Nghiên cứu thụ tinh ống nghiệm từ tế bào trứng trên bò sữa cao sản

ng bố trong bất cứ cơng trình nào khác. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong luận văn này đều đã được ghi rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Văn Hải Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin chân thành gửi tới Ban Giám hiệu trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội, Viện Sau ðại Học, Khoa Chăn nuơi và Nuơi trồng Thuỷ sản cùng các thầy cơ giáo trong trường lời cảm ơn sâu sắc nhất. Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Bá Mùi giảng viên Bộ mơn Hố sinh và Sinh lý ðộng vật – Khoa Chăn nuơi và Nuơi trồng Thuỷ sản - Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn trong suốt thời gian học tập và giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này. Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới các cơ, chú, anh, chị em phịng Thí nghiệm Trọng điểm cơng nghệ tế bào động vật, Viện chăn nuơi Quốc gia và các bạn bè đồng nghiệp, đặc biệt là tới Thạc sĩ Nguyễn Thị Thoa đã nhiệt tình giúp đỡ, gĩp ý, tạo điều kiện cho tơi trong quá trình thực hiện để luận văn này cĩ thể hồn thành. Cuối cùng tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn tới gia đình, anh em, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt quá trình hồn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 29 tháng 10 năm 2009 Học viên Nguyễn Văn Hải Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục viết tắt vi Danh mục bảng biểu vii Danh mục đồ thị viii Danh mục hình ix 1. MỞ ðẦU 1 1.1 ðẶT VẤN ðỀ 1 1.2 MỤC TIÊU 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THỤ TINH ỐNG NGHIỆM TRONG VÀ NGỒI NƯỚC 3 2.2. ðẶC ðIỂM SINH DỤC BỊ CÁI 4 2.2.1 Chu kỳ động dục của bị cái 4 2.2.2 Thần kinh và thể dịch điều tiết hoạt động sinh sản ở bị cái 5 2.2.3 Cấu tạo và chức năng buồng trứng 6 2.2.4 Cấu tạo tế bào trứng 9 2.3 THU TẾ BÀO TRỨNG BỊ 10 2.4. NUƠI TẾ BÀO TRỨNG THÀNH THỤC TRONG ỐNG NGHIỆM 11 2.5 KIỆN TỒN NĂNG LỰC THỤ TINH CỦA TINH TRÙNG 13 2.5.1 Khái niệm 13 2.5.2 Phương pháp kiện tồn năng lực thụ tinh của tinh trùng trong TTON.14 2.6 SINH LÝ QUÁ TRÌNH THỤ TINH 15 2.6.1 Quá trình thụ tinh 15 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. iv 2.6.2 ðặc điểm của phơi giai đoạn đầu 17 2.7 TẠO PHƠI TRONG ỐNG NGHIỆM 18 2.8 NUƠI PHƠI TRONG ỐNG NGHIỆM 19 2.9 ðƠNG LẠNH PHƠI VÀ GIẢI ðƠNG PHƠI 20 2.9.1 Những chất bảo vệ sinh học lạnh thơng dụng 21 2.9.2 Phương pháp đơng lạnh 22 2.9.3 Giải đơng phơi 24 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 26 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 26 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.3.1 Thu tế bào trứng từ bị sống bằng máy siêu âm 26 3.3.2 ðánh giá phân loại tế bào trứng sau khi thu 27 3.3.3 Nuơi tế bào trứng bị thành thục trong ống nghiệm 28 3.3.4 Hoạt hố tinh trùng cho thụ tinh ống nghiệm 29 3.3.5 Nuơi hợp tử trong ống nghiệm 29 3.3.6 ðơng lạnh và giải đơng phơi bị 30 3.3.7 Nuơi cấy in-vitro để đánh giá chất lượng phơi bị sau đơng lạnh và giải đơng 31 3.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 32 3.5 THỜI GIAN VÀ ðỊA ðIỂM THỰC TẬP 32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 THU TẾ BÀO TRỨNG TỪ BỊ SỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SIÊU ÂM 33 4.2 NUƠI TẾ BÀO TRỨNG THÀNH THỤC TRONG ỐNG NGHIỆM 37 4.3 THỤ TINH ỐNG NGHIỆM TẾ BÀO TRỨNG BỊ 43 4.4 NUƠI HỢP TỬ TRONG ỐNG NGHIỆM 50 4.5 ðƠNG LẠNH PHƠI TẠO RA TRONG ỐNG NGHIỆM 58 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. v 4.5.1 Chất lượng phơi trước đơng lạnh 58 4.5.2 Chất lượng phơi sau giải đơng 61 4.5.3 Sự phát triển của phơi sau đơng lạnh-giải đơng 63 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 66 5.1 KẾT LUẬN 66 5.1.1 Kết quả thu tế bào trứng bị bằng phương pháp siêu âm hút trứng 66 5.1.2 Kết quả nuơi tế bào trứng thành thục trong ống nghiệm 66 5.1.3 Kết quả thụ tinh và nuơi hợp tử trong ống nghiệm 66 5.1.4 ðơng lạnh phơi bị 66 5.2 ðỀ NGHỊ 67 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT OPU B2 BO BSA CR1 DMSO DPBS FCS FSH GnRH IVM LH COC PBS PCR TCM 199 Vero TTON Ovum Pick Up Menezo’s B2 medium Brackett and Oliphan Bovine Serum Albumin Milieu de Rosekrans Dimethyl Sulfoxide Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Foetal Calf Serum Follicle Stimulating Hormone Gonadotropin Releasing Hormone In vitro Maturation Luteining hormone Cumulus- Oocyte Complex Photphate Buffered Saline Polymerase Chain Reaction Tissue Culture Medium 199 Cellules de rein de singe vert Thụ tinh ống nghiệm Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. vii DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1. Kết quả thu tế bào trứng từ bị sống bằng kỹ thuật siêu âm 34 Bảng 4.2. Kết quả phân loại tế bào trứng thu được bằng phương pháp siêu âm 36 Bảng 4.3. Kết quả nuơi thành thục trứng bị trong ống nghiệm 38 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của chất lượng trứng tới tỷ lệ thành thục 40 Bảng 4.5. Kết quả thụ tinh ống nghiệm trứng bị 44 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của chất lượng tế bào trứng tới kết quả thụ tinh trong ống nghiệm 46 Bảng 4.7 Kết quả nuơi hợp tử trong ống nghiệm 50 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của mật độ nuơi đến sự phát triển của hợp tử 52 Bảng 4.9. Ảnh hưởng chất lượng tế bào trứng đến sự phát triển của hợp tử 54 Bảng 4.10. Ảnh hưởng của mơi trường đến sự phát triển của hợp tử 56 Bảng 4.11. Phân loại phơi sau thu hoạch 59 Bảng 4.12. ðánh giá phân loại phơi trước đơng lạnh 60 Bảng 4.13. Chất lượng phơi sau đơng lạnh-giải đơng 62 Bảng 4.14 Sự phát triển của phơi sau đơng lạnh-giải đơng 63 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. viii DANH MỤC BIỂU ðỒ Biểu đồ 4.1. Kết quả thành thục của các loại tế bào trứng 42 Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ thụ tinh của các loại tế bào trứng 48 Biểu đồ 4.3. Kết quả phát triển của hợp tử ở các mật độ nuơi 53 Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của chất lượng tế bào trứng đến sự phát triển của hợp tử 58 Biểu đồ 4.5. Kết quả phát triển của hợp tử trong mơi trường nuơi cấy 58 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. ix DANH MỤC HÌNH Hình 4.1.Tế bào trứng loại A 37 Hình 4.2. Tế bào trứng loại B 37 Hình 4.3.Tế bào trứng loại C 37 Hình 4.4. Tế bào trứng loại D 37 Hình 4.5. Tế bào trứng cĩ tế bào Cumulus giãn nở sau khi nuơi thành thục 43 Hình 4.6. Tế bào trứng đã thành thục với sự xuất hiện thể cực thứ nhất 43 Hình 4.7. Tế bào trứng được ủ với tinh trùng 49 Hình 4.8. Tế bào trứng đã được thụ tinh (xuất hiện thể cực thứ 2) 49 Hình 4.9. Phơi dâu loại A 65 Hình 4.10. Phơi dâu loại B 65 Hình 4.11. Phơi nang loại A 65 Hình 4.12. Phơi nang loại B 65 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 1 1. MỞ ðẦU 1.1 ðẶT VẤN ðỀ Thụ tinh ống nghiệm là quá trình kết hợp giữa tinh trùng với tế bào trứng để tạo ra hợp tủ ngồi cơ thể mẹ (trong phịng thí nghiệm) trong các mơi trường nhân tạo cĩ các điều kiện thích hợp giống như cơ thể mẹ về nhiệt độ, độ ẩm, áp suất thẩm thấu, chất dinh dưỡng… ðể tạo ra nguồn phơi cùng với kỹ thuật gây động rụng đồng pha và cấy phơi sẽ nhân nhanh được sản lượng và chất lượng đàn bị cao sản . Hơn nữa làm nguyên liệu cho các nghiên cứu khác như: xác định giới tính phơi, bảo tồn nguồn gen những giống cao sản và động vật quý hiếm, tạo động vật chuyển gen … Các kỹ thuật và nghiên cứu về cơng nghệ phơi mục đích nâng cao năng suất sinh sản của vật nuơi, tạo động vật cĩ tiềm năng di truyền cao hoặc phục vụ các mục đích đặc biệt của con người. Trên thế giới, thụ tinh ống nghiệm đã được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỷ trước và con thỏ đầu tiên ra đời bằng kỹ thuật này vào năm 1959, em bé thụ tinh ống nghiệm đầu tiên ra đời vào năm 1978 ở Anh và con bê TTON đầu tiên ra đời năm 1981 ở Mỹ (Brackett và cs (1982)[19]). Bê đực này là kết quả thụ tinh trong ống nghiệm giữa các tinh trùng với tế bào trứng đã thành thục in vitro, sau đĩ hợp tử được cấy vào tử cung trứng bị nhận. Tại Việt Nam, TTON đã được nghiên cứu trên gia súc từ đầu những năm 1990 và tiếp tục được nghiên cứu tại Viện Cơng nghệ sinh học và Viện Chăn nuơi Quốc Gia. Trong những năm đầu thực hiện kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm, người ta tiến hành thu trứng từ lị mổ với ưu điểm là ổn định, rẻ và số lượng lớn để phục vụ, hồn thiệm thí nghiệm. Tuy nhiên nhược điểm là khơng kiểm sốt được nguồn gốc tế bào trứng, tiềm năng di truyền của cá thể mẹ. Ngày nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật phương pháp thu tế bào trứng bằng siêu âm hút trứng xác định con giống, tạo được nguồn phơi từ bị sống cĩ năng suất cao. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 2 Với mục đích nâng cao hiệu quả của kỹ thuật TTON bằng tế bào trứng bị được khai thác từ con vật sống, tạo tiền đề cho nghiên cứu sử dụng kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng từ con vật sống để sản xuất phơi cĩ chất lượng cao, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thụ tinh ống nghiệm từ tế bào trứng trên bị sữa cao sản”. 1.2 MỤC TIÊU - Tạo được nguồn phơi in-vitro từ trứng bị sữa cao sản thu được bằng phương pháp siêu âm. - Nâng cao tỷ lệ tạo phơi in-vitro. - Bảo quản phơi bằng phương pháp đơng lạnh Vitrification. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THỤ TINH ỐNG NGHIỆM TRONG VÀ NGỒI NƯỚC Năm 1890, thí nghiệm đầu tiên về cấy phơi thành cơng trên thỏ được tiến hành do giáo sư Walter Heape thực hiện. ðến năm 1932, cấy truyền phơi đã thành cơng trên dê bởi Warwich và Berry và con bê đầu tiên trên thế giới đã ra đời bằng cấy phơi bởi Willet và cs (1951)[55 ]. Từ đĩ cơng nghệ phơi đã đạt được các kết quả mới như đơng lạnh phơi, cắt phơi, ghép phơi, xác định giới tính sớm từ giai đoạn phơi… Những năm tiếp theo, nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới và các kỹ thuật liên quan đến cơng nghệ phơi tiếp tục được nghiên cứu cải tiến như nuơi thành thục trứng trong ống nghiệm (Fukui và cs (1983)[25]; Beker và cs (2002)[15]), thụ tinh ống nghiệm (Leibfreid-Rutledge và cs (1986)[35]), nuơi phơi trong ống nghiệm (Ali và cs (2003)[12]), xác định giới tính phơi giai đoạn sớm bằng kỹ thuật PCR, khai thác trứng ở con vật sống với sự hỗ trợ của máy siêu âm (Ovum Pick Up - OPU) (Galli và cs (2001)[27])… Trên thế giới, thụ tinh ống nghiệm đã được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỷ trước và con thỏ đầu tiên ra đời bằng kỹ thuật này vào năm 1959, em bé thụ tinh ống nghiệm đầu tiên ra đời năm 1978 ở Anh và con bê thụ tinh ống nghiệm đầu tiên ra đời năm 1981 tại Mỹ. Thụ tinh ống nghiệm đã được nghiên cứu trên gia súc từ đầu những năm 1990 tại Việt Nam. Nguyễn Thị Ước và cs (1999)[10] đã báo cáo về sản xuất phơi bị bằng thụ tinh ống nghiệm và nghiên cứu sản xuất bị sữa giống thương phẩm bằng cấy phơi thụ tinh ống nghiệm và xác định giới tính (Nguyễn Thị Ước và cs (2003)[11]). Nguyễn Thị Ước (1996)[9] đã nghiên cứu về sự chín nhân ở tế bào trứng trâu đầm lầy nuơi trong ống nghiệm. Bùi Xuân Nguyên và cộng sự (1994)[8] đã báo cáo kết quả bước đầu nghiên cứu nuơi trứng và thụ tinh ống nghiệm ở trâu bị. Nguyễn Hữu ðức và cs Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 4 (1996)[2] đã nghiên cứu về trạng thái phát triển nhân tế bào trứng thu từ buồng trứng của bị nội Việt Nam. Nguyễn Hữu ðức và cs (2003)[3] đã báo cáo kết quả thụ tinh ống nghiệm và cấy phơi ở bị lai Sind và con bê thụ tinh ống nghiệm ra đời vào ngày 28/11 năm 2002 tại Viện Cơng Nghệ Sinh Học. Tại Viên Chăn Nuơi Quốc Gia, tác giả Nguyễn Văn Lý và cs (2003)[6] đã báo cáo nghiên cứu tạo đàn bê bằng phơi thụ tinh ống nghiệm. 