Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng kháng kháng khuẩn của phương thuốc Tam Hoàng Thang

Hiện nay thuốc y học cổ truyền đã và đang trở thành một xu thế mạnh không chỉ ở nước ta mà còn nhiều nước trên thế giới. Một số bệnh nan giải như gan, thận, bệnh mạn tính... cũng được chữa bằng thuốc cổ truyền cho kết quả tốt. Vì thuốc cổ truyền có tác dụng điều hoà âm dương, cân bằng sự hoạt động giữa các bộ phận trong cơ thể. Mặt khác, khi sử dụng hầu như không có tác dụng phụ. Để góp phần nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng của phương thuốc, chúng tôi đã tiến hành “Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng kháng kháng khuẩn của phương thuốc tam hoàng thanG ” - một phương thuốc kinh điển của y học cổ truyền với mục tiêu sau đây: Nghiên cứu về thành phần hoá học chính của phương thuốc THT. 2. Nghiên cứu tính kháng khuẩn của phương thuốc THT. Phần 1 tổng quan 1.1 vàI nét về thuốc thang của yhct. - Thuốc cổ truyền là một vị thuốc sống hoặc chín hay một chế phẩm thuốc được phối ngũ ( lập phương ) và bào chế theo phương pháp của YHCT từ một hay nhiều vị thuốc có nguồn gốc thực vật, động vật, khoáng vật, có tác dụng chữa bệnh hoặc có lợi cho sức khoẻ con người [2]. - Trên thực tế, người ta thường phối hợp các vị thuốc với nhau hơn là dùng riêng lẻ. Việc phối hợp thành phương thuốc ( đặc biệt là thuốc thang ) nhằm làm tăng tác dụng, giảm độc tính trong điều trị bệnh. - Thuốc thang là một trong những dạng thuốc của YHCT được cấu tạo từ những dược liệu đã chế biến và được bào chế bằng cách sắc với nước ở nhiệt độ bằng hoặc thấp hơn 1000C. Thuốc thang có thể ngâm với rượu ở nhiệt độ thường trong thời gian dài [7]. - Thuốc thang được hấp thu nhanh qua đường tiêu hoá do đó đưa lại hiệu quả nhanh, hay dùng trong bệnh cấp tính [7]. - Thuốc thang được cấu tạo dựa trên nguyên lý của YHCT, theo nguyên tắc có đủ các thành phần: Quân ,Thần, Tá, Sứ [5]. 1.2 phương thuốc tam hoàng thang. THT là phương thuốc kinh điển, được sử dụng chủ yếu trong các trường hợp nhiệt nhập vào phần dinh, phần huyết, phần tâm bào, gây sốt cao, mê sảng, bất tỉnh, thần chí không ổn định, đôi khi phát cuồng co giật [2,5,8,17,18]. THT được cấu tạo từ 3 vị thuốc thuộc loại thanh nhiệt táo thấp. Do 3 vị có màu vàng nên có tên phương THT. * Công thức của tht: Hoàng Liên Hoàng Bá ýđồng lượng Hoàng Cầm Trong đó HL có tác dụng tả hoả ở tạng tâm, lại có thể dẫn thuốc đến các tạng phủ bị bệnh nên vừa là Quân vừa là Sứ. HC có tác dụng tả hoả ở thượng tiêu, ở tạng phế, làm tăng tác dụng hạ sốt của HL; HB có tác dụng thanh nhiệt chủ yếu ở hạ tiêu, bàng quang, làm tăng tác dụng hạ sốt của HL nên HC, HB vừa là Thần vừa là Tá. * Cách dùng-liều dùng. - Thường được dùng dưới dạng sắc. - Uống 2 lần trong ngày. * Chú ý khi dùng: - Không nên dùng với người âm hư, tỳ hư, tiết tả. - Các vị thuốc trong bài đều có vị rất đắng, do đó khi sử dụng cần chú ý về liều lượng và thời gian sử dụng. Không nên dùng liều cao kéo dài, vì sẽ làm tê liệt thần kinh vị giác, gây cảm giác ăn không biết ngon hoặc buồn nôn [2,4]. - Gần đây người ta đã bào chế dưới dạng cải tiến – Viên nén. * Một số bài thuốc có nguồn gốc từ phương THT. Từ cổ phương THT, các lương y đã gia giảm tạo nên những phương thuốc mới như: (1). Tam Hoàng Giải Độc Thang [17]. Hoàng liên 8g Hoàng cầm 8g Hoàng bá 8g Chi tử 12g Có tác dụng thanh nhiệt táo thấp, giải độc ở tam tiêu. Chủ trị phiền táo, nhiệt độc, sốt cao, nôn ra máu, chảy máu cam. Bài thuốc còn có tên Hoàng Liên giải độc thang và đã được nghiên cứu về ảnh hưởng của phương pháp sắc đến hàm lượng hoạt chất trong bài [14]. (2). Tam Hoàng Cự Thắng Thang [17,18]. Hoàng Liên 3,2g Mang Tiêu 4g Thạch Cao 12g Hoàng Bá 8g Chỉ Thực 8g Cam Thảo 3,2g