Nghiên cứu thu nhận Enzym α - Amylase từ trực khuẩn cỏ khô

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP. HOÀ CHÍ MINH ------------------------------------ NGUYEÃN THÒ HOAØNG HAÛI NGHIEÂN CÖÙU THU NHAÄN ENZYM α – AMYLASE TÖØ TRÖÏC KHUAÅN COÛ KHOÂ LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC Thaønh phoá Hoà Chí Minh – 2009 BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP. HOÀ CHÍ MINH ------------------------------------ NGUYEÃN THÒ HOAØNG HAÛI NGHIEÂN CÖÙU THU NHAÄN ENZYM α – AMYLASE TÖØ TRÖÏC KHUAÅN COÛ KHOÂ Chuyeân ngaønh: Vi sinh vaät hoïc Maõ soá: 60 42 40 LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC NGÖÔØI HÖÔÙNG DAÃN KHOA HOÏC: PGS.TS. LÖÔNG ÑÖÙC PHAÅM Thaønh phoá Hoà Chí Minh – 2009 MỞ ÑAÀU Vi sinh vaät trong töï nhieân raát ña daïng vaø phong phuù. Chuùng coù maët khaép nôi: trong ñaát, trong nöôùc, trong khoâng khí,… keå caû trong cô theå con ngöôøi. Ngoaøi taùc haïi do vi sinh vaät gaây ra nhö: gaây beänh cho thöïc vaät, ñoäng vaät vaø con ngöôøi; thì nguoàn lôïi maø chuùng mang laïi cho chuùng ta voâ cuøng to lôùn neáu ta hieåu, bieát vaø söû duïng chuùng hôïp lyù. Caùc chuûng vi sinh vaät noùi chung vaø vi khuaån Bacillus noùi rieâng ñaõ vaø ñang ñöôïc söû duïng raát phoå bieán trong caùc cheá phaåm sinh hoïc ñeå phuïc vuï cho caùc ngaønh saûn xuaát nhö: röôïu, bia, coâng nghieäp deät, thuoäc da, boå sung vaøo thöùc aên cho gia suùc ñeå deã tieâu hoaù, thöùc aên trong nuoâi troàng thuyû saûn, trong y hoïc vaø nghieân cöùu,… laø nhôø khaû naêng sinh caùc loaïi enzym thuyû phaân cuûa caùc chuûng vi sinh vaät naøy. Enzym laø nhöõng chaát xuùc taùc sinh hoïc, ngoaøi nhöõng tính chaát cuûa moät chaát xuùc taùc noù coøn coù nhöõng tính chaát öu vieät hôn nhö: coù hieäu suaát xuùc taùc raát cao ôû ñieàu kieän nhieät ñoä vaø aùp suaát bình thöôøng, coù tính ñaëc hieäu cao. Caùc tính chaát naøy vaãn ñöôïc baûo toàn khi taùch enzym ra khoûi heä thoáng soáng, hoaït ñoäng trong ñieàu kieän invitro. Vì vaäy, enzym ngaøy caøng ñöôïc söû duïng roäng raõi trong thöïc teá, vôùi quy moâ ngaøy caøng lôùn, daãn ñeán vieäc hình thaønh vaø phaùt trieån ngaønh coâng ngheä saûn xuaát enzym. Vieäc söû duïng enzym trong thöïc teá khoâng chæ coù yù nghóa veà kinh teá maø coøn giaûi quyeát nhieàu vaán ñeà xaõ hoäi, caùc vaán ñeà böùc xuùc veà moâi tröôøng. Tröôùc kia, enzym thöôøng ñöôïc thu nhaän töø teá baøo thöïc vaät hoaëc ñoäng vaät (chaúng haïn amylase ñöôïc laáy töø haït naûy maàm, protease töø nhöïa ñu ñuû, daï daøy,…). Tuy nhieân quaù trình sinh toång hôïp enzym ôû ñoäng vaät vaø thöïc vaät gaén lieàn vôùi söï trao ñoåi chaát vaø nhu caàu cuûa teá baøo. Ngoaøi ra, ngöôøi ta coøn phaûi phaù boû caùc toå chöùc teá baøo ñeå taùch chieát vaø thu nhaän enzym. Nhö vaäy, vieäc duøng teá baøo ñoäng vaät, thöïc vaät laøm nguoàn nguyeân lieäu ñeå thu nhaän enzym laø khaù haïn cheá, thieáu tính kinh teá vaø khoâng ñaùp öùng ñöôïc nhu caàu veà soá löôïng enzym caàn thieát cho saûn xuaát. Trong khi ñoù, ôû vi sinh vaät haàu nhö chöùa ñaày ñuû caùc loaïi enzym vaø vieäc söû duïng nguoàn enzym töø vi sinh vaät mang laïi lôïi ích lôùn hôn, cuï theå nhö nguoàn nguyeân lieäu duøng ñeå nuoâi caáy vi sinh vaät thöôøng reû tieàn hôn vì chuùng thöôøng laø pheá phuï phaåm coâng noâng nghieäp (nhö caùm, traáu, baõ mía, baõ khoai myø,…) hoaëc nguoàn nguyeân lieäu töï nhieân nhö daàu moû, khí ñoát,… Maët khaùc, ñieàu kieän nuoâi caáy deã daøng, vaø enzym coù hoaït tính cao hôn. Vì theá, khoaûng 50 naêm gaàn ñaây caùc cheá phaåm enzym töø vi sinh vaät ñaõ daàn thay theá caùc enzym coù nguoàn goác thöïc vaät, ñoäng vaät. Trong haøng loaït caùc loaïi enzym khaùc nhau thì amylase laø enzym phaân giaûi tinh boät taïo ñöôøng cho caùc sinh vaät. Töø nhöõng naêm ñaàu theá kyû 18 caùc nhaø khoa hoïc ñaõ baét ñaàu nghieân cöùu veà amylase vaø ñeán nay ñaõ bieát khaù roõ veà loaïi enzym naøy. Amylase ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong nhieàu lónh vöïc saûn xuaát nhö coâng nghieäp thöïc phaåm, coâng nghieäp deät,…Saûn xuaát amylase coâng nghieäp ñaõ ñöôïc chuù yù töø raát laâu vaø ngaøy caøng phaùt trieån ôû nhieàu nöôùc treân theá giôùi. Vieät Nam chuùng ta laø moät trong nhieàu nöôùc ñaõ vaø ñang coù raát nhieàu nghieân cöùu vaø öùng duïng enzym amylase, nhöng neàn coâng nghieäp saûn xuaát enzym ôû nöôùc ta chöa thaät söï phaùt trieån. Xuaát phaùt töø cô sôû treân chuùng toâi choïn ñeà taøi cho luaän vaên: “Nghieân cöùu thu nhaän enzym α-amylase töø tröïc khuaån coû khoâ”. Noäi dung cuûa ñeà taøi goàm moät soá vaán ñeà sau: 1. Phaân laäp vaø tuyeån choïn caùc chuûng vi khuaån coù khaû naêng sinh tröôûng vaø sinh enzim amylase coù hoaït tính maïnh töø ñaát vöôøn qua trung gian coû khoâ. 2. Nghieân cöùu hình thaùi teá baøo, hình thaùi khuaån laïc, vaø caùc ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng tuyeån choïn. 3. Khaûo saùt caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu ñeå thu ñöôïc dòch enzym amylase coù hoaït ñoä cao. 4. Ñònh danh chuûng ñöôïc tuyeån choïn baèng kyõ thuaät di truyeàn phaân töû. 5. Nuoâi caáy chuûng ñaõ tuyeån choïn trong thieát bò bình leân men tam giaùc 1 lít vôùi caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu. Nghieân cöùu ñoäng hoïc quaù trình sinh toång hôïp amylase vôùi 3 thoâng soá laø pH, sinh tröôûng vaø hoaït ñoä enzym. 6. Taùch chieát enzym amylase töø dòch leân men nhôø caùc taùc nhaân tuûa. 7. So saùnh hieäu suaát thu nhaän vaø hoaït ñoä cheá phaåm enzym (CPE) amylase thu ñöôïc töø caùc taùc nhaân tuûa khaùc nhau. 8. Nghieân cöùu ñoä beàn nhieät vaø ñoä beàn pH cuûa CPE amylase. Chương I: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 1.1. Giống vi khuaån Bacillus [5], [16], [38], [39] Bacillus laø vi khuaån Gram döông, hình que coù kích thöôùc khaùc nhau (0,5 – 2,5) ×(1,2 - 10) μm. Chuùng phaân boá roäng raõi trong töï nhieân, trong ñaát, nöôùc, khoâng khí. Laø vi khuaån dò döôõng hoaù naêng, thu naêng löôïng nhôø söï oxi hoaù caùc hôïp chaát höõu cô, coù chuøm tieân mao giuùp chuùng coù khaû naêng di ñoäng, soáng hieáu khí hoaëc hieáu khí tuyø tieän. Bacillus coù khaû naêng sinh baøo töû, baøo töû ñöôïc hình thaønh khi teá baøo ñaõ traûi qua giai ñoaïn phaùt trieån maïnh nhaát, hoaëc khi thieáu chaát dinh döôõng. Moãi teá baøo sinh döôõng sinh ra moät baøo töû. Khi baøo töû tröôûng thaønh, teá baøo sinh döôõng töï phaân giaûi giaûi phoùng baøo töû. Caùc teá baøo Bacillus ñaëc tröng laø sinh baøo töû maøø vaãn giöõ hình daùng tröïc khuaån khi mang baøo töû, trong moät soá tröôøng hôïp teá baøo vi khuaån chæ phình to moät ít khi chöùa baøo töû. Tuyø loaøi maø baøo töû coù theå naèm chính taâm, leäch taâm hay gaàn ñaàu teá baøo. Baøo töû coù khaû naêng chòu nhieät, tia töû ngoaïi, phoùng xaï vaø nhieàu ñoäc toá, vì vaäy chuùng coù khaû naêng giöõ ôû traïng thaùi baøo töû nhieàu naêm. Baøo töû khoâng phaûi cô quan sinh saûn maø laø moät traïng thaùi baûo veä noøi gioáng, noù ñöôïc taïo ra ñeå giuùp teá baøo chòu ñöôïc caùc ñieàu kieän baát lôïi cuûa moâi tröôøng. Ñoù laø daïng nghæ cuûa teá baøo. Baøo töû ôû daïng töï do khoâng coù quaù trình trao ñoåi chaát, khi gaëp ñieàu kieän thuaän lôïi moãi baøo töû cho ra moät teá baøo sinh döôõng. Ña soá Bacillus sinh tröôûng toát ôû pH = 7, moät soá phuø hôïp vôùi pH = 9 – 10 nhö Bacillus alcalophillus, hoaëc vôùi pH = 2 – 6 nhö Bacillus- acidocaldrius. Veà nhieät ñoä, coù nhieàu chuûng öa nhieät ñoä cao (450C – 750C), hoaëc öa laïnh (50C –250C), nhöng thöôøng gaëp Bacillus soáng ôû nhieät ñoä toái öu laø 340C – 370C. Haàu heát Bacillus khoâng gaây beänh cho ngöôøi vaø ñoäng vaät. Moät soá loaïi gaây beänh cho coân truøng nhö Bacillus thuringiensis, B. poplliae, B. lentimorbus, B. cereus, B. anthracis (trong ñoù B. cereus vaø B. anthracis coù theå gaây beänh cho ngöôøi)…ña soá coøn laïi trong töï nhieân laø coù ích. Bacillus coù khaû naêng sinh enzym ngoaïi baøo: α-amylase, protease kieàm, cellulase… vaø caùc enzym naøy ñöôïc öùng duïng raát nhieàu trong coâng nghieäp, baûo veä moâi tröôøng, noâng nghieäp… Sau ñaây laø moät soá loaøi Bacillus thöôøng gaëp trong töï nhieân 1.1.1 Bacillus subtilis Bacillus subtilis ñöôïc phaùt hieän vaø ñaët teân vaøo naêm 1872, noù phaân boá phoå bieán trong ñaát vaø ñaëc bieät laø ôû coû khoâ neân Bacillus subtilis ñöôïc goïi laø tröïc khuaån coû khoâ. Laø nhöõng vi khuaån hình que, ngaén, nhoû, kích thöôùc (3 -5) × 0,6 μm, nhieàu khi teá baøo noái laïi vôùi nhau thaønh chuoãi daøi ngaén khaùc nhau hoaëc teá baøo ñöùng rieâng reõ. Khuaån laïc khoâ, khoâng maøu hoaëc maøu xaùm nhaït, hôi nhaên hoaëc taïo ra lôùp maøng mòn lan treân beà maët thaïch, coù meùp nhaên baùm chaët vaøo moâi tröôøng thaïch. Nhieät ñoä thích hôïp cho Bacillus subtilis sinh tröôûng laø 300C – 500C, thöôøng nuoâi caáy ôû 370C. Baøo töû hình baàu duïc, kích thöôùc 0,6 – 0,9 μm, phaân boá leäch taâm, gaàn taâm nhöng khoâng chính taâm. Baøo töû coù theå soáng vaøi naêm ñeán vaøi chuïc naêm. Ñaõ coù nhöõng chöùng cöù veà vieäc duy trì söùc soáng baøo töû B. subtilis trong 200-300 naêm. Vi khuaån B. subtilis coù maøng nhaøy (giaùc maïc) giuùp vi khuaån coù khaû naêng chòu ñöôïc ñieàu kieän khaéc nghieät vì maøng nhaøy coù theå döï tröõ thöùc aên vaø baûo veä vi khuaån traùnh toån thöông khi khoâ haïn. Maøng nhaøy coù theå quan saùt ñöôïc khi nhuoäm tieâu baûn, qua kính hieån vi chuùng ta coù theå nhìn thaáy maøng nhaøy cuûa B. subtilis laø khoâng maøu, trong suoát, coøn teá baøo vi khuaån baét maøu naâu ñoû treân neàn tieâu baûn xanh hoaëc ñen. B. subtilis coù khaû naêng sinh ra moät soá enzym nhö: α-amylase, protease kieàm coù giaù trò cao, ñaëc bieät coù khaû naêng toång hôïp riboflavin (tieàn vitamin B2). Vì vaäy, B. subtilis ñöôïc öùng duïng khaù nhieàu trong caùc ngaønh coâng nghieäp. 1.1.2. Bacillus mesentericus Bacillus mesentericus coøn ñöôïc goïi laø tröïc khuaån khoai taây do chuùng coù maët chuû yeáu treân khoai taây. Chuùng gaàn gioáng Bacillus subtilis khuaån laïc aên saâu vaø baùm chaët vaøo moâi tröôøng thaïch, beà maët nhaên nhuùm, khoâ, khoâng moïc lan ra moâi tröôøng, maøu xaùm nhaït-traéng, hoaëc hôi vaøng naâu, hoaëc hoàng nhö Bacillus mensentericus ruber hoaëc ñen nhö Bacillus mensentericus niger . Bacillus mensentericus sinh tröôûng phaùt trieån toát nhaát ôû nhieät ñoä 36 – 450C, toái ña 50 – 550C, pH = 4,5 – 5 thì ngöøng phaùt trieån. Bacillus mensentericus coù hoaït tính amylase vaø protease lôùn hôn haún Bacillus subtilis, nhöng leân men ñöôøng laïi keùm hôn. Bacillus mensentericus vaø Bacillus subtilis raát phoå bieán trong töï nhieân, chuùng laây nhieãm laøm hö hoûng thöïc phaåm, nhaát laø caùc loaïi thöïc phaåm coù chöùa nitô vaø caùc saûn phaåm giaøu ñöôøng (baùnh keïo, hoa quaû). Ngoaøi ra, chuùng coøn sinh ra moät loaïi hôïp chaát coù hoaït tính khaùng moät soá vi khuaån khaùc goïi laø bacterioxin, ôû Bacillus subtilis goïi laø subtilin. 