Nghiên cứu tạo đột biến ở cây cẩm chướng bằng xử lý kết hợp EMS (Ethyl Methane Sulfonate) và tia gamma

Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o tr­êng ®¹i häc n«ng nghiÖp hµ néi ----------eêf---------- ph¹m thÞ chi NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN Ở CÂY CẨM CHƯỚNG BẰNG XỬ LÝ KẾT HỢP EMS VÀ TIA GAMMA LuËn v¨n th¹c sÜ n«ng nghiÖp Chuyªn ngµnh: trång trät M· sè: 60.62.01 Ng­êi h­íng dÉn khoa häc: pgs.ts. nguyÔn thÞ lý anh Hµ Néi - 2009 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được sử dụng và công bố trong các luận văn, luận án và các công trình khoa học nào trước đây. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn được sử dụng trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo đúng quy định. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này ! Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2009 Tác giả Phạm Thị Chi LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực của bản thân tôi đã nhận được sự giúp đỡ về mọi mặt của các thầy cô giáo, các tập thể và các cá nhân. Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo, cán bộ bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Sinh học nông nghiệp - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. Đặc biệt xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Lý Anh, người đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi về mọi mặt trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cũng qua đây cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới các, tập thể, cá nhân, bạn bè đồng nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2009 Tác giả Phạm Thị Chi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CT: Công thức EMS: Ethylmethane sulphonate IAA: 3- Indoleacetic axit MS: Môi trường Murashige and Skoog NXB: Nhà xuất bản R: Hệ số tương quan α NAA: α- Napthaleneaxetic axid 0Krad: Công thức 1: Đối chứng không xử lý 3Krad: Công thức 2: Đối chứng 2: Chỉ xử lý đơn tia gamma ở liều suất 3Krad 3Krad-0,1%: Công thức 3: Xử lý kép EMS nồng độ 0,1% kết hợp và tia gamma liều suất 3Krad 3Krad-0,2%: Công thức 4: Xử lý kép EMS nồng độ 0,2% kết hợp và tia gamma liều suất 3Krad 3Krad-0,3%: Công thức 5: Xử lý kép EMS nồng độ 0,3% kết hợp và tia gamma liều suất 3Krad 3Krad-0,4%: Công thức 6: Xử lý kép EMS nồng độ 0,4% kết hợp và tia gamma liều suất 3Krad 3Krad-0,5%: Công thức 7: Xử lý kép EMS nồng độ 0,5% kết hợp và tia gamma liều suất 3Krad TB: Trung bình. MỤC LỤC 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài 3 1.3. Giới hạn của đề tài. 3 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Giới thiệu cây cẩm chướng 4 2.2. Tạo giống đột biến bằng xử lý gamma và EMS 9 2.3. Tạo giống đột biến thực nghiệm 16 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1. Đối tượng nghiên cứu 29 3.2. Vật liệu nuôi cấy 29 3.3. Nội dung nghiên cứu 29 3.4. Phương pháp nghiên cứu. 32 3.5. Các chỉ tiêu theo dõi 33 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến khả năng sống, sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy 35 4.1.1. Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến khả năng sống và sinh trưởng của chồi in vitro 35 4.1.2. Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến sự phát sinh phát sinh hình thái và khả năng sinh trưởng của các dạng chồi in vitro 39 4.2. Nghiên cứu, đánh giá sự sinh trưởng và khả năng phục hồi của các chồi sau xử lý qua các lần cấy chuyển (3 lần) 46 4.2.1. Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến khả năng sinh trưởng của chồi invitro qua 3 lần cấy chuyển 46 4.3. Ảnh hưởng của xử lý kết hợp tia gamma và EMS đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh của các chồi sau xử lý 64 4.4. Nghiên cứu sự sinh trưởng của các chồi sau xử lý trong điều kiện tự nhiên 67 5. KẾT QUẢ VÀ ĐỀ NGHỊ 72 5.1. Kết luận 72 5.2. Đề nghị 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 PHỤ LỤC 79 DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến khả năng sinh trưởng của chồi in vitro giống số 4 36 4.2: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến khả năng sinh trưởng của chồi in vitro giống số 6 37 4.3: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp gamma và EMS đến sự phát sinh hình thái và sinh trưởng của các chồi in vitro giống số 4 sau 4 tuần 42 4.4: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp gamma và EMS đến sự phát sinh hình thái và sinh trưởng của các chồi in vitro giống số 6 sau 4 tuần 43 4.5: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến sinh trưởng của chồi cẩm chướng in vitro giống số 4 qua 3 lần cấy chuyển 48 4.6: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến sinh trưởng của chồi cẩm chướng in vitro giống số 6 qua 3 lần cấy chuyển 50 