Nghiên cứu tính đa dạng của Virus y trên Khoai tây trồng tại Thái Nguyên

PGS.TS. Chu Hoàng Mậu Phản biện 1:…………………………………… Phản biện 2:……………………………………. Luận văn sẽ được bảo vệ trước hội đồng chấm luận văn họp tại: Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên Ngày…….tháng………năm 2009 Có thể tìm hiểu luận văn tại thư viện Đại học Thái Nguyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------------------------------ VŨ THỊ BƢỞI NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA VIRUS Y TRÊN KHOAI TÂY TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Chu Hoàng Mậu, Phó Giám đốc Đại học Thái Nguyên, đã rất tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn của mình. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (trƣờng Đại học Khoa học), các thầy cô giáo, cán bộ khoa sau đại học và khoa Sinh (trƣờng Đại học Sƣ phạm-Đại học Thái Nguyên) đã hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Chu Hoàng Hà, chị Phạm Thị Vân, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật-Viện Công nghệ Sinh học và các cán bộ phòng thí nghiệm Di truyền học, khoa Sinh-Trƣờng Đại học Sƣ phạm; phòng thí nghiệm thuộc khoa Sinh-Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình hƣớng dẫn, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin dành cho những ngƣời thân yêu trong gia đình và bạn bè những lời biết ơn sâu sắc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa có ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 9, năm 2009 Tác giả Vũ Thị Bƣởi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iv NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT aa Acid amine DNA DeoxyribonucleicvAcid RNA Ribonuleic Acid bp Basepair cDNA Complementary DNA CP Coat protein cs Cộng sự DEPC Diethyl pyrocarbonate NXB Nhà xuất bản IPTG Isopropylthio-β-D-galactosidase Kb Kilobase LB Luria and Bertani RT-PCR Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction PVY Potato virus Y PVY N Potato virus Y strain N PVY C Potato virus Y strain C PVY O Potato virus Y strain O PVY NTN Potato virus Y strain (variant) NTN RNase Ribonuclease X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên v DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1. Các gen kháng (màu xanh) với 4 virus chủ yếu (PVY, PLRV, PVX, PVA) .............................................................................. Hình 1.2. Những đốm (mottle) điển hình trên cây thuốc lá N. tabacum cv Xanthi gây ra bởi PVY khoai tây sau 15 ngày tiêm ......................... Hình 1.3. Hình dạng của PVY ............................................................. Hình 1.4. Sơ đồ mô tả hệ gen của các chủng PVYO, PVYN và các biến thể PVYNTN, PVYNW ........................................................................... Hình 1.5. Loài rệp có cánh truyền PVY (Aphis nasturtii) ..................... Hình 1.6. Dấu hiệu so sánh PVY trên Nicotiana tabacum cv Xanthi (sau 15 ngày tiêm) ............................................................................... Hình 1.7. Triệu chứng nhiễm lần 2 với PVY trên cánh đồng khoai tây .... Hình 1.8. Triệu chứng của bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD) .... Hình 1.9. Vị trí các gen kháng PVY trên genome khoai tây ................. Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát ................................................... Hình 3.1. Một số hình ảnh về khoai tây ở các vùng nghiên cứu ........... Hình 3.2. Kết quả RT-PCR từ RNA của các mẫu lá khoai tây nghi nhiễm bệnh .......................................................................................... Hình 3.3. Kết quả điện di DNA thu đƣợc từ kỹ thuật thôi gel trên agarose 1% ....... Hình 3.4. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phổ Yên ...... Hình 3.5. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phú Bình ........ Hình 3.6. Kết quả điện di tách plasmid mang gen CP .......................... Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu ........................................................................................... Hình 3.8. So sánh trình tự acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu ........................................................................................... Hình 3.9. Biểu đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của CP- PVY phân lập đƣợc từ Phổ Yên và Phú Bình với 19 trình tự trong ngân hàng gen ...................................................................................... 13 16 16 17 19 21 22 23 24 29 39 41 43 45 46 46 49 50 52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vi DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 1 ............................... Bảng 1.2. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 2 ............................... Bảng 1.3. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 3 ............................... Bảng 1.4. Ảnh hƣởng của bệnh virus đến củ khoai tây ..................... Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu tại các điểm nghiên cứu .............. Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR .............................................. Bảng 2.3. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR ....................................... Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng ........ Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự ........................... Bảng 2.6. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự .................... Bảng 3.1. Tỉ lệ có triệu chứng bị bệnh ở các cánh đồng khoai tây nghiên cứu ....................................................................................... Bảng 3.2. Trình tự mồi đặc hiệu nhân gen CP .................................. Bảng 3.3. Trình tự mồi để thực hiện colony-PCR ............................ Bảng 3.4. 19 trình tự trong ngân hàng gen đƣợc sử dụng để đƣa ra so sánh ............................................................................................. Bảng 3.5. Hệ số giống nhau và khác nhau về trình tự nucleotide vùng mã hoá của gen CP ở mẫu nghiên cứu với các mẫu trên ngân hàng gen NCBI ................................................................................ 8 8 9 10 28 32 32 33 35 36 39 40 45 51 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................... Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................... 1.1. Cây khoai tây .................................................................................. 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và giá trị của khoai tây ............................... 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây ................................. 1.1.3. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và ở Việt Nam ............. 1.2. Virus gây bệnh trên khoai tây.......................................................... 1.2.1. Các loại virus khoai tây ................................................................ 1.2.2. Đặc điểm chính của bệnh virus trên khoai tây .............................. 1.3. Virus Y ở khoai tây ......................................................................... 1.3.1. Phân loại ...................................................................................... 