Hoàng Cầm 8g Đại Hoàng 8g Có tác dụng trị dương độc, phát cuồng, phiền khát, đại tiện táo bón, thở gấp. (3). Tam Hoàng Thục Ngải Thang [17,18]. Hoàng Liên Hoàng Cầm Hoàng Bá Thục Ngải Lượng bằng nhau. Có tác dụng trị chứng đậu, sởi, ỉa chảy ra máu mủ hôi thối, cơ thể phát sốt, phiền khát. (4). Tam Hoàng Thạch Cao Thang [17,18]. Hoàng Bá 4g Thạch Cao 10g Tri Mẫu 6g Hoàng Liên 8g Huyền Sâm 4g Cam thảo 2,8g Hoàng Cầm 6g Có tác dụng trị tam tiêu thực nhiệt. * Hiện nay, Bệnh viện Y học Dân Tộc Cao Bằng đang sử bài thuốc có tên Bột Tam Hoàng; trên cơ cở gia giảm một số vị thuốc của phương THT để phòng nhiễm khuẩn sau khi thắt trĩ. Bài thuốc có thành phần: Hoàng Liên 1 kg Hoàng Bá nam 1 kg Hoàng Đằng 1 kg CuSO4 100 g 1.3 Các vị thuốc trong phương. 1.3.1 Hoàng Liên * Đặc điểm thực vật, phân bố, thu hái. Có nhiều loại HL chân gà: Coptis chinensis Franch.; Coptis teeta Wall.; ( 2 loài này có ở Việt nam [11] ); Coptis teetoides C.Y. Cheng.; Coptis deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao.; Coptis quinqueseeta W.T. Wang., Coptis omeiensis ( Chen ) C.Y.Cheng, Họ Hoàng Liên-Ranunculaceae. ở Trung Quốc có tất cả các loài HL trên. Hình 1: Hoàng Liên HL chân gà Coptis chinensis Franch., thuộc cây thảo, sống nhiều năm.Thân rễ màu vàng thường phân nhánh. Lá có cuống dài tập trung ở gốc, phiến lá chia thành 3 thuỳ chính, mép răng cưa không đều. Hoa nhỏ màu vàng mọc thành tụ tán trên một cuống dài khoảng 25cm, có khoảng 20 nhị, 8-12 lá noãn rời nhau. Quả đại [3,9,10,11,13,21]. HL thường mọc ở vùng núi cao 1500-1800m. ở nước ta, HL mọc trên núi Hoàng Liên Sơn ( Lào Cai ), Quảng Bạ ( Hà Giang ). ở Trung Quốc, HL mọc hoang và trồng ở Vân Nam,Tứ Xuyên, Kiến Bình, Hồ Nam...[3,13]. Sau khi trồng 4-5 năm, người ta đào cả cây, loại bỏ đất cát, cắt loại thân lá, đem phơi, sấy khô rồi đóng gói. * Bộ phận dùng. Thân rễ - Rhizoma Coptidis Là những mẩu cong queo, dài 3-5cm, rộng 0,2-0,5cm, có nhiều đốt khúc khuỷu và phân nhánh nhiều. Nhánh trông giống hình chân gà, mặt ngoài màu vàng nâu mang vết tích rễ phụ và cuống lá. Thể chất cứng rắn, vết bẻ ngang không phẳng, phần gỗ màu vàng tươi, không mùi, vị rất đắng [1,3,6,20,21]. Các loại HL khác, thân rễ màu vàng, ít phân nhánh cũng có bán trên thị trường Việt Nam. - Bột: Màu vàng ,vị rất đắng. Dưới tia tử ngoại có huỳnh quang màu vàng tươi. Soi kính hiển vi thấy: tế bào mô cứng hình tròn hay nhiều cạnh; hạt tinh bột hình trứng hay bầu dục; mảnh bần màu vàng nâu; mạch mạng; sợi có thành rất dày [1,3,6]. * Chế biến. HL được chế biến theo nhiều cách khác nhau, cụ thể được chế biến thành: HL phiến, HL ủ rượu, HL trích nước gừng, HL trích với ngô thù du, HL sao vàng, HL sao đất, HL thán, HL chế giấm, HL trích muối, HL trích mật lợn [16]. * Thành phần hoá học. Thân rễ HL chứa nhiều Alcaloid ( 5-8% ) trong đó chủ yếu là Berberin. Ngoài ra còn có Palmatin, Worenin, Coptisin, Jatrorizin, Magnoflorin, Columbamin, Urbenin, Acid ferulic [3,19,22]. OCH3 OCH3 R1O R2O Công thức cấu tạo của một số Alcaloid phân lập từ rễ HL: Berberin R1+ R2 = - CH2 - Palmatin R1 = R2 = - CH3 Jatrorizin R1= - H R2= - CH3 Coptisin Worenin H3C H3CO CH Acid ferulic COOH CH HO OCH3 OCH3 Columbamin H3CO HO H3CO HO H3CO CH3 CH3 Magnoflorin HO Từ Berberin, Palmatin người ta hydro hoá tạo Tetrahydroberberin và Tetrahydropalmatin có công thức: Tetrahydroberberin: R1+ R2 = - CH2 - Tetrahydropalmatin: R1 = R2= - CH3 R1O R2O OCH3 OCH3 * Tác dụng sinh học của HL. - Tác dụng kháng khuẩn: Nước sắc HL có phổ kháng khuẩn rất rộng. Nước sắc thể hiện tác dụng ức chế vi khuẩn ở những nồng độ pha loãng sau: nồng độ 1:5120 có tác dụng trên Shigella shiga; nồng độ 1:2560 có tác dụng với Shigella dysenteriae; nồng độ 1:1640 có tác dụng với Staphylococcus