Nghiên cứu thu nhận Enzym Amylase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

c tập và tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu, hồn thành luận văn này. Tơi xin ghi nhớ cơng ơn tất cả Quý Thầy Cơ trong Khoa Sinh, và trong phịng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hĩa, Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành cơng việc nghiên cứu thực hiện luận văn. Xin chân thành cảm ơn các bạn học viên Cao học khĩa 17 và 18 ngành Vi sinh vật học, Trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong suốt quá trình tiến hành thực nghiệm. Cuối cùng tơi xin gởi lời biết ơn đến Ba Má, hai em và bạn bè đã luơn yêu thương và ủng hộ tơi vượt qua những khĩ khăn trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2010 NGUYỄN THỊ THANH BÌNH LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Những số liệu, kết quả trong luận văn này là hồn tồn trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kì cơng trình nào khác. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh Bình DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMC Carboxymethy cellulose dd Dung dịch DNS 3, 5 – dinitrosalicylic acid Hđamylase Hoạt độ amylase HST Hệ sinh thái KL Khuẩn lạc KS Kháng sinh MT Mơi trường NS Nấm sợi NXB Nhà xuất bản OD Optical density (mật độ quang) PTN Phịng thí nghiệm RNM Rừng ngập mặn SV Sinh vật VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật MỞ ĐẦU Amylase là một loại enzym thủy phân tinh bột quan trọng nhất trong cơng nghệ sinh học. Nĩ cĩ khả năng phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside, α-1,6 glucoside của amylose và amilopectin, làm tăng tốc độ đường hĩa tinh bột của nguyên liệu giúp các phản ứng xảy ra nhanh chĩng, rút ngắn thời gian hình thành sản phẩm. Amylase thu nhận từ VSV nĩi chung, từ NS nĩi riêng cĩ nhiều ưu điểm nổi bật hơn các loại amylase từ thực vật và động vật như: hoạt tính enzym cao hơn, khả năng chịu nhiệt cao, thời gian thu enzym nhanh, giá thành rẻ, cĩ thể sản xuất ở quy mơ cơng nghiệp với nguồn nguyên liệu đơn giản và rẻ tiền. Với những ưu thế nổi trội, NS trở thành nguồn nguyên liệu dồi dào, đầy hứa hẹn cho ngành cơng nghiệp sản xuất enzym. Do đĩ, trong vịng 50 năm trở lại đây, các chế phẩm enzym từ NS đã dần thay thế enzym từ động vật. Các chủng NS sinh amylase cao như: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Rhizopus,... Với phạm vi ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: cơng nghệ thực phẩm, dược phẩm, cơng nghệ lên men, cơng nghiệp dệt nên khối lượng chế phẩm amylase được sản xuất hàng năm trên thế giới lên tới hàng chục vạn tấn và ngày một gia tăng. Chính vì vậy, việc tìm kiếm các chủng NS sinh amylase cao luơn thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trong và ngồi nước. Trong quá trình tìm kiếm ấy, con người luơn quan tâm đến NS sống trong các hệ sinh thái đặc biệt. Nằm giữa đất liền và biển cả, RNM Cần Giờ cĩ mơi trường sống vốn khắc nghiệt, mang tính cạnh tranh cao, làm tăng khả năng sinh các chất cĩ hoạt tính sinh học giúp SV thích nghi tốt với điều kiện sống. Nơi đây lưu trữ, bảo tồn nguồn tài nguyên thiên nhiên vơ cùng quý giá của vùng ven biển nhiệt đới từ thực vật, động vật và cả VSV. Hơn nữa, Việt Nam là nước cĩ nguồn tinh bột và phụ phẩm nơng nghiệp khá dồi dào là điều kiện thuận lợi để ứng dụng amylase thu nhiều sản phẩm. Cĩ thể nĩi cho đến nay, sự hiểu biết về khu hệ NS ở RNM và vai trị của chúng trong hệ sinh thái này cịn quá ít và chưa đầy đủ. Trước thực tế này, nhằm đa dạng hĩa nguồn enzym từ các NS, cũng như mong muốn thu nhận được các chủng NS mang đặc tính quý, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận enzym amylase của một số chủng NS phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”.  Mục tiêu đề tài Tuyển chọn và khảo sát được một số chủng NS sinh α-amylase và glucoamylase cao từ RNM Cần Giờ Tp. Hồ Chí Minh  Nhiệm vụ của đề tài - Phân lập các chủng NS thu nhận từ RNM Cần Giờ. - Khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase các chủng NS phân lập được - Tuyển chọn 2 chủng sinh amylase cao tiếp tục khảo sát - Phân loại đến chi các chủng NS đã tuyển chọn - Khảo sát các điều kiện sinh trưởng của 2 chủng NS tuyển chọn - Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình thu nhận amylase - Thu nhận chế phẩm amylase thơ và so sánh với enzym thương mại trên thị trường. - Khảo sát các đặc tính sinh học khác  Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng là các chủng NS phân lập từ các mẫu đất, thân, lá cây, …ở RNM Cần Giờ - Phạm vi nghiên cứu gồm 5 xã: Bình Khánh, Tam Thơn Hiệp, An Thới Đơng, Long Hịa, Lý Nhơn thuộc RNM huyện Cần Giờ.  Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài - Thời gian: Từ tháng 8/2009 – 7/ 2010 - Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại PTN Vi sinh - Sinh hĩa, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Tp. Hồ Chí Minh Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. KHÁI QUÁT VỀ RNM CẦN GIỜ TP. HỒ CHÍ MINH 1.1.1. Đặc điểm các nhân tố sinh thái cơ bản RNM Cần Giờ là một hệ sinh thái ngập mặn cĩ vai trị và vị trí đặc biệt quan trọng đối với MT và cộng đồng dân cư địa phương trong vùng. Là rừng mới tái sinh nhưng RNM Cần Giờ là Khu Dự trữ Sinh quyển đầu tiên tại Việt Nam với hệ thực vật và động vật rất phong phú mang tính đa dạng sinh học cao [34], [39]. Hình 1.1. Rừng ngập mặn Cần Giờ Về vị trí địa lý khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu hệ thống sơng Đồng Nai – Sài Gịn nằm ở cửa ngõ Đơng Nam Tp. Hồ Chí Minh. Tọa độ: 10°22’ – 10°40’ độ vĩ Bắc và 106°46’ – 107°01’ kinh độ Đơng. Cách trung tâm Tp. Hồ Chí Minh khoảng 70km, phía Bắc Cần Giờ giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đơng, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đơng giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Chiều dài khu vực từ Bắc xuống Nam là 35 km, từ Đơng sang Tây là 30 km [39]. Ở RNM Cần Giờ, nhiệt độ trung bình là 25,80C, biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5 – 70C. Khí hậu nĩng ẩm và chịu sự chi phối của quy luật giĩ mùa xích đạo. Nhiệt độ khơng khí cĩ ảnh hưởng khá lớn đến sinh trưởng, phát triển của sinh vật RNM. Chapman (1977) cho rằng RNM chỉ phát triển khi biên độ nhiệt ở tháng lạnh nhất cao hơn 200C, và biên độ dao động theo mùa khơng quá 100C [36], [34], [39]. Trong các nhân tố khí hậu ở RNM thì lượng mưa là nhân tố quan trọng. Ở đây, mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khơ từ tháng 1 đến tháng 4. Lượng mưa trung bình từ 1300 đến 1400 mm hàng năm. Độ ẩm cao hơn các nơi khác trong khu vực Tp.Hồ Chí Minh: mùa mưa là 70 – 83%, mùa khơ là 74 – 77%; ẩm nhất vào tháng 9, khơ nhất vào tháng 4. Lượng nước bốc hơi bình quân 4mm/ ngày và 1204mm/tháng [34]. Ngồi ra, giĩ cũng là nhân tố tác động tới sự phân bố của thực vật RNM qua sự ảnh hưởng tới độ thốt hơi nước và tác động tới sự phát tán bào tử VSV [36]. Đất Cần Giờ được cấu tạo bởi quá trình trầm tích sét, quá trình phèn hố, quá trình nhiễm mặn đồng thời nĩ được phát triển trên một đầm mặn mới do phù sa sơng Sài Gịn và sơng Đồng Nai mang đến lắng đọng tạo thành nền bùn ngập mặn. Độ mặn của nước ở Cần Giờ phụ thuộc rất nhiều yếu tố như giĩ mùa, thuỷ triều, mưa, nước dâng và đặc biệt chịu ảnh hưởng rõ rệt từ nguồn nước ngọt ở thượng nguồn chảy xuống (do hoạt động của hồ Trị An, Dầu Tiếng…) đã làm thay đổi qui luật hoạt động nhiễm mặn ở Cần Giờ. Độ mặn nơi đây dao động 1,8 – 3%. Độ mặn là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, tỉ lệ sống của các lồi cây ngập mặn và phân bố của RNM. Hầu hết cây ngập mặn sinh trưởng tốt ở nước cĩ độ mặn từ 25% đến 50% độ mặn nước biển. Nhiều ý kiến cho rằng, muối là nhân tố quan trọng, tác động thơng qua quá trình chọn lọc tự nhiên thích nghi, tạo điều kiện để cây ngập mặn tồn tại, phát triển [36]. RNM Cần Giờ chịu tác động của chế độ bán nhật triều khơng đều của biển Đơng. Mỗi tháng cĩ khoảng 2 ngày nhật triều khơng đều xuất hiện 2-3 ngày trước, giữa và cuối tháng âm lịch. Mực nước trung bình cao nhất thường xuất hiện vào tháng 10, 11 và thấp nhất vào tháng 6, 7 [39]. Chế độ bán nhật triều với biên độ triều cao là một trong những nhân tố thuận lợi cho RNM sinh trưởng so với vùng cĩ nhật triều. Các dịng hải lưu ở đây là nhân tố chính giúp phát tán quả, hạt, trụ mầm và SV dọc theo các vùng ven biển. 1.1.2. Đặc điểm của các khu hệ SV tại RNM Cần Giờ RNM Cần Giờ cĩ hệ SV vơ cùng đa dạng và phong phú, trong đĩ cĩ nhiều lồi đem lại những giá trị kinh tế cao. Về thực vật: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ cĩ trên 150 lồi thực vật, các lồi chủ yếu như Bần trắng, Mấm trắng, các quần hợp Đước đơi - Bần trắng cùng Xu, Ổi, Trang, Đưng… Các loại cây nước lợ như Bần chua, các quần hợp Mái dầm – ơrơ, dừa lá, ráng… Thảm cỏ biển với các lồi ưu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp [66]. Động vật: bao gồm động vật thủy sinh khơng xương sống với trên 700 lồi, khu hệ cá trên 130 lồi, 9 lồi lưỡng thê, 31 lồi bị sát, 4 lồi cĩ vú. Trong đĩ cĩ 11 lồi bị sát cĩ tên trong sách đỏ Việt Nam như: tắc kè (Gekko gekko), kỳ đà nước (Varanus salvator), trăn đất (Python molurus), trăn gấm (Python reticulatus) … Khu hệ chim cĩ khoảng 130 lồi thuộc 47 họ, 17 bộ [66]. Thảm động thực vật nơi này trở thành nguồn cung cấp thức ăn và nơi trú ngụ cho rất nhiều lồi thủy sinh, các động vật cĩ xương sống và hệ VSV. Vi sinh vật rất đa dạng gồm cĩ: vi khuẩn, nấm, tảo  Vi khuẩn VK cùng với nấm tạo nên một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái RNM. Là những SV phân huỷ, chúng đĩng vai trị trung tâm về mặt chức năng trong hệ sinh thái này. Số lượng VK trong rừng ngập mặn chiếm tỉ lệ khá cao, đặc biệt là trong trầm tích các quần thể VK dị dưỡng nhiều gấp 2-3 lần lớp nước trên mặt, các quần thể trên nền bùn lớn gấp vài lần trên nền cát. Nhiều lồi sống trên các giá thể bề mặt rắn bằng chất nhầy dính bám. Do đĩ, VK cĩ thể tạo nên một bề mặt mỏng trên mặt bùn tạo điều kiện cho các lồi tảo, cỏ biển và cây ngập mặn phát triển [36].  Nấm Khu hệ nấm trong RNM nhiều và rất đa dạng, phần lớn là vi nấm, chỉ cĩ một số lồi cĩ kích thước lớn. Nấm đĩng vai trị quan trọng trong RNM, cùng với VK chúng gĩp phần phân huỷ nhanh xác lá thực vật (Fell và cộng sự, 1975). Người ta cĩ thể phân loại nấm dựa trên mơi trường RNM: trên tán cây, trên thân, rễ hơ hấp và trong đất, nhưng cũng cĩ một số lồi cĩ thể sống được từ hai MT trở lên [36]. Người ta tìm thấy trên lá cây ngập mặn cĩ các lồi nấm ký sinh và hoại sinh như: Ascomycetes, Bacidomycetes và Deuteromycetes. Người ta đã tìm thấy 6 chi nấm cĩ mặt trên lá cây Đước đỏ (R. mangle) khi cịn trên cây: Cladosporium, Pestalotia, Alternaria, Zygosporium, Penicillium và Aureobacidium [36]. Các chi nấm ký sinh và hoại sinh sống trên lá cây ngập mặn thường gây bệnh cho các cây chủ như: Pestalotia, Phyllosticta, Cladosporium và Cercospora. Hầu hết các lồi nấm trên đất liền đều cĩ trên lá cây ngập mặn, cịn các lồi nấm biển thì cĩ trên rễ hoặc phần gỗ ngâm trong nước mặn. Khi cây chết thì gỗ phân huỷ tạo điều kiện thuận lợi cho các loại nấm phân huỷ phát triển. Các mẫu gỗ để ngâm trong nước biển cĩ tỉ lệ phân huỷ cao hơn những vùng chỉ ngập khi triều cao [36] Đối với lá cây ngập mặn thì nấm là sinh vật phân huỷ đầu tiên nhờ khả năng phân giải cellulose, lignin. Fell và Masters (1973) đã nghiên cứu tồn bộ quá trình phân hủy của lá cây ngập mặn đồng thời phân lập được 66 chi nấm, đại diện là các chi Phycomycetes, Thraustochytrium, Aspergillus, Penicillium, Tricoderma, Fusarium… Đa số các loại nấm được phân lập trên lá, gỗ và cây con thường là nấm hoại sinh gĩp phần phân huỷ xác thực vật. Chúng cịn gĩp phần phân huỷ cỏ biển, bùn và đầm lầy mặn. Những lồi này chịu được điều kiện mặn của RNM [36].  