác định được con lai H2 từ hai dòng thuần. Đối với 18S rRNA thì không phát hiện được các băng đa hình [22]. Asif M. và cs (2006) đã tiến hành phân tích DNA cho 6 giống ngô lai bằng cách sử dụng các mồi ngẫu nhiên để khuếch đại đa hình DNA bằng kỹ thuật RAPD. Tác giả đã sử dụng 40 mồi ngẫu nhiên, trong đó có OPR – 03, OPR – 11 và OPR- 06 đã cho đa hình. Kết quả đã kiểm tra được 3 trong rất nhiều giống ngô lai và cũng phân biệt được nguồn gốc của một số giống ngô lai. Tác giả đã kết luận RAPD là một công cụ hữu hiệu để phát hiện sự tinh khiết của giống lai nhằm nâng cao hiệu quả trong trồng trọt và chăn nuôi [25]. 23 Valdemar P. C. và cs (2004) nghiên cứu khoảng cách di truyền của 81 giống ngô trong đó có 79 thuộc vùng bắc Châu Âu và 2 giống cải tiến. Sử dụng kỹ thuật RAPD với 32 mồi được khuếch đại, cao nhất là 255 chỉ thị mà có 184 băng DNA (chiếm khoảng 72,2%) là đa hình. Dựa trên những chỉ thị RAPD, việc lập một phả hệ sử dụng phương pháp UPGMA. Tỷ lệ kiểu di truyền tương tự nhau từ 0,78 đến 0,91. Nhóm số liệu phân tử tập hợp thành 2 nhóm chính, mà màu sắc hạt có tương quan với nhau [40]. Naureen Z. và cs (2005) nghiên cứu đa hình của 30 chủng vi khuẩn ở rễ ngô nhằm chọn tạo giống ngô cho năng suất cao và tách dòng vi khuẩn rhizo rễ ngô. Các tác giả đã sử dụng 30 mồi oligonucleotide, kết quả sự đa dạng di truyền đạt mức đáng kể với khoảng cách di truyền 2 – 16% [41]. Amorime. P. và cs (2003) đã sử dụng các chỉ thị phân tử RAPD và SSR để chọn lọc 13 giống ngô đường. Trong đó, sử dụng 50 mồi RAPD tạo được 104 băng (chiếm 72,2%), còn sự phân tích SSR đánh giá 7 locus với 42 alen đạt giá trị PEC từ 0,5 đến 0,89. Ước tính sự tương đồng di truyền đối với mồi RAPD là 0,79, còn chỉ thị SSR là 0,49 [24]. Osipova E.S. và cs (2001) nghiên cứu sự khác nhau di truyền học giữa dòng ngô A188 và dòng soma bắt nguồn từ A188, được đánh giá qua sự phân tích của kỹ thuật RAPD. Sử dụng 15 mồi trong số 17 mồi decanucleotie, từng mồi cho sự khuếch đại đạt từ 2 – 17 phân đoạn dài 200 – 2000 bp. Mô hình RAPD không khác giữa những các cá thể của dòng A188, biểu hiện tính đồng nhất về di truyền học cao. Sự khác nhau giữa dòng ban đầu và dòng soma cao từ 64 – 72%. Căn cứ vào sự phân ly di truyền dòng soma chia làm 2 nhóm. Sự phân biệt những nhóm dòng soma này phù hợp với nguồn gốc của chúng [43]. Bauer I (2005) nghiên cứu đặc tính trưởng thành sớm của ngô lai thu được bằng cách đánh dấu protein và RAPD. Khi sử dụng mồi RAPD cho thấy tỉ lệ đa hình cao hơn đánh dấu protein [26]. 24 Ở Việt Nam, Bùi Mạnh Cường và cs (2002) đã tiến hành nghiên cứu sự đa hình di truyền của một số giống ngô và xác định được một số cặp lai ưu tú có khả năng cho ưu thế lai cao [5]. Ngô Hữu Tình và cs (2002), nghiên cứu khoảng cách di truyền của các cặp lai và nhóm ưu thế lai ở một giống ngô, kết quả tuyển được 7/28 cặp lai cho năng suất cao[19]. Ngô Việt Anh (2005) đã sử dụng kỹ thuật RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên đã nhận được 150 phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên từ hệ gen của 7 giống ngô nếp địa phương. Cả 5 mồi sử dụng trong nghiên cứu đều biểu hiện tính đa dạng và có 16 phân đoạn DNA đa hình chiếm 51,6% [1]. 