4.7: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến sự phát sinh và sinh trưởng của các dạng chồi in vitro giống số 4 ở cấy chuyển 1 sau 4 tuần 52 4.8: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến sự phát sinh và sinh trưởng của các dạng chồi in vitro giống số 4 ở cấy chuyển 2 sau 4 tuần 53 4.9: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến sự phát sinh và sinh trưởng của các dạng chồi in vitro giống số 4 ở cấy chuyển 3 sau 4 tuần 54 4.10: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến sự phát sinh và sinh trưởng của các dạng chồi in vitro giống số 6 ở cấy chuyển 1 sau 4 tuần 55 4.11: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến sự phát sinh và sinh trưởng của các dạng chồi in vitro giống số 6 ở cấy chuyển 2 sau 4 tuần 56 4.12: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến sự phát sinh và sinh trưởng của các dạng chồi in vitro giống số 6 ở cấy chuyển 3 sau 4 tuần 57 4.13: Khả năng ra rễ của chồi sau xử lý kết hợp EMS và tia gamma của giống số 4 64 4.14: Khả năng ra rễ của chồi sau xử lý kết hợp EMS và tia gamma của giống số 6 66 4.15: Sinh trưởng của các cây sau xử lý trong điều kiện tự nhiên 67 4.16: Sự tăng trưởng chiều cao của các cây sau xử lý (cm/tháng) 68 4.17: Sự tăng trưởng số lá của các cây sau xử lý (lá/tháng) 68 4.18: Tỷ lệ các dạng cây biến đổi hình thái của giống số 4 (%) 69 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1. Sự kết cặp nhầm chuyên biệt do đột biến cảm ứng alkyl hoá [24] 15 3.1. Ảnh mẫu hoa nghiên cứu 29 4.1. Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến khả năng sống của giống số 4 và giống số 6 38 4.2. Các dạng chồi in vitro thu được sau xử lý kết hợp EMS và tia gamma 41 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ EMS xử lý đến tỷ lệ chồi biến đổi hình thái của giống số 4 và giống số 6 44 4.4 Sự phục hồi dạng A giống số 4 61 4.5. Sự phục hồi dạng D giống số 4 61 4.6. Sự phục hồi dạng B giống sô 4 61 4.7. Sự phục hồi dạng E giống số 4 61 4.8. Sự phục hồi dạng C giống sô 4 61 4.9. Sự phục hồi dạng G giống số 4 61 4.10. Sự phục hồi dạng A giống sô 6 62 4.11. Sự phục hồi dạng D giống số 6 62 4.12. Sự phục hồi dạng B giống sô 6 62 4.13. Sự phục hồi dạng E giống số 6 62 4.14. Sự phục hồi dạng C giống sô 6 62 4.15. Sự phục hồi dạng G giống số 6 62 4.16. Các dạng biến đổi hình thái trồng trong điều kiện tự nhiên 71 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cùng với sự phát triển của xã hội, đời sống của con người ngày càng được nâng cao, thị hiếu yêu cầu và thẩm mỹ của con người cũng không ngừng phát triển. Trong nông nghiệp cùng với những yêu cầu ngày càng cao về lương thực, thực phẩm thì cây hoa cũng đã trở thành một nhu cầu không thể thiếu trong đời sống con người. Sản xuất hoa đã trở thành một ngành thương mại cao, mang lại lợi ích lớn cho nền kinh tế của các nước. Trong chiến lược phát triển nông nghiệp hiện nay ở Việt Nam, chuyển đổi cơ cấu cây trồng để nâng cao hiệu quả kinh tế trên một đơn vị diện tích đất đai đang là một yêu cầu bức thiết của sản xuất. Thực tế trong những năm qua ở hầu hết các địa phương trong cả nước đã xuất hiện nhiều mô hình chuyển đổi cơ cấu cây trồng, trong đó phải kể đến mô hình chuyển đổi từ trồng lúa sang trồng hoa thâm canh có hiệu quả kinh tế cao hơn. Trong những loài hoa cắt được trồng, cẩm chướng đang dần trở thành cây trồng phổ biến. Với những ưu điểm: mầu sắc đẹp, đa dạng và phong phú (khoảng hơn 300 loài và rất nhiều giống lai khác nhau [28]), sản lượng cao, dễ vận chuyển và bảo quản, cây cẩm chướng ngày càng được người tiêu dùng biết đến, nó đã trở thành một trong bốn loài hoa cắt cành được trồng phổ biến trên thế giới (chiếm 17% tổng sản lượng hoa cắt) [7]. Ở nước ta, trước đây hoa cẩm chướng được trồng làm cảnh trang trí, năm 1975 chúng ta đã bắt đầu sản xuất hoa cẩm chướng cắt cành với những giống được nhập nội từ nước ngoài. Từ năm 1995 có nhiều giống hoa cẩm chướng mới được nhập nội có nguồn gốc từ Hà Lan, Trung Quốc với màu sắc đa dạng phong phú [54]. Cho đến nay, cẩm chướng đã trở thành một loài hoa được trồng phổ biến và góp phần không nhỏ vào sự phát triển của ngành rau hoa quả của nước ta. Theo số liệu sơ bộ của Tổng cục Hải quan, kim ngạch xuất khẩu hoa các loại trong tháng 8/09 đạt 1,7 triệu USD, tăng 111,9% so với cùng kỳ 2008 [54]. Trong đó, xuất khẩu cẩm chướng đạt 8,4 triệu cành, thị trường chủ yếu là Nhật Bản, Oxtraylia và Đài Loan. Đa đa số các giống hoa cẩm chướng được trồng ở nước ta hiện nay phải nhập từ nước ngoài, nên chi phí sản xuất cao, không chủ động trong sản xuất, năng suất, chất lượng sản phẩm chưa đáp ứng được yêu cầu, thị hiếu của người tiêu dùng. Đặc biệt các giống này chưa thích ứng với điều kiện sinh thái của nước