Tảo Tảo mọc ở RNM thường làm thành lớp phủ màu hồng, nâu hoặc lục nhạt phát triển trên các MT: bề mặt bùn, bề mặt thân cây, rễ, những cành và tán phía trên. Trong đĩ trên bề mặt bùn gồm cả tảo đơn bào, tảo đa bào mà chủ yếu là tảo xanh lục. Người ta liệt kê cĩ khoảng 41 lồi tảo silic trên mặt bùn quần xã RNM; Chúng khơng hình thành trên các vùng rõ ràng mà tùy thuộc vào độ ngập triều [36]. Tảo bùn cĩ tầm quan trọng trong kinh tế đất vì nĩ làm tăng hàm lượng hữu cơ trong đất nhờ quá trình quang hợp. Tảo cịn tạo ra độ thống khí giữa các hạt đất, tiết ra các chất nhầy hình thành phức hệ keo, tảo xanh lục dị dưỡng làm tăng hàm lượng đạm cho đất nhờ khả năng cố định đạm [36]. Các SV trong RNM làm nên sự đa dạng sinh học của các quần xã RNM, chúng là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một nhân tố khơng thể thiếu trong chu trình chuyển hĩa vật chất ở RNM Cần Giờ. 1.1.3. Vai trị của RNM đối với hệ sinh thái RNM cĩ liên quan mật thiết với các đầm lầy mặn, các bãi bùn, bãi cỏ ven biển hoặc các quần xã cửa sơng khác. Dịng nước ngọt đổ từ thượng nguồn ra biển, dịng nước triều từ biển lên xuống các vùng cửa sơng đều đi qua RNM. Các dịng nước này vận chuyển vật chất, SV từ quần xã này tới quần xã khác và như vậy hệ sinh thái RNM chính là nơi giao lưu của các quần xã, tạo nên sự phong phú về thành phần SV cho nơi này [36]. Hệ thực vật RNM bao gồm các lồi thực vật (Sú, Vẹt, Mắm, Đước, Bần,…) sống trong vùng nước mặn, hệ rễ của cây gĩp phần vào việc làm giảm tốc độ dịng chảy của thủy triều, tạo điều kiện lắng đọng bùn, các vật chất lơ lửng, chúng gĩp phần bảo vệ vùng ven bờ; cung cấp các giá trị về lâm sản như than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc,…Bên cạnh đĩ, hệ thực vật cịn đĩng vai trị quan trọng trong việc điều hịa khí hậu, cung cấp chất hữu cơ để tăng năng suất cho vùng ven biển [34]. RNM cịn là nơi kiếm ăn, sinh sản và cư trú của nhiều lồi hải sản cĩ giá trị kinh tế cao như tơm, cua, cá,... Mới đây, Bell và cộng sự (1984) khẳng định RNM là vườn ươm quan trọng cho các lồi cá sống ở cửa sơng. Khi so sánh thành phần các lồi cá và tơm trong một vùng cĩ RNM vào các mùa vụ trong năm đều thấy lượng con non của các lồi này đều cao hơn hẳn các vùng đất, cát ở ngồi đầm. Từ đây cho thấy RNM là nơi nuơi dưỡng chính cho con non của nhiều lồi hải sản [36] Các lồi động thực vật, VSV sống trong MT tự nhiên của RNM Cần Giờ liên kết với nhau thơng qua các quá trình trao đổi chất và đồng hĩa năng lượng nhằm khép kín chu trình dinh dưỡng của hệ sinh thái này. Các quá trình nội tại như cố định năng lượng, tích lũy sinh khối, phân hủy vật chất hữu cơ và chu trình dinh dưỡng đều chịu sự ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các nhân tố bên ngồi như: thủy triều, nhiệt độ và lượng mưa. RNM phát triển tốt nhất ở nước cĩ nồng độ muối 15 - 25‰ [36] Tuy nhiên, hiện nay RNM đang cĩ những thay đổi đáng kể trước áp lực của việc đánh bắt cá, tơm,… khai thác gỗ, củi, nhiên liệu, nuơi trồng thủy sản, du lịch… Sự tác động này nếu quản lý khơng tốt thì các vùng đất RNM sẽ bị suy thối và khơng thể tồn tại lâu bền. 1.2. TỔNG QUAN VỀ NẤM SỢI 1.2.1. Đặc điểm sinh học của NS NS là VSV cĩ nhân chuẩn. Hệ nấm cĩ cấu tạo khuẩn ty dạng sợi, sợi nấm (hypha) là những ống dài phân nhánh hay khơng phân nhánh, cĩ hay khơng cĩ vách ngăn ngang (septum), đường kính sợi từ 3-3,5 µm. Các sợi nấm phát triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) hay cịn gọi là khuẩn ty thể [58]. Cấu trúc sợi nấm gồm cĩ thành tế bào, màng, tế bào chất và nhân. Thành tế bào NS chứa kitin-cellulose hoặc kitin-glucan [58]. Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm. Khuẩn lạc NS thường cĩ dạng hình trịn hoặc gần trịn. Bề mặt KL cĩ thể mượt, nhẵn bĩng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, cĩ những vết khứa xuyên tâm hoặc lồ lõm khơng đều. Mép KL trơn, răng cưa [60] Một số sợi nấm cĩ thể tiết sắc tố vào MT hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm. Các đặc điểm hình thái khác cĩ tính đặc trưng cho lồi như bĩ sợi, bĩ giá, thể quả, hạch nấm, giọt tiết, sắc tố hịa tan [58],... Phương thức dinh dưỡng của NS là hấp phụ qua màng, khơng cĩ cơ quan tiêu hĩa, khơng cĩ khả năng quang hợp. Đa phần là các cơ thể hoại sinh, một số kí sinh, một số gây bệnh trên người và động thực vật. Hình1.2. Cấu trúc sợi nấm NS sinh sản chủ yếu bằng bào từ, bào tử cĩ thể hình thành theo kiểu vơ tính hoặc hữu tính. Bào tử vơ tính gồm các dạng bào tử trần hay bào tử kín, trong đĩ bào tử trần là phổ biến nhất. Trong sinh sản hữu tính, NS cĩ các hình thức đẳng giao, dị giao và tiếp hợp [59]. NS được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất cĩ hoạt tính sinh học như: enzym, các chất KS, các axit hữu cơ được ứng dụng rộng rãi và đem lại lợi ích kinh tế cao. Bên cạnh đĩ, từ NS cịn cĩ các chất cĩ khả năng phân giải nguồn cacbonhydro ứng dụng trong xử lý ơ nhiễm MT do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong lịng đất [1], [57], [59].  Khả năng sinh các enzym ngoại bào NS đã trở thành nguồn VSV chủ yếu dùng trong việc sản xuất enzym. Hiện nay, từ NS người ta đã sản xuất được trên 80 loại enzym khác nhau, trong đĩ cĩ 10 enzym được ứng dụng rộng rãi trong kỹ thuật. Một số enzym ngoại bào từ NS được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như cellulase, protease, amylase, pectinase và chitinase [21], [26], [29].  Cellulase là enzym xúc tác phân giải các hợp chất lingo –cellulose thành glucose. Ligno-cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật gồm cellulose (30-40%), hemi- cellulose và lignin (15-30%). Các chủng NS Trichoderma, Penicillium, Aspergillus…cĩ khả năng sinh enzym cellulase được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, làm phân bĩn, xử lý chất thải hữu cơ, các xác bã thực vật chứa cellulose ở RNM [21].  Protease là enzym thủy phân các phân tử protein tạo thành các chuỗi polypeptide ngắn. NS cĩ khả năng phân giải mạnh protein chứa trong các xác bã động vật ở RNM thường gặp thuộc các chi Aspergillus, Penicillium,…Protease cịn được sử dụng nhiều trong cơng nghiệp bột Hình1.3: Hình thái khuẩn ty NS Hình1.4 Hình thái khuẩn lạc NS Hình1.5: Hình thái một số dạng bào tử của NS giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác nhau như cơng nghiệp dược, cơng nghiệp thuộc da, cơng nghiệp thực phẩm, xử lý chất thải...[29].  Amylase là enzym xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ chủ yếu của thực vật thành đường glucose. Tổ hợp phức hệ enzym amylase (α-amylase, β-amylase và glucoamylase) sẽ cắt đứt các liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucpside trong phân tử tinh bột để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose. NS cĩ khả năng phân giải tinh bột nhanh chĩng là những tác nhân khơng thể thiếu ở RNM như Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor… Amylase được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất sirơ, sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, trong chế biến thực phẩm gia súc, trong cơng nghiệp dệt....[21].  Chitinase là các biopolymer chứa các gốc N-acetyl-glucozamin liên kết với nhau bởi mối liên kết β-1,4-glucoside. Trong RNM, lượng kitin trong xác, vỏ tơm, cua, ốc rất nhiều. Nhiều lồi NS thuộc chi Trichoderma, Glycladium, Chaetomium,… cĩ khả năng sinh chitinase, giúp tăng cường khả năng tiêu diệt các lồi nấm gây bệnh và chống các lồi cơn trùng cĩ vỏ kitin. [21]. Các chủng NS thuộc chi Acremonium, Aspergillus, Penicillium cịn cĩ khả năng sinh các enzym phân giải dầu gĩp phần xử lý ơ nhiễm dầu giúp bảo vệ MT tự nhiên và SV sống ở RNM Cần Giờ [35].  Khả năng sinh KS của NS KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện trượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình cĩ tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác. Các chất KS cĩ nguồn gốc từ NS chiếm tỷ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp nấm bất tồn. Chất KS được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephalo-sporin-C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, viêm màng phổi, bạch cầu, uốn ván. Trong phẫu thuật, chúng được dùng để chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương [11]. Chất KS được sinh ra nếu kết hợp với các enzym thủy phân protein là một trong những phương thức cĩ nhiều triển vọng nâng cao hiệu quả điều trị của KS. Những vấn đề về chất KS được sinh ra từ VSV đang là mối quan tâm hàng đầu và phát triển mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực cuộc sống ngày nay [11]. Ngồi ra, trước nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều trong cơng nghệ thực phẩm, cơng nghệ chế biến mủ cao su, trong cơng nghiệp nhẹ và cả trong y học. Axit hữu cơ sản xuất từ NS được nghiên cứu nhiều hơn: Năm 2004, Võ Thị Hạnh nghiên cứu sản xuất axit citric bằng NS Aspergillus niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì; các nhà khoa học Nhật Bản tổng hợp chất kích thích sinh trưởng Giberrelin từ hai chủng F. monoforme và F. oxysporum [29]. Bên cạnh những lợi ích trên, nhiều lồi NS là nguyên nhân gây hư hỏng hoặc giảm chất lượng của thực phẩm, dụng cụ quang học,... Một số NS tiết độc tố gây ngộ độc hoặc cĩ thể gây ung thư. Ví dụ: A. flavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư gan. Một số NS gây bệnh cho người và động vật như hen suyễn, bạch huyết, nấm chân tay…, bệnh nấm rỉ sắt ở thực vật, bệnh vàng lùn, thối cổ bơng ở lúa…[6], [7]. 1.2.2. Vị trí phân loại Cho đến nay, người ta ước tính trong tự nhiên cĩ khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu lồi nấm nhưng mới định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 lồi. Trung Quốc đã điều tra được 40.000 lồi. Riêng các lồi nấm thuộc lớp Nấm bất tồn ở nước ta hiện chỉ mới phát hiện được 338 lồi thuộc 306 chi khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004). Việc phân loại NS chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, nuơi cấy, một số đặc điểm sinh lý, sinh hĩa và phương thức sinh sản [6]. Về phân loại nấm, hiện nay cĩ hai hệ thống phân loại nấm được sử dụng phổ biến hơn cả là: Hệ thống phân loại hình thái học và hệ thống phân loại phát sinh, với nhiều khĩa phân loại được sử dụng như: Barron G.L (1968), Ellis M.B (1971), Barnett và cộng sự (1972), Ainsworth G.C và cộng sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Kendrich (1992), Ainsworth & Bisby (1995). Trong luận văn này, chúng tơi phân loại nấm dựa vào các đặc điểm mơ tả theo hệ thống phân loại của Ainsworth và cộng sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984, 2004), Nguyễn Lân Dũng (2006) [57]. Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ của sinh học phân tử đã đem lại phương pháp mới cho việc nghiên cứu phân loại học. Người ta sử dụng phương pháp nhân gen và giải trình tự gen (PCR-Plymerase Chain Reaction) để thu được kết quả phân loại nhanh và chính xác [40]. 