2.2. ðẶC ðIỂM SINH DỤC BỊ CÁI 2.2.1 Chu kỳ động dục của bị cái Chu kỳ động dục được bắt đầu từ khi gia súc thành thục về tính và ở cơ quan sinh dục khơng cĩ bào thai, khơng cĩ hiện tượng bệnh lý, ở bên trong buồng trứng cĩ quá trình phát triển của nỗn bao, trứng chín và rụng. Ở bị thời gian bắt đầu thành thục về tính trung bình từ 8-24 tháng tuổi, lúc đĩ cơ thể con cái đặc biệt là cơ quan sinh dục cĩ biến đổi kèm theo sự rụng trứng. Dưới sự điều tiết của hocmone thuỳ trước tuyến yên, trứng phát triển, chín, rụng một cách cĩ chu kỳ và biểu hiện bằng những triệu chứng động dục theo chu kỳ gọi là chu kỳ tính. Bị thuộc lồi gia súc đa chu kỳ, mỗi chu kỳ từ 18-24 ngày trung bình là 21 ngày. Chu kỳ tính của bị chia làm 4 giai đoạn: Giai đoạn trước động dục: là giai đoạn từ khi thể vàng tiêu huỷ đến lần động dục tiếp theo, chuẩn bị điều kiện cho đường sinh dục cái và trứng để tiếp nhận tinh trùng, đĩn trứng rụng và thụ tinh. Thời gian của giai đoạn này là khoảng 3 ngày. Giai đoạn này biểu hiện các đặc điểm sau: đường sinh dục xung huyết và tăng cường nhu động. Các tuyến sinh dục phụ tiết chất nhầy, âm đạo tiết dịch nhầy lỗng làm trơn đường sinh dục, con vật bắt đầu xuất hiện tính dục. Giai đoạn động dục: gồm ba thời kỳ liên tiếp là hưng phấn, chịu đực và hết chịu đực. ðây là giai đoạn quan trọng nhưng thời gian lại ngắn khoảng 1-3 ngày. Ở giai đoạn này con vật cĩ những biểu hiện: âm đạo xung huyết, Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 5 sưng tấy chuyển từ màu hồng nhạt sang màu mận chín; dịch trong suốt từ âm đạo chảy ra nhiều, con vật ở trạng thái khơng yên tĩnh, ăn ít hoặc bỏ ăn, phá chuồng kêu rít, nhảy lên lưng con khác hay để con khác nhảy lên lưng, xuất hiện các tư thế của phản xạ giao phối như hai chân sau dạng ra, đuơi cong về một bên... Sau khi hết chịu đực 6-10 giờ thì trứng rụng. Khi trứng rụng mà được thụ tinh thì chuyển sang thời kỳ chửa, nếu khơng được thụ tinh thì chuyển sang giai đoạn sau động dục. Giai đoạn sau động dục: bắt đầu từ khi kết thúc động dục và kéo dài vài ngày, các hưng phấn thần kinh giảm dần, sự tăng sinh và tiết dịch của tử cung ngừng lại. Biểu hiện về hành vi tính dục là khơng muốn gần con đực. Con vật dần trở lại trạng thái sinh lý bình thường. Giai đoạn yên tĩnh: đây là giai đoạn dài nhất, thường bắt đầu từ ngày thứ tư sau khi trứng rụng mà khơng thụ tinh và kết thúc khi thể vàng tiêu huỷ. Giai đoạn này khơng cĩ biểu hiện về hành vi sinh dục. ðây là giai đoạn nghỉ ngơi yên tĩnh để khơi phục lại cấu tạo chức năng cũng như năng lượng cho chu kỳ tiếp theo. 2.2.2 Thần kinh và thể dịch điều tiết hoạt động sinh sản ở bị cái Hoạt động sinh lý sinh sản của gia súc chịu sự điều tiết của hệ thống thần kinh và thể dịch (Hypothalamus - tuyến yên - tuyến sinh dục) dưới tác động của các nhân tố bên trong và bên ngồi. Nhân tố nội tại: là hàm lượng Estrogen trong cơ thể gia súc khi đã thành thục về tính. Estrogen tác động lên khu vỏ não và ảnh hưởng đến Hypothalamus, gây tiết GnRH theo chu kỳ. Nhân tố ngoại cảnh: nhiệt độ, ánh sáng, chế độ chăm sĩc nuơi dưỡng đặc biệt là Steroid tự nhiên trong thức ăn xâm nhập vào cơ thể thơng qua tiêu hố, qua da vào cơ quan trong cơ thể gây nên những kích thích mãnh liệt tác động lên vỏ đại não. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 6 Vỏ đại não sau khi tiếp thu những kích thích sẽ truyền xung động đến Hypothalamus gây tiết các yếu tố giải phĩng mà ngày nay gọi là các hormone giải phĩng. Các hormone đĩ gồm: LRH kích thích thuỳ trước tuyến yên tiết ra hồng thể tố (Luteino Releslaing Hormone – LH), LH tác động vào buồng trứng làm trứng chín. LH kết hợp với FSH làm bao nỗn vỡ gây hiên tượng rụng trứng... hình thành thể vàng. PRH kích thích thuỳ trước tuyến yên phân tiết LTH (Luteinotrofic hormone). LTH tác động vào buồng trứng duy trì sự tồn tại của thể vàng, kích thích thể vàng tiết Progesteron. Progesteron tác động lên tuyến yên gây ức chế quá trình phân tiết FSH, LH. Quá trình động dục chấm dứt, nĩ tác động vào tử cung làm tử cung tăng sinh tạo điều kiện cho sự làm tổ của hợp tử. Như vậy, hoạt động chu kỳ tính của gia súc chịu sự chi phối của các hormone FSH, LH, LTH trong đĩ FSH và LH đĩng vai trị quan trọng. FSH và LH tuy được phân tiết riêng lẻ song lại hoạt động phối hợp chặt chẽ nhịp nhàng với nhau. Sự cân bằng nội tiết được giữ vững bởi cơ chế điều khiển ngược. Khi hormone của tuyến nội tiết nào tăng hoặc giảm sẽ gây hiện tượng giảm hoặc tăng hormone tương ứng của tuyến yên. Cơ chế đĩ được gọi là cơ chế điều khiển ngược dương tính. Cơ chế điều khiển ngược cĩ ba kiểu: ðiều khiển ngược vịng dài (Long feed back): Hypothalamus và tuyến yên cĩ những cảm thụ và chịu tác động của các hormone tuyến sinh dục. ðiều khiển ngược vịng ngắn (Short feed back): do các hormone tuyến yên tác động vào cơ quan thụ cảm đặc biệt của Hypothalamus. ðiều khiển vịng cực ngắn (Ultra-Short feed back): do chính các hormone của Hypothalamus quay lại điều hồ chính Hypothalamus. 2.2.3 Cấu tạo và chức năng buồng trứng Buồng trứng là cơ quan sinh sản cơ bản ở gia súc cái bởi vì chúng sản sinh ra giao tử cái (nỗn bào-tế bào trứng) và hormone sinh sản cái (oestrogen Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 7 và progesteron). Trâu, bị, ngựa, cừu là gia súc đơn thai, bình thường mỗi chu kỳ động dục chỉ cĩ một tế bào trứng chín và rụng vì vậy mỗi lần chửa chúng chỉ đẻ một con. Buồng trứng bị cĩ hình ơ van dẹt, nhưng hình dáng này cũng bị thay đổi do những nang trứng phát triển hay do sự tồn tại của thể vàng. Buồng trứng gồm cĩ hai miền: miền tuỷ bên trong và miền vỏ bên ngồi. - Miền tuỷ cĩ nhiều mạch máu, thần kinh và mơ liên kết. - Miền vỏ gồm các tế bào và các mơ cĩ nhiệm vụ tạo ra tế bào trứng và hormone. Lớp ngồi cùng của miền vỏ buồng trứng là biểu mơ bề mặt. Biểu mơ bề mặt là một lớp tế bào lập phương, đầu tiên được gọi là biểu mơ sinh dục bởi vì người ta tin rằng nĩ là nguồn gốc của tế bào sinh dục cái. Giờ đây người ta biết rằng tế bào sinh dục khơng xuất phát từ lớp biểu mơ này. Chúng cĩ nguồn gốc từ mơ ruột của phơi và sau đĩ di chuyển vào miền vỏ tuyến sinh dục của phơi. Ngay bên dưới biểu mơ bề mặt là một lớp mỏng, dày đặc các mơ liên kết gọi là áo trắng buồng trứng. Phía dưới áo trắng là nhu mơ, được coi là lớp chức năng bởi vì nĩ chứa nang trứng và các tế bào phân tiết hormone buồng trứng. Người ta cho rằng tất cả nang sơ cấp được hình thành trước khi con vật cái được sinh ra. Nang sơ cấp (nang bậc I) là một tế bào sinh dục được bao quanh bởi một lớp tế bào hạt. Chúng nằm trong nhu mơ và thường xuyên được nhìn thấy theo nhĩm gọi là tổ trứng. Người ta ước lượng rằng cĩ khoảng 75000 nang sơ cấp được tìm thấy trong buồng trứng bê. Với sự phát triển liên tục và thành thục trong suốt đời sống sinh sản, mỗi bị già chỉ cĩ khoảng 2500 nỗn bào cĩ khả năng phát triển. Một số nỗn bào cĩ khả năng phát triển đã thành thục hồn tồn và được giải phĩng vào đường sinh dục để thụ tinh và phát triển thành bê. Nhưng hầu hết nỗn bào cịn lại đã phát triển và thối hố. Vì thế, số nỗn bào cĩ khả năng phát triển thu được từ buồng trứng để tạo bê lớn hơn rất nhiều so với thực tế nhận thấy. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 8 Nang trứng thường xuyên ở trạng thái phát triển và thành thục. Sau giai đoạn nang sơ cấp là sự tăng sinh các tế bào hạt bao quanh một tế bào trứng cĩ khả năng phát triển. Một tế bào trứng cĩ khả năng phát triển được bao quanh bởi hai hay nhiều lớp tế bào hạt gọi là nang thứ cấp (nang bậc II). Trong quá trình phát triển, các tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy chúng tách rời và hình thành một xoang. Khi một xoang đã được hình thành thì nang đĩ được gọi là nang bậc III. Nang bậc III thành thục khi quan sát thấy nĩ chứa đầy dịch và nổi lên bề mặt buồng trứng, được gọi là nang Graaf. Dịch trong nang bậc III được gọi là dịch nang trứng. ðây là một dịch nhớt giàu hormone sinh sản và các yếu tố khác giúp điều hồ chức năng buồng trứng. Cĩ nhiều lớp tế bào trong nang Graaf được coi là cĩ chức năng quan trọng. Ngồi cùng là lớp tế bào sợi được gọi là tế bào vỏ bên ngồi. Tiếp theo là lớp tế bào vỏ bên trong. Trong lớp này cĩ nhiều mạch máu. Các tế bào vỏ và các mạch máu được hình thành khi nang trứng lớn lên và di chuyển vào miền tuỷ. Màng mềm tách lớp tế bào vỏ bên trong khỏi lớp tế bào trong cùng - lớp tế bào hạt và ngăn cản sự di chuyển của hệ thống mạch máu vào các tế bào này. Các tế bào hạt bao quanh xoang. Ngồi ra khối Cumulus Oophorus - tế bào hạt nằm ở bên kia của xoang. Nỗn bào cĩ khả năng phát triển nằm trong khối tế bào Cumulus với các tế bào hạt bao quanh. Những tế bào hạt bao quanh và tiếp xúc trực tiếp với tế bào trứng cĩ khả năng phát triển được gọi là vành phĩng xạ. Khi rụng trứng xảy ra, nang trứng vỡ đẩy dịch nang trứng, một số tế bào hạt và tế bào trứng cĩ khả năng phát triển vào xoang cơ thể gần với chỗ mở ra của ống dẫn trứng. Trong lúc giải phĩng ra, tế bào trứng được bao quanh bởi vành phĩng xạ và một khối tế bào hạt (Cumulus) dính giúp ống dẫn trứng thu tế bào trứng và dịch chuyển trong ống dẫn trứng. Nang trứng vỡ làm chảy máu, do đĩ hình thành cục máu ở vị trí trứng rụng. Nang trứng vỡ chứa đầy máu được gọi là thể huyết. Thể huyết sau đĩ được thay thế bằng thể vàng là một thể cứng được hình thành nhanh chĩng Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 9 bởi hỗn hợp tế bào vỏ và tế bào hạt. Cĩ hai loại tế bào được tìm thấy trong thể vàng. Loại tế bào thể vàng nhỏ cĩ nguồn gốc từ tế bào vỏ và loại tế bào lớn cĩ nguồn gốc từ tế bào hạt. Trong thể vàng cĩ nhiều mạch máu và là nguồn progesteron và các progestin khác duy nhất của buồng trứng. Khi thể vàng thối hố, nĩ khơng cịn phân tiết progesteron nữa. Nĩ thay đổi màu sắc cuối cùng trở thành một cái sẹo màu trắng trên bề mặt buồng trứng. Nếu gia súc cĩ chửa, thể vàng sẽ được duy trì đến cuối giai đoạn mang thai. 2.2.4 Cấu tạo tế bào trứng Hình thái: tế bào trứng bị là một loại tế bào lớn nhất trong cơ thể (0,135-0,145mm), cĩ dạng hình cầu. Cấu tạo tế bào trứng gồm ba phần: (Trần Tiến Dũng và cs (2002)[1]) nguyên sinh chất, nhân và màng bao. ði từ ngồi vào trong thì tế bào trứng cĩ cấu tạo: Màng ngồi cùng: là đám tế bào Cumulus, cĩ dạng lầy nhầy, khơng rõ hình dạng, cấu trúc, bao gồm nhiều lớp tế bào hình nang, hình chĩp, những tế bào này được phân bố khắp xung quanh tế bào trứng nên được gọi là màng phĩng xạ. Các tế bào này được gắn với nhau bởi axit Hyanuronilic. Lớp màng giữa: bao gồm nhiều tế bào, được sinh ra từ lớp tế bào hình nang, là lớp nuơi dưỡng tế bào trứng cịn được gọi là màng trong suốt, màng này đảm bảo dinh dưỡng cho tế bào trứng ở trong buồng trứng. Lớp màng trong: là một lớp tế bào màng mỏng bao bọc phần nguyên sinh chất gọi là màng nỗn hồng hay màng nguyên sinh chất. Màng này cĩ tác dụng nuơi dưỡng trứng đã thụ tinh. Ở giữa màng trong suốt và màng nỗn hồng cĩ khoảng trống. Khoảng trống cĩ độ dầy 14-15µm, cĩ độ pH = 3-5, chứa dịch cĩ nồng độ ion cao. Nguyên sinh chất: bao quanh nhân trứng, thành phần chủ yếu của nguyên sinh chất là: nước, muối khống, các vật chất hữu cơ, các men và đặc biệt là các bào quan của tế bào. Nhân trứng: bao gồm lưới nhiễm sắc thể (NST) và nhiều hạt nhân. Ở bị cĩ 29 cặp nhiễm sắc thể thường và một cặp nhiễm sắc thể giới tính. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 10 2.3 THU TẾ BÀO TRỨNG BỊ Phương pháp khai thác tế bào trứng gồm cĩ phương pháp khai thác in- vitro và khái thác in-vivo. Khai thác trứng bị in-vitro: là phương pháp chủ yếu khi tiến hành thu trứng bị phục vụ cơng nghệ phơi động vật ở gĩc độ nghiên cứu cơ bản cũng như ứng dụng tại hầu hết các phịng thí nghiệm trên thế giới. Phương pháp này cho phép cung cấp một lượng trứng lớn và ổn định. Buồng trứng bị được thu ngay khi con vật chết, sau đĩ được rửa, bảo quản và đưa ngay về phịng thí nghiệm. Sau đĩ các tế bào trứng được khai thác theo hai phương pháp là phương pháp chọc hút nang trứng và giải phẫu nang trứng. Khai thác trứng bị in-vivo: ngồi phương pháp khai thác trứng in- vitro, người ta nghiên cứu áp dụng một phương pháp mới gọi là phương pháp Ovum Pick Up (OPU). Phương pháp này được xây dựng trên cơ sở phương pháp hút trứng với sự trợ giúp của máy siêu âm dùng trong các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản ở người. Phương pháp OPU được sử dụng để khai thác trứng từ các cá thể cĩ tiềm năng di truyền cao, kết hợp với cơng nghệ thụ tinh ống nghiệm cho phép tạo ra các phơi cĩ chất lượng tốt bằng việc chủ động dùng các nguồn tinh đực giống. Bols và cs (2004)[16], Galli và cs (2001)[27] đã khẳng định rằng hút dịch nang trứng từ gia súc sống lặp lại cĩ thể thực hiện ít nhất 2 lần/tuần trong nhiều tháng mà khơng cần phải dùng hormone để kích thích. Việc áp dụng kỹ thuật nào để thu tế bào trứng phụ thuộc vào trang thiết bị và kỹ thuật của mỗi phịng thí nghiệm. Tuy nhiên, kỹ thuật thu tế bào trứng ở gia súc sống cĩ ý nghĩa lớn vì biết rõ được nguồn gốc và tiềm năng di truyền của con cái. Kỹ thuật này địi hỏi trình độ kỹ thuật cao và trang thiết bị hút nội soi đắt tiền. Lựa chọn tế bào trứng bị cho, tế bào trứng thu được ở dạng chưa thành thục, nuơi chín tế bào trứng trong ống nghiệm (IVM) trên cơ sở đánh giá dưới kính hiển vi về những đặc điểm hình thái của chúng. Loos và cs Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 11 (1989)[38] đã chia trứng bị nuơi trong ống nghiệm thành 4 loại dựa trên sự chặt chẽ và trong suốt của tế bào Cumulus bao quanh tế bào trứng, sự đồng nhất và trong suốt của nỗn bào chất (ooplasma). Sau đĩ Loos và cs đã mơ tả hình thái của trứng sau khi IVM và so sánh với hình thái của tế bào trứng thành thục in-vivo. Các tác giả này kết luận rằng cĩ một sự dao động đáng kể về hình thái giữa các tế bào trứng cĩ khả năng phát triển bình thường. Loại A (trứng tốt): Các lớp tế bào Cumulus chặt chẽ, tế bào đơng nhất, khối tế bào trứng – Cumulus (COC) sáng và trong suốt. Loại B (loại tế bào trứng khá): Các lớp tế bào Cumulus chặt chẽ, tế bào đồng nhất, nhưng cĩ những vùng tối phía ngồi tế bào trứng; khối COC sáng và ít trong suốt. Loại C ( tế bào trứng trung bình): Các lớp tế bào Cumulus ít chặt chẽ, trứng khơng đều và cĩ những đám đen, khối COC tối hơn loại A và B ở trên. Loại D (tế bào trứng kém): Các lớp Cumulus giãn nở, tụ tập thành những đám tối, trứng khơng đều với những đám tối, khối COC tối và khơng đều. 2.4. NUƠI TẾ BÀO TRỨNG THÀNH THỤC TRONG ỐNG NGHIỆM Các trứng khai thác từ buồng trứng đều ở trạng thái chưa thành thục, để cĩ thể được thụ tinh trứng cần cĩ khả năng phát triển và đạt đến trạng thái thành thục. Sự phát triển của trứng như vậy cĩ kèm theo những biến đổi về mặt hình thái, sinh lý và sinh hố liên quan đến nhân trứng, nguyên sinh chất và màng trứng. Do vậy sau khi thu hoạch, phân loại, các tế bào trứng được nuơi thành thục trong ống nghiệm. Mơi trường dùng cho nuơi tế bào trứng thành thục trong ống nghiệm khơng chỉ ảnh hưởng tới tỷ lệ tế bào trứng bị đạt tới trung kỳ II và cĩ khả năng diễn ra thụ tinh, mà cịn ảnh hưởng tới sự phát triển tiếp theo của phơi. Các mơi trường thường dùng để nuơi thành thục tế bào trứng bị trong ống nghiệm cĩ thể chia thành 2 loại: đơn giản và phức tạp. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 12 Các loại mơi trường thường được bổ sung thêm huyết thanh hay albumin và kháng sinh (penicillin, streptomycin, gentamycin). Mơi trường phức tạp, ngồi các thành phần cơ bản của mơi trường đơn giản, cĩ chứa các axit amin, vitamin, purin và các chất khác, chủ yếu là các chất được tìm thấy trong huyết thanh. Một trong những mơi trường phức tạp được sử dụng rộng rãi để nuơi tế bào trứng bị trong ống nghiệm là mơi trường nuơi cấy mơ 199 (TCM-199). Hầu hết các phịng thí nghiệm TTON đều sử dụng TCM-199 làm mơi trường cơ bản cho nuơi tế bào trứng trong ống nghiệm và cĩ rất ít báo cáo chỉ ra rằng các mơi trường khác cĩ phù hợp khơng. ðã cĩ nhiều nghiên cứu báo cáo rằng gonadotropin, steroid và các yếu tố tế bào tất cả tương tác với nhau để hỗ trợ trứng thành thục in-vivo. Nang trứng trước rụng trứng cĩ thể coi là một cấu trúc mà ở đĩ hàng triệu tế bào soma đĩng gĩp cho sự phát triển của tế bào sinh dục: tế bào trứng. Trong nhiều năm người ta biết rằng tế bào trứng cĩ quan hệ chặt chẽ với tế bào Cumulus. Những tế bào Cumulus tiếp xúc trực tiếp với tế bào trứng cĩ nguyên sinh chất kéo dài, xuyên qua màng trong suốt và kết thúc ở chỗ phồng ra gần với màng tế bào trứng. Tầm quan trọng của chỗ nối này tăng lên khi người ta biết rằng màng tế bào trứng khơng cĩ khả năng xuyên thấm đối với các chất trao đổi cĩ phân tử lượng thấp. Sự xâm nhập của các chất đĩ được biết là thơng qua chỗ tiếp xúc giữa tế bào trứng và tế bào Cumulus. Sự tương tác trao đổi chất giữa tế bào trứng và tế bào Cumulus đĩng một vai trị dinh dưỡng quan trọng trong giai đoạn trứng thành thục. Người ta cũng biết rõ rằng các tế bào Cumulus liên kết với nhau bằng những chỗ trống tiếp xúc và những chỗ trống tiếp xúc này cho phép các chất cĩ phân tử lượng thấp đi qua từ tế bào này sang tế bào khác. Các tế bào Cumulus liên kết với các tế bào hạt, mà các tế bào hạt lại đi kèm với các tế bào vỏ bên trong. Như vậy, cĩ khả năng các chất do tế bào hạt tạo ra sẽ đi vào các tế bào nang trứng và sau đĩ đi vào tế bào trứng. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 13 2.5 KIỆN TỒN NĂNG LỰC THỤ TINH CỦA TINH TRÙNG 2.5.1 Khái niệm ðây là một điều kiện bắt buộc đối với các tinh trùng tham gia vào quá trình thụ tinh in-vitro. Hiện tượng kiện tồ._.n năng lực thụ tinh (capacitation) của tinh trùng được phát hiện bởi Austin (1951)[13] và Chang (1951)[21]. Cả hai đã chứng minh rằng tinh trùng của động vật cĩ vú cĩ khả năng xâm nhập vào tế bào trứng thành thục chỉ sau khi chúng cĩ một thời gian di chuyển ở trong đường sinh dục cái để đạt tới khả năng thụ tinh. Các biến đổi sinh lý, sinh hố ở tinh trùng dẫn đến khả năng tương tác một cách hiệu quả giữa tinh trùng với trứng được gọi là sự kiện tồn năng lực thụ tinh của tinh trùng. Hiện tượng kiện tồn năng lực thụ tinh (hoạt hố) giờ đây đã được nhận biết một cách rõ ràng như một quá trình mà ở đĩ tinh trùng diễn ra một loạt các phản ứng sinh lý và sinh hố phức tạp trước khi cĩ khả năng thụ tinh với tế bào trứng thành thục. Người ta cho rằng giai đoạn đầu tiên của quá trình liên quan loại bỏ và thay thế các thành phần cĩ nguồn gốc từ ống sinh tinh, phụ dịch hồn, ống dẫn tinh và tinh thanh. Trong khi di chuyển từ tinh hồn qua phụ dịch hồn, tinh trùng được thay đổi để trở thành những tế bào thành thục cĩ khả năng thụ tinh và dự trữ ở đuơi phụ dịch hồn đến khi được giải phĩng ra trong quá trình xuất tinh hay thải vào nước tiểu. Trong việc định nghĩa, một số nhà nghiên cứu đưa cả khái niệm phản ứng acrosome vào, trong khi một số khác lại khơng đưa vào. Khái niệm được Furuya và cs (1992)[26] đưa ra: hoạt hố là một chuỗi thay đổi sinh hố mà những thay đổi đĩ làm tinh trùng cĩ thể diễn ra phản ứng acrosome khi tiếp xúc với màng trong suốt, mà màng trong suốt dường như là tác nhân sinh lý gây nên phản ứng đĩ. Ở bị, dựa vào sự xâm nhập của tinh trùng đầu tiên vào tế bào trứng sau khi thụ tinh nhân tạo, thời gian cần cho hoạt hố của tinh Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 14 trùng trong đường sinh dục cái khoảng 6 giờ. Tuy nhiên, các yếu tố ở đường sinh dục bị cái liên quan tới hoạt hố và nguồn gốc của chúng vẫn chưa được rõ. 2.5.2 Phương pháp kiện tồn năng lực thụ tinh của tinh trùng trong TTON 2.5.2.1 Sử dụng sự chênh lệch tỷ trọng Số lượng tinh trùng bị cĩ hình thái bình thường, hoạt lực và khả năng sống cao khi sử dụng chênh lệch albumin huyết thanh bị (BSA) khơng liên tục. Ở Lợn số lượng tinh trùng cĩ hoạt lực cao với các đặc điểm về khả năng thụ tinh cao đã được tách ra bằng sự chênh lệch BSA khơng liên tục tương tự, sử dụng phương pháp này đã cho mẫu tinh trùng cĩ hơn 90% tinh trùng cĩ hoạt lực tốt. 2.5.2.2 Kỹ thuật bơi ngược dịng (swim up) Chuyển động là một đặc điểm quan trọng của tinh trùng bị vì chúng phải đi qua đường sinh dục cái và ảnh hưởng đến sự thụ tinh. Sự xâm nhập của tinh trùng qua màng trong suốt địi hỏi một sự chuyển động rất mạnh của tinh trùng. Kỹ thuật Swim-up trở thành một kỹ thuật cĩ thể chấp nhận được để thu được tinh trùng cĩ hoạt lực cao dùng cho TTON ở bị. Kỹ thuật Swim- up thường liên quan đến việc giải đơng tinh trùng và đưa chúng vào một thể tích mơi trường thích hợp. Mẫu tinh trùng được để trong tủ nuơi ở nhiệt độ 39oC từ 30-60 phút, trong thời gian đĩ những tinh trùng cĩ hoạt lực tốt trong tinh dịch sẽ bơi lên phía trên mơi trường TALP. Mặc dù kỹ thuật Swim-up cĩ thể cho mẫu tinh trùng cĩ hoạt lực cao nhưng chúng cũng cĩ những bất lợi vì số lượng tinh trùng bơi lên tương đối thấp, đĩ là điều quan tâm trong thực tế khi sử dụng tinh cọng rạ rất đắt. Các nhà khoa học cũng báo cáo rằng sử dụng kỹ thuật Swim-up trong TTON ở bị cĩ một ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ thụ tinh. Tỷ lệ thụ tinh thường tăng từ 46% lên 59% và các mẫu tinh trùng từ kỹ thuật Swim-up cho thấy tinh trùng cĩ hoạt lực cao. Tuy nhiên trong thực tế Swim-up khơng được sử dụng nhiều. Nhu cầu sử dụng kỹ thuật Swim-up cĩ thể lớn hơn khi chất lượng tinh trùng và hoạt lực tinh trùng kém. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 15 2.5.2.3 Kỹ thuật lọc qua màng lọc thuỷ tinh (phân lớp Percoll) Trong những năm 1950, người ta đã chỉ ra rằng tinh dịch bị pha lỗng, khi lọc qua một lớp thuỷ tinh nhỏ thì những tinh trùng chết bị màng lọc giữ lại, cịn những tinh trùng sống đi qua được. Khi lọc tinh trùng bằng cột màng thuỷ tinh cho số lượng tinh trùng cĩ khả năng xâm nhập vào tế bào trứng cao. Khi so sánh với kỹ thuật lọc tinh trùng bằng Swim-up, tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ phát triển phơi là tương tự nhau song lọc bằng màng lọc thuỷ tinh chỉ địi hỏi mất ba phút để hồn thành, điều đĩ làm cho việc xử lý tinh trùng trong ống nghiệm tiết kiệm được nhiều. 2.6 SINH LÝ QUÁ TRÌNH THỤ TINH 2.6.1 Quá trình thụ tinh Thụ tinh là quá trình đồng hố giữa trứng và tinh trùng để tạo thành hợp tử 2n NST cĩ bản chất hồn tồn mới và cĩ khả năng phân chia nguyên nhiễm liên tiếp tạo thành phơi. ðĩ là sự tái tổ hợp các gen từ hai nguồn gen khác nhau. Sau khi rụng, tế bào trứng và dịch nang trứng được hút vào loa kèn rồi vận chuyển nhanh đến chỗ phình của ống dẫn trứng. Trong thời gian di chuyển, dịch ống dẫn trứng cĩ tác động nhất định đối với tế bào trứng, lớp tế bào vành phĩng xạ của tế bào trứng cũng bị mất đi một phần bởi tế bào hình trụ ống dẫn trứng bào mịn. Sau khi thụ tinh (nhân tạo hay phối giống), tế bào tinh trùng tiến nhanh qua tử cung đến 1/3 phía trên của ống dẫn trứng trong vịng 5-15 giờ tuỳ lồi nhờ nhu động của tử cung, ống dẫn trứng và hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng. Quá trình thụ tinh xảy ra tốt nhất khi trứng và tinh trùng gặp nhau tại 1/3 phía trên ống dẫn trứng. Các giai đoạn của quá trình thụ tinh diễn ra như sau: - Khi trứng di chuyển trong ống dẫn trứng, nĩ tiết ra một chất kích thích Ferilinzin làm cho tinh trùng hoạt động mạnh và tiến tới bao vây trứng. ðồng thời xoang Aroxom của tinh trùng cũng tiết ra men Hyaluronidaza để phá vỡ lớp tế bào của màng phĩng xạ nhờ hai quá trình phân giải và thuỷ Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 16 phân. Lượng tinh trùng để tiết ra men Hyaluronidaza làm nhiệm vụ phá vỡ lớp tế bào của màng phĩng xạ ở các lồi gia súc phải cĩ một số lượng nhất định, men này cho hiệu quả tốt nhất khi cĩ nồng độ 4-6 mg% trong tinh dịch. Tinh trùng của lồi nào thì thụ tinh với trứng của lồi đĩ đây chính là tín hiệu lồi, tuy nhiên men Hyaluronidaza do tinh trùng tiết ra khơng đặc trưng cho lồi cho nên tinh trùng của gia súc này cĩ thể tiết men Hyaluronidaza để phá vỡ tế bào vành phĩng xạ của tế bào trứng của lồi gia súc khác. - Tinh trùng đi vào tế bào trứng: Sau khi phá vỡ lớp tế bào của màng phĩng xạ nhờ men Hyaluronidaza, tinh trùng tiếp xúc với màng trong suốt của tế bào trứng. Tại đây, tinh trùng tiết ra men Zonalizin phá vỡ màng trong suốt tạo thành khe hở, tạo điều kiện cho vài chục tinh trùng chui vào “khoảng trống”, ở đây tinh trùng được hồi phục sức lực. Số tinh trùng này tiếp tục phá vỡ màng nỗn hồng nhờ men Muraminidaza và chỉ cho một tinh trùng đi vào nhân tế bào trứng. Hai men Zonalizin và Muraminidaza là hai men đặc hiệu chủng lồi nên chỉ cho phép tinh trùng cùng lồi đi vào trong nhân của tế bào trứng để xảy ra quá tình thụ tinh. Những khe hở để tinh trùng đi qua được đĩng mở theo cơ chế đơng máu với sự tham gia của ion Ca++. Khi tinh trùng đi vào giữa tế bào trứng thì phần đầu của tinh trùng kết hợp với nhân tế bào trứng và xảy ra quá trình đồng hố, dị hố giữa hai loại tế bào, phần thân và đuơi của tinh trùng được nguyên sinh chất của tế bào trứng đồng hố và tiêu tan. Sau khi tinh trùng đi vào giữa tế bào trứng, lúc này xảy ra quá trình đồng hố và dị hố phức tạp. Thực chất của quá trình thâm nhập là khích thích tế bào phân chia giảm nhiễm lần II hồn thành quá trình chín của nĩ. Sau khi thâm nhập vào tế bào trứng đầu tinh trùng tăng lên về thể tích rồi hình thành các nhân nguyên, sau đĩ các nhân nguyên chui qua màng tế bào. Khi nhân nguyên đực và nhân nguyên cái phối hợp với nhau cĩ chọn lọc hình thành hợp tử và tiếp tục phân chia. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 17 2.6.2 ðặc điểm của phơi giai đoạn đầu Sau khi hợp tử hình thành cùng với sự di chuyển của tế bào trứng đến nơi làm tổ theo quy định của giống lồi, trứng bắt đầu phân chia theo cấp số nhân: 1 thành 2, 2 thành 4... Do sự phân chia mà hình thành nên đường biên giới giữa các tế bào gọi là cầu phân chia, cầu phân chia cĩ những rãnh dọc ngang gọi là rãnh phân chia. Cầu phân chia to nhỏ khác nhau, màu sáng tối khơng giống nhau. Những cầu mầu tối sẽ hình thành thân phơi, cầu màu sáng sẽ hình thành nên các khí quan, quá trình phân chia này diễn ra ở ống dẫn trứng. Một đặc điểm nữa của phơi là giai đoạn đầu của quá trình phân chia khơng làm phơi lớn lên về kích thước vì tồn bộ quá trình phân chia diễn ra trong màng trong suốt. Trong quá trình phân chia, cầu phân chia nhỏ đi hình thành các đám tế bào, giữa các đám tế bào đĩ cĩ xoang chứa dịch keo to dần lên, lúc này kích thước phơi mới tăng lên, cuối cùng phá vỡ màng trong suốt, phơi chui ra ngồi, giai đoạn này tương ứng với ngày thứ 9-11 sau khi thụ tinh. Thơng thường phơi ở ngày thứ 5, 6 cĩ 16-32 hoặc 64 phơi bào trở lên được gọi là phơi dâu (morula) vì trơng nĩ nổi lên giống hệt quả dâu khi nhìn qua kính hiển vi. Giai đoạn giữa và cuối của phơi dâu khĩ xác định được số phơi bào đã phân chia. Những tế bào phơi sẽ tiết ra một ít dịch và hình thành nên một xoang gọi là xoang phơi, xoang này dần lớn lên và cĩ thể nhận biết qua kính hiển vi. Phơi khi đã hình thành xoang gọi là phơi nang (blastocyst). Xoang phơi lớn dần lên đẩy khối tế bào về một cực, khối tế bào này gọi là đĩa phơi hay mầm phơi. Mầm phơi sau này biệt hĩa hình thành nên các cơ quan bộ phận của cơ thể. Khối tế bào bao bọc mầm phơi và thành vách của xoang phơi gọi là lớp màng nuơi hay dưỡng bào (trophoblast) sau hình thành nên hệ thống nhau thai. Dựa vào các đặc điểm trên cùng kết quả của các nghiên cứu, phơi thường được thu vào ngày thứ 7 sau khi phối giống hoặc thụ tinh do phơi ở thời điểm này là phơi dâu, phơi nang, là loại phơi tốt nhất cho đơng lạnh cũng như cấy truyền. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 18 2.7 TẠO PHƠI TRONG ỐNG NGHIỆM Tạo phơi trong ống nghiệm từ tế bào trứng của những con vật sống là một kỹ thuật linh hoạt vì nĩ cĩ thể áp dụng cho những con cho ở tất cả các giai đoạn tuổi từ 2 tháng đến những con bị rất già. Cĩ thể được sử dụng cho những con bị cạn sữa hoặc đang vắt sữa thạm chí ở cả giai đoạn cĩ chửa. Nĩ khơng làm ảnh hưởng đến trạng thái sinh lý của con cho bởi vì khơng địi hỏi sự kích thích của hormone. Năm 1988, tế bào trứng đầu tiên được Pieterse và cs [42] thu từ gia súc sống với sự trợ giúp của hệ thống siêu âm qua âm đạo (OPU). Siêu âm hút trứng qua âm đạo là một kỹ thuật thu tế bào trứng chưa thành thục từ con cho cịn sống. Phương pháp này được xây dựng trên cơ sở phương pháp hút trứng với sự trợ giúp của máy siêu âm dùng trong các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản của người. Phương pháp OPU được sử dụng để khai thác trứng từ các cá thể cĩ tiềm năng di truyền cao, kết hợp thụ tinh ống nghiệm cho phép tạo ra các phơi cĩ chất lượng tốt bằng việc chủ động dùng các nguồn tinh đực giống. Các phơi này được cấy vào các bị nhận đồng pha để sinh ra các bê con cĩ tiềm năng năng suất cao. Các thí nghiệm về thu tế bào trứng bị bằng phương pháp dùng siêu âm được tiến hành đầu tiên bởi Callesen và cs (1987)[20]; sau đĩ Pieterse và cs (1988)[42] là những người đầu tiên sử dụng phương pháp OPU như là một phương pháp khai thác trứng một cách hiệu quả và đều đặn trên đối tượng bị. Phương pháp OPU địi hỏi phải cĩ các thiết bị và dụng cụ chuyên dụng như máy siêu âm, đầu dị, kim chọc hút cũng như tay nghề cao của người thao tác. Phương pháp OPU cho phép hút các trứng trong nang của buồng trứng từ con vật đang sống. Con vật đưa vào khai thác được đứng trong giá cố định và người thao tác một tay đưa vào trực tràng kiểm sốt buồng trứng, áp buồng trứng vào đầu dị, tay kia điều kiển kim hút. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 19 Khi quan sát thấy nang trứng xuất hiện trên màn hình của máy siêu âm, một tay (thơng qua trực tràng) cố định buồng trứng áp sát vào đầu dị và tay kia ấn nhẹ kim chọc hút vào lịng nang trứng. Thao tác này diễn ra nhẹ nhàng và hình ảnh kim hút chọc vào nang sẽ hiện rõ trên màn hình máy siêu âm giúp người thao tác điều chỉnh chính xác và nhịp nhàng kim hút. Những hình ảnh lần lượt hiện ra trên màn hình máy siêu âm giúp chúng ta biết được hướng đi của kim, vị trí nang trứng và vị trí kim chọc vào nang. Phương pháp khai thác trứng bị từ buồng trứng (phương pháp in-vitro và phương pháp OPU) phục vụ cơng nghệ phơi cho phép cung cấp một số lượng lớn trứng với chất lượng tốt. Phương pháp thu trứng in-vitro được sử dụng cho các nghiên cứu cơ bản tại hầu hết các phịng thí nghiệm trên thế giới. Phương pháp OPU kết hợp thụ tinh ống nghiệm và cấy phơi đặc biệt cĩ giá trị trong việc nhân nhanh các cá thể cĩ tiềm năng năng suất cao. Trứng bị sau khi được khai thác từ buồng trứng bị bằng một trong các phương pháp trên , chúng được phân loại và lập tức đưa vào các mơi trường nuơi giàu dinh dưỡng. Ngồi ra, OPU cịn cĩ tác dụng điều trị ở những con cho vơ sinh đặc biệt là những con bị u nang buồng trứng, các con cho khơng động dục đã cĩ chu kỳ trong vịng hai tuần kể từ lần thu tế bào trứng cuối cùng và cĩ thể phối giống thành cơng. 2.8 NUƠI PHƠI TRONG ỐNG NGHIỆM Trong những thập kỷ qua, khả năng nuơi phơi trong ống nghiệm ở giai đoạn đầu của nhiều lồi động vật cĩ vú trở thành hiện thực. Từ cuối những năm 1960, các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều loại mơi trường khác nhau để nuơi phơi ở giai đoạn đầu và hầu hết các loại mơi trường đều dựa vào các chất cĩ trong ống dẫn trứng và dựa vào kiến thức về trao đổi chất của phơi. Tế bào của ống dẫn trứng được sử dụng thành cơng đầu tiên trong các hệ thống nuơi kết hợp ở cừu và bị, việc sử dụng hệ thống nuơi các tế bào ống dẫn trứng ở cừu đã đặt những nền mĩng quan trọng cho việc nuơi phơi trong ống nghiệm . Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 20 Tuy nhiên, sau đĩ người ta đã biết rõ rằng khơng chỉ các tế bào ống dẫn trứng mà cịn nhiều loại tế bào sơ ma khác cũng cĩ khả năng cung cấp mơi trường phù hợp để phơi vật nuơi cĩ thể phát triển. Các mơi trường nuơi thơng thường là những mơi trường được phát triển để nuơi tế bào. Việc sử dụng các loại mơi trường này để nuơi phơi vật nuơi cho kết quả khơng thống nhất. Các nhà khoa học đã báo cáo rằng hầu hết phơi nuơi bằng những mơi trường này thường dừng phát triển ở giai đoạn 8 tế bào. Ngồi ra chỉ số ít phơi nuơi lâu hơn cho thấy sự phân chia bình thường và hầu hết khơng phát triển khi cấy cho con nhận. Khi nuơi phơi ở giai đoạn đầu, nhiều cơng thức dựa trên dung dịch muối Krebs ringer Bicarbonate (KRB) đã sử dụng pyruvate, glucose và lactate làm nguồn năng lượng. Những mơi trường này cịn được bổ sung thêm một nguồn protein như huyết thanh thai bê (FCS) hay albumin huyết thanh bị (BSA). Ở hầu hết các phịng thí nghiệm, phơi dâu và phơi nang động vật cĩ vú cĩ thể thu được bằng sự nuơi trứng thành thục trong ống nghiệm/thụ tinh ống nghiệm tế bào trứng. Tuy nhiên dừng phát triển ở giai đoạn trước hay sau 8 tế bào khi sử dụng các loại mơi trường nuơi chỉ bổ sung thêm huyết thanh bê đã đưa các nhà khoa học phải nghĩ đến các mơi trường nuơi thay thế cĩ sử dụng tế bào Cumulus hay tế bào ống dẫn trứng. Một kỹ thuật nuơi thay thế khác nữa là sử dụng mơi trường nuơi khơng bổ sung thêm các loại tế bào, điển hình là mơi trường nuơi cấy mơ TCM-199 cĩ bổ sung thêm huyết thanh. 2.9 ðƠNG LẠNH PHƠI VÀ GIẢI ðƠNG PHƠI ðơng lạnh phơi là quá trình chuyển phơi từ trạng thái sinh lý bình thường (trong cơ thể mẹ hoặc ngồi cơ thể mẹ ở nhiệt độ 37oC) sang trạng thái tiềm sinh đơng lạnh để cất giữ, bảo quản ở nhiệt độ sâu -196oC. Phơi đơng lạnh vẫn cĩ thể sống, phát triển bình thường sau giải đơng và đem cấy cho con cái nhận phơi động dục đồng pha hoặc sử dụng trong các kỹ thuật sinh sản khác. Nhờ cĩ kỹ thuật đơng lạnh và bảo quản mà phơi động vật cĩ Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 21 thể thương mại hố trong nước cũng như trên phạm vi quốc tế một cách dễ dàng vì khơng phải vận chuyển gia súc sống, tránh được sự thay đổi đột ngột bất lợi đối với gia súc cũng như tránh được sự lây truyền dịch bệnh giữa các vùng lãnh thổ. Ngồi ra, kỹ thuật đơng lạnh và bảo quản phơi cịn là nền tảng cho việc duy trì ngân hàng phơi đơng lạnh của những động vật cĩ nguy cơ bị diệt vong. 2.9.1 Những chất bảo vệ sinh học lạnh thơng dụng Phơi chỉ sống sĩt khi người ta bổ sung một dung mơi hữu cơ hay cịn gọi là chất bảo vệ sinh học lạnh vào mơi trường huyền phù để đơng lạnh. Các chất thường được sử dụng là: glycerol, dimethysufoxide (DMSO) và một số glycol (ethylen glycol, propylen glycol…) trong đĩ glycol là chất bảo vệ sinh học lạnh được sử dụng phổ biến trên nhiều lồi động vật và cĩ hiệu quả cao nhất. - Glycerol cĩ phân tử lượng 92, cĩ độc tính nhẹ, cĩ tác dụng như một chất chống đơng, cĩ khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, hồ tan trong nước và cồn. Trong quá trình cân bằng, glycerol xâm nhập vào bên trong tế bào làm cho tế bào khơng bị giảm dung tích. ðể phơi cĩ thể cân bằng với glycerol, người ta chuyển phơi vào dung dịch PBS cĩ nồng độ glycerol tăng dần trong một khoảng thời gian nhất định để thực hiện rút nước nội bào và thay thế bằng glycerol. ðiều quan trọng nhất là thời gian và nồng độ thích hợp để ngâm phơi, điều này phụ thuộc vào phơi của mỗi lồi động vật và trạng thái phát triển của phơi. - Ethylene glycol, cĩ phân tử lượng thấp hơn (62,07), chất này tương tự như glycerol nhưng thời gian ngâm phơi bị ngắn hơn. Ưu điểm của việc dùng ethylene glycol trong đơng lạnh phơi bị là khi giải đơng khơng cần rút chất này ra khỏi phơi theo các bước mà nĩ tự thẩm xuất ra khỏi tế bào, vì vậy người ta cĩ thể cấy phơi ngay được. ðiều cần lưu ý là Ethylene glycol rất độc cho phơi do đĩ phải thận trọng khi sử dụng. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 22 - Dimethylsulfoxide (DMSO) cũng là chất bảo vệ lạnh cĩ phân tử lượng thấp (78,13). Chất này đầu tiên được Wilmut và Rowson (1973)[56] sử dụng để đơng lạnh phơi bị. Tuy nhiên, nhiều tác giả nhận thấy rằng, cĩ sự khác nhau về khả năng thẩm thấu của chất bảo vệ lạnh giữa phơi của các lồi và đối với phơi bị thì glycerol cĩ khả năng thẩm thấu tốt hơn DMSO. Vì thế đến cuối những năm 1970, glycerol được dùng nhiều hơn DMSO trong việc đơng lạnh phơi bị. ðường (sucrose, lactose) và protein (bovine serum albumin, hyaluronic acid) cũng được dùng như những chất bảo vệ lạnh nhưng chúng thường được dùng với các chất bảo vệ lạnh khác. Các phịng thí nghiệm trên thế giới cĩ thể sử dụng một chất bảo vệ lạnh duy nhất hoặc kết hợp nhiều chất bảo vệ lạnh như dimethy sulphoside, acetamide, propylen glycol, glycerol, ethylene glycol, polyethylene glycol, BSA, sucrose, trehalose và glucose với các nồng độ khác nhau để đơng lạnh phơi động vật cĩ vú. Theo Bui Xuan Nguyen (1997)[18], việc sử dụng các chất bảo vệ lạnh và khả năng sống của phơi đơng lạnh cĩ sự khác nhau giữa các lồi. ðối với thỏ, khả năng sống của phơi đơng lạnh trong hỗn hợp sucrose và glyceorol hay DMSO là rất thấp (0-5%) so với đơng lạnh bằng propaneol (92%). ðối với phơi dâu - phơi nang bị, sử dụng chất bảo vệ lạnh propaneol tốt hơn so với sử dụng glycerol (75% so với 0%). Trong khi đĩ phơi bị được đơng lạnh trong hỗn hợp bảo vệ lạnh sucrose-propaneol-glycerol cĩ tỷ lệ sống cao hơn so với hỗn hợp sucrose-propaneol (65% so với 0%). Sự khác biệt về khả năng sống của phơi khi sử dụng các chất bảo vệ lạnh khác nhau giữa các lồi khác nhau vẫn chưa được làm rõ. 2.9.2 Phương pháp đơng lạnh ðơng lạnh phơi cĩ thể chia làm hai phương pháp: đơng lạnh chậm và đơng lạnh nhanh. ðơng lạnh chậm là phương pháp mà ở đĩ quá trình làm mất nước nội bào và việc hạ nhiệt độ cĩ kiểm sốt xảy ra chậm trước khi phơi được chuyển Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 23 vào bảo quản trong nitơ lỏng. ðối với phương pháp đơng lạnh chậm, phơi được chuyển vào mơi trường cĩ chứa chất bảo vệ lạnh theo nhiều bước với nồng độ chất bảo vệ lạnh tăng dần hay chuyển thẳng vào mơi trường đơng lạnh cĩ nồng độ chất bảo vệ lạnh thích hợp. Thời gian cân bằng trong phương pháp này thường 10-30 phút. Sau khi cân bằng phơi được đơng lạnh với tốc độ hạ nhiệt 0,3oC/phút xuống nhiệt độ -32oC hay -35oC và từ nhiệt độ này phơi được chuyển thẳng vào nitơ lỏng (-196oC). Ví dụ chuyển phơi vào dung dịch glycerol 6 bước với nồng độ tăng dần 0,25M; 0,5M; 0,75M; 1M; 1,25M và 1,5M hay 3 bước 0,47M; 0,93M; 1,4M glycerol và thời gian cân bằng ở mỗi bước khoảng 5 phút hay 1 bước vào dung dịch 1,8 ethylene glycol và cân bằng 15 phút. Sau đĩ cọng rạ chứa phơi được chuyển thẳng vào máy đơng lạnh và việc tạo đá được thực hiện ở nhiệt độ -3oC đến -7oC. Tạo mầm tinh thể nước (seeding) là thuật ngữ được để mơ tả việc hình thành tinh thể đá cĩ kiểm sốt ở nhiệt độ lạnh, bằng cách chạm panh đã được nhúng trước vào nitơ lỏng vào thành của cọng rạ. Ngay sau khi tạo mầm tinh thể đá, đá sẽ được hình thành nhanh chĩng trong tồn bộ cọng rạ chứa phơi và việc hạ nhiệt độ vẫn được thực hiện với tốc độ 0,3oC/phút xuống - 35oC, từ nhiệt độ này phơi được chuyển thẳng vào nitơ lỏng để bảo quản. ðơng lạnh nhanh là những phương pháp đơng lạnh mà thời gian từ lúc khử nước nội bào đến lúc kết thúc quá trình đơng lạnh xảy ra rất nhanh. Phơi sau khi đã được khử nước nội bào được chuyển thẳng vào nitơ lỏng mà khơng cần phải sử dụng máy đơng lạnh cĩ kiểm sốt nhiệt đã được lập trình sẵn. Trong gần 20 năm cuối thế kỷ XX, cùng với sự phát triển của cơng nghệ sinh học và cơng nghệ thơng tin đã gĩp phần hiện đại hố kỹ thuật đơng lạnh bằng chương trình hố các giai đoạn đơng lạnh, nhiều loại thiết bị tự động đã được chế tạo. Hiện nay cĩ nhiều loại máy đơng lạnh phơi trong đĩ cĩ hai loại được sử dụng phổ biến nhất là: Loại sử dụng rượu methanol đựng trong hộp làm lạnh và nối với hệ thống làm lạnh như Biocool của Mỹ. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 24 Loại làm lạnh bằng nitơ lỏng trong một hộp nối liền với bộ phận điều khiển máy vi tính như Freezer control của Úc. Các loại máy đều được cài đặt chương trình đơng lạnh khác nhau để phù hợp với phơi của từng loại động vật cĩ vú. Nguyen và cs (1984)[17] đã đề xuất một khả năng đơng lạnh nhanh hay siêu nhanh trên cơ sở thay thế việc mất nước tăng dần bởi nhiệt độ thấp bằng mất nước bộ phận nhanh ở nhiệt độ phịng. Dựa trên nguyên tắc này, một phương pháp đơng lạnh nhanh, đơn giản trong nitơ lỏng được thực hiện bằng cách làm mất nước một phần (1-2 phút) ở nhiệt độ phịng và cân bằng ở nhiệt độ -30oC đã được cơng bố. Một trong những phương pháp đơng lạnh nhanh được nghiên cứu rộng rãi hiện nay là phương pháp thuỷ tinh hố (vitrification). Thuỷ tinh hĩa là thuật ngữ chỉ quá trình đơng cứng mà khơng tạo thành tinh thể đá, khơng cĩ sự cơ đọng các chất hồ tan như trong các phương pháp đơng lạnh truyền thống, cĩ sự tăng đột ngột sự đặc quánh (viscovity) trong mơi trường lưu phơi, tạo nên chất rắn dạng thuỷ tinh. Ưu điểm của phương pháp này là thời gian đơng lạnh nhanh, khơng cần thiết bị đơng lạnh đắt tiền và điều quan trọng là tỷ lệ phơi sống sau đơng lạnh và giải đơng cao. 2.9.3 Giải đơng phơi Tế bào phơi đơng lạnh được bảo quản trong nitơ lỏng -196oC khi đem ra sử dụng tế bào phơi phải được phục hồi sự sống trong điều kiện bình thường ở trạng thái ban đầu cĩ nghĩa là khơng cĩ tinh thể nước đá, khơng cĩ chất bảo vệ lạnh ở trong và ngồi tế bào phơi; tế bào phơi tiếp tục sống và phát triển trong điều kiện mới. Nhìn chung tế bào phơi từ trạng thái sinh học bình thường chuyển sang trạng thái tiềm sinh học lạnh -196oC rồi lại trở về trạng thái sinh học bình thường của mơi trường, sức sống của tế bào phơi cĩ thể bị giảm đi rất nhiều, số tế bào phơi chết cĩ thể tăng lên. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 25 Về nguyên tắc, giải đơng phơi và tách chất bảo vệ lạnh sinh học phụ thuộc vào phương pháp đơng lạnh và bổ sung chất bảo vệ lạnh. Trong các quy trình pha lỗng chất bảo vệ lạnh thơng thường, phơi được tiếp xúc với nồng độ chất bảo vệ lạnh giảm dần. Quy trình này địi hỏi phải sử dụng kính hiển vi và thao tác trong phịng thí nghiệm. ðầu những năm 1980, một số tác giả đã nghiên cứu phương pháp giải đơng mới thay thế cho phương pháp giải đơng nhiều bước (Renard và cs (1987)[46]). Ở phương pháp này, phơi bị đơng lạnh-giải đơng được chuyển từ mơi trường cĩ chất bảo vệ lạnh sang mơi trường ưu trương các chất dinh dưỡng khơng thẩm thấu như sucrose. Khi quá trình này xảy ra, các chất bảo vệ lạnh nội bào thẩm thấu ra ngồi để duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu. Khi phơi khơng cịn chứa các chất bảo vệ lạnh nữa, nĩ co lại tới một thể tích do áp suất thẩm thấu của dung dịch sucrose và phơi nhanh chĩng được pha lỗng trong mơi trường đẳng trương. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 26 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU - Bị dùng để siêu âm hút trứng là bị lai hướng sữa (F1,F2), cĩ năng suất sữa cao trên 4000 lít/chu kỳ, thể trọng 400-450kg. - Tinh cọng rạ của bị đực HF sản xuất tại Trung tâm Tinh đơng lạnh Moncada cĩ hoạt lực > 40%, cĩ năng suất sữa trên 10.000 lít/chu kỳ. Loại tinh này đã được kiểm tra năng suất qua các đời. - Các loại máy mĩc thiết bị chuyên dụng. 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Thu tế bào trứng từ bị sữa cao sản với sự trợ giúp của máy siêu âm. - Tạo phơi bằng phương pháp thụ tinh ống nghiệm - ðơng lạnh phơi bằng phương pháp thuỷ tinh hố (Vitrification). 