aureus; nồng độ 1:640 có tác dụng với Bacillus cholerae; nồng độ 1:80 với Bacillus coli, Bacillus proteus; nồng độ 1:5 với Bacillus pyocyaneus [3]. Cơ chế tác dụng do Berberin ức chế sự tổng hợp ARN, protein và ngăn ngừa sự chuyển hoá hydradcarbon của vi khuẩn. - HL có tác dụng tăng cường hệ thống miễn dịch và quá trình thực bào; là tác nhân kháng độc tố, kháng viêm. HL có thể gây hạ huyết áp do tác dụng vào thụ thể M ( muscarinic ) và làm giảm hoạt động của enzym cholinesterase. HL có tác dụng chống thiếu máu cục bộ ở não do giảm sự ngưng kết tiểu cầu và giảm lượng Thomboxan A2. Nó tăng cường chức năng tâm thất trái khi đã suy yếu bởi tính hướng cơ đặc hiệu và giãn mạch nhẹ toàn cơ thể [19]. - HL chế gừng có tác dụng hạ sốt tốt, HL chế giấm có tác dụng lợi mật tốt [1]. - Ngoài ra HL còn có tác dụng trên virus cúm, amip và một số nấm gây bệnh ngoài da [14]. - Sản phẩm hydro hoá của Berberin là Tertrahydroberberin, có tác dụng an thần, mềm cơ, hạ huyết áp nhẹ [3]. * Công dụng, liều dùng. Theo đông y HL vị đắng tính hàn, qui vào 5 kinh: can, đởm, tâm, vị, đại tràng. HL có tác dụng thanh nhiệt táo thấp, giải độc hạ hoả, chỉ huyết, thanh tâm trừ phiền, thanh can sáng mắt. Dùng để chữa sốt cao, mê sảng, lỵ, tâm hoả thịnh, nôn ra máu, đau mắt đỏ, mất ngủ. Ngày dùng 2-12g dưới dạng thuốc sắc hoặc bột [2,4,8,23,24]. 1.3.2 Hoàng bá * Đặc điểm thực vật, phân bố , thu hái. Có 2 loài HB: Phellodendron amurense Rurp. và Phellodendron chinense Schneider, thuộc họ Cam - Rutaceae. Hình 2: Hoàng Bá HB thuộc cây gỗ, cao 10-25cm, cành rất phát triển.Vỏ màu nâu hoặc màu xám nhạt, vỏ phân thành hai lớp; lớp bần dày có đường rách dọc, lớp trong màu vàng tươi. Lá kép lông chim, có khoảng 5-13 lá chét, mép lá có răng cưa. Phần gốc của gân mang lông che chở mềm. Hoa nhỏ màu vàng, mẫu 5, đơn tính khác gốc. Quả mọng hình cầu [3,7,10,13,21]. HB mọc hoang và trồng nhiều ở Trung Quốc, Xiberi. Việt Nam đã di thực và trồng thí nghiệm thấy cây mọc tốt nhưng chưa trồng trên qui mô lớn, còn phải nhập của Trung Quốc [3]. Vỏ thu hái ở cây đã trồng trên 10 năm, thường thu hái vào mùa hạ, cạo sạch lớp bần, cắt thành từng miếng phơi khô [3,13]. * Bộ phận dùng. Vỏ thân, vỏ cành già - Cortex Phellodendri. Vỏ thân màu nâu, dày 0,3 - 0,5cm, dài 20 - 40cm, rộng 3-6 cm. Mặt ngoài có chỗ còn sót lại lớp bần mầu nâu đất, có những vết lõm sần sùi và rãnh dọc. Mặt trong màu nâu nhạt, có các vết nhăn dọc nhỏ, dài. Vết bẻ lởm chởm màu vàng rơm.Thể chất chắc, nhẹ [3,7,20,21]. - Bột: Màu vàng tươi, vị rất đắng. Soi kính hiển vi có: đám sợi màu vàng có vách dày hoá gỗ; sợi chữa tinh thể hình lăng trụ; mảnh mô mềm với các tế bào hình tròn; mảnh bần màu vàng nâu hình chữ nhật [3,7]. * Chế biến. HB được chế biến bằng nhiều cách khác nhau, cụ thể được chế thành: HB phiến, HB sao, HB trích rượu, HB trích muối, HB thán [16]. * Thành phần hoá học. Obakunon H3C CH3 H3C CH3 H3C Thành phần hoá học chính là Alcaloid trong đó chủ yếu là Berberin còn có một lượng nhỏ Palmatin, Phellodendrin, Magnoflorin, Jatrorizin, Candixin,…. Ngoài ra còn có một hợp chất Sterolic, chất béo [3,19,22]. OH OCH3 CH3 H3CO HO Phellodendrin Công thức hoá học của một số chất trong cây: HO CH2 CH2 N(CH3)3 Candixin OH OR OH R1O R2O R R1 R2 Phellodendrozid glucose H H Phellamurin H glucose H Dihydrophellozid H glucose glucose * Tác dụng sinh học của Hoàng Bá. - Tác dụng kháng khuẩn: HB có tác dụng kháng khuẩn tốt, đặc biệt tốt trên Bạch hầu, Liên cầu, Tả, Lỵ, Salmonella [3,14,19]. - HB có tác dụng kích thích hoạt động thực bào của bạch cầu. Nó có tác dụng giãn mạch, tăng tuần hoàn vành, hạ huyết áp [15,19]. - Hợp chất Lacton trong HB có tác dụng ức chế thần kinh trung ương và gây hạ đường huyết ở thỏ [13]. - Phellodendrin