1.3.2. Cây chủ ........................................................................................ 1.3.3. Hình dạng và cấu trúc phân tử ...................................................... 1.3.4. Quan hệ họ hàng với các potyvirus khác ...................................... 1.3.5. Lan truyền của PVY ..................................................................... 1.3.6. Một số đặc điểm của PVY trên khoai tây ..................................... 1.4. Tình hình nghiên cứu PVY trên thế giới và ở Việt Nam .................. 1.4.1. Tình hình nghiên cứu PVY trên thế giới ....................................... 1.4.2. Tình hình nghiên cứu PVY ở Việt Nam ....................................... 1 3 3 3 5 5 6 7 9 14 14 14 16 17 18 20 24 24 27 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 2.1. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................... 2.2. Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu ........................................... 2.2.1. Hóa chất ....................................................................................... 2.2.2. Thiết bị......................................................................................... 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu .................................................................... 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................. 2.3.1. Phƣơng pháp thống kê .................................................................. 2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số ........................................... 28 28 28 28 28 29 29 29 30 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên viii 2.3.3. Phƣơng pháp RT-PCR ................................................................. 31 2.3.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR ......................................... 2.3.5. Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng ................................. 2.3.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α ........ 2.3.7. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) ............... 2.3.8. Tách chiết plasmid ....................................................................... 2.3.9. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide .................................... 2.3.10. Phƣơng pháp xử lí trình tự gen thu đƣợc .................................... Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 3.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ nhiễm PVY ................................................... 3.2. Kết quả nhân gen, tách dòng cDNA ................................................ 3.2.1. Kết quả nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR ..................................... 3.2.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR.................................................. 3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. ...... 3.2.4. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng colony-PCR................. 3.2.5. Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu ...... 3.3. Kết quả so sánh trình tự gen CP-PVY phân lập từ 2 mẫu nghiên cứu với một số trình tự trong ngân hàng gen .......................................... 3.3.1. So sánh trình tự nucleotide và acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu ..................................................................................... 3.3.2. So sánh trình tự nucleotide gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu với các trình tự gen CP-PVY trên khoai tây đã đƣợc công bố trong ngân hàng gen ................................................................................................ KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ............................................................... TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................... 33 33 34 34 34 35 36 38 38 40 40 42 43 44 46 47 47 50 55 56 57 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một cây lƣơng thực chủ lực đứng đầu trong các loại cây lấy củ trên thế giới và đứng thứ 5 trong số các cây lƣơng thực nói chung (chỉ sau lúa mì, gạo, ngô, đậu tƣơng). Củ khoai tây có giá trị dinh dƣỡng cao, đƣợc chế biến thành hàng trăm món ăn đặc sắc, ngon miệng và có lợi cho sức khoẻ con ngƣời. Củ khoai tây còn là nguyên liệu quan trọng trong ngành công nghiệp, chế biến thức ăn cho gia súc. Ngoài ra, khoai tây còn là một dƣợc phẩm dùng để chữa trị nhiều bệnh nhƣ khó tiêu, đau bụng, viêm loét dạ dày, say nắng…Với những lợi ích to lớn đó, khoai tây đã đƣợc trồng ở hơn 130 quốc gia và là một nguồn thu lớn cho hàng triệu nông dân [5]. Ở khoai tây, bệnh virus đã trở thành một hiểm họa. Ngƣời ta thấy có ít nhất 38 loại virus trên khoai tây đã đƣợc phát hiện và mô tả, phổ biến là: PVY (potato virus Y), PLRV (potato leafroll virus), PVX (potato virus X), PVA (potato virus A), PVS (potato virus S)…Trong đó, PVY gần đây đƣợc xem là virus gây bệnh nghiêm trọng nhất (Kerlan, 2008) [40]. Chúng làm giảm kích thƣớc, số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng củ khoai tây, gây thiệt hại kinh tế tới 80% thậm chí còn hơn (Kerlan và cs, 2008) [41]. Mặc dù vậy, nhận thức của nông dân cũng nhƣ những nghiên cứu về bệnh virus trên khoai tây ở nƣớc ta còn rất hạn chế so với các nƣớc Bắc Mĩ và Châu Âu. Do đó, việc chẩn đoán nhanh, chính xác nhằm đƣa ra những biện pháp phòng trừ bệnh thích hợp để hạn chế tối đa những thiệt hại do bệnh virus gây ra là hết sức cần thiết. Hơn nữa, những biện pháp truyền thống sử dụng để ngăn cản sự lan truyền của PVY chỉ mang tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại đƣợc bệnh này, lại tốn nhiều thời gian và công sức. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 Gần đây, với việc áp dụng những kĩ thuật tiên tiến của sinh học phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng, đặc biệt là sử dụng các vật liệu di truyền từ các virus gây bệnh để tạo cây trồng chuyển gen kháng virus đã thu đƣợc kết quả đáng khích lệ nhƣ cây khoai tây chuyển gen Nib kháng PVY. Tạo cây khoai tây chuyển gen kháng virus đƣợc coi là một biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn và hạn chế tác hại do virus gây ra. Nhƣng vấn đề đặt ra là phổ kháng bệnh của những cây chuyển gen này phụ thuộc vào độ tƣơng đồng về mặt di truyền của chủng virus có gen đƣợc sử dụng để tạo cây chuyển gen và các dòng virus gây bệnh trong tự nhiên. Vì vậy khảo sát tính đa dạng di truyền của gen mã hoá cho protein vỏ virus (coat protein- CP) có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus. Xuất phát từ những lí do trên, tôi lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ là: “Nghiên cứu tính đa dạng của virus Y trên khoai tây trồng tại Thái Nguyên”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định sự đa dạng trong cấu trúc gen mã hoá protein vỏ (CP- coat protein) của PVY phân lập từ các mẫu lá khoai tây thu tại một số địa phƣơng thuộc tỉnh Thái Nguyên. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1. Khảo sát, thống kê và xác định tỉ lệ nhiễm PVY trên khoai tây ở Thái Bình, Thái Nguyên, Hƣng Yên, Bắc Giang làm cơ sở cho việc thu mẫu và xác định sự có mặt của virus PVY. 3.2. Tách chiết RNA của virus từ các mẫu khoai tây thu thập đƣợc. 3.3. Nhân gen CP, tách dòng và đọc trình tự gen CP của PVY trong các mẫu khoai tây. 3.4. So sánh trình gen CP của PVY phân lập đƣợc với một số trình tự đã công bố trong ngân hàng gen NCBI. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY KHOAI TÂY 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và giá trị của khoai tây Cây khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum L., thuộc họ cà (Solanaceae). Khoai tây có nguồn gốc từ vùng núi Andes của Bolivia và Peru. Vào thế kỉ XVI, ngƣời Tây Ban Nha xâm chiếm Peru và họ đã đem cây khoai tây về nƣớc trồng. Đến cuối thế kỉ XVI, khoai tây đã đƣợc trồng rộng rãi ở nhiều nƣớc Châu Âu (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12], (Macdec, 1963) [45]. Khoai tây đƣợc du nhập vào nƣớc ta là do một ngƣời Pháp là giám đốc vƣờn bách thảo Hà Nội đem vào trồng thử, và nó nhanh chóng đƣợc trồng ở nhiều địa phƣơng. Do ngƣời Pháp là ngƣời đem cây về nƣớc ta và phổ biến cách trồng nên nhân dân ta gọi cây này là “khoai tây” (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12], (Macdec, 1963) [45]. Khoai tây vừa là cây lƣơng thực vừa là cây thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao. Củ khoai tây chứa trung bình 19% hydratcacbon (trong đó 15% tinh bột; 2,2% chất xơ); 0,1% chất béo; 2-3% protein và 79% là nƣớc. Ngoài ra, trong khoai tây còn chứa nhiều loại vitamin và chất khoáng. Ngƣời ta đã tính khoảng hơn 200g khoai tây nƣớng cả vỏ cung cấp 844mg kali; 28% khẩu phần sắt hàng ngày; 43% khẩu phần vitamin C; 35% khẩu phần vitamin B6 và nhiều chất khác nhƣ niacin, thiamin, folat…. (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12]. Còn theo Bill và Dean (1992), sử dụng 100g khoai tây có thể đảm bảo ít nhất 8% nhu cầu protein; 3% nhu cầu năng lƣợng; 10% nhu cầu sắt; 19% nhu cầu vitamin B1; 20-50% nhu cầu vitamin C của ngƣời trong một ngày (Bill và cs, 1992) [18]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Khoai tây đƣợc chế biến thành hàng trăm món ăn ngon phục vụ nhu cầu ẩm thực của con ngƣời. Không chỉ vậy, khoai tây còn đƣợc coi là công cụ làm đẹp hiệu quả và dễ sử dụng nhất. Ngoài ra, củ khoai tây cũng còn là nguyên liệu quan trọng của ngành công nghiệp, chế biến thức ăn trong chăn nuôi. Trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, khoai tây đã đƣợc chế biến thành nhiều sản phẩm thơm ngon, có giá trị dinh dƣỡng cao. Khoai tây cũng đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất cồn, cao su nhân tạo (Hồ Hữu An và cs, 2005) [1]. Đặc biệt, khoai tây cũng là một dƣợc phẩm. Củ khoai tây có vị ngọt, tính bình, có tác dụng bổ khí, kiện tỳ, tiêu viêm. Nó dùng để chữa chứng khó tiêu, đau bụng, viêm loét dạ dày, viêm tuyến nƣớc bọt, say nắng, sốt, bỏng nhẹ, eczema, vết thƣơng…Hoa khoai tây chữa bệnh tăng huyết áp và là nguyên liệu chiết rutin để chữa bệnh. Quả và mầm củ khoai tây ít đƣợc dùng làm thuốc vì dễ gây độc. Trong công nghiệp dƣợc phẩm, chúng đƣợc chiết lấy solanin để làm thuốc giảm đau, chữa đau bụng, đau nhức xƣơng khớp, chữa dị ứng, chống hen, viêm phế quản, động kinh (Hƣơng Tú, 2008) [11]. Trong củ khoai tây có nhiều chất chống oxi hoá, nó có khả năng ngăn ngừa quá trình lão hoá, hạn chế sự phát triển của ung thƣ và một số bệnh khác. Các nhà nghiên cứu tại trƣờng Đại học Y Harvard-Mỹ đã phát hiện ra rằng: những ngƣời thƣờng xuyên ăn khoai tây có khả năng giảm ung thƣ tuyến tiền liệt (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12]. Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy củ khoai tây rất giàu sterol, giúp tăng cƣờng khả năng miễn dịch của cơ thể. Có nghiên cứu cho thấy, khoai tây có tác dụng làm chậm sự tấn công của HIV/ AIDS. Theo dõi trên một nhóm bệnh nhân HIV thấy những ngƣời ăn khoai tây có khả năng sống thêm đƣợc ít nhất 2 năm nữa so với những bệnh nhân không ăn (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây Cây khoai tây thuộc loại thân thảo, bao gồm các bộ phận thân, lá, rễ, hoa, quả, hạt. Thân và lá khoai tây có nhiều lông, lá kép lông chim không đối xứng. Hoa cân đối, cánh hoa có gốc dính liền nhau. Nhị đực kết dính thành ống hoặc chóp cụt, nhị cái ở trên và dễ rụng. Cây khoai tây chủ yếu là tự thụ, một số trƣờng hợp giao phấn. Cánh hoa có các màu: trắng, tím- đỏ, tím xanh, xanh thẫm. Quả có hai ô, hạt rất nhỏ có mầm uốn cong. Khoai tây thƣờng đƣợc nhân giống bằng củ. Củ là phần phình to của phần thân cây nằm dƣới đất chứa nhiều chất dinh dƣỡng (Hồ Hữu An và cs, 2005) [1], (Đƣờng Hồng Dật, 2005) [3], (Trƣơng Quang Vinh, 2007) [14]. Ở nƣớc ta, khoai tây địa phƣơng trồng phổ biến ở phía Bắc là giống Thƣờng Tín, và phía Nam là giống Đà Lạt. Các giống nhập nội của Trung Quốc, Đức, Pháp, Hà Lan…hiện đang đƣợc trồng ở nhiều nơi (Nguyễn Mạnh Chinh, 2005) [2]. Ở đồng bằng sông Hồng, khoai tây chủ yếu trồng ở vụ đông vào tháng 10, 11, thu hoạch tháng 1, 2 năm sau. Ở các tỉnh miền núi phía Bắc và Đà Lạt trồng muộn hơn một chút khoảng tháng 1, 2 để tránh sƣơng giá vào tháng 11, 12 (Nguyễn Mạnh Chinh, 2005) [2]. 1.1.3. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và ở Việt Nam Khoai tây đƣợc trồng phổ biến ở 130 nƣớc trên thế giới. Do điều kiện sinh thái, mức độ thâm canh và trình độ sản xuất khác nhau nên năng suất khoai tây chênh lệch rất lớn, từ 7 tấn/ha đến 65 tấn/ha. Tính đến năn 2005, trên thế giới trồng đƣợc 18,57 triệu ha khoai tây, sản lƣợng đạt 320,15 triệu tấn (bằng 60-70% tổng sản lƣợng lúa hay mì). Diện tích khoai tây của thế giới trong những năm gần đây có xu hƣớng giảm nhẹ. Năm 2005, diện tích khoai tây giảm 0,37 triệu ha so với năm 2003; giảm 1,37% triệu ha so với năm 2000. Tuy vậy, năng suất khoai tây trung bình lại có xu hƣớng tăng. Năm 2005, năng suất khoai tây tăng 0,79 tấn/ha so với năm 2000 và tăng 1,32 tấn/ha so với năm 2001 (FAO, 2005) [30]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Trong những năm gần đây, ở nƣớc ta diện tích trồng khoai tây ngày một tăng, nhƣng tốc độ tăng không cao. Năng suất khoai tây của nƣớc ta chỉ bằng 61,3% năng suất bình quân chung của thế giới, bằng 62,9% năng suất khoai tây của Châu Âu (FAO, 2005) [30]. Nhƣ vậy, khoai tây ở nƣớc ta đã và đang phát triển nhƣng tốc độ mở rộng diện tích và tăng năng suất hằng năm không cao, không ổn đinh. Có thể đƣa ra 2 nguyên nhân quan trọng dẫn đến hiện tƣợng này là: + Thiếu giống có chất lƣợng tốt, phù hợp với điều kiện khí hậu. + Chƣa có biện pháp phòng trừ bệnh đặc biệt là bệnh virus có hiệu quả (Trƣơng Quang Vinh, 2007) [14]. 