1.2.3. Tình hình nghiên cứu khu hệ NS ở RNM nĩi chung và NS sinh amylase ở RNM nĩi riêng. Hiện nay cĩ khoảng 800 – 1000 lồi nấm biển được định loại (Hawkswworth et al., 1995 ; Jones, 1995), trong khi đĩ một số lượng lớn các lồi nấm trên đất liền đã được phân loại. Sự hiểu biết về nấm RNM và vai trị của chúng đối với khu hệ sinh thái này cịn quá ít và chưa đầy đủ. Cĩ thể nĩi đây là một mảng rỗng của ngành VSV học (Agate A.D., Subraramnian, C. V and Anuci, V, 1998) [43]. Sự nghiên cứu về nấm RNM chỉ được các nhà nấm học quan tâm từ năm 1950. Những năm đầu, việc nghiên cứu xác định tính đa dạng của nấm trong RNM cịn rất lẻ tẻ, nhưng sau này các nhà khoa học đã thành lập hội nghiên cứu nấm tồn thế giới trong đĩ cĩ nấm biển ở RNM. Nhiều nước trên thế giới đã và đang tích cực nghiên cứu phân loại và hệ thống hĩa các lồi nấm biển cĩ mặt ở vùng RNM của họ. Ví dụ : Ấn Độ đã phân loại được 170 lồi, Hồng Kơng 170 lồi, Đài Loan 7 lồi, Singapore 156 lồi, Nhật 26 lồi, Úc 67 lồi, Mexico 94 lồi, Đức 4 lồi, Thái Lan 83 lồi,…[49] Năm 1979, Kohlmeyer phân lập 42 lồi vi nấm RNM thuộc các ngành phụ Ascomycotina, Deuteromycotina và Basidiomycotina Năm 1987, Hype và cộng sự cơng bố phát hiện được 89 lồi nấm từ cây Rhizophora mucronata lanak ở RNM Ấn Độ [48]. Năm 1988, Agate A. D., Subramania C. V và Vanuci M., đã nêu ra 8 lĩnh vực nghiên cứu cấp bách của VSV ở RNM cần các nhà khoa học giải quyết, trong đĩ cĩ sự phân loại, hệ thống hĩa cơ bản các lồi VSV của RNM trên thế giới [43]. Năm 1990, Hyde đã liệt kê 120 lồi nấm RNM trên tồn thế giới. Trong đĩ bao gồm 87 lồi thuộc Ascomycetes, 31 lồi thuộc Deuteromycetes và 2 lồi thuộc Basidiomycetes. Năm 1994, Newell S.Y phân lập được các lồi nấm nhày (Oomycetes) ưa mặn từ lá cây mục ở RNM, cĩ khả năng phân hủy xác động vật, thực vật ở đĩ. Năm 1995, Hyde và Lee ; Kohlmeyer et al., đưa ra nhận định các nấm RNM đĩng vai trị quan trọng đối với các chu trình tuần hồn vật chất trong hệ sinh thái RNM. Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ cĩ một thơng báo của Mai Thị Hằng và cộng sự về nấm sợi RNM Giao Thủy, Nam Định. Năm 2001, tác giả này tiếp tục nghiên cứu khả năng sinh enzym ngoại bào của 144 chủng phân lập từ RNM Giao Thủy. Năm 2002, Mai Thị Hằng nghiên cứu khả năng diệt cơn trùng và khả năng phân giải cacbuahydro của nấm sợi RNM ở hai tỉnh Nam Định, Thái Bình [52]. Với rừng RNM, những phát hiện khoa học đầy thú vị chưa dừng lại ở đĩ. Các nghiên cứu VSV trong RNM ven biển đồng bằng sơng Hồng và Cần Giờ (2001-2003) đã chứng minh được: ở các hệ sinh thái RNM này cĩ tới 83/199 chủng nấm cĩ khả năng phân giải dầu mỏ ở các mức độ khác nhau. Đĩ là các lồi NS thuộc một số chi Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Paecilomyces, Canninghamela cĩ khả năng phân giải dầu DO rất mạnh [69]. Theo nhĩm nghiên cứu của Phan Nguyên Hồng và Nguyễn Hồng Trí, những chất thải rắn trong sinh hoạt, y tế, cơng nghiệp, nơng nghiệp cùng với các hĩa chất dư thừa từ nội địa theo sơng ra RNM được giữ lại và nhờ VSV phân hủy, biến chúng thành thức ăn cho hệ sinh vật ở đây, làm trong sạch nước biển. Chính vì thế “người ta đã ví RNM là quả thận khổng lồ lọc các chất thải cho MT vùng ven biển” [69]. Năm 2004, Phan Thị Phương Hoa nghiên cứu phân loại 67 chủng NS thuộc chi Aspergillus phân lập từ RNM Nam Định và Thái Bình. Đây là một nghiên cứu được đánh giá cao trong số các nghiên cứu về NS ở RNM Việt Nam [8]. Đến năm 2007 mới cĩ tác giả Khưu Phương Yến Anh“Nghiên cứu khả năng sinh enzym cellulase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ” [1] Năm 2009, cĩ tác giả Nguyễn Thị Bích Viên “Khảo sát một số đặc tính sinh học của một số chủng NS thuộc chi Aspergillus và Penicillium phân lập được từ RNM Cần Giờ” [41]. Bên cạnh việc tìm kiếm những chủng NS mới ở RNM, người ta cịn nghiên cứu các đặc tính sinh học của chủng này. Ví dụ, để thu nhận amylase thì dùng các chủng Aspergillus, Rhizopus. Một số lồi của Neurospora, Mucor tổng hợp rất mạnh cả hai loại α-amylase và glucoamylse (Rodzevits, Butova 1965, Fennkxova. Rư-zakova 1966 ; Phillips, Caldwell 1951. Corman Lanalu-ke, 1948) [17]. Một số cơng trình nghiên cứu của Azarova (1981) ; Jerebtxov, Pankratove (1977) cho thấy glucoamylase cĩ khả năng thủy phân hồn tồn tinh bột, glucogen, amylopectin dextrin cuối tới glucose [17]. Năm 2001, nhà khoa học Nhật Bản B.N. Okolo đã tiến hành tinh sạch và xác định một số tính chất của amylase phân giải tinh bột sống mới từ A. cacbonarius Năm 2008, tạp chí khoa học United States Patent Application cĩ đăng cơng trình “Nghiên cứu về α-amylase ngoại bào của chi Aspergillus” của Baldwin, Toby M, …cho thấy sự liên quan giữa việc sinh α- amylase và glucoamylase của chi nấm này [15]. Tại Việt Nam, năm 1974, tác giả D. V Hợp nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase từ A. niger. Năm 1977, tác giả L. V. Chứ, Đ. T. T Thu nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase với đối tượng A. awamorii . Đến năm 1984, N. B Ngà và N. L Dũng nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc các lồi A. oryzae, A. niger, A. awamorii cĩ hoạt tính α-amylase và glucoamylase cao để thủy phân tinh bột sắn. Năm 1993, cĩ cơng trình : “Nghiên cứu chọn lọc chủng Asp. niger TH3 – 19K của Nhật Bản cĩ hoạt tính glucoamylase cao dùng để thủy phân tinh bột sống” của tác giả D. V Hợp và cộng sự. Năm 1998, Hồng Kim Anh, Ngơ Kế Sương, Nguyễn Thị Phương Thủy cĩ cơng trình “Thu nhận amlyse từ nấm mốc Aspergillus sp” [2]. Ở Việt Nam, viện Sinh học Nhiệt đới đã sản xuất các chế phẩm BioI, BioII, BioIII… cĩ dạng bột, chứa các enzym protease, cellulase, amylase và các VSV dùng bổ sung vào thức ăn cho cá, heo, bị. Chế phẩm cĩ tác dụng phịng chống chứng rối loại tiêu hĩa, kích thích tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn, phân hủy những thức ăn thừa và khí thải ở đáy ao…[57]. Năm 2002, Mai Thị Hằng và cộng sự cũng cĩ những khảo sát về khả năng sinh enzym amylase của NS phân lập từ RNM Nam Định và Thái Bình [10] Năm 2009 tác giả Nguyễn Thị Lan Hương “Nghiên cứu về khả năng sinh enzym amylase của một số chủng NS ở RNM Cần Giờ” [15]. Cĩ thể nĩi những nghiên cứu về NS sinh amylase trên đất liền khá phong phú và đa dạng, cịn những nghiên cứu về amylase của NS từ RNM Cần Giờ vẫn cịn khá ít ỏi, chưa tương xứng với tiềm năng. 1.3. TINH BỘT VÀ HỆ ENZYM AMYLASE 1.3.1. Tinh bột Tinh bột khơng phải một hợp chất đồng thể mà gồm hai polysaccarit khác nhau: amilose và amilopectin [5].  Thành phần cấu trúc của amylose. Amilose là loại mạch thẳng, chuỗi dài từ 500-2000 đơn vị glucozơ, liên kết nhau bởi liên kết α−1,4 glicozit. Hình1.6 – Phân tử Amilose  Thành phần cấu trúc của amilopectin Amilopectin là polyme cĩ mạch nhánh, ngồi mạch chính cĩ liên kết α-1,4 glucozit cịn cĩ nhánh liên kết với mạch chính bằng liên kết α-1,6 glucozit. Cấu tạo của amilopectin cịn lớn và dị thể hơn amilose nhiều. Trong tinh bột tỉ lệ amiloza/amilopectin khoảng ¼. Tỉ lệ này cĩ thể thay đổi phụ thuộc thời tiết, mùa vụ và cách chăm sĩc. Hình1.7 – Phân tử amilopectin Ở nước ta, nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vơ cùng đa dạng và phong phú. Nhưng để phù hợp cho sản xuất enzym amylase ở qui mơ cơng nghiệp thì cần phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm [5], [23], [28]. 1.3.2. Hệ enzym amylase Amylase là tên gọi của một nhĩm enzym cĩ tác dụng xúc tác thủy phân liên kết glucoside trong polysaccharide (tinh bột) và các dextrin cuối. Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen. Sản phẩm tạo thành của quá trình thủy phân là glucose, maltose và dextrin [15], [31], [44]. Các amylase chủ yếu thủy phân tinh bột thường gặp là: 1.3.2.1. α – amylase hay α-1,4-glucohydrolase Là enzym phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside trong mạch amilose và amilopectin một c._.ách ngẫu nhiên khơng theo trật tự nào cả. Việc tác dụng α – amylase lên hồ tinh bột làm giảm nhanh khả năng bắt màu của tinh bột với iod và độ nhớt của dịch hồ, amilose tạo thành maltose và maltotriose. Nếu trong thời gian dài thì sản phẩm thủy phân của amilose chứa 13% glucose và 87% maltose. Cịn amilopectin sẽ tạo thành maltose, maltotriose và dextrin phân tử thấp cùng 5-10% glucose [5], [21]. α – amylase thủy phân tinh bột chủ yếu tạo thành maltose và dextrin phân tử thấp khơng tạo màu với iod. Chúng cĩ ở thực vật, động vật và đặc biệt là ở rất nhiều VSV. α – amylase dễ tan trong nước, dung dịch muối, rượu lỗng. Tất cả các α – amylase đều chứa từ 1-30 nguyên tử gam canxi (Ca)/mol. Nếu tách hồn tồn Ca khỏi phân tử enzym thì α – amylase mất khả năng thủy phân cơ chất vì Ca tham gia hình thành và ổn định enzym. Ca cịn tác dụng đảm bảo α – amylase cĩ độ bền cực lớn với các tác động gây biến tính và phân hủy bởi các enzym phân giải protein [21] α – amylase từ các nguồn thu nhận khác nhau thường khơng giống nhau. + pH thích hợp cho hoạt động của đa số α – amylase từ NS là 4,5 – 5,5; của đại mạch nảy mầm và thĩc mầm là 4,7 – 5,4; và của VK là 5,5 – 6. pH tối thích của α – amylase từ A. oryzae là 4,8 – 5,8 [26]. + Độ bền của α – amylase với tác dụng của axit từ NS được sắp xếp theo thứ tự sau: A. batatae > A. usamii> A. oryzae> A. awamori> B. subtilis> thĩc mầm [21]. + α – amylase của NS rất nhạy cảm với hoạt động của nhiệt độ tối thích khoảng 40 - 500C, thĩc mầm và malt là 58 – 600C và VK là 70 – 750C [21]. α – amylase hầu như khơng tác dụng trên tinh bột nguyên thủy nhưng thủy phân hồ tinh bột rất nhanh. Thủy phân tinh bột bằng α – amylase thường xảy ra hai giai đoạn: * Giai đoạn đầu: (Giai đoạn dextrin hĩa) chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt từ hồ tinh bột giảm Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp * Giai đoạn 2: (Giai đoạn đường hĩa) thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa hình thành [17] Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide Amylase oligosacharide poliglucose Maltose maltotriose maltotetrose 1.3.2.2. β – amylase hay β (1 - 4) glucomaltohydrolase α-amylase Là ngoại enzym chỉ phân cắt các liên kết α – 1,4 glucoside ở đầu mạch. Chỉ phổ biến ở thực vật, nhiều ở hạt nảy mầm. Vi khuẩn khơng cĩ enzym này, cịn NS chưa được chứng minh hồn tồn về sự hiện diện của enzym này [5], [21]. β – amylase kém bền ở nhiệt độ cao, vơ hoạt hồn tồn ở 700C nhưng trong dịch nấu thì nhiệt độ tối thích là 60 – 650C. Enzym này khá bền trong MT axit ở pH 3-4. Đa số β – amylase hoạt động mạnh hơn ở MT pH 4,5-5 và vẫn giữ được hoạt tính khi khơng cĩ canxi. Điểm khác biệt của enzym này so với α-amylase là hầu như khơng tác dụng lên tinh bột sống mà chỉ phân giải hồ tinh bột. Chúng phân giải 100% amilose và 54-58% amilopectin thành maltose [26]. 