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Thu tế bào trứng từ bị sống bằng máy siêu âm Là phương pháp thu tế bào trứng từ con vật sống với sự trự giúp của máy siêu âm dùng trong các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản ở người. Những bị tốt đã được lựa chọn về mặt di truyền sẽ được sử dụng máy siêu âm hoặc khám qua trực tràng để xác định khả năng cho tế bào trứng, sau đĩ tiến hành thu tế bào trứng. Thu tế bào trứng với sự trợ giúp của máy siêu âm được tiến hành mỗi tuần một lần. Các bước tiến hành như sau: Con bị đưa vào khai thác được cố định vào giá, lấy hết phân, rửa sạch sau đĩ sát khuẩn âm hộ và khu vực xung quanh. Chuẩn bị hệ thống máy siêu âm, nối đầu dị âm đạo vào máy, nối kim hút tế bào trứng (kim 16G dài 55 cm), đặt máy tạo áp suất ở 120mmHg, tương đương dịng chảy 25ml/phút. Chuẩn bị mơi trường hút tế bào trứng (mDPBS) cĩ bổ sung 50 UI/ml heparin và 5% huyết thanh bê và kháng sinh (100.000UI Penicinllin/ml và 100µg Streptomycin/ml) duy trì ở 37oC bằng máy ổn nhiệt. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 27 Người thao tác một tay đưa vào trực tràng kiểm tra buồng trứng, xác định vị trí của buồng trứng, vị trí các nang trứng rồi đưa buồng trứng về phía đầu dị, quan sát nang trứng trên màn hình máy siêu âm, đến số nang trứng cĩ mặt trên buồng trứng. Trước khi hút dịch nang trứng, hút một ít dung dịch hút trứng để làm trơn hệ thống kim và ống dẫn, sau đĩ một tay ấn nhẹ kim chọc hút vào lịng nang trứng. Thao tác này diễn ra nhẹ nhàng, các hình ảnh kim hút chọc vào nang hiện rõ trên màn hình máy siêu âm giúp người thao tác điều chỉnh chính xác và nhịp nhàng kim hút. Sau khi chọc hút 2-4 nang trứng, rút kim ra, hút dung dịch thu tế bào trứng để tế bào trứng chảy vào ống falcon, tiến hành hút lập lại đến khi khơng cịn nhìn thấy nang trứng nào trên buồng trứng thì chuyển qua buồng trứng cịn lại. Dịch hút được thu vào ống ly tâm 50ml và duy trì ở nhiệt độ 37oC bằng máy ổn nhiệt. Sau khi hút xong một buồng trứng đưa ngay về phịng thí nghiệm, lọc bằng cốc lọc Emcon cĩ đường kính lỗ lọc 20µm, khoảng 10ml dung dịch cịn lại được chuyển vào đĩa petri vơ trùng cĩ đường kính 90mm để soi tìm tế bào trứng.Việc tìm và làm sạch tế bào trứng được thực hiện dưới kính hiển vi soi nổi. 3.3.2 ðánh giá phân loại tế bào trứng sau khi thu Tế bào trứng thu được được đánh giá phân loại theo phương pháp của Loos và cs (1989)[38]. Phương pháp này cho phép đánh giá nhanh chĩng chất lượng tế bào trứng thu được dựa trên đặc điểm hình thái của lớp tế bào Cumulus bao quanh tế bào trứng như sau: Loại A (loại trứng tốt): Các lớp Cumlus chặt chẽ; tế bào chất đồng nhất, khối tế bào trứng - Cumulus (COC) sáng và trong suốt. Loại B (loại tế bào trứng khá): Các lớp Cumulus chặt chẽ; tế bào chất đồng nhất, nhưng cĩ những vùng tối phía ngồi tế bào trứng; khối COC sáng ít và ít trong suốt. Loại C (tế bào trứng trung bình): Các lớp Cumulus ít chặt chẽ, trứng khơng đều cĩ các đám đen, khối COC tối hơn loại A và B ở trên. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 28 Loại D (tế bào trứng kém): Các lớp Cumulus giãn nở, tụ tập thành từng đám tối, trứng khơng đều với các đám tối, khối COC tối và khơng đều. Sau khi thu được, những tế bào trứng cĩ chất lượng phù hợp (loại A, B, C) được làm sạch trong mơi trường M-199 cĩ bổ sung 5% huyết thanh bê mới sinh (sigma; đã được xử lý ở nhiệt độ 56oC trong 30 phút) ít nhất 8 lần. Mơi trường này được vơ trùng bằng cách lọc qua màng lọc 0,22µm và cân bằng trong tủ ấm CO2 ít nhất 2 giờ trước khi dùng. 3.3.3 Nuơi tế bào trứng bị thành thục trong ống nghiệm Việc nuơi tế bào trứng bị thành thục trong ống nghiệm được tiến hành theo qui trình của Kajihara và cs (1999)[31] và một số tác giả khác như sau: Sau khi làm sạch 8 lần trong mơi trường M-199 cĩ bổ sung 5% huyết ._.ơi dâu) và 8,93% (phơi nang). Khurana và Niemann (2000)[33] đã sử dụng mơi trường M-199 cĩ bổ sung 20% huyết thanh bị động dục để làm mơi trường nuơi. Tỷ lệ phân chia của các tác giả này là 61,50%, tuy nhiên tỷ lệ phát triển đến giai đoạn phơi dâu, phơi nang là 26,70%. Khi so sánh tỷ lệ phân chia và tỷ lệ phát triển đến phơi dâu, phơi nang khi nuơi trong mơi trường CR1aa và TCM-199 chúng tơi thấy rằng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa về tỷ lệ phân chia cũng như phát triển đến giai đoạn phơi dâu, phơi nang. Tỷ lệ tế bào phân chia và phát triển đến giai đoạn phơi dâu, phơi nang khi nuơi trong mơi trường CR1aa cao hơn khi nuơi trong mơi trường TCM-199 (52,41% và 32,23% so với 49,78% và 24,44%). Kajihara và cs (1999)[31] đã nghiên cứu so sánh ảnh hưởng của mơi trường TCM-199 và mơi trường CR1aa đến sự phát triển của phơi trong ống nghiệm, các tác giả này đã nhận thấy rằng khơng cĩ sự khác biệt về tỷ lệ phân chia sau 48 giờ tuy nhiên tỷ lệ phơi dâu, phơi nang trong mơi trường CR1aa cao hơn so với mơi trường TCM-199. Từ các nghiên cứu trên của các tác giả, nhìn chung khơng cĩ sự khác biệt về tỷ lệ phân chia khi nuơi hợp tử trong mơi trường TCM-199 cĩ bổ sung thêm huyết thanh và mơi trường CR1aa, tuy nhiên sau 7 ngày nuơi cấy tỷ lệ hợp tử phát triển đến giai đoạn phơi dâu, phơi nang trong mơi trường CR1aa cao hơn trong mơi trường TCM-199. Ngồi ra trong qui trình thụ tinh ống nghiệm, sự phân chia và phát triển của hợp tử cịn chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố khác như chất lương đực giống, thời gian tiến hành thụ tinh, phương pháp xử lý tinh trùng… Tuỳ vào điều kiện cụ thể của phịng thí nghiệm, của thực tế mà lựa chọn các cách thức tiến hành thụ tinh nhằm mục đích cuối cùng là nâng cao tỷ lệ phát triển đến giai đoan phơi dâu, phơi nang. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 58 55,21 53,9 29,87 33,13 27,28 15,58 0 10 20 30 40 50 60 A B C Ch
t lng t bào trng Tỷ lệ hợ p tử ph ân ch ia , ph át tr iể n (% ) Hợp tử phân chia Hợp tử phát triển Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của chất lượng tế bào trứng đến sự phát triển của hợp tử 52,41 49,78 32,23 24,44 0 10 20 30 40 50 60 CR1aa TCM-199 Mơi tr ng nuơi c
y Tỷ lệ hợ p tử ph ân c hi a , ph át tr iể n (% ) Hợp tử phân chia Hợp tử phát triển Biểu đồ 4.5. Kết quả phát triển của hợp tử trong mơi trường nuơi cấy 4.5 ðƠNG LẠNH PHƠI TẠO RA TRONG ỐNG NGHIỆM 4.5.1 Chất lượng phơi trước đơng lạnh Chất lượng phơi cĩ ảnh hưởng rất lớn đến kết quả cấy phơi cũng như tỷ lệ cĩ chửa (đối với phơi cấy tươi) và khả năng sống sĩt của phơi sau đơng lạnh-giải đơng. Trên thực tế, số lượng phơi tạo ra được cấy ngay cho bị nhận là Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 59 rất thấp mà chủ yếu được đơng lạnh để phục vụ các nghiên cứu cơ bản cũng như bảo quản phơi. Chính vì vậy chất lượng phơi trước đơng lạnh rất quan trọng. Ở bất kỳ trạng thái phát triển nào của phơi sau khi đơng lạnh-giải đơng chất lượng phơi đều giảm đi rõ rệt. Vì vậy đánh giá và phân loại phơi là rất quan trọng, cần lựa chọn chính xác phơi cĩ chất lượng tốt để đơng lạnh. Do vậy sau khi thu hoạch phơi được đánh giá về chất lượng theo phương pháp của Lindner và Wright (1983)[37]. Phơi loại A: cĩ hình thái chuẩn phản ánh đúng giai đoạn phát triển, màng trong suốt trịn đẹp, khối phơi bào đậm, phân chia đều rõ. Các phơi bào liên kết với nhau chặt chẽ, khơng cĩ tế bào rời hay mảnh vụn bên ngồi. Phơi loại B: cĩ hình thái chuẩn, phản ánh đúng giai đoạn phát triển, màng trong suốt trịn đẹp nhưng khối phơi bào khơng đều, rõ nét như phơi loại A. Sự liên kết của phơi bào tương đối chặt, đơi khi cĩ mảnh vụn hay một số phơi bào rời. Phơi loại C: cĩ màu sắc phân bố khơng đều, các tế bào liên kết lỏng lẻo, nhiều tế bào rời, nhiều mảnh vụn xen kẽ hoặc tụ thành đám nhỏ. Kết quả phân loại phơi sau thu hoạch được trình bầy qua bảng 4.11 Bảng 4.11. Phân loại phơi sau thu hoạch Kết quả Chất lượng phơi Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Tổng số phơi 162 100 Phơi loại A 60 37,04 Phơi loại B 55 33,95 Phơi loại C 47 29,01 Phơi đủ tiêu chuẩn (A,B) 115 70,99 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 60 Qua bảng 4.11 cho thấy: trong trong số 162 phơi thu được cĩ 60 phơi loại A chiếm tỷ lệ 37,04%; 55 tế bào phơi loại B chiếm 33,95% cịn lại là 29,01% phơi loại C. Phơi loại A, B và C là những phơi cĩ khả năng cấy tươi nhưng để tỷ lệ phơi sống sau đơng lạnh-giải đơng cao chúng tơi chỉ sử dụng những phơi loại A và B. Tổng số phơi đủ tiêu chuẩn đơng lạnh là 115 đạt tỷ lệ 70,99%. Phơi loại C là phơi khơng đủ tiêu chuẩn để đơng lạnh. Như vậy trong 162 phơi cĩ 115 phơi dâu, phơi nang đủ tiêu chuẩn đơng lạnh. Kết quả đánh giá phơi trước đơng lạnh được trình bầy qua bảng 4.12 Trước đơng lạnh, tỷ lệ phơi loại A là 53,04%, tỷ lệ phơi loại B là 46,96%. Tỷ lệ phơi dâu được đơng lạnh là 57,39% trong khi đĩ tỷ lệ phơi nang là 42,61%. Tỷ lệ phơi loại A được đơng lạnh cao hơn phơi loại B và tỷ lệ phơi dâu đơng lạnh cĩ chiều hướng cao hơn phơi nang. Bảng 4.12. ðánh giá phân loại phơi trước đơng lạnh Chất lượng phơi Phơi loại A Phơi loại B Loại phơi Số lượng (n) Tỷ lệ (%) n % n % Phơi dâu 66 57,39 40 60,60 26 39,40 Phơi nang sớm 49 42,61 21 42,86 28 57,14 Tổng số 115 100 61 53,04 54 46,96 Sự khác nhau về sự sống của trạng thái phát triển cĩ liên quan đến sự khác nhau về kích thước tế bào trong quá trình phát triển, đến sự biến đổi về tính thẩm thấu của màng tế bào, đến sự thay đổi tính thẩm thấu này với nhiệt độ. Phơi nang 6-8 ngày tuổi cĩ màng trong suốt cĩ sức kháng cơ học với biến đổi nhiệt độ tốt hơn và hạn chế tổn hại hơn. Polge và cs (1974)[43] cho rằng ở bị phơi nang sớm nên chọn để đơng lạnh và giải đơng; phơi nang giãn nở cĩ khả năng nhạy cảm hơn phơi dâu muộn và phơi nang sớm vì tầm Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 61 vĩc của phơi mầm phơi và xoang phơi phát triển hơn (Willadsen (1980)[54]). Tuy nhiên sức kháng cơ học khi xoang phơi lớn sẽ kém hơn với biến đổi nhiệt độ và tỷ lệ tế bào sống sau đơng lạnh-giải đơng cao nên khả năng hồi phục tốt hơn. Cũng theo nghiên cứu của nhiều tác giả thấy rằng chọn phơi dâu và phơi nang để đơng lạnh là thích hợp nhất vì phơi dâu và phơi nang cĩ màng trong suốt cĩ sức kháng cơ học tốt trong quá trình biến đổi nhiệt độ và ít tổn hại, ít ảnh hưởng tới chất lượng phơi. Do vậy trong thực tế nên sử dụng phơi dâu và phơi nang sớm để đơng lạnh. 4.5.2 Chất lượng phơi sau giải đơng Phơi sau khi đơng lạnh được bảo quản trong Nitơ lỏng (-196oC). Lúc này tế bào phơi đang ở trạng thái tiềm sinh lạnh. Chúng tơi sử dụng phương pháp để đơng lạnh phơi bị là: ðơng lạnh theo phương pháp thuỷ tinh hố Sau khi bảo quản trong Nitơ lỏng khoảng 1 tuần, chúng tơi giải đơng để đánh giá chất lượng phơi sau đơng lạnh-giải đơng. Quá trình giải đơng được tiến hành theo qui trình ngược với quá trình đơng lạnh. Sau quá trình đơng lạnh-giải đơng, dưới tác động của các chất bảo vệ lạnh, mơi trường đơng lạnh- giải đơng, nhiệt độ đã cĩ ảnh hưởng