có tác dụng ức chế miễn dịch nhưng khác Prednisolon và Cyclophosphamid do không ảnh hưởng đến sự sản xuất kháng thể của hồng cầu cừu và chuột [19]. * Công dụng, liều dùng. Theo đông y, HB vị đắng tính hàn quy vào 3 kinh: thận, bàng quang, tỳ. HB có tác dụng tư âm giáng hoả, thanh nhiệt táo thấp, giải độc tiêu viêm được dùng trong các trường hợp âm hư, phát sốt, hạ tiêu thấp nhiệt ( như bàng quang thấp nhiệt dẫn đến tiểu tiện ngắn đỏ hoặc buốt rắt ), còn dùng khi cơ thể bị thấp chẩn, lở ngứa, mun nhọt. Ngày dùng: 6 - 12 g dưới dạng thuốc sắc hoặc thuốc bột [2,4,23,24]. 1.3.3 hoàng cầm. * Đặc điểm thực vật, phân bố, thu hái. HC - Scutellaria baicalensis Georgi, Họ hoa môi - Lamiaceae. Hình 3: Hoàng Cầm HC là cây thuộc thảo nhiều năm, cao khoảng 20 - 50 cm, thân đứng vuông, lá mọc đối, cuống ngắn hoặc không có. Phiến lá hình mác, mép nguyên. Hoa mọc hướng về một phía ở ngọn. Hoa hình môi, màu xanh lơ, có 4 nhị, bầu 4 ngăn [3,7,9,10,13,21]. HC mọc hoang và trồng nhiều ở Trung Quốc ( Hắc Long Giang, Hà Bắc, Vân Nam...). Hiện nay HC còn phải nhập từ Trung Quốc [3,13]. Rễ HC được thu hái vào mùa xuân hoặc mùa thu. Khi thu hái, bỏ rễ con, thân lá, phơi gần khô thì đập bỏ lớp vỏ ngoài rồi lại phơi khô. * Bộ phận dùng. Là rễ cây HC Radix Scutellariae. Dược liệu hình truỳ, vặn xoắn, dài 8 - 25 cm, đường kính 1 - 3 cm. Mặt ngoài màu nâu vàng hoặc vàng thẫm, rải rác có vết rễ con hơi lồi. Trên vỏ có những vết dọc vặn vẹo hoặc vân dạng mạng. Phần dưới có các sọc dọc và các vết ngăn nhỏ. Thể chất chắc, dòn, dễ bẻ. Mặt bẻ màu vàng thẫm, giữa có lõi màu nâu đỏ. Rễ già bên trong có bột vụn màu nâu hoặc đen nâu. Dược liệu bị ẩm sẽ chuyển thành màu xanh vàng [3,7,20]. - Bột màu vàng hay màu nâu, vị đắng. Soi kính hiển vi thấy: sợi rải rác hay tập trung thành bó, hình thoi, thành dày, ống lỗ nhỏ; mảnh mô mềm chứa hạt tinh bột; tinh bột kép đôi hay kép ba; tế bào mô cứng có thành dày; mảng mạch chấm và mạch điểm [3,7]. * Chế biến. HC được chế biến bằng nhiều cách khác nhau, cụ thể được chế thành: HC phiến, HC tẩm rượu, HC sao tồn tính, HC sao cháy cạnh, HC trích mật, HC trích gừng [16]. * Thành phần hoá học. Thành phần chính là flavonoid như Baicalein, Baicalin, Scutellarein, Scutellarin, Wogonin, Wogonosid, 7- Metroxynorwogonin, Scullcapflavon I, II. Ngoài ra còn có Tanin thuộc nhóm Pyrocatechin, nhựa [3,19,22]. RO HO HO O R1 Baicalein R= - H; R1= - H Baicalin R= - Gluc; R1= - H Scutellarein R= - H; R1= - OH Scutellarin R= - Gluc; R1= - OH Công thức cấu tạo một số chất trong rễ Hoàng Cầm: RO O OR1 Wogonin R= - H; R1= - CH3 Wogonosid R= - Gluc; R1= - CH3 7- Metroxynorwogonin R= - CH3; R1= - H OH Skullcapflavon I R= - H; R1= - CH3 Skullcapflavon II R= - OCH3; R1= -OCH3 R O OCH3 H3CO HO R1 OH * Tác dụng sinh học của Hoàng Cầm. - Tác dụng kháng khuẩn: HC có tác dụng trên Staphylococcus, Streptococcus, E. coli, Tả, Lỵ, Thương hàn, Bạch hầu... [3,13]. - Tác dụng chống Virus: HC có tác dụng ức chế đối với Virus Influenza [19]. - HC có tác dụng hạ nhiệt, chữa ho, lợi tiểu, an thần, hạ huyết áp [3,15]. - Baicalein có tác dụng hạ sốt yếu hơn Aspirin, còn là tác nhân kháng độc tố. Glycosid của Baicalein là baicalin có tác dụng chống viêm, chống khối u. Baicalin ngăn ngừa lây nhiễm HIV do ức chế HIV - 1 RT [19]. - Cả Baicalin và Baicalein đều có tác dụng bảo vệ hồng cầu tốt hơn a- tocoferol. Ngoài ra Baicalein có tác dụng lợi mật tốt hơn Baicalin [19]. * Công dụng, liều dùng. HC vị đắng tính hàn, qui vào kinh: tâm, phế, can đởm, đại tràng, tiểu tràng. HC có tác dụng thanh thấp nhiệt, trừ hoả độc ưu tiên ở thượng tiêu ( tạng phế ), lương huyết an thai; dùng cho các bệnh phế ung, phế có mủ, viêm phổi... gây sốt cao. Ngoài ra còn có tác dụng trừ thấp