ta. Vì vậy, việc phát triển cây hoa có giá trị này không chỉ là việc nhân nhanh các giống nhập nội hay tìm ra những biện pháp kỹ thuật nhằm nâng cao năng suất chất lượng mà còn phải tạo ra được những giống hoa cẩm chướng mới đáp ứng được nhu cầu thị trường và phù hợp với điều kiện sinh thái của Việt Nam. Hiện nay, cùng với sự phát triển của công nghệ tế bào thực vật, công nghệ xử lý đột biến in vitro đã trở thành công cụ hữu hiệu trong chọn tạo giống cây trồng. Kỹ thuật gây đột biến in vitro đã gây tạo và làm tăng tần số xuất hiện đột biến, rút ngắn thời gian chọn tạo với các tính trạng có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nói chung và cây hoa nói riêng, góp phần không nhỏ cho việc cải tiến giống cây trồng. Phương pháp được đánh giá là một trong những thành tựu của thế kỷ 20. Ở nước ta hiện nay việc nghiên cứu gây đột biến in vitro vẫn còn hạn chế. Đối với cây cẩm chướng đã có những công bố ban đầu về xử lý riêng rẽ EMS và tia gamma in vitro. Để gia tăng tần xuất xuất hiện đột biến nhằm tạo nguồn nguyên liệu phong phú cho chọn toạ giống hoa cẩm chướng mới, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tạo đột biến ở cây cẩm chướng bằng xử lý kết hợp EMS (Ethyl Methane Sulfonate) và tia gamma.” 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài 1.2.1. Mục đích Xác định được tác động của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến cây cẩm chướng in vitro, nhằm tìm ra phương pháp hiệu quả để tạo nguồn nguyên liệu di truyền cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng. 1.2.2. Yêu cầu của đề tài - Xác định được nồng độ EMS xử lý kết hợp với tia gamma chiếu xạ gây hiệu quả đột biến cho cây hoa cẩm chướng in vitro. - Đánh giá được sự sinh trưởng, phát triển của các cây sau xử lý trong điều kiện in vitro và trong điều kiện tự nhiên. 1.3. Giới hạn của đề tài. - Các thí nghiệm xử lý đột biến được tiến hành trong phòng thí nghiệm tại Viện sinh học Nông nghiệp với điều kiện hoàn toàn nhân tạo. - Các thí nghiệm ngoài tự nhiên được tiến hành trong điều kiện khí hậu vùng đồng bằng sông Hồng vụ hè năm 2009. 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài - Đây là đề tài đầu tiên tiến hành nghiên cứu xử lý kết hợp tác nhân gây đột biến phóng xạ (tia γ) và tác nhân đột biến hoá học (EMS) cho cây cẩm chướng trong điều kiện in vitro. Các kết quả nghiên cứu của đề tài đã minh chứng được sự gia tăng tỷ lệ biến dị khi xử lý kết hợp hai nhân tố so với xử lý riêng rẽ từng nhân tố. Đồng thời đề tài đã xác định được sự thay đổi tỷ lệ các dạnh biến dị in vitro qua các lần cấy chuyển mẫu và làm rõ sự sai khác ở mức độ ADN của các dạng biến dị này. Trên cơ sở đó đã tìm được phương pháp xử lý kết hợp EMS và tia gamma in vitro hiệu quả cho cây cẩm chướng. - Các kết quả nghiên cứu của đề tài cũng là tư liệu giảng dạy có giá trị trong lĩnh vực công nghệ Sinh học và chọn tạo giống cây trồng. Đồng thời các dòng cẩm chướng thu đuợc sau xử lý kết hợp EMS và tia gamma in vitro sẽ là nguồn nguyên liệu di truyền quý cho việc chọn tạo giống hoa cẩm chướng. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu cây cẩm chướng 2.1.2. Nguồn gốc, phân loại Cây cẩm chướng, hay còn gọi là hoa Phăng, có tên khoa học là Dianthus caryophyllus L., thuộc lớp hai lá mầm (Dicotylendonea), bộ phôi cong (Sentrospemea), họ Cẩm chướng (Cariophyllaceae), chi Dianthus [7], [11]. Cẩm chướng có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải, bắt đầu được nuôi trồng để thưởng ngoạn từ thế kỷ XVI. Lần đầu tiên vào năm 1750, các nhà làm vườn Pháp đã tạo ra giống cẩm chướng Remontant, cây cao, ra hoa nhiều lần trong năm. Năm 1846, họ đã trồng được rất nhiều giống cẩm chướng hoang dại và điều khiển cho chúng ra hoa quanh năm [7]. Năm 1852, cây cẩm chướng từ châu Âu được nhập vào Mỹ. Tại đây hàng trăm giống hoa cẩm chướng mới với các hình dạng và mầu sắc khác nhau đã được tạo ra, trong đó các giống như North, Berwick, Maine và Wiliam Sim đã trở thành những giống hàng đầu. Từ các giống hoa này, người ta đã gây đột biến và lai tạo ra rất nhiều giống cẩm chướng khác nhau trong đó có các giống thuộc dòng Sim nổi tiếng nhất và được trồng khắp nơi trên thế giới [7]. Ở Việt Nam hoa cẩm chướng được người Pháp đưa vào trồng từ đầu thế kỷ XIX, chủ yếu trồng ở những nơi có khí hậu mát mẻ như Đà Lạt, SaPa. Những năm gần đây, cẩm chướng đã được trồng ở nhiều vùng trong cả nước [5]. 