1.1.3. Bacillus cereus Vi khuaån naøy coù moái quan heä gaàn guõi vôùi Bacillus anthracis, B. mycoides, B. thuringiensis. Baøo töû cuûa chuùng hình baàu duïc, kích thöôùc 0,9 × (1,2 – 1,5) μm, naèm leäch taâm, phaùt taùn khaép nôi, trong ñaát, trong khoâng khí…Chuùng thöôøng sinh soâi naûy nôû treân thöïc phaåm nhö côm vaø coù theå sinh ra ñoäc toá laøm cho thöïc phaåm hö hoûng vaø gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm. Teá baøo cuûa B. cereus daøy, kích thöôùc (1 -1,5) × (3 – 5) μm coù khi daøi hôn, ñöùng rieâng reõ hoaëc xeáp thaønh chuoãi. Khuaån laïc cuûa B. cereus phaúng, hôi loõm, beà maët hôi xuø xì (daïng boät, hoaëc daïng haït nhoû) traéng ñuïc, meùp loài loõm. 1.1.4. Bacillus megaterium Megaterium coù nghóa laø “con thuù lôùn”, teá baøo cuûa noù khaù lôùn khoaûng gaáp hôn 2 laàn teá baøo cuûa Bacillus subtilis, kích thöôùc (1,2 – 1,5) × (3 – 12) μm. ÔÛ caùc oáng nuoâi giaø thì teá baøo ngaén hôn, troøn hôn, ñoâi khi hình thoi vôùi ñaàu heïp laïi. Teá baøo chöùa nhieàu haït nhoû vaø chaát döï tröõ (haït môõ, glycogen). Baøo töû lôùn, hình ovan hay baàu duïc, kích thöôùc 1,5 × (0,7 – 1) μm, chuùng naèm leäch taâm thöôøng theo chieàu ngang hoaëc chieàu xieân cuûa teá baøo. Khuaån laïc troøn ñeàu, loài nhaün nhöng thöôøng coù voøng vieàn quanh khuaån laïc hoaëc caùc voøng ñoàng taâm treân beà maët, khoâng thuyø, khoâng neáp, meùp troøn ñeàu hay löôïn soùng, maøu traéng söõa hay ñuïc, coù khi coù maøu naâu nhaït. Sinh tröôûng treân moâi tröôøng dinh döôõng ñôn giaûn khoâng caàn theâm baát kyø yeáu toá dinh döôõng naøo khaùc. 1.1.5. Bacillus pumilus Baøo töû phaùt taùn roäng, coù maët trong ñaát nhieàu hôn Bacillus subtilis. Khuaån laïc nhoû, xung quanh vieàn môø lan khoâng ranh giôùi. Teá baøo cuûa noù gaàn gioáng teá baøo B. subtilis. 1.1.6. Bacillus polymyxa Kích thöôùc teá baøo laø (0,6 – 1) × (2 – 7) μm, ñöùng rieâng reõ hoaëc xeáp thaønh ñoâi, chuoãi ngaén. Khi hình thaønh baøo töû teá baøo seõ phoàng leân hình quaû chanh. Baøo töû hình baàu duïc keùo daøi khoaûng (1,7 – 2,6 μm), treân beà maët caét ngang nhö hình sao, naèm giöõa teá baøo, chuùng phaùt taùn roäng. Khuaån laïc cuûa B. polymyxa voâ maøu, phaúng hoaëc loài, trôn, lan daàn ra xung quanh, meùp ñoâi khi coù thuyø. Chuùng thöôøng sinh tröôûng phaùt trieån treân thöïc vaät ñang bò hoûng. Vì vaäy, ngöôøi ta thöôøng phaân laäp chuùng töø thöïc phaåm. Chuùng laø nguoàn ñeå saûn xuaát khaùng sinh polymyxin. 1.1.7. Bacillus simplex Teá baøo B. simplex nhoû beù, coù kích thöôùc (2 – 5) × 0,6 μm, thöôøng ñöùng rieâng reõ khoâng gaén thaønh chuoãi. Baøo töû hình baàu duïc coù kích thöôùc 0,6 × 0,9 μm, naèm leäch taâm. Khuaån laïc cuûa B. simplex gioáng khuaån laïc B. cereus, chæ khaùc laø khuaån laïc cuûa B. simplex coù khaû naêng sinh saéc toá luïc nhaït, vaøng vaø tieát vaøo moâi tröôøng. 1.1.8. Bacillus brevis B. brevis laø tröïc khuaån coù kích thöôùc (0,7 – 1,0) × (3 – 5) μm, ñöùng rieâng reõ, ñoâi khi xeáp thaønh chuoãi. Baøo töû coù hình baàu duïc naèm cuoái teá baøo laøm cho teá baøo coù moät ñaàu hôi phoàng to. Khuaån laïc cuûa B. brevis maøu traéng, ñoâi khi coù maøu vaøng, loài hoaëc phaúng, laáp laùnh, meùp raêng cöa gioáng nhö daïng môõ ñaëc. 1.1.9. Bacillus aslersporus Teá baøo daøy (1,0–1,2) × (3 –7) μm, ñöùng rieâng reõ hoaëc xeáp thaønh ñoâi. Baøo töû hình truï hay hình keùo daøi, kích thöôùc 1,0 × (1,5–2) μm, naèm giöõa teá baøo. Khi hình thaønh baøo töû teá baøo phoàng leân moät chuùt troâng gioáng nhö daïng Clostridium. Khuaån laïc cuûa B. aslersporus nhoû, maøu traéng hay maøu luïc nhaït, phaúng, meàm, nhaøy, ñoàng chaát. 1.2. Khaùi quaùt chung veà enzym [1], [4], [15], [23], [49]. Sinh vaät ñöôïc xem nhö laø moät heä thoáng môû coù lieân quan chaët cheõ ñeán quaù trình trao ñoåi chaát trong teá baøo cuûa cô theå, vaø giöõa cô theå vôùi moâi tröôøng ngoaøi. Quaù trình trao ñoåi chaát cuûa sinh vaät laø bieåu hieän sinh ñoäng nhaát cuûa söï soáng. Khi cô theå khoâng coøn khaû naêng trao ñoåi chaát thì cô theå seõ cheát. Quaù trình trao ñoåi chaát lieân tuïc ñöôïc xaûy ra giöõa trong vaø ngoaøi teá baøo, taïo neân söï bieán ñoåi lieân tuïc cuûa vaät chaát trong thieân nhieân. Caùc phaûn öùng sinh hoïc xaûy ra thöôøng xuyeân khoâng chæ ôû trong teá baøo sinh vaät maø ôû caû ngoaøi moâi tröôøng bao quanh teá baøo. Caùc phaûn öùng sinh hoïc naøy ñöôïc xuùc taùc bôûi moät loaïi protein ñaëc bieät ñöôïc goïi laø enzym. Caùc enzym tham gia phaûn öùng trong teá baøo goïi laø enzym noäi baøo, coøn caùc enzym thuyû phaân coù chöùc naêng phaân huyû chaát höõu cô ngoaøi teá baøo thaønh chaát dinh döôõng coù theå haáp thuï vaøo teá baøo goïi laø enzym ngoaïi baøo. Caû hai loaïi enzym naøy ñeàu ñöôïc toång hôïp trong teá baøo. 1.2.1. Enzym caûm öùng. Nhöõng enzym ñöôïc taïo thaønh töø VSV khoâng phaûi chæ phuï thuoäc vaøo loaïi VSV maø coøn phuï thuoäc thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy, ñieàu kieän nuoâi caáy. Hieän töôïng treân laø do trong moâi tröôøng coù chaát khoù ñoàng hoaù, VSV tieát vaøo moâi tröôøng moät hoaëc caùc enzym töông öùng ñeå taïo thaønh chaát coù theå ñoàng hoaù ñöôïc. Caùc enzym ñöôïc tieát ra nhö theá ñöôïc goïi laø enzym caûm öùng vaø caùc cô chaát kích thích quaù trình toång hôïp enzym caûm öùng goïi laø chaát caûm öùng. 1.2.2. Baûn chaát sinh hoïc cuûa enzym. Caùc loaïi enzym ñeàu coù caùc ñaëc tính sinh hoïc chung nhö sau: + Enzym ñöôïc taïo ra trong teá baøo sinh vaät. + Enzym tham gia phaûn öùng caû trong teá baøo soáng vaø caû khi enzym ñöôïc taùch khoûi teá baøo soáng. + Enzym tham gia phaûn öùng trong ñieàu kieän nhieät ñoä oân hoaø, vì enzym ñöôïc toång hôïp vaø hoaït ñoäng trong ñieàu kieän nhieät ñoä cuûa teá baøo vaø nhieät ñoä cuûa cô theå. Phaàn lôùn nhieät ñoä cuûa cô theå sinh vaät dao ñoäng trong khoaûng 30-40oC. + Enzym coù theå tham gia xuùc taùc caùc phaûn öùng trong vaø ngoaøi cô theå. + Phaûn öùng enzym laø nhöõng phaûn öùng tieâu hao naêng löôïng raát ít. Trong khi ñoù, caùc phaûn öùng hoaù hoïc ñöôïc xuùc taùc bôûi caùc chaát xuùc taùc hoaù hoïc ñoøi hoûi naêng löôïng raát lôùn. + Enzym chòu söï ñieàu khieån bôûi gen vaø caùc ñieàu kieän phaûn öùng. Ñieàu naøy coù yù nghóa raát lôùn trong vieäc ñieàu khieån söï toång hôïp enzym trong teá baøo sinh vaät. 1.2.3. Baûn chaát hoaù hoïc cuûa enzym. Phaân tích thaønh phaàn hoaù hoïc cuûa enzym ngöôøi ta chia thaønh hai nhoùm: + Nhoùm enzym ñôn caáu töû: laø caùc enzym ñöôïc caáu taïo chæ coù protein. Caùc hydrolase thuoäc loaïi naøy. + Nhoùm enzym ña caáu töû: bao goàm nhöõng enzym coù hai thaønh phaàn: • Phaàn protein thuaàn ñöôïc goïi laø apoprotein hay apoenzym. Ngaøy nay môùi tìm thaáy moät soá ARN coù hoaït tính enzym chuyeån hoaù tieàn chaát thaønh caùc ARN. Caùc enzym ARN ñöôïc goïi laø Ribozim. Hieän nay ñaõ bieát coù 3500 enzym coù baûn chaát protein vaø 100 ribozim. • Phaàn thöù hai laø thaønh phaàn khoâng phaûi protein maø laø nhöõng chaát höõu cô ñaëc hieäu coù vai troø thuùc ñaåy quaù trình xuùc taùc. Thieáu thaønh phaàn thöù hai naøy thì caùc enzym khoâng hoaït ñoäng, neân goïi chuùng laø chaát coäng taùc (cofactor). Caùc chaát höõu cô ñaëc hieäu naøy coù theå gaén raát chaët vôùi phaàn protein baèng lieân keát ñoàng hoaù trò ñöôïc goïi laø nhoùm phuï (prosthetic), hoaëc cuõng coù theå gaén loûng leûo vaø deã daøng taùch chuùng khoûi protein ñöôïc goïi laø coenzym. Apoenzym quyeát ñònh tính ñaëc hieäu cao vaø laøm taêng hoaït ñoä xuùc taùc cuûa enzym. Coøn nhöõng chaát höõu cô ñaëc hieäu quyeát ñònh kieåu phaûn öùng, tröïc tieáp tham gia phaûn öùng vaø laøm taêng ñoä beàn cuûa apoenzym ñoái vôùi caùc yeáu toá gaây bieán tính. Ngoaøi ra, trong thaønh phaàn cuûa enzym coøn coù söï hieän dieän moät soá kim loaïi, caùc kim loaïi naøy thöôøng raát deã taùch ra khoûi enzym. Trong tröôøng hôïp enzym maát kim loaïi chuùng seõ maát hoaït tính. Khi ñöa trôû laïi caùc kim loaïi töông öùng vaøo enzym thì hoaït tính cuûa enzym laïi ñöôïc khoâi phuïc, tính chaát naøy mang tính thuaän nghòch. Vai troø cuûa kim loaïi trong hoaït ñoäng cuûa enzym vaãn chöa thöïc söï laøm saùng toû. Tuy nhieân caùc nhaø khoa hoïc cho raèng coù theå kim loaïi ñoùng vai troø lieân keát giöõa enzym vaø cô chaát, giöõa apoenzym vaø coenzym, tham gia tröïc tieáp vaøo quaù trình vaän chuyeån ñieän töû nhö vai troø cuûa saét trong cytochrome vaø peroxydase. 1.2.4. Tính chaát hoaù hoïc cuûa enzym. Enzym coù theå hoaø tan trong nöôùc, trong dung dòch muoái loaõng taïo thaønh caùc dung dòch keo öa nöôùc, nhöng enzym khoâng tan trong dung moâi khoâng phaân cöïc. Khi enzym ñöôïc hoaø tan vaøo nöôùc, caùc phaân töû nöôùc löôõng cöïc seõ keát hôïp vôùi caùc ion, caùc nhoùm ion hoaëc caùc nhoùm phaân cöïc trong phaân töû enzym taïo thaønh lôùp voû hydrat. Löôïng nöôùc hydrat naøy khaù lôùn vaø coù vai troø quan troïng laøm moâi tröôøng cho caùc phaûn öùng sinh hoaù. Enzym bò keát tuûa bôûi caùc taùc nhaân gaây tuûa protein nhö muoái trung tính baõo hoaø (NaCl, (NH4)2SO4 …), dung moâi höõu cô ôû nhieät ñoä thaáp (etanol, aceton…) neân caùc chaát naøy ñöôïc duøng ñeå thu cheá phaåm enzym hoaït ñoäng. Tuy nhieân, protein seõ bò bieán tính laøm cho enzym maát hoaït tính do söï taùc ñoäng cuûa caùc taùc nhaân nhö: nhieät ñoä cao, moâi tröôøng acid hay kieàm quaù cao, caùc muoái kim loaïi naëng. Vì vaäy, ngöôøi ta ñaõ duøng caùc yeáu toá treân ñeå kìm haõm hoaït tính enzym khi caàn thieát. 1.2.5. Caáu truùc enzym. Khoâng phaûi toaøn boä caùc thaønh phaàn cuûa enzym tham gia vaøo hoaït ñoäng xuùc taùc, maø chæ coù nhöõng boä phaän raát ñaëc bieät mang tính ñaëc hieäu trong phaân töû enzym môùi tham gia xuùc taùc phaûn öùng. Boä phaän ñaëc hieäu naøy ñöôïc goïi laø trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Phaàn coøn laïi ñoùng vai troø nhö moät caùi khung, giöõ cho caáu truùc khoâng gian thích hôïp vôùi khaû naêng xuùc taùc. Moãi enzym thöôøng coù moät trung taâm hoaït ñoäng. Tuy nhieân cuõng coù enzym coù hai thaäm chí coù boán trung taâm hoaït ñoäng. 1.2.6. Cô cheá taùc duïng cuûa enzym Baûn chaát cuûa caùc phaûn öùng enzym laø khi coù söï tham gia xuùc taùc cuûa caùc enzym, caùc cô chaát seõ ñöôïc hoaït hoaù maïnh, töø ñoù laøm thay ñoåi tính chaát hoaù hoïc cuûa cô chaát. Döôùi taùc duïng cuûa enzym, cô chaát coù theå coù nhöõng thay ñoåi khoâng chæ veà caáu truùc hoaù hoïc, maø coøn thay ñoåi tính chaát hoaù hoïc. Quaù trình xuùc taùc cuûa enzym xaûy ra qua ba giai ñoaïn: • Giai ñoaïn thöù nhaát: enzym seõ keát hôïp vôùi cô chaát baèng nhöõng lieân keát yeáu, nhôø ñoù seõ taïo ra phöùc heä enzym-cô chaát thöôøng khoâng beàn, phaûn öùng xaûy ra raát nhanh, ñoøi hoûi moät ít naêng löôïng. • Giai ñoaïn thöù hai: cô chaát bò thay ñoåi caáu hình khoâng gian vaø möùc ñoä beàn vöõng cuûa caùc lieân keát. Keát quûa laø caùc lieân keát trong cô chaát bò phaù vôõ. • Giai ñoaïn thöù ba: ñaây laø giai ñoaïn cuoái cuøng, saûn phaåm ñöôïc taïo thaønh vaø taùch khoûi enzym. Enzym ñöôïc giaûi phoùng döôùi daïng töï do nhö ban ñaàu. Cô cheá xuùc taùc toång quaùt cuûa enzym ñöôïc toùm taét nhö sau: E + S ↔ ES → E + P Trong ñoù, E: enzym (enzyme); S: cô chaát (substrate); P: saûn phaåm (products). 1.2.7. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán vaän toác phaûn öùng enzym. • Noàng ñoä cô chaát Khi phaân giaûi moät loaïi cô chaát naøo ñoù, phaàn cô cheá taùc duïng cuûa enzym cho thaáy phaûn öùng khi coù enzym tham gia seõ traûi qua ba giai ñoaïn: Giai ñoaïn ñaàu neáu noàng ñoä cô chaát thaáp thì vaän toác phaûn öùng (V) phuï thuoäc tuyeán tính vôùi noàng ñoä cô chaát. Giai ñoaïn keá tieáp neáu V xaáp xæ giaù trò cöïc ñaïi thì V khoâng phuï thuoäc vaøo cô chaát. Giai ñoaïn tieáp theo neáu noàng ñoä cô chaát tieáp tuïc taêng cao thì haàu nhö V khoâng taêng nöõa maø ñaït giaù trò gaàn vôùi Vmax vì caùc enzym ñaõ baõo hoaø cô chaát. • Noàng ñoä enzym Neáu thöøa cô chaát, V phuï thuoäc tuyeán tính vaøo noàng ñoä enzym: V = k[E] Trong ñoù: V: vaän toác phaûn öùng [E]: noàng ñoä enzym k: haèng soá vaän toác phaûn öùng. • Nhieät ñoä Nhieät ñoä coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán phaûn öùng enzym. Toác ñoä phaûn öùng chæ taêng ñeán moät giôùi haïn nhieät ñoä nhaát ñònh, vöôït quaù nhieät ñoä ñoù vaän toác phaûn öùng seõ giaûm vaø daãn ñeán möùc trieät tieâu do caáu truùc protein ñaõ bò phaù vôõ. Nhieät ñoä toái öu cuûa nhöõng enzym khaùc nhau laø hoaøn toaøn khaùc nhau. Phaàn lôùn enzym hoaït ñoäng maïnh nhaát ôû nhieät ñoä 40-50oC, coù moät soá enzym khaùc laø 600C hoaëc 700C, thaäm chí moät soá enzym cuûa vi khuaån Bacillus subtilis laïi hoaït ñoäng maïnh ôû 900C. Neáu taêng nhieät ñoä cao hôn möùc toái öu thì hoaït tính cuûa enzym seõ bò giaûm, khi ñoù enzym khoâng coù khaû naêng phuïc hoài laïi hoaït tính. Ngöôïc laïi, ôû nhieät ñoä 00C thì hoaït tính cuûa enzym bò haïn cheá raát maïnh, nhöng khi ñöa nhieät ñoä leân töø töø thì hoaït tính cuûa enzym seõ taêng daàn ñeàu ñeán möùc toái öu. Nhieät ñoä toái öu cuûa moät enzym phuï thuoäc raát nhieàu vaøo söï coù maët cuûa cô chaát, kim loaïi, pH, caùc chaát baûo veä. Ngöôøi ta thöôøng söû duïng heä soá nhieät Q10 ñeå bieåu thò aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán vaän toác phaûn öùng. Heä soá naøy caøng lôùn thì phaûn öùng caøng khoù xaûy ra ôû nhieät ñoä thöôøng. • pH moâi tröôøng pH thöôøng aûnh höôûng ñeán möùc ñoä ion hoaù cô chaát, enzym, vaø ñaëc bieät aûnh höôûng ñeán ñoä beàn cuûa enzym. Ña soá enzym beàn ôû pH = 5-9, ñoä beàn cuûa enzym taêng neáu coù maët cô chaát, coenzym, hoaëc Ca2+. Moãi enzym coù moät giaù trò pH toái öu (pHopt) taïi ñoù V ñaït Vmax. Nhieàu enzym hoaït ñoäng raát maïnh ôû pH trung tính, cuõng coù enzym hoaït ñoäng ôû pH acid hoaëc pH kieàm. • Caùc chaát kìm haõm (I) Caùc chaát kìm haõm hoaït ñoäng cuûa enzym laøm giaûm hoaït tính enzym nhöng laïi khoâng bò enzym laøm thay ñoåi tính chaát hoaù hoïc, caáu taïo hoaù hoïc vaø tính chaát vaät lyù cuûa chuùng. Caùc chaát naøy bao goàm caùc ion, caùc phaân töû voâ cô, caùc chaát höõu cô vaø caû protein. Caùc chaát kìm haõm coù yù nghóa raát lôùn trong ñieàu khieån caùc quùa trình trao ñoåi chaát ôû teá baøo sinh vaät. Cô cheá kìm haõm cuûa caùc chaát kìm haõm coù theå thuaän nghòch hoaëc khoâng thuaän nghòch, ñaëc hieäu hoaëc khoâng ñaëc hieäu. Sau ñaây chuùng ta chæ xeùt caùc chaát kìm haõm thuaän nghòch. Tuyø thuoäc vaøo baûn chaát taïo phöùc EI, baûn chaát cuûa chaát kìm haõm ngöôøi ta chia thaønh caùc loaïi chaát kìm haõm sau:  Caùc chaát kìm haõm caïnh tranh Caùc chaát naøy coù caáu truùc töông töï nhö caáu truùc cuûa cô chaát vì theá chuùng coù khaû naêng keát hôïp vôùi trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Keát quaû laø trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym bò chaát kìm haõm chieám maát, do ñoù cô chaát maát moät phaàn khaû naêng töông taùc laøm toác ñoä phaûn öùng giaûm.  Caùc chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh Caùc chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh keát hôïp vôùi enzym ôû moät vò trí khoâng phaûi trung taâm hoaït ñoäng, keát quaû laø chuùng laøm thay ñoåi caáu truùc khoâng gian cuûa phaân töû enzym theo chieàu höôùng baát lôïi cho hoaït ñoäng xuùc taùc. Vì theá caùc chaát kìm haõm laøm giaûm hoaït ñoäng cuûa enzym. Khi keát hôïp vôùi chaát kìm haõm, enzym vaãn coù khaû naêng keát hôïp vôùi cô chaát khi ñoù seõ taïo thaønh phöùc hôïp EIS. Trong thöïc teá chaát kìm haõm chæ keát hôïp vôùi phöùc hôïp ES maø khoâng keát hôïp vôùi E töï do. Caùc chaát kìm haõm coù theå laø nhöõng chaát sau:  Kìm haõm bôûi saûn phaåm cuûa phaûn öùng Caùc saûn phaåm cuûa phaûn öùng coù theå ñoùng vai troø nhö chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh. Neáu enzym xuùc taùc cho phaûn öùng cuûa cô chaát A vaø B taïo thaønh saûn phaåm P1 vaø P2, enzym coù aùi löïc vôùi P1, P2 vaø caû cô chaát A, B. Khi ñoù P1vaø P2 trôû thaønh chaát kìm haõm cuûa enzym.  Kìm haõm do thöøa cô chaát Khi ES ñöôïc taïo thaønh coù theå coù moät cô chaát gaén vôùi ES laøm chuùng khoâng theå chuyeån hoaù tieáp ñöôïc: ES + S ↔ ESS • Chaát hoaït hoaù Laø nhöõng chaát coù taùc duïng laøm taêng hoaït tính enzym. Chaát hoaït hoaù enzym coù theå laø anion, caùc ion kim loaïi, caùc chaát höõu cô coù caáu truùc phöùc taïp coù nhieäm vuï chuyeån nhoùm hydrogen hoaëc phaù vôõ moät soá lieân keát trong phaân töû tieàn enzym hoaëc phuïc hoài caùc nhoùm chöùc naêng trong trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Caùc chaát hoaït hoaù chæ coù taùc duïng hoaït hoaù ôû moät noàng ñoä nhaát ñònh, vöôït quaù noàng ñoä naøy chuùng seõ gaây öùc cheá hoaït ñoäng cuûa enzym. 1.3. Heä enzym amylase [4], [8], [13], [16], [27], [44] Amylase thuoäc heä enzym thuyû phaân (hydrolase) chuùng thuyû phaân caùc lieân keát α-1,4 vaø α-1,6 glucoside cuûa tinh boät. Töø xöa chuû yeáu ngöôøi ta thu nhaän amylase töø malt, nhöng ngaøy nay vieäc thu nhaän chuû yeáu töø nuoâi caáy VSV. Cuõng nhö nhieàu VSV khaùc, vi khuaån Bacillus taïo ra raát nhieàu enzym ngoaïi baøo nhö: amylase, protease, celullase,... Trong ñoù amylase raát quan troïng vì chuùng ñöôïc söû duïng phoå bieán vaø mang laïi nhieàu lôïi ích cho neàn saûn xuaát coâng nghieäp. Caùc loaïi amylase thöôøng gaëp khi nuoâi caáy VSV goàm: α – amylase, β- amylase vaø γ-amylase. 1.3.1. Giôùi thieäu veà enzym α – amylase. • Caáu taïo: α-amylase coù caáu taïo goàm 3 tieåu ñôn vò: * A laø tieåu ñôn vò loõi coù caáu truùc ñaëc tröng helix (α/β) 8 barel. * Tieåu ñôn vò C ñöôïc noái vôùi A coù caáu truùc taùm ñoaïn β-sheet song song. * Tieåu ñôn vò B goàm hai ñoaïn β-sheet ñöôïc loàng vaøo giöõa ñoaïn β-sheet thöù ba vaø α-helix thöù ba cuûa tieåu ñôn vò A. Tieåu ñôn vò B quyeát ñònh ñoä beàn hoaït ñoä cuûa enzym vaø lieân keát enzym-cô chaát. Ion canxi noái giöõa tieåu ñôn vò A vaø B, coù töø 1-30 nguyeân töû gam Ca/mol. Khi taùch hoaøn toaøn canxi ra khoûi enzym thì α-amylase maát heát hoaït tính, vì Ca duy trì caáu hình hoaït ñoäng cuûa enzym. Maët khaùc, Ca coøn coù taùc duïng ñaûm baûo ñoä beàn raát lôùn cuûa enzym ñoái vôùi caùc taùc ñoäng gaây bieán tính vaø söï thuyû phaân cuûa caùc enzym phaân giaûi protein. Tuyø thuoäc vaøo daïng enzym maø coù theå coù theâm moät soá tieåu ñôn vò khaùc ñöôïc gaén vôùi ñaàu C-terminal hoaëc ñaàu N-terminal cuûa phaân töû protein. Taâm hoaït ñoäng cuûa α-amylase coù chöùa caùc nhoùm –COOH vaø NH3 . • Tính chaát lyù hoùa Ñieàu kieän hoaït ñoäng cuûa α-amylase töø caùc nguoàn khaùc nhau thöôøng khoâng Hình 1.1. Caáu truùc phaân töû α-amylase [50] gioáng nhau. - pH pH toái thích cho hoaït ñoäng cuûa α-amylase töø naám sôïi laø 4,5-4,8 vaø cuûa vi khuaån laø 5,8-6,0. Nhìn chung pH toái öu naèm trong khoaûng acid yeáu 4,8-6,9. pH<4,0 α-amylase cuûa vi khuaån bò voâ hoaït hoaøn toaøn, tuy nhieân moät soá α- amylase chòu acid cao nhö cuûa Bacillus acidocaldarious (pH toái thích laø 3,5) vaø chòu kieàm maïnh nhö B. licheniformis (pH toái thích laø 9,0). - Nhieät ñoä Nhìn chung α-amylase beàn nhieät hôn so vôùi caùc amylase khaùc, ñaëc tính naøy ñöôïc cho raèng coù lieân quan ñeán haøm löôïng ion canxi trong phaân töû (α- amylase cuûa caùc vi khuaån öa nhieät coù chöùa canxi nhieàu hôn α - amylase cuûa naám moác 3 - 4 laàn). α - amylase cuûa vi khuaån coù ñoä beàn nhieät cao hôn caû. Baûng 1.1. Ñoä beàn nhieät cuûa α-amylase töø caùc nguoàn khaùc nhau (theo Miller, Johson vaø Palmer) Hoaït ñoä α-amylase, % so vôùi hoaït ñoä ban ñaàu Nhieät ñoä (oC) cuûa naám sôïi cuûa malt cuûa vi k._.huaån 65 70 75 80 85 90 95 100 52 3 - - - - 100 100 58 25 1 - - 100 100 100 92 58 52 8 Tính beàn nhieät cao cuûa α-amylase vi khuaån laø moät öu ñieåm lôùn. Vì trong saûn xuaát α-amylase ñöôïc söû duïng ñeå xöû lyù nguyeân lieäu ôû coâng ñoaïn phaûi duøng nhieät ñoä cao. • Cô cheá taùc duïng α-amylase coù khaû naêng phaân caét caùc lieân keát α-1,4 glucoside trong phaân töû polysaccharid moät caùch ngaãu nhieân. Vì theá ngöôøi ta goïi noù laø enzym amylase noäi phaân (endoamylase). Khi taùc duïng leân tinh boät taïo ra saûn phaåm chuû yeáu laø dextrin phaân töû löôïng thaáp (phaûn öùng khoâng maøu vôùi iod), ngoaøi ra coøn coù maltose, vaø moät ít glucose. Vì vaäy, ngöôøi ta goïi α-amylase laø amylase dextrin hoaù hay amylase dòch hoaù. 1.3.2 Nguoàn thu nhaän enzym amylase. Enzym coù theå ñöôïc thu nhaän töø nhieàu nguoàn khaùc nhau nhö ñoäng vaät, thöïc vaät, vi sinh vaät (VSV). Tuy nhieân vieäc khai thaùc enzym töø thöïc vaät, ñoäng vaät thöôøng gaëp khoù khaên vì nguoàn nguyeân lieäu haïn cheá, hieäu suaát thaáp neân giaù thaønh cao. Hieän nay phaàn lôùn enzym ñeàu ñöôïc thu nhaän töø vi sinh vaät, vì coù nhöõng ñieåm noåi baät sau: - VSV coù toác ñoä sinh tröôûng, phaùt trieån vaø sinh saûn cöïc kyø nhanh, töø ñoù toång hôïp enzym vôùi cöôøng ñoä raát maïnh, neân trong moät thôøi gian ngaén coù theå thu ñöôïc moät löôïng enzym raát lôùn. - Heä enzym cuûa VSV raát phong phuù, töø caùc chuûng VSV khaùc nhau ta coù theå thu nhaän ñöôïc nhieàu loaïi enzym khaùc nhau, trong ñoù coù nhöõng enzym chuyeân bieät chæ coù ôû VSV maø haàu nhö khoâng thaáy ôû ñoäng vaät, thöïc vaät. - Moâi tröôøng nuoâi caáy VSV ñôn giaûn, reû tieàn, thöôøng laø nhöõng pheá phuï lieäu cuûa ngaønh coâng nghieäp neân giaù thaønh enzym reû hôn vaø deã aùp duïng cho caùc cô sôû saûn xuaát. - VSV chòu aûnh höôûng raát lôùn bôûi thaønh phaàn dinh döôõng, caùc taùc ñoäng cuûa moâi tröôøng, do ñoù ngöôøi ta coù theå thay ñoåi thaønh phaàn dinh döôõng hoaëc caùc yeáu toá taùc ñoäng ñeå ñieàu khieån quaù trình toång hôïp enzym theo yeâu caàu. - Vieäc caûi taïo gioáng VSV ñeå taïo ra caùc chuûng VSV coù khaû naêng toång hôïp ra caùc loaïi enzym theo yù muoán coù theå thöïc hieän ñöôïc vaø chæ trong thôøi gian ngaén, vì khaû naêng thích öùng vôùi moâi tröôøng cuûa VSV laø raát maïnh. - Saûn xuaát enzym töø VSV coù theå thöïc hieän treân qui moâ coâng nghieäp, töï ñoäng hoùa vaø cô giôùi hoaù. Ngöôøi ta ñaõ bieát nhieàu loaïi VSV coù khaû naêng toång hôïp amylase, trong ñoù ñöôïc söû duïng nhieàu hôn caû laø naám sôïi, giaû naám men vaø vi khuaån, coøn xaï khuaån thì ít hôn. - Caùc gioáng naám sôïi thöôøng ñöôïc duøng ñeå thu amylase laø Aspergillus, Rhizopus. - Nhieàu chuûng vi khuaån cuõng coù khaû naêng taïo löôïng lôùn amylase nhö: Bacillus polymyxa, Phytomonas destructans, Clostridium acetobutylicum,… trong ñoù caùc chuûng vi khuaån öa nhieät taïo nhieàu amylase ñaùng chuù yù laø Bacillus diastaticus, B. stearothermophilus, B. coagulans, B. circulans; vi khuaån öa aåm taïo amylase maïnh ñöôïc nghieân cöùu nhieàu hôn caû vaø söû duïng roäng raõi nhaát laø B. subtilis. Nhöõng chuûng VSV taïo nhieàu amylase thöôøng ñöôïc phaân laäp töø caùc nguoàn töï nhieân. Trong coâng nghieäp, caùc bieán chuûng taïo ra ñöôïc baèng caùch gaây ñoät bieán, nhôø taùc nhaân lyù hoïc hoaëc hoaù hoïc hoaëc phoái hôïp caû hai loaïi taùc nhaân treân, laø nhöõng chuûng hoaït ñoäng raát maïnh vaø coù khaû naêng sinh toång hôïp nhieàu amylase. 1.3.3 Moät soá yeáu toá aûnh höôûng ñeán sinh toång hôïp amylase cuûa VSV [18], [23]  Gioáng vi sinh vaät Coù raát nhieàu yeáu toá aûnh höôûng ñeán söï hình thaønh amylase vaø löôïng amylase cuûa VSV nhö: chuûng VSV, moâi tröôøng dinh döôõng, ñieàu kieän nuoâi caáy,… Trong caùc yeáu toá treân thì chuûng gioáng VSV laø ñieàu kieän ñaàu tieân vaø cô baûn nhaát. Khoâng phaûi caùc chuûng VSV ñeàu coù khaû naêng toång hôïp amylase nhö nhau. Ngay caû nhöõng chuûng cuøng chi, thaäm chí laø cuøng loaøi cuõng raát khaùc nhau veà löôïng enzym do chuùng sinh ra. Chính vì theá maø vieäc tuyeån choïn chuûng VSV coù khaû naêng taïo nhieàu amylase laø voâ cuøng quan troïng. Ngoaøi vieäc tuyeån gioáng coù khaû naêng sinh amylase cao, thì vieäc baûo quaûn gioáng, tieán haønh nuoâi caáy trong ñieàu kieän toái öu cuõng voâ cuøng quan troïng nhaèm ñaûm baûo khaû naêng sinh toång hôïp enzym cao nhaát vaø oån ñònh nhaát. Vì taàm quan troïng nhö vaäy maø nhieàu nöôùc treân theá giôùi ñaõ ñöa coâng taùc naøy leân taàm côõ quoác gia vaø ñaõ thaønh laäp caùc trung taâm, chi nhaùnh giöõ gioáng goïi laø baûo taøng VSV.  