1.3.2.3. Glucoamylase hay amyloglucozidaza, cịn gọi là γ-amylae Đây là enzym đường hĩa quan trọng nhất trong hệ amylase. Glucoamylase xúc tác thủy phân các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside bắt đầu từ đầu khơng khử trên mạch amilose và amilopectin tạo sản phẩm cuối cùng là glucose. Glucoamylase cĩ khả năng thủy phân hồn tồn tinh bột, glucogen, dextrin và maltose thành glucose [21], [26], [44]. Trong số các VSV cĩ khả năng sinh glucoamylase đã được biết cho đến nay, chi Aspergillus là chi được biết đến nhiều nhất bởi khả năng sinh glucoamylase rất cao, đặc biệt là lồi Aspergillus niger. Đa số chế phẩm glucoammylase của VSV đều hoạt động tốt ở vùng axit, pH tối thích 4,5 – 5,0. Tuy hoạt động tốt trong vùng axit nhưng glucoamylase của một số chủng VSV cũng bền ở pH kiềm. Ví dụ glucoamylase của lồi Coniphora cerebella và Corticum rolfsii tương đối bền ở pH=9, glucoamylase của Mucor rouxianus bền ở pH=8 [21], [44]. Nhiệt độ tối thích của glucoamylase 50 – 600C. Tuy nhiên, cũng cĩ trường hợp glucoamylase hoạt động tốt nhất ở 65 – 700C, ví dụ như glucoamylase của lồi C. thermosaccharolytium. Glucoamylase bị ức chế mạnh bởi Hg+ nhưng các ion Mn2+ và Fe2+ lại cĩ tác dụng kích thích sự hoạt động của enzym này [5], [21], [29]. 1.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp amylase của NS a. Giống nấm sợi Trong các yếu tố thì chủng giống NS là điều kiện đầu tiên và cơ bản nhất quyết định sự hình thành và hàm lượng amylase. Khơng phải tất cả các chủng nấm đều cĩ khả năng tổng hợp amylase như nhau. Ngày cả những chủng cùng chi, thậm chí cùng lồi cũng rất khác nhau về lượng enzym do chúng sản sinh ra. Chính vì thế mà việc tuyển chọn chủng NS cĩ khả năng tạo nhiều amylase là điều vơ cùng quan trọng [26], [31]. Bên cạnh việc tuyển chọn được chủng NS cĩ khả năng sinh amylase cao, cần phải đồng thời tiến hành nuơi cấy trong các điều kiện tối ưu nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp enzym cao nhất và ổn định nhất. Sau đĩ, cần phải tiến hành bảo quản giống một cách cẩn thận để giữ được hoạt tính ban đầu. b. Nguồn dinh dưỡng Các yếu tố trong thành phần MT ảnh hưởng lớn tới hoạt động sống và sự tạo thành enzym của NS. Vì vậy, trong MT nuơi cấy cần bảo đảm đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỉ lệ các chất dinh dưỡng hợp lý, phù hợp với từng loại NS [26]  Nguồn dinh dưỡng cacbon Trong MT nuơi cấy NS sinh amylase nhất thiết phải cĩ nguồn tinh bột làm chất cảm ứng và nguồn cacbon. NS cĩ khả năng đồng hĩa rất nhiều nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbonhydrat dễ hấp thu nhất với NS là glucose - là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào chu trình chuyển hĩa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff [26]. Nồng độ tinh bột và các nguồn cacbon khác nhau cũng cĩ ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành các enzym riêng biệt của hệ amylase. Ví dụ như để đảm bảo hoạt lực α-amylase cao cần 6% tinh bột, cịn với glucoamylase là 2% [26]. Nguyên liệu sử dụng cho nuơi cấy NS thu amylase thường là những nguyên liệu cĩ nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, ngơ mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác. Trong đĩ cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại này cĩ đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển. Mặt khác, khi chế tạo MT, các nguyên liệu này chúng thường cĩ tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng khơng khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu [26].  Nguồn dinh dưỡng nitơ Nguồn dinh dưỡng nitơ để nuơi NS tạo amylase thường được dùng dưới các dạng muối vơ cơ chủ yếu là NaNO3 hoặc NH4NO3 với hàm lượng 0,91% cĩ hiệu quả cao hơn các loại muối khác. Các hợp chất N hữu cơ thường dưới dạng nguyên liệu giàu đạm như: cao ngơ, bột đậu tương, khơ lạc, khơ dầu,…[21], [26]. Khi sử dụng nguồn nitơ nhất định cho vào MT cĩ thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Theo mức độ tiêu thụ muối, MT bị acid hĩa, quá trình chuyển dịch mạnh về phía tổng hợp tích cực glucoamylase và ức chế tổng hợp α-amylase. Tỉ lệ giữa cacbon và nitơ trong MT cĩ ý nghĩa rất lớn đối với sự tạo thành amylase. Chỉ khi nào trong MT cĩ đủ lượng cacbon và nitơ cần thiết mới tích lũy được enzym cực lớn. Trong MT Czapeck tỉ lệ giữa tinh bột và NaNO3 là 18:1 [21].  Nguồn dinh dưỡng khống Các chất khống như Fe, Mn, Zn, Cu…cĩ vai trị quan trọng như tham gia vào quá trình chuyển hĩa vật chất qua màng và thành tế bào NS, tham gia vào thành phần cấu tạo protein, enzym, điều hịa các chất trong tế bào…[26] Một số chất khống cĩ vai trị rất quan trọng trong quá trình tổng hợp enzym amylse như: Canxi là thành phần khơng thể thiếu được trong cấu tạo amylase vì nĩ cần cho quá trình tổng hợp và ổn định α-amylase, bảo vệ enzym này khỏi tác động của protease; Magie (Mg) ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzym. Thiếu MgSO4 sẽ ảnh hưởng đến tổng hợp mọi amylase của NS (Fenikxova, Muxaeva, 1967). Nồng độ tối ưu của muối này cần cho sự tổng hợp α-amylase và glucoamylase là 0,05%. Phospho ảnh hưởng đến sự sinh sản của NS, khi bổ sung phospho hữu cơ vào MT sẽ làm tăng giá trị dinh dưỡng MT và làm tăng tổng hợp amylase 2-3 lần; Tuy nhiên, nếu trong MT cĩ nhiều Mn, Cu, Hg thì sẽ kìm hãm sự tổng hợp amylase [21]. c. Điều kiện nuơi cấy Ngồi các yếu tố dinh dưỡng, trong MT nuơi cấy VSV các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH, thời gian nuơi cấy cũng ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp amylase của VSV. - Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng đa số NS trên MT rắn là 28-320C. Chu kỳ sinh trưởng của NS cĩ thể chia làm 3 thời kì: Thời kì trương và nảy mầm của đính bào tử (10-11 giờ đầu tiên), nhiệt độ cần ở 23-300C. Thời kì sinh trưởng nhanh hệ sợi (4-18 giờ), nấm hơ hấp mạnh nên giữ nhiệt độ phĩng ở 28-290C. Và ở thời kì sinh amylse mạnh (10-12 giờ) ở nhiệt độ 28-290C [26]. - Ảnh hưởng của độ ẩm Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu của MT thích hợp với NS là 60-65%, VK là khoảng 70%, độ ẩm MT cần phải được duy trì trong quá trình sản xuất. Độ ẩm cao sẽ làm giảm độ thống khí của MT, cịn khi độ ẩm thấp lại kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV. - Ảnh hưởng của pH Đa số NS phát triển và tạo amylase ở MT axit yếu trong khi vi khuẩn lại phát triển và sinh enzym cao ở MT trung tính. pH mơi trường khơng chỉ ảnh hưởng đến lượng enzym tổng hợp mà cịn ảnh hưởng đến chủng loại enzym được tổng hợp. Ví dụ, A. oryzae khi MT cĩ pH=6,5 thì ưu thế tổng hợp thuộc về α – amylase, trong khi đĩ ưu thế thuộc về glucoamylase khi pH của MT là 4,5. - Ảnh hưởng của độ mặn Muối ăn NaCl ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng phát triển của VSV, ngồi tác dụng cung cấp nguồn ion Cl- cịn cĩ tác dụng làm thay đổi sức thẩm thấu của màng tế bào, tạo điều kiện cho việc tiết các chất ra MT [26]. Hầu hết các chủng nấm sợi RNM đều cĩ khả năng phát triển tốt ở nồng độ muối từ 3-5% (Mai Thị Hằng, 2001). Một số chủng cĩ nguồn gốc tại RNM là cĩ khả năng chịu mặn thì sinh trưởng tốt ở nồng độ muối 10%. Tuy nhiên, khi nồng độ muối tăng từ 20 - 30% thì một số NS cĩ thể sống được nhưng mọc rất yếu [12] - Ảnh hưởng của thời gian Thời gian nuơi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzym. Trong quá trình nuơi cấy NS, sự hình thành amylase cực đại thường kết thúc khi NS bắt đầu sinh bào tử. Thời gian kết thúc sự tạo thành amylase thường từ 30 đến 42 giờ. Cịn đối với vi khuẩn sự tạo thành amylase tốt nhất là trong khoảng từ 40 đến 50 giờ [21] 1.3.4. Các phương pháp nuơi cấy NS thu nhận amylase  Phương pháp nuơi cấy chìm – MT nuơi dạng lỏng. NS được nuơi trong dung dịch đường hay dịch thủy phân cellulose, tinh bột cĩ bổ sung nguồn nitơ vơ cơ (NaNO3). Để tạo điều kiện cho NS sinh trưởng và phát triển tốt, tổng hợp nhiều amylase, người ta thường bổ sung thêm vào MT một số chất thích hợp như: nước chiết mầm mạch, nước chiết ngơ,… Phương pháp này địi hỏi phải cĩ cánh khuấy hay máy lắc để đảo trộn MT cung cấp ơxy cho NS phát triển. Để thu nhận enzym, dịch enzym được cơ đặc ở nhiệt độ thấp [26], [28]. Phương pháp này cĩ ưu điểm: -NS được gieo cấy và phân tán khắp mọi điểm trong MT, nên bề mặt xung quanh NS dễ tiếp xúc với dịch dinh dưỡng. - Các thiết bị lên men dễ cơ khí hĩa và tự động hĩa. Song phương pháp nuơi cấy chìm cũng cĩ một số nhược điểm sau: - Địi hỏi trang thiết bị hiện đại, điều kiện vơ trùng tuyệt đối - Trong quá trình nuơi cấy phải thổi khí và khuấy liên tục - Dễ bị nhiễm trùng tồn bộ - Cần chọn thành phần MT với tỉ lệ dinh dưỡng thích hợp và chú ý tới chất cảm ứng để NS sinh enzym ở mức tối đa.  Phương pháp nuơi cấy bề mặt – MT bán rắn Là phương pháp tạo điều kiện cho NS phát triển trên bề mặt MT. Nguyên liệu chính thường là cám mì, cám gạo, cám nếp, bắp xay nhỏ, tấm gạo,…được bổ sung lượng nhỏ (10-20%) trấu, hạt ngũ cốc, mạt cưa,… để làm tăng độ thống khí. MT được bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác, rồi tiến hành trộn đều với nước sao cho độ ẩm khoảng 55 – 60%. Hấp thanh trùng ở 1-1,5 atm/45-60 phút, để nguội rồi cho bào tử nấm hay NS vào. MT đã cấy giống được tãi lên các khay sạch với chiều dày từ 2 – 5cm và nuơi ở các điều kiện thích hợp. Sau khoảng thời gian nuơi cấy, người ta thu nhận MT đem sấy nhẹ ở 400C để đạt độ ẩm 8-12%, nghiền nhỏ. Đây chính là chế phẩm enzym dạng thơ [26]. Phương pháp này cĩ nhược điểm là: - Tốn diện tích mặt bằng - Khĩ cơ khí hĩa và đặc biệt là khĩ tự động hĩa được tồn bộ quá trình - Chi phí nhân cơng, điện nước...cho một đơn vị sản phẩm cao Trong hai phương pháp trên, thì nuơi cấy NS trên MT bán rắn đem lại hiệu quả cao hơn, vì NS là VSV hiếu khí bắt buộc do đĩ nuơi trên MT này thì độ thống khí cao. Nồng độ enzym tạo thành cao hơn nhiều so với nuơi cấy chìm. MT khơng cần điều kiện vơ trùng tuyệt đối, nếu bị nhiễm VSV lạ cũng dễ dàng xử lý. Chế phẩm dễ sấy khơ, bảo quản, dễ vận chuyển và ít tổn hao hoạt tính enzym. Là phương pháp sử dụng trong điều kiện khơng cần thu enzym tinh khiết, rất dễ thực hiện, quy trình cơng nghệ đơn giản khơng địi hỏi quá cao về trang thiết bị [28].  Phương pháp thu nhận amylase - Từ phương pháp nuơi cấy chìm: Sau khi lọc bỏ sinh khối VSV và các tạp chất rắn khơng tan cịn khoảng 1-3% chất khơ hịa tan, trong đĩ cĩ enzym. Thu dịch lọc, sau đĩ cơ đặc cho giảm thể tích từ 4-10 lần trong điều kiện chân khơng ở 25 – 300C, rồi tiến hành tách enzym. - Từ mơi trường nuơi cấy bề mặt: Chế phẩm enzym thơ được bổ sung lượng nước gấp 4 – 5 lần khối lượng canh trường để hịa tan enzym. Lọc và thu dịch lọc, bảo quản lạnh 10-120C. Dịch chiết thu được cĩ màu nâu sẫm, khá trong. Dịch chiết được cơ đặc chân khơng tới 50-55% chất khơ hịa tan, dịch đậm đặc này cĩ thể bảo quản lâu dài mà khơng mất hoạt lực và rất dễ hịa tan. - Tinh sạch amylase: Sử dụng cồn lạnh (40C) lượng gấp 2 – 2,5 lần lượng dịch enzym đổ từ từ vào dịch lọc, khuấy nhẹ để cồn hịa đều với dịch lọc enzym. Đưa hỗn hợp vào tủ lạnh. Sau 15 – 24 giờ, hỗn hợp phân thành 2 lớp. Đem ly tâm hay lọc để thu enzym dạng tủa. Sấy khơ nhẹ ở nhiệt độ < 400C để thu chế phẩm enzym bán tinh khiết [26] 1.3.4. Ứng dụng của enzym amylase Amylase là hệ enzym thủy phân quan trọng nhất trong ngành cơng nghệ sinh học. Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm amylase đã được khai thác theo tiêu chuẩn cơng nghiệp và ứng dụng trong nhiều lãnh vực khác nhau [29]. a. Trong cơng nghệ rượu, cồn, bia Trong vài chục năm gần đây, các nhà sản xuất đã sử dụng chế phẩm amylse từ NS A. oryzae hay A. awamori, B. subtilis để thay thế malt trong việc đường hĩa tinh bột sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu cĩ chứa tinh bột. Việc thay thế này giúp tiết kiệm được hàng vạn tấn tinh bột loại tốt, giảm giá thành sản phẩm và rút ngắn quá trình sản xuất. Người Nhật đã biết sử dụng enzym của nấm mốc trong quá trình đường hĩa để sản xuất rượu Sake từ cách đây hơn 1700 năm. Người Trung Quốc thì đã sử dụng nhiều loại nấm mốc để đường hĩa rượu trong sản xuất rượu từ cách đây 4000 năm. Cịn người Việt Nam đã biết sản xuất rượu từ gạo cách đây hàng ngàn năm [29], [31]. Riêng ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi Takamine người Nhật đưa nấm mốc Aspergillus sang mới biết sử dụng enzym của nấm này thay amylase của malt để sản xuất cồn [29]. b. Sản xuất bánh mì Để rút ngắn thời gian ủ bột, khi thêm 0,002 – 0,003% chế phẩm amylase vào bột nhào sẽ nâng cao chất lượng bánh mì về hương vị, màu sắc, thể tích riêng và độ xốp. Nhiệt độ vơ hoạt α- amylase của NS tương đối cao (700C) nên cĩ thể dùng enzym này với liều lượng lớn mà khơng cĩ hiện tượng dextrin hĩa khi nướng. Hơn nữa, hoạt độ α-amylase lại cao nên cĩ thể đạt đến độ đường hĩa cần thiết rất nhanh chĩng, sau đĩ bị vơ hoạt ngay. Tuy nhiên, chế phẩm enzym nấm mốc thường là một phức hệ enzym, trong đĩ protease cĩ thể làm cho chất lượng bánh mì xấu đi [29]. c. Cơng nghiệp dệt Chế phẩm amylase được dùng để rũ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm. Trong vải thơ thường chứa khỏang 5% tinh bột và các tạp chất khác. Để làm vải mềm, cĩ khả năng nhúng nước, tẩy trắng và bắt màu tốt người ta thường sử dụng 1 lượng chế phẩm amylase (từ VK hay nấm mốc) khỏang 0,3-0,6 g/l dung dịch và thời gian xử lý 5-15 phút ở nhiệt độ 900C. Phương pháp này khơng làm hại vải, độ mao dẫn tốt, đồng thời đảm bảo vệ sinh. Ngồi ra, amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột, sản xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose, sản xuất tương và nước chấm …ở quy mơ cơng nghiệp [29]. d. Trong sản xuất thức ăn gia súc Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn với thành phần tinh bột rất cao. Để tăng hiệu suất sử dụng năng lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường sử dụng chế phẩm amylase của A. oryzae, A. owamorii thêm enzym amylase vào khẩu phần ăn của động vật, nhất là động vật non làm tăng khả năng đồng hĩa dẫn đến tăng trọng nhanh [31]. e. Nghiên cứu sinh học, y học Cĩ rất nhiều nghiên cứu trong y học và lâm sàng học liên quan đến ứng dụng của amylase. Chế phẩm amylase cho phép phát hiện các oligosaccharide phân tử lượng lớn với độ nhạy cao Amylase cùng các enzym khác, được dùng trong chữa bệnh do thiếu enzym, kém khả năng chuyển hĩa chất, bệnh về tiêu hĩa, tim, thần kinh,… Ngồi ra, chế phẩm enzym được dùng để điều chế MT nuơi VSV phục vụ cho cơng tác nghiên cứu khoa học, chuẩn trị bệnh [29], [31].  Một số chế phẩm enzym amylase trên thế giới và Việt Nam Bảng 1.1 : Một số chế phẩm enzym amylase thương mại [21] STT Chế phẩm enzym Tên thương mại Hãng sản xuất 1 α-amylase vi khuẩn Tenase Optiamyl BAN Miles lab Miles Kali-chemie Novo-nordisk 2 α-amylase vi khuẩn chịu nhiệt Termamyl Opti-therm Maxamyl Novo-nordisk Miles Kali-chemie Gist-brocades 3 Amyloglucosidase Diazym AMG Spezym Miles lab Novo-nordisk Fiun Biochemical 4 β-amylase Dextrozym (chứaAMG) Promozym Novo-nordisk Novo-nordisk 5 Biozym MKC. Fugal amylase Fungamyl clarase Amano Novo-nordisk Miles lab Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu - Các chủng NS phân lập từ mẫu đất, thân, lá cây tại 5 xã của RNM Cần Giờ - Các VSV kiểm định: E. coli, B. subtilis từ viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh - Chế phẩm amylase từ viện Sinh học nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh - Nguồn nguyên liệu thu nhận enzym: Cám mì, trấu, bột ngơ, đậu tương mua từ chợ Tân Bình.  Các mơi trường sử dụng trong thí nghiệm * MT1 - MT Czapek – Dox cải tiến: dùng để phân lập NS [9], [22], [43] NaNO3 3.5g; KH2PO4 1.5g; MgSO4.7H2O 0.5g; KCl 0.5g; FeSO4.7H2O 0.01g (vết); glucose 20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 6.5; khử trùng 1atm/ 30 phút; Cloramphenicol 1% MT. *MT2 - MT cao nấm men (YEA) (Yeast Extraxt Agar) Dùng để nuơi cấy và giữ giống NS [15] , [54] Cao nấm men 4g; glucose 20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 5.5 – 6.0; khử trùng 1atm/ 30 phút. *MT3 - MT Malt Extract Agar (MEA): Dùng để bảo quản NS [22], [54] Pepton 1g; Malt Extract 20g; glucose 20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 5 – 6; khử trùng 1amt/30 phút. *MT4 - MT cảm ứng tổng hợp amylase: Dùng để phân lập nhanh các chủng NS sinh amylase[11], [13], [21] NaNO3 3.5g; K2HPO4 1.5g; MgSO4.7H2O 0.5g; KCl 0.5g; FeSO4.7H2O 0.1g (vết); tinh bột tan 10g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 6.5; khử trùng 1atm/ 30 phút *MT5 - MT cảm ứng tổng hợp cellulose [1]: Tương tự MT4 nhưng thay 10g tinh bột tan bằng 10g CMC. *MT6 - MT cảm ứng tổng hợp protease [26]: Tương tự MT4 nhưng khơng sử dụng NaNO3 và thay 10g tinh bột tan bằng 10g casein. *MT7 - MT cảm ứng tổng hợp chitinase[26]: Tương tự MT4 nhưng thay 10g tinh bột tan bằng 10g chitin. *MT8 - MT cảm ứng tổng hợp pectinase[26]: 200g cà rốt gọt vỏ, xay nhỏ, đun với 1000ml nước biển trong 60 phút, thêm 1 ít CaCO3 để trung hịa MT. Sau đĩ lọc lấy nước trong, bổ sung 20g agar; pH = 6,5; khử trùng 1atm/30 phút. *MT9 - MT Meat Peptone Agar (MPA): MT nuơi cấy và giữ giống vi khuẩn kiểm định [11] Pepton 5g; NaCl 5g; cao thịt 5g; agar 20g; nước cất 1000ml; pH = 7.5; khử trùng 1atm/ 30 phút. *MT10 – MT thử khả năng phân giải dầu [1],[11], [35]: KH2PO4 0,3g; MgSO4 0,4g; KNO3 3g; Na2HPO4 0,7g; Dầu DO 50ml; nước biển 950ml; khử trùng 1atm/ 30 phút  Một số MT bán rắn khảo sát khả năng sinh amylase *MT11 [1], [11], [26]: Cám mì 65g; trấu 25g; bột bắp 7,5g; NaNO3 2g; MgSO4 0,05g; KH2PO4 0,2g; KCl 0,05g; urê 0,2g; độ ẩm 50 - 60%, pH = 5 – 6, khử trùng 1atm/ 30 phút. *MT12 [21], [26]: Trấu 55g; cám 30g; bột bắp 5g; bã khoai mì 5g; đường 4g; (NH4)2HPO4 0,1g; ure 0,2g; CaCl20,1g; KCl 0,05g; HCl 0,05g; độ ẩm 50 – 60%; khử trùng 1atm/45 phút. *MT13 [21], [26]: 90% bã khoai mì; 10% trấu, bổ sung dung dịch khống (KH2PO4 0,1%; NH4Cl 0,1%; KNO3 0,3%; MgSO4 0,05%) cho đủ độ ẩm 60%; khử trùng 1atm/30 phút. *MT14 [15]: 50% cám gạo; 33% bã khoai mì; 17% trấu; độ ẩm 60%; pH 5-5,5; khử trùng 1atm/30 phút. *MT15 [15]: Cám 60%; bột đậu nành 30%; bột ngơ 10%; trấu 25%; độ ẩm 60%; pH 5,0-5,5; khử trùng 1atm/60 phút. 2.2. Hĩa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.1. Hĩa chất - Cồn, NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KCl, FeSO4.7H2O, NaCl, HCl,... - Glucose, cao nấm men, nước chiết khoai tây, tinh bột tan, agar, peptone, cao thịt, casein, thuốc thử lugol, HgCl2, Dinitrosalysilic, lactophenol… - Chất KS: Cloramphenycol (Ấn Độ) 2.2.2. Dụng cụ Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, pipet, que cấy, que gạt, bơng mỡ, đèn cồn, cốc thủy tinh, 2.2.3. Thiết bị Tủ cấy vơ trùng (Việt Nam), tủ lạnh (National - Nhật), tủ giữ mẫu (Sanyo - Nhật), máy giập mẫu (Đức), máy lắc Gerhardt (Đức), cân điện Sartorius (Đức), tủ sấy Memmert (Đức), nồi hấp áp lực Autoclave (Đài Loan), máy đo quang phổ UV – Visible spectrophometer (Nhật), máy chụp hình kỹ thuật số Olympus 5.1 (Nhật), máy đo pH (Pometer KL-009 (II) (Trung Quốc), máy ly tâm Rotina (Đức), cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ), máy đo độ ẩm Startorius (Đức),... 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ (Theo A. D. Agate, 1988) [42] Tiến hành lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Cần Giờ: Xã Bình Khánh, xã Tam Thơn Hiệp, xã An Thới Đơng, xã Long Hịa…Đi sâu vào các rừng già, cách biển khoảng 2km, các điểm lấy mẫu cách nhau khoảng 200m. Vị trí lấy mẫu theo những vị trí chấm đỏ trên bản đồ. Khu vực lấy mẫu là vùng nước lợ cĩ độ mặn 3%, nhiệt độ khoảng 290C; pH 7,02 Lấy các mẫu đất mặt, đất sâu 5-10 cm, lá vàng sắp rụng, lá rụng bị mục, thần cành chết khơ cịn trên cây, thân cành chết đang bị phân hủy trên mặt đất. Cách lấy: Dùng dao, kéo vơ trùng cắt khoảng 20g mẫu cho vào túi ni lơng vơ trùng buộc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản trong thùng nước đá vận chuyển về PTN và giữ ở tủ giống 40C. Các mẫu được phân lập ngay khơng giữ quá 24 giờ [43]. 2.3.2. Phương pháp vi sinh 2.3.2.1. Phân lập mẫu theo phương pháp pha lỗng mẫu (F. Uyenco, 1988) * Lấy mẫu và pha lỗng Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển Cần Giờ vơ trùng. Sau đĩ dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong vịng 2 phút, tốc độ 230 vịng/ phút. Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ, phần dịch hơi đục chảy ra bên ngồi. Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha lỗng 10-1. Lắc đều, hút 1ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vơ trùng ta được dung dịch pha lỗng nồng độ 10-2. Tiếp tục pha lỗng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4… * Cấy mẫu Nhỏ 2 giọt dung dịch ở mỗi nơng độ lên đĩa petri chứa MT czapek- dox cải tiến. Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch. Sau đĩ sử dụng que trang đĩ trang tiếp hai đĩa tiếp theo. Hình 2.1. Bản đồ tổng quan về RNM Cần Giờ và các vị trí lấy mẫu * Ủ mẫu Lật ngược đĩa petri, gĩi vào giấy báo, ủ ở nhiệt độ phịng từ 3-7 ngày. Chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy chuyền vào ống thạch nghiêng. * Làm thuần Lấy một khuẩn lạc riêng rẽ trong ống thạch nghiêng, hịa vào nước cất, trải đều trên mặt đĩa lần 2. Nếu các dạng khuẩn lạc đồng đều, cĩ màu sắc giống nhau, soi dưới kính hiển vi đều cĩ 1 dạng tế bào chứng tỏ giống phân lập thuần khiết. Sau đĩ chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy truyền vào 3 ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hĩa. 2.3.2.2. Giữ giống trên MT thạch dưới lớp dầu khống (Lumiere và Chevrotier – 1914) Chuẩn bị ống giống đã nuơi ở nhiệt độ phịng và thời gian thích hợp. Dầu khống chứa trong ống eppendorf hấp vơ trùng ở 1210C trong 2 giờ rồi sấy khơ ở 1700C trong 1-2 giờ, để nguội. Dùng que cấy lấy bào tử NS cho vào eppendorf chứa dầu khống vơ trùng. Hàn kín eppendorf bằng paraffin, bảo quản ở nhiệt độ 40C. Phương pháp này cĩ thể bảo quản trong 1-3 năm. 2.3.2.3. Quan sát đại thể NS [6], [7] NS sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ như sau - Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vơ trùng. - Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm. Lắc đều tạo dung dịch huyền phù. - Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chĩng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri. Làm 2-3 hộp. - Ủ ấm trong một tuần để tạo KL. Hàng ngày lấy ra quan sát - Dùng kính lúp ba chiều soi mơ tả các đặc điểm: + Hình thái, kích thước KL + Màu sắc mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc của KL + Màu sắc của MT do sắc tố NS tạo ra. + Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT, đặc điểm của mép KL + Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt Kl…… 2.3.2.4. Quan sát vi thể NS - Phương pháp cấy khối thạch [8] - Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri. - Dùng khoan nút chai vơ trùng cĩ d = 8mm, khoan các khối thạch. - Chuẩn bị đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bơng thấm nước, nước cất vơ trùng. - Đặt 1 hoặc 2 khối thạch trên mỗi phiến kính. Cấy một ít bào tử lên bề mặt xung quanh khối thạch. Đặt lá kính vơ trùng lên trên bề mặt các khối thạch. - Các phiến kính cĩ khối thạch cấy NS nghiên cứu được đặt trong các hộp petri cĩ sẵn một ít bơng thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vơ trùng. Các hộp petri này được bao và giữ trong tủ ấm 3 - 4 ngày. - Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch cĩ một giọt dung dịch lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất. - Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần NS trên phiến kính, nhỏ giọt lactyophenol, đậy lá kính lên trên ta được tiêu bản thứ hai. - Dùng kính hiển vi quan sát và vẽ mơ tả các đặc điểm + Hình dạng cuống sinh bào tử. + Hình dạng thể bình. + Sợi nấm cĩ hay khơng cĩ sự phân nhánh và vách ngăn. + Đặc điểm bào từ đính, màu sắc, kích thước bào tử… 2.3.2.5. Định danh NS bằng kĩ thuật di truyền phân tử (PCR).