1.3. NHẬN XÉT CHUNG Trong những năm gần đây phương hướng sản xuất ngô ở nước ta là cần tăng cường diện tích trồng ngô lai năng xuất cao trên cơ sở ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật nhằm tăng năng suất để đạt và vượt mức trung bình của thế giới. Tuy nhiên, trong thực tế sản xuất ngô Việt Nam vẫn phải nhập nội rất nhiều các giống ngô mà vẫn có những mùa bị thất thu do giống không đảm bảo chất lượng. Vì vậy, việc nghiên cứu hóa sinh hạt ngô nhằm tìm ra các giống ngô có năng suất cao, chất lượng tốt và ổn định là góp phần chọn được các giống có năng suất và chất lượng ổn định. Những công trình đánh giá sự di truyền của cây ngô ở nước ta còn ít. Sự đa dạng di truyền sẽ chỉ ra được mức độ sai khác giữa các giống ngô nghiên cứu ở mức độ phân tử đồng thời giải thích được tính đa dạng nguồn gen của cây ngô. 25 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Vật liệu thực vật Sử dụng 14 giống ngô làm vật liệu nghiên cứu. Nguồn gốc, đặc điểm nơi thu mẫu được trình bày ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Danh sách 14 giống ngô nghiên cứu STT Giống Nguồn gốc Đặc điểm nơi thu mẫu 1 TL Trà Lĩnh – Cao Bằng Địa hình cao 2 VN Lâu Thượng – Võ Nhai Địa hình cao 3 CB Phục Hoà – Cao Bằng Địa hình cao 4 SLO Bản Lầm – Sơn La Địa hình cao 5 T26 Sông Bằng – Cao Bằng Địa hình cao 6 SL Bản Đen – Sơn La Địa hình cao 7 SLV Bản Cóc – Sơn La Địa hình cao 8 TQ Hàm Yên – Tuyên Quang Địa hình cao 9 ÔL Phú Lương – Thái Nguyên Địa hình cao 10 ĐP Phú Bình – Thái Nguyên Trung du 11 LC Than Uyên – Lai Châu Địa hình cao 12 SLT Bản Cóc – Sơn La Địa hình cao 13 YB Văn Chấn – Yên Bái Địa hình cao 14 T4 Quyết Thắng – Thái Nguyên Trung du 2.1.2. Hoá chất Sử dụng các loại hoá chất tinh khiết nhập từ các nước Mỹ, Trung Quốc, Đức, Anh, Thụy Điển như: Tris, EDTA, CTAB, taq – polymerase, agarose, buffer PCR, MgCl2, dNTPs, NaCl, sorbitol, NaH2PO4.2H2O… và các hoá chất thông dụng khác. 26 2.1.3. Thiết bị Nồi hấp khử trùng (Sturdy - Tai Wan); Lò vi sóng (Sharp); Máy soi gen tia UV (Weatea - USA); Nguồn điện di DNA (USA); Máy li tâm (Hettich – Germary); Máy lắc nhuộm DNA (UK); Cân điện tử; Máy khuấy trộn Vortex; Máy đo pH (Mettler Toledo); Bể ổn nhiệt; Tủ sấy (Memmert); Tủ cấy vô trùng; Tủ lạnh sâu -20oC, -80oC (Sanyo, Nhật Bản); Máy PCR (Applied Biosystems- Mỹ); Máy quang phổ (Thermo Electron). Và một số thiết bị khác như: ống eppendorf, đầu côn, pipet man, ống PCR… 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phƣơng pháp hóa sinh 2.2.1.1 Xác định hàm lƣợng lipid Hàm lượng lipid được xác định trên hệ thống bán tự động Soxhlet của hãng Gerhardt, gồm có: bình cầu, trụ chiết, ống sinh hàn. Dựa vào tính chất hoà tan của dung môi hữu cơ để chiết lipid, dung môi hữu cơ được sử dụng là petroleum ether. 2.2.1.2 Xác định hàm lƣợng protein Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Kjeldahl. Nguyên lý: mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 98% kết hợp với chất xúc tác để chuyển nitơ hữu cơ thành (NH4)2SO4 rồi dùng NaOH để đẩy NH3 ra khỏi muối amoni. NH3 sau khi được giải phóng ra sẽ được cuốn đi bằng dòng hơi nước nóng. Sau khi được làm nguội sẽ hấp thụ vào dung dịch H3BO3 ở trong bình hứng tạo ra muối borat amon có màu xanh trong. Để xác định được lượng amoniac giải phóng ra trong quá trình chưng cất ta đem đi chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N đến khi dung dịch chuyển sang màu tím nhạt. Từ lượng H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ sẽ tính được lượng protein có trong mẫu. 27 2.2.1.3. Xác định hàm lƣợng đƣờng tan - Xác định hàm lượng đường theo phương pháp Bertrand được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs [4]. - Nguyên tắc: Đường trực tiếp khử oxi của hydroxit đồng ở môi trường kiềm mạnh làm cho nó bị kết tủa dưới dạng đồng hóa trị 1 (Cu2O) có màu đỏ gạch. Số lượng đồng hóa trị 1 tương ứng với số lượng đường khử theo phương trình phản ứng: RCHO + 2Cu(OH)2 → RCOOH + Cu2O + 2H2O Cu +1 + Fe 3+ + H2SO4 → 2CuSO4 + H2O + 2FeSO4 FeSO4 có tính khử oxi tác dụng với KMnO4 do đó dùng KMnO4 để chuẩn độ. Từ số ml KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ sẽ xác định được hàm lượng đường khử. 2.