tới chất lượng phơi. Chất lượng phơi sau đơng lạnh-giải đơng được trình bày qua bảng 4.13. Sau quá trình đơng lạnh và giải đơng: tỷ lệ phơi loại A từ 53,04% trước đơng lạnh chỉ cịn 43,48%, tỷ lệ phơi loại B trước đơng lạnh là 46,96% giảm xuống chỉ cịn lại là 34,78% và xuất hiện 21,74% phơi loại C (đây là phơi kém chất lượng hoặc chết). Như vậy dưới tác động của quá trình đơng lạnh-giải đơng đã cĩ ảnh hưởng tới chất lượng phơi, cĩ một số phơi loại A chuyển thành loại B hoặc C, đồng thời một số phơi loại B chuyển thành phơi loại C. Tỷ lệ phơi loại A thu được vẫn cao nhất do vậy việc sử dụng phơi loại A để đơng lạnh sẽ thu được phơi sau giải đơng cĩ chất lượng bảo đảm. Tỷ lệ phơi sống sau đơng lạnh-giải đơng trong thí nghiệm của chúng tơi là 78,26%. Kết quả của chúng tơi khơng sai khác nhiều với một số tác giả đã cơng bố. Theo kết quả nghiên cứu của Miyamoto, Ishibashi (1987)[39] tỷ lệ phơi sống sau giải đơng là 80%. Theo Trounson và cs (1982)[51] thì tỷ lệ sống sau giải đơng Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 62 là 84,40%. Theo Leibo (1982)[36], Renard và cs (1982)[45] cho biết tỷ lệ phơi sống sau giải đơng đạt trên 80%. Theo kết quả nghiên cứu của Miyamoto, Ishibashi (1987)[39] tỷ lệ phơi sống sau giải đơng là 80%. Bảng 4.13. Chất lượng phơi sau đơng lạnh-giải đơng Chất lượng phơi Loại A Loại B Loại C Phơi sống sau đơng lạnh - giải đơng (A,B) Loại phơi Số lượng n % n % n % n % Phơi dâu 66 31 46,97 19 28,79 16 24,24 50 75,75a±0,57 Phơi nang sớm 49 19 38,78 21 42,86 9 18,36 40 81,64b ±1,26 Tổng số 115 50 43,48 40 34,78 25 21,74 90 78,26± 1,75 Những chữ cái cùng cột khác nhau, các giá trị sai khác cĩ ý nghĩa ở mức p <0,05 Qua bảng 4.13 chúng tơi cũng nhận thấy rằng: sau đơng lạnh-giải đơng tỷ lệ phơi dâu sống (A,B) đạt tỷ lệ 75,75% trong khi đĩ tỷ lệ phơi nang sớm sống sau giải đơng là 81,64% và sự khác biệt này là cĩ ý nghĩa (P<0.05). Như vậy khi sử dụng phơi nang để đơng lạnh sẽ cho tỷ lệ phơi sống sau đơng lạnh-giải đơng cao hơn khi sử dụng phơi dâu. Theo Trounson và cs (1982)[51] thì tỷ lệ phơi sống sau giải đơng là 84,40% ; cịn theo Chupin và Procureur (1982)[22] tỷ lệ phơi sống sau giải đơng là 90% và tỷ lệ phơi nang sống sau giải đơng là 96,10%. Theo Sang Runzi và cs (1996)[48], tỷ lệ phơi sống sau giải đơng đạt 76,20%, trong đĩ tỷ lệ phơi nang sống đạt 81,80% cịn phơi dâu là 77,40%; phơi loại A đạt tỷ lệ sống 91%, phơi loại B đạt tỷ lệ sống 63,30%. Cĩ nhiều ý kiến khác nhau về sự ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của phơi đến tỷ lệ sống sau giải đơng. Những nghiên cứu trên phơi chuột từ 16 tế bào cho đến phơi nang đơng lạnh ở -196oC của Whittingham (1972)[53] Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 63 và Willadsen (1980)[54] đã làm cơ sở ban đầu để nghiên cứu ứng dụng ở các lồi gia súc khác. Niemann và Nienhaus (1982)[41] nhận thấy rằng kỹ thuật đơng lạnh nhanh thì kết quả phơi ở 8 ngày tuổi tốt hơn so với phơi ở 7 ngày tuổi. Seidel và cs (1983)[50] cũng nhận xét rằng tỷ lệ sống của phơi nang cao hơn của phơi dâu. Sang Runzi và cs (1996)[48] cho rằng sử dụng phơi dâu và phơi nang để đơng lạnh thì tỷ lệ sống sau đơng lạnh-giải đơng là như nhau. 4.5.3 Sự phát triển của phơi sau đơng lạnh-giải đơng ðể đánh giá sự phát triển của phơi sau khi giải đơng, phơi được chuyển vào mơi trường nuơi cấy và giữ trong tủ nuơi. Sau 3 giờ đánh giá sự hồi phục của phơi sau giải đơng: dùng kính hiển vi soi nổi đánh giá dựa vào trạng thái của khối tế bào phơi. Nếu khối tế bào phơi giãn ra, sáng đều thì phơi cịn sống, nếu khối tế bào phơi co nhỏ lại thì phơi đã chết. Sau 48 giờ đánh giá sự phát triển của phơi sau giải đơng: nếu phơi tiếp tục phát triển ta quan sát được phơi ở giai đoạn thốt màng dưới kính hiển vi soi nổi, nếu phơi giữ nguyên trạng thái trước đơng lạnh tức là phơi chết hoặc thối hố. Sự phát triển của phơi sau giải đơng được trình bày qua bảng 4.14. Sau khi tiến hành nuơi cấy, sau 3 giờ cĩ 64 phơi phát triển đạt tỷ lệ 71,11% và sau 48 giờ nuơi cấy cĩ 58 phơi phát triển đến giai đoạn thốt màng đạt tỷ lệ 64,44%. Bảng 4.14 Sự phát triển của phơi sau đơng lạnh-giải đơng Kết quả Chỉ tiêu Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Phơi sau giải đơng đưa vào nuơi cấy 90 100 Phơi phát triển 64 71,11 Phơi thốt màng 58 64,44 Kết quả trên của chúng tơi khơng sai khác nhiều so với kết quả của một số tác giả đã báo cáo. Theo Lazar và cs (2000)[34] đã thơng báo, đơng lạnh Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 64 phơi bị tạo ra trong ống nghiệm bằng phương pháp thuỷ tinh hố, tỷ lệ phơi phát triển đến giai đoạn thốt màng là 69,20%. Phương pháp đơng lạnh thuỷ tinh hố là phương pháp đơng lạnh mới được nghiên cứu trong những năm gần đây song kết quả cũng tương đương các phương pháp đơng lạnh ba bước và một bước. Theo Lưu Cơng Khánh và cs (2003)[5], khi đơng lạnh phơi bị in-vivo với 10% Glycerol tỷ lệ phơi sống sau giải đơng là 80,95%. Hasler và cs (1997)[29] đơng lạnh phơi bị tạo ra trong ống nghiệm với chất bảo vệ lạnh là 10% Glycerol trong mơi trường PBS, sau giải đơng và nuơi cấy in-vitro 24 giờ cĩ 78,80% số phơi hồi phục và phát triển trong đĩ cĩ 69,20% phơi thốt màng. Khi tác giả này sử dụng 1,5M Ethylen glycol trong mơi trường PBS để đơng lạnh phơi bị tạo ra trong ống nghiệm thì tỷ lệ phơi thốt màng là 62,40% thấp hơn khi sử dụng 10% Glycerol. Phương pháp đơng lạnh thuỷ tinh hố cĩ ưu điểm thời gian đơng lạnh- giải đơng nhanh, khơng cần thiết bị đắt tiền dễ thực hiện tại cơ sở đồng thời địi hỏi trình độ kỹ thuật cao và điều quan trọng là tỷ lệ phơi sống sau đơng lạnh giải đơng cao. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 65 Hình 4.9. Phơi dâu loại A Hình 4.10. Phơi dâu loại B Hình 4.11. Phơi nang loại A Hình 4.12. Phơi nang loại B Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 66 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 5.1.1 Kết quả thu tế bào trứng bị bằng phương pháp siêu âm hút trứng - Sử dụng phương pháp siêu âm hút trứng, tế bào trứng thu được /buồng trứng là 3,8, tỷ lệ thu tế bào trứng đạt 71,20%. 5.1.2 Kết quả nuơi tế bào trứng thành thục trong ống nghiệm - Tỷ lệ tế bào trứng bị thành thục đạt 71,63%. - Tế bào trứng cĩ chất lượng tốt cĩ ảnh hưởng tích cực đến kết quả nuơi thành thục, tỷ lệ thành thục cao nhất khi sử dụng tế bào trứng loại A và B (77,59% và 76,67%). 5.1.3 Kết quả thụ tinh và nuơi hợp tử trong ống nghiệm - Tỷ lệ thụ tinh đạt 50,70%. - Tế bào trứng cĩ chất lượng tốt cĩ ảnh hưởng tích cực đến tỷ lệ thụ tinh cũng như sự phát triển của hợp tử trong ống nghiệm. Tỷ lệ thụ tinh đạt cao nhất khi sử dụng tế bào loại A và B. Sự phát triển của hợp tử đạt tỷ lệ cao nhất khi sử dụng tế bào trứng loại A - Nuơi hợp tử ở mật độ 20 và 25 tế bào/giọt nuơi cho tỷ lệ phân chia và phát triển đến giai đoạn phơi dâu và phơi nang cao hơn khi nuơi ở mật độ 15 và 30 tế bào/giọt nuơi. - Khi nuơi hợp tử trong 2 mơi trường TCM 199 và CR1aa: tỷ lệ hợp tử phân chia và phát triển đến đến giai đoạn phơi dâu, phơi nang trong mơi trường CR1aa tốt hơn khi nuơi trong mơi trường TCM 199. 5.1.4 ðơng lạnh phơi bị ðơng lạnh phơi bằng phương pháp thuỷ tinh hố cho kết quả phơi sống sau đơng lạnh-giải đơng cũng như phát triển đến giai đoạn thốt màng cao tương ứng đạt 78,26% và 64,44%. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 67 5.2 ðỀ NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu thu tế bào trứng bằng phương pháp siêu âm hút trứng và đưa một số kiến thức vào chương trình giảng dạy - Sử dụng các phơi tạo ra từ trứng thu bằng phương pháp siêu âm hút trứng trong chăn nuơi bị sữa ở nước ta Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Trần Tiến Dũng, Dương ðình Long, Nguyễn Văn Thanh (2002), Giáo trình Sinh lý Sinh sản gia súc, NXB Nơng Nghiệp 2. Nguyễn Hữu ðức, Nguyễn Thị Ước, Bùi Xuân Nguyên (1996),Trạng thái phát triển nhân tế bào trứng thu từ buồng trứng của bị nội Việt Nam, Kỷ yếu Viện cơng nghệ sinh học. 3. Nguyễn Hữu ðức, Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Quảng Xuân Hữu, Nguyễn Trung Thành, Bùi Linh Chi, Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Thuỳ Anh, Nguyễn Việt Liên, Bùi Xuân Nguyên (2003), Kết quả thụ tinh ống nghiệm và cấy phơi ở bị lai Sind, Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 699-702 4. Nguyễn Hữu ðức (2004), Nghiên cứu nuơi thành thục và thụ tinh ống nghiệm trứng bị nội tại Việt Nam, Luận án tiến sĩ Nơng nghiệp, 5. Lưu Cơng Khánh, Nguyễn Văn Lý, Nguyễn Thị Thoa, Phan Lê Sơn, ðặng Vũ Hồ, Chu Thị Yến, Nguyễn Thị Kim Anh, Hồng Kim Giao (2003), Nghiên cứu ứng dụng đơng lạnh phơi bị bằng glycerol trong cơng nghệ cấy truyền phơi, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội : 720-722 6. Nguyễn Văn Lý, Hồng Kim Giao, Lưu Cơng Khánh, Nguyễn Thị Thoa, Phan Lê Sơn, ðặng Văn Hồ, Chu Thị Yến (2003), Thu thập và nuơi cấy tế bào trứng bị In-vitro, Tạp chí Nơng nghiệp và Phát triển Nơng thơn 7. Nguyễn Văn Lý (2006), Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thụ tinh ống nghiệm trứng bị ở Việt Nam. Luận án tiến sĩ Nơng nghiệp 8. Bùi Xuân Nguyên, Nguyễn Hữu ðức, Lê Văn Ty, Nguyễn Thị Ước (1994), Kết quả bước đầu nghiên cứu nuơi trứng và thụ tinh in vitro trâu bị, Kỷ yếu Viện Cơng nghệ sinh học 1994, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội: 166-168 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 69 9. Nguyễn Thị Ước (1996), Nghiên cứu gây rụng trứng nhiều và gây động rụng đồng pha trong cấy phơi trâu bị, Luận án phĩ tiến sỹ khoa học nơng nghiệp, 5-40 10. Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Nguyễn Hữu ðức, Bùi Linh Chi, Hồng Nghĩa Sơn, Bùi Xuân Nguyên (1999), Sản xuất phơi bị bằng thụ tinh ống nghiệm, Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc, NXB khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 934-936 11. Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Nguyễn Hữu ðức, Bùi Linh Chi, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Việt Linh, Nguyễn Văn Hạnh, Quảng Xuân Hữu, Nguyễn Thuỳ Anh, Hồng Nghĩa Sơn, Dương ðình Long, Bùi Xuân Nguyên (2003), Nghiên cứu sản xuất giống bị sữa thương phẩm bằng cấy phơi thụ tinh ống nghiệm và xác định giới tính, Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc, NXB khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 717-719 TÀI LIỆU THAM KHẢO NƯỚC NGỒI 12. Ali.A., BilodeauuJ.F., Sirard M.A., (2003), “Antioxidant requirements for bovine oocytes varies during in vitro maturation, fertilization and development”, Theriogenology 59 pp. 939-949 13. Austin, C.R. (1951), “Observations on the penetration of the sperm into the mammalian egg”, Australian Journal of Scientific Resreach 4, pp. 581-596 14. Avery,B., Strobech,L., Jacobsen,T., Bogh,I.B. and Greve, T. (2003), “Invitro maturation of bovine cumulus-oocyte complexes in undiluted follicular fluid: effect on nuclear maturation, pronucleus formation and embryo development”, Theriogenology 59, pp. 987-999 15. Beker A.R.C.L., Colenbrander B., Bevers M.M.