1.2. VIRUS GÂY BỆNH Ở KHOAI TÂY Hiện tƣợng thoái hoá khoai tây, do virus gây ra, đã đƣợc mô tả và phát hiện ngay từ thế kỉ XVIII, nhƣng tác nhân gây ra nó phải đến tận thế kỉ XX mới đƣợc xác định. Virus cuốn lá (potato leafroll virus viết tắt là PLRV) là virus đƣợc phát hiện đầu tiên vào năm 1916 bởi Quanfer, Vanderlek và O. Botfes. Những virus chủ yếu gây khảm trên khoai tây (potato virus M, potato virus X, potato virus Y, potato virus A) đƣợc xác định trong những năm 1920 và 1930. Những virus quan trọng khác chỉ đƣợc phám phá trong những năm 1950 (tobacco rattle virus, potato virus S) hoặc giữa những năm 1960 (potato mop-top virus) (Vũ Triệu Mân, 1986) [6], (Kerlan, 2008) [40]. Trong 4 thập kỉ gần đây, ngƣời ta đã phát hiện thấy số lƣợng virus ngày càng gia tăng ở châu Mỹ La Tinh, đặc biệt là trong châu thổ Andean, nơi đƣợc xem là khởi nguồn của khoai tây. Nhiều virus phổ biến ở các cây chủ khác, đôi khi lại nhiễm vào khoai tây. Một số chúng, ví dụ nhƣ virus đốm héo cà chua (tomato spotted wilt virus), gây bệnh cho khoai tây và có thể trở nên nghiêm trọng trong tƣơng lai. Nhiều tác giả cũng lƣu ý rằng, một virus truyền qua con đƣờng tiếp xúc, nhƣ pepino mosaic virus, cho đến nay vẫn chƣa đƣợc phát Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 hiện trên khoai tây, cũng có khả năng nhiễm vào nhiều cây khoai tây quan trọng và trở thành một hiểm họa trong tƣơng lai. Những ngƣời trồng khoai tây ở nhiều quốc gia đã thừa nhận rằng khoai tây giống ảnh hƣởng lớn tới hiệu quả sản xuất. Chƣơng trình sản xuất khoai tây giống phát triển trong những năm 1940 và 1950. Khoai tây giống đƣợc chứng nhận với mức độ nhiễm virus thấp bây giờ đã trở thành nhân tố chính trong cuộc chiến chống virus. Nhân giống kháng mạnh với virus cuộn lá (potato leafroll virus) đƣợc sử dụng ít nhất là từ những năm 1925 và khả năng kháng virus của nhiều cây dại họ cà đã đƣợc khai thác. Ba kiểu kháng đƣợc mô tả từ những năm 1950 và thông tin di truyền về yếu tố quy định khả năng kháng đƣợc xác định từ những năm 1970. Hiện nay, nhiều gen chống chịu đã đƣợc xác định vị trí trên genome khoai tây, tạo điều kiện cho công tác nhân giống kháng virus dựa trên các chỉ thị phân tử. Hàng loạt những biện pháp mạnh đã đƣợc xác lập để tránh sự xâm nhập của các virus kiểm dịch (Kerlan, 2008) [40]. Sử dụng vật liệu di truyền từ các virus gây bệnh để tạo cây chuyển gen kháng virus đƣợc xem là biện pháp hữu hiệu và đã thu đƣợc kết quả khá khả quan. 1.2.1. Các loại virus khoai tây Ở khoai tây có ít nhất 38 virus đã đƣợc mô tả (Kerlan, 2008) [40]. Dựa trên mức độ thiệt hại và phạm vi phân bố, virus khoai tây đƣợc phân chia thành 3 nhóm: + Nhóm 1: Gồm những virus gây thiệt hại đáng kể, phân bố tƣơng đối rộng trên thế giới. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 Bảng 1.1. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 1 Loài Chi Năm đầu tiên đƣợc nói đến Thiệt hại về kinh tế Phân bố Potato virus Y (PVY) Potyvirus 1931 Rất cao Rộng khắp Potato leafroll virus (PLRV) Polerovirus 1916 Rất cao Rộng khắp Potato virus X (PVX) Potexvirus 1931 Cao Rộng khắp Potato virus A (PVA) Potyvirus 1932 Vừa phải Rộng khắp Potato virus S (PVS) Carlavirus 1952 Vừa phải Rộng khắp Potato virus M (PVM) Carlavirus 1923 Vừa phải Rộng khắp Tobacco rattle Tobravirus 1946 Cao Rộng khắp Potato mop-top virus (PMTV) Pomovirus 1966 Khá cao Chủ yếu ở khí hậu lạnh + Nhóm 2: Gồm những virus chỉ xuất hiện ở Châu Mỹ La Tinh, ít hay không gây thiệt hại về kinh tế. Bảng 1.2. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 2 Loài Chi Năm đầu tiên đƣợc nói đến Thiệt hại về kinh tế Phân bố Andean potato latent virus (APLV) Tymovirus 1966 Rất thấp Bolivia, Colombia, Ecuador, Peru Andean potato mottle virus (APMoV) Comovirus 1977 Chƣa biết Chili, Ecuador, Peru, Brazil Arracacha virus B- oca strain (AVB-O) Nepovirus 1981 Chƣa biết Bolivia, Peru Potato deforming mosaic virus (PDMV) Begomovirus 1985 Cao ở một cây Bắc Brazil Potato rough dwart virus (PRDV) Carlavirus 1995 Rất thấp Argentina, Uruguay Potato virus T (PVT) Trichovirus 1977 Chƣa biết Bolivia, Peru Potato virus U (PVU) Nepovirus 1983 Không có Peru Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 + Nhóm 3: Gồm những virus xuất hiện ở những vùng khác nhau trên thế giới, mức độ thiệt hại không đáng kể hay chỉ cục bộ. Bảng 1.3. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 3 Loài Chi Năm đầu tiên đƣợc nói đến Thiệt hại về kinh tế Phân bố Alfalfa mosaic virus (AMV) Alfamovirus 1940 Chỉ cục bộ Hiếm thấy Eggplant mottled Dwarf virus (EMDV) Nucleorhabdovirus 1987 Rất thấp Iran Potato aucuba Mosaic Virus (PAMV) Potexvirus 1961 Thấp Hiếm thấy Potato latent virus (PotLV) Carlavirus 1996 Chƣa biết Bắc Mỹ Potato virus V (PVV) Potyvirus 1986 Thấp Bolivia, Peru, Bắc châu Âu 1.2.2. Đặc điểm chính của bệnh virus trên khoai tây 1.2.2.1. Triệu chứng và thiệt hại Virus gây ra các triệu chứng chủ yếu là: khảm, đốm hay sự đổi màu, bộ lá bị quăn cuộn hay méo mó, sự rụng lá, còi cọc hay biến dạng của cây (Vũ Triệu Mân, 2007) [7]. Các kiểu chết hoại khác nhau có thể xuất hiện trên lá, thân và củ có thể ở cả trong và ngoài. Kích thƣớc, số lƣợng, diện mạo và chất lƣợng của củ có thể bị ảnh hƣởng (Kerlan, 2008) [40]. Theo Vũ Triệu Mân, ở Việt Nam, các bệnh virus ảnh hƣởng lớn tới năng suất củ khoai tây. Trọng lƣợng củ trên khóm giảm, tỉ lệ củ lớn thấp hoặc không có, tỉ lệ củ nhỏ tăng cao. Nhiều củ không sử dụng để làm lƣơng thực hay thực phẩm đƣợc mà phải dùng làm thức ăn gia súc hay loại bỏ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Thiệt hại do bệnh virus khoai tây gây ra đƣợc chú ý nhiều hơn ở ngoài cánh đồng, nhƣng thực ra ngay ở trong kho bảo quản bệnh cũng gây ra thiệt hại. Một số điều tra cho thấy, củ khoai tây thuộc giống Ackersegen bị nhiễm virus Y, X, S, M và virus cuốn lá (PLRV) khi đƣa vào bảo quản đều tăng lƣợng củ thối và giảm khả năng nảy mầm (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]. Bảng 1.4. Ảnh hƣởng của bệnh virus đến củ khoai tây (tính bình quân 20 khóm mỗi loại hình bệnh). (Theo Vũ Triệu Mân, 1973 -1977) Chỉ tiêu theo dõi Loại hình khóm bệnh Khóm khoẻ Xoăn lùn Cuốn lá Khảm lá Trọng lƣợng củ (g/khóm) 30,0 225,0 240,0 295,0 Tỉ lệ % củ lớn (%) 0,0 9,2 7,7 10,4 Tỉ lệ % củ trung bình(%) 38,0 42,4 56,3 55,8 Tỉ lệ củ nhỏ(%) 62,0 48,4 36,0 30,8 Tác hại của bệnh virus phụ thuộc vào nhiều yếu tố: điều kiện sống (khí hậu, thổ nhƣỡng, biện pháp chăm sóc), cây trồng có khả năng chống chịu khác nhau và loại, chủng virus gây bệnh. Có những vùng ở Tây Âu, virus cuốn lá làm giảm tới 90% sản lƣợng dự thu khi bệnh nặng. Trong khi đó, thiệt hại ở Đông Âu phần lớn lại do virus Y gây ra. Ở Việt Nam, virus cuốn lá gây hại nhẹ, nhƣng virus Y lại gây hại nặng. Nhìn chung, nơi có khí hậu ẩm và lạnh năng suất khoai tây giảm ít hơn so với nơi có khí hậu nóng và khô khi bị bệnh virus. Giống khoai tây kháng virus gồm nhiều loại: kháng cao, kháng trung bình, chịu bệnh. Virus có thể có trong giống chịu bệnh nhƣng cây không có triệu chứng, mặc dù chúng có thể là nguồn lây nhiễm cho những cây khác. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Ngƣời ta thấy cả khi ngoại cảnh rất phù hợp cho bệnh phát triển, nhƣng năng suất và phẩm chất củ bị ảnh hƣởng rất ít. Nhiều tác giả nhận thấy các cây ở các dòng lai có thể chống virus Y, X, S, M và virus cuốn lá Ở cây khoai tây có một hiện tƣợng đáng chú ý là sự xâm nhiễm hỗn hợp của nhiều virus trên một cây bệnh. Trong trƣờng hợp này, cây bệnh thƣờng có hiện tƣợng thoái hoá rất nặng và thiệt hại về năng suất rất nghiêm trọng (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]. Sự nhiễm virus và một số bệnh hại khác ở khoai tây có mối quan hệ với nhau và cần xem sự nhiễm virus nhƣ một chỉ tiêu đánh giá sự nhiễm bệnh nấm của cây khoai tây. Bệnh thối trong kho do nấm Fusarium sẽ tăng lên gấp 5 lần khi củ khoai tây bị nhiễm virus X và tăng gấp 6 lần khi củ khoai tây bị nhiễm nhiều virus cùng lúc (X, S, M) (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]. 