2.1.2. Đặc điểm thực vật học * Rễ: Cẩm chướng có bộ rễ chùm. Chiều dài của rễ 15 – 20 cm, phân bố tập trung ở tầng đất mặt 20 cm, một số ít có khả năng ăn sâu tới 40 - 45 cm. Ở trạng thái bình thường rễ và tán cây theo tỷ lệ tương đương. Nếu đất quá nhiều phân, nhiều nước rễ sẽ sinh trưởng không tốt. Nhiệt độ đất cao cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của rễ. * Thân: Thân thảo, nhỏ, mảnh mai. Thân rất dễ gãy ở đốt. Các đốt cẩm chướng thường gãy khúc. Cẩm chướng thường có thân màu xanh nhạt, bao phủ một lớp phấn trắng xung quanh. Ở Việt Nam hiện trồng hai loại cẩm chướng: các giống cẩm chướng thấp cây (30 – 50 cm) và các giống cẩm chướng cao cây (50 – 80 cm). * Lá: Lá kép, mọc từ các đốt thân, lá mọc đối. Phiến lá dày hình lưỡi mác, mép lá trơn. Mặt lá nhẵn không có độ bóng. Trên mặt lá phủ một lớp phấn trắng, mỏng và mịn. Lớp phấn trắng có tác dụng làm giảm bốc hơi nước. * Hoa: Hoa chùm và hoa đơn. Về cánh hoa, có thể xếp làm hai loại: hoa đơn và hoa kép. Hoa đơn mọc đơn từng chiếc một, hoa chùm có nhiều hoa trên một cánh. Hoa nằm ở đầu cành. Hoa có nhiều màu sắc. Ngay cả trên hoa cẩm chướng kép cũng có từ 2 – 3 màu khác nhau. Hoa cẩm chướng đẹp tự nhiên. Hoa có mùi thơm thoang thoảng. Nụ hoa có đường kính khoảng 2,0 – 2,5 cm. Hoa khi nở hoàn toàn có đường kính 6,0 – 7,0 cm. * Hạt cẩm chướng: Hạt cẩm chướng nhỏ, nằm trong quả. Mỗi quả thường có từ 300 – 600 hạt. (Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, 2005) [7], (Lê Sỹ Dũng (2001) [5]. 2.1.3. Yêu cầu ngoại cảnh * Nhiệt độ: Cây cẩm chướng là cây ôn đới nên thích hợp với khí hậu mát mẻ. Nhiệt độ thích hợp: 17 – 25oC, nhưng trong phạm vi từ 10 – 15oC cây vẫn sinh trưởng bình thường và cho chất lượng hoa tương đối tốt. Nếu vượt quá 30oC thì cây sinh trưởng kém, thân lá nhỏ, hoa nhỏ, sản lượng và chất lượng hoa giảm, tuổi thọ hoa ngắn, dưới 10oC cây sinh trưởng yếu, sản lượng giảm rõ rệt. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng và phát triển của cây từ 19 – 21oC. * Ánh sáng: Cẩm chướng là loại cây ưa sáng và thích hợp với thời gian chiếu sáng ngày dài. Thời gian chiếu sáng trong ngày càng dài cây càng nhanh phân hóa hoa, hoa nở đều, chất lượng hoa tốt. Lượng chất khô và tốc độ sinh trưởng của cây tương quan thuận với cường độ ánh sáng. * Nước: Hàm lượng nước trong lá cẩm chướng chiếm 70 – 80%, trong cành 68 – 70%, trong rễ 80%. Độ ẩm tương đối của không khí và đất ảnh hưởng trực tiếp đến sự quang hợp và hô hấp của cây cẩm chướng. * Không khí: Cẩm chướng ưa khí hậu mát mẻ và thông thoáng. Trồng ở nơi có độ ẩm cao, kém gió sẽ bị bệnh nhiều. * Đất: Cẩm chướng là cây ưa đất thịt nhẹ, có độ thoáng cao, thoát nước tốt, 70% số rễ cẩm chướng tập trung ở tầng mặt (0 – 20 cm). Độ pH thích hợp với cẩm chướng là từ 6,0 – 6,5. Đối với đất liên tục trồng cẩm chướng thì phải khử trùng, tiêu độc hoặc luân canh vì đất có nhiều vi sinh vật gây bệnh. * Dinh dưỡng: Các căn cứ để xác định phân và thời gian bón phân cho cây là trạng thái dinh dưỡng của cây, nồng độ dinh dưỡng trong đất, lượng dinh dưỡng cây hút. Trạng thái dinh dưỡng của cây thường được biểu thị bằng % nguyên tố dinh dưỡng và chất khô trong lá. Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ dinh dưỡng lý tưởng nhất trong lá cẩm chướng là: Nitơ (3,0 – 3,5%); Photpho (0,2 – 0,3%); Kali (3,0 – 4,0%); Caxi (1,0 – 2,0%); Magie (0,2 – 0,5%). (Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, 2005) [7], (Lê Đức Thảo, 2003) [23]. 2.1.4. Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới và trong nước 2.1.4.1. Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới Trong số các loại hoa, hoa cẩm chướng là loại hoa được trồng rộng rãi, phổ biến ở Châu Âu, Châu Á, Châu Mỹ. Các nước trồng hoa nhiều đều có trồng hoa cẩm chướng [14]. Với những ưu điểm: sản lượng cao, đẹp mắt, dễ vận chuyển, bảo quản... cẩm chướng đã trở thành một loài hoa cắt cành được trồng phổ biến trên thế giới (chiếm khoảng 17% tổng sản lượng hoa cắt). Theo Đặng Văn Đông (2005), Italia là nước có diện tích trồng cẩm chướng nhiều nhất, năm 1995 sản lượng hoa cắt của nước này đạt 2.500 triệu cành [7]. Ở Hà Lan, tuy diện tích trồng hoa cẩm chướng không bằng diện tích trồng hoa tuylip nhưng sản lượng cũng đạt trên 1800 triệu cành/năm, đứng thứ 2 trên thế giới và có xuất khẩu sang Châu Âu, Bắc Mỹ và Nhật Bản [29]. Ở Ba Lan, cẩm chướng chiếm 60% sản lượng hoa cắt, mỗi năm nước này sản xuất được khoảng 400 triệu cành, đứng thứ 3 trên thế giới [7]. Ở Kenya, diện tích trồng hoa cẩm chướng chủ yếu tập trung ở Ritf Valley. Cây cẩm chướng cảnh được trồng ngoài đồng không bảo vệ ở độ cao khoảng 1800m và cẩm chướng thường được trồng trong nhà plastic ở độ cao 2700m so với mực nước biển [27]. Ở Colombia, hoa cẩm chướng là cây hoa quan trọng nhất, chiếm tỷ lệ 40% tổng lượng hoa xuất khẩu. Colombia là nước trồng cẩm chướng cho hoa tốt nhất trên thế giới và được gọi là thiên đường của hoa cẩm chướng. Trong tổng số 4.200 ha hoa cắt thì cẩm chướng chiếm 45,8%. Với điều kiện tự nhiên rất phù hợp, cây cẩm chướng đã phát triển trên 25 năm, năm 