Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn Emodin từ đại hoàng phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc

OÀNG PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG THUỐC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Chuyên ngành : Kiểm nghiệm thuốc - độc chất Mã số : 60 73 15 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS.Trịnh Văn Lẩu 2. ThS. Phạm Thị Giảng Hà Nội - 2008 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tôi xin chân thành cảm ơn: PGS. TS Trịnh Văn Lẩu - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương. Thạc sĩ Phạm Thị Giảng - Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Dược liệu, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương. Những người đã tận tình, trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới: Thạc sĩ Nguyễn Tuấn Anh, dược sĩ Trần Thị Thu Hương – Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Dược liệu - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương. PGS.TS Chu Đình Kính - Viện Hoá học- Viện Khoa học công nghệ Việt Nam Tiến sĩ Trần Việt Hùng – Khoa Vật lý đo lường - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương. Thạc sĩ Lê Thị Hường Hoa - Khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương. Đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng quản lý sau Đại học, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà nội, các bạn đồng nghiệp trong khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm, khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Dược liệu, khoa Vật lý đo lường viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi, gia đình và bạn bè đã động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như quá trình thực hiện luận văn này. Hà nội, ngày tháng năm 2008 Dược sĩ: Đỗ Thị Thanh Thuỷ MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Vài nét về chất đối chiếu (chất chuẩn) 3 1.2. Tổng quan về các vị dược liệu dùng trong nghiên cứu đề tài 3 1.2.1. Đại hoàng (Rhizoma Rhei) 4 1.2.2. Cốt khí củ (Radix Polygoni cuspidati) 5 1.3. Khái niệm chung về anthranoid 6 1.4. Emodin 6 1.4.1. Đặc điểm và tính chất của Emodin 6 1.4.2. Tác dụng dược lý của Emodin 8 1.5. Tổng quan về chiết xuất dược liệu, chiết xuất và tinh chế anthranoid 8 1.5.1. Chiết xuất dược liệu 8 1.5.2. Chiết xuất và tinh chế anthranoid 9 1.6. Tổng quan về một số phương pháp hoá lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài 10 1.6.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) 10 1.6.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 12 1.6.3. Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy 16 1.6.4. Phương pháp đo phổ hồng ngoại (phổ IR) 16 1.6.5. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 17 1.6.6. Phương pháp phân tích khối phổ (MS) 18 1.7. Nhận xét chung 20 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Nguyên liệu 21 2.2. Phương tiện nghiên cứu 21 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ 21 2.2.2. Hoá chất, dung môi 22 2.3. Nội dung nghiên cứu 22 2.4. Các phương pháp dùng để nghiên cứu 23 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 25 3.1. Chiết xuất và tinh chế Emodin từ vị dược liệu Đại hoàng 25 3.1.1. Chiết xuất Emodin 25 3.1.2. Tinh chế Emodin 32 3.2. Định tính Emodin tinh chế được bằng SKLM, xác định nhiệt độ nóng chảy và đo phổ IR 41 3.2.1. Định tính Emodin tinh chế được bằng SKLM 41 3.2.2. Xác định nhiệt độ nóng chảy của Emodin tinh chế được 44 3.2.3. Đo phổ hồng ngoại của Emodin tinh chế được 45 3.3. Xác minh cấu trúc của Emodin tinh chế được 46 3.3.1. Phân tích khối phổ 46 3.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 46 3.4. Định tính, định lượng Emodin tinh chế được và xác định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được bằng HPLC 49 3.4.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật để định tính, định lượng Emodin tinh chế được và xác định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được bằng phương pháp HPLC với detector UV 49 3.4.2. Định tính Emodin tinh chế được 52 3.4.3. Định lượng Emodin tinh chế được 55 3.4.4. Xác định giới hạn tổng cộng các tạp chất chất liên quan của Emodin tinh chế được 56 3.5. Thẩm định phương pháp HPLC đã sử dụng để định lượng Emodin tinh chế được 59 3.5.1. Tính chính xác 59 3.5.2. Tính tuyến tính 60 3.5.3. Tính đúng 61 3.5.4. Tính đặc hiệu 63 3.6. Xây dựng tiêu chuẩn dự thảo cho chất chuẩn phòng thí nghiệm Emodin 65 3.7. Sử dụng Emodin tinh chế được làm chất chuẩn phòng thí nghiệm để định tính, định lượng Emodin trong hai vị dược liệu: Đại hoàng, Cốt khí củ 67 3.7.1. Định tính và định lượng Emodin trong vị dược liệu Đại hoàng 67 3.7.2. Định tính và định lượng Emodin trong vị dược liệu Cốt khí củ 76 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 88 4.1. Về chiết xuất và tinh chế 88 4.2. Về định tính Emodin tinh chế được bằng SKLM, xác định nhiệt độ nóng chảy và đo phổ IR 88 4.3. Về việc xác minh cấu trúc của Emodin tinh chế được 88 4.4. Về định tính, định lượng Emodin tinh chế được, xác định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được bằng HPLC 88 4.5. Về việc sử dụng Emodin tinh chế được làm chất chuẩn phòng thí nghiệm để định tính, định lượng Emodin trong hai vị dược liệu: Đại hoàng, Cốt khí củ 90 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91 KẾT LUẬN 91 KIẾN NGHỊ 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13C-NMR : Carbon (13) Nuclear magnetic resonance C : Chuẩn C + T : Chuẩn + Thử 1H-NMR : Proton nuclear magnetic resonance DĐVN III : Dược điển Việt Nam III DEPT : Distotionless enhancement by polarization transfer ĐT : Định tính GLP : Good laboratory practice HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation HMQC : Heteronuclear multiple quantum correlation HPLC : High performance liquid chromatography. HQ : Huỳnh quang HSQC : Heteronuclear single quantum correlation IEC : International electrotechnical commission IR : Infrared ISO : International organization for standardization MS : Mass spectrum NMR : Nuclear magnetic resonance PA : Pure analysis PĐ : Phân đoạn. RSD : Relative standard deviation SKLM : Sắc ký lớp mỏng T : Thử TB : Trung bình TCKC1 : Thử cốt khí củ 1 TCKC2 : Thử cốt khí củ 2 TT : Thứ tự UV : Ultra violete VIS : Visible DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Độ tan của Emodin trong một số dung môi hữu cơ ở 250C 7 Bảng 3.1. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của cắn 1 - Hệ I 29 Bảng 3.2. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của cắn 2 - Hệ I 30 Bảng 3.3. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của cắn 3 - Hệ I 31 Bảng 3.4. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của các phân đoạn khi khảo sát với hệ dung môi I 35 Bảng 3.5. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của phân đoạn 5 khi khảo sát với hệ dung môi II và III 39 Bảng 3.6. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của cắn Emodin khi khảo sát với hệ dung môi I, II và III 42 Bảng 3.7. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của cắn Emodin 45 Bảng 3.8. Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân của cắn Emodin 48 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi định lượng Emodin tinh chế được 50 Bảng 3.10. Kết quả định lượng Emodin tinh chế được 56 Bảng 3.11. Một số thông số của các pic phụ trên sắc ký đồ của dung dịch thử khi xác định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được 58 Bảng 3.12. Kết quả xác định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được 59 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 60 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 63 Bảng 3.15. Kết quả định tính Emodin trong vị dược liệu Đại hoàng bằng SKLM 69 Bảng 3.16. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi định lượng Emodin trong vị dược liệu Đại hoàng 74 Bảng 3.17. Kết quả định lượng Emodin trong vị dược liệu Đại hoàng 75 Bảng 3.18. Kết quả định tính Emodin tự do trong vị dược liệu Cốt khí củ bằng SKLM 78 Bảng 3.19. Kết quả định tính Emodin toàn phần trong vị dược liệu Cốt khí củ bằng SKLM 79 Bảng 3.20. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi định lượng Emodin trong vị dược liệu Cốt khí củ 85 Bảng 3.21. Kết quả định lượng Emodin trong vị dược liệu Cốt khí củ 86 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1. Vị dược liệu Đại hoàng 4 Hình 1.2. Vị dược liệu Cốt khí củ 6 Hình 1.3. Cấu trúc hoá học của Emodin 7 Hình 1.4. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng 12 Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất Emodin bằng phương pháp đun nóng hồi lưu 27 Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát cắn 1-Hệ I 29 Hình 3.3. Sắc ký đồ khảo sát cắn 2-Hệ I 30 Hình 3.4. Sắc ký đồ khảo sát cắn 3-Hệ I 31 Hình 3.5. Hệ thống sắc ký cột tự tạo để tinh chế Emodin 34 Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 1- Hệ I 36 Hình 3.7. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 2 - Hệ I 36 Hình 3.8. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 3- Hệ I 37 Hình 3.9. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 4- Hệ I 37 Hình 3.10. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 5 - Hệ I 38 Hình 3.11. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 5 - Hệ II 39 Hình 3.12. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 5 - Hệ III 40 Hình 3.13. Ảnh chụp cắn Emodin 41 Hình 3.14. Sắc ký đồ khảo sát cắn Emodin - Hệ I 43 Hình 3.15. Sắc ký đồ khảo sát cắn Emodin - Hệ II 43 Hình 3.16. Sắc ký đồ khảo sát cắn Emodin - Hệ III 44 Hình 3.17. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn khi định lượng Emodin tinh chế được 52 Hình 3.18. Sắc ký đồ dung dịch thử khi định lượng Emodin tinh chế được 52 Hình 3.19. Phổ UV-VIS của mẫu chuẩn và mẫu thử khi định lượng Emodin tinh chế được 53 Hình 3.20. Kết quả chồng phổ pic Emodin của mẫu chuẩn và mẫu thử khi định lượng Emodin tinh chế được 54 Hình 3.21. Kết quả xác định độ tinh khiết của pic Emodin khi định lượng Emodin tinh chế được 55 Hình 3.22. Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu khi xác định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được 57 Hình 3.23. Sắc ký đồ dung dịch thử khi xác định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được 57 Hình 3.24. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích của pic Emodin 61 Hình 3.25. Sắc ký đồ của mẫu trắng – Khảo sát độ đặc hiệu 64 Hình 3.26. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn-Khảo sát độ đặc hiệu 64 Hình 3.27. Sắc ký đồ của mẫu thử-Khảo sát độ đặc hiệu 64 Hình 3.28. Sắc ký đồ thu được khi định tính Emodin trong vị dược liệu Đại hoàng bằng SKLM 69 Hình 3.29. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn khi định lượng Emodin trong vị dược liệu Đại hoàng bằng HPLC 70 Hình 3.30. Sắc ký đồ dung dịch thử khi định lượng Emodin trong vị dược liệu Đại hoàng bằng HPLC 70 Hình 3.31. Phổ UV-VIS của dung dịch chuẩn và dung dịch thử khi định lượng Emodin trong vị dược liệu Đại hoàng 71 Hình 3.32. Kết quả chồng phổ UV-VIS của pic Emodin thu được từ dung dịch thử và dung dịch chuẩn khi định lượng Emodin trong vị dược liệu Đại hoàng 71 Hình 3.33. Sắc ký đồ thu được khi định tính Emodin tự do trong vị dược liệu Cốt khí củ bằng SKLM 78 Hình 3.34. Sắc ký đồ thu được khi định tính Emodin toàn phần trong vị dược liệu Cốt khí củ bằng SKLM 80 Hình 3.35. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn khi định lượng Emodin trong vị dược liệu Cốt khí củ bằng HPLC 81 Hình 3.36. Sắc ký đồ dung dịch thử khi định lượng Emodin trong vị dược liệu Cốt khí củ bằng HPLC 81 Hình 3.37. Phổ UV-VIS của dung dịch chuẩn và dung dịch thử khi định lượng Emodin trong vị dược liệu Cốt khí củ 82 Hình 3.38. Kết quả chồng phổ UV-VIS của pic Emodin thu được từ dung dịch chuẩn và dung dịch thử khi định lượng Emodin trong vị dược liệu Cốt khí củ 82 ĐẶT VẤN ĐỀ Những năm gần đây cùng với sự phát triển của nền kinh tế nước nhà, ngành dược cũng có nhiều khởi sắc. Thị trường dược phẩm nở rộ với nhiều chủng loại thuốc khác nhau: thuốc sản xuất trong nước và thuốc nhập ngoại, thuốc tân dược và thuốc đông dược, thuốc đơn thành phần và thuốc đa thành phần, cùng một loại hoạt chất nhưng có nhiều biệt dược khác nhau, nhiều dạng bào chế khác nhau. Trước một thị trường dược phẩm đa dạng như vậy thì việc tăng cường quản lý Nhà nước để đảm bảo chất lượng thuốc cho nhân dân luôn được coi là nhiệm vụ chiến lược của ngành Dược nói riêng và ngành Y tế nói chung. Một trong những khâu quan trọng trong nhiệm vụ đảm bảo chất lượng thuốc cho nhân dân hiện nay là công tác kiểm tra chất lượng thuốc. Trong công tác này chất chuẩn đóng vai trò rất quan trọng vì nhiều phép thử như định tính, định lượng, xác định tạp chất ... đều cần đến chất chuẩn. Đến nay chúng ta đã thiết lập được hàng trăm chất chuẩn, chủ yếu là chất chuẩn hoá học có nguồn gốc tổng hợp phục vụ đắc lực cho công tác kiểm tra chất lượng thuốc. Tuy nhiên vẫn còn rất nhiều chất chuẩn đặc biệt là các chất chuẩn có nguồn gốc dược liệu chúng ta chưa thiết lập được để đáp ứng yêu cầu của công tác kiểm nghiệm thuốc nói chung và thuốc đông dược, dược liệu nói riêng. Một trong số những chất chuẩn hiện nay chúng ta chưa thiết lập được là Emodin, một hoạt chất có trong các vị dược liệu như Đại hoàng (Rhizoma Rhei), Hà thủ ô đỏ (Radix Polygoni multiflori), Cốt khí củ (Radix Polygoni cuspidati), Muồng trâu (Folium Cassiae alatae), Chút chít (Radix Rumicis). . . Xuất phát từ nhu cầu cần có chất chuẩn để phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn Emodin từ Đại hoàng phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc” Đề tài này là một phần trong đề tài cấp bộ “Nghiên cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường dùng phục vụ công tác giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược” của Khoa kiểm nghiệm Đông dược - Dược liệu - Việm kiểm nghiệm thuốc Trung ương. Đề tài được thực hiện với các mục tiêu sau: 1. Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế Emodin từ vị dược liệu Đại hoàng. 2. Định tính, xác minh cấu trúc, định lượng Emodin tinh chế được và xác định giới hạn tổng cộng các tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được. 3. Sử dụng Emodin tinh chế được làm chất chuẩn phòng thí nghiệm để định tính và định lượng Emodin trong hai vị dược liệu: Đại hoàng, Cốt khí củ. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Vài nét về chất đối chiếu (chất chuẩn) Các chất đối chiếu là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã được qui định về hoá học, vật lý, sinh học. Trong các phép thử đó, các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất cần thử. Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng. Chất đối chiếu được dùng trong các phép thử sau: - Định tính bằng phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại. - Định lượng bằng phương pháp quang phổ tử ngoại và khả kiến, quang phổ huỳnh quang. - Các phép thử định tính, tạp chất và định lượng bằng phương pháp sắc ký. - Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật. - Các phép chuẩn độ thể tích, phân tích trọng lượng. - Các phép thử sinh học. - Một số phép thử khác có hướng dẫn trong các chuyên luận riêng [6]. Ngoài ra các chất đối chiếu còn được dùng để: - Thẩm định một phương pháp mới - Chuẩn hoá các chất đối chiếu khác - Khẳng định giá trị pháp lý của một phương pháp đã chuẩn hoá [28]. 