Nghiên cứu thu hồi sinh khối của chủng vi khuẩn lactic Lc.TL6 và ứng dụng trong quá trình muối chua các sản phẩm rau quả

g bổ sung thêm vào chuyển hĩa thành axit lactic do quá trình lên men lactic bởi các vi khuẩn lactic. Axit lactic và các sản phẩm khác của quá trình lên men lactic tạo cho sản phẩm rau quả muối chua hương vị đặc trưng. Ngồi ra axit lactic cĩ khả năng ức chế hoạt động của nhiều loại vi sinh vật gây hư hỏng sản phẩm, do đĩ rau quả muối chua cĩ thể bảo quản được lâu ngày. Vì vậy cĩ thể nĩi rau quả muối chua là nhu cầu khơng thể thiếu được của người dân Việt Nam. Các sản phẩm rau quả muối chua như rau cải bẹ, cà muối, su hào muối, bắp cải muối ... là những sản phẩm truyền thống được nhân dân ta sử dụng từ rất lâu đời, nĩ phù hợp với khẩu vị và mĩn ăn của người Việt Nam. Những nguyên liệu dùng để muối chua như cải bẹ, cà pháo, cà bát, su hào, bắp cải... đều là những nguyên liệu cĩ thể trồng quanh năm, năng suất cao, dễ trồng và thời gian trồng ngắn. Hiện nay ở nước ta các sản phẩm rau quả muối chua chủ yếu được sản xuất ở mức độ thủ cơng, lên men tự nhiên và mới bắt đầu sản xuất cơng nghiệp ở qui mơ nhỏ, do đĩ năng suất thấp, chất lượng khơng đồng đều, cĩ độ rủi ro cao, thời gian sử dụng ngắn. Vấn đề đặt ra hiện nay là phải tạo ra những sản phẩm rau quả muối chua cĩ chất lượng ổn định, đồng đều, cĩ thời gian bảo quản lâu và sản xuất với năng suất lớn. Xuất phát từ những yêu cầu trên chúng tơi đã đi sâu vào “ Nghiên cứu thu hồi sinh khối của chủng vi khuẩn lactic Lc.TL6 và ứng dụng trong quá trình muối chua các sản phẩm rau quả”. Mục tiêu chính của chúng tơi là : 1. Từ hai chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ sản phẩm rau cải bẹ muối tự nhiên theo phương pháp truyền thống và một chủng Lactobacillus lactis sản xuất axit lactic được cung cấp bởi Viện Cơng nghiệp Thực Đồ án tốt nghiệp Cao Hồng Lan 2 phẩm, chọn ra chủng vi khuẩn thích hợp nhất cho quá trình muối chua các sản phẩm rau quả. 2. Nghiên cứu các điều kiện nuơi cấy thích hợp để phát triển sinh khối vi khuẩn lactic đã chọn. 3. Ứng dụng sinh khối vi khuẩn lactic trong quá trình muối chua các sản phẩm rau quả khác nhau. Đồ án tốt nghiệp Cao Hồng Lan 3 PHẦN I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1. Khái quát tình hình sản xuất và tiêu thụ rau quả muối chua trên thế giới và ở Việt Nam Sự lên men lactic được ứng dụng rộng rãi trong đời sống hàng ngày cũng như trong nơng nghiệp, trong cơng nghiệp, đặc biệt trong cơng nghiệp thực phẩm. Từ rất lâu con người đã sử dụng những sản phẩm của quá trình lên men lactic như sữa chua, phomat, hải sản muối và các sản phẩm rau quả muối chua. Khác với các sản phẩm khác, sản phẩm rau quả muối chua chủ yếu được sản xuất ở qui mơ gia đình trong điều kiện thủ cơng. Hiện nay một số nước đã đưa việc sản xuất các sản phẩm trên ở qui mơ cơng nghiệp, đi đầu là Nhật Bản, Hàn Quốc, Philipine và Thái Lan. Cịn ở châu Âu, cơng nghệ lên men lactic được ứng dụng với những nguyên liệu rau quả như bắp cải, dưa chuột, ơliu, cà rốt, cà chua, tảo biển... Ở Việt Nam, dưa muối cĩ thể được coi là sản phẩm truyền thống của dân tộc. Từ giữa thế kỷ 18 đến giữa thế kỷ 19, nhân dân ta đã tiếp thu kinh nghiệm của người Hoa làm ra dưa muối từ các loại rau, củ, quả. Cĩ hai loại dưa : dưa muối xổi thường dùng các loại rau cải non, các loại củ, quả cắt nhỏ, ngâm trong dấm, cĩ thể ăn ngay sau khi muối một thời gian ngắn; cịn loại thứ hai là dưa muối để lâu dùng các loại cải bẹ, cà, hành, dưa chuột, xơ mít... Cách muối truyền thống thường rất đơn giản, rau củ rửa sạch, để ráo nước cho nguyên liệu hơi héo rồi xếp vại, thêm muối, đường, gia vị, giữ được trong thời gian tương đối dài từ vài ngày đến vài tuần, một