[40]  Nguyên tắc: Dùng phương pháp PCR để khuếch đại một trình tự gen lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt là NK28s-F và NK28s-R đặc hiệu một đoạn ADN dài 260 bps cĩ chứa các trình tự đặc hiệu giống. Các phân đoạn ADN sẽ được phân tách qua điện di trên gel agarose 2%. Giải trình tự sản phẩm này và đối chiếu với ngân hàng dữ liệu gen NCBI để định danh NS [40].  Các bước tiến hành: - Nuơi cấy chủng NS trong ống nghiệm từ 2-3 ngày rồi lấy một lượng mẫu NS khoảng ½ hạt gạo cho vào một tube eppendorf - Cho thêm 180µl TE1X và 20µl Prokprep rồi đem ủ ở 560C qua đêm - Thêm 500µl Phenol Buffer và 500µl L2 vào vortex khoảng 15 giây rồi đun sơi ở 1000C trong 15 phút. - Sấy nhẹ rồi thêm vào 250µl Chloroform/Isoamyl Alcohol vào vortex, lắc đều rồi ly tâm 14,000 vịng/phút trong 10 phút - Hút 450µl dịch nổi sang một tube eppendorf mới. Sau đĩ thêm vào 500µl Isopropanol. Giữ tube ở nhiệt độ -200C trong 1 – 2 giờ - Ly tâm 14,000 vịng/phút trong 15 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch nổi - Rửa cặn DNA 2 lần, mỗi lần cho 500µl Ethanol 70% vào, úp ngừa tube 3-4 lần. - Ly tâm 14,000 vịng/phút trong 15 phút. Đổ bỏ dịch nổi - Làm khơ cặn DNA ở 560C trong 10 – 15 phút - Hịa tan cặn DNA trong 50µl TE1X. Lấy 5µl dịch ly trích DNA này để thực hiện kỹ thuật PCR nấm - Lấy 5µl DNA của NS sau khi ly trích của vào PCR mix. -Tiến hành điện di nhúng chìm trên gel agarose 2% điện di trên DNA chip trên hệ thống Bio Analyzer. Sản phẩm PCR cĩ độ dài 260 bps. - Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch thì tiến hành giải trình tự gen 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH để xác định chi và lồi của chủng nghiên cứu [40] 2.3.2.6. Xác định hoạt tính enzym ngoại bào: bằng khuyếch tán trên MT thạch (William, 1983).  Nguyên tắc: Dùng thuốc thử với cơ chất màu đặc trưng, phần cơ chất bị NS phân hủy sẽ khơng tạo màu mà tạo vịng phân giải trong suốt quanh khuẩn lạc  Cách tiến hành: Dùng MT định tính đo khả năng phân giải các hệ enzym. + Phương pháp cấy chấm điểm: Chuẩn bị các chủng NS nghiên cứu và MT thử hoạt tính enzyme tương ứng (MT4, MT5, MT6, MT7, MT8) cấy chấm điểm (3 điểm/đĩa), giữ các đĩa trong 28-30oC, 3-4 ngày. +Phương pháp đục lỗ trên thạch: - Thu dịch nuơi cấy NS: dùng que cấy vơ trùng lấy 1 vịng que cấy NS vào bình tam giác chứa 50ml MT lỏng vơ trùng. Nuơi cấy trên máy lắc (160 vịng/phút), 4 ngày, 25-28oC - Ly tâm dịch nuơi cấy 3000 tốc độ vịng/phút trong 20 phút. - Lọai bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vơ trùng là dịch enzym thơ, bổ sung 0,04% NaNO3 để khử trùng; cĩ thể giữ dịch ly tâm 1 tháng trong tủ lạnh sâu ở -20oC. - Dùng khoan nút chai vơ trùng (d = 8mm) khoan các lỗ thạch trên MT nghiên cứu tương ứng trong các đĩa. - Dùng pipet vơ trùng nhỏ 0,1ml dịch enzym thơ vào các lỗ khoan trên các MT thử hoạt tính tương ứng. Giữ các hộp petri ở tủ lạnh 40C trong 4 - 6 giờ. Sau đĩ chuyển sang tủ ấm 28-300C trong 24giờ. - Thuốc thử lugol (hỗn hợp 0,05% I2 với 2,65%KI) cho amylase, cellulose, kitinase; dung dịch 10% HgCl2 cho protease, nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vịng phân giải bằng thước đo KL.  Kiểm tra kết quả - Kiểm tra hoạt tính amylase, cellulase, kitinase: + Nếu NS cĩ hoạt tính amylase sẽ tạo vịng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa dịch enzym. Vùng tinh bột chưa bị phân giải cĩ màu xanh tím đậm. + Nếu NS cĩ hoạt tính cellulase sẽ tạo vịng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa dịch enzym. Vùng cellulose chưa bị phân giải cĩ màu tím hồng nhạt. + Nếu NS cĩ ho._. (mg/ml) 0 2 4 6 8 10 OD (560nm) 0.002 0.087 0.171 0.25 0.342 0.415 Delta OD 0 0.085 0.169 0.248 0.340 0.413 D el ta O D Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Đồ thị 4.1: Sự tương quan giữa giá trị OD560nm và hàm lượng tinh bột (mg/ml) 5. Đồ thị đường chuẩn glucose để xác định hoạt độ glucoamylase theo phương pháp so màu với thuốc DNS (MILLER) Số ống 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nồng độ Glucose (μg/ml) 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 OD (530nm) 0.035 0.054 0.082 0.107 0.132 0.166 0.187 0.214 0.24 0.269 0.292 Delta OD 0 0.019 0.047 0.072 0.097 0.131 0.152 0.179 0.205 0.234 0.257  Bảng 5.1: Đường chuẩn glucose cĩ nồng độ từ 0 - 500 µg/m Đồ thị 5.1: Sự tương quan giữa giá trị OD530nm và nồng độ glucose (µg/ml) D el ta O D Nồng độ Glucose (µg/ml) 6. PHỤ LỤC 6 Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS Chủng Đ10 (α) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Thời gian (Giờ) 1 2 3 24 OD 0,052 0,051 0,046 0,050 0,0000 0,003 Lượng tinh bột (mg/ml) 1,216 1,192 1,072 1,160 0,0060 0,077 Hoạt độ (UI/g) 81,090 79,487 71,474 77,350 26,5382 5,152 36 OD 0,048 0,056 0,060 0,055 0,0000 0,006 Lượng tinh bột (mg/ml) 1,120 1,313 1,409 1,280 0,0216 0,147 Hoạt độ (UI/g) 74,679 87,500 93,910 85,363 95,8799 9,792 48 OD 0,121 0,122 0,129 0,124 0,0000 0,004 Lượng tinh bột (mg/ml) 2,875 2,899 3,067 2,947 0,0110 0,105 Hoạt độ (UI/g) 191,667 193,269 204,487 196,474 48,7960 6,985 60 OD 0,123 0,115 0,121 0,120 0,0000 0,004 Lượng tinh bột (mg/ml) 2,923 2,731 2,875 2,843 0,0100 0,100 Hoạt độ (UI/g) 194,872 182,051 191,667 189,530 44,5157 6,672 72 OD 0,121 0,112 0,118 0,117 0,0000 0,005 Lượng tinh bột (mg/ml) 2,875 2,659 2,803 2,779 0,0121 0,110 Hoạt độ (UI/g) 191,667 177,244 186,859 185,256 53,9324 7,344 84 OD 0,116 0,107 0,105 0,109 0,0000 0,006 Lượng tinh bột (mg/ml) 2,755 2,538 2,490 2,595 0,0198 0,141 Hoạt độ (UI/g) 183,654 169,231 166,026 172,970 88,1753 9,390 0,102 0,104 0,097 0,101 0,0000 0,004 6, PHỤ LỤC 6 (tt) Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS Chủng Đ56 (α) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Thời gian (Giờ) 1 2 3 24 OD 0,133 0,126 0,137 0,132 0,000 0,006 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,163 2,995 3,260 3,139 0,018 0,134 Hoạt độ (UI/g) 210,897 199,679 217,308 209,295 79,615 8,923 36 OD 0,146 0,144 0,120 0,137 0,000 0,014 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,476 3,428 2,851 3,252 0,121 0,348 Hoạt độ (UI/g) 231,731 228,526 190,064 216,774 537,612 23,186 48 OD 0,257 0,248 0,264 0,256 0,000 0,008 Lượng tinh bột (mg/ml) 6,144 5,928 6,313 6,128 0,037 0,193 Hoạt độ (UI/g) 409,615 395,192 420,833 408,547 165,222 12,854 60 OD 0,250 0,263 0,271 0,261 0,000 0,011 Lượng tinh bột (mg/ml) 5,976 6,288 6,481 6,248 0,065 0,255 Hoạt độ (UI/g) 398,397 419,231 432,051 416,560 288,496 16,985 72 OD 0,228 0,228 0,239 0,232 0,000 0,006 Lượng tinh bột (mg/ml) 5,447 5,447 5,712 5,535 0,023 0,153 Hoạt độ (UI/g) 363,141 363,141 380,769 369,017 103,585 10,178 OD 0,231 0,239 0,221 0,230 0,000 0,009 7. PHỤ LỤC 7 Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS Chủng Đ10 (glucoamylase) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Thời gian (Giờ) 1 2 3 24 OD 0,035 0,036 0,039 0,037 0,000 0,002 Nồng độ Glucose (μg/ml) 79,200 81,200 87,200 82,533 17,333 4,163 Hoạt độ (UI/g) 184,800 189,467 203,467 192,578 94,370 9,714 36 OD 0,101 0,094 0,097 0,097 0,000 0,004 Nồng độ Glucose (μg/ml) 211,200 197,200 203,200 203,867 49,333 7,024 Hoạt độ (UI/g) 492,800 460,133 474,133 475,689 268,593 16,389 48 OD 0,140 0,213 0,185 0,179 0,001 0,037 Nồng độ Glucose (μg/ml) 289,200 435,200 379,200 367,867 5425,333 73,657 Hoạt độ (UI/g) 674,800 1015,467 884,800 858,356 29537,926 171,866 60 OD 0,264 0,281 0,278 0,274 0,000 0,009 Nồng độ Glucose (μg/ml) 537,200 571,200 565,200 557,867 329,333 18,148 Hoạt độ (UI/g) 1253,467 1332,800 1318,800 1301,689 1793,037 42,344 72 OD 0,211 0,218 0,207 0,212 0,000 0,006 Nồng độ Glucose (μg/ml) 431,200 445,200 423,200 433,200 124,000 11,136 Hoạt độ (UI/g) 1006,133 1038,800 987,467 1010,800 675,111 25,983 84 OD 0,197 0,189 0,187 0,191 0,000 0,005 Nồng độ Glucose (μg/ml) 403,200 387,200 383,200 391,200 112,000 10,583 Hoạt độ (UI/g) 940,800 903,467 894,133 912,800 609,778 24,694 96 OD 0,179 0,178 0,185 0,181 0,000 0,004 367,200 365,200 379,200 370,533 57,333 7,572 7. PHỤ LỤC 7 (tt) Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS Chủng Đ56 (Glucoamylase) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Thời gian (Giờ) 1 2 3 24 OD 0,010 0,006 0,004 0,007 0,000 0,003 Nồng độ Glucose (μg/ml) 29,200 21,200 17,200 22,533 37,333 6,110 Hoạt độ (UI/g) 68,133 49,467 40,133 52,578 203,259 14,257 36 OD 0,003 0,040 0,027 0,023 0,000 0,019 Nồng độ Glucose (μg/ml) 15,200 89,200 63,200 55,867 1409,333 37,541 Hoạt độ (UI/g) 35,467 208,133 147,467 130,356 7673,037 87,596 48 OD 0,158 0,167 0,159 0,161 0,000 0,005 Nồng độ Glucose (μg/ml) 325,200 343,200 327,200 331,867 97,333 9,866 Hoạt độ (UI/g) 758,800 800,800 763,467 774,356 529,926 23,020 60 OD 0,340 0,419 0,376 0,378 0,002 0,040 Nồng độ Glucose (μg/ml) 689,200 847,200 761,200 765,867 6257,333 79,103 Hoạt độ (UI/g) 1608,133 1976,800 1776,133 1787,022 34067,704 184,574 72 OD 0,314 0,287 0,293 0,298 0,000 0,014 Nồng độ Glucose (μg/ml) 637,200 583,200 595,200 605,200 804,000 28,355 Hoạt độ (UI/g) 1486,800 1360,800 1388,800 1412,133 4377,333 66,161 84 OD 0,218 0,209 0,199 0,209 0,000 0,010 Nồng độ Glucose (μg/ml) 445,200 427,200 407,200 426,533 361,333 19,009 Hoạt độ (UI/g) 1038,800 996,800 950,133 995,244 1967,259 44,354 OD 0,171 0,184 0,156 0,170 0,000 0,014 8. PHỤ LỤC 8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS 9. PHỤ LỤC 9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS Chủng Đ10 (α) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Nhiệt độ 1 2 3 25 OD 0,131 0,128 0,127 0,129 4,333E-06 0,002 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,115 3,043 3,019 3,059 2,504E-03 0,050 Hoạt độ (UI/g) 207,692 202,885 201,282 203,953 11,129 3,336 30 OD 0,129 0,137 0,136 0,134 1,900E-05 0,004 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,067 3,260 3,236 3,188 1,098E-02 0,105 Hoạt độ (UI/g) 204,487 217,308 215,705 212,500 48,796 6,985 35 OD 0,155 0,165 0,159 0,160 2,533E-05 0,005 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,692 3,933 3,788 3,804 1,464E-02 0,121 Hoạt độ (UI/g) 246,154 262,179 252,564 253,632 65,061 8,066 40 OD 0,139 0,138 0,134 0,137 7,000E-06 0,003 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,308 3,284 3,188 3,260 4,045E-03 0,064 Hoạt độ (UI/g) 220,513 218,910 212,500 217,308 17,977 4,240 Chủng Đ56 (α) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Nhiệt độ 1 2 3 25 OD 0,127 0,136 0,132 0,132 2,033E-05 0,005 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,019 3,236 3,139 3,131 1,175E-02 0,108 Hoạt độ (UI/g) 