1.2. Tổng quan về các vị dược liệu dùng trong nghiên cứu đề tài Hai vị dược liệu: Đại hoàng, Cốt khí củ mà chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu đề tài đều là các vị dược liệu thuộc nhóm dược liệu chứa anthranoid họ Rau răm (Polygonaceae). Các vị dược liệu này được sử dụng khá phổ biến trong nhân dân cũng như thường xuất hiện trong các bài thuốc Y học cổ truyền [21], [22], [23], [24]. 1.2.1. Đại hoàng (Rhizoma Rhei) Dược liệu là thân rễ phơi hay sấy khô của nhiều loại đại hoàng như chưởng diệp đại hoàng, Rheum palmatum L., đường cổ đặc đại hoàng Rheum tanguticum Maxim.ex Regel (Rheum palmatum L.var. tanguticum Maxim, hoặc dược dụng đại hoàng, họ Rau răm Polygonaceae [4], [6], [15], [19], [22], [26]. Đặc điểm dược liệu: Dược liệu là những miếng hình trụ hoặc mặt phẳng hơi lồi. Mặt ngoài màu vàng nâu. Trên mặt đôi chỗ thấy rõ một mạng lưới màu trắng, mắt hình quả trám và những ngôi sao nhỏ. Vết bẻ màu đỏ cam có hạt lổn nhổn [6], [15], [22], [25], [26], [27]. (Hình 1.1) Thành phần hoá học: Anthraglycosid, anthraquinon tự do (emodin, chrysophanol, physcion, aloe-emodin, rhein), canxi oxalat, tinh bột, pectin, chất nhựa [3], [4], [15], [19], [22], [26]. Công dụng: Dùng chữa hạ lỵ, ứ huyết, kinh bế thuỷ thũng, thấp nhiệt gây vàng da, ung thũng đinh độc. Dùng liều nhẹ làm thuốc giúp sự tiêu hoá, chữa kém ăn, ăn không tiêu, đau bụng, da vàng. Dùng với liều cao làm thuốc tẩy nhẹ, dùng cho người đầy bụng, đi lỵ, hoàng đản (da và mắt vàng) [3], [4], [9], [25], [26]. Hình 1.1. Vị dược liệu Đại hoàng 1.2.2. Cốt khí củ (Radix Polygoni cuspidati) Dược liệu là rễ phơi khô của cây Cốt khí củ Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc., họ Rau răm Polygonaceae [4], [6], [11], [15], [17], [19], [22], [26]. Đặc điểm dược liệu: Rễ (quen gọi là củ ) hình trụ cong queo, đường kính 0,5 – 1,5 cm, được cắt thành miếng dày khoảng 1-2 cm. Mặt ngoài màu nâu xám, sần sùi, nhăn nheo theo chiều dọc, có các mấu đốt lồi lên chia củ thành từng gióng. Mặt cắt ngang màu vàng bẩn, hầu hết phần lõi ở giữa rỗng hoặc nếu không rỗng thì có màu nâu sẫm, thể chất nhẹ, hơi cứng [15], [16], [17], [22], [26], [27]. (Hình 1.2) Thành phần hoá học: Trong rễ Cốt khí củ có chứa các dẫn chất anthranoid ở dạng tự do và dạng kết hợp glycosid hàm lượng 0,1- 0,5 %. Các thành phần đã xác định: chrysophanol, emodin, physcion, emodin 8-b-glucosid. Ngoài các dẫn chất anthranoid, trong rễ cốt khí củ còn có polydatin là một stilben glucosid khi thuỷ phân cho resveratrol, trong rễ còn có tanin [4], [11], [15], [16], [19], [26] Công dụng: Cốt khí củ được dùng chữa phong thấp tê bại, đau nhức gân xương, chấn thương, ngã sưng đau ứ huyết, kinh nguyệt bế tắc, sau khi đẻ huyết hôi bị tích trong tử cung, bụng chướng, đái rắt, đái buốt, đái ra máu. Còn dùng trị mụn nhọt, lở ngứa và dùng làm thuốc cầm máu trong trường hợp vết thương chảy máu [4], [9], [11], [16], [19], [22], [26] Hình 1.2. Vị dược liệu Cốt khí củ 1.3. Khái niệm chung về anthranoid Anthranoid hay anthraquinon là những hợp chất nằm trong nhóm lớn hydroxyquinon. Những hợp chất quinon là những sắc tố, được tìm thấy chủ yếu trong ngành nấm, địa y, thực vật bậc cao nhưng cũng còn tìm thấy trong động vật. Căn cứ vào số vòng thơm đính thêm vào nhân quinon mà người ta xếp thành benzoquinon, naphtoquinon, anthraquinon và naphtacenquinon hay còn gọi là anthracyclinon (4 vòng). Các anthraquinon hay anthranoid khi tồn tại dưới dạng glycosid thì được gọi là anthraglycosid hay anthracenosid. Cũng như các loại glycosid khác, anthraglycosid khi bị thuỷ phân thì giải phóng ra phần aglycon và phần đường. Các dẫn chất anthraquinon trong tự nhiên chủ yếu là các dẫn chất 9, 10-anthracendion, được phân bố trong khoảng 30 họ thực vật khác nhau chủ chủ yếu là những cây hai lá mầm và trong các họ Caesalpiniaceae, Rhamnaceae, Rubiaceae, Polygonaceae [12], [13], [26], [30]. 1.4. Emodin 1.4.1. Đặc điểm và tính chất của Emodin Emodin là một anthraquinon tự do có trong một số vị dược liệu như đại hoàng, cốt khí củ, hà thủ ô đỏ, muồng trâu, chút chít . . . [3], [4], [19], [25] Công thức phân tử: C15H10O5 Phân tử lượng: 270,24 Emodin có cấu trúc hoá học như hình 1.4 Hình 1.3. Cấu trúc hoá học của Emodin Tên khoa học: 1,3,8-tri hydroxy-6-methyl-9,10-anthracenedione. Tính chất: - Bột kết tinh hoặc tinh thể hình kim màu vàng cam - Nhiệt độ nóng chảy khoảng 256oC – 257oC - Không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ (ether, ether dầu hoả, cloroform, benzen, aceton, acid acetic băng). Tan trong dung dịch kiềm, dung dịch natri carbonat, dung dịch amoniac [26], [42]. - Độ tan của Emodin trong một số dung môi hữu cơ ở 250C (tính theo g/100 ml dung môi) được thể hiện ở bảng 1.1 [42] Bảng 1.1. Độ tan của Emodin trong một số dung môi hữu cơ ở 250C TT Dung môi hữu cơ Độ tan của Emodin (g /100 ml) 1 Ether 0,140 2 Cloroform 0,071 3 Carbon tetraclorid 0,010 4 Carbon bisulfid 0,009 5 Benzen 0,041 Emodin có 4 cực đại hấp thụ trong vùng tử ngoại là: 223 nm, 254 nm, 267 nm, 290 nm và 1 cực đại hấp thụ trong vùng khả kiến là 440 nm [25], [26], [42]. 1.4.2. Tác dụng dược lý của emodin Emodin có tác dụng lợi niệu do ức chế Na+K+ATPase [4]. Thử nghiệm trên chuột cho thấy Emodin có khả năng bảo vệ tế bào gan, phục hồi hoạt động của tế bào gan nhiễm mỡ, cải thiện tuần hoàn gan, giảm các biểu hiện bệnh lý của gan [50]. Với liều 75 mg/kg có tác dụng ức chế ung thư vú ở chuột [4], [25]. Emodin cũng có khả năng chống ung thư phổi, ung thư gan, ung thư cổ ở người do tác dụng ức chế hiện tượng đột biến gen, gây độc với tế bào ung thư [35], [37], [39], [40], [51], [52]. Emodin có tác dụng lên màng sinh học, có ái lực cao với các màng phospholipid vì thế có khả năng kháng virus, vi khuẩn [36]. Ngoài ra Emodin còn có khả năng chống loãng xương [46]. 1.5. Tổng quan về chiết xuất dược liệu, chiết xuất và tinh chế anthranoid 1.5.1. Chiết xuất dược liệu [29] Chiết xuất dược liệu có vai trò rất quan trọng trước hết là để lấy được các chất có trong dược liệu dưới dạng cần thiết (dung dịch, bột) toàn phần hoặc tinh khiết hơn cho mục đích nghiên cứu hoặc điều trị. Phương pháp chiết xuất dược liệu bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và phương pháp chiết. Có nhiều cách phân loại phương pháp chiết xuất dựa vào các yếu tố khác nhau: - Căn cứ vào nhiệt độ: + Chiết nóng + Chiết nguội - Căn cứ vào chế độ làm việc: + Phương pháp chiết gián đoạn + Phương pháp chiết bán liên tục + Phương pháp chiết liên tục - Căn cứ vào chuyển động tương hỗ giữa 2 pha: + Phương pháp chiết ngược dòng + Phương pháp chiết xuôi dòng + Phương pháp chiết chéo dòng - Căn cứ vào áp suất làm việc: + Phương pháp chiết ở áp suất thường (áp suất khí quyển) + Phương pháp chiết ở áp suất giảm (áp suất chân không) + Phương pháp chiết ở áp suất cao (chế độ làm việc có áp lực) - Căn cứ vào trạng thái làm việc của 2 pha: + Phương pháp ngâm + Phương pháp ngấm kiệt - Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt: + Phương pháp dùng siêu âm + Phương pháp khí hoá lỏng + Phương pháp tạo dòng xoáy + Phương pháp mạch nhịp. . . 