số loại như cà muối mặn cĩ thể để được hàng tháng. Các sản phẩm rau, củ, quả muối được sản xuất quanh năm, mùa đơng, mùa xuân cĩ cải bẹ muối, hành muối, bắp cải muối, cịn mùa hè, mùa thu cĩ cà muối, dưa chuột muối...Các sản phẩm trên được tiêu thụ với số lượng lớn tuy nhiên chủ yếu được sản xuất ở qui mơ gia đình. Một số sản phẩm như dưa chuột muối, cà muối, hành muối đã bắt đầu được sản xuất ở một số nhà máy, ở qui mơ bán cơng nghiệp nhưng số lượng khơng đáng kể. Trong những năm gần đây ở nước ta đã cĩ một số cơng trình nghiên cứu về quá trình lên men lactic của một số loại rau quả chủ yếu là dưa chuột và bắp cải, tuy nhiên, những cơng trình nghiên cứu về các sản phẩm rau quả muối chua cịn chưa nhiều và chưa thật sự đi sâu [2], [3], [4]. Đồ án tốt nghiệp Cao Hồng Lan 4 I.2. Cơng nghệ muối chua rau quả Rau quả muối chua là sản phẩm chế biến từ rau quả, bằng cách làm cho chất đường cĩ sẵn trong rau quả hoặc đường bổ sung thêm vào chuyển hĩa thành axit lactic, do quá trình lên men lactic bởi các vi sinh vật lactic. Axit lactic và các sản phẩm khác của quá trình lên men lactic tạo cho sản phẩm một hương vị đặc trưng. Axit lactic tạo thành trong quá trình lên men lactic làm giảm pH của sản phẩm do đĩ cĩ khả năng ức chế được sự hoạt động của nhiều loại vi sinh vật gây hư hỏng sản phẩm vì thế các sản phẩm rau quả muối chua cĩ thể bảo quản dài ngày. I.2.1. Nguyên liệu dùng muối chua rau quả Cĩ thể sử dụng rất nhiều loại nguyên liệu để sản xuất ra các sản phẩm rau quả muối chua như cải bẹ, dưa chuột, cà chua, cà, bắp cải, cải trắng, su hào, hành, cà rốt, tảo... Mỗi một quốc gia và vùng khác nhau lại cĩ những sản phẩm rau quả muối chua truyền thống đặc trưng. Sau đây là một số nguyên liệu dùng muối chua thường sử dụng : I.2.1.1. Cải bẹ Tên khoa học là : Brassica campestrus L hay cịn gọi là nhĩm cải dưa, gồm các giống cải như cải Đơng Dư, cải bẹ Nam (cải mào gà), cải Hà Lưỡng, cải Lạng Sơn, cải tàu cuốn... Đặc điểm của nhĩm cải bẹ là cĩ lá to, lá rất lớn, một cây cĩ thể nặng từ 2-3 kg, thời gian sinh trưởng dài thường từ 120 - 160 ngày. Tuy nhiên hiện nay một số giống cải mới như cải Đơng Dư thì thời gian sinh trưởng ngắn chỉ khoảng 30 - 45 ngày, thường được trồng từ tháng 6 đến tháng 9. Cải cĩ bộ rễ ăn nơng trên tầng đất màu, bộ lá khá phát triển, to bản nhưng chịu hạn kém và dễ bị sâu bệnh phá hoại [5]. Hiện nay cĩ rất ít những cơng trình nghiên cứu về rau cải bẹ. Theo Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi [5] thì thành phần của rau cải bẹ như sau: Bảng 1 : Thành phần của rau cải bẹ, % Nƣớc Protein Đƣờng Chất xơ Tro Vitamin, mg% B1 B2 C 93,8 1,7 2,1 1,8 0,6 0,07 0,1 51 Đồ án tốt nghiệp Cao Hồng Lan 5 Khác với các loại rau quả khác cải bẹ chỉ cĩ một ứng dụng duy nhất là muối dưa, rất ít khi dùng nấu canh hay xào nấu, dưa cải bẹ là một trong những sản phẩm muối chua phổ biến nhất ở nước ta. Độ già của rau tốt nhất ở mức độ bánh tẻ, mới chớm cĩ hoa, khơng sử dụng dưa quá già hay quá non. Nên sử dụng cây dưa cĩ bẹ, khối lượng trung bình mỗi cây từ 1 - 2 kg với hàm lượng đường trung bình trong nguyên liệu từ 2 - 2,5%. I.2.1.2. Dƣa chuột Dưa chuột muối là một trong những sản phẩm rau muối chua phổ biến nhất trên thế giới. Dưa chuột là một loại rau ngắn ngày thuộc họ bầu bí, vụ chính từ tháng 3 đến tháng 5. Dưa chuột cĩ ba loại chính là loại nhỏ, loại trung bình và loại lớn. Dưa chuột dùng để muối chua cần phải là dưa non, hạt nhỏ, ít ruột, thịt quả chắc, vỏ mỏng, buồng hạt của quả khơng lớn và chưa già. Để sản phẩm cĩ chất lượng tốt nguyên liệu cần tươi tốt, thời gian từ lúc thu hái đến lúc đưa vào sử dụng khơng nên quá 24 h. Kích thước quả dưa và hàm lượng đường trong dưa ảnh hưởng lớn đến chất lượng