201,282 215,705 209,295 208,761 52,220 7,226 30 OD 0,155 0,135 0,148 0,146 1,030E-04 0,010 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,692 3,212 3,524 3,476 5,952E-02 0,244 Hoạt độ (UI/g) 246,154 214,103 234,936 231,731 264,526 16,264 35 OD 0,136 0,164 0,156 0,152 2,080E-04 0,014 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,236 3,909 3,716 3,620 1,202E-01 0,347 Hoạt độ (UI/g) 215,705 260,577 247,756 241,346 534,188 23,113 40 OD 0,153 0,157 0,161 0,157 1,600E-05 0,004 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,644 3,740 3,837 3,740 9,246E-03 0,096 Hoạt độ (UI/g) 242,949 249,359 255,769 249,359 41,091 6,410 OD 0,151 0,146 0,143 0,147 1,633E-05 0,004 9. PH Ụ Chủng Đ10 (glucoamylase) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Nhiệt độ 1 2 3 25 OD 0,056 0,042 0,061 0,053 0,000 0,010 Nồng độ Glucose (μg/ml) 121,200 93,200 131,200 115,200 388,000 19,698 Hoạt độ (UI/g) 282,800 217,467 306,133 268,800 2112,444 45,961 30 OD 0,145 0,134 0,141 0,140 0,000 0,006 Nồng độ Glucose (μg/ml) 299,200 277,200 291,200 289,200 124,000 11,136 Hoạt độ (UI/g) 698,133 646,800 679,467 674,800 675,111 25,983 35 OD 0,153 0,143 0,162 0,153 0,000 0,010 Nồng độ Glucose (μg/ml) 315,200 295,200 333,200 314,533 361,333 19,009 Hoạt độ (UI/g) 735,467 688,800 777,467 733,911 1967,259 44,354 40 OD 0,258 0,231 0,245 0,245 0,000 0,014 Nồng độ Glucose (μg/ml) 525,200 471,200 499,200 498,533 729,333 27,006 Hoạt độ (UI/g) 1225,467 1099,467 1164,800 1163,244 3970,815 63,014 45 OD 0,083 0,082 0,091 0,085 0,000 0,005 Nồng độ Glucose (μg/ml) 175,200 173,200 191,200 179,867 97,333 9,866 Hoạt độ (UI/g) 408,800 404,133 446,133 419,689 529,926 23,020 LỤC 9 (tt) Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS Chủng Đ56 (glucoamylase) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Nhiệt độ 1 2 3 25 OD 0,090 0,092 0,087 0,090 0,000 0,003 Nồng độ Glucose (μg/ml) 189,200 193,200 183,200 188,533 25,333 5,033 Hoạt độ (UI/g) 441,467 450,800 427,467 439,911 137,926 11,744 30 OD 0,094 0,097 0,102 0,098 0,000 0,004 Nồng độ Glucose (μg/ml) 197,200 203,200 213,200 204,533 65,333 8,083 Hoạt độ (UI/g) 460,133 474,133 497,467 477,244 355,704 18,860 35 OD 0,178 0,166 0,165 0,170 0,000 0,007 Nồng độ Glucose (μg/ml) 365,200 341,200 339,200 348,533 209,333 14,468 Hoạt độ (UI/g) 852,133 796,133 791,467 813,244 1139,704 33,759 40 OD 0,181 0,184 0,187 0,184 0,000 0,003 Nồng độ Glucose (μg/ml) 371,200 377,200 383,200 377,200 36,000 6,000 Hoạt độ (UI/g) 866,133 880,133 894,133 880,133 196,000 14,000 45 OD 0,137 0,148 0,139 0,141 0,000 0,006 Nồng độ Glucose (μg/ml) 283,200 305,200 287,200 291,867 137,333 11,719 Hoạt độ (UI/g) 660,800 712,133 670,133 681,022 747,704 27,344 10. PHỤ LỤC 10 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS Chủng Đ10 (α) Số lần Trung bình Phương sai Sai số pH 1 2 3 3 OD 0,339 0,378 0,347 0,355 0,0004 0,021 Lượng tinh bột (mg/ml) 8,115 9,053 8,308 8,492 0,2452 0,495 Hoạt độ (UI/g) 541,026 603,526 553,846 566,132 1089,778 33,012 4 OD 0,384 0,384 0,376 0,381 0,0000 0,005 Lượng tinh bột (mg/ml) 9,197 9,197 9,005 9,133 0,0123 0,111 Hoạt độ (UI/g) 613,141 613,141 600,321 608,868 54,789 7,402 5 OD 0,395 0,392 0,397 0,395 0,0000 0,003 Lượng tinh bột (mg/ml) 9,462 9,389 9,510 9,454 0,0037 0,060 Hoạt độ (UI/g) 630,769 625,962 633,974 630,235 16,265 4,033 6 OD 0,377 0,409 0,391 0,392 0,0003 0,016 Lượng tinh bột (mg/ml) 9,029 9,798 9,365 9,397 0,1487 0,386 Hoạt độ (UI/g) 601,923 653,205 624,359 626,496 660,886 25,708 7 OD 0,384 0,388 0,378 0,383 0,0000 0,005 Lượng tinh bột (mg/ml) 9,197 9,293 9,053 9,181 0,0146 0,121 Hoạt độ (UI/g) 613,141 619,551 603,526 612,073 65,061 8,066 8 OD 0,369 0,371 0,371 0,370 0,0000 0,001 Lượng tinh bột (mg/ml) 8,837 8,885 8,885 8,869 0,0008 0,028 Hoạt độ (UI/g) 589,103 592,308 592,308 591,239 3,424 1,850 10. PHỤ LỤC 10 (tt) Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS Chủng Đ56(α) Số lần Trung bình Phương sai Sai số pH 1 2 3 3 OD 0,034 0,011 0,028 0,024 0,0001 0,012 Lượng tinh bột (mg/ml) 0,784 0,231 0,639 0,551 0,0822 0,287 Hoạt độ (UI/g) 52,244 15,385 42,628 36,752 365,5421 19,119 4 OD 0,247 0,249 0,246 0,247 0,0000 0,002 Lượng tinh bột (mg/ml) 5,904 5,952 5,880 5,912 0,0013 0,037 Hoạt độ (UI/g) 393,590 396,795 391,987 394,124 5,9925 2,448 5 OD 0,281 0,266 0,272 0,273 0,0001 0,008 Lượng tinh bột (mg/ml) 6,721 6,361 6,505 6,529 0,0329 0,181 Hoạt độ (UI/g) 448,077 424,038 433,654 435,256 146,3881 12,099 6 OD 0.286 0.301 0.298 0.295 0.000 0.008 Lượng tinh bột (mg/ml) 6.841 7.202 7.130 7.058 0.036 0.191 Hoạt độ (UI/g) 456.090 480.128 475.321 470.513 161.797 12.720 7 OD 0.285 0.285 0.292 0.287 0.000 0.004 Lượng tinh bột (mg/ml) 6.817 6.817 6.986 6.873 0.009 0.097 Hoạt độ (UI/g) 454.487 454.487 465.705 458.226 41.947 6.477 8 OD 0,255 0,207 0,241 0,234 0,0006 0,025 Lượng tinh bột (mg/ml) 6,096 4,942 5,760 5,599 0,3521 0,593 Hoạt độ (UI/g) 406,410 329,487 383,974 373,291 1564,8970 39,559 11. PHỤ LỤC 11 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS Chủng Đ10 (glucoamylase) Số lần Trung bình Phương sai Sai số pH 1 2 3 3 OD 0,211 0,274 0,241 0,242 0,001 0,032 Nồng độ Glucose (μg/ml) 431,200 557,200 491,200 493,200 3972,000 63,024 Hoạt độ (UI/g) 1006,133 1300,133 1146,133 1150,800 21625,333 147,056 4 OD 0,252 0,274 0,258 0,261 0,000 0,011 Nồng độ Glucose (μg/ml) 513,200 557,200 525,200 531,867 517,333 22,745 Hoạt độ (UI/g) 1197,467 1300,133 1225,467 1241,022 2816,593 53,072 5 OD 0,233 0,308 0,271 0,271 0,001 0,038 Nồng độ Glucose (μg/ml) 475,200 625,200 551,200 550,533 5625,333 75,002 Hoạt độ (UI/g) 1108,800 1458,800 1286,133 1284,578 30626,815 175,005 6 OD 0,209 0,345 0,277 0,277 0,005 0,068 Nồng độ Glucose (μg/ml) 427,200 699,200 563,200 563,200 18496,000 136,000 Hoạt độ (UI/g) 996,800 1631,467 1314,133 1314,133 100700,444 317,333 7 OD 0,203 0,271 0,229 0,234 0,001 0,034 Nồng độ Glucose (μg/ml) 415,200 551,200 467,200 477,867 4709,333 68,625 Hoạt độ (UI/g) 968,800 1286,133 1090,133 1115,022 25639,704 160,124 8 OD 0,197 0,261 0,213 0,224 0,001 0,033 Nồng độ Glucose (μg/ml) 403,200 531,200 435,200 456,533 4437,333 66,613 Hoạt độ (UI/g) 940,800 1239,467 1015,467 1065,244 24158,815 155,431 11. PHỤ LỤC 11 (tt) Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS Chủng Đ56 (glucoamylase) Số lần Trung bình Phương sai Sai số pH 1 2 3 3% OD 0,032 0,021 0,024 0,026 0,000 0,006 Nồng độ Glucose (μg/ml) 73,200 51,200 57,200 60,533 129,333 11,372 Hoạt độ (UI/g) 170,800 119,467 133,467 141,244 704,148 26,536 4% OD 0,231 0,279 0,253 0,254 0,001 0,024 Nồng độ Glucose (μg/ml) 471,200 567,200 515,200 517,867 2309,333 48,056 Hoạt độ (UI/g) 1099,467 1323,467 1202,133 1208,356 12573,037 112,130 5% OD 0,276 0,326 0,286 0,296 0,001 0,026 Nồng độ Glucose (μg/ml) 561,200 661,200 581,200 601,200 2800,000 52,915 Hoạt độ (UI/g) 1309,467 1542,800 1356,133 1402,800 15244,444 123,468 6% OD 0,391 0,322 0,334 0,349 0,001 0,037 Nồng độ Glucose (μg/ml) 791,200 653,200 677,200 707,200 5436,000 73,729 Hoạt độ (UI/g) 1846,133 1524,133 1580,133 1650,133 29596,000 172,035 7% OD 0,141 0,276 0,172 0,196 0,005 0,071 Nồng độ Glucose (μg/ml) 291,200 561,200 353,200 401,867 20001,333 141,426 Hoạt độ (UI/g) 679,467 1309,467 824,133 937,689 108896,148 329,994 8% OD 0,124 0,198 0,167 0,163 0,001 0,037 Nồng độ Glucose (μg/ml) 257,200 405,200 343,200 335,200 5524,000 74,324 Hoạt độ (UI/g) 600,133 945,467 800,800 782,133 30075,111 173,422 12. PHỤ LỤC 12 Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS Chủng Đ10 (α) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Độ ẩm (%) 1 2 3 50% OD 0,126 0,125 0,126 0,126 3,333E-07 0,001 Lượng tinh bột (mg/ml) 2,995 2,971 2,995 2,987 1,926E-04 0,014 Hoạt độ (UI/g) 199,679 198,077 199,679 199,145 8,561E-01 0,925 55% OD 0,154 0,165 0,157 0,159 3,233E-05 0,006 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,668 3,933 3,740 3,780 1,868E-02 0,137 Hoạt độ (UI/g) 244,551 262,179 249,359 252,030 8,304E+01 9,113 60% OD 0,145 0,176 0,166 0,162 2,503E-04 0,016 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,452 4,197 3,957 3,869 1,447E-01 0,380 Hoạt độ (UI/g) 230,128 279,808 263,782 257,906 6,429E+02 25,356 65% OD 0,188 0,178 0,185 0,184 2,633E-05 0,005 Lượng tinh bột (mg/ml) 4,486 4,245 4,413 4,381 1,522E-02 0,123 Hoạt độ (UI/g) 299,038 283,013 294,231 292,094 6,763E+01 8,224 70% OD 0,178 0,179 0,173 0,177 1,033E-05 0,003 Lượng tinh bột (mg/ml) 4,245 4,269 4,125 4,213 5,971E-03 0,077 Hoạt độ (UI/g) 283,013 284,615 275,000 280,876 2,654E+01 5,152 12. PHỤ LỤC 12 (tt) Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS Chủng Đ56 (α) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Độ ẩm (%) 1 2 3 50% OD 0,179 0,182 0,186 0,182 1,233E-05 0,004 Lượng tinh bột (mg/ml) 4,269 4,341 4,438 4,349 7,127E-03 0,084 Hoạt độ (UI/g) 284,615 289,423 295,833 289,957 3,167E+01 5,628 55% OD 0,197 0,206 0,198 0,200 2,433E-05 0,005 Lượng tinh bột (mg/ml) 4,702 4,918 4,726 4,782 1,406E-02 0,119 Hoạt độ (UI/g) 313,462 327,885 315,064 318,803 6,249E+01 7,905 60% OD 0,198 0,223 0,212 0,211 1,570E-04 0,013 Lượng tinh bột (mg/ml) 4,726 5,327 5,063 5,038 9,072E-02 0,301 Hoạt độ (UI/g) 315,064 355,128 337,500 335,897 4,032E+02 20,080 65% OD 0,209 0,233 0,221 0,221 1,440E-04 0,012 Lượng tinh bột (mg/ml) 4,990 5,567 5,279 5,279 8,321E-02 0,288 Hoạt độ (UI/g) 332,692 371,154 351,923 351,923 3,698E+02 19,231 70% OD 0,198 0,228 0,211 0,212 2,263E-04 0,015 Lượng tinh bột (mg/ml) 4,726 5,447 5,038 5,071 1,308E-01 0,362 Hoạt độ (UI/g) 315,064 363,141 335,897 338,034 5,813E+02 24,110 13. PHỤ LỤC 13 Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS Chủng Đ10 (glucoamylase) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Độ ẩm (%) 1 2 3 50% OD 0,034 0,042 0,037 0,038 0,000 0,004 Nồng độ Glucose (μg/ml) 77,200 93,200 83,200 84,533 65,333 8,083 Hoạt độ (UI/g) 180,133 217,467 194,133 197,244 355,704 18,860 55% OD 0,056 0,042 0,061 0,053 0,000 0,010 Nồng độ Glucose (μg/ml) 121,200 93,200 131,200 115,200 388,000 19,698 Hoạt độ (UI/g) 282,800 217,467 306,133 268,800 2112,444 45,961 60% OD 0,082 0,107 0,073 0,087 0,000 0,018 Nồng độ Glucose (μg/ml) 173,200 223,200 155,200 183,867 1241,333 35,233 Hoạt độ (UI/g) 404,133 520,800 362,133 429,022 6758,370 82,209 65% OD 0,153 0,142 0,162 0,152 0,000 0,010 Nồng độ Glucose (μg/ml) 315,200 293,200 333,200 313,867 401,333 20,033 Hoạt độ (UI/g) 735,467 684,133 777,467 732,356 2185,037 46,744 Chủng Đ56 (glucoamylase) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Độ ẩm (%) 1 2 3 50% OD 0,036 0,041 0,047 0,041 3,03E-05 0,006 Nồng độ Glucose (μg/ml) 81,2 91,2 103,2 91,867 1,21E+02 11,015 Hoạt độ (UI/g) 189,467 212,8 240,8 214,356 6,61E+02 25,702 55% OD 0,083 0,082 0,093 0,086 3,70E-05 0,006 Nồng độ Glucose (μg/ml) 175,2 173,2 195,2 181,200 1,48E+02 12,166 Hoạt độ (UI/g) 408,8 404,13 455,467 422,800 8,06E+02 28,386 60% OD 0,092 0,087 0,098 0,092 3,03E-05 0,006 Nồng độ Glucose (μg/ml) 193,2 183,2 205,2 193,867 1,21E+02 11,015 Hoạt độ (UI/g) 450,8 427,47 478,8 452,356 6,61E+02 25,702 65% OD 0,104 0,112 0,103 0,106 2,43E-05 0,005 Nồng độ Glucose (μg/ml) 217,2 233,2 215,2 221,867 9,73E+01 9,866 Hoạt độ (UI/g) 506,8 544,13 502,133 517,689 5,30E+02 23,020 14. PHỤ LỤC 14 Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS Chủng Đ10 (α) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Độ mặn (%) 1 2 3 0% OD 0,131 0,128 0,127 0,129 4,333E-06 0,002 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,115 3,043 3,019 3,059 2,504E-03 0,050 Hoạt độ (UI/g) 207,692 202,885 201,282 203,953 1,113E+01 3,336 1% OD 0,178 0,181 0,179 0,179 2,333E-06 0,002 Lượng tinh bột (mg/ml) 4,245 4,317 4,269 4,277 1,348E-03 0,037 Hoạt độ (UI/g) 283,013 287,821 284,615 285,150 5,992E+00 2,448 3% OD 0,207 0,199 0,204 0,203 1,633E-05 0,004 Lượng tinh bột (mg/ml) 4,942 4,750 4,870 4,854 9,438E-03 0,097 Hoạt độ (UI/g) 329,487 316,667 324,679 323,611 4,195E+01 6,477 5% OD 0,178 0,165 0,172 0,172 4,233E-05 0,007 Lượng tinh bột (mg/ml) 4,245 3,933 4,101 4,093 2,446E-02 0,156 Hoạt độ (UI/g) 283,013 262,179 273,397 272,863 1,087E+02 10,427 10% OD 0,107 0,088 0,097 0,097 9,033E-05 0,010 Lượng tinh bột (mg/ml) 2,538 2,082 2,298 2,306 5,220E-02 0,228 Hoạt độ (UI/g) 169,231 138,782 153,205 153,739 2,320E+02 15,231 OD 0,092 0,021 0,067 0,060 1,297E-03 0,036 14. PHỤ LỤC 14 (tt) Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS Chủng Đ56 (α) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Độ mặn (%) 1 2 3 0% OD 0,083 0,097 0,072 0,084 0,000157 0,013 Lượng tinh bột (mg/ml) 1,962 2,298 1,697 1,986 0,091 0,301 Hoạt độ (UI/g) 130,769 153,205 113,141 132,372 403,209 20,080 1% OD 0,086 0,087 0,091 0,088 7E-06 0,003 Lượng tinh bột (mg/ml) 2,034 2,058 2,154 2,082 0,004 0,064 Hoạt độ (UI/g) 135,577 137,179 143,590 138,782 17,977 4,240 3% OD 0,122 0,121 0,119 0,121 2,33333E-06 0,002 Lượng tinh bột (mg/ml) 2,899 2,875 2,827 2,867 0,001 0,037 Hoạt độ (UI/g) 193,269 191,667 188,462 191,132 5,992 2,448 5% OD 0,132 0,123 0,138 0,131 5,7E-05 0,008 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,139 2,923 3,284 3,115 0,033 0,181 Hoạt độ (UI/g) 209,295 194,872 218,910 207,692 146,388 12,099 10% OD 0,099 0,07 0,086 0,085 0,000211 0,015 Lượng tinh bột (mg/ml) 2,346 1,649 2,034 2,010 0,122 0,349 Hoạt độ (UI/g) 156,410 109,936 135,577 133,974 541,893 23,279 20% OD 0,014 0,046 0,039 0,033 0,000283 0,017 Lượng tinh bột (mg/ml) 0,303 1,072 0,904 0,760 0,164 0,404 5. PHỤ LỤC 15 Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS Chủng Đ10 (glucoamylase) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Độ mặn (%) 1 2 3 0% OD 0,025 0,042 0,037 0,035 0,000 0,009 Nồng độ Glucose (μg/ml) 59,200 93,200 83,200 78,533 305,333 17,474 Hoạt độ (UI/g) 138,133 217,467 194,133 183,244 1662,370 40,772 1% OD 0,029 0,081 0,032 0,047 0,001 0,029 Nồng độ Glucose (μg/ml) 67,200 171,200 73,200 103,867 3409,333 58,389 Hoạt độ (UI/g) 156,800 399,467 170,800 242,356 18561,926 136,242 3% OD 0,056 0,041 0,053 0,050 0,000 0,008 Nồng độ Glucose (μg/ml) 121,200 91,200 115,200 109,200 252,000 15,875 Hoạt độ (UI/g) 282,800 212,800 268,800 254,800 1372,000 37,041 5% OD 0,113 0,090 0,093 0,099 0,000 0,013 Nồng độ Glucose (μg/ml) 235,200 189,200 195,200 206,533 625,333 25,007 Hoạt độ (UI/g) 548,800 441,467 455,467 481,911 3404,593 58,349 10% OD 0,022 0,038 0,034 0,031 0,000 0,008 Nồng độ Glucose (μg/ml) 53,200 85,200 77,200 71,867 277,333 16,653 Hoạt độ (UI/g) 124,133 198,800 180,133 167,689 1509,926 38,858 20% OD 0,012 0,041 0,029 0,027 0,000 0,015 Nồng độ Glucose (μg/ml) 33,200 91,200 67,200 63,867 849,333 29,143 Hoạt độ (UI/g) 77,467 212,800 156,800 149,022 4624,148 68,001 15. PHỤ LỤC 15 (tt) Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS Chủng Đ56 (glucoamylase) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Độ mặn (%) 1 2 3 0% OD 0,021 0,017 0,019 0,019 0,000 0,002 Nồng độ Glucose (μg/ml) 51,200 43,200 47,200 47,200 16,000 4,000 Hoạt độ (UI/g) 119,467 100,800 110,133 110,133 87,111 9,333 1% OD 0,029 0,030 0,032 0,030 0,000 0,002 Nồng độ Glucose (μg/ml) 67,200 69,200 73,200 69,867 9,333 3,055 Hoạt độ (UI/g) 156,800 161,467 170,800 163,022 50,815 7,128 3% OD 0,088 0,090 0,086 0,088 0,000 0,002 Nồng độ Glucose (μg/ml) 185,200 189,200 181,200 185,200 16,000 4,000 Hoạt độ (UI/g) 432,133 441,467 422,800 432,133 87,111 9,333 5% OD 0,109 0,123 0,097 0,110 0,000 0,013 Nồng độ Glucose (μg/ml) 227,200 255,200 203,200 228,533 677,333 26,026 Hoạt độ (UI/g) 530,133 595,467 474,133 533,244 3687,704 60,726 10% OD 0,100 0,101 0,107 0,103 0,000 0,004 Nồng độ Glucose (μg/ml) 209,200 211,200 223,200 214,533 57,333 7,572 Hoạt độ (UI/g) 488,133 492,800 520,800 500,578 312,148 17,668 20% OD 0,024 0,021 0,026 0,024 0,000 0,003 Nồng độ Glucose (μg/ml) 57,200 51,200 61,200 56,533 25,333 5,033 Hoạt độ (UI/g) 133,467 119,467 142,800 131,911 137,926 11,744 16. PHỤ LỤC 16 Đơng học quá trình sinh α-amylase của hai chủng NS Chủng Đ10 (α) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Tổng hợp 1 2 3 24 OD 0,114 0,109 0,105 0,109 2,033E-05 0,005 Lượng tinh bột (mg/ml) 2,707 2,587 2,490 2,595 1,175E-02 0,108 Hoạt độ (UI/g) 180,449 172,436 166,026 172,970 5,222E+01 7,226 36 OD 0,158 0,149 0,154 0,154 2,033E-05 0,005 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,764 3,548 3,668 3,660 1,175E-02 0,108 Hoạt độ (UI/g) 250,962 236,538 244,551 244,017 5,222E+01 7,226 48 OD 0,187 0,186 0,189 0,187 2,333E-06 0,002 Lượng tinh bột (mg/ml) 4,462 4,438 4,510 4,470 1,348E-03 0,037 Hoạt độ (UI/g) 297,436 295,833 300,641 297,970 5,992E+00 2,448 60 OD 0,157 0,153 0,163 0,158 2,533E-05 0,005 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,740 3,644 3,885 3,756 1,464E-02 0,121 Hoạt độ (UI/g) 249,359 242,949 258,974 250,427 6,506E+01 8,066 72 OD 0,167 0,147 0,141 0,152 1,853E-04 0,014 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,981 3,500 3,356 3,612 1,071E-01 0,327 Hoạt độ (UI/g) 265,385 233,333 223,718 240,812 4,760E+02 21,817 84 OD 0,149 0,149 0,137 0,145 4,800E-05 0,007 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,548 3,548 3,260 3,452 2,774E-02 0,167 Hoạt độ (UI/g) 236,538 236,538 217,308 230,128 1,233E+02 11,103 96 OD 0,133 0,128 0,125 0,129 1,633E-05 0,004 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,163 3,043 2,971 3,059 9,438E-03 0,097 16. PHỤ LỤC 16 (tt) Đơng học quá trình sinh α-amylase của hai chủng NS Chủng Đ56 (α) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Tổng hợp 1 2 3 24 OD 0,115 0,117 0,114 0,115 0,000 0,002 Lượng tinh bột (mg/ml) 2,731 2,779 2,707 2,739 0,001 0,037 Hoạt độ (UI/g) 182,051 185,256 180,449 182,585 5,992 2,448 36 OD 0,155 0,145 0,146 0,149 0,000 0,006 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,692 3,452 3,476 3,540 0,018 0,132 Hoạt độ (UI/g) 246,154 230,128 231,731 236,004 77,902 8,826 48 OD 0,146 0,172 0,153 0,157 0,000 0,013 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,476 4,101 3,644 3,740 0,105 0,323 Hoạt độ (UI/g) 231,731 273,397 242,949 249,359 464,846 21,560 60 OD 0,179 0,162 0,164 0,168 0,000 0,009 Lượng tinh bột (mg/ml) 4,269 3,861 3,909 4,013 0,050 0,223 Hoạt độ (UI/g) 284,615 257,372 260,577 267,521 221,722 14,890 72 OD 0,163 0,129 0,138 0,143 0,000 0,018 Lượng tinh bột (mg/ml) 3,885 3,067 3,284 3,412 0,179 0,423 Hoạt độ (UI/g) 258,974 204,487 218,910 227,457 797,002 28,231 84 OD 0,124 0,127 0,126 0,126 0,000 0,002 Lượng tinh bột (mg/ml) 2,947 3,019 2,995 2,987 0,001 0,037 Hoạt độ (UI/g) 196,474 201,282 199,679 199,145 5,992 2,448 96 OD 0,121 0,123 0,118 0,121 0,000 0,003 Lượng tinh bột (mg/ml) 2,875 2,923 2,803 2,867 0,004 0,060 17. PHỤ LỤC 17 Đơng học quá trình sinh glucoamylase của hai chủng NS Chủng Đ10 (glucoamylase) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Tổng hợp 1 2 3 24 OD 0,094 0,062 0,076 0,077 0,000 0,016 Nồng độ Glucose (μg/ml) 197,200 133,200 161,200 163,867 1029,333 32,083 Hoạt độ (UI/g) 460,133 310,800 376,133 382,356 5604,148 74,861 36 OD 0,152 0,136 0,141 0,143 0,000 0,008 Nồng độ Glucose (μg/ml) 313,200 281,200 291,200 295,200 268,000 16,371 Hoạt độ (UI/g) 730,800 656,133 679,467 688,800 1459,111 38,198 48 OD 0,217 0,222 0,213 0,217 0,000 0,005 Nồng độ Glucose (μg/ml) 443,200 453,200 435,200 443,867 81,333 9,018 Hoạt độ (UI/g) 1034,133 1057,467 1015,467 1035,689 442,815 21,043 60 OD 0,166 0,334 0,262 0,254 0,007 0,084 Nồng độ Glucose (μg/ml) 341,200 677,200 533,200 517,200 28416,000 168,570 Hoạt độ (UI/g) 796,133 1580,133 1244,133 1206,800 154709,333 393,331 72 OD 0,247 0,086 0,162 0,165 0,006 0,081 Nồng độ Glucose (μg/ml) 503,200 181,200 333,200 339,200 25948,000 161,084 Hoạt độ (UI/g) 1174,133 422,800 777,467 791,467 141272,444 375,862 84 OD 0,109 0,167 0,137 0,138 0,001 0,029 Nồng độ Glucose (μg/ml) 227,200 343,200 283,200 284,533 3365,333 58,011 Hoạt độ (UI/g) 530,133 800,800 660,800 663,911 18322,370 135,360 96 OD 0,049 0,069 0,063 0,060 0,000 0,010 Nồng độ Glucose (μg/ml) 107,200 147,200 135,200 129,867 421,333 20,526 17. PHỤ LỤC 17 (tt) Đơng học quá trình sinh glucoamylase của hai chủng NS Chủng Đ56 (glucoamylase) Số lần Trung bình Phương sai Sai số Tổng hợp 1 2 3 24 OD 0,119 0,118 0,119 0,119 0,000 0,001 Nồng độ Glucose (μg/ml) 247,200 245,200 247,200 246,533 1,333 1,155 Hoạt độ (UI/g) 576,800 572,133 576,800 575,244 7,259 2,694 36 OD 0,142 0,117 0,125 0,128 0,000 0,013 Nồng độ Glucose (μg/ml) 293,200 243,200 259,200 265,200 652,000 25,534 Hoạt độ (UI/g) 684,133 567,467 604,800 618,800 3549,778 59,580 48 OD 0,254 0,158 0,216 0,209 0,002 0,048 Nồng độ Glucose (μg/ml) 517,200 325,200 441,200 427,867 9349,333 96,692 Hoạt độ (UI/g) 1206,800 758,800 1029,467 998,356 50901,926 225,615 60 OD 0,205 0,234 0,227 0,222 0,000 0,015 Nồng độ Glucose (μg/ml) 419,200 477,200 463,200 453,200 916,000 30,265 Hoạt độ (UI/g) 978,133 1113,467 1080,800 1057,467 4987,111 70,619 72 OD 0,297 0,255 0,261 0,271 0,001 0,023 Nồng độ Glucose (μg/ml) 603,200 519,200 531,200 551,200 2064,000 45,431 Hoạt độ (UI/g) 1407,467 1211,467 1239,467 1286,133 11237,333 106,006 84 OD 0,065 0,113 0,073 0,084 0,001 0,026 Nồng độ Glucose (μg/ml) 93,200 127,200 113,200 111,200 292,000 17,088 Hoạt độ (UI/g) 217,467 296,800 264,133 259,467 1589,778 39,872 96 OD 0,042 0,059 0,052 0,051 0,000 0,009 Nồng độ Glucose (μg/ml) 139,200 235,200 155,200 176,533 2645,333 51,433 . PHỤ LỤC 18 So sánh hoạt độ amylase của chế phẩm thu được với chế phẩm amylase đang lưu hành trên thị trường Khả năng dịch hĩa Khả năng đường hĩa Enzyme Chỉ số Số lần Trung bình Phương sai Sai số 1 2 3 Chủng Đ10 OD 0.312 0.356 0.347 0.338 0.001 0.023 Lượng tinh bột (mg/ml) 7.466 8.524 8.308 8.099 0.312 0.559 Hoạt độ (UI/g) 497.756 568.269 553.846 539.957 1387.690 37.252 Chủng Đ56 OD 0.403 0.413 0.378 0.398 0.000 0.018 Lượng tinh bột (mg/ml) 9.654 9.894 9.053 9.534 0.188 0.433 Hoạt độ (UI/g) 643.590 659.615 603.526 635.577 834.669 28.891 Chế phẩm VSHNNĐ OD 0.176 0.223 0.215 0.205 0.001 0.025 Lượng tinh bột (mg/ml) 4.197 5.327 5.135 4.886 0.365 0.604 Enzyme Chỉ số Số lần Trung bình Phương sai Sai s 1 2 3 Chủng Đ10 OD 0.082 0.107 0.073 0.087 0.000 0.018 Nồng độ Glucose (μg/ml) 173.200 223.200 155.200 183.867 1241.333 35.233 Hoạt độ (UI/g) 4041.333 5208.000 3621.333 4290.222 675837.037 822.093 Chủng Đ56 OD 0.086 0.087 0.091 0.088 0.000 0.003 Nồng độ Glucose (μg/ml) 181.200 183.200 191.200 185.200 28.000 5.292 Hoạt độ (UI/g) 4228.000 4274.667 4461.333 4321.333 15244.444 123.468 Chế phẩm OD 0.217 0.245 0.263 0.242 0.001 0.023 Nồng độ Glucose (μg/ml) 443.200 499.200 535.200 492.533 2149.333 46.361 ._.