1986 đã có diện tích gần 1000 ha cẩm chướng được trồng trong nhà che plastic [37]. Ở Thổ Nhĩ Kỳ, hoa cẩm chướng được trồng rộng rãi từ năm 1925, hiện nay diện tích hoa cẩm chướng chiếm tỷ lệ 21%, đứng thứ 2 sau hoa hồng (24%) (Menguc, A; Eris, A, 1987) [36]. Ở Châu Á, hoa cẩm chướng được trồng nhiều ở Trung Quốc, Malaysia, Srilanka,… Ở Trung Quốc, hoa cẩm chướng cùng hoa hồng là hai loại hoa phổ biến nhất. Cẩm chướng chiếm khoảng 25% tổng lượng hoa trên thị trường tại Bắc Kinh và Côn Minh. Trung tâm sản xuất hoa cẩm chướng tập trung ở Côn Minh và Thượng Hải. Hầu hết các giống của Trung Quốc được nhập từ Israel, Hà Lan và Đức [44]. Tại Malaysia, sản lượng hoa cẩm chướng đứng thứ 3 sau cây hoa hồng và hoa cúc, chiếm 9,02% tổng sản lượng hoa. Ở đây, hoa cẩm chướng được trồng bao gồm cả loại hoa chùm và hoa đơn (Teresita L. Risario, 1998) [42]. Ngược lại, ở Philippin, cây cẩm chướng trồng được rất ít và phải nhập khẩu từ các nước khác. Tỷ lệ nhập khẩu hoa cẩm chướng đứng thứ hai trong tổng giá trị nhập khẩu hoa với 22,05% chỉ đứng sau hoa cúc (36,98%) (Teresita L. Risario, 1998) [52]. Tại Srilanka, hoa cẩm chướng là cây hoa ôn đới quan trọng nhất. Hoa cẩm chướng được trồng chủ yếu để xuất khẩu, còn các loại hoa khác chỉ tiêu thụ được ở nội địa. Hai giống cẩm chướng Châu Mỹ và cẩm chướng Địa Trung Hải của Srilanka rất nổi tiếng trên thị trường thế giới (D.M.U.B. Dhanasekera, 1998) [30]. Ixraen có 150 ha hoa cẩm chướng chiếm 7,5% tổng diện tích trồng hoa, mỗi năm nước này xuất khẩu đạt 119 triệu USD [54]. 2.1.4.2. Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng ở Việt Nam Ở Việt Nam, hoa cẩm chướng được trồng rộng rãi ở Hà Nội, Hải Phòng, Đà Lạt, thành phố Hồ Chí Minh. Các vùng chuyên hoa như An Hải (Hải Phòng), Tây Tựu – Từ Liêm (Hà Nội), Phú Thượng – Tây Hồ (Hà Nội) trồng nhiều hoa cẩm chướng. Trước đây, vào mùa hè, hoa cẩm chướng trên thị trường chủ yếu phải nhập từ Côn Minh (Trung Quốc) và Hà Lan nhưng vài năm trở lại đây, cẩm chướng trồng từ Đà Lạt, Lào Cai đang dần chiếm lĩnh thị trường trong nước (Nguyễn Thị Kim Lý, Nguyễn Xuân Linh, 2004) [16]. Theo số liệu thống kê trên trang wed thì xuất khẩu hoa các loại trong 8 tháng qua có sự tăng trưởng vượt bậc, số liệu thống kê cho thấy, kim ngạch xuất khẩu hoa các loại trong tháng 8/09 đạt 1,7 triệu USD, tăng 111,9% so với cùng kỳ 2008. Sản phẩm hoa xuất khẩu chủ yếu là hoa cúc, hoa cẩm chướng. Số liệu thống kê cho thấy lượng xuất khẩu hoa cẩm chướng trong tháng 8/09 đạt 1,7 triệu cành, kim ngạch đạt 343,8 nghìn USD, mặc dù có tăng 32% về lượng và 48% về kim ngạch so với tháng 7/09 nhưng lại giảm 12% về lượng và 19% về kim ngạch so với cùng kỳ 2008. Tính chung 8 tháng đầu năm 2009, lượng xuất khẩu hoa cẩm chướng đạt 8,4 triệu cành, tăng 10% về lượng nhưng kim ngạch chỉ đạt gần 1,5 triệu USD, giảm 0,5% so với cùng kỳ năm 2008 [54]. Cẩm chướng là hoa đang có triển vọng về sản xuất cũng như xuất khẩu. Thị trường xuất khẩu hoa Cẩm chướng chủ yếu là Nhật Bản, Ôxtrâylia và Đài Loan. Trong đó kim ngạch xuất khẩu sang thị trường Nhật Bản đạt cao nhất với 5,6 triệu cành, kim ngạch đạt 924,9 nghìn USD. Tiếp đến là Ôxtrâylia với lượng đạt 1,9 triệu cành, kim ngạch đạt 440,7 nghìn USD. Đáng chú ý, kim ngạch xuất khẩu hoa Cẩm chướng sang thị trường Đài Loan vẫn tăng rất mạnh, đạt 901 nghìn cành và hơn 120 nghìn USD, tăng 111% về lượng và 117,9% về kim ngạch. Đơn giá trung bình xuất khẩu hoa Cẩm chướng trong tháng 8/09 hiện vẫn đang duy trì ở mức 0,18 USD/cành. Tuy diện tích trồng không nhiều nhưng cẩm chướng luôn là hoa có trong danh mục hoa xuất khẩu. Trồng hoa cẩm chướng sau 3 - 4 tháng đã bắt đầu cho thu hoạch. Một sào Bắc Bộ trong một vụ cho thu từ 96000 – 120000 bông. Như vậy thâm canh đúng kỹ thuật thì mỗi vụ phần lãi thu được là 17 – 30 triệu đồng/sào [7]. Như vậy có thể thấy cẩm chướng là một loại hoa có tiềm năng phát triển rất lớn, và có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc phát triển ngành sản xuất hoa của nước ta nói riêng và thế giới nói chung. 