của sản phẩm. Giống dưa quả nhỏ hàm lượng đường cao hơn so với dưa quả to, vì vậy giống dưa quả nhỏ cho sản phẩm cĩ chất lượng cao hơn giống dưa quả to. Dưa chuột dùng muối chua cĩ hàm lượng đường khơng thấp hơn 2% [3]. I.2.1.3. Cà Cà cĩ nhiều loại như cà bát, cà pháo, cà tím, cà trắng...Trong đĩ thích hợp cho muối chua là cà bát, cà pháo loại trắng. Độ già thích hợp là quả cĩ vết vàng ở đáy, tai quả nhỏ với hàm lượng đường trong nguyên liệu là 3,5 - 4%. Cà non quá hoặc già quá đều cĩ hàm lượng đường thấp, cho sản phẩm cĩ chất lượng khơng cao. Khơng sử dụng những quả sâu, dập nát hoặc thối [3], [4]. I.2.1.4. Bắp cải Bắp cải là một cây rau được trồng và sử dụng nhiều ở nước ta. Khơng phải tất cả các loại bắp cải đều cĩ thể sử dụng để muối chua. Để muối chua cần dùng loại nguyên liệu cĩ hàm lượng đường cao và mơ lá khơng quá giịn để sản phẩm đỡ gẫy nát. Độ chín kỹ thuật của bắp cải biểu hiện ở chỗ: lá cuốn thật chặt, hàm lượng chất khơ khoảng 10% trong đĩ bao gồm 4 - 5% đường, 1 - 2% protein để tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic phát triển thuận lợi. Bắp cải chứa nhiều vitamin C (26 - 60 mg%) và trong quá trình muối chua vitamin ít bị tổn thất. Dùng bắp cải to lợi hơn vì Đồ án tốt nghiệp Cao Hồng Lan 6 tỷ lệ phế liệu thấp hơn so với bắp cải nhỏ. Khơng dùng bắp cải quá non, quá già hoặc bị sâu bệnh. Bắp cải tươi được lưu vài ngày trong kho thơng giĩ tốt để bắp cải hơi héo, khi cắt nhỏ đỡ dập nát. Trước khi muối cắt bỏ những lá xanh và lá khuyết tật. Cĩ thể tận dụng lõi bắp cải vì trong lõi cĩ chứa nhiều đường và axit ascorbic. I.2.1.5. Cà chua Cà chua là một loại quả cĩ thể sử dụng tất cả các độ chín khác nhau để muối chua như : cà chua xanh, cà chua ương, cà chua chín nhưng phải muối riêng từng độ chín khác nhau. Sau khi đã loại bỏ những quả khuyết tật và khơng hợp quy cách, cà chua được phân cỡ rồi rửa sạch và tiến hành muối trong những thùng hoặc vại. I.2.2 . Phƣơng pháp muối chua truyền thống (muối chua tự nhiên) Các sản phẩm rau quả muối chua là những sản phẩm truyền thống, được nhân dân ta sử dụng từ rất lâu. Từ giữa thế kỷ 18 đầu thế kỷ 19, nhân dân ta đã tiếp thu kinh nghiệm của người Hoa về sản xuất và chế biến một số loại như cải thìa, cải bẹ dùng để muối dưa hoặc làm ca-la thầu [3]. Bên cạnh sản phẩm chủ yếu là dưa cải bẹ nhân dân ta cịn sử dụng rất nhiều loại nguyên liệu khác nhau để muối dưa như cà bát, cà pháo, cải bắp, hành, quả sung, quả trám, su hào, xơ mít, rau cần...Mỗi loại nguyên liệu cũng như mỗi vùng miền đều cĩ một cách thức muối chua riêng, nhưng nhìn chung phương pháp muối chua rau quả truyền thống được thực hiện như sau: tùy từng loại nguyên liệu mà lựa chọn độ non già khác nhau. Trong muối chua truyền thống nhân dân ta thường sử dụng gia vị để muối kèm với nguyên liệu như : khi muối cà thường cho thêm một chút tỏi hoặc giềng, khi muối dưa cải bẹ thì cho hành hoặc kiệu, khi muối bắp cải thì cho hành, rau răm hoặc rau cần...Các gia vị cĩ rất nhiều vai trị trong quá trình muối chua như làm tăng hương vị và giá trị cảm quan cho sản phẩm, tăng hàm lượng đường cho dưa, một số loại gia vị cĩ tác dụng ức chế một số vi sinh vật lạ. Nguyên liệu được lựa chọn, cắt bỏ những phần già, dập nát hoặc sâu bệnh. Theo như kinh nghiệm của nhân dân nguyên liệu thường được để héo bằng cách phơi nắng một thời gian, cũng cĩ thể muối nguyên liệu tươi mà khơng cần để héo. Nguyên liệu và gia vị được rửa sạch, để ráo, sau đĩ xếp vại. Dịch dùng muối chua bao gồm nước, muối, cĩ thể bổ sung đường hoặc khơng. Tùy từng loại sản phẩm và nhu cầu thĩi quen của người sử dụng mà lượng muối dùng cho muối chau cĩ thể khác nhau, thường từ 3-10% so với nguyên liệu. Lượng dịch cho vào thường gần