1.2.2.2. Lan truyền của virus khoai tây Các virus khoai tây đƣợc truyền có hiệu quả bởi rệp. Rệp có thể định cƣ ở khoai tây hay di cƣ từ cây trồng, cỏ dại khác. Potato leafroll virus (PLV._.R) và potato virus Y (PVY) là những virus điển hình cho việc nghiên cứu cơ chế của sự truyền virus qua rệp theo cách bền vững và không bền vững (persistent and nonpersistent) (Vũ Triệu Mân, 2007) [8]. Nhiều virus ít gây thiệt hại đƣợc truyền qua các côn trùng khác, đáng chú ý là rầy xanh đuôi đen, bộ trĩ, ruồi trắng. Potato virus X (PVX) và một số chủng của potato virus S (PVS) đƣợc truyền bởi sự tiếp xúc giữa bộ lá, các mầm, giữa các củ khi cắt và cũng thông qua các dụng cụ nông nghiệp. Một số virus sinh sản trong đất trồng đƣợc truyền bởi giun tròn (tabacco rattle virus) hoặc nấm (potato mop-top virus, tobacco nerosis virus). Nhiều loài virus Andean có thể truyền bởi hạt (true potato seeds) và phấn hoa. Trong hầu hết các trƣờng hợp thì nguồn lây nhiễm là bản thân cây khoai tây (Kerlan, 2008) [40]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 1.2.2.3. Phƣơng pháp phòng chống bệnh virus khoai tây * Quản lí khoai tây giống Mục đích của công việc này là phân loại chất lƣợng về phạm trù thƣơng mại của khoai tây giống. Tiêu chuẩn này phụ thuộc vào từng nƣớc, tuy nhiên mức độ nhiễm không nên quá 10% với tất cả các virus (Kerlan, 2008) [40]. Quá trình sản xuất khoai tây giống đảm bảo chất lƣợng gồm các bƣớc chính sau: + Nhân giống trong điều kiện mức độ nhiễm virus rất thấp. Ví dụ nhƣ trong ống nghiệm, hay trong nhà kính, ống nhựa ngăn chặn đƣợc vector hay trong những cánh đồng cô lập ở vùng mà khả năng nhiễm virus thấp. + Kiểm tra cánh đồng bao gồm: - Tỉa cây bị bệnh - Diệt tất cả các nguồn lây nhiễm - Có biện pháp xử lí chống lại các vector (sinh vật trung gian truyền bệnh), đặc biệt là các côn trùng + Sử dụng kĩ thuật trồng đặc biệt tính đến ngăn chặn các vector nhƣ tỉa cành khoai tây, trồng cây hàng rào. + Quản lí vụ thu hoạch: Kiểm tra ở phòng thí nghiệm trên diện rộng, thông thƣờng sử dụng ELISA, đôi khi là các kĩ thuật phân tử. * Nhân giống kháng virus Có 3 kiểu kháng virus là: Resistance to infection hay field resistance; hypersensitivity resistance (HR); extrem resistance (ER). Resistance to infection đƣợc di truyền đa gen, đƣợc xác định bởi số củ con cháu bị nhiễm. Nó bao gồm cả sự kháng với virus lẫn với tác nhân truyền bệnh. Mức độ kháng phụ thuộc mạnh vào điều kiện môi trƣờng, thời gian nhiễm, chất tiêm nhiễm và vector. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 HRvà ER đƣợc quy định bởi các gen trội đơn lần lƣợt N và R. ER là một dạng tăng cƣờng của HR (ER is an enhanced form of HR), kết quả là triệu chứng không rõ ràng và không có sự nhiễm vào cơ thể. Ngƣợc lại, HR gây ra những tổn thƣơng chết hoại cục bộ trên các lá đƣợc tiêm và trong hầu hết các trƣờng hợp sự chết hoại này mở rộng tới lá thấp hay cao hơn, tới thân và củ. Mặc dù virus phân bố không đều nhƣng có thể đƣợc phát hiện trong tất cả các cơ quan. Hình 1.1. Các gen kháng (màu xanh) với 4 virus chủ yếu (PVY, PLRV, PVX, PVA) ở khoai tây. (Theo: S. Marchadour, FNPPPT-INRA, Pháp) Các chƣơng trình nhân giống khoai tây resistance to infection của các virus chính đã đƣợc tiến hành từ lâu ở nhiều nƣớc trồng khoai tây. ER cũng đƣợc khai thác cao, đặc biệt là ở các nƣớc mà quy định về khoai tây giống đảm bảo chất lƣợng không đƣợc quản lí thoả đáng. Khả năng bảo vệ chống lại một số virus chính (PVX, PVY, PVA, PVM) quy định bởi gen R đã đƣợc tìm thấy trong một số loài họ cà dại nhƣ: S. stolonniferum, S. andigena, S. chacoense, S. acaule. Những loài này đƣợc sử dụng trong các chƣơng trình nhân giống ngay từ giữa những năm 1940. Gen N có mặt trong nhóm khoai tây cổ bởi vậy nó sát nhập dễ dàng vào cây khoai tây mới. Ngoài ra, khoai tây dễ biến đổi bởi các kĩ thuật di truyền. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 Bên cạnh đó, sự kháng bắt nguồn từ mầm bệnh chống lại một số virus chính (PVY, PVX, PMTV) đã đƣợc nghiên cứu tỉ mỉ (Kerlan, 2008) [40]. * Biện pháp kiểm dịch Các biện pháp kiểm dịch nhằm ngăn chặn nguy cơ xâm nhập của các virus lạ từ một quốc gia hay một lục địa khác. Cho đến bây giờ, chƣa có một loại virus hay chủng nào trong danh sách kiểm dịch truyền ra ngoài vùng khởi đầu của nó. Các kĩ thuật cần thiết cho việc kiểm tra các vật liệu xuất nhập khẩu (củ, cành, hạt, phấn hoa, cây non trong ống nghiệm) đã đƣợc thiết lập. Các virus đƣợc chuẩn đoán bởi các thí nghiệm sinh học trên cây chỉ thị đƣợc chọn lựa, phần lớn kiểm tra bởi ELISA. Các kĩ thuật sinh học phân tử và kính kiển vi điện tử cũng có thể đƣợc sử dụng (Kerlan, 2008) [40]. 1.3. POTATO VIRUS Y 1.3.1. Phân loại Potato virus Y (PVY) thuộc chi potyvirus và họ potyviridae. Đây đƣợc xem là một họ lớn nhất và gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế nhất của virus thực vật (Dimitre và cs, 2004) [28], (Tetsuji Ogawa và cs, 2008) [66]. 1.3.2. Cây chủ Phạm vi cây chủ tự nhiên của PVY gồm những cây thuộc 9 họ. Có thể kể đến các cây sau: Khoai tây (S. tuberosum ssp.tuberosum); một vài loài khoai tây địa phƣơng ở Andes nhƣ A. andigena; nhiều cây dại họ cà; hồ tiêu (Capsicum spp.); thuốc lá (Nicotiana spp.); cà chua (Lycopersicon spp.); cà tím (S. melongena); các cây cảnh (Petunia spp., Dahlia spp.); các cây lâu năm (Physalis virginiana, P. heterophyla); một số cây hàng năm hoặc cây tự nhân giống lâu năm. Nhiều cây ở những vùng riêng biệt cũng là cây chủ của PVY nhƣ Cotula australis ở New Zealand hoặc Sorbaria tomentosa ở Himalaya. Cỏ dại thuộc họ cà thƣờng là nguồn lây nhiễm PVY cho cà chua, hồ tiêu. Chúng gồm: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 + S. nigrum và S. dulcamara ở nhiều quốc gia + S. chacoense và P. viscosa ở nam Mỹ + S. Florida, P. gracile, S. aculeatissimum, P. angulata, P. ciliosa và P. floridana ở Floria + P. virginiana và P. heterophyla là những cây chủ qua đông ở bắc Mỹ, S. dulcamara ở phía tây châu Âu hoặc Datura spp. ở các nƣớc địa trung hải là nguồn lây nhiễm PVY cho khoai tây trồng cũng nhƣ khoai tây mọc tự nhiên. Với thuốc lá ở USA, Canada, Italy, những cây cà chua, hồ tiêu, khoai tây nhiễm virus đƣợc xem là nguồn lây nhiễm (Kerlan và cs, 2008) [41]. Khoảng 495 loài cây chủ thuộc 72 chi, 31 họ đƣợc sử dụng để làm các thí nghiệm. Chúng gồm 287 loài thuộc họ Solanaceae; 28 loài thuộc họ Amaranthaceae; 25 loài thuộc họ Fabaceae ; 20 loài thuộc họ Chenopodiaceae và 11 loài thuộc họ Asteraceae. Phần lớn những cây này là những cây chủ tổn thƣơng cục bộ. Từ những năm 1980-1990, Datura stramonium đƣợc chứng minh là miễn dịch hoàn toàn với tất cả các chủng. Một số PVY có thể nhiễm vào cây mô hình Arabidopsis thaliana (Kerlan và cs, 2008) [41]. N. tabacum , N. benthamiana, N. occidentalis nhạy cảm với tất cả các chủng PVY và có thể sử dụng nhƣ các loài chuẩn đoán. Các cây non N. tabacum thƣờng đƣợc sử dụng trong các thí nghiệm truyền virus qua rệp. Đây cũng là cây chủ thích hợp cho nhân virus. Lƣợng virus thu đƣợc dao động từ 10 đến 25mg (có khi lên tới 40mg) trên 1kg lá thuốc lá . Ngoài ra, lá của cây này là vật liệu nhiễm virus tốt nhất cho việc tích trữ (Kerlan và cs, 2008) [41]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 Hình 1.2. Những đốm (mottle) điển hình trên cây thuốc lá N. tabacum cv Xanthi gây ra bởi PVY khoai tây sau 15 ngày tiêm. (Theo: C. Lacroix, IVRA, Pháp) 1.3.3. Hình dạng và cấu trúc phân tử Virion PVY không có vỏ bao, dạng sợi nhỏ, cong queo, dài 730-740nm, đƣờng kính 11-12nm. Nó có một ống trục với đƣờng