2.2. Tạo giống đột biến bằng xử lý gamma và EMS 2.2.1. Đột biến tự nhiên và đột biến nhân tạo Đột biến là những biến đổi di truyền hợp thành cơ sở di truyền của tính biến dị, nó là hiện tượng thường xuyên gắn liền với sự sống và tiến hoá của sinh vật. Tác động của các đột biến rất đa dạng, nó có thể gây ra những biến đổi bất kỳ tính trạng nào với những mức độ khác nhau, từ những biến đổi rõ rệt, đến những sự sai lệch rất nhỏ khó nhận thấy. Một số đột biến được biểu hiện ra kiểu hình có thể quan sát được, nhưng cũng có những đột biến chỉ ảnh hưởng đến sức sống. Có những đột biến lặn nhưng cũng có những đột biến trội. Sự thay đổi kiểu hình do đột biến có thể biểu hiện ra ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau như phôi, hạt, cây con, cây trưởng thành. Căn cứ vào sự biến đổi cấu trúc di truyền người ta có thể phân ra làm các loại đột biến khác nhau như: đột biến gen là sự biến đổi rất nhỏ trên một đoạn ADN, thường liên quan đến 1 hay 1 số cặp nucleotide; đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể như tái sắp xếp, lặp đoạn, mất đoạn,... Các đột biến này còn có thể gọi là sai hình nhiễm sắc thể [24]. Trong các dạng đột biến nêu trên dạng làm biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể thường dẫn đến những biến đổi có hại đối với cơ thể sinh vật. Vì vậy, các nhà chọn giống chú trọng chủ yếu đến dạng đột biến gen, dạng này liên quan đến sự biến đổi cấu trúc của gen dẫn tới sự xuất hiện alen mới [12]. Sự phát sinh đột biến có thể do tự phát (đột biến tự nhiên): đột biến xuất hiện trong tự nhiên do tác động của tập hợp các yếu tố (vật lý, hoá học,…) có trong môi trường sống và do những biến loạn về trao đổi chất trong tế bào. Đột biến có thể do tác động của con người (đột biến nhân tạo) bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến như các tác nhân vật lý (tia X, tia gamma, bức xạ cực tím UV, bức xạ, neutron,…), các tác nhân hoá học (các chất đồng phân có tính base và những hợp chất có liên quan, chất kháng sinh, những tác nhân alkyl hoá, acridines, azides, hydroxylamine, nitrous acid,...). Trong điều kiện tự nhiên, tần số xuất hiện đột biến thay đổi tuỳ thuộc vào từng loại cây trồng và của từng gen riêng biệt, tuy nhiên tần số đột biến rất thấp (khoảng 10-6 [8]) và khó phát hiện, số đột biến có lợi cho sản xuất và đời sống lại càng thấp hơn. Ngày nay các nhà chọn giống không thể chỉ trông chờ vào việc sử dụng các dạng đột biến tự phát. Vì vậy, việc nghiên cứu đột biến nhân tạo được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, nhằm tăng tần suất xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nói chung và cây trồng nói riêng. Mặc dù còn nhiều hạn chế nhưng đột biến thực nghiệm đã và đang đóng góp rất lớn cho việc cải tiến giống cây trồng trên thế giới. 2.2.2. Nguyên lý tạo giống đột biến bằng phóng xạ, hoá chất 2.2.2.1. Tác nhân phóng xạ gây đột biến Nhờ sự phát hiện mới trong vật lý nguyên tử đã mở rộng phạm vi nghiên cứu, ứng dụng phóng xạ trong tạo giống cây trồng. Có 2 dạng phóng xạ là phóng xạ hạt và phóng xạ điện từ. Phóng xạ hạt là dòng chuyển động của những hạt cơ bản: nơtron, proton,... Phóng xạ điện từ là các sóng điện từ như tia gamma, tia X... Tia gamma và tia X là 2 dạng tia được sử dụng như nguồn chiếu xạ cơ bản trong các thực nghiệm, phổ biến nhất là tia gamma với nguồn Co6o và Cs137. Cơ chế gây đột biến của tác nhân bức xạ: Theo lý thuyết của A.M.Kuzin cơ chế của quá trình tương tác gây đột biến gồm 3 giai đoạn chính: - Giai đoạn 1: Có tính chất vật lý, sự tương tác của các bức xạ tạo ra các quá trình ion hoá và sự biến đổi các hợp chất ở mức dưới phân tử và phân tử. - Giai đoạn 2: Có tính chất hoá học, ở giai đoạn này diễn ra các phản ứng tương tác của các sản phẩm sơ cấp do kết quả tương tác của bức xạ với các đại phân tử chưa bị biến tính của các cấu trúc sinh học, tạo ra các peoxit hữu cơ đồng thời diễn ra các phản ứng oxi hoá dẫn tới sự tạo thành các hợp chất mới và các gốc độc tính. - Giai đoạn 3: Có tính chất sinh học là giai đoạn phát huy tác dụng của các phản ứng lên hoạt động của các tế bào sống. Tức là các biến đổi hoá học gây nên do bức xạ dưới mức tế bào, chẳng hạn làm thay đổi cấu trúc và tính thấm của màng tế bào. Quá trình tác động qua nhiều giai đoạn như thế gọi là tác động gián tiếp của bức xạ lên tế bào sống. Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy các tia bức xạ còn gây ra tác động trực tiếp lên một số cấu trúc dưới tế bào gây ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tổng hợp ADN và tổng hợp protit trong tế bào sống đặc biệt là các biến đổi trong cấu trúc ADN, làm phát sinh đột biến di truyền [19]. Tia gamma có bước sóng ngắn nên mang năng lượng cao dẫn đến khả năng đâm xuyên lớn. Tia gamma có khả năng điện ly gián tiếp các phân tử vật chất trong tế bào nhờ hiệu ứng quang điện. Do đó nó có khả năng biến các nguyên tử, phân tử thành những phân tử mang điện tích và tạo nên sự ion hoá. Nhờ sự ion hoá mà trong tế bào xảy ra những biến đổi về mặt hoá học vật liệu di truyền và những chất khác khi hấp thụ năng lượng bức xạ. Kết quả quá trình này dẫn tới những biến đổi trong phân tử ADN, gây ra đột biến điểm, đôi khi gây ra sự gẫy đứt tạo nên đột biến cấu trúc NST. Quá trình phát sinh đột biến cảm ứng rất phức tạp, liên quan và phụ thuộc vào nhiều yếu tố: - Đặc tính lý học của loại tia phóng xạ - Liều lượng, cường độ phóng xạ - Sự phục hồi các biến dị tiềm năng - Các yếu tố