bằng hoặc ngập nguyên liệu. Dịch pha xong được rĩt vào vại đã chứa Đồ án tốt nghiệp Cao Hồng Lan 7 sẵn nguyên liệu, sau đĩ nén vỉ, đậy lại, một số sản phẩm cần phải nén với một lực lớn như su hào muối, cà muối. Tùy từng sản phẩm mà nồng độ muối cho vào, nhiệt độ mơi trường bên ngồi mà thời gian muối khác nhau: thường đối với dưa cải bẹ, cà pháo, muối với nồng độ thấp thì sau 3-5 ngày là cho sản phẩm. Những nguyên liệu đầu cĩ dạng củ, kích thước to hơn như su hào, dưa chuột, cà bát thì thời gian lên men dài hơn. Thơng thường các sản phẩm muối chua truyền thống thường chỉ sử dụng trong một thời gian ngắn, tuy nhiên cĩ một số những sản phẩm đặc biệt như nhút (làm từ xơ mít) ở miền Trung, cà muối mặn ở một số vùng ở miền Bắc cĩ thể bảo quản trong thời gian vài tháng. Nĩi chung các sản phẩm muối chua theo phương pháp truyền thống thường cĩ chất lượng khơng ổn định, khơng đồng đều, mức độ hư hỏng lớn, thời gian bảo quản ngắn và chỉ sản xuất ở quy mơ gia đình nên năng suất thấp. I.2.3. Muối chua ở quy mơ cơng nghiệp Trên thế giới hiện nay đặc biệt ở một số nước châu Á các sản phẩm rau quả muối chua đã được sản xuất ở quy mơ cơng nghiệp như [4]: 1. Dưa chua Nhật Bản (Takana Zuke) : Làm từ nguyên liệu chính : lá rau cải 80--85%, ớt đỏ 0,5%, muối 15--20%. Trong đĩ trên 90% sản phẩm này được sản xuất trên qui mơ cơng nghiệp. 2. Dưa chua Triều Tiên (Baechơ Kim Chi): Cĩ thành phần nguyên liệu là cải trắng 90%, hành 2,0%, ớt 2,0%, gừng 0,5%, muối 2,5-3%. Hàng năm sản xuất khoảng 800.000 tấn trong đĩ trên 90% sản xuất ở qui mơ cơng nghiệp, chỉ khoảng 10% sản xuất theo phương pháp thủ cơng. 3. Dưa chua Thái Lan (Pak gaad dong) : Được làm từ lá rau cải đắng 90%, muối 8%, nước cháo gạo 2%. Sản xuất khoảng 4,6 triệu tấn/ năm nhưng chủ yếu sản xuất theo phương pháp thủ cơng. 4. Trái cây muối chua của Philipine (Byrong prutas). Nguyên liệu: trái cây100%, muối 2,25-2,5%, đường 1%. Trong đĩ trên 90% là sản xuất thủ cơng và khoảng 10% được sản xuất cơng nghiệp. Trong cơng nghiệp, đặc biệt ở các nước châu Âu thì quá trình muối chua các sản phẩm rau quả được tiến hành trong những bể cĩ thể tích lớn, quá trình lên men lactic diễn ra ở nhiệt độ thấp, thời gian dài. Cĩ thể làm tăng chất lượng sản phẩm bằng cách sử dụng chủng vi sinh vật lên men lactic thuần khiết được đưa vào dưới dạng dịch men, được phun đều lên trên bề mặt của từng lớp nguyên liệu trong bể Đồ án tốt nghiệp Cao Hồng Lan 8 muối. Để điều chế dịch men sử dụng các chủng vi khuẩn lactic thuần khiết, khơng sinh hơi và nấm men mà các cơ sở chế biến nhận về dưới dạng lỏng chứa trong các chai thủy tinh. Điều chế dịch men bằng cách nhân giống các chủng vi sinh vật thuần khiết, nấm men và vi khuẩn phải được nhân giống riêng sau đĩ mới trộn lại với nhau. Sau khi lên men lactic đạt đến nồng độ axit lactic cần thiết thì tiến hành hạ nhiệt độ để quá trình lên men xảy ra chậm, tránh tổn thất axit, vitamin C làm cho sản phẩm cĩ chất lượng tốt hơn, sau đĩ sản phẩm thường được bảo quản ở nhiệt độ thấp trong thời gian dài. Khi sử dụng chủng vi sinh vật thuần khiết trong quá trình muối chua rau quả thì sản phẩm thu được cĩ chất lượng ổn định, cĩ thể bảo quản trong thời gian dài [2], [3]. I.2.4. Các giai đoạn của quá trình lên men lactic Quá trình lên men lactic trong các sản phẩm rau quả muối chua cĩ thể phân ra làm ba giai đoạn. Trong giai đoạn đầu do muối ăn gây áp suất thẩm thấu lớn nên đường và các chất dinh dưỡng khác trong nguyên liệu được khuếch tán vào trong nước và các vi sinh vật bắt đầu hoạt động. Trên bề mặt của nước muối xuất hiện các bọt khí đĩ là do hoạt động của một số vi khuẩn coli và một số vi sinh vật cĩ khả năng sinh khí khác. Chủng vi khuẩn lactic phát triển chủ yếu