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.2.1. Phƣơng pháp tách DNA từ lá non của ngô - Quy trình tách chiết và làm sạch DNA tổng số từ lá ngô theo phương pháp của Gawel và cs [31]. Quy trình tách chiết DNA tổng số đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau: - Lấy khoảng 200g lá ngô non đã để lạnh ở -850C ở nghiền nhanh trong cối chày sứ có chứa nitơ lỏng. - Bổ sung 0,8ml đệm rửa, li tâm 15 phút, 12000 vòng/ phút, loại bỏ dịch nổi. Bước này làm 2 lần. - Thêm 700µl đệm tách, mix nhẹ, ủ 650C trong 2h, sau đó lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút. - Thêm 600µl cloroform:isoamyl alcohol (24:1 ), trộn đều 20 phút - Li tâm 15 phút, 12000 vòng/phút. Hút cẩn thận 500µl dịch trong sang ống eppendorf 1,5 ml mới ( bỏ tủa). 28 - Thêm 600µl isopropanol, lắc nhẹ, đặt lên đá (để tủ lạnh qua đêm), chờ có dịch tủa trắng. - Li tâm 5 phút, 13000 vòng/ phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. - Bổ sung 300µl cồn 70%, búng nhẹ. Li tâm 5 phút, 13000 vòng/ phút, loại bỏ cồn (thực hiện 2 lần). - Làm khô DNA. - Hòa tan DNA trong 50 µl nước khử ion. - Kiểm tra chất lượng DNA thu được thông qua điện di trên gel agarose 0,8%. - Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ và pha loãng về nồng độ sử dụng 10ng/µl. 2.2.2.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch DNA tổng số Phương pháp quang phổ hấp thụ Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bước sóng  = 260 nm và  = 280 nm. Hàm lượng và độ sạch của DNA trong dung dịch tách chiết được tính theo công thức: Hàm lượng DNA (ng/l) = OD260×50× hệ số pha loãng. Độ sạch DNA = OD260/OD280. Trong đó: OD260: chỉ số đo được ở bước sóng 260 nm OD280: chỉ số đo được ở bước sóng 280 nm Nếu độ sạch DNA = 1,8 - 2,0 thì mẫu được coi là sạch. Phương pháp điện di DNA tổng số trên gel agarose - Pha agarose 0,8% trong TAE 1X, đun nóng cho tan agarose trong lò vi sóng, để nguội khoảng 60oC; Đổ bản gel và đợi cho khô (khoảng 1 giờ) sau đó tháo lược. - Lấy 5 µl mẫu DNA tách được trộn với 2 µl dye 6X, tra mẫu vào giếng điện di. - Chạy điện di với điện thế 80V trong 30 phút. 29 - Lấy bản gel nhuộm ethidium bromide 0,5 µl/ml trong 10 phút, rửa lại bằng nước. - Soi bản gel trên máy soi gen tia UV, chụp ảnh. 2.2.2.3. Phản ứng RAPD Phản ứng RAPD được tiến hành với các mồi ngẫu nhiên theo phương pháp của Foolad và cs (1990) [29]. - Sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên được tổng hợp tại hãng Invitrogen, mỗi mồi dài 10 nucleotide, thông tin về trình tự các mồi sử dụng được trình bày trong bảng 2.2 Phản ứng RAPD được thực hiện trong 20 µl dung dịch với thành phần trong bảng 2.3. Tiến hành nhân bản DNA trong máy PCR với chu trình nhiệt của phản ứng RAPD là 1 chu kì 94oC trong 3 phút; 45 chu kì với nhiệt độ (92 o C trong 30 giây, 36 o C trong 45 giây, 72 o C trong 1 phút); 1 chu kì 72 o C trong 10 phút; lưu giữ ở 4oC. Bảng 2.2. Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu STT Tên mồi Trình tự nucleotide 1 M1 5’ AACCGACGGG 3’ 2 M2 5’ GGGGGTCGTT 3’ 3 M3 5’ TACCACCCCG 3’ 4 M4 5’ GGCGGACTGT 3’ 5 M5 5’ TCGGCGATAG 3’ 6 M6 5’ GTGTCTCAGG 3’ 7 M8 5’ GGAAGTCGCC 3’ 8 M9 5’ CCTCCAGTGT 3’ 9 RA159 5’ GTCCACACGG 3’ 10 UBC23 5’ CCCGCCTTCC 3’ 30 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RAPD STT Thành phần Thể tích (l) 1 H2O khử ion 11,7 2 Buffer PCR 2,0 3 MgCl2 (25 mM) 2,0 4 dNTP (2,5 mM) 1,2 5 Primer (10 mM) 1,6 6 DNA (10 ng/µl ) 1,0 7 Taq-polymerase 0,5 Tổng 20,0 Điện di sản phẩm RAPD Pha agarose 2% trong TAE 1X. Chạy điện di với hiệu điện thế 100V trong 90 phút. Nhuộm bản gel bằng ethidium bromide 0,5 µg/ml trong 15 phút, rửa sạch bằng nước, soi gel trên đèn UV và chụp ảnh. Phân tích số liệu RAPD Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn DNA khi điện di sản phẩm RAPD của các giống ngô nếp với các đoạn mồi ngẫu nhiên để làm cơ sở cho sự phân tích số liệu theo quy ước: Số 1: xuất hiện phân đoạn DNA, số 0: không xuất hiện các phân đoạn DNA. Các số liệu này được xử lý trên máy vi tính theo chương trình NTSYSpc version 2.0 để xác định quan hệ di truyền của các giống ngô ở mức độ phân tử. 2.2.2.4. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định trị số thống kê như trung bình mẫu ( x ), phương sai ( 2), độ lệch chuẩn (), và sai số trung bình mẫu ( x S ), với n ≤ 30, α = 0,05. Các số liệu được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình Excel [21]. 31 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HÓA SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đặc điểm hình thái của 14 giống ngô nghiên cứu Hình thái và khối lượng hạt là những đặc tính quan trọng trong chọn giống ngô vì nó liên quan đến chất lượng và năng suất. Kết quả nghiên cứu hình thái và khối lượng 100 hạt được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái và khối lượng hạt của 14 giống ngô nếp địa phương STT Giống Hình thái hạt Khối lƣợng 100 hạt (g) Màu vỏ hạt 1 TL Hạt nhỏ, góc cạnh 16,09 ± 0,001 Trắng ngà 2 VN Hạt tròn, mẩy 16,72 ± 0,002 Trắng vàng, tím 3 CB Hạt tròn, mẩy 20,45 ± 0,003 Trắng ngà 4 SLO Hạt tròn, mẩy 21,21 ± 0,002 Trắng ngà 5 T26 Hạt dẹt, mẩy 28,88 ± 0,003 Vàng 6 SL Hạt dẹt, mẩy 25,50 ± 0,003 Trắng ngà 7 SLV Hạt tròn, mẩy 26,81 ± 0,004 Trắng đục 8 TQ Hạt tròn, mẩy 23,42 ± 0,001 Trắng đục 9 ÔL Hạt nhỏ, dẹt, dài 17,19 ± 0,002 Trắng ngà 10 ĐP Hạt nhỏ, tròn, mẩy 19,63 ± 0,001 Trắng đục, tím 11 LC Hạt tròn, mẩy 24,50 ± 0,001 Trắng đục 12 SLT Hạt nhỏ, dẹt, dài 23,35 ± 0,001 Trắng đục, tím 13 YB Hạt tròn, mẩy 27,42 ± 0,004 Trắng ngà 14 T4 Hạt nhỏ, dẹt 25,46 ± 0,003 Trắng ngà, vàng 32 Tính trạng màu sắc hạt do kiểu gen quy định, ít chịu ảnh hưởng của môi trường. Vỏ bao quanh hạt ngô đó là một màng mỏng, nhẵn có màu trắng, vàng hay tím tuỳ từng giống. Màu sắc vỏ ngô cũng là một chỉ tiêu quan trọng để phân loại các thứ trong loài phụ. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khối lượng 100 hạt của 14 giống ngô dao động trong khoảng 16,09 g đến 28,88 g, cao nhất là giống T26, thấp nhất là giống TL. Khối lượng của hạt phụ thuộc vào kiểu gen từng giống. Thứ tự các giống ngô từ cao xuống thấp xếp theo khối lượng 100 hạt là: T26 > YB > SLV > SL > T4> LC > TQ > SLT > SLO > CB > ĐP > ÔL > VN > TL. Tính trạng khối lượng hạt phụ thuộc vào kiểu gen từng giống. Tuy nhiên, khối lượng 100 hạt có thể bị thay đổi nếu chịu tác động xấu của môi trường ở những giai đoạn nhất định. Hình 3.1. Hình dạng hạt của 14 giống ngô Ký hiệu: 1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6. SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4. 3.1.2. Hàm lƣợng protein, lipid, đƣờng của 14 giống ngô nghiên cứu Để đánh giá chất lượng hạt của 14 giống ngô._.