1.5.2. Chiết xuất và tinh chế anthranoid [26] Muốn chiết xuất glycosid dùng cồn ethylic hoặc cồn methylic hoặc hỗn hợp cồn - nước. Muốn chiết phần aglycon, thuỷ phân bằng acid sau đó chiết bằng ether hoặc cloroform. Để tách các dẫn chất anthraquinon có thể sử dụng độ hoà tan khác nhau trong môi trường kiềm khác nhau, tuy nhiên sự phân chia không tách bạch mà thường còn lẫn chất này với một ít chất khác. Trong nghiên cứu, người ta hay dùng sắc ký cột với silicagel, kieselghur, bột cellulose. Có thể dùng calci carbonat, magnesi carbonat, dicalci phosphat, calci sulfat, magnesi oxyd, calci oxyd. Để triển khai, nếu tách các glycosid thì dùng ethanol hoặc methanol với các nồng độ cồn khác nhau, còn tách aglycon thì dùng các dung môi hữu cơ theo độ phân cực tăng dần, tăng dần lượng cồn từ 1-5 %, theo dõi các phân đoạn bằng đèn tử ngoại. 1.6. Tổng quan về một số phương pháp hoá lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài 1.6.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) [8], [13], [28], [29] 1.6.1.1. Nguyên tắc Dựa vào hệ số phân tách khác nhau của chất cần phân tích giữa 2 pha: pha động và pha tĩnh. Chất cần phân tích được hấp phụ (hoặc phân bố, trao đổi ion) trên pha tĩnh, pha động chạy qua pha tĩnh đồng thời kéo theo chất cần phân tích. Dựa vào hệ số phân bố khác nhau của mỗi chất đối với pha động và pha tĩnh ta có thể tách riêng từng thành phần trong hỗn hợp phân tích. Các thành phần sau khi được phân tách riêng biệt khỏi hỗn hợp được lưu giữ trên pha tĩnh. Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu các chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở các bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc phun thuốc thử hiện màu, hoặc quét lên bề mặt bản mỏng thiết bị densitometer, một thiết bị đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến của chất cần phân tích . . . Tuỳ thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng một trong các phương pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích. 1.6.1.2. Các đại lượng đặc trưng a. Hệ số lưu giữ Rf: Đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động: (1.1) Trong đó: dR là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm) dM là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm) Rf có giá trị dao động giữa 0 và 1 b. Hệ số lưu giữ tương đối Rr: (1.2) Trong đó: dR,x : là đường đi của chất phân tích (cm) DR,c : là đường đi của chất chuẩn (cm) (Giá trị Rr càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất) 1.6.1.3. Ứng dụng a. Định tính: Thường dựa vào trị số Rf của mẫu thử và mẫu chuẩn chạy sắc ký trong cùng điều kiện. Đôi khi do sắc ký không liên tục không xác định được tuyến dung môi pha động, người ta dùng hệ số lưu giữ tương đối Rr để đặc trưng cho chất phân tích. b.Thử tinh khiết: Dùng SKLM để kiểm tra mức độ tinh khiết của các hợp chất thể hiện ở các vết lạ trên sắc ký đồ c. Định lượng: Có 2 cách để định lượng các chất trong vết sắc ký Cách 1: Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp. Sau khi làm sạch dịch chiết, định lượng chất phân tích bằng một kỹ thuật thích hợp như phổ hấp thụ, huỳnh quang, cực phổ... Phương pháp này hiện nay ít dùng vì có nhiều trở ngại lại mất nhiều thời gian. Cách 2: Định lượng trực tiếp trên bản mỏng: Đo diện tích hay cường độ màu của vết sắc ký. Hiện nay dùng 2 kỹ thuật: Densitometer: Chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cường độ huỳnh quang. Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số: Quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh, nhất là camera kỹ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký. Xử lý dữ liệu bằng máy tính. 1.6.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [8], [10], [13], [18], [20], [28], [29] 1.6.2.1. Nguyên tắc Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp sắc ký tách các chất ra khỏi hỗn hợp phân tích trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ. 1.6.2.2. Một số thông số đặc trưng của quá trình sắc ký Hình 1.4. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng a. Thời gian lưu : tR: (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó. t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký tR’(Thời gian lưu thực): tR’= tR – t0 (Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định). W : là chiều rộng đáy pic. W1/2 : là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic. b. Hệ số dung lượng k’: Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k’ được tính theo công thức: (1.3) Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời điểm cân bằng. Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm mẫu do đó làm giảm khả năng tách, nếu k’ lớn quá thì sẽ dẫn đến doãng pic, độ nhạy thấp và thời gian lưu kéo dài. Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 2-5 là tốt nhất. c. Hệ số chọn lọc a: (k’B > k’A) (1.4) a khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng. Để tách riêng hai chất thường chọn a nằm trong khoảng 1,05 đến 2. d. Hiệu lực cột: Hiệu lực cột được đánh giá thông qua 2 thông số: số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa lý thuyết (H). Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi tầng sự phân bố chất tan vào hai pha đạt đến một trạng thái cân bằng. Mỗi tầng được giả định như một pha tĩnh có chiều cao H. (1.5) hay (1.6) Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính bằng công thức: (1.7) e. Hệ số bất đối AF (tailing factor): Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ. (1.8) Trong đó: W1/20 : là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic. a : là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic. Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 AF 2 Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối f. Độ phân giải (resolution): Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách 2 chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký. Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức: (1.9) Độ phân giải cơ bản đạt được khi RS = 1,5 khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ ràng, chỉ xen phủ nhau 0,3 % Rs = 1,0: Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4 % RS = 0,75: Hai pic chưa tách nhau 1.6.2.3. Ứng dụng của phương pháp HPLC: a. Định tính: Dựa vào thời gian lưu, hình dáng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hoặc chồng phổ của pic thử và pic chuẩn để định tính chất thử. b. Xác định tạp chất: Dùng để kiểm tra tạp chất trong mẫu, trên sắc ký đồ không có pic tại thời gian lưu của tạp chất (dùng chất đối chiếu) khi chạy sắc ký trong cùng điều kiện. c. Định lượng: Dựa trên nguyên tắc nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng: Phương pháp chuẩn ngoại: Đây là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó đem so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic thu được từ mẫu thử với pic của mẫu chuẩn đã biết nồng độ sẽ tính ra nồng độ các chất có trong mẫu thử. Phương pháp chuẩn nội: Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống với thời gian lưu và đáp ứng của chất cần phân tích. Chất chuẩn thứ hai gọi là chất chuẩn nội. Từ những dữ kiện về diện tích (hoặc chiều cao ) pic của chuẩn, chuẩn nội, mẫu thử và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội sẽ tính ra nồng độ các chất có trong mẫu thử. Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và sự tăng của diện tích (hoặc chiều cao pic). Phươn._.g pháp chuẩn hoá diện tích: Dựa trên nguyên tắc hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ. Phương pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều được rửa giải và được phát hiện; tất cả các thành phần đều có đáp ứng detector như nhau. 1.6.3. Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy [13] Mỗi chất khác nhau có nhiệt độ nóng chảy khác nhau. Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn lý học rất quan trọng. Điểm chảy là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ tinh khiết của một chất. Nếu điểm chảy của 2 loại tinh thể thu được qua 2 lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau 0,5oC thì có thể xem sản phẩm kết tinh đã tinh khiết. Nếu một hợp chất kết tinh có điểm chảy còn thấp xa hơn so với điểm chảy lý thuyết chứng tỏ sản phẩm thu được chưa tinh khiết còn phải tiếp tục kết tinh và tinh chế lại. Có hai cách xác định điểm chảy: + Đo điểm chảy bằng ống mao quản. + Đo điểm chảy bằng dụng cụ điện có lắp kính hiển vi hoặc kính lúp. 1.6.4. Phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) [5], [10], [13], [28], [29]. 1.6.4.1. Nguyên tắc: Sử dụng đặc tính hấp thụ ánh sáng trong vùng hồng ngoại ( bước sóng khoảng 760 – 1000 nm) của các chất hoá học. Mỗi chất khác nhau có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng hồng ngoại (IR) khác nhau đặc trưng riêng cho chất đó. Khả năng hấp thụ ánh sáng hồng ngoại được ghi lại và gọi là phổ hồng ngoại đặc trưng riêng cho từng chất. 1.6.4.2. Ứng dụng: Cường độ của các đỉnh trên phổ hồng ngoại không chi tiết như trong phổ UV-VIS mà chỉ có tính chất tương đối nên ít được sử dụng để định lượng. Vì thế quang phổ hồng ngoại chủ yếu được ứng dụng cho định tính các hợp chất. Có 2 ứng dụng chính của phổ hồng ngoại như một công cụ phân tích là nhận ra các nhóm chức đặc biệt trong phân tử và định tính các chất bằng cách so sánh với phổ chuẩn. 1.6.5. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [5], [13], [28] 1.6.5.1. Nguyên tắc Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong một từ trường, khi thay đổi từ trường sẽ dẫn đến hấp thụ năng lượng của sóng vô tuyến và xuất hiện phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có momen từ và cho tín hiệu NMR. Các hạt nhân nguyên tử có khối lượng và số thứ tự nguyên tử là những số chẵn thì không có momen từ và không cho tín hiệu NMR Vị trí của tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ điện tử ở vùng lân cận quanh proton đó 1.6.5.2. Các đại lượng đặc trưng a. Độ chuyển dịch hoá học: Sự khác nhau về vị trí hấp thụ giữa proton của mẫu phân tích và của chất chuẩn được gọi là độ chuyển dịch hoá học (d) (1.10) Trong đó: d : là độ dịch chuyển hoá học nmau : tần số của mẫu phân tích nTMS : là tần số của mẫu chuẩn tetramethylsilane nmay : là tần số làm việc của máy b. Hằng số tương tác spin: Khoảng cách giữa các vạch của tín hiệu bội được biểu hiện bằng Hz, đặc trưng cho sự tương tác spin gọi là hằng số tương tác spin (J). Trị số J phụ thuộc vào tương quan không gian và mật độ điện tử ở vùng lân cận của 2 proton tương tác. c. Diện tích dưới tín hiệu: Diện tích dưới tín hiệu tỷ lệ với số lượng proton cho tín hiệu đó. Đường cong tích phân diện tích dưới tín hiệu cho biết số lượng tương đối của proton cho tín hiệu. 1.6.5.3. Ứng dụng của phổ NMR Bằng cách xác định độ dịch chuyển hoá học d, hằng số tương tác J và diện tích dưới tín hiệu người ta có thể biện giải phổ và kết hợp với các thông tin của các loại phổ khác như IR, MS từ đó xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. 1.6.6. Phương pháp phân tích khối phổ (MS) [5], [13], [28] 1.6.6.1. Nguyên tắc Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50 – 100 eV) để bắn phá phân tử hữu cơ ở môi trường chân không cao (10-3 - 10-6 mmHg). Trong quá trình đó, chất hữu cơ bị ion hoá và bị phá vỡ thành mảnh. Các ion được tạo thành trong buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối. 1.6.6.2. Ứng dụng của MS Xác định các đồng vị Các nguyên tử đồng vị của cùng một nguyên tố có cùng số điện tích hạt nhân chỉ khác nhau về số neutron trong nhân đó nên khối lượng nguyên tử khác nhau. Có thể dùng MS để xác định thành phần các đồng vị của các nguyên tố trong mẫu. Định tính Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử M+, (M+1)+, (M+2)+, đây là các đặc trưng quan trọng của hợp chất hoá học. Bên cạnh đó xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của chúng cùng với khối lượng của các mảnh ion có thể xác định công thức nguyên của chất phân tích. Có thể so sánh phổ nghiên cứu với thư viện phổ có trong máy hoặc phổ nghiên cứu với phổ chất đối chiếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu. Xác định công thức cấu tạo Để xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu cần dùng kỹ thuật ion hoá thích hợp phân tách chất nghiên cứu thành nhiều mảnh ion để làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng. Việc biện giải phổ nên phối hợp với phổ NMR và phổ IR. Định lượng Phân tích định lượng khối phổ tương tự như các kỹ thuật khác dùng cách thiết lập đường chuẩn hoặc thêm đường chuẩn cùng với đo cường độ vạch phổ để xác định nồng độ. 1.7. Nhận xét chung Hiện nay vì chưa có chất chuẩn Emodin nên một số tài liệu trong nước [15], [16], [25] chỉ định tính dược liệu chứa Emodin bằng các phản ứng ống nghiệm hoặc bằng SKLM nhưng chưa tiến hành song song với dung dịch chuẩn. Trong chuyên luận “Rhubarb” của dược điển Anh 2008 [47] và dược điển Châu Âu 2002 [34] đều qui định dùng Emodin để pha dung dịch đối chiếu khi định tính bằng SKLM. Chuyên luận “Đại hoàng” trong DĐVN III [6], cũng qui định tiến hành định tính Đại hoàng bằng SKLM, dùng dung dịch đối chiếu là dung dịch Emodin chuẩn nồng độ 1 mg/ml hoặc chiết song song dược liệu chuẩn Đại hoàng làm dung dịch đối chiếu, nhưng thực tế hiện nay vì chưa có chất chuẩn Emodin nên chỉ có thể thực hiện theo cách chiết song song với dược liệu Đại hoàng chuẩn phức tạp hơn. Cũng một phần vì chưa có chất chuẩn Emodin nên một số tài liệu trong nước [6], [16], [25] chưa định lượng riêng Emodin mà mới chỉ định lượng anthranoid nói chung trong dược liệu có chứa Emodin bằng phương pháp tạo màu đo quang với việc xây dựng đường chuẩn là Coban clorid khá phức tạp. Mặt khác trong nước chưa có công trình nào nghiên cứu về chiết xuất và tinh chế Emodin làm chất chuẩn và hiện tại chúng ta chưa thiết lập được chất chuẩn Emodin để sử dụng trong công tác kiểm nghiệm. Xuất phát từ nhu cầu cần có chất chuẩn Emodin chúng tôi thực hiện đề tài này để phục vụ công tác kiểm tra chất lượng một số dược liệu. CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu - Chuẩn phòng thí nghiệm Emodin của Trung quốc hàm lượng 98,32 %. - Vị dược liệu Đại hoàng. - Vị dược liệu Cốt khí củ. Các vị dược liệu này được mua tại Hiệu thuốc dân tộc, Công ty cổ phần Dược và thiết bị y tế Hà Nội, 59 phố Lãn Ông, Hà Nội. 2.2. Phương tiện nghiên cứu 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi sử dụng các thiết bị, dụng cụ đã được hiệu chuẩn theo ISO/IEC 17025 và GLP của Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương và Viện Hoá học- Viện Khoa học công nghệ Việt nam gồm: Buồng soi tử ngoại DESAGA HP-UVIS Cân phân tích DENVER AA-200 có độ chính xác 0,1 mg Cân phân tích METTLER AG 245 có độ chính xác 0,01 mg Cột sắc ký Apollo C18 ( 250´ 4,6 mm; 5 mm) Máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR-BRUKER-500MHz Máy đo điểm chảy BUCHI 535 Máy đo phổ hồng ngoại Nicolet NEXUS 670FT-IR Máy lắc siêu âm ELMASONIC S100 Máy phổ khối 5989B.HP-MS Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao SHIMADZU diode array UV-VIS SPD-M10AVP Nồi cách thuỷ MEMMERT Tủ sấy