trong thời kỳ này là Leuconostoc mesenteroides. Đĩ là loại cầu khuẩn cĩ khả năng sinh axit lactic và sinh khí, sự tích tụ axit lactic trong giai đoạn này là thấp. Trong giai đoạn thứ hai, các vi khuẩn lactic phát triển mạnh mẽ và axit lactic được tích tụ nhiều, phần lớn các vi khuẩn gây thối bị ức chế vì độ pH của mơi trường giảm xuống 3-3,5. Thời kỳ này là thời kỳ quan trọng của quá trình lên men lactic vì sản phẩm tích tụ được lượng axit lactic cao và cĩ hương vị đặc trưng của sản phẩm. Trong thời kỳ thứ ba, khi axit lactic đã tích tụ với lượng lớn thì ngay bản thân vi khuẩn lactic cũng bị ức chế. Khi đĩ các nấm men và nấm mốc cĩ khả năng phát triển mạnh làm giảm chất lượng sản phẩm vì chúng cĩ khả năng phân hủy axit lactic mạnh. Vì vậy cần ngăn chặn giai đoạn này bằng cách bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ thấp hoặc ở điều kiện yếm khí [17]. I.2.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men lactic Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic là nồng độ muối ăn, hàm lượng đường trong sản phẩm (đường cĩ sẵn trong nguyên liệu và đường bổ sung thêm vào), độ pH của sản phẩm, hệ vi sinh vật trong sản phẩm và nhiệt độ mơi trường. Đồ án tốt nghiệp Cao Hồng Lan 9 Dung dịch muối ăn với nồng độ tương đối cao sẽ ức chế sự phát triển của các vi sinh vật lạ và cả vi khuẩn lactic. Khi tiến hành muối chua rau quả cần tạo điều kiện cho các vi khuẩn lactic phát triển và ức chế các vi sinh vật lạ. Do vậy cần sử dụng nồng độ muối khơng quá cao : thường sử dụng muối ăn với nồng độ 4-6% hoặc nước muối với nồng độ 6-10%. Đường trong quá trình muối chua rau quả là nguồn tạo axit lactic. Trong trường hợp đường trong nguyên liệu khơng đủ thì hàm lượng axit lactic tích tụ trong sản phẩm cũng khơng đạt mức yêu cầu, khi đĩ sản phẩm cĩ hương vị kém và dễ bị hư hỏng trong quá trình bảo quản. Vì vậy khi muối chua cần chọn loại nguyên liệu cĩ hàm lượng đường đạt mức yêu cầu và khi cần thì phải bổ sung thêm đường. Độ axit trong sản phẩm cũng ảnh hưởng lớn tới quá trình muối chua vì các vi sinh vật rất nhạy cảm đối với pH mơi trường (pH tối ưu của vi khuẩn lactic là 5,5- 6,5). Trong quá trình lên men của rau quả muối chua axit lactic tích tụ với hàm lượng 0,5% cũng đã ức chế hoạt động của nhiều vi sinh vật lạ gây ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men. Khi tích tụ axit lactic với hàm lượng cao (1-2%) thì ngay cả các vi khuẩn lactic cũng bị ức chế và do đĩ quá trình lên men lactic bị kìm hãm. Nồng độ axit lactic giới hạn đạt được trong quá trình lên men lactic phụ thuộc vào lượng đường cĩ sẵn trong nguyên liệu, nồng độ muối, nhiệt độ lên men và loại vi khuẩn lactic. Tuy nhiên axit lactic khơng ức chế hoạt động của một số nấm men nấm mốc. Nhiệt độ lên men ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men và tới chất lượng sản phẩm. Ở nhiệt độ 0-40C thì sự lên men lactic khơng bị đình chỉ mà chỉ diễn ra chậm. Nhiệt độ tối ưu cho nhiều loại vi khuẩn lactic là 35-420C, nhưng nhiệt độ này cũng kích thích sự phát triển của nhiều vi sinh vật lạ. Sự lên men lactic cần tiến hành trong điều kiện yếm khí. Phần lớn các vi khuẩn lactic hoạt động trong điều kiện yếm khí tùy tiện, tức là phát triển khơng nhất thiết phải cĩ mặt của oxy khơng khí. Một số lồi trong chúng cũng bị giảm hoạt động khi cĩ mặt của oxy khơng khí [17]. I.2.6. Các biện pháp làm chủ quá trình lên men I.2.6.1. Làm chủ chất lƣợng ban đầu của nguyên liệu Lượng vi sinh vật ban đầu của nguyên liệu là một nhân tố quan trọng. Rửa rau cho phép loại bỏ một phần vi sinh vật và những cặn bẩn. Theo Hasan và các cộng sự (1993), một sự chiếu xạ thích hợp đối với nguyên liệu trước khi lên men sẽ tạo điều kiện thuận lợi hơn cho