Nguoàn dinh döôõng Trong moâi tröôøng nuoâi caáy VSV caàn phaûi ñaûm baûo ñaày ñuû, thích hôïp caùc thaønh phaàn vaø tæ leä caùc chaát dinh döôõng cho töøng VSV cuï theå. • AÛnh höôûng nguoàn cacbon Thaønh phaàn vaø haøm löôïng cacbon coù aûnh höôûng lôùn ñeán sinh toång hôïp enzym. Theo soá lieäu cuûa Grigorev veà aûnh höôûng cuûa nguoàn cacbon tôùi cöôøng ñoä sinh toång hôïp amylase coù theå xeáp theo thöù töï sau: Vôùi α–amylase: tinh boät > dextrin > maltozô > lactozô > glucozô > sacarozô > galactozô > manozô > arabinozô. Vôùi glucoamylase: tinh boät > dextrin > maltozô > sacarozô > glucozô > lactozô > lactozô > arabinozô > galactozô > manozô. Noàng ñoä nguoàn cacbon cuõng aûnh höôûng lôùn ñeán söï taïo thaønh enzym. Moãi loaøi VSV chæ coù theå thích hôïp vôùi moät noàng ñoä hydratcacbon nhaát ñònh. • AÛnh höôûng nguoàn nitô Nitô caàn cho söï hình thaønh caùc axit amin ñeå caáu taïo neân caùc protein caáu truùc cho caùc phaân töû cuûa enzym. Nguoàn nitô boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy coù theå laø nitô voâ cô hoaëc nitô höõu cô. Nguoàn nitô thöôøng duøng laø nitrat amon, sunfat amon, ureâ,… Caùc hôïp chaát höõu cô laø nhöõng nguyeân lieäu giaøu ñaïm nhö cao ngoâ, boät ñaäu töông, khoâ laïc, khoâ ñaäu,… Ngoaøi ra moät soá axit amin, bazô purin, pyrimidin cuõng thöôøng ñöôïc boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy VSV. Ngoaøi hai nhaân toá cô baûn treân, trong moâi tröôøng dinh döôõng cuûa VSV sinh enzym noùi chung caàn phaûi coù maët nhieàu nguyeân toá khoaùng ôû daïng muoái magieâ, photpho, kali,…vaø caùc nguyeân toá vi löôïng. Ví duï ion Mg2+ coù taùc duïng laøm oån ñònh amylase ôû nhieät ñoä cao, Ca2+ coù trong thaønh phaàn protein cuûa α – amylase.  Ñieàu kieän nuoâi caáy Trong moâi tröôøng nuoâi caáy VSV caùc yeáu toá nhö, nhieät ñoä, ñoä pH, ñoä aåm, thôøi gian nuoâi caáy,… cuõng aûnh höôûng lôùn ñeán söï taïo thaønh enzym cuûa VSV. • AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä Nhieät ñoä toái thích cho sinh toång hôïp enzym cuûa caùc VSV laø khaùc nhau. Ví duï ôû ña soá naám moác treân moâi tröôøng raén laø 28-32oC, cuûa vi khuaån 30-35oC. • AÛnh höôûng cuûa pH moâi tröôøng pH ban ñaàu cuûa moâi tröôøng aûnh höôûng khoâng nhoû ñeán söï phaùt trieån vaø taïo thaønh enzym. Ña soá naám moác phaùt trieån vaø taïo amylase ôû moâi tröôøng axit yeáu, trong khi ñoù vi khuaån laïi thích hôïp trong moâi tröôøng trung tính. pH moâi tröôøng khoâng chæ aûnh höôûng ñeán löôïng enzym toång hôïp maø coøn aûnh höôûng ñeán chuûng loaïi enzym ñöôïc toång hôïp. Ví duï ôû Asperillus oryzae khi pH moâi tröôøng laø 6,5 thì öu theá toång hôïp thuoäc veà α – amylase, trong khi ñoù öu theá toång hôïp glucoamylase khi pH moâi tröôøng laø 4,5. • AÛnh höôûng ñoä aåm cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy Trong quaù trình saûn xuaát caàn phaûi duy trì ñoä aåm cuûa moâi tröôøng, vì ñoä aåm seõ laøm giaûm ñoä thoaùng khí cuûa moâi tröôøng, coøn ñoä aåm thaáp laïi kìm haõm söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa VSV. Ñoä aåm moâi tröôøng xoáp thích hôïp nuoâi naám moác laø 50 – 60%, coøn ñoái vôùi vi khuaån laø 50 – 70%. • AÛnh höôûng thôøi gian nuoâi caáy Thôøi gian nuoâi caáy aûnh höôûng lôùn ñeán söï hình thaønh enzym. Ñoái vôùi ña soá naám moác khi nuoâi ôû moâi tröôøng xoáp söï taïo thaønh amylase cöïc ñaïi thöôøng keát thuùc khi naám moác baét ñaàu sinh baøo töû, thôøi gian keát thuùc söï taïo thaønh amylase thöôøng töø 30-42 giôø. Coøn ñoái vôùi vi khuaån söï taïo thaønh amylase toát nhaát töø khoaûng 40-50 giôø. Coøn nuoâi caáy chìm sinh tröôûng cuûa chuûng gioáng ñaït cöïc ñaïi tôùi pha oån ñònh tröôùc, khoaûng töø 5 ñeán 8 giôø sau thì hoaït ñoä enzym ñaït cöïc ñaïi. 1.3.4. Taùch chieát enzym töø caùc nguoàn nguyeân lieäu [4], [10], [12], [14] - Ñoái vôùi enzym ngoaïi baøo: ngöôøi ta taùch sinh khoái vaø caùc chaát caën baõ khoûi canh tröôøng baèng phöông phaùp loïc hoaëc ly taâm. Söû duïng theâm caùc chaát trôï loïc (diatomite, than hoaït tính…) hoaëc caùc chaát taïo keát tuûa ñeå caùc chaát naøy deã daøng bò laéng caën keùo theo sinh khoái giuùp quaù trình loïc deã daøng hôn. - Ñoái vôùi enzym noäi baøo: ñeå thu nhaän enzym caàn phaûi phaù vôõ teá baøo baèng caùc phöông phaùp sau: ▪ Phöông phaùp vaät lyù Nghieàn teá baøo trong maùy ñoàng hoaù hoaëc nghieàn vôùi boät thuyû tinh hay caùt traéng saïch trong coái söù. Thay ñoåi nhieät ñoä ñoät ngoät hoaëc taïo aùp suaát thaåm thaáu cao ñeå phaù vôõ thaønh teá baøo. ▪ Phöông phaùp hoaù hoïc Söû duïng acid ñeå thuyû phaân thaønh teá baøo. Tuy nhieân cho acid quaù nhieàu coù theå laøm bieán tính enzym. Hoaëc coù theå duøng kieàm, nhöng neáu enzym coù tính acid thì khoâng duøng ñöôïc. ▪ Phöông phaùp sinh hoïc Phöông phaùp sinh hoïc ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát laø phöông phaùp enzym. Duøng caùc enzym töông öùng vôùi caùc cô chaát coù trong thaønh teá baøo ñeå thuyû phaân, nhö vaäy thaønh teá baøo seõ bò phaù vôõ. Sau khi phaù vôõ teá baøo, caùc enzym ñöôïc taùch chieát baèng caùc dung moâi khaùc nhau nhö: nöôùc, dung dòch ñeäm, muoái trung tính. Phaàn lôùn caùc enzym thuyû phaân tan toát trong nöôùc, do ñoù nöôùc laø dung moâi toát nhaát ñeå chieát ruùt enzym, coù theâm moät ít focmalin ñeå saùt truøng. Nhieät ñoä nöôùc ñeå ruùt chieát enzym thöôøng laø 25-280C. Caàn laøm laïnh nhanh dòch chieát xuoáng 10-120C ñeå ngaên caûn VSV laï phaù hoûng dòch enzym. 1.3.5 ÖÙng duïng cuûa amylase trong thöïc teá saûn xuaát vaø ñôøi soáng [6], [15], [28], [29], [46]  Trong saûn xuaát baùnh keïo Muïc ñích cuûa vieäc söû duïng enzym vaøo saûn xuaát caùc loaïi baùnh quy laø laøm taêng muøi vaø vò cuûa baùnh. Theâm caùc enzym protease vaø amylase khi cheá bieán boät laøm taêng haøm löôïng caùc acid amin töï do vaø löôïng ñöôøng khöû, töø ñoù chuùng tham gia vaøo caùc phaûn öùng oxi hoaù khöû vaø keát quûa taïo cho baùnh quy coù muøi, vò vaø maøu haáp daãn.  Trong coâng ngheä saûn xuaát baùnh mì Trong saûn xuaát baùnh mì, enzym ñöôïc xem nhö chaát phuï gia ñeå laøm taêng chaát löôïng baùnh: laøm taêng theå tích baùnh, baùnh coù maøu saéc ñeïp hôn vaø muøi thôm hôn. Trong quaù trình saûn xuaát ngöôøi ta söû duïng enzym protease, α-amylase, β- amylase, trong ñoù: o Enzym protease coù taùc duïng laøm giaûm ñoä nhôùt cuûa boät nhaøo do gluten gaây ra vaø laøm taêng heä soá tieâu hoaù protein. o Enzym α-amylase, β-amylase tham gia thuyû phaân tinh boät taïo ra ñöôøng, nhôø ñoù naám men deã daøng chuyeån hoaù ñöôøng thaønh coàn, CO2, töø ñoù laøm taêng theå tích cuûa baùnh vaø taïo maøu saéc, höông vò cuûa baùnh. Ngaøy nay, nguoàn enzym amylase vaø protease ñöôïc söû duïng chuû yeáu töø naám moác Aspergillus oryzae, vaø A. awamori.  Trong saûn xuaát bia Ngaøy nay, caùc nöôùc treân theá giôùi öùng duïng enzym trong caùc coâng ñoaïn saûn xuaát bia. Ngöôøi ta thöôøng söû duïng enzym amylase vaø protease cuûa vi khuaån, vì caùc loaïi enzym thu nhaän töø vi khuaån thöôøng coù hoaït tính cao vaø khaû naêng chòu nhieät ñoä cao raát toát maø nhieät ñoä cao thöôøng laøm bieán tính enzym trong malt. Ngöôøi ta söû duïng roäng raõi cheá phaåm enzym amylase cuûa naám moác Aspergillus oryzae, A. niger, A. awamori,…vaø cuûa vi khuaån Bacillus subtilis, B. diastaticus,…ñeå ñöôøng hoaù thay malt. Duøng amylase VSV coù theå thay theá töø 50- 100% malt baèng nguyeân lieäu khaùc nhö boät gaïo, boät baép, boät saén…nhöng thoâng thöôøng chæ thay theá töø 60-70% malt thì chaát löôïng bia toát hôn, thôm ngon hôn. YÙ nghóa cuûa vieäc söû duïng enzym VSV thay theá malt trong saûn xuaát bia ñaõ tieát kieäm ñöôïc haøng taán malt ñaïi maïch loaïi toát, giaûm giaù thaønh vaø ruùt ngaén thôøi gian saûn xuaát. Ñoái vôùi Vieät Nam cuõng nhö nhöõng nöôùc phaûi nhaäp malt vôùi giaù thaønh cao thì bieän phaùp treân coù yù nghóa to lôùn.  Trong saûn xuaát röôïu Söû duïng amylase cuûa VSV ôû giai ñoaïn ñöôøng hoaù trong saûn xuaát röôïu, coàn ñaõ ruùt ngaén thôøi gian vaø taêng hieäu suaát do khaû naêng thuyû phaân saâu saéc cuûa phöùc heä enzym VSV. Vai troø cuûa α-amylase trong saûn xuaát röôïu laø laøm dòch hoaù nhanh ôû giai ñoaïn naáu vaø ôû caû giai ñoaïn ñaàu cuûa söï ñöôøng hoaù, dextrin hoaù vaø tích tuï ñöôøng. Enzym amylase ñöôïc thu nhaän töø naám moác Aspergillus usamii, A. awamori, A. oryzae vaø töø vi khuaån Bacillus subtilis, B. diastaticus. Saûn phaåm cuoái cuøng cuûa söï thuyû phaân tinh boät nhôø amylase naám moác chuû yeáu laø glucose, ñöôøng deã leân men, do ñoù söï leân men röôïu xaûy ra nhanh hôn. Coøn cheá phaåm amylase töø vi khuaån chòu ñöôïc nhieät ñoä cao neân ñöôïc söû duïng trong giai ñoaïn dòch hoaù tinh boät tröôùc khi ñöôøng hoaù laø raát thích hôïp.  Trong saûn xuaát maät tinh boät Ngaøy nay ngöôøi ta duøng cheá phaåm amylase VSV thay cho acid vaø malt ñeå thuyû phaân tinh boät taïo maät tinh boät (maät glucose, maltose). Khi thuyû phaân tinh boät nhôø amylase VSV laøm cho chaát löôïng dòch thuyû phaân toát hôn vaø deã daøng tinh cheá hôn, vì khoâng xaûy ra söï phaân huyû ñöôøng bôûi acid, bôûi nhieät, vaø khoâng phaân huyû caùc taïp chaát coù laãn trong tinh boät. Hai loaïi enzym ñöôïc söû duïng chuû yeáu laø α-amylase vaø γ-amylase (glucoamylase) töø naám moác, vi khuaån vaø giaû naám men. α-amylase duøng ñeå dòch hoaù tinh boät vaø taïo maltose, coøn γ-amylase duøng ñeå ñöôøng hoaù taïo glucose.  Trong saûn xuaát chaát taåy röûa Enzym amylase coù khaû naêng phaân giaûi caùc veát baån do carbohydrate trong quaàn aùo. Ngöôøi ta thöôøng söû duïng α-amylase cuûa vi khuaån vì enzym naøy thöôøng chòu ñöôïc nhieät ñoä cao (ñeán 90oC) vaø pH kieàm (pH = 9). Ngoaøi ra, enzym naøy coøn ñöôïc duøng phoái hôïp vôùi protease kieàm cho hieäu quaû taåy röûa caùc chaát carbohydrate vaø protein ñöôïc toát hôn.  Trong coâng nghieäp deät Enzym amylase ñöôïc duøng ñeå ruõ hoà vaûi tröôùc khi taåy traéng vaø nhuoäm. Trong vaûi moäc chöùa 5% tinh boät vaø nhieàu taïp chaát khaùc. Ñeå laøm vaûi meàm, coù khaû naêng nhuùng öôùt, taåy traéng vaø baét maøu toát khi nhuoäm thì nhaát thieát phaûi taùch boû tinh boät. Ngaøy nay, ngöôøi ta söû duïng α-amylase cuûa VSV nhö vi khuaån Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus hay naám moác Aspergillus oryzae thay cho amylase malt vaø pancreatin. α-amylase cuûa vi khuaån chòu ñöôïc nhieät ñoä cao, hoaït ñoäng maïnh ôû 85-90oC. Moät soá enzym cuûa amylase cuûa B.subtilis coù theå hoaït ñoäng ôû 105-115oC. Khi ruõ hoà vaûi, löôïng cheá phaåm enzym tính cho moãi lít dung dòch laø 0,3-0,6g, nhieät ñoä xöû lyù laø 90oC, trong thôøi gian töø 5-15 phuùt. Phöông phaùp naøy khoâng laøm haïi vaûi, maø taïo ñoä mao daãn toát ñoàng thôøi ñaûm baûo veä sinh.  