nhiệt ỏ vị tràng, thanh can nhiệt, chỉ huyết. Ngày dùng 6 - 15 g dưới dạng thuốc sắc hoặc bột [2,4,23,24]. Phần 2 thực nghiệm và kết quả Nguyên vật liệu. * Nguyên liệu. - Thân rễ HL chân gà (Coptis chinensis Franch.) thu hái trên dãy núi Hoàng Liên Sơn - Thôn Séo Mý Tỷ, Xã Tả Van, Huyện Sa Pa, Tỉnh Lào Cai. - Thân rễ HL Trung Quốc mua ở Phố Lãn Ông - Hà Nội. - Rễ HC (Scutellaria baicalensis Georgi) mua ở Phố Lãn Ông - Hà Nội. - Vỏ HB ( Phellodendron sp. ) mua ở Phố Lãn Ông - Hà Nội. - Hoá chất đạt tiêu chuẩn phân tích mua tại CTTNHH hoá học ứng dụng- Phố Lê Thánh Tông - Hà Nội. - Berberin chuẩn từ trung tâm kiểm nghiệm Sở Y Tế Hà Nội. - Palmatin chuẩn từ Bộ môn Dược Liệu trường Đại Học Dược Hà nội. - Các môi trường dùng cho nghiên cứu kháng khuẩn được bào chế theo đúng tiêu chuẩn tại phòng thí nghiệm Vi Sinh - Kháng Sinh, Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại Học Dược. * Đối tượng nghiên cứu. - Phương thuốc THT được bào chế từ 3 loại dược liệu: HL, HB, HC có cùng trọng lượng. - Khả năng kháng khuẩn của THT trên một số vi khuẩn kiểm định. * Dụng cụ thí nghiệm. - Máy xác định độ ẩm dược liệu “Precisa HA 6.0 ”. - Máy cất quay thu hồi dung môi “Buchi”. - Máy đo tử ngoại UV “Camag”. - Tủ sấy “Shellab” và “Memert”. - Nồi hấp tiệt trùng. - Các dụng cụ đo lường đạt tiêu chuẩn kiểm định. 2.2 Phương pháp thực nghiệm 2.2.1 Sắc thuốc Cân 15 g dược liệu ( HL, HB, HC, THT ), thêm 90 ml nước, đun sôi nhỏ lửa trong 1 giờ, gạn lấy dịch sắc. Tiến hành sắc 3 lần, gộp các dịch sắc, cô nhỏ lửa còn 15 ml; được dịch sắc 1:1. 2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học chính của phương THT và từng vị thuốc trong phương. * Định tính Alcaloid bằng phản ứng hoá học. - Tiến hành sắc như mục (2.2.1) đối với THT và các vị thuốc có alcaloid trong thành phần. - Chiết Alcaloid: Lần lượt kiềm hoá từng dịch sắc bằng NaOH 10 %, sau đó chuyển vào các bình gạn tương ứng. Lắc với chloroform (3 lần x 15ml). Tách lấy lớp chloroform vào các cốc tương ứng, acid hoá dịch chloroform bằng HCl 10%. Tách lấy lớp acid làm phản ứng với các thuốc thử chung Alcaloid. - Các phản ứng: + Phản ứng với TT Mayer: 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt TT Mayer. Nếu xuất hiện tủa trắng vàng là phản ứng dương tính. + Phản ứng với TT Bouchardat: 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt TT. Nếu xuất hiện tủa nâu đỏ là phản ứng dương tính. + Phản ứng với TT Dragendorff: 1 ml dịch chiết , thêm 2-3 giọt TT. Nếu xuất hiện tủa màu da cam là phản ứng dương tính. + Phản ứng với acid Picric: 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt TT. Nếu xuất hiện tủa màu vàng là phản ứng dương tính. * Định tính Flavonoid bằng phản ứng hoá học. - Sắc thuốc như mục ( 2.2.1 ) được 15 ml dịch sắc HC, 15 ml dịch sắc THT . - Chiết Flavonoid: thêm từ từ vào từng dịch sắc trên cồn 950 cho đến khi không thấy xuất hiện tủa thêm. Để lắng, lọc, cô dịch lọc trên nồi cách thuỷ đến dạng cao mềm. Thêm 10 ml nước sôi, lắc đều cho tan, lọc vào bình gạn. Thêm ethylacetat ( 3 lần x 10 ml ), lắc, tách lấy lớp ethylacetat làm phản ứng: + Phản ứng với NaOH 10%: 1 ml dịch chiết, thêm 0,5 ml NaOH 10%. Nếu xuất hiện màu vàng là phản ứng dương tính. + Phản ứng với Acetat chì 30%: 1 ml dịch chiết, thêm 0,5 ml Acetat chì. Nếu thấy xuất hiện tủa nâu là phản ứng dương tính. + Phản ứng với FeCl3 5%: 1 ml dịch chiết, thêm 0,5 ml FeCl3 5%. Nếu xuất hiện tủa màu xanh đen là phản ứng dương tính. + Phản ứng với NH3: nhỏ 1-2 giọt dịch chiết lên giấy lọc, để khô, đem hơ trên hơi NH3. Nếu màu vàng tăng lên là phản ứng dương tính. + Phản ứng Cyanidin: 1ml dịch chiết, thêm 0,1g Mg, vài giọt HCL đặc, đun cách thuỷ vài phút. Nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính. * Định