sự phát triển của vi khuẩn lactic - loại vi khuẩn chịu được chiếu xạ tốt hơn so với các loại khác. Tuy nhiên biện pháp này cịn ít được sử Đồ án tốt nghiệp Cao Hồng Lan 10 dụng do giá thành cao. Cĩ thể xử lý nhiệt đối với nguyên liệu trước khi muối khi đĩ cũng làm giảm được một phần vi sinh vật cĩ trong nguyên liệu. Mặt khác thời gian tồn trữ của nguyên liệu trước khi muối cũng ảnh hưởng lớn đến chất lượng sản phẩm. Theo Andersson và các cộng sự (1990) cà rốt lên men ngay sau khi thu hoạch, sẽ bảo quản được lâu hơn cà rốt lên men sau khi thu hoạch 6 tháng được bảo quản ở 20C [16]. I.2.6.2. Thay đổi các điều kiện lên men Một phương pháp khác để làm chủ quá trình lên men là thay đổi các điều kiện lên men: thay đổi nồng độ đường, nồng độ muối khác nhau, tìm điều kiện nhiệt độ thích hợp, axit hĩa, tạo mơi trường yếm khí thích hợp, cải thiện tính đệm...Ví dụ như thêm canxi axetat cho phép một mặt tăng tính đệm của mơi trường mặt khác đảm bảo sự phân hủy hồn tồn lượng đường [16]. I.2.6.3. Sử dụng chủng vi khuẩn lactic thuần khiết Hiện nay, ở các nước phương Tây việc sử dụng chủng vi khuẩn thuần khiết vào quá trình sản xuất các sản phẩm lên men rau quả là rất phổ biến. Lựa chọn chủng vi khuẩn này dựa trên các chỉ tiêu sau: - Phát triển nhanh - Tạo lượng axit nhanh - Đảm bảo sự lên men đường hồn tồn, tránh sự lên men phụ bởi nấm men. - Các tế bào vi khuẩn phải cĩ khả năng lắng tốt, lọc nhanh để dễ dàng loại bỏ nếu cần thiết. - Cĩ khả năng giữ được hoạt tính sau khi bảo quản [17]. I.3. Vi khuẩn lactic và quá trình lên men lactic Axit lactic (CH3CHOHCOOH) được sử dụng từ rất lâu để bảo quản và chế biến thực phẩm. Axit này lần đầu tiên được phát hiện ra từ sữa bị lên men bởi nhà bác học Thụy Điển Carl Wilhelm Scheele năm 1780 và được coi là axit sữa. Trong thời gian từ năm 1857 đến 1876 Pasteur đã chỉ ra rằng tất cả các quá trình lên men đều do tác dụng của vi sinh vật, mỗi dạng lên men đều do một loại vi sinh vật gây ra. Ơng cũng chứng minh được quá trình làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhĩm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic [10]. Năm 1878, Joseph Lister lần đầu tiên phân lập được một loại vi khuẩn lactic đặt tên là Bacterium lactis (hiện nay gọi là Streptococcus lactis), về sau các nhà khoa học liên tiếp phân lập được các loại Đồ án tốt nghiệp Cao Hồng Lan 11 vi khuẩn lactic khác nhau. Năm 1919, Orla Iencen là người đầu tiên nghiên cứu, phân loại cĩ hệ thống các vi khuẩn lactic. Tiếp đĩ các nhà khoa học người Đức và Thụy Sĩ G.Muler và A.Ostervalder đã nghiên cứu tỉ mỉ các thay đổi hố sinh trong các loại “rượu vang bị bệnh”. Ơng đặt tên cho các loại nghiên cứu được là Bacterium mannitopeum, Bacterium graccile, Bacterium intermedium, Micrococcus acidovorax, Micrococcus variococcus. Tuy nhiên việc định tên này chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ. Sau các nhà khoa học này cịn cĩ rất nhiều nhà khoa học khác nghiên cứu về vi khuẩn lactic trong các loại sản phẩm khác nhau như thịt, rượu vang, sữa...[10] Tất cả các vi khuẩn lactic đều cĩ những đặc tính chung: là vi khuẩn Gram dương, khơng chuyển động, khơng tạo bào tử, hơ hấp yếm khí hoặc yếm khí tùy tiện. Chúng đều địi hỏi nguồn dinh dưỡng tổng hợp chứa axit amin, peptit, vitamin, muối, axit béo, đường cĩ khả năng lên men. Vi khuẩn lactic lên men đường để tạo ra năng lượng cần thiết cho sự phát triển của chúng. Nhờ quá trình lên men, đường được chuyển hĩa thành axit lactic, etanol, axit axetic và dioxyt cacbon trong trường hợp lên men dị hình [15]. I.3.1. Phân loại vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic cĩ thể được phân loại theo hình thức lên men và theo lượng sản phẩm cuối cùng tạo ra:  Vi khuẩn lactic lên men đồng hình: lên men đồng hình là con đường lên men tạo ra 70 - 90% axit lactic. Vi khuẩn lactic lên men đồng hình cĩ thể được chia thành hai nhĩm đĩ là Streptococcus và Lactobacterium.  