Trong chaên nuoâi Amylase ñöôïc söû duïng rieâng reõ hay phoái hôïp vôùi caùc enzym khaùc nhö protease, cellulase, pectinase…ñeå saûn xuaát caùc loaïi thöùc aên deã tieâu hoaù cho gia suùc, gia caàm, ñaëc bieät laø vaät nuoâi coøn non giuùp taêng troïng nhanh, sinh saûn toát, söùc ñeà khaùng cao…  Trong y hoïc vaø nghieân cöùu khoa hoïc Amylase cuøng caùc enzym khaùc ñöôïc duøng trong chöõa trò beänh do thieáu enzym, khaû naêng chuyeån hoaù caùc chaát keùm, caùc beänh veà tieâu hoaù,… Ngoaøi ra, cheá phaåm amylase coøn ñöôïc duøng ñeå ñieàu cheá moâi tröôøng nuoâi VSV phuïc vuï cho coâng taùc khoa hoïc. Moät dung dòch beàn vöõng chöùa α-amylase cho pheùp phaùt hieän caùc oligosaccharide phaân töû löôïng lôùn vôùi ñoä nhaïy raát cao. Chương II: VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 2.1 Vaät lieäu 2.1.1 Ñoái töôïng Laø caùc chuûng tröïc khuaån ñöôïc phaân laäp töø ñaát vöôøn qua trung gian coû khoâ. 2.1.2. Duïng cuï Caùc duïng cuï, thieát bò cuûa phoøng thí nghieäm Vi sinh – sinh hoaù Tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm Thaønh phoá Hoà Chí Minh. Thieát bò goàm coù: Tuû caáy voâ truøng Beáp oån nhieät Caân ñieän töû Maùy laéc Kính hieån vi ñieän töû Maùy ño OD Tuû aám Tuû laïnh Tuû saáy Maùy ño pH Noài haáp thanh truøng Maùy ly taâm 2.1.3. Hoaù chaát Caùc hoaù chaát cuûa phoøng Vi sinh – sinh hoaù Tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm Thaønh phoá Hoà Chí Minh, goàm coù: NaCl Cao thòt MgCl2 Pepton CaCl2 Cao naám men Agar KI Iot Tinh boät tan Tím Gentian H2O2 Etanol 96oC Aceton (NH4) 2SO4 Na2HPO4.12H2O2 KH2PO4 Thuoác thöû Folin HCl ñaäm ñaëc Na2CO3 CaCO3 K2HPO4 2.2. Caùc moâi tröôøng ñöôïc söû duïng 2.2.1 Moâi tröôøng phaân laäp vaø nuoâi Bacillus (MPA) [5] Pepton 10g Cao thòt 5g NaCl 5g Agar 10g Nöôùc caát 1000ml 2 2.2. Moâi tröôøng caûm öùng sinh toång hôïp α-amylase cuûa Bacillus [7] Pepton 5g Cao naám men 2g MgSO4 0,5g NaCl 0,5g K2HPO4 1g Tinh boät 10g KH2PO4 1g Nöôùc caát 1000ml CaCl2 0,15g 2.2.3. Moâi tröôøng thöû hoaït tính amylase [17] Pepton 5g Nöôùc 1000ml Cao men 2,5g pH 5,5 – 7,8 Tinh boät tan 1% Ñeå thöû hoaït tính amylase söû duïng dung dòch lugol, ño voøng thuyû phaân tinh boät. 2.3. Caùc phöông phaùp nghieân cöùu 2.3.1 Phöông phaùp phaân laäp caùc chuûng Bacillus töø ñaát vöôøn qua trung gian coû khoâ [5], [17]. Laáy moät ít ñaát vöôøn (10g) cho vaøo bình tam giaùc vaø theâm 90ml nöôùc caát voâ truøng laéc ñeàu ñeå taïo huyeàn phuø, gia nhieät tôùi 850C trong 20 – 25 phuùt. Caét nhoû moät ít coû khoâ, raéc xung quanh coû ít boät CaCO3 roài cho vaøo bình tam giaùc treân sao cho nöôùc vöøa ngaäp coû, ñeå töø 1 – 2 ngaøy ôû nhieät ñoä phoøng. Ñoå 10ml moâi tröôøng phaân laäp vaøo ñóa petri voâ truøng, ñeå nguoäi vaø caáy moät laàn que caáy voøng töø maøng VSV moïc treân maët lôùp coû khoâ leân beà maët moâi tröôøng ñaëc, duøng que gaït gaït ñeàu, sau ñoù goùi ñóa petri vaø cho vaøo tuû aám 25-35oC. Sau 2-3 ngaøy thaáy xuaát hieän caùc khuaån laïc rieâng bieät treân maët moâi tröôøng thaïch. 2.3.2. Phöông phaùp giöõ gioáng caáy chuyeàn [11] Ñoå moâi tröôøng giöõ gioáng vaøo oáng nghieäm, ñeå nghieâng oáng nghieäm. Tieáp theo, duøng que caáy voâ truøng laáy dòch vi khuaån phaân laäp ñaõ ñöôïc pha loaõng baèng nöôùc caát voâ truøng, vaø caáy zic zaéc treân beà maët thaïch nghieâng. Nuùt oáng nghieäm laïi ñaët vaøo tuû aám ôû 34oC, sau 24h thaáy xuaát hieän khuaån laïc thì chuyeån oáng nghieäm vaøo tuû laïnh ôû 4oC ñeå giöõ gioáng. Gioáng ñöôïc caáy chuyeàn haøng thaùng vaø hoaït hoaù tröôùc khi nhaân gioáng. 2.3.3. Moät soá phöông phaùp nghieân cöùu ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa Bacillus  Phöông phaùp nhuoäm Gram [18] Vôùi muïc ñích choïn caùc chuûng coù khaû naêng nhuoäm maøu Gram (+). Ñaây laø phöông phaùp laøm tieâu baûn nhuoäm maøu ñöôïc söû duïng phoå bieán ñeå quan saùt ñaëc ñieåm hình thaùi, ñeám soá löôïng vi khuaån. Nhöõng tieâu baûn naøy coù theå giöõ ñöôïc laâu. • Nguyeân taéc: Khaû naêng baét maøu cuûa VSV coù lieân quan ñeán muoái Magie cuûa acid Ribocleic. Khi nhuoäm muoái naøy coù phaûn öùng vôùi thuoác nhuoäm loaïi tryphenylmetan (gelatin violet, oryatan violet, metyl violet) vaø khoâng bò maát maøu döôùi taùc duïng cuûa coàn. Nhöõng vi khuaån nhö theá goïi laø vi khuaån Gram döông, ngöôïc laïi nhöõng vi khuaån khoâng giöõ ñöôïc maøu khi nhuoäm goïi laø vi khuaån Gram aâm. • Caùch tieán haønh: Cho moät gioït nöôùc caát leân phieán kính, duøng que caáy voâ truøng laáy moät ít teá baøo vi khuaån moïc treân moâi tröôøng ñaëc hoaø vaøo gioït nöôùc. Hô phieán kính leân ngoïn löûa ñeøn coàn 2-3 laàn, chuù yù khoâng ñeå phieán kính noùng quaù vì nhö theá teá baøo vi khuaån seõ bò bieán daïng. Khi gioït nöôùc bay hôi daàn vi khuaån seõ gaén chaët vaøo phieán kính. Nhuoäm maøu nhôø tím Gentian baèng caùch nhoû thuoác nhuoäm naøy leân veát boâi, giöõ 1-2 phuùt roài röûa baèng nöôùc caát. Tieáp theo nhoû dung dòch Lugol leân tieâu baûn ñeå trong 1 phuùt, roài ñoå thuoác ñi vaø traùng baèng nöôùc caát. Sau ñoù röûa baèng coàn 96o trong thôøi gian khoaûng 30-40 giaây. Röûa laïi tieâu baûn baèng nöôùc caát roài ñeå khoâ veát boâi. Sau ñoù nhuoäm boå sung baèng Fucshin loaõng khoaûng 1-2 phuùt. Röûa laïi baèng nöôùc caát cho ñeán khi heát maøu roài ñôïi khoâ. Quan saùt döôùi kính hieån vi quang hoïc, neáu vi khuaån nhuoäm maøu tím laø vi khuaån Gram döông, ngöôïc laïi vi khuaån nhuoäm maøu hoàng laø vi khuaån Gram aâm.  Phöông phaùp nhuoäm baøo töû [11] Baøo töû vi khuaån khoâng phaûi laø cô quan sinh saûn vaø thöôøng coù 2 daïng: hình caàu vaø hình baàu duïc. Khi teá baøo soáng trong moâi tröôøng khoâng thích hôïp cho söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån hoaëc khi teá baøo ñaõ traûi qua giai ñoaïn phaùt trieån maïnh nhaát thì baøo töû ñöôïc hình thaønh. • Nguyeân taéc: Khi teá baøo ñöôïc xöû lyù baèng nhieät hay/vaø acid thì teá baøo chaát cuûa baøo töû raát deã baét maøu. Nhuoäm caû teá baøo chaát cuûa baøo töû vaø teá baøo vôùi thuoác nhuoäm coù hoaït tính nhuoäm maïnh roài taåy maøu cuûa teá baøo chaát cuûa teá baøo vaø nhuoäm noù vôùi moät thuoác nhuoäm phaân bieät khaùc. Khi ñoù teá baøo chaát mang moät maøu vaø baøo töû seõ mang maøu khaùc. • Caùch tieán haønh: Nuoâi vi khuaån treân moâi tröôøng MPA ñaëc trong tuû aám 34oC, sau 5 ngaøy laøm veát boâi treân moät phieán kính saïch vaø ñeå khoâ töï nhieân. Nhoû vaøi gioït HCl 0,5% leân veát boâi, hô noùng treân ngoïn löûa ñeøn coàn cho boác hôi trong 2 phuùt roài röûa vôùi nöôùc. Nhuoäm veát boâi vôùi thuoác nhuoäm Fuchsin, qua mieáng giaáy loïc, hô noùng cho ñeán boác hôi trong voøng 5 phuùt. Röûa veát boâi baèng nöôùc. Taåy maøu baèng dung dòch H2SO4 1% trong 2 phuùt. Röûa veát boâi baèng nöôùc. Nhuoäm veát boâi baèng xanh methylene trong 5-15 phuùt. Röûa laïi vôùi nöôùc vaø ñeå khoâ töï nhieân. Quan saùt döôùi kính hieån vi vôùi vaät kính daàu (×100). Baøo töû seõ mang maøu ñoû, teá baøo sinh döôõng mang maøu xanh.  Phöông phaùp phaùt hieän hoaït tính catalase [19] Phöông phaùp naøy duøng ñeå xaùc ñònh vi khuaån hieáu khí. Tröôùc khi thöû hoaït tính catalase caàn phaûi tieán haønh caáy daøn vi khuaån treân ñóa petri coù moâi tröôøng MPA ñaëc, nuoâi trong tuû aám 340C. Sau 24h thaáy xuaát hieän khuaån laïc thì nhoû moät gioït dung dòch H2O2 10% leân khuaån laïc. Neáu thaáy coù boït khí xuaát hieän thì chöùng toû coù catalase trong teá baøo, vaø keát luaän laø chuûng vi khuaån hieáu khí.  Quan saùt ñaëc ñieåm khuaån laïc [17] Quan saùt moät soá chæ tieâu cuûa chuûng nghieân cöùu treân moâi tröôøng nuoâi Bacillus: - Khaû naêng phaùt trieån cuûa khuaån laïc. - Beà maët khuaån laïc. - Maøu saéc khuaån laïc.  Laøm tieâu baûn teá baøo soáng [5] Loaïi tieâu baûn naøy duøng ñeå xem hình daïng, kích thöôùc vaø söï saép xeáp caùc teá baøo, khaû naêng hình thaønh baøo töû. • Caùch tieán haønh: Laáy moät phieán kính khoâ vaø saïch ñaët leân giaù ñôõ, nhoû moät gioït nöôùc caát leân giöõa phieán kính. Duøng que caáy laáy moät ít VSV moïc treân moâi tröôøng ñaëc MPA hoaø nheï vaøo gioït nöôùc treân phieán kính ñeå taïo huyeàn phuø. Ñaäy nheï laù kính ñeå traùnh taïo thaønh boït khí. Duøng giaáy thaám huùt löôïng nöôùc thöøa ôû quanh laù kính. Moïi thao taùc phaûi ôû caïnh ngoïn löûa ñeøn coàn, vaø moïi duïng cuï phaûi ñöôïc laøm saïch, voâ truøng. Sau ñoù ñaët tieâu baûn leân baøn kính vaø quan saùt vôùi vaät kính 40X. 2.3.4. Phöông phaùp xaùc ñònh söï sinh tröôûng cuûa vi khuaån theo maät ñoä quang [11], [25] • Nguyeân taéc: Phöông phaùp xaùc ñònh noàng ñoä teá baøo baèng maùy so maøu quang hoïc ñöôïc söû duïng roäng raõi. Cô sôû cuûa phöông phaùp naøy laø tính chaát haáp phuï hoaëc laøm leäch moät phaàn aùnh saùng cuûa caùc dung dòch coù vaät chaát lô löûng. Ñeå ñaùnh giaù toác ñoä phaùt trieån cuûa vi khuaån ta coù theå ño söï taêng sinh khoái qua giaù trò OD (Optical Density) ôû böôùc soùng 620nm (OD620). • Caùch tieán haønh: Sau khi nuoâi caáy vi khuaån trong moâi tröôøng loûng vôùi caùc ñieàu kieän phuø hôïp vôùi muïc ñích thí nghieäm treân maùy laéc, thì laáy dòch sau nuoâi caáy ño OD baèng maùy so maøu ôû böôùc soùng 620nm. Taát caû dòch nuoâi caáy ñeàu ñöôïc pha loaõng 10 laàn tröôùc khi ño OD620. 2.3.5. Phöông phaùp nghieân cöùu khaû naêng phaân huyû tinh boät [17], [20] Söû duïng phöông phaùp ñuïc loã treân ñóa thaïch. • Nguyeân taéc: Enzym ngoaïi baøo α-amylase coù khaû naêng phaân huyû tinh boät taïo ra ñöôøng, maø tinh boät laø moät polysaccharide coù caáu truùc khoâng gian töông ñoái phöùc taïp. Khi moâi tröôøng chöùa tinh boät ñöôïc nhuoäm baèng iod, iod ñöôïc giöõ laïi trong caáu truùc maïng khoâng gian cuûa tinh boät vaø laøm cho moâi tröôøng coù maøu xanh ñaäm. Neáu VSV coù khaû naêng phaân giaûi tinh boät thì caáu truùc khoâng gian cuûa tinh boät bò phaù vôõ, neân xuaát hieän voøng phaân giaûi trong suoát. • Caùch tieán haønh: Nuoâi vi khuaån treân moâi tröôøng caûm öùng sinh toång hôïp amylase daïng loûng ôû 37oC treân maùy laéc vôùi cheá ñoä laéc 200 voøng/phuùt. Sau 36- 40h laáy caùc dòch nuoâi ñoù ñem ly taâm vôùi cheá ñoä 5000 voøng/phuùt trong 15 phuùt ñeå thu dòch enzym. Tieáp theo, ñoå moâi tröôøng ñaëc thöû hoaït tính amylase coù chöùa 1% tinh boät ñaõ ñöôïc khöû truøng vaøo ñóa petri, chôø cho moâi tröôøng nguoäi vaø ñoâng laïi. Sau ñoù duøng khuyeân ñuïc loã (ñöôøng kính khoaûng 1cm) ñaõ ñöôïc khöû truøng ñeå ñuïc loã treân beà maët moâi tröôøng taïo thaønh caùc gieáng. Duøng pipet Man huùt dòch enzym nhoû vaøo caùc gieáng trong ñóa petri. Goùi ñóa laïi vaø ñaët vaøo tuû laïnh 3-4h ñeå dòch trong gieáng khueách taùn ñeàu, sau ñoù ñaët vaøo tuû aám 34oC. Sau 24h duøng dung dòch Lugol ñoå leân moâi tröôøng coù chöùa tinh boät. Neáu coù enzym amylase thì xuaát hieän vuøng chöa bò phaân giaûi coù maøu xanh möïc, vaø vuøng trong suoát xung quanh gieáng laø do tinh boät bò phaân giaûi bôûi amylase. Tieán haønh ñaùnh giaù khaû naêng sinh amylase baèng caùch ño ñöôøng kính voøng phaân giaûi tinh boät cuûa amylase. 2.3.6. Phöông phaùp xaùc ñònh hoaït ñoä α- amylase theo Heinkel, 1956 [7] • Nguyeân taéc Amylase xuùc taùc phaûn öùng thuyû giaûi tinh boät thaønh ñöôøng (ñöôøng ñôn, ñöôøng ñoâi, hay dextrin phaân töû lôùn). Löôïng tinh boät coøn laïi phaûn öùng maøu vôùi iod. Xaùc ñònh löôïng tinh boät bò thuyû giaûi, töø ñoù suy ra hoaït ñoä amylase theo ñònh nghóa: Hoaït ñoä amylase ñöôïc bieåu thò laø soá mg tinh boät bò thuyû giaûi bôûi 1ml dòch enzym (hay 1mg nguyeân lieäu chöùa enzym) trong 1 phuùt ôû ñieàu kieän chuaån laø 500C, pH=6. • Hoaù chaát Dung dòch NaH2PO4 0,05M Dung dòch Na2HPO4 0,05M Dung dòch ñeäm phosphate 0,05M pH 6: troän 87,7ml dung dòch NaH2PO4 0,05M vaø 12,3ml dung dòch Na2HPO4 0,05M theâm 100ml nöôùc caát, ño laïi pH. Dung dòch tinh boät 1% pha trong pH 6: laáy 50ml dung dòch ñeäm phosphate 0,05M pH 6 ñem ñun soâi. Caân 1g tinh boät tan, hoaø vaøo moät ít ñeäm, khuaáy ñeàu, ñoå vaøo dung dòch ñeäm ñang soâi, vöøa khuaáy vöøa ñun soâi trong 3 phuùt cho ñeán khi dung dòch trong suoát. Ñònh möùc tôùi 100ml baèng dung dòch ñeäm. Dung dòch iod: 1g I2 vaø 2g KI, theâm nöôùc thaønh 100ml, baûo quaûn laïnh. Khi duøng pha loaõng 500 laàn. Dung dòch HCl 1N: 8,4ml HCl ñaäm ñaëc pha thaønh 100ml. Dung dòch HCl 0,1N: pha loaõng töø dung dòch HCl 1N. • Tieán haønh thí nghieäm Döïng ñöôøng chuaån tinh boät OÁng nghieäm 1 2 3 4 5 6 Tinh boät 1% (ml) 0 1 2 3 4 5 Dung dòch ñeäm (ml) 10 9 8 7 6 5 Haøm löôïng tinh boät (mg/ml) 0 1 2 3 4 5 - Huùt 1ml dung dòch töø caùc oáng nghieäm, theâm vaøo 5ml dung dòch I2KI ñaõ pha loaõng 500 laàn. Ñem so maøu ôû böôùc soùng 560nm. -Veõ ñoà thò töông quan giöõa haøm löôïng tinh boät vaø giaù trò ΔOD. Phaûn öùng enzym Thöû thaät (3 oáng) Thöû khoâng (3 oáng) Tinh boät 1% (ml) 5 5 Dung dòch enzym (ml) 0,5 0 Ñeå oån nhieät ôû 500C, 10 phuùt Dung dòch HCl 0,1N (ml) 5 5 Dung dòch enzym (ml) 0 0,5 - Huùt 1ml dung dòch töø caùc oáng nghieäm treân, theâm vaøo moãi oáng 5ml dung dòch I2KI ñaõ pha loaõng. - Laéc ñeàu, ñem ño OD taïi böôùc soùng 560nm. • Coâng thöùc tính: hoaït ñoä α-amylase trong 1ml dòch enzym HñA vt KVX * ** = Trong ñoù: X: soá mg tinh boät suy ra töø ñöôøng chuaån. V: toång theå tích hoãn hôïp phaûn öùng enzym (10,5ml). t: thôøi gian enzym phaûn öùng (10 phuùt). v: theå tích enzym cho vaøo hoãn hôïp phaûn öùng enzym (0,5ml). K: heä soá pha loaõng. 