tính Alcaloid bằng SKLM. - Chuẩn bị dung dịch phân tích. Sắc thuốc như mục (2.2.1 ) ta được 15 ml dịch sắc HL, 15 ml dịch sắc HB, 15 ml dịch sắc THT. Cô dịch sắc tới cắn, hoà tan bằng acid HCl 10%, lọc qua giấy lọc vào bình gạn, kiềm hoá dịch lọc bằng NaOH 10%, lắc với chloroform (3 lần x 15 ml), tách lấy lớp chloroform, cô trên nồi cách thuỷ còn khoảng 1 ml, ta được dịch phân tích. - Chuẩn bị dung dịch đối chiếu. + Cân 0,005 g Berberin chuẩn, hoà vào 1 ml chloroform. + Cân 0,005 g Palmatin chuẩn, hoà vào 1 ml chloroform. - Chất hấp phụ: Sử dụng Silicagel G của Merck, bản nhôm tráng sẵn Silicagel GF254 Merck. - Hệ dung môi khai triển. + Hệ 1: Toluen : Aceton : Ethylacetat : Acid formic ( 5 :2 :2 :1 ). + Hệ 2: n-Butanol : Acid acetic : Nước ( 7 :1 :2 ). - Dung dịch hiện màu. + Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 366 nm. + Dung dịch Iod 1% trong chloroform. + Dung dịch Dragendorff. * Định tính Flavonoid bằng SKLM . - Dịch chấm sắc ký Dùng dịch chiết trong ethylacetat nói trên. - Chất hấp phụ Sử dụng Silicagel G của Merck, bản nhôm tráng sẵn Silicagel GF254 Merck. - Hệ dung môi khai triển. + Hệ 1: Toluen : Chloroform : Aceton ( 8 :5 :7 ). + Hệ 2: Chloroform : Acid acetic ( 9:1 ). - Thuốc thử hiện màu. + Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm. + Hơi NH3 đặc. + H2SO4 20% trong MeOH. * Định lượng Alcaloid. - Định lượng Alcaloid toàn phần bằng phương pháp cân. + Nguyên tắc: dựa vào độ tan khác nhau của Alcaloid trong dung môi phân cực và không phân cực. + Cách tiến hành: cân chính xác một lượng dược liệu, xác định độ ẩm, sắc, loại tạp bằng cách chuyển alcaloid từ dạng bazơ sang dạng muối và ngược lại. Chiết alcaloid bazơ bằng chloroform. * Định lượng Flavonoid. - Nguyên tắc: dựa vào độ tan của Flavonoid trong cồn cao độ ( 950 ) và ethylacetat. - Tiến hành: cân chính xác một lượng dược liệu, xác định độ ẩm, sắc, loại tạp bằng cồn cao độ, chiết bằng ethylacetat. * Xử lý kết quả [12]. - Hàm lượng Alcaloid và Flavonoid được tính theo công thức: (a-b) x 100 X% = x 100% m x (100-d) Trong đó X%: là hàm lượng phần trăm alcaloid hoặc flavonoid a : là khối lượng cắn ( kể cả bì ) b : là khối lượng bì m : là khối lượng dược liệu d : độ ẩm dược liệu ( % ) - Dùng phương pháp thống kê toán học trong nghành dược để sử lý kết quả: Sxi x = n S(xi - x)2 n - 1 S t. S k = x ± n Trong đó: n Số mẫu làm x Giá trị trung bình S Độ lệch chuẩn k Khoảng tin cậy t thay đổi tuỳ thuộc độ tự do n-1 của mẫu với P = 95% ta có t = 2,776 2.2.3 nghiên cứu tính kháng khuẩn. Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Vi sinh - Kháng sinh, Bộ môn công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội theo phương pháp sử dụng khoanh giấy lọc. * Chủng vi khuẩn 10 chủng vi khuẩn đã sử dụng gồm: - 5 chủng vi khuẩn Gram ( + ): Bacillus subtilis ATCC 6633 viết tắt là BS. Bacillus cereus ATCC 9946 viết tắt là BC. Sarcina lutea ATCC 9341 viết tắt là SL. Staphylococcus aureus ATCC 12228 viết tắt là Sta. Bacillus pumilus ATCC 10241 viết tắt là BP. - 5 chủng vi khuẩn Gram ( - ): Shigella flexneri DT 112 viết tắt là Shi. Salmonella typhii DT 220 viết tắt là Typh. Escherichia coli ATCC 25922 viết tắt là EC. Proteus mirabilis BV 108 viết tắt là Pro. Pseudomonas aeruginosa VM 201 viết tắt là Pseu. * Môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Dùng môi trường canh thang nuôi cấy vi khuẩn kiểm định. Công thức: Cao thịt 0,3%. Pepton 0,5%. NaCl 0,5%. Nước cất vừa đủ 100ml. pH trung tính. Pha 100ml môi trường, lấy 10 ống nghiệm sạch, cho vào mỗi ống 5ml môi trường. Đem hấp tiệt trùng ở 117 - 118oC trong 30 phút. Sau đó lấy ra, để nguội, cấy các chủng vi khuẩn kiểm định vào, mỗi chủng vi khuẩn cấy vào một ống môi trường ( tiến hành trong tủ cấy vô trùng ). Sau khi cấy xong, nuôi vi khuẩn trong tủ ấm ở 370C, thời gian nuôi từ 18 - 24 giờ. * Chuẩn bị chế phẩm thử và mẫu thử. - Chuẩn bị chế phẩm thử. Sắc như mục ( 2.2.1 ) ta được các dịch sắc: HL tỷ lệ 1:1, HB tỷ lệ 1:1, HC tỷ lệ 1:1, THT tỷ lệ 1:1. - Mẫu thử. + Dung dịch Penicillin G 30 UI = 18 mg/ml. + Dung dịch Gentamicin 20 UI = 20 mg/ml. * Chuẩn bị khoanh giấy thử. - Đục khoanh giấy lọc có đường kính D = 6,0 mm, khối lượng từ 33,5 - 34,0mg. - Hấp tiệt trùng các khoanh giấy ở nhiệt độ 117 - 1180C trong 30 phút, sau đó sấy khô ở 600C trong khoảng 5 - 10 giờ. - Cho các khoanh giấy đã tiệt trùng vào 6 đĩa petri sạch khác nhau. Mỗi đĩa tẩm một trong các dịch: Pen, Gen, HL, HB, HC, THT. Sau mỗi lần tẩm, đem sấy ở nhiệt độ 500C cho đến khô. Tẩm 3 lần. Kết quả: Mỗi khoanh giấy tẩm dịch sắc chứa khoảng 0,8g dược liệu. Mỗi khoanh giấy tẩm Pen chứa khoảng 1 UI kháng sinh. Mỗi khoanh giấy tẩm Gen chứa khoảng 0,7 UI kháng sinh. * Chuẩn bị môi trường thử kháng khuẩn. Sử dụng môi trường thạch thường có công thức: Cao thịt 0,3% Pepton 0,5% NaCl 0,5% Thạch 1,6% Nước cất vừa đủ 1000ml pH trung tính Pha 1000 ml môi trường, chia vào 10 bình nón dung tích 250ml mỗi bình 100ml, đem hấp tiệt trùng ở 117-118oC trong 30 phút. Để nguội đến 45-50oC rồi lần lượt cho mỗi vi khuẩn kiểm định đã nuôi vào mỗi bình nói trên; lắc đều rồi phân ra 10 hộp petri. Để nguội xuống nhiệt độ phòng. * Thử tính kháng khuẩn. - Mỗi vi khuẩn làm trên 5 đĩa petri. - Trên mỗi đĩa petri đã đổ thạch, đặt các khoanh giấy đã tẩm kháng sinh và dịch sắc theo sơ đồ: .KS HL . HB. .THT .HC Trong đó: KS : Khoanh giấy tẩm kháng sinh HL : Khoanh giấy tẩm dịch sắc Hoàng Liên HB : Khoanh giấy tẩm dịch sắc Hoàng Bá THT : Khoanh giấy tẩm dịch sắc Tam Hoàng Thang HC : Khoanh giấy tẩm dịch sắc Hoàng Cầm Sau khi cấy, để vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4 - 100C trong 2 giờ cho hoạt chất khuếch tán trong môi trường thạch. Sau đó để các hộp petri vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 18 - 24 giờ. Khi đủ thời gian, đưa ra đọc kết quả và đo các vòng vô khuẩn ( nếu có ). 2.3 Kết quả thực nghiệm và nhận xét. 2.3.1 nghiên cứu về nguyên liệu. * Mô tả đặc điểm dược liệu. - Hoàng Liên Thân rễ HL thu hái từ Sapa cong queo dài 5 - 7cm, đường kính trung bình 0,3 - 0,5cm, có nhiều rễ phụ, nhỏ, cứng. Thể chất cứng, khi bẻ vết bẻ không phẳng. Vỏ rễ màu vàng nâu nhạt, bên trong màu vàng, vị rất đắng tồn tại lâu trong miệng, không mùi ( hình 4, hình 5 ). Thân rễ HL mua ở Lãn Ông dài 4 - 6cm, đường kính trung bình 0,5 - 0,7cm, phân nhánh.Vỏ mầu vàng nâu, bên trong mầu vàng đậm. Thể chất cứng, khi bẻ vết bẻ không phẳng. Vị rất đắng tồn tại lâu trong miệng ( hình5). - Hoàng Bá Vỏ HB có chiều dài không đồng nhất, dày 3- 4mm. Mặt ngoài màu vàng lục có vết rãnh dọc, bần sót lại màu vàng. Mặt trong màu vàng sáng. Thể chất cứng, vết bẻ xơ, màu vàng tươi. Dược liệu gần như không mùi, vị đắng.(hình4) - Hoàng Cầm Đầu trên to dưới nhỏ, có vết tích rễ con, có thớ vặn, chiều dài 8 - 20cm, đường kính trung bình 1 - 2,5cm. Mặt ngoài màu vàng thẫm. Thể chất dòn, dễ bẻ. Mặt bẻ màu vàng, giữa có lõi màu nâu ( hình 4). Hình 4: Bài thuốc THT Hình 5: HL Sapa và HL thị trường * Đặc điểm bột. - Bột Hoàng Liên Bột HL màu vàng, vị rất đắng. Soi kính hiển vi thấy: tế bào mô mềm chứa tinh bột; tế bào mô cứng màu vàng; hạt tinh bột hình trứng hoặc hình bầu dục; mảnh bần màu nâu; sợi màu vàng sẫm có thành dày đứng riêng rẽ hoặc tụ với nhau thành từng bó; mảng mạch màu nâu ( hình 8 ). - Bột Hoàng Bá Bột HB màu vàng lục, dưới đèn tử ngoại có huỳnh quang màu vàng sáng, vị rất đắng. Soi kính hiển vi thấy: đám sợi màu vàng có vách rất dày; sợi chứa tinh thể canxioxalat hình