kính 2-3 nm, và cơ thể đối xứng xoắn ốc. Quá trình lắp ráp các bộ phận và phá vỡ hạt PVY đƣợc nghiên cứu tỉ mỉ. Hình 1.3. Hình dạng của PVY Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 Virion chứa khoảng 6% axit nucleic. Genome của PVY là phân tử RNA dạng thẳng, sợi đơn, chiều dƣơng, có poly A ở đầu 3‟ và liên kết với protein (VPg) ở đầu 5‟ nhƣng không có lipid cũng nhƣ các thành phần khác. RNA của PVY khối lƣợng khoảng 3,1-3,2kDa, dài chừng 9,7kb, trừ đuôi poly A. Trình tự về toàn bộ hệ gen của PVY ở khoai tây, thuốc lá, hồ tiêu, cà chua, cà đen đã đƣợc công bố (Kerlan và cs, 2008) [41]. Cũng nhƣ các potyvirus khác, bộ khung đọc mở của nó quy định một polypeptit lớn, khoảng 3061-3063 aa. Polypeptit lớn này đƣợc cắt thành 10 protein chức năng: P1 (284aa); HC-Pro (456aa); P3 (365aa); 6K1(52aa); CI (634aa); 6K2 (52aa); VPg (188aa); NiaPro (244aa); Nib (521aa); CP (267aa). Có 2 vùng ngoại biên không dịch mã: 5‟ NTR (184aa); 3‟ NTR (326-333aa). Hình 1.4. Sơ đồ mô tả hệ gen của các chủng PVY0, PVYN và các biến thể PVYNTN , PVYNW (Đƣợc mô phỏng lại của Glais L,Tribodet M và Kerlan C (2002)) 1.3.4. Quan hệ họ hàng với các potyvirus khác PVY có quan hệ xa về huyết thanh với potato virus A (PVA), potato virus V (PVV) và 17 virus khác thuộc chi potyvirus. PVY, pepper mottle virus Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 (PepMoV), PVV, pepper yellow mosaic virus, pepper severe mosaic virus, wild potato mosaic virus và Peru tomato virus tạo thành một nhánh cây phát sinh phân biệt với các potyvirus khác kể cả PVA (Kerlan và cs, 2008) [41]. 1.3.5. Lan truyền của PVY Trong tự nhiên, PVY đƣợc truyền bởi rệp và các cơ quan sinh sản sinh dƣỡng của cây nhƣ củ hay cành. Với các cây thuốc lá và cà chua đƣợc trồng ở Bắc Mỹ, PVY đƣợc truyền thông qua sự tiếp xúc giữa cây với cây. Chúng cũng đƣợc truyền bởi sự tiếp xúc giữa các mầm củ khoai tây trong quá trình cất giữ. Ngoài ra, phƣơng thức truyền bởi hạt cũng đƣợc thông báo ở S. nigrum và Nicandra physaloides. Sự lan truyền bởi phấn hoa chƣa từng đƣợc xác định ở bất cứ cây chủ nào. Không giống với các potyvirus khác, PVY có phạm vi rệp truyền bệnh rất lớn. 70 loài rệp thuộc họ Aphidinae đều có thể truyền PVY. Trong đó, Mysus persicae là loại rệp có hiệu quả truyền PVY lớn nhất. Ở khoai tây, loài này cùng những loài định cƣ ở khoai tây trong thời gian dài trên cánh đồng là tác nhân truyền virus chủ yếu. Tuy vậy, những loài di cƣ từ những cánh đồng khác cũng có vai trò đáng kể trong việc truyền PVY. Rệp ngũ cốc, rệp đậu hà lan đƣợc cho là liên quan tới dịch bệnh xảy ra trên cánh đồng khoai tây ở Châu Âu, Bắc Mỹ (Kerlan và cs, 2008) [41]. PVY có phạm vi cây chủ rộng nhƣng cho tới tận bây giờ, ngoài khoai tây chƣa có cây chủ nào đƣợc nhận định nhƣ là một nguồn lây nhiễm đáng kể. Cũng trên khoai tây, có sự khác nhau về hiệu quả truyền PVY giữa các chủng. PVYN có hiệu quả truyền qua rệp cao hơn các chủng khác do thời gian duy trì của chúng trong rệp dài hơn (Kerlan, 2008) [40]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Hình 1.5. Loài rệp có cánh truyền PVY (Aphis nasturtii) (Theo: B. Chaubet, INRA, Pháp) Rệp truyền PVY theo cách không bền vững (nonpersistent manner). Giai đoạn thu nhận đƣợc và tiêm rất ngắn (vài giây hay vài phút). Vòi của rệp xuyên vào bên trong lớp tế bào biểu bì của cây và đâm thủng màng tế bào chất. Virus đƣợc giữ trong rệp không quá 1 đến 2 giờ. Tuy vậy, ở Aphis nasturtii, thời gian giữ có thể lên tới trên 17 giờ. Thời kì đói của rệp làm tăng hiệu quả của việc truyền virus mặc dù nó không ảnh hƣởng tới số lƣợng các lỗ trích trong suốt thời kì thu nhận đƣợc (Kerlan và cs, 2008) [41]. Tính chất có thể lan truyền của PVY đƣợc quyết định bởi cả hai protein là coat protein (CP) và helper component protein (HC-Pro). Tất cả PVY có thể đƣợc truyền bởi rệp đều chứa bộ ba aa: DAG (Asp-Ala-Gly) trong vùng tận cùng đầu N của CP. Khác với tobacco vein mottling virus, các virus trình tự DAGE cũng có thể đƣợc truyền bởi rệp. PVY là virus đầu tiên đƣợc chứng minh rằng một thành phần của nó trong nhựa cây cần thiết cho sự vận chuyển của rệp. Sự làm mất hoạt tính của HC- Pro liên quan tới việc không giữ đƣợc virion trên vòi rệp. Các virus đƣợc vận chuyển bởi rệp và không đƣợc vận chuyển bởi rệp khác nhau ở một hoặc 2 sự thay thế axit amin: Gly35 cho Asp, Lys 50 cho Glu hoặc Lys50 cho Asn, Ile225 cho Val, Ser355 cho Gly. Lys50 là một Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 phần của “LITC motif” có tính bảo thủ (Lys–Ile–Thr–Cys). Thay đổi bên trong hay xung quanh motif này có thể làm mất tính chất có thể truyền bởi rệp của PVY. 1.3.6. Một số đặc điểm của PVY trên khoai tây 1.3.6.1. Thiệt hại PVY gây ra trên khoai tây Ở khoai tây, hiện nay PVY đã trở thành virus nghiêm trọng nhất, gây thiệt hại lớn về kinh tế. Nó ảnh hƣởng tới hầu hết các cây và gây thiệt hại về sản lƣợng tới 80%, thậm chí còn lớn hơn trong trƣờng hợp bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD). Kết quả nghiên cứu những năm trƣớc, Weideman (1979) cho biết, ở Đức khi bị PVY nặng, khoai tây có thể giảm tới gần 60% năng suất dự thu. Thiệt hại do PVY gây ra trên khoai tây phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó hai yếu tố quan trọng nhất là giống khoai tây và chủng virus. 1.3.6.2. Các chủng và các biến thể của PVY khoai tây PVY khoai tây đƣợc chia thành 3 chủng (PVYO, PVYN và PVYC), nhiều biến thể. PVYO, PVYN và PVYC đƣợc phân biệt dựa trên các phản ứng của chúng trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum và trên khoai tây trồng mang các „hypersensitivity gene’ Nytbr và Nc (Kerlan, 2008) [40]. PVY N khác với PVY O và PVY C trong việc gây ra phản ứng chết hoại gân lá của N. tabacum cv Samsun hoặc cv Xanthi. 2aa ở vị trí 400 và 419 trong protein HC- Pro liên quan tới sự cảm ứng phản ứng chết hoại này ở cây thuốc lá. Ngoài ra, các chủng PVY còn đƣợc phân biệt bởi phản ứng trên cây chủ P. floridance. PVY C gây ra sự suy sụp và chết sớm ở loại cây này (Kerlan và cs, 2008) [41]. Các biến thể PVYNTN, PVYNW và PVYN:O cũng khá phổ biến. PVYNW, PVY N:O và phần lớn PVYNTN là sự tái tổ hợp giữa chủng PVYO và PVYN với từ một đến ba điểm tái tổ hợp. PVYNTN đặc trƣng bởi sự gây ra chết hoại củ trên khoai tây. Việc phát hiện ra PVYNTN không có điểm tái tổ hợp đã chỉ ra Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 rằng cấu trúc tái tổ hợp của genome không phải là điều kiện quyết định cần thiết cho kiểu hình chết hoại củ. PVYN W phân biệt với PVYN ở tính chất gây độc và kiểu huyết thanh là O-C. PVYN:O đƣợc mô tả trong những năm 2000 cũng mang một phần thuộc tính của PVYN và PVYO. Một số PVYN:O gây ra sự chết hoại củ (Kerlan, 2008) [40], (Kerlan và cs, 2008) [41], (Tetsuji Ogawa, 2008) [66]. Các chủng PVYO và PVYN phân bố rộng khắp, nhƣng đến nay, PVYN vẫn chƣa thuộc danh sách mầm bệnh kiểm dịch ở Canada và USA. Chủng PVY C ít gặp hơn (ở Pháp PVYC chiếm ít hơn 5% PVY). Biến thể PVYNTN đƣợc tìm thấy trong hầu hết các nƣớc trồng khoai tây kể cả USA và Peru. Còn biến thể PVYNW đƣợc thông báo ở một vài quốc gia và phổ biến ở Poland. Ở Canada và USA cùng thông báo sự xuất hiện của PVYN:O. Hình 1.6. Dấu hiệu so sánh PVY trên Nicotiana tabacum cv Xanthi (sau 15 ngày tiêm): (a) Thuốc lá nhiễm PVYN; (b) Thuốc lá nhiễm PVYO 1.3.6.3. Triệu chứng của bệnh do