(2002), “Effect of 17β- Estradiol on the in vitro maturation of bovine oocytes”, Theriogenology 58, pp. 1666-1673 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 70 16. Bols, P.E.J.. Leroy, J.L.M.R., Vanholder, T. and Van Som, A (2004), “A comparison of a chemical sector and linear array transducer for ultrasound-guided transvaginal oocyte retrieval (OPU) in cow”, Theriogenology 62, pp. 906-914 17. Bui Xuan Nguyen., Heyman, Y. and Renard, J. P (1984), “Direct freezing of cattle embryos after partial dehydration at room temperature”, Theriogenology 22, pp. 389-399 18. Bui Xuan Nguyen (1997), “Long term gamete and embryo preservation based on the asscociate treatments of partial dehydration and freezing. Proceeding of International Worshop on Ultra-long- term cryogenic preservation network of biological and environmental specimens”, Senri Life Science Center, Osaka, Japan: 192-198 19. Brackett, R.G., Bousquet, D., Boice, M.L., Donawick, W.J., Evans, J.F. and Drassel, M.A.(1982), “Normal development follwing in vitro fertilization in the cow”, Biology of Reproduction 27, pp. 147-158 20. Callesen H., Greev T.nad Hyttel.P.(1987), “Premature ovulation in superovulation cattle”, Theriogenology 28, pp. 155-156 21. Chang, M.C.(1951), “Fertilising capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tube”, Nature 168, pp. 697-698. 22. Chupin D and Procureur R.,(1982), “La Stimulation des I' ovaire pour produire embryos chez les bovins. In: transplantation embryonaire ". Ed. Par I' Insttut Technique de l' elevage bovin, compte rendu des journees d' information . ITEB-UNCWIA : 75-85 23. De Roover, R., Genicot, G., Leonard, S., Bols, P. and Dessy, F. (2005),. Ovum pick up and in vitro embryo production in cows superstimulated with an individually adapted superstimulation protocol. Animal Reproduction Science 86: 13 – 25 24. Fuhrer. F., Mayr.B., Schelader,K., M and schlega.W. (1989), “Maturation conpetence and chromatin behavior in growthing and full grow cattle oocytes”, Jounal of veterrinary 36 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 71 25. Fukui Y., Fukushima M. and Ono H.(1983), “Fertilization in vitro of bovine oocytes after various sperm procedures”, Theriogenology 20, pp. 651-660 26. Furuya, S., Endo, Y., Oda, M., Matsui, Y., Nozawa, S. and Suzuki, S.(1992), “Protein phosphorlation regulates the mouse sperm acrosome reaction induced by the zona pellucia”, Journal of Assisted Reproduction and Genetics 9, pp. 384-390 27. Galli C., Crotti G., Notari C., Turini P., Duchi R., Lazzani G.,(2001), “Embryo production by Ovum Pick Up from live donors”, Theriogenology 55, pp. 1341-1357 28. Gomez E., Diez C.(2000), “Effects of glucose and protein sources on bovine embryo development in vitro”, Anim. Reprod. Sci 58, pp. 23-37 29. Hasler J.F., Hurtgen, P.J., Jin. Z.Q. and Stokes, J,E., (1997), “Survival of IVF – derived bovine embryos frozen in glycerol or ethylene glycol”, Theriogenology 48, pp. 563-579 30. Holm P., Booth P.J., Schmidt M.H., Greve T., Callesen H.(1999), “High bovine blastocyst development in a static in vitro production system using SOFaa medium supplemented with sodium citrate and myo-inositol with or without serum-proteins”, Theriogenology 52, pp. 683-700 31. Kajihara Y.,Roses G.,Lago I., Calvo J., Fila D. and Crispo M.(1999), “Influence of culture medium on the development of bovine blastocysts”, Theriogenology, Vol 51, No.1, pp. 239 32. Katska, L. (1984), “Comparison of two methods for recovery of ovarian oocytes from slaughter cattle”, Animal Reproduction Scien 7 , pp. 461-463 33. Khurana. N. K., Niemann. H. (2000), “Effects of oocyte quality, oxygen tension, embryo density, cumulus cells and energy substrates on cleavage and morula/blastocyst formation of bovine embryos”, Theriogenology 54, pp. 741 - 756 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 72 34. Lazar L,J., Spak and V.David. (2000), “The vitrification of in vitro fertilized cow blastocysts by the open pulled straw method” Therigenology 54,pp. 571-578 35. Leibfried-Rutledge M.L., Critser E.SS., Eyestone W.H., Northey D.L and First N.L.(1986), “Development potential of bovine oocytes matured in vitro”, Congress proceeding, p. 342 36. Leibo S.P.,(1982), “A one - step method for direct nonsurgical transfer of frozen - thawed bovine embryos”, Theriogenology 21, pp. 767 37. Lindner G,M. and Wright R,W.,(1983), “Bovine embryo morphology and evaluatio, Theriogenology 20, pp. 407-416 38. Loos, de F., Van Vliet,C., van Maurik, P. and Kruip, T.A.M. (1989), “Morphology of immature bovine oocytes”, Gamete Research 24, pp. 197-204 39. Miyamoto.H., Ishibashi.T., (1987), “Protective action of glyceroles against freezing damage of mouse and embryos”, Journal of reproduction and fertility 54, pp. 427-432 40. Newton C.R., Hansen P.J., and Low B.G.(1988), “Characterization of a high molecular weight Glycoprotein secreted the pre-implantation bovine conceptus”, Biology of Reproduction 39, pp. 553-560 41. Niemann H. and Nienhaus P.(1982), “Comparison of survial rate of day 7 and 8 bovine blastocysts after fast freezing and thawing” Theriogenology 18, pp. 445-452 42. Pieterse MC., Kappen KA., Kruip ThAM., Taverne MAM.(1988), “Aspiration of bovine oocytes during transvagial ultrasound scanning of the ovaries”, Theriogenology 30, pp. 751-761 43. Polge C., Wilmut I. and Rowson L.E.A (1974), “The low temperature preservation of cow, sheep and pig embryos”, Cryobiology 11, pp. 560 44. Reis , A., Steines, M.E., Watt, R.G., Dolman, D.F., McEvoy, T.G. (2002), Embryo production using defined oocyte maturation and zygote culture media following repeated ovum pick-up (OPU) from FSH-stimulated Simmental heifers. Animal Reproduction Science 72: 137-151. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 73 45. Renard, J.P., Ozil. P. and Heyman.Y (1982), “Crevical trans-fer of deep frozen cattle embryos”, Theriogenology 15. pp. 311-320 46. Renard, J.P., Menez O.Y., saumande J. and Heyman Y.(1987), “Attempts to predict the viability of cattle embryos produced by superovulation” In: control of reprod in the cow, Galmay, XX. Ed, pp. 398-417. 47. Rizos, D., Burke, L., Duffy, P., Wade, M., Mee, J.F., O'Farrell, K.J., MarSiurtain, M., Boland, M.P. and Lonergan, P. (2005), Comparisons between nulliparous heifers and cows as oocyte donors for embryo production in vitrro. Theriogenology 63: 939-949. 48. Sang Runzi , Li Janguo, Wang Fengming, Zhao Yingjie, Lui Sujuan (1996), “Studies on improving survial and pregnancy rate of frozen bovine embryos”, 2nd Asian symposium on animal biotechnology, November, pp. 11-14 49. Shioya Y., Kuwayama m., Fukushima M., Iwasaki S. and Hanada A (1988), “In vivo fertilization and cleavage capability of bovine follicular oocytes classified by cumulus cells and matured in vitro” Theriogenology, Vol.13, No 3, pp. 489-496 50. Seidel G.E. (1983), “Field trains with cryopreserved bovine embryos” In: Beier H.M., Linder HR: Fertilization of the human egg vitro, pp. 343-352 51. Trouson ,A.O., Woods,E. and leeton, J. (1982), “Freezing of embryos .An ethicl obligation”, Med.J, Aust 2, pp. 332-333 52. Viana, J.H.M., Camargo, L.S.A., Ferreira, A.M., de Sa., W.F., Fernandes, C.A.C., Junior, A.P.M. (2004), Short intervals between ultrasonographically guided follicle aspiration improve oocyte quality but do not prevent establishment of dominant follicles in the Gir breed (Bos indicus) of cattle. Animal Reproduction Science 84: 1-12. 53. Whittingham,D.G., Leibo. S.P. and Mazur.P. (1972), “Survival of mouse embryos frozen to -196o C and -269o C”, Science 178, pp. 411 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 74 54. Willadsen S.M. (1980), “The viability of early clevage containing the normal number of blastomeres in the sheep”, J. Reprod.Fert. Vo 59, pp. 357-362 55. Willet E.L., Black W.G., Casida L.E, Stone W.M and Buckner P.J. (1951), “Successful transplantion of a fertilied bovine oum” 56. Wilmut.I. and Rowson.L.E.A. (1973), “Experiments on the low- temperature preservation of cow embryos”, Vet. Rec. 92, pp. 686 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 75 PHỤ LỤC Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 76 MƠI TRƯỜNG 1. CHUẨN BỊ MƠI TRƯỜNG DPBS Pha mơi trường PBS(-) NaCl KCL Na2HPO4 KH2PO4 Nước cất 8,0g 0,2g 1,15g 0,2g 700ml Pha mơi trường PBS(+) CaCl2 MgCl2.6H2O Nước cất khử ion 0,1g 0.1g 200ml Sau khi đã chuẩn bị xong, rĩt từ từ mơi trường PBS (+) vào mơi trường PBS (-) để tránh kết tủa. Sau đĩ bổ sung thêm 100ml nước cất khử ion để đủ 1000ml. Sau đĩ bổ sung thêm 1,0g glucose và 0,036g Natri pyruvate được mDBPS. Sau đĩ lọc seize và bảo quản trong tủ lạnh. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 77 2. CHUẨN BỊ MƠI TRƯỜNG BO 2.1.Chuẩn bị mơi trường BO gốc (BO= Brackett and Oliphan) Dung dịch A NaCl KCl CaCl2.2H2O NaH2PO4.2H2O MgCl2.6H2O Phenol Red (dung dich 0,5%) Nứơc khử ion 4,3092g 0,1974g 0,2171g 0,0840g 0,0697g 0,1ml Thêm đủ 500ml Dung dịch B NaHCO3 Phenol Red 0,5% Nước khử ion 2,5873g 0,04ml Thêm đủ 200ml Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 78 2.2.Chuẩn bị mơi trường BO Dung dịch A Na Pyruvate Penicilin Streptomycin Dung dịch B 76ml 0,01375g 10.000UI 10mg 24ml Sau khi chuẩn bị xong, lọc bằng microfilter 2.3. Chuẩn bị mơi trường hoạt hố tinh trùng Dung dịch BO Na Caffein benzoate Heparin (Novo-heparin: 5000UI/ml) 50ml 0,1942g 50µl 2.4.Chuẩn bị dung dịch rửa tế bào trứng Dung dịch BO BSA 2.5. Dung dịch thụ tinh ống nghiệm Dung dịch BO BSA 40ml 400mg 10ml 200mg Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 79 3. CHUẨN BỊ MƠI TRƯỜNG NUƠI PHƠI CR1aa Dung dịch A NaCl KCL Na pyruvate NaHCO3 Phenol Red 5% Nước cất khử ion Dung dịch B Hemicalcium lactate Nước cất khử ion Mơi trường CR1aa Dung dịch A Dung dịch B BMEEssential Amino Acids MEM Non Essential Amino Acids L-glutamic Acid (2mg/ml) BSA Penicillin-G Streptomycin Sulfate 6,7031g 0,231g 0,0440g 2,2011g 2ml Thêm đủ 760ml 0,5996g Thêm đủ 200ml 76ml 20ml 2ml 1ml 1ml 3mg/ml 10.000UI (100UI/ml) 10mg(100µg/ml) Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp………………. 80 4. DỤNG CỤ HỐ CHẤT - Các loại kính hiển vi soi nổi : Kính hiển vi thao tác Niko TE 300; kính hiển vi soi nổi Wild M3B; kính hiển vi soi nổi Leica MZ6; kính hiển vi soi nổi Olympus SD 30; kính hiển vi soi nổi Olympus CH30. - Tủ nuơi cấy CO2 - Buồng vơ trùng Labcaire - Cân phân tích Precisa - Máy li tâm Universal 32R - Bồn nước ổn nhiệt- Memer Waterbath - Máy ổn nhiệt Ht50 - Tủ sấy khơ SL Shel lab - Tủ sấy ẩm Sanyo Incubator - Tủ sấy áp suất Tomy autoclave SS - 325 - Máy đơng lạnh CL-2000 - Buồng đếm Thoma - Pippetteman các cỡ - Các loại đĩa petri - Pippete pasteur - Găng tay vơ trùng, bơm tiêm 5ml, kim tiêm 18G, Microfilter 0,22µm - Các loại hố chất chuyên dụng ._.