lập phương; tế bào mô cứng màu vàng tươi đứng riêng rẽ hoặc tụ tập thành từng đám; tinh bột hình cầu nhỏ ( hình 6 ). - Bột Hoàng Cầm Bột HC màu vàng, vị đắng. Soi kính hiển vi thấy: mô mềm chứa tinh bột; các hạt tinh bột kép đôi, kép ba; sợi hình thoi đứng riêng rẽ hoặc tụ với nhau thành từng bó; tế bào mô cứng có thành dày; mạng chấm và mạng điểm ( hình 7 ). Hình 6: Đặc điểm bột Hoàng Bá 1 2 4 3 5 4 6 Sợi và bó sợi chứa Tinh thể canxioxalat hình lập phương. Tinh thể canxioxalat Hình lập phương. Tinh bột. Tế bào mô cứng. 6 4 5 2 3 1 Hình 7: Đặc điểm bột Hoàng Cầm Mạch mạng. Mạch điểm. Tế bào mô cứng. Bó sợi. Mô mềm chứa tinh bột. Tinh bột. 1 2 3 4 5 6 Mảnh mô mềm chứa tinh bột. Hạt tinh bột. Mảnh bần. Tế bào mô cứng. Bó sợi. Mảng mạch điểm. Mảng mạch Hình 8: Đặc điểm bột Hoàng Liên Nhận xét: Qua kết quả nghiên cứu phần dược liệu và vi học thấy rằng các vị thuốc nghiên cứu phù hợp với các tài liệu thực vật đã công bố [7,9,10,11,13]. 2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học chính. * Định tính Alcaloid bằng phản ứng hoá học. Bảng 1: Kết quả định tính Alcaloid DC TT Dragendorff Mayer Buchardat Acid picric HL Vàng cam Trắng vàng Nâu đỏ Vàng HB Vàng cam Trắng vàng Nâu đỏ Vàng THT Vàng cam Trắng vàng Nâu đỏ Vàng Chú thích: ( tủa ) Nhận xét : Qua bảng 1 thấy rằng trong dịch chiết HL, HB, THT đều có Alcaloid. * Định tính flavonoid bằng phản ứng hoá học. Bảng 2 : Kết quả định tính flavonoid. TT DC NaOH 10% Pb acetat 30% FeCl 5% NH3 dặc Phản ứng Cyanidin HC Màu vàng Nâu Xanh đen Vàng tăng Màu đỏ THT Màu vàng Vàng Xanh đen Vàng tăng Màu đỏ Chú thích: ( tủa ) Nhận xét: Ta thấy trong dịch chiết HC, THT đều có flavonoid. * Định tính Alcaloid bằng SKLM. - Hệ dung môi 1 1 2 3 4 5 {Toluen : Aceton : Ethylacetatacetat : Acid formic = 5:2:2:1 ] Palmatin chuẩn. Berberin chuẩn. Dịch chiết HL. Dịch chiết HB. Dịch chiết THT. Hình9: Sắc ký đồ của Alcaloid trên hệ dung môi 1. Bảng 3: Kết quả SKLM của Alcaloid trên hệ dung môi 1. Vết Rf x 100 và màu của các vết Pal Ber HL HB THT Rf Màu Rf Màu Rf Màu Rf Màu Rf Màu 1 27 Vàng 27 Vàng 27 Vàng 27 Vàng 2 29 Vàng 29 Vàng 29 Vàng 29 Vàng 3 33 Vàng 33 Vàng 33 Vàng 3 35 Vàng 35 Vàng 35 Vàng 5 48 Vàng 48 Vàng 6 62 Vàng 62 Vàng 7 71 Vàng 71 Vàng 71 Vàng Nhận xét: ở hệ dung môi này ta thấy phương thuốc THT có 7 vết alcaloid tương tự các vết của từng vị thuốc trong phương và có Berberin ( Rf x100 = 29 ); Palmatin ( Rf x 100 = 27 ). Hệ dung môi 2 1 2 3 4 5 [n-Butanol : A.acetic : H2O = 7:1:2 ]. Palmatin chuẩn. Berberin chuẩn. Dịch chiết HL. Dịch chiết HB. Dịch chiết THT. Hình 10: Sắc ký đồ Alcaloid trên hệ dung môi 2. Bảng 4: Kết quả SKLM của Alcaloid trên hệ dung môi 2. Vết Rf x 100 và màu sắc của các vết Pal Ber HL HB THT Rf Màu Rf Màu Rf Màu Rf Màu Rf Màu 1 39 Vàng 39 Vàng 39 Vàng 39 Vàng 2 44 Vàng 44 Vàng 44 Vàng 44 Vàng 3 48 Vàng 48 Vàng 48 Vàng 4 53 Vàng 53 Vàng 5 72 Vàng 72 Vàng 72 Vàng 6 76 Vàng 76 Vàng 76 Vàng Nhận xét: ở hệ dung môi này thấy phương THT có alcaloid tương ứng với các vết của từng vị thuốc trong phương và đều có Berberin ( Rf x100 = 44), Palmatin( Rf x100 = 39). Nhận xét chung: Qua 2 hệ dung môi trên, sơ bộ kết luận về thành phần hoá học của phương THT đều tồn tại các vết alcaloid tương ứng với các vết của HL, HB; đặc biệt 2 alcaloid chính là Berberin, Palmatin . * Định tính flavonoid bằng SKLM - Hệ dung môi 1 [ Toluen : Chloroform : Aceton = 8:5:7 ] 1 2 Dịch chiết HC. Dịch chiết THT. Hình 11: Sắc ký đồ của flavonoid trên hệ dung môi 1. Bảng 5: Kết quả SKLM của flavonoid trên hệ dung môi 1. Vết Rf x 100 và màu sắc của các vết HC THT Rf Màu Rf Màu 1 14 Vàng 14 Vàng 2 21 Vàng 21 Vàng 3 29 Vàng 29 Vàng 4 38 Vàng 38 Vàng 5 42 Vàng 42 Vàng 6 59 Vàng 59 Vàng Nhận xét: ở hệ dung ._.