MEMMERT Các dụng cụ thuỷ tinh cần thiết cho quá trình thực nghiệm 2.2.2. Hoá chất, dung môi Các hoá chất, dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (PA) và loại tinh khiết dùng cho HPLC Acid formic PA Acid hydrocloric PA Acid phosphoric PA Acid sulfuric PA Bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck) Cloroform PA Dung dịch acid hydrocloric 10 % được pha từ acid hydrocloric PA Dung dịch acid phosphoric 0,1 % được pha từ acid phosphoric PA Dung dịch acid sulfuric 10 % được pha từ acid sulfuric PA Dung dịch amoniac PA Ethanol tuyệt đối PA Ether ethylic PA Ethylacetat PA Methanol dùng cho HPLC Methanol PA N-hexan PA Nước cất Silica gel dùng cho sắc ký cột, cỡ hạt 0,040-0,063 mm (Merck) 2.3. Nội dung nghiên cứu 2.3.1. Nghiên cứu tìm qui trình chiết xuất và tinh chế Emodin từ dược liệu Đại hoàng 2.3.2. Định tính Emodin tinh chế được. 2.3.3. Xác minh cấu trúc của Emodin tinh chế được 2.3.4. Định lượng Emodin tinh chế được 2.3.5. Xác định giới hạn tổng cộng các tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được 2.3.6. Thẩm định phương pháp HPLC đã sử dụng để định lượng Emodin tinh chế được về các mặt Tính chính xác Tính tuyến tính Tính đúng Tính đặc hiệu 2.3.7. Trên cơ sở nghiên cứu đưa ra tiêu chuẩn dự thảo cho chất chuẩn phòng thí nghiệm Emodin 2.3.8. Sử dụng Emodin tinh chế được làm chất chuẩn phòng thí nghiệm để xác định Emodin trong hai vị dược liệu: Đại hoàng, Cốt khí củ. Định tính và định lượng Emodin trong vị được liệu Đại hoàng Định tính và định lượng Emodin trong vị dược liệu Cốt khí củ 2.4. Các phương pháp dùng để nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp chiết xuất anthranoid từ dược liệu để chiết xuất Emodin từ vị dược liệu Đại hoàng. 2.4.2. Phương pháp tinh chế anthranoid để tinh chế Emodin chiết xuất được. 2.4.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng để định tính Emodin 2.4.4. Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy để định tính và nhận xét sơ bộ mức độ tinh khiết của Emodin 2.4.5. Phương pháp đo phổ hồng ngoại để định tính Emodin 2.4.6. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định tính, định lượng Emodin và xác định tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được. 2.4.7. Phương pháp phân tích khối phổ để xác minh cấu trúc của Emodin tinh chế được 2.4.8. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác minh cấu trúc của Emodin tinh chế được 2.4.9. Phương pháp xử lý số liệu [2] Dùng toán thống kê để xử lý số liệu các kết quả định lượng Emodin. Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả: - Giá trị trung bình: (2.1) - Độ lệch chuẩn: (2.2) - Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): (2.3) - Sai số chuẩn: (2.4) - Khoảng tin cậy: (2.5) CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Chiết xuất và tinh chế Emodin từ vị dược liệu Đại hoàng 3.1.1. Chiết xuất Emodin Emodin là một anthraquinon tồn tại trong vị dược liệu Đại hoàng dưới dạng tự do và cả dạng glycosid do liên kết với đường. Chúng tôi tiến hành chiết xuất Emodin theo nguyên tắc chung về chiết xuất anthranoid [26]. 3.1.1.1. Chuẩn bị dược liệu Dược liệu Đại hoàng đã được sấy ở 600C trong 24 giờ rồi nghiền thành bột thô. 3.1.1.2. Lựa chọn phương pháp chiết Sử dụng phương pháp chiết hồi lưu cách thuỷ. Đây là phương pháp chiết nóng để tăng khả năng hoà tan của hoạt chất trong dung môi chiết, phương pháp này tiến hành đơn giản và có thể chiết được lượng dược liệu lớn hơn so với phương pháp chiết bằng Shoxlet. 3.1.1.3. Lựa chọn dung môi chiết Trước hết chúng tôi chọn methanol làm dung môi chiết vì methanol hoà tan được cả Emodin tự do và Emodin liên kết với đường. Sau giai đoạn thuỷ phân bằng acid để đưa toàn bộ Emodin dạng liên kết về dạng tự do sẽ chọn cloroform làm dung môi chiết ở giai đoạn tiếp theo. Theo nguyên tắc chung thì có thể dùng cloroform hoặc ether để chiết phần aglycon [26] nhưng chúng tôi chọn cloroform vì cloroform nặng hơn nước sẽ nằm ở lớp dưới của hỗn hợp chiết dễ tiếp xúc và hoà tan hoạt chất hơn, còn ether nhẹ hơn nước sẽ nằm ở lớp trên của hỗn hợp chiết thì khả năng hoà tan hoạt chất ở lớp dưới sẽ hạn chế hơn, mặt khác ether dễ cháy nổ hơn cloroform [1]. Sau khi chiết bằng cloroform sẽ tinh chế sơ bộ bằng các dung môi như ether ethylic và ethanol tuyệt đối. 3.1.1.4. Tiến hành Cân khoảng 150 g dược liệu Đại hoàng đã được nghiền thành dạng bột thô cho vào bình thuỷ tinh nút mài có dung tích 1000 ml, thêm khoảng 600 ml methanol, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều rồi để yên 30 phút cho methanol ngấm đều vào dược liệu. Sau đó đem chiết hồi lưu cách thuỷ trong 2 giờ. Lấy hỗn hợp chiết ra, để nguội, lọc để thu dịch chiết methanol. Thực hiện chiết tiếp bã dược liệu trên 2 lần nữa với 400 ml và 300 ml methanol. Gộp dịch chiết methanol lại đem bốc hơi trên cách thuỷ đến khô thu được cao dược liệu. Thêm 200 ml dung dịch acid hydrocloric 10 % vào cao dược liệu và lắc siêu âm 20 phút rồi chuyển vào bình nón nút mài dung tích 1000 ml, thêm 300 ml cloroform, đun hồi lưu trên cách thuỷ trong 2 giờ. Lấy hỗn hợp chiết ra để nguội, chuyển vào bình gạn và gạn lấy lớp cloroform. Lặp lại quá trình chiết bằng cloroform 2 lần nữa mỗi lần sử dụng 200ml cloroform. Gộp dịch chiết cloroform đem bốc hơi trên cách thuỷ đến khô gọi là cắn 1. Loại tạp không tan trong ether ở cắn 1 bằng cách thêm 200 ml ether ethylic vào cắn 1 khuấy kỹ và lọc lấy dịch ether đem bốc hơi trên cách thuỷ đến còn khoảng 20 ml dung môi thì để bay hơi tự nhiên đến khô thu được cắn 2. Loại tạp không tan trong ethanol bằng cách thêm 200 ml ethanol tuyệt đối vào cắn 2, lắc siêu âm 15 phút rồi lọc lấy dịch ethanol đem bốc hơi trên cách thuỷ đến khi còn khoảng 10 ml dung môi, để bay hơi tự nhiên thu được cắn 3. Sơ đồ chiết xuất Emodin bằng phương pháp đun nóng hồi lưu được thể hiện ở hình 3.1. Bột dược liệu Đại hoàng Methanol Đun hồi lưu cách thuỷ 1 giờ Dịch chiết methanol Bốc hơi methanol Cao dược liệu HCl 10 % Siêu âm 10 phút Hỗn hợp cao dược liệu trong dung dịch acid Dịch chiết CHCl3 CHCl3 Đun hồi lưu cách thuỷ 1 giờ, gạn lấy lớp CHCl3 Cắn 1 Bốc hơi CHCl3 Ether ethylic Khuấy kỹ, lọc Dịch chiết ether Bốc hơi ether Cắn 2 Cồn tuyệt đối Dịch chiết cồn Khuấy kỹ, lọc Bốc hơi cồn Cắn 3 Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất Emodin bằng phương pháp đun nóng hồi lưu 3.1.1.5. Khảo sát các cắn 1, 2, 3 bằng phương pháp SKLM Điều kiện sắc ký: Hệ dung môi triển khai sắc ký: Cloroform - methanol (90:10) (Hệ I) Bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck) đã được hoạt hoá ở 1100C trong 1 giờ. Dung dịch chuẩn: Dung dịch Emodin chuẩn trong methanol có nồng độ 2 mg/ml. Dung dịch thử 1: Hoà tan 10 mg cắn 1 trong 2 ml methanol Dung dịch thử 2: Hoà tan 8 mg cắn 2 trong 2 ml methanol Dung dịch thử 3: Hoà tan 6 mg cắn 3 trong 2 ml methanol Phát hiện vết bằng 4 cách: + Quan sát dưới ánh sáng thường + Quan sát dưới đèn tử ngoại UV 254 nm + Quan sát dưới đèn tử ngoại UV 366 nm + Hiện vết bằng hơi amoniac bão hoà Chấm riêng biệt lên trên bản mỏng 5 ml các dung dịch thử và dung dịch chuẩn. Sau khi triển khai sắc ký lấy bản mỏng ra để bay hơi hết dung môi và phát hiện vết bằng các cách trên. Kết quả: Kết quả khảo sát cắn 1 được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.2. Kết quả khảo sát cắn 2 được thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.3. Kết quả khảo sát cắn 3 được thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.4. Bảng 3.1. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của cắn 1 - H ệ I TT vết Rf Màu sắc Ánh sáng thường UV 254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 1 0,15 Xám Tím nhạt Tím Xám 2 0,43 - Tím - - 3 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam 4 0,61 Xám Xám Tím Xám 5 0,74 Vàng Vàng nâu HQ vàng Vàng Vết chuẩn 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát cắn 1-Hệ I Bảng 3.2. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của cắn 2 - H ệ I TT vết Rf Màu sắc Ánh sáng thường UV 254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 1 0,15 Xám Tím nhạt Tím Xám 2 0,43 - Tím - - 3 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam 4 0,61 Xám Xám Tím Xám 5 0,74 Vàng Vàng nâu HQ vàng Vàng Vết chuẩn 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.3. Sắc ký đồ khảo sát cắn 2-Hệ I Bảng 3.3. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của cắn 3 - H ệ I TT vết Rf Màu sắc Ánh sáng thường UV 254nm UV 366nm Hiện vết bằng NH3 1 0,43 - Tím - - 2 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam 3 0,74 Vàng Vàng nâu HQ vàng Vàng Vết chuẩn 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.4. Sắc ký đồ khảo sát cắn 3-Hệ I Nhận xét: Qua quá trình khảo sát các cắn 1, 2, 3 thu được sau mỗi giai đoạn chiết xuất ta nhận thấy: Cả 3 cắn khi phát hiện màu bằng các cách nêu trên, trong số các vết thu được trên sắc ký đồ luôn có 1 vết có vị trí và màu sắc tương tự vết chuẩn Emodin. Cắn 2 và cắn 1 có sắc ký đồ không khác nhau về số vết nhưng phần chưa tách khỏi điểm chấm của cắn 2 ít hơn của cắn 1. Cắn 3 cho số vết ít nhất và các vết tách khỏi nhau rõ nhất. Như vậy đến cắn 3 đã loại bớt được khá nhiều tạp chất. 3.1.2. Tinh chế Emodin 3.1.2.1. Lựa chọn dung môi rửa giải Từ cắn 3 thu được sau quá trình chiết xuất chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tìm qui trình tinh chế để thu được Emodin tinh khiết. Chúng tôi tiến hành phương pháp sắc ký cột để tinh chế Emodin từ cắn 3. Qua khảo sát một số hệ dung môi rửa giải chúng tôi nhận thấy: Nếu chỉ rửa giải bằng n-hexan thì không tách được riêng Emodin. Nếu rửa giải bằng hỗn hợp cloroform – methanol hoặc hỗn hợp ether dầu hoả - ether ethylic với các tỷ lệ thay đổi đều không tách riêng được Emodin. Dùng hỗn hợp n-hexan: ethylacetat với các tỷ lệ thay đổi thì nhận thấy nếu tỷ lệ ethylacetat nhiều thì Emodin bị dính vết khác. Qua khảo sát, chúng tôi lựa chọn hỗn hợp n-hexan - ethylacetat với các tỷ lệ thay đổi như sau làm dung môi rửa giải: n-hexan - ethylacetat (98 : 2), (95:5), (93:7), (90:10). 3.1.2.2. Chuẩn bị cột sắc ký Chuẩn bị cột sắc ký làm bằng thuỷ tinh trung tính có đường kính 2,5 cm, chiều dài 30 cm được lắp thẳng đứng trên giá, phía dưới cột có van để điều chỉnh tốc độ dung môi. Khoá van, cho một ít n-hexan vào cột. Lót một lớp bông mỏng ở phía đáy cột, ngay trên van để silica gel sau khi được nhồi vào cột không gây tắc chuôi cột. Cân 25 g silica gel dùng cho sắc ký cột đem sấy ở 1000C trong 3 giờ để hoạt hoá silicagel. Để nguội silicagel trong bình hút ẩm rồi trộn với 150 ml n-hexan cho phân tán đều và chuyển hỗn hợp (silica gel : n-hexan) vào cột. Chú ý chuyển từ từ để tránh tạo bọt khí trong cột, mở khoá cho dung môi chảy bớt đi chỉ để dung môi luôn ở phía trên bề mặt silicagel khoảng 1 cm. Tiếp tục cho 100 ml n-hexan chảy qua với tốc độ 25 giọt/phút để rửa hệ thống. Sau đó khoá van và để ổn định cột trong 6 giờ. 3.1.2.3. Đưa mẫu lên cột Cân khoảng 0,1 g cắn 3 (tương đương với khoảng 50 g dược liệu Đại hoàng) thêm 30 ml n-hexan, lắc siêu âm 10 phút, thêm 1,5 g silica gel đã hoạt hoá vào hỗn hợp, khuấy nhẹ cho phân tán đều. Chuyển hỗn hợp này lên trên cột. Dùng n-hexan tráng rửa và chuyển hết hỗn hợp vào cột. Đặt một miếng bông nhỏ đã tẩm ướt bằng n-hexan lên trên cùng để tránh xáo trộn khi rót dung môi rửa giải lên trên cột. 3.1.2.4. Tiến hành rửa giải Cho hỗn hợp n-hexan : ethylacetat với các tỷ lệ đã khảo sát qua cột với tốc độ khoảng 25 giọt/phút, theo thứ tự sau: 200 ml hỗn hợp n-hexan - ethylacetat (98:2) 200 ml hỗn hợp n-hexan - ethylacetat (95:5) 500 ml hỗn hợp n-hexan - ethylacetat (93:7) 500 ml hỗn hợp n-hexan - ethylacetat (90:10) Hình 3.5. Hệ thống sắc ký cột tự tạo để tinh chế Emodin Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm, mỗi ống khoảng 10 ml. Kiểm tra từng ống nghiệm bằng SKLM với hệ dung môi I: cloroform - methanol (90:10). Chấm riêng biệt lên trên bản mỏng 100 ml dung dịch rửa giải trong từng ống nghiệm và 5 ml dung dịch chuẩn Emodin nồng độ 2 mg/ml. Sau khi triển khai sắc ký sẽ phát hiện vết bằng 4 cách: quan sát dưới ánh sáng thường, quan sát dưới đèn tử ngoại UV 254 nm, UV 366 nm và hiện màu bằng hơi NH3 bão hoà. Các ống có thành phần tương tự được gộp lại thành một phân đoạn. Kết quả thu được 5 phân đoạn: Phân đoạn 1 cho 1 vết màu tím nhạt khi quan sát dưới đèn UV 254 nm, và có giá trị Rf khác vết chuẩn Emodin. Phân đoạn 2 cho 1 vết có màu thay đổi theo cách phát hiện vết, có giá trị Rf khác vết chuẩn Emodin. Phân đoạn 3 cho 1 vết khi quan sát dưới ánh sáng thường, 2 vết khi quan sát dưới cả 2 đèn tử ngoại UV 254 nm và UV 366 nm. Phân đoạn 4 cho 1 vết khi quan sát dưới ánh sáng thường và dưới đèn tử ngoại UV 366 nm, 2 vết khi quan sát dưới đèn tử ngoại UV 254 nm. Phân đoạn 5 khi phát hiện vết bằng các cách khác nhau đều cho 1 vết có màu sắc và giá trị Rf tương tự vết Emodin chuẩn . Kết quả khảo sát các phân đoạn được thể hiện ở bảng 3.4 và các hình 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 3.10. Bảng 3.4. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của các phân đoạn khi khảo sát với hệ dung môi I Phân đoạn TT vết Rf Màu sắc Ánh sáng thường UV 254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 1 1 0,74 - Tím nhạt - - 2 1 0,74 Vàng Vàng nâu HQ vàng Vàng 3 1 0,43 - Tím - - 2 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam 3 0,74 Vàng Vàng nâu HQ vàng Vàng 4 1 0,43 - Tím - - 2 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam 5 1 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Vết chuẩn 1 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 1- Hệ I Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.7. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 2 - Hệ I Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.8. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 3- Hệ I Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.9. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 4- Hệ I Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.10. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 5 - Hệ I Nhận xét: Qua khảo sát các phân đoạn với hệ dung môi I thì thấy phân đoạn 5 khi phát hiện vết bằng 4 cách đã nêu đều cho 1 vết duy nhất có vị trí và màu sắc tương tự vết chuẩn Emodin. Để khẳng định phân đoạn 5 chỉ có một vết duy nhất tương tự vết chuẩn Emodin chúng tôi tiếp tục triển khai SKLM phân đoạn 5 song song với dung dịch chuẩn Emodin trên 2 hệ dung môi II và III. Hệ II gồm: n-hexan - ethylacetat (2: 1) và hệ III gồm: ether dầu hoả - ethyl acetat - acid formic (75:25:1), cách tiến hành sắc ký như mục 3.1.2.4. Kết quả cũng cho thấy phân đoạn 5 luôn cho 1 vết duy nhất có vị trí (giá trị Rf) và màu sắc tương tự vết chuẩn Emodin. Kết quả khảo sát phân đoạn 5 trên hệ dung môi II và III được thể hiện ở bảng 3.5 và các hình 3.11, 3.12. Bảng 3.5. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của phân đoạn 5 khi khảo sát với hệ dung môi II và III Hệ dung môi Vết Rf Màu sắc Ánh sáng thường UV 254nm UV 366nm Hiện vết bằng NH3 II Chuẩn 0,29 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Thử 0,29 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam III Chuẩn 0,20 Vàng cam Vàng nâu HQ vàng cam Đỏ cam Thử 0,20 Vàng cam Vàng nâu HQ vàng cam Đỏ cam Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.11. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 5 - Hệ II Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.12. Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 5 - Hệ III Nhận xét: Từ kết quả khảo sát phân đoạn 5 trên 3 hệ dung môi và 4 cách phát hiện vết khác nhau đều cho thấy phân đoạn 5 có một vết tương tự vết chuẩn Emodin, chúng tôi bay hơi dung môi của phân đoạn 5 thu được cắn 4. Loại chất tan trong nước trong cắn 4 bằng cách thêm nước vào cắn 4 theo tỷ lệ 250 ml nước cho 100 mg cắn 4, lắc siêu âm 15 phút, lọc lấy cắn , đem sấy cắn này ở 600C trong 48 giờ, và làm khô thêm trong bình hút ẩm chứa silica gel trong 48 giờ thu được sản phẩm tinh chế cuối cùng là dạng bột có màu vàng cam gọi là cắn Emodin hay Emodin tinh chế được (Hình 3.13). Hình 3.13. Ảnh chụp cắn Emodin 3.2. Định tính Emodin tinh chế được bằng SKLM, xác định nhiệt độ nóng chảy và đo phổ IR 3.2.1. Định tính Emodin tinh chế được bằng SKLM Tiến hành: Hệ dung môi triển khai sắc ký: + Hệ I gồm: Cloroform - methanol (90:10) + Hệ II gồm: n-hexan - ethylacetat (2: 1) + Hệ III gồm: ether dầu hoả - ethyl acetat - acid formic (75:25:1) Bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck) đã được hoạt hoá ở 1100C trong 1 giờ. Dung dịch chuẩn: Dung dịch Emodin chuẩn trong methanol có nồng độ 2 mg/ml. Dung dịch thử : Hoà tan 2 mg cắn Emodin trong 1 ml methanol Phát hiện vết bằng 4 cách: + Quan sát dưới ánh sáng thường + Quan sát dưới đèn tử ngoại UV 254 nm + Quan sát dưới đèn tử ngoại UV 366 nm + Hiện vết bằng hơi amoniac bão hoà Chấm riêng biệt lên trên bản mỏng 5 ml các dung dịch thử và dung dịch chuẩn, đồng thời chấm chồng 5 ml dung dịch chuẩn và 5 ml dung dịch thử. Sau khi triển khai sắc ký lấy bản mỏng ra để bay hơi hết dung môi và phát hiện vết bằng các cách trên. Kết quả khảo sát cắn Emodin được thể hiện ở bảng 3.6 và các hình 3.14, 3.15, 3.16. Bảng 3.6. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của cắn Emodin khi khảo sát với hệ dung môi I, II và III Hệ dung môi Vết Rf Màu sắc Ánh sáng thường UV 254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 I Chuẩn 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Thử 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Chuẩn + Thử 0,56 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam II Chuẩn 0,29 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Thử 0,29 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Chuẩn + Thử 0,29 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam III Chuẩn 0,20 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Thử 0,20 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Chuẩn + Thử 0,20 Vàng cam Vàng nâu HQ đỏ cam Đỏ cam Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.14. Sắc ký đồ khảo sát cắn Emodin - Hệ I Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.15. Sắc ký đồ khảo sát cắn Emodin - Hệ II Ánh sáng thường UV254 nm UV 366 nm Hiện vết bằng NH3 Hình 3.16. Sắc ký đồ khảo sát cắn Emodin - Hệ III Nhận xét: Qua khảo sát Emodin tinh chế được bằng SKLM trên cả 3 hệ dung môi khai triển với 4 cách phát hiện vết nói trên cho thấy, trên sắc ký đồ thu được khi chấm riêng biệt dung dịch thử (dung dịch Emodin tinh chế được) và khi chấm chồng dung dịch chuẩn và dung dịch thử đều cho 1 vết duy nhất có vị trí và màu sắc tương tự vết chuẩn Emodin. Điều này cũng chứng tỏ Emodin tinh chế được khá tinh khiết. 3.2.2. Xác định nhiệt độ nóng chảy của Emodin tinh chế được Đưa một lượng cắn Emodin đã được nghiền mịn vào ống mao quản thuỷ tinh đường kính 1 mm, chiều dài 10 cm để tạo ra khối bột chiều cao khoảng 5 mm và xác định điểm chảy bằng máy đo điểm chảy BUCHI 535. Kết quả đo điểm chảy được thể hiện ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của cắn Emodin Nhiệt độ Lần đo Bắt đầu chảy (0C) Chảy hoàn toàn (0C) 1 256,6 257,1 2 256,4 257,2 3 256,3 257,2 4 256,2 257,3 5 256,4 257,1 6 256,5 257,2 TB 256,4 257,2 RSD (%) 0,055 0,029 Nhận xét: Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy cho thấy nhiệt độ nóng chảy trung bình của cắn Emodin từ 256,30C đến 257,20C là phù hợp với nhiệt độ nóng chảy của Emodin theo lý thuyết (từ 256 0C đến 2570C) [42]. Điều này chứng tỏ sản phẩm Emodin tinh chế được khá tinh khiết. Giá trị RSD thấp (0,055 % và 0,029 %) cho thấy kết quả đo điểm chảy khá chính xác. 3.2.3. Đo phổ hồng ngoại của Emodin tinh chế được Cân 50 mg Kali bromid và 2 mg cắn Emodin, trộn lẫn bằng cối mã não. Lấy một lượng nhỏ hỗn hợp trên (khoảng 13 mg) làm thành viên nén bằng kìm nén nhanh tạo thành viên nén mỏng và trong. Đặt viên nén vào buồng chứa mẫu. Tiến hành thao tác trên phần mềm của máy đo phổ hồng ngoại Nicolet NEXUS 670FT-IR để đo phổ IR của viên nén vừa tạo thành. Song song tiến hành với mẫu chuẩn Emodin. So sánh phổ IR của mẫu thử với phổ IR của mẫu chuẩn ta thấy vị trí và số lượng các đỉnh là tương tự nhau. Vậy cắn Emodin thu được đúng là hợp chất Emodin. (Phụ lục 1) 3.3. Xác minh cấu trúc của Emodin tinh chế được 3.3.1. Phân tích khối phổ Phổ MS của cắn Emodin được ghi trên thiết bị 5989B.HP-MS bằng phương pháp đưa mẫu trực tiếp, bắn phá dòng electron có năng lượng 70eV. Trên phổ thấy rõ pic phân tử đồng thời là pic cơ bản có giá trị M+m/z = 270 amu tương ứng đúng với phân tử lượng của Emodin. Tra thư viện phổ Winley 275L cho thấy phổ của mẫu đo trùng với phổ Emodin lưu trữ trong thư viện tới 95 % và cấu trúc được ghi nhận theo danh pháp chuẩn là 1,3,8-tri hydroxy-6-methyl-9,10-anthracenedion. (Phụ lục 2) 3.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Các dạng phổ NMR đã được ghi với cắn Emodin là 13C-NMR, DEPT 90, DEPT 135, 1H-NMR, HSQC và HMBC. 3.3.2.1.Bộ phổ 13C-NMR, DEPT 90, DEPT 135 Bộ phổ 1D-13C-NMR chỉ rõ cấu trúc của mẫu gồm 15 cacbon với một nhóm –CH3, 4 nhóm –CH– và 10 nhóm C bậc 4 (–C–). Đây là một cấu trúc đơn giản nên các pic đều mang tính đặc trưng. Hai pic ở 189,690 ppm và 181, 368 ppm rất đặc trưng cho hai nhóm –C=O. Bốn pic –CH= đều có độ dịch chuyển hoá học đặc trưng cho –CH= nhân thơm (107,910 ppm; 108,747 ppm; 120,453 ppm và 124,109 ppm). Pic –CH3 có độ dịch chuyển 21,490 ppm chính là –CH3 gắn vào nhân thơm. Ba nhóm –C– có độ dịch chuyển 161,393 ppm; 164,425 ppm và 165,543 ppm chính là cacbon bậc 4 của nhân thơm liên kết với –OH. Như vậy phổ 1D-13C-NMR hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của Emodin. 3.3.2.2. Bộ phổ 1H-NMR, HSQC Phổ 1H-NMR của mẫu bao gồm 5 pic: 4 pic của –CH= nhân thơm đều là vạch rộng hoặc tách vạch với giá trị J rất nhỏ (» 2HZ ) chứng tỏ các nhóm –CH= đều cách nhau 1 cacbon bậc 4. Phổ HSQC cho phép nhận dạng 2 pic –OH ở 12,072 ppm và 12,000 ppm. Đây là 2 nhóm –OH có khả năng lập cấu trúc hydro với oxy của ceton. Nhóm OH còn lại bị trải rộng chỉ nhận ra được qua gờ nổi trên đường nền ở khoảng 11,4 ppm. Nhóm –CH3 là 1 vạch đơn có độ dịch chuyển 2,406 ppm. 3.3.2.3. Phổ HMBC Phổ HMBC có vai trò đặc biệt quan trọng cho phép phân biệt 1–OH (d =12,072 ppm ) và 8–OH (d = 12,000 ppm). Nhờ phổ HMBC sự phân định vị trí C=O (9) và C=O (10) trở nên rõ ràng vì C=O (10) có tương quan với –CH= (5) và –CH=(4). Mặt khác vị trí thế của 3 nhóm –OH và nhóm –CH3 cũng được kiểm tra Kết quả: Qua bộ phổ NMR mẫu nghiên cứu đã được khẳng định là Emodin. Số liệu phổ._.