PVY trên khoai tây Ba chủng (PVYO, PVYN, PVYC) gây ra các triệu chứng khác nhau ở cây khoai tây: + PVY O: Khi lây nhiễm lần đầu (primer), phản ứng của cây với chủng virus này phụ thuộc vào giống khoai tây. Lá cây có thể chết hoại, tạo đốm hay ngả vàng, lá rũ xuống, đôi khi cây non bị chết. Lúc đầu các lá non xuất hiện Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 vết đốm hay vết hình khuyên, sau đó chết và treo trên thân, lá cây giòn (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]. Khi nhiễm lần hai (secondery), triệu chứng điển hình là khảm, quăn, đốm chết hoại của lá và sự còi cọc của cây. + PVY N gây ra các triệu chứng nhẹ hơn, thƣờng là khảm, đốm trên lá. Đôi khi những vết đốm không rõ ở lần nhiễm đầu tiên. Khi bệnh nhiễm vào cây chậm, triệu chứng ở tán lá có thể không biểu hiện, nhƣng củ thu hoạch ở nhóm cây nhiễm chậm vẫn có thể mang bệnh (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]. + PVY C gây ra các sọc chấm trên thân và những đốm nâu xung quanh các mắt củ. Bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD) do PVYNTN và một số PVY N W, PVY N:O đƣợc đặc trƣng bởi những kiểu đặc biệt trên lá và thân (đôi khi là chết hoại lá sồi) sự chết hoại hình vòng và cong trên bề mặt củ. Đầu tiên, nó nhô ra không đáng kể trên vỏ củ, rồi trở nên nâu đen cùng một số vết rạn nứt (Kerlan và cs, 2008) [41]. Hình 1.7. Triệu chứng nhiễm lần hai (secondary) với PVY trên cánh đồng khoai tây: quăn, vàng và nhỏ của lá (Theo: V. Le Hingrat, FNPPPT, Pháp) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Hình 1.8. Triệu chứng của bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD): (a)Vàng và chết hoại trên lá cơ bản; (b) Kiểu chết hoại lá sồi trên lá trung gian; (c) Triệu chứng điển hình của PTNRD trên củ ở cv Monalisa; (d) Triệu chứng không điển hình gây ra bởi PVYO trên củ ở cv Yukon Gold. (Theo: K. Charlet-Ramage, GNIS-INRA, France (a–c) và R. P. Singh Potato Research Centre, NB, Canada (d)) 1.3.6.4. Biện pháp phòng chống bệnh do PVY gây ra trên khoai tây Các bệnh do PVY gây ra trên khoai tây đƣợc phòng chống dựa trên các biện pháp quản lí khoai tây giống, gây giống kháng bệnh và các quy định về kiểm dịch, đặc biệt là đối với PVYN. Sự sản xuất khoai tây giống an toàn gồm: kiểm tra rệp truyền bệnh, xử lí dầu vô cơ chống lại sự truyền của rệp, trừ cỏ dại, kiểm tra phát hiện virus trong vụ thu hoạch chính bằng sử dụng ELISA trên phạm vi rộng. Nhiều các thí nghiệm sinh học phân tử cũng đƣợc phát triển để phát hiện PVY trong lá, củ và rệp nhƣ lai cDNA (cDNA hybridization), các RT-PCR khác nhau, kĩ thuật microarray. HR và ER lần lƣợt do các gen trội đơn Ny và Ry quy định. Gen Ry (Rysto, Ryadg) ở loài họ cà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 dại, nằm trên nhiễm sắc thể XI và XII, quy định khả năng kháng rộng. Ngƣợc lại, gen Nc, Nytbr nằm trên nhiễm sắc thể thứ IV và Nz lần lƣợt quy định khả năng kháng PVYC, PVYO và PVYZ. Protein NiaPro của PVY liên quan tới việc hoạt động của Ry. Đã tạo đƣợc hơn 20 loại cây trồng chứa Ry đem lại khả năng kháng virus khá bền (Kerlan và cs, 2008) [41]. Ngoài ra, hƣớng nghiên cứu sử dụng vật liệu di truyền có nguồn gốc từ virus để tạo cây chuyển gen kháng virus đang đƣợc nhiều tác giả quan tâm. Hình 1.9. Vị trí các gen kháng PVY trên genom khoai tây (Theo: S. Marchadour, FNPPPT-INRA, Pháp) 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PVY TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.4.1. Tình hình nghiên cứu PVY trên thế giới Năm 1931, Smith lần đầu tiên phát hiện ra PVY trên khoai tây. Từ đó đến nay, hàng loạt các công trình nghiên cứu về virus này đã đƣợc công bố. Các chủng và các biến thể PVY đƣợc phát hiện, nghiên cứu tỉ mỉ, thiệt hại của bệnh, các phƣơng pháp chuẩn đoán cũng nhƣ các biện pháp phòng chống PVY đƣợc đƣa ra. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Việc chẩn đoán các chủng PVY đầu tiên dựa vào các thí nghiệm sinh học. Các chủng khác nhau biểu hiện các triệu chứng khác nhau trên cây chỉ thị. Tuy vậy, phƣơng pháp này tốn nhiều thời gian, nhiều khâu phức tạp, không phù hợp với chuẩn đoán nhanh trên quy mô lớn. Vì vậy, nhiều nhóm nghiên cứu ở các phòng thí nghiệm quốc tế đã cố gắng phát triển các phƣơng pháp khác để phát hiện, mô tả PVY dựa trên các đặc điểm sinh học, huyết thanh và phân tử của PVY. Từ cuối những năm 1970, những hiểu biết về thuộc tính gây miễn dịch của PVY đã đƣợc sử dụng trong việc nhận dạng virus. Dựa trên phản ứng kháng nguyên-kháng thể này, nhiều phƣơng pháp chuẩn đoán lần lƣợt đƣợc công bố nhƣ: DAS-ELISA hoặc TAS-ELISA (double-or triple-antibody Sandwich-enzyme-linked immunosorbent assays); sử dụng kháng thể đơn dòng hay đa dòng (Gugerli và Fries, 1983 [33]; Maat và Huttinga, 1987 [44]; Oshima và cs, 1990 [53]; Sanz và cs, 1990 [60]; Singh và cs, 1993 [62]; Ellis và cs, 1996 [29]); kính hiển vi điện tử hấp thụ miễn dịch immunosorbent electron microscopy (Walkey và Webb, 1984 [70]); chất kết dính nhựa mủ latex agglutination (Berckx, 1967 [16]; Talley và cs, 1980 [65]). Tuỳ theo sự đặc trƣng của những kháng thể đƣợc sử dụng mà sự kiểm tra này có thể có phổ rộng (Health và cs, 1987 [35]; Ellis và cs, 1996 [29]), hay chỉ phân biệt đƣợc giữa PVYN với PVYO hoặc với PVYC (Mc Donald và Singh, 1996 [48]; Boonham và Barker, 1998 [19]; Ounouna và cs, 2002 [54]). Phƣơng pháp huyết thanh nhanh, đáng tin cậy cho việc nhận dạng PVYN và PVYO và phƣơng pháp này đƣợc sử dụng khá phổ biến để phát hiện virus trong lá cây (Clark và Adams, 1977 [26]) hay trong các mô khác nhƣ củ khoai tây (Vetten và cs, 1983 [69]). Tuy nhiên, gần đây sự nổi lên của các biến thể nhƣ PVYNTN (Le Romancer và cs, 1994 [43]; Kerlan và cs, 1999 [42]) và PVY NW đã cho thấy điểm hạn chế của phƣơng pháp huyết thanh (Chrzanowska, 1991 [25]). Bằng phƣơng pháp sử dụng kháng thể đơn dòng, đa dòng đã xếp PVYN W vào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 nhóm PVY O, mặc dù chúng rõ ràng gây ra triệu chứng chết hoại trên gân thuốc lá. Ngoài ra, phƣơng pháp này không phân biệt đƣợc PVYNTN và PVYN. Sự phát triển của kĩ thuật sinh học phân tử từ đầu những năm 1980 cho phép nghiên cứu tính đa dạng di truyền của PVY. Những nghiên cứu sử dụng bản đồ RFLP của một phần hay toàn bộ genome đã đƣợc tiến hành. Toàn bộ trình tự của PVYN (Robaglia và cs, 1989 [56]; Jakab và cs, 1997 [38]; Abdelmaksoud và Gamal Eldin, 2002 [15]; Nie và Singh, 2003 [51]), PVY O , PVY NTN (Thole và cs, 1993; Nie và Singh, 2003 [51]) đã đƣợc công bố. Hơn nữa, trình tự vùng không dịch mã (NTR) ở đầu 5‟ và đầu 3‟, các gen của PVY đã có sẵn trong ngân hàng gen. Những dữ liệu này cho phép so sánh giữa các trình tự, xác định sự tƣơng đồng hay khác biệt về trình tự giữa các virus. Những nghiên cứu này đã chỉ ra rằng: + Tính biến đổi cao của PVY (trên 28% khác nhau giữa vùng P1 của PVY N và PVY O (Marie-Jeanne Tordo và cs, 1995 [46])). + Sự tƣơng đồng giữa trình tự coat protein (CP) của PVYNW và PVY O. Điều này đã giải thích việc phát hiện PVYNW bởi các kháng thể đơn dòng đặc trƣng của PVYO. + Sự có mặt của 1 (PVYNW) đến 3 (PVYNTN) điểm tái tổ hợp giữa trình tự của PVYN và PVYO trong các biến thể PVY nổi lên gần đây. Nhƣ một sự thay thế cho phƣơng pháp huyết thanh, nhiều thí nghiếm sinh học phân tử đặc hiệu và nhạy cảm đƣợc phát triển dựa trên sự biến đổi trong trình tự PVYN, PVYO hay điểm tái tổ hợp ở bên trong genome nhằm phát hiện đặc hiệu các chủng và biến thể của PVY. Có thể kể đến các phƣơng pháp nhƣ: gel retardation (Rosner và Maslenin, 2001, 2003 [58] [59]; Matousek và cs, 2000 [47]); RT-PCR-RFLP (Glais và cs, 2002 [31]); single-restriction cleavage of PCR products (Rosner và Maslenin, 1999 [57] ); RT-PCR đơn thành phần (Nie và Singh, 2002 [50]; Boonham và cs, 2002 [20]); RT-PCR đa thành phần Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 (Nie và Singh, 2002 [50]); AmpliDet RNA; competitive fluorescent RT-PCR (Walsh và cs, 2001 [71]) và PCR 3 mồi (Moravec và cs, 2003 [49]). Sử dụng vật liệu di truyền của virus để tạo cây khoai tây chuyển gen là một hƣớng đi mới, đã và đang nhận đƣợc những kết quả khá khả quan. Schubert và cs, 2004 đã tạo thành công khoai tây chuyển gen Nib kháng PVY. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu virus PVY ở Việt Nam Ở nƣớc ta, những nghiên cứu về bệnh virus nói chung và bệnh PVY nói riêng trên khoai tây còn rất ít. Việc nghiên cứu mới bắt đầu dừng lại ở phát hiện sự xuất hiện của bệnh, sự phân bố của bệnh trên các cánh đồng khoai tây, tỉ lệ nhiễm, thiệt hại và phản ứng của cây khi bị nhiễm virus. Cũng có những nghiên cứu xác định loại và chủng virus, nhƣng dựa trên các phƣơng pháp quan sát bằng mắt thƣờng, cây chỉ thị, huyết thanh, kính hiển vi điện tử (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]. Với sự tiến bộ của công nghệ sinh học đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống khoai tây củ bi sạch bệnh Nguyễn Thị Kim Thanh và cs, 1994) [9], (Trần Thanh Thu và cs, 1988) [10], (Trƣơng Quang Vinh, 2007) [14]. Đến nay, vẫn chƣa có nhiều nghiên cứu áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử trong phân tích, đánh giá đặc điểm di truyền của PVY khoai tây đƣợc công bố (Phạm Thị Vân và cs, 2009) [13]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Các mẫu lá khoai tây có triệu chứng bị nhiễm bệnh đƣợc thu từ một số vùng thuộc miền Bắc Việt Nam. Các mẫu nghiên cứu đƣợc thể hiện trong bảng sau: Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu tại các điểm nghiên cứu STT Địa điểm thu thập mẫu Kí hiệu 1 Phú Bình – Thái Nguyên Phú Bình 2 Phổ Yên – Thái Nguyên Phổ Yên 3 Văn Lâm – Hƣng Yên Hƣng Yên 4 Việt Yên - Bắc Giang Bắc Giang 5 Thái Thụy - Thái Bình Thái Bình 2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.2.1. Hoá chất - Bộ kit tách chiết RNA tổng số của hãng Invitrogen. - Bộ kit tổng hợp cDNA của hãng Fermentas. - Bộ hoá chất sử dụng cho kĩ thuật PCR. - Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR của Bioneer. - Các hoá chất thông dụng phục vụ cho các kĩ thuật sinh học phân tử nhƣ agarose, cồn, X- gal, ampicilin… 2.2.2. Thiết bị Máy li tâm, máy soi gel, bộ điện di, tủ cấy vô trùng, máy chụp ảnh, pipet, máy PCR, máy xác định trình tự nucleotit tự động và nhiều thiết bị khác. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu Các thí nghiệm đƣợc tiến hành tại: + Phòng thí nghiệm Di truyền học, khoa Sinh-trƣờng Đại học Sƣ phạm; Phòng thí nghiệm thuộc khoa Sinh-trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên. + Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các thí nghiệm công bố trong luận văn đƣợc thể hiện qua sơ đồ sau: Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 2.3.1. Phƣơng pháp thống kê Tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY đƣợc xác định theo phƣơng pháp thống kê. Trong mỗi khu vực nghiên cứu, lấy ngẫu nhiên 3 lô thí nghiệm. Mỗi lô có 100 khóm. Xác định số khóm có triệu chứng bị bệnh trong Xác định tỉ lệ nhiễm, Thu thập mẫu bệnh Tách RNA tổng số Nhân gen CP Tách dòng gen Xác định và so sánh trình tự gen CP Khai thác trình tự trong NCBI Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 từng lô. Tỉ lệ khoai tây có triệu chứng bị bệnh ở mỗi vùng sẽ đƣợc tính bằng trung bình của tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm bệnh trên 3 lô. 2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số Chúng tôi đã sử dụng bộ kit Trizol Reagents (Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số theo quy trình sau: - Cân 100mg lá khoai tây có triệu chứng nhiễm bệnh, nghiền nhanh trong nitơ lỏng, đảm bảo mẫu phải đƣợc nghiền triệt để và tránh enzyme RNase cắt RNA. - Chuyển ngay mẫu vào ống eppendorf 2ml. - Bổ sung 1ml Trizol Reagents, đảo đều ở nhiệt độ phòng (15-300C) trong 5 phút. - Bổ sung 200µl Chloroform: Isoamyl (24:1). - Đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút. - Hút 500 dịch nổi, chuyển sang ống eppendorf 1,5ml. - Bổ sung 500µl Isopropanol đã đƣợc làm lạnh đến 40C, lắc nhẹ ống để RNA kết tủa. - Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút. - Loại bỏ dịch nổi, rửa tủa RNA bằng cồn 700 pha trong DEPC 0,01%. - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút. - Làm khô RNA bằng máy Speed Vac trong khoảng 3 phút. - Pha loãng RNA trong 40µl H2O đã xử lí DEPC 0,01%. - Ủ ở nhiệt độ 550C trong 5 phút để RNA tan hết. Do RNA dễ bị RNase cắt nên tất cả các dụng cụ đều phải xử lí DEPC 1% và khử trùng trƣớc khi sử dụng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 2.3.3. Phƣơng pháp RT-PCR Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) là sự kết hợp của hai phản ứng: sao mã ngƣợc (reverse transcription) tạo cDNA và PCR để nhân một đoạn gen quan tâm từ cDNA. Kỹ thuật RT-PCR để nhân gen CP đƣợc tiến hành theo hai bƣớc sau: Bước 1: Tổng hợp cDNA - Bổ sung lần lƣợt các thành phần sau đây vào ống eppendorf 0,5ml đã đƣợc xử lí DEPC 1% hoặc Rnase: Thành phần Thể tích 250ng mồi ngẫu nhiên 2µl 10pg - 5µg RNA tổng số 2µl dNTPs 10mM 2µl - Bổ sung nƣớc DEPC 0,01% tới thể tích 13µl. - Ủ ở 650C trong 5 phút, sau đó đặt vào đá. - Tiếp tục bổ sung các thành phần sau vào ống phản ứng: Buffer 5X 4µl DTT 0,1M 1µl Rnase OUT TM (40 đơn vị/µl) 1µl Cloned AMV RT (15 đơn vị/µl) 1µl - Trộn mẫu nhẹ nhàng, sau đó thực hiện một chu kì nhiệt nhƣ sau: Bƣớc Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 25 10 2 45 50 3 85 5 4 4 ∞ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Bước 2: Phản ứng PCR Sau khi tổng hợp cDNA, tiến hành chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP. Thành phần, chu kì nhiệt cho phản ứng PCR đƣợc trình bày trong bảng 2.2 và bảng 2.3. Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 12,5 2 Dung dịch đệm 10X 2,5 3 MgCl2 (25mM) 2,5 4 dNTPs (10mM) 2 5 Mồi xuôi 1 6 Mồi ngƣợc 1 7 Taq polymerase (1U/1µl) 0,5 8 cDNA 3 Tổng 25 Bảng 2.3. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kì 1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 1 phút 30 3 Gắn mồi 52 50 giây 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarase 1%, rồi đƣợc làm sạch (thôi gel) theo bộ kit của Bioneer và gắn vào vector pBT, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. 2.3.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR - Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm, có kích thƣớc khoảng 1200bp. - Bổ sung dung dịch QG theo tỉ lệ: Vmẫu:VQG= 1 : 3. - Ủ ở 500C trong 15 phút, 3 phút trộn nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn. - Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel Qiaquick spin column, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ cột chảy qua cột. - Thêm 750µl dung dịch PE vào cột, để ở nhiệt đ._.