2.3.7. Caùc phöông phaùp nghieân cöùu xaùc ñònh ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu [5], [12], [14], [20], [21], [45]. Khaû naêng sinh tröôûng vaø sinh amylase khoâng chæ phuï thuoäc vaøo chuûng gioáng VSV maø ñieàu kieän nuoâi caáy cuõng aûnh höôûng raát nhieàu. Do ñoù chuùng toâi tieán haønh caùc thí nghieäm sau ñeå xaùc ñònh caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu ñeå chuûng nghieân cöùu sinh tröôûng vaø sinh amylase toát nhaát. 2.3.7.1. Loaïi cô chaát Tieán haønh nuoâi caáy chuûng ñaõ choïn trong moâi tröôøng sinh toång hôïp amylase coù chaát caûm öùng khaùc nhau: boät gaïo, boät myø, boät baép, tinh boät tan ôû nhieät ñoä 37oC vôùi cheá ñoä laéc 200 voøng/phuùt. Sau moãi moác thôøi gian: 20h, 30h, 40h, 45h, 50h, 55h, 60h, 70h ño OD620 xaùc ñònh khaû naêng sinh tröôûng, vaø ly taâm loaïi boû sinh khoái ôû 5000 v/p ._.|||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 146 GATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGA 205 Query 181 TGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 206 TGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTA 265 Query 241 GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 266 GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG 325 Query 301 AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 326 AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG 385 Query 361 TGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAAT 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 386 TGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAAT 445 Query 421 AGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCA 473 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 446 AGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCA 498 KEÁT LUAÄN Bacillus subtilis TP. Hoà Chí Minh, ngaøy 17 thaùng 04 naêm 2009 TRÖÔÛNG PHOØNG y = 24.035x R2 = 0.9996 0 1 2 3 4 5 6 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 Delta OD H aøm lö ôïn g tin h bo ät (m g/ m l) 1. ÑOÀ THÒ CHUAÅN TINH BOÄT ÑEÅ XAÙC ÑÒNH HOAÏT ÑOÄ AMYLASE (THEO PHÖÔNG PHAÙP HEINKEL) Baûng 1.1. Döïng ñöôøng chuaån tinh boät OÁng soá 1 2 3 4 5 6 Haøm löôïng tinh boät (mg/ml) 0 1 2 3 4 5 OD (560nm) 0,002 0,044 0,086 0,126 0,171 0,208 Delta OD 0 0,042 0,084 0,124 0,169 0,206 Ñoà thò 1.1. Söï töông quan giöõa ΔOD560nm vaø haøm löôïng tinh boät (mg/ml) 2. Xaùc ñònh hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK Baûng 2. So saùnh hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK Soá laàn ño Chuûng 1 2 3 Trung bình Sai soá Delta OD 0,208 0,197 0,213 0,206 0,005 Löôïng tinh boät(mg/ml) 4,999 4,735 5,119 4,951 0,114 CK 1 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 10,50 9,94 10,75 10,398 0,239 Delta OD 0,321 0,315 0,325 0,320 0,003 Löôïng tinh boät(mg/ml) 7,715 7,571 7,811 7,699 0,070 CK 2 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 16,20 15,90 16,40 16,168 0,147 Delta OD 0,184 0,178 0,18 0,181 0,002 Löôïng tinh boät(mg/ml) 4,422 4,278 4,326 4,342 0,042 CK 3 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 9,29 8,98 9,09 9,119 0,089 3. Nghieân cöùu caùc ñieàu kieän aûnh höôûng tôùi khaû naêng sinh toång hôïp α – amylase cuûa chuûng CK2. Baûng 3.1. AÛnh höôûng loaïi cô chaát laø boät gaïo ñeán hoaït ñoä amylase Soá laàn ño Thôøi gian (h) 1 2 3 Trung bình Sai soá Delta OD 0,045 0,042 0,045 0,044 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 1,082 1,009 1,082 1,058 0,024 20 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 2,271 2,120 2,271 2,221 0,050 Delta OD 0,083 0,082 0,083 0,083 0,0003 Löôïng tinh boät(mg/ml) 1,995 1,971 1,995 1,987 0,008 30 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 4,189 4,139 4,189 4,172 0,017 Delta OD 0,128 0,127 0,130 0,128 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 3,076 3,052 3,125 3,084 0,021 40 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 6,461 6,410 6,562 6,477 0,045 Delta OD 0,166 0,165 0,163 0,165 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 3,990 3,966 3,918 3,958 0,021 45 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 8,379 8,328 8,227 8,311 0,045 Delta OD 0,160 0,165 0,164 0,163 0,002 Löôïng tinh boät(mg/ml) 3,846 3,966 3,942 3,918 0,037 50 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 8,076 8,328 8,278 8,227 0,077 Delta OD 0,160 0,158 0,158 0,159 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 3,846 3,798 3,798 3,814 0,016 55 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 8,076 7,975 7,975 8,008 0,034 Delta OD 0,151 0,152 0,156 0,153 0,002 Löôïng tinh boät(mg/ml) 3,629 3,653 3,749 3,677 0,037 60 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 7,621 7,672 7,874 7,722 0,077 Delta OD 0,144 0,138 0,142 0,141 0,002 Löôïng tinh boät(mg/ml) 3,461 3,317 3,413 3,397 0,042 70 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 7,268 6,965 7,167 7,134 0,089 Baûng 3.2. AÛnh höôûng loaïi cô chaát laø boät myø ñeán hoaït ñoä amylase Soá laàn ño Thôøi gian (h) 1 2 3 Trung bình Sai soá Delta OD 0,077 0,074 0,076 0,076 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 1,851 1,779 1,827 1,819 0,021 20 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 3,886 3,735 3,836 3,819 0,045 Delta OD 0,099 0,102 0,104 0,102 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 2,379 2,452 2,500 2,444 0,035 30 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 4,997 5,148 5,249 5,131 0,073 Delta OD 0,131 0,129 0,129 0,130 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 3,149 3,101 3,101 3,117 0,016 40 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 6,612 6,511 6,511 6,545 0,034 Delta OD 0,151 0,155 0,150 0,152 0,002 Löôïng tinh boät(mg/ml) 3,629 3,725 3,605 3,653 0,037 45 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 7,621 7,823 7,571 7,672 0,077 Delta OD 0,150 0,148 0,150 0,149 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 3,605 3,557 3,605 3,589 0,016 50 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 7,571 7,470 7,571 7,537 0,034 Delta OD 0,148 0,147 0,148 0,148 0,0003 Löôïng tinh boät(mg/ml) 3,557 3,533 3,557 3,549 0,008 55 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 7,470 7,420 7,470 7,453 0,017 Delta OD 0,147 0,143 0,145 0,145 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 3,533 3,437 3,485 3,485 0,028 60 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 7,420 7,218 7,319 7,319 0,058 Delta OD 0,132 0,130 0,129 0,130 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 3,173 3,125 3,101 3,133 0,021 70 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 6,663 6,562 6,511 6,578 0,045 Baûng 3.3. AÛnh höôûng loaïi cô chaát laø boät baép ñeán hoaït ñoä amylase Soá laàn ño Thôøi gian (h) 1 2 3 Trung bình Sai soá Delta OD 0,079 0,077 0,077 0,078 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 1,899 1,851 1,851 1,867 0,016 20 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 3,987 3,886 3,886 3,920 0,034 Delta OD 0,126 0,122 0,128 0,125 0,002 Löôïng tinh boät(mg/ml) 3,028 2,932 3,076 3,012 0,042 30 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 6,360 6,158 6,461 6,326 0,089 Delta OD 0,158 0,159 0,162 0,160 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 3,798 3,822 3,894 3,838 0,029 40 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 7,975 8,025 8,177 8,059 0,061 Delta OD 0,202 0,205 0,200 0,202 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 4,855 4,927 4,807 4,863 0,035 45 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 10,196 10,347 10,095 10,212 0,073 Delta OD 0,200 0,199 0,203 0,201 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 4,807 4,783 4,879 4,823 0,029 50 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 10,095 10,044 10,246 10,128 0,061 Delta OD 0,197 0,196 0,199 0,197 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 4,735 4,711 4,783 4,743 0,021 55 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 9,943 9,893 10,044 9,960 0,045 Delta OD 0,182 0,184 0,180 0,182 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 4,374 4,422 4,326 4,374 0,028 60 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 9,186 9,287 9,085 9,186 0,058 Delta OD 0,168 0,167 0,167 0,167 0,0003 Löôïng tinh boät(mg/ml) 4,038 4,014 4,014 4,022 0,008 70 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 8,480 8,429 8,429 8,446 0,017 Baûng 3.4. AÛnh höôûng loaïi cô chaát laø tinh boät tan ñeán hoaït ñoä amylase Soá laàn ño Thôøi gian (h) 1 2 3 Trung bình Sai soá Delta OD 0,098 0,096 0,098 0,097 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 2,355 2,307 2,355 2,339 0,016 20 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 4,946 4,845 4,946 4,913 0,034 Delta OD 0,144 0,148 0,148 0,147 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 3,461 3,557 3,557 3,525 0,032 30 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 7,268 7,470 7,470 7,403 0,067 Delta OD 0,202 0,205 0,203 0,203 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 3,461 3,485 3,461 3,469 0,008 40 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 10,196 10,347 10,246 10,263 0,045 Delta OD 0,293 0,297 0,295 0,295 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 4,374 4,422 4,326 4,374 0,028 45 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 14,789 14,991 14,890 14,890 0,058 Delta OD 0,288 0,290 0,293 0,290 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 6,922 6,970 7,042 6,978 0,035 50 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 14,536 14,637 14,789 14,654 0,073 Delta OD 0,285 0,285 0,287 0,286 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 6,850 6,850 6,898 6,866 0,016 55 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 14,385 14,385 14,486 14,419 0,034 Delta OD 0,276 0,274 0,270 0,273 0,002 Löôïng tinh boät(mg/ml) 6,634 6,586 6,489 6,570 0,042 60 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 13,931 13,830 13,628 13,796 0,089 Delta OD 0,246 0,249 0,249 0,248 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 5,913 5,985 5,985 5,961 0,024 70 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 12,416 12,568 12,568 12,517 0,050 Baûng 3.5. AÛnh höôûng noàng ñoä tinh boät tan ñeán hoaït ñoä amylase Soá laàn ño noàng ñoä tinh boät tan (%) 1 2 3 Trung bình Sai soá Delta OD 0,184 0,186 0,186 0,185 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 4,422 4,471 4,471 4,454 0,016 0,5 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 9,287 9,388 9,388 9,354 0,034 Delta OD 0,267 0,266 0,261 0,265 0,002 Löôïng tinh boät(mg/ml) 6,417 6,393 6,273 6,361 0,045 1,0 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 13,476 13,426 13,174 13,359 0,094 Delta OD 0,322 0,326 0,325 0,324 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 7,739 7,835 7,811 7,795 0,029 1,5 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 16,252 16,454 16,404 16,370 0,061 Delta OD 0,281 0,283 0,280 0,281 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 6,754 6,802 6,730 6,762 0,021 2,0 