khác: dưỡng khí, nhiệt độ, lượng nước trong mô, một số chất hoạt hoá, điều kiện sinh thái, giai đoạn phát triển, kiểu gen của vật liệu xử lý. 2.2.2.2. Tác nhân hoá học gây đột biến Một số tác nhân hoá học, đặc biệt là các chất có khả năng oxy hoá, ethyl hoặc methyl hoá cao tác động lên cơ thể sinh vật sẽ có tác dụng oxy hoá, ethyl hoá các bazơ có đạm có trong nucleotit, làm thay đổi cấu tạo hoá học của chúng và gây nên đột biến gen. Phương pháp xử lý phụ thuộc vào cây, bộ phận xử lý và tác nhân xử lý. Ngoài ra, nó còn phụ thuộc vào thời kỳ sinh trưởng, phát dục của cây. Các tác nhân hoá học có đặc điểm chung sau [9]: - Có khả năng thẩm thấu cao - Có đặc điểm làm thay đổi keo nguyên sinh Ngày nay, người ta đã phát hiện ra hơn 400 hoá chất có thể sử dụng gây đột biến. Căn cứ vào cấu trúc hoá học, tác dụng của các tia mà người ta chia chúng làm 5 loại [9]: - Nhóm 1: oxy hoá khử - Nhóm 2: gồm các chất đồng phân với bazơ tham gia trong thành phần ADN ở vị trí Thimin, thay thế nucleotid này bằng nucleotid khác và gây đột biến. - Nhóm 3: Các chất có tác dụng kìm hãm sự tổng hợp Guanin và Thimin tạo ra các nucleotid không bình thuờng trong thành phần ADN gây nên hiện tượng đột biến. - Nhóm 4: Alkyl hoá, các chất này có tác dụng Alkyl hoá AND dẫn tới đứt mạch ADN hoạc làm sai lệch trật tự các bazơ trong mạch gây ra đột biến. - Nhóm 5: Acridin, đây là nhóm thuốc nhuộm, tác động lên ADN làm rối loạn quá trình tái sinh mã gây hiện tượng thiếu hoặc thừa nucleotid trong phân tử ADN, dẫn đến đột biến. 2.2.3. Giới thiệu về tia gamma, hoá chất Ethyl methane sulfonate (EMS). 2.2.3.1. Giới thiệu về tia gamma Tia gamma (kí hiệu là γ) là một loại bức xạ điện từ hay quang tử có tần số cao hơn tia X (bước sóng nhỏ hơn 100 picomét). Nguồn tia γ hay dùng nhất là Co60 và Cs137. Tia này có bước sóng ngắn nên hiệu quả xuyên thấu hơn tia χ. Tia γ cũng không bị lệch trong từ trường hay điện trường, có tác dụng điện ly gián tiếp nhờ hiệu ứng quang điện. Để xử lý cây trồng, người ta thiết kế các “trường” γ lớn. Trên thế giới hiện nay có nhiều “trường” γ lớn như ở Liên Xô, Mỹ, Nhật, Thuỵ Điển [9]. 2.2.3.2. Giới thiệu về EMS * EMS là hợp chất hóa học gây đột biến nằm trong nhóm các hợp chất alkyl hóa, nhóm này gồm phần lớn các chất hóa học được dùng phổ biến cho mục đích chọn giống hiện nay như EI, EMS, NEU, NMU....Quá trình akyl hóa là sự thay thế hydro có trong bazơ nitơ bằng một gốc alkyl có trong các chất alkyl hóa (như -C2H5 có trong EMS) (Lê Duy Thành, 2001) [22]. EMS có tên khoa học là Ethylmethane sulphonate, công thức hóa học: CH3 – CH2 – O – SO2 – CH3. (Eldon John Gardner, Michael J. Simmons, D. Peter Snustad, 1984) [31]. * Cơ chế tác động của EMS: EMS là chất gây đột biến gen, gây nên những đột biến điểm và mất đoạn nhỏ ADN [22]. EMS gây alkyl hóa với bazơ nitơ thường xuất hiện ở vị trí O6 của Guanin khiế._.n cho nó sau đó có thể kết cặp với Thymine và dẫn đến sự đồng hoán giữa các bazơ nitơ (đồng hoán – transition – là sự thay thế một purin này bằng một purin khác hoặc một pyrimidin này bằng một pyrimidin khác, hoặc sự thay thế một cặp bazơ này bằng một cặp bazơ khác mà vẫn giữ nguyên định hướng của purin và pyrimidin) (Lê Duy Thành, 2001) [22]. Kỹ thuật lớn của đột biến gen bằng tác động của EMS đòi hỏi sự dịch chuyển của nhóm methyl hoặc ethyl để các bazơ chẳng hạn như trong sự cặp đôi của chúng phải là kết quả của sự dịch chuyển. Cho ví dụ, nhóm ethyl (CH3 – CH2 –) ở vị trí N7 và ở vị trí O6 chắc chắn là hai hiệu quả tác động của EMS. 7 – ethylguanine tin chắc rồi sẽ cặp đôi với Thymine làm sai lệch sự cặp đôi theo nguyên tắc bán bảo toàn G – C (Guanin – Cytozin). (Eldon John Gardner, Michael J.Simmons, D.Peter Snustad, 1984) [31]. Trong các tác nhân gây đột biến bằng hoá học EMS là chất được sử dụng phổ biến và cho hiệu quả cao. Dung dịch hoá chất gây đột biến này phải được chuẩn bị trước khi dùng và nó được tồn trữ như dung dịch gốc “stock”. Tốc độ thuỷ phân của hợp chất này được đo bằng phương pháp bán thời gian “hafl life”. Qua các kết quả nghiên cứu người ta cho thấy tốc độ thuỷ phân của EMS phụ thuộc rất lớn vào nhiệt độ. Trong nước cất (pH = 7) ở nhiệt độ 200C hafl life của EMS là 93 giờ, ở 300C là 26 giờ và ở 370C là 10 giờ [2]. Vì vậy, để đảm bảo hoạt tính của chất gây đột biến chỉ nên chuẩn bị dung dịch trước khi xử lý không quá 30 phút và giữ trong bóng tối trong suốt thời gian xử lý [1]. Người ta còn phát hiện rằng dimethylsulphoxide (DMSO) là một chất mang có chức năng thúc đẩy hiện tượng phát sinh đột biên gen của EMS. Xử lý chất này làm giảm sự sinh trưởng 30 - 40% có khả năng tạo nên đột biến ở tần suất tối hảo cho cây trồng thuộc nhóm mễ cốc [2]. Hình 2.1. Sự kết cặp nhầm chuyên biệt do đột biến cảm