Vi khuẩn lên men lactic dị hình: lên men dị hình là con đường lên men ngồi axit lactic tạo thành cịn cĩ các sản phẩm như axit axetic, CO2 và etanol. Tỷ lệ giữa các sản phẩm này thay đổi ít hay nhiều tùy thuộc vào loại vi khuẩn và điều kiện mơi trường. Một số lồi lên men lactic dị hình như Bacterium coli, Lactobacillus casei... I.3.2. Đặc điểm hình thái Các giống vi khuẩn khác nhau cĩ hình dạng và kích thước khác nhau. Ngồi ra hình dạng và kích thước của tế bào vi khuẩn lactic cịn phụ thuộc vào mơi trường, điều kiện nuơi cấy, sự cĩ mặt của oxy và tuổi của tế bào [17]. Đồ án tốt nghiệp Cao Hồng Lan 12 Những tế bào hình cầu, hình ơvan thường cĩ đường kính khoảng 0,5-2 m, sắp xếp riêng biệt, cặp đơi hoặc thành chuỗi dài. Các giống Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus và Enterrococcus được tạo thành từ những tế bào hình ơvan sắp xếp thành chuỗi, giống Leuconostoc được tạo thành từ những tế bào hình thấu kính (hình hột đậu lăng) sắp xếp thành cặp hay thành chuỗi, các giống Pediococcus, Aerococcus, Tetragenococcus được tạo thành từ những tế bào hình cầu ghép nối bốn tế bào [17]. Những tế bào hình que cân đối cĩ kích thước từ 0,5-2m chiều rộng và 1- 10m chiều dài, sắp xếp riêng biệt, cặp đơi hoặc thành chuỗi dài. Theo Orla Jensen, giống Lactobacillus cĩ thể chia làm ba lồi : Thermobacterium (lên men đồng hình chặt chẽ) được tạo thành từ những tế bào hình que dài, riêng biệt hay được sắp xếp thành những chuỗi rất dài hoặc ở dạng chuỗi xoắn, lồi Streptobacterium (lên men dị hành tùy tiện) được tạo thành từ những tế bào hình que ngắn đơi khi cĩ dạng cong, sắp xếp thành chuỗi ngắn hoặc rất dài, lồi Betabacterium (lên men dị hình chặt chẽ) nĩi chung được tạo thành từ những tế bào rất ngắn, thẳng, sắp xếp riêng biệt. Giống Carnobacterium được tạo thành từ những tế bào mà chiều dài của chúng thay đổi theo tuổi [17]. Những tế bào hình que khơng cân đối điển hình là Bifidobacterium. Chúng được tạo thành từ những tế bào hình que sần sùi, phân nhánh tạo thành hình ngơi sao, hình giàn đậu, hình chữ V [17]. Thành phần mơi trường cũng như sự cĩ mặt của oxy cĩ ảnh hưởng lớn tới hình dạng tế bào. Trong mơi trường cĩ hàm lượng etanol cao sẽ làm cho chiều dài tế bào dài ra. Mặt khác etanol cịn kìm hãm sự phân chia tế bào mạnh hơn so với sự sinh trưởng. Thực tế là trong mơi trường cĩ etanol trực khuẩn lactic sẽ dài ra, mảnh hơn, cịn cầu khuẩn thì bảo tồn được hình dạng của mình [17]. I.3.3. Đặc điểm sinh lí sinh hĩa Các cách phân loại vi khuẩn trong nhĩm lactic từ lâu đã được dựa vào một tập hợp các tính chất sinh lý và hố sinh cĩ thể dễ dàng xác định được đồng thời lại đĩng vai trị quan trọng trong ứng dụng cơng nghiệp. Các dịng khác nhau mà chúng ta cĩ thể quan sát được giữa các chi, lồi của nhĩm vi khuẩn này chính là kết quả của sự biến đổi gen trong quá trình phát triển do tính khơng đồng nhất của mơi trường nuơi cấy các thế hệ vi khuẩn đầu tiên [17]. Đồ án tốt nghiệp Cao Hồng Lan 13 Nhiều tính chất đã được sử dụng để phân loại vi khuẩn lactic : lượng axit lactic sinh ra trong quá trình lên men ; nhiệt độ phát triển thấp nhất, cao nhất và thích hợp nhất ; khả năng phát triển trong mơi trường cĩ chứa oxy và ở các nồng độ natri clorua khác nhau ; khả năng sinh khí và các hợp chất thơm bay hơi ; khả năng chống lại bacteriophage ; khả năng chịu các chất kháng sinh ; khả năng sinh ra các họp chất ức chế như bacteriocine v.v... Một trong các chỉ tiêu quan trọng để tuyển chọn các chủng vi khuẩn để ứng dụng trong