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 14,183 14,284 14,133 14,200 0,045 Delta OD 0,188 0,185 0,188 0,187 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 4,519 4,446 4,519 4,495 0,024 2,5 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 9,489 9,338 9,489 9,439 0,050 Baûng 3.6. Nhieät ñoä aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase Soá laàn ño Nhieät ñoä (0C) 1 2 3 Trung bình Sai soá Delta OD 0,279 0,277 0,275 0,277 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 6,706 6,658 6,610 6,658 0,028 25-28 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 14,082 13,981 13,880 13,981 0,058 Delta OD 0,411 0,415 0,412 0,413 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 9,878 9,975 9,902 9,918 0,029 30-33 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 20,745 20,947 20,795 20,829 0,061 Delta OD 0,632 0,635 0,634 0,634 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 15,190 15,262 15,238 15,230 0,021 35-37 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 31,899 32,051 32,000 31,983 0,045 Delta OD 0,565 0,560 0,562 0,562 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 13,580 13,460 13,508 13,516 0,035 38-40 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 28,518 28,265 28,366 28,383 0,073 Delta OD 0,476 0,474 0,478 0,476 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 11,441 11,393 11,489 11,441 0,028 40-42 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 24,025 23,924 24,126 24,025 0,058 Delta OD 0,371 0,371 0,377 0,373 0,002 Löôïng tinh boät(mg/ml) 8,917 8,917 9,061 8,965 0,048 42-45 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 18,726 18,726 19,029 18,827 0,101 Baûng 3.7. AÛnh höôûng cuûa pH ban ñaàu Soá laàn ño pH 1 2 3 Trung bình Sai soá Delta OD 0,021 0,024 0,023 0,023 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 0,505 0,577 0,553 0,545 0,021 5,0 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 1,060 1,211 1,161 1,144 0,045 Delta OD 0,032 0,030 0,034 0,032 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 0,769 0,721 0,817 0,769 0,028 5,5 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 1,615 1,514 1,716 1,615 0,058 Delta OD 0,176 0,177 0,176 0,176 0,000 Löôïng tinh boät(mg/ml) 4,230 4,254 4,230 4,238 0,008 6,0 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 8,883 8,934 8,883 8,900 0,017 Delta OD 0,298 0,298 0,290 0,295 0,003 Löôïng tinh boät(mg/ml) 7,162 7,162 6,970 7,098 0,064 6,5 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 15,041 15,041 14,637 14,907 0,135 Delta OD 0,477 0,478 0,472 0,476 0,002 Löôïng tinh boät(mg/ml) 11,465 11,489 11,345 11,433 0,0457,0 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 24,076 24,126 23,823 24,009 0,094 Delta OD 0,545 0,546 0,550 0,547 0,002 Löôïng tinh boät(mg/ml) 13,099 13,123 13,219 13,147 0,037 7,5 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 27,508 27,559 27,760 27,609 0,077 Delta OD 0,311 0,308 0,310 0,310 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 7,475 7,403 7,451 7,443 0,021 8,0 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 15,697 15,546 15,647 15,630 0,045 Delta OD 0,101 0,096 0,098 0,098 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 2,428 2,307 2,355 2,363 0,035 8,5 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 5,098 4,845 4,946 4,963 0,073 Baûng3.8. AÛnh höôûng cuûa ñoä hieáu khí ñeán hoaït ñoä amylase Soá laàn ño Theå tích dòch nuoâi caáy (ml) 1 2 3 Trung bình Sai soá Delta OD 0,327 0,324 0,324 0,325 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 7,859 7,787 7,787 7,811 0,02450 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 16,505 16,353 16,353 16,404 0,050 Delta OD 0,440 0,443 0,444 0,442 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 10,575 10,648 10,672 10,631 0,02975 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 22,208 22,360 22,410 22,326 0,061 Delta OD 0,558 0,560 0,558 0,559 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 13,412 13,460 13,412 13,428 0,016100 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 28,164 28,265 28,164 28,198 0,034 Delta OD 0,329 0,328 0,326 0,328 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 7,908 7,883 7,835 7,875 0,021150 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 16,606 16,555 16,454 16,538 0,045 Delta OD 0,264 0,264 0,266 0,265 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 6,345 6,345 6,393 6,361 0,016200 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 13,325 13,325 13,426 13,359 0,034 Delta OD 0,215 0,210 0,213 0,213 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 5,168 5,047 5,119 5,111 0,035250 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 10,852 10,599 10,751 10,734 0,073 Delta OD 0,182 0,184 0,184 0,183 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 4,374 4,422 4,422 4,406 0,016300 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 9,186 9,287 9,287 9,253 0,034 Baûng 3.9. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä NaCl Soá laàn ño NaCl (%) 1 2 3 Trung bình Sai soá Delta OD 0,081 0,085 0,084 0,083 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 1,947 2,043 2,019 2,003 0,029 0 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 4,088 4,290 4,240 4,206 0,061 Delta OD 0,231 0,234 0,234 0,233 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 5,552 5,624 5,624 5,600 0,024 0,03 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 11,659 11,811 11,811 11,760 0,050 Delta OD 0,388 0,385 0,388 0,387 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 9,326 9,253 9,326 9,302 0,024 0,05 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 19,584 19,432 19,584 19,533 0,050 Delta OD 0,806 0,805 0,806 0,806 0,000 Löôïng tinh boät(mg/ml) 19,372 19,348 19,372 19,364 0,008 0,08 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 40,682 40,631 40,682 40,665 0,017 Delta OD 0,662 0,666 0,663 0,664 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 15,911 16,007 15,935 15,951 0,029 0,1 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 33,413 33,615 33,464 33,498 0,061 Delta OD 0,525 0,527 0,525 0,526 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 12,618 12,666 12,618 12,634 0,016 0,12 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 26,499 26,600 26,499 26,532 0,034 Baûng 3.10. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä CaCl2 Soá laàn ño %CaCl2 1 2 3 Trung bình Sai soá Delta OD 0,481 0,485 0,483 0,483 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 11,561 11,657 11,609 11,609 0,0280 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 24,278 24,480 24,379 24,379 0,058 Delta OD 0,568 0,565 0,565 0,566 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 13,652 13,580 13,580 13,604 0,0240,01 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 28,669 28,518 28,518 28,568 0,050 Delta OD 0,455 0,458 0,456 0,456 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 10,936 11,008 10,960 10,968 0,0210,015 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 22,965 23,117 23,016 23,033 0,045 Delta OD 0,404 0,405 0,408 0,406 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 9,710 9,734 9,806 9,750 0,0290,02 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 20,391 20,442 20,593 20,475 0,061 Delta OD 0,378 0,373 0,375 0,375 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 9,085 8,965 9,013 9,021 0,0350,025 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 19,079 18,827 18,928 18,944 0,073 4. Nghieân cöùu ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men chuûng CK2 trong bình tam giaùc 1 lít. Baûng 4. Hoaït ñoä amylase trong quaù trình nghieân cöùu ñoäng hoïc Soá laàn ño Thôøi gian (h) 1 2 3 Trung bình Sai soá Delta OD 0,385 0,388 0,387 0,387 0,001 Löôïng tinh boät (mg/ml) 9,253 9,326 9,302 9,294 0,021 20 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 19,432 19,584 19,533 19,516 0,045 Delta OD 0,421 0,425 0,424 0,423 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 10,119 10,215 10,191 10,175 0,029 30 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 21,249 21,451 21,401 21,367 0,061 Delta OD 0,504 0,508 0,505 0,506 0,001 Löôïng tinh boät(mg/ml) 12,114 12,210 12,138 12,154 0,029 35 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 25,439 25,641 25,489 25,523 0,061 Delta OD 0,639 0,640 0,644 0,641 0,002 Löôïng tinh boät(mg/ml) 15,358 15,382 15,479 15,406 0,037 40 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 32,253 32,303 32,505 32,354 0,077 Delta OD 0,880 0,885 0,885 0,883 0,002 Löôïng tinh boät(mg/ml) 21,151 21,271 21,271 21,231 0,040 45 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 44,417 44,669 44,669 44,585 0,084 Delta OD 0,871 0,875 0,878 0,875 0,002 Löôïng tinh boät(mg/ml) 20,934 21,031 21,103 21,023 0,049 50 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 43,962 44,164 44,316 44,147 0,102 Delta OD 0,849 0,853 0,855 0,852 0,002 Löôïng tinh boät(mg/ml) 20,406 20,502 20,550 20,486 0,042 55 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 42,852 43,054 43,155 43,020 0,089 Delta OD 0,797 0,803 0,808 0,803 0,003 Löôïng tinh boät(mg/ml) 19,156 19,300 19,420 19,292 0,076 60 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 40,227 40,530 40,783 40,513 0,160 Delta OD 0,751 0,756 0,757 0,755 0,002 Löôïng tinh boät(mg/ml) 18,050 18,170 18,194 18,138 0,045 70 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 37,906 38,158 38,208 38,091 0,094 5. Hoaït ñoä cuûa CPE amylase thu ñöôïc bôûi caùc taùc nhaân tuûa Baûng 5. Hoaït ñoä cuûa CPE amylase (UI/g CPE) thu ñöôïc bôûi caùc taùc nhaân tuûa Soá laàn ño Taùc nhaân tuûa 1 2 3 Trung bình Sai soá Delta OD 0,861 0,867 0,864 0,864 0,002 Löôïng tinh boät (mg/ml) 20,694 20,838 20,766 20,766 0,042etanol 960C Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 10864 10940 10902 10902,28 21,86 Delta OD 0,678 0,675 0,674 0,676 0,001 Löôïng tinh boät (mg/ml) 16,296 16,224 16,200 16,240 0,029aceton Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 8555,3 8517,4 8504,8 8525,82 15,17 Delta OD 0,314 0,318 0,313 0,315 0,002 Löôïng tinh boät (mg/ml) 7,547 7,6431 7,523 7,571 0,037sulphate amon Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 3962,2 4012,6 3949,6 3974,79 19,27 6. Ñoä beàn nhieät cuûa CPE amylase Baûng 6. Ñoä beàn nhieät cuûa CPE amylase Soá laàn ño Nhiệt ñoä (0C) 1 2 3 Trung bình Sai soá Delta OD 0,876 0,879 0,868 0,874 0,003 Löôïng tinh boät (mg/ml) 21,055 21,127 20,862 21,015 0,0794 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 11053,70 11091,55 10952,75 11032,67 41,43 Delta OD 0,873 0,872 0,876 0,874 0,001 Löôïng tinh boät (mg/ml) 20,983 20,959 21,055 20,999 0,02930 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 11015,84 11003,22 11053,70 11024,25 15,17 Delta OD 0,848 0,849 0,845 0,847 0,001 Löôïng tinh boät (mg/ml) 20,382 20,406 20,310 20,366 0,02940 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 10700,38 10713,00 10662,53 10691,97 15,17 Delta OD 0,809 0,812 0,81 0,810 0,001 Löôïng tinh boät (mg/ml) 19,444 19,516 19,468 19,476 0,02150 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 10208,27 10246,12 10220,88 10225,09 11,13 Delta OD 0,766 0,769 0,771 0,769 0,001 Löôïng tinh boät (mg/ml) 18,411 18,483 18,531 18,475 0,03560 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 9665,68 9703,53 9728,77 9699,32 18,33 Delta OD 0,696 0,698 0,696 0,697 0,00170 Löôïng tinh boät 16,728 16,776 16,728 16,744 0,016 (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 8782,39 8807,63 8782,39 8790,80 8,41 Delta OD 0,313 0,318 0,314 0,315 0,002 Löôïng tinh boät (mg/ml) 7,523 7,6431 7,547 7,571 0,03780 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 3949,55 4012,64 3962,17 3974,79 19,27 Delta OD 0,009 0,006 0,006 0,007 0,001 Löôïng tinh boät (mg/ml) 0,216 0,1442 0,1442 0,168 0,02490 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 113,57 75,71 75,71 88,33 12,62 100 Delta OD 0 0 0 0 0,00 7. Ñoä beàn pH cuûa CPE amylase Baûng 7. Ñoä beàn pH cuûa CPE amylase Soá laàn ño pH 1 2 3 Trung bình Sai soá Delta OD 0,056 0,056 0,058 0,057 0,001 Löôïng tinh boät (mg/ml) 1,346 1,346 1,394 1,362 0,0164,0 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 706,63 706,63 731,87 715,04 8,41 Delta OD 0,333 0,332 0,335 0,333 0,001 Löôïng tinh boät (mg/ml) 8,004 7,980 8,052 8,012 0,0214,5 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 4201,92 4189,30 4227,16 4206,13 11,13 Delta OD 0,662 0,664 0,662 0,663 0,0015,0 Löôïng tinh boät (mg/ml) 15,911 15,959 15,911 15,927 0,016 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 8353,36 8378,60 8353,36 8361,78 8,41 Delta OD 0,805 0,809 0,807 0,807 0,001 Löôïng tinh boät (mg/ml) 19,348 19,444 19,396 19,396 0,0285,5 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 10157,7 9 10208,2 7 10183,0 3 10183,03 14,57 Delta OD 0,903 0,905 0,903 0,904 0,001 Löôïng tinh boät (mg/ml) 21,704 21,752 21,704 21,720 0,0166,0 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 11394,3 9 11419,6 3 11394,3 9 11402,81 8,41 Delta OD 0,848 0,845 0,844 0,846 0,001 Löôïng tinh boät (mg/ml) 20,382 20,310 20,286 20,326 0,0296,5 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 10700,3 8 10662,5 3 10649,9 1 10670,94 15,17 Delta OD 0,736 0,738 0,735 0,736 0,001 Löôïng tinh boät (mg/ml) 17,690 17,738 17,666 17,698 0,0217,0 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 9287,12 9312,36 9274,51 9291,33 11,13 Delta OD 0,664 0,668 0,667 0,666 0,001 Löôïng tinh boät (mg/ml) 15,959 16,055 16,031 16,015 0,0297,5 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 8378,60 8429,07 8416,46 8408,04 15,17 Delta OD 0,464 0,461 0,466 0,464 0,001 Löôïng tinh boät (mg/ml) 11,152 11,080 11,200 11,144 0,0358,0 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) 5854,93 5817,07 5880,16 5850,72 18,33 Lôøi Caûm Ôn დ Toâi xin chaân thaønh baøy toû loøng bieát ôn saâu saéc ñeán: PGS.TS. Löông Ñöùc Phaåm ñaõ taän tình höôùng daãn, luoân ñoäng vieân vaø taïo moïi ñieàu kieän toát nhaát cho toâi hoaøn thaønh luaän vaên naøy. დ Toâi xin gôûi lôøi caûm ôn chaân thaønh ñeán: TS. Traàn Thanh Thuyû vaø caùc Caùn boä phoøng thí nghieäm Vi sinh - Sinh hoaù – Tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm TP. HCM. Quyù Thaày, Coâ tröïc tieáp giaûng daïy. Phoøng Khoa hoïc Coâng ngheä Sau ñaïi hoïc - Tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm TP. HCM. Ban Giaùm hieäu – Tröôøng THPT Nguyeãn Traõi vaø Tröôøng THPT chuyeân Leâ Quyù Ñoân – tænh Ninh Thuaän. Caùc Caùn boä phoøng thí nghieäm Sinh hoaù – Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc Töï nhieân. Vaø caùc baïn beø, ñoàng nghieäp. Ñaõ truyeàn ñaït kieán thöùc, chia seû, ñoäng vieân tinh thaàn vaø taïo moïi ñieàu kieän giuùp ñôõ toâi trong thôøi gian hoïc taäp vaø thöïc hieän ñeà taøi. დ Cuoái cuøng toâi xin ghi nhaän tình caûm yeâu thöông cuûa nhöõng ngöôøi thaân trong gia ñình, luoân uûng hoä, ñoäng vieân toâi vöôït qua nhöõng khoù khaên trong cuoäc soáng cuõng nhö trong coâng taùc. NGUYEÃN THÒ HOAØNG HAÛI CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT TRONG LUAÄN VAÊN B. subtilis : Bacillus subtilis CPE : Cheá phaåm enzym ÑVHÑ : Ñôn vò hoaït ñoä OD : Giaù trò maät ñoä quang Delta OD : Hieäu soá giaù trò maät ñoä quang VSV : Vi sinh vaät DANH MUÏC CAÙC BAÛNG Trang Baûng 1.1. Ñoä beàn nhieät cuûa α-amylase töø caùc nguoàn khaùc nhau…………………………. 17 Baûng 3.1. Ñöôøng kính phaân giaûi tinh boät cuûa 3 chuûng CK…………….…………………………44 Baûng 3.2. Söï sinh tröôûng cuûa 3 chuûng CK………………………………………………………….………...45 Baûng 3.3. So saùnh hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK…………………………………………………46 Baûng 3.4. Moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng CK2…………………………………………………49 Baûng 3.5. AÛnh höôûng loaïi cô chaát ñeán hoaït ñoä amylase……………………………………..……50 Baûng 3.6. Noàng ñoä tinh boät tan aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase…………………..…….52 Baûng 3.7. Nhieät ñoä aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase………………………………………….………53 Baûng 3.8. AÛnh höôûng pH ban ñaàu ñeán hoaït ñoä amylase………………………………….….……54 Baûng 3.9. AÛnh höôûng cuûa ñoä hieáu khí ñeán hoaït ñoä amylase……………………….………..55 Baûng 3.10. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä muoái NaCl ñeán hoaït ñoä amylase…….………..57 Baûng 3.11. AÛnh höôûng noàng ñoä CaCl2 ñeán hoaït tính amylase……………………………….58 Baûng 3.12. Noàng ñoä NaCl cao nhaát öùc cheá sinh tröôûng…………………………………….………59 Baûng 3.13. Nghieân cöùu ñoäng hoïc quaù trình leân men Bacillus subtilis CK2……….61 Baûng 3.14. Thu nhaän cheá phaåm enzym (CPE) amylase töø caùc taùc nhaân tuûa…….62 Baûng 3.15. Hoaït ñoä cuûa CPE amylase khi duøng caùc taùc nhaân tuûa……….………….…63 Baûng 3.16. Ñoä beàn nhieät cuûa amylase………………………………………………………….…………..…...64 Baûng 3.17 . Ñoä beàn pH cuûa amylase………………………..………………………………………………………66 DANH MUÏC CAÙC HÌNH, ÑOÀ THÒ VAØ BIEÅU ÑOÀ Trang Hình 1.1. Caáu truùc phaân töû α-amylase……………………………………………………………………………..16 Hình 3.1. Voøng phaân giaûi tinh boät cuûa 3 chuûng CK……………………….…………………………..44 Hình 3.2. Hình thaùi khuaån laïc chuûng CK2……………………………………………………………………..47 Hình 3.3. Hình thaùi teá baøo chuûng CK2…………………………………………………………………………….48 Hình 3.4. Baøo töû cuûa chuûng CK2……………………………………………………………………………………….48 Hình 3.5. Trình töï 16S-rARN cuûa chuûng CK2……………………………………………………………..60 Ñoà thò 3.1. So saùnh söï sinh tröôûng cuûa 3 chuûng CK…………………………………………………….45 Ñoà thò 3.2. AÛnh höôûng caùc loaïi cô chaát ñeán hoaït ñoä amylase………………………………..51 Ñoà thò 3.3. Ñoäng hoïc quaù trình nuoâi caáy B. subtilis CK2 sinh α-amylase…….…….61 Bieåu ñoà 3.1. So saùnh hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK…………………………………….…….46 Bieåu ñoà 3.2. Noàng ñoä tinh boät tan aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase…………..………53 Bieåu ñoà 3.3. Nhieät ñoä aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase………………………………..….………54 Bieåu ñoà 3.4. AÛnh höôûng pH ban ñaàu ñeán hoaït ñoä amylase…………………………….…….…55 Bieåu ñoà 3.5. AÛnh höôûng cuûa ñoä hieáu khí ñeán hoaït ñoä amylase………………….….……..56 Bieåu ñoà 3.6. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä NaCl ñeán hoaït ñoä amylase………………………..57 Bieåu ñoà 3.7. AÛnh höôûng noàng ñoä CaCl2 ñeán hoaït tính amylase…………………………….58 Bieåu ñoà 3.8. Noàng ñoä NaCl cao nhaát öùc cheá sinh tröôûng…………………………………….……59 Bieåu ñoà 3.9. Hieäu suaát thu nhaän CPE amylase bôûi caùc taùc nhaân tuûa khaùc nhau……….62 Bieåu ñoà 3.10. Hoaït ñoä cuûa CPE amylase khi duøng caùc taùc nhaân tuûa…………….….…63 Bieåu ñoà 3.11. Ñoä beàn nhieät cuûa amylase…………………………………………………………………………64 Bieåu ñoà 3.12. Ñoä beàn pH cuûa amylase………………………….…………………………………………………66 MUÏC LUÏC Trang Trang phuï bìa Lôøi caùm ôn Muïc luïc Caùc chöõ vieát taét trong luaän vaên Danh muïc caùc baûng Danh muïc caùc hình veõ, ñoà thò vaø bieåu ñoà Môû ñaàu……………………..…………………………………………………………………………………………………….……………1 Chöông 1: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU…………………………………………………………….……………….4 1.1. Giống vi khuaån Bacillus ………………………………………………………………………………….……………..4 1.2. Khaùi quaùt chung veà enzym ………………………………………………………………………….………………..8 1.2.1. Enzym caûm öùng. ………………………………………………………………………….………………….………9 1.2.2. Baûn chaát sinh hoïc cuûa enzym. ……………………………………………………………….….………9 1.2.3. Baûn chaát hoaù hoïc cuûa enzym……………………………………………………….………….……….10 1.2.4. Tính chaát hoaù hoïc cuûa enzym……………………………………………………….………….………11 1.2.5. Caáu truùc enzym. ……………………………………………………………….….……………………………….11 1.2.6. Cô cheá taùc duïng cuûa enzym…………………………………………….…………….……….…………11 1.2.7. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán vaän toác phaûn öùng enzym……………………………..12 1.3. Heä enzym amylase………………………………………………………………………….………………………………15 1.3.1. Giôùi thieäu enzym α – amylase. ……………………………………………………………………….15 1.3.2 Nguoàn thu nhaän enzym amylase……………………………………………………………………….18 1.3.3 Moät soá yeáu toá aûnh höôûng ñeán sinh toång hôïp amylase cuûa VSV……….…19 1.3.4. Taùch chieát enzym töø caùc nguoàn nguyeân lieäu…………………….……………………….22 1.3.5 ÖÙng duïng cuûa amylase trong thöïc teá saûn xuaát vaø ñôøi soáng …………….……23 Chương II: VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU……………………….27 2.1 Vaät lieäu……………………………………………………………………………………………………………………………….27 2.2. Caùc moâi tröôøng ñöôïc söû duïng.………………………………………………………………………………28 2.3. Caùc phöông phaùp nghieân cöùu………………………………………………………………………………….28 2.3.1. Phöông phaùp phaân laäp caùc chuûng Bacillus töø ñaát vöôøn qua coû khoâ….28 2.3.2. Phöông phaùp giöõ gioáng caáy chuyeàn……………………………………….….………………...29 2.3.3. Moät soá phöông phaùp nghieân cöùu ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa Bacillus…….29 2.3.4. Phöông phaùp xaùc ñònh söï sinh tröôûng theo maät ñoä quang……………………..32 2.3.5. Phöông phaùp nghieân cöùu khaû naêng phaân huyû tinh boät……………………………32 2.3.6. Phöông phaùp xaùc ñònh hoaït ñoä α- amylase theo Heinkel, 1956………….33 2.3.7. Caùc phöông phaùp nghieân cöùu xaùc ñònh ñieàu kieän nuoâi caáy………………….35 2.3.8. Phöông phaùp phaân loaïi ñeå xaùc ñònh loaøi ……………………………………….….……….37 2.3.9. Phöông phaùp nghieân cöùu ñoäng hoïc……………………………………….….………………….38 2.3.10. Phöông phaùp thu nhaän dòch chieát enzym amylase töø moâi tröôøng…….39 2.3.11. Phöông phaùp thu nhaän CPE α – amylase……………………………………………………39 2.3.12. Xaùc ñònh hoaït ñoä CPE amylase thu ñöôïc töø caùc taùc nhaân tuûa……………41 2.3.13. Xaùc ñònh ñoä beàn cuûa CPE amylase……………………………………….….…………………41 2.3.14. Phöông phaùp xöû lyù soá lieäu thöïc nghieäm……………………………………….……………42 CHƯƠNG III: KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN………………………………………………………..46 3.1. Phaân laäp, tuyeån choïn caùc chuûng coù hoaït tính amylase cao…………………..….44 3.2. Xaùc ñònh söï sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK……………..…45 3.3. Moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng CK2…………………………………………………..……47 3.4. Nghieân cöùu caùc ñieàu kieän sinh toång hôïp amylase…………….……………………………49 3.4.1. Loaïi cô chaát …………………………………………………………………………………………………………..49 3.4.2. AÛnh höôûng noàng ñoä tinh boät tan………………………………………………………………………52 3.4.3. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä …………………………………………………………………………………..53 3.4.4. AÛnh höôûng cuûa pH ban ñaàu.……………………………………….…………………………………….54 3.4.5. AÛnh höôûng cuûa ñoä hieáu khí……………………………………………………………………………….55 3.4.6. AÛnh höôûng cuûa caùc loaïi muoái……………………………………………………………………………56 3.4.7. Noàng ñoä NaCl cao nhaát öùc cheá sinh tröôûng………………………………………………..59 3.5. Xaùc ñònh teân cuûa chuûng CK2 ñaõ tuyeån choïn……………………………………………………60 3.6. Nghieân cöùu ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men…………………………………………………..60 3.7. Taùch enzym töø dòch nuoâi caáy, xaùc ñònh hoaït ñoä vaø ñoä beàn cuûa enzym…62 3.7.1. Taùch enzym töø dòch nuoâi caáy vôùi caùc taùc nhaân tuûa khaùc nhau…………….62 3.7.2. Hoaït ñoä cuûa CPE amylase thu ñöôïc bôûi caùc taùc nhaân tuûa…………………….63 3.7.3. Xaùc ñònh ñoä beàn nhieät cuûa CPE amylase…………………………………………..……….64 3.7.4. Xaùc ñònh ñoä beàn pH cuûa CPE amylase……………………………………………………..…65 Chương IV: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ……………………………………………………….…..67 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO…………………………………………………………………………………………….…..69 PHUÏ LUÏC…………………………………………………………………………………………………………………………………73 ._.