chế biến thực phẩm phải kể đến : hoạt lực proteolytic (làm chín phomat), lên men xitrat (tạo hương cho các sản phẩm lên men tưoi)... I.3.4. Ứng dụng của quá trình lên men lactic I.3.4.1. Vai trị và ứng dụng của vi khuẩn lactic trong quá trình chế biến thực phẩm Quá trình lên men lactic là một quá trình chuyển hố yếm khí glucoza thành axit lactic, được thực hiện bởi vi khuẩn lactic. Sự chuyển hố này đã được biết đến từ lâu và được ứng dụng rộng rãi trong quá trình chế biến các sản phẩm thực phẩm. Vi khuẩn lactic, cùng với nấm men, là các vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất trong các quy trình sản xuất thực phẩm. Ở Pháp hàng năm cĩ 15 triệu lít sữa được chế biến tbành phomat và sữa chua nhờ vào hoạt động của các vi khuẩn này. Chúng cịn đĩng vai trị mấu chốt trong sản xuất các sản phẩm truyền thống như bơ và các sản phẩm từ sữa, thực phẩm muối (xúc xích), bánh mỳ, bắp cải muối, các rau quả muối khác, rượu vang, rượu táo...[19], [[20]. Trong cơng nghiệp thực phẩm, ứng dụng của quá trình lên men lactic trong chế biến các sản phẩm rau quả và sữa khơng chỉ nhằm mục đích kéo dài thời gian bảo quản, mà cịn nhằm tạo ra hương vị và chất lượng mong muốn cho sản phẩm cuối cùng. Một số lượng lớn các chủng loại sản phẩm xuất phát từ quá trình lên men lactic được giải thích bởi sự phong phú của nguyên liệu đầu và phương thức sản xuất cũng như sự phong phú của chủng loại vi khuẩn phát triển tự nhiên hay được đưa vào. Tùy thuộc vào sản phẩm, các chủng vi khuẩn hay gặp nhất là Lactococcus lactis (trong phomat), Streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus (sữa chua), Lactobacillus sake (thực phẩm muối) và Oenococcus oenos (rượu vang). Ngồi chức năng chính trong việc tạo ra hương thơm, cấu trúc mong muốn cho sản phẩm, vi khuẩn lactic cịn ngăn chặn sự phát triển của các vi khuẩn gây hại như Listeria, các vi khuẩn đường ruột, hay sự biến tính thực phẩm bởi các vi sinh vật khác như Pseudomonas hay Clostridium [19], [22]. Đồ án tốt nghiệp Cao Hồng Lan 14 Bảng 2 : Một vài sản phẩm thực phẩm đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp lên men lactic (Theo J.M.Jay.Modern Food Microbiology, 3 rd ed New York: Van Nostran Reinhod, 1986) [10] Sản phẩm Nguyên liệu ban đầu Vi sinh vật lên men Nơi sản xuất Từ sữa Phomat Sữa Leuconostoc sp Steptococcus sp Tồn thế giới Kefir Sữa Steptococcus lactic Lactobacillus bulgaricus Tồn thế giới Yoghurt Sữa tươi, sữa bột Steptococcus thermophilus Lactobacillus bulgaricus Tồn thế giới Từ thịt cá Xúc xích khơ Thịt bị tươi, thịt lợn Pediococcus cerevisiae Mĩ, Châu âu Izushi Cá tươi, gạo, rau Lactobacillus spp Nhật bản Từ thực vật Kim chi Rau cải và các loại rau khác Vi khuẩn lactic Triều Tiên Ơliu muối chua Ơ liu xanh Leuconostoc mensentoroides Lactobacillus plantarum Tồn thế giới Dưa bắp cải Bắp cải Leuconostoc mensentoroides Lactobacillus plantarum Tồn thế giới Từ ngũ cốc Idli Bột gạo, bột đậu Leuconostoc mensentoroides Ấn Độ Bánh chua lúa mạch đen Bột lúa mì đen Leuconostoc mensentoroides Thụy Sĩ I.3.4.2. Ứng dụng vi khuẩn lactic trong lên men rau quả Nhiều sản phẩm lên men từ rau và quả đã được tiêu thụ trên khắp thế giới. Các sản phẩm của quá trình lên men lactic này càng ngày càng thêm phong phú đồng thời đáp ứng được nhu cầu về thực phẩm của một lượng lớn dân số. Bảng 3 đưa ra các ví dụ về các sản phẩm lên men từ rau và quả trên thế giới. Bảng 3 : Các sản phẩm rau quả lên men trên tồn thế giới [21] Địa điểm Loại sản phẩm Ấn độ Acar, Achar, Tandal achar, Garam nimboo achar Rau quả muối mặn Gundruk Rau khơ muối Chanh muối, xồi muối Đồ án tốt nghiệp Cao Hồng Lan 15 Đơng Nam Á Asinan, Burong mangga, Dalok, Jeruk, Kiam-chai, Kiam-cheyi, Kong-chai, N._.