ứng alkyl hoá [24] Để gây đột biến cho cây trồng có thể xử lý hoá chất EMS trên các bộ phận như hạt, chồi, củ, phôi trong thời gian đang phát triển. Tuy nhiên, đối với mỗi giống, bộ phận của cây trồng có sự cảm ứng khác nhau với hoá chất gây đột biến. Các kết quả nghiên cứu cho thấy, khi tăng nồng độ của tác nhân đến mức độ nhất định thì khả năng sống của cây cũng tăng, sau đó nếu tiếp tục tăng thì khả năng sống của đối tượng lại giảm xuống. Vì vậy, đối với từng giống, từng bộ phận cây trồng cần phải xác định nồng độ, thời gian tác động hợp lý mới có thể mong muốn đem lại hiệu quả di truyền cao. 2.3. Tạo giống đột biến thực nghiệm 2.3.1. Vai trò của đột biến thực nghiệm trong công tác chọn tao giống cây trồng Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, nhiều phương pháp chọn tạo giống đã và đang được quan tâm phát triển. Bằng các phương pháp truyền thống như lai tạo hay chọn lọc, để tạo ra một giống cây trồng năng suất cao, ổn định cần ít nhất từ 6-10 thế hệ. Trong khi đó chọn giống bằng phương pháp đột biến nhân tạo (đột biến thực nghiệm) chỉ cần 3-6 thế hệ [8]. Đồng thời sử dụng phương pháp này có thể giải quyết những vấn đề mà nhiều phương pháp khác không thể thực hiện được như khi biến dị tự nhiên về một đặc tính mong muốn không có sẵn trong nguồn vật liệu di truyền; khi có sẵn một gen cần thiết song do mối liên kết chặt chẽ với các gen khác làm cho gen đó không sử dụng được; khi tạo đặc tính mong muốn không thể thực hiện được bằng phương pháp lai; khi muốn thay đổi một hoặc một số tính trạng riêng biệt nhằm khắc phục nhược điểm của giống mà không làm thay đổi những tính trạng khác của giống [21]. Với phương pháp đột biến thực nghiệm, sử dụng các tác nhân lý hoá gây đột biến đã làm tăng sự sai khác di truyền trong quần thể. Việc xử lý đột biến thực nghiệm có thể tạo ra những đột biến mang tính nhảy vọt đáng kể. Do đó có thể tạo ra giống mới khác xa giống cũ [4]. Với các thành tựu mới về vật lý, hoá học, con người đã sử dụng các tia phóng xạ (tác nhân lý học) và các chất hoá học (tác nhân hoá học) như colchicine, EMS,... trong công tác chọn giống cây trồng và đã thu được các thành tựu đáng kể. Từ những kết quả thu được chứng tỏ đây là một trong những phương pháp có hiệu quả nhất để tạo ra giống mới. Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đánh giá: một trong những thành tựu xuất sắc của thế kỷ 20 là khám phá ra phương pháp tạo giống bằng cách gây đột biến thực nghiệm. Theo một số tài liệu thì tác nhân gây đột biến hoá học có hiệu quả hơn tác nhân vật lý. Nếu dưới ảnh hưởng của chiếu tia ở các cây nông nghiệp xuất hiện 10 - 15% biến đổi di truyền có khả năng sống thì tác nhân hoá học cho phép thu nhận từ 30 - 60%. Hơn nữa tác nhân gây đột biến hoá học thường làm xuất hiện những biến dị đặc biệt hơn [24]. 2.3.2. Xử lý đột biến thực nghiệm in vitro Khi sử dụng các phương pháp cải tạo giống truyền thống như kết hợp phương pháp lai, sinh sản sinh dưỡng với phương pháp gây đột biến, các nhà sản xuất đã tạo ra hàng loạt giống cây trồng có năng suất cao, chất lượng tốt, đáp ứng nhu cầu của xã hội. Tuy nhiên vẫn còn nhiều hạn chế như thời gian tác động không lâu (khoảng 10 năm), cây bị tác động mạnh về sinh lý, sinh hoá, nhu cầu về giống tốt rất lớn trong khi số lượng cung cấp lại hạn chế. Với sự phát triển của công nghệ tế bào thực vật hiện nay, việc kết hợp xử lý đột biến nhân tạo và nuôi cấy mô trở thành một trong những hướng tạo giống cây trồng quan trọng. Vật liệu xử lý có thể là các cơ quan đang trong giai đoạn phát triển mạnh: đỉnh chồi, callus...Tác nhân gây đột biến có thể là tác nhân vật lý hay hoá học. Xử lý đột biến chiếu xạ kết hợp nuôi cấy mô đã được nhiều nhà khoa học chứng minh là phương pháp nhanh chóng tạo ra các biến dị mong muốn, tạo nguồn vật liệu phong phú cho chọn giống và lai tạo giống. Đồng thời kỹ thuật này có thể giải quyết vấn đề khó khăn: thể khảm sau xử lý chiếu xạ. Broetjes và cộng sự 1976 đã đưa ra giả thuyết rằng tái sinh in vitro có thể loại bỏ thể khảm. Vì vậy kỹ thuật này càng có ý nghĩa hơn đối với cây nhân giống vô tính, nhờ tiềm năng nhân nhanh trong thời gian ngắn, rút ngắn chu trình chọn lọc đột biến. Xử lý đột biến in vitro sẽ giảm tác động không tốt của các tác nhân gây đột biến tới môi trường, con người và động vật. 2.3.3. Thành tựu đạt được trên thế giới và Việt Nam với xử lý đột biến bằng gamma và EMS 2.3.3.1. Những nghiên cứu chọn giống bằng đột biến phóng xạ và tia gamma * Trên thế giới Các nghiên cứu về phóng xạ được bắt đầu từ 1925 với việc phát hiện ra hiệu quả gây đột biến của tia Rơnghen đối với cơ thể sống. Đối với cây trồng, phương pháp này đã tạo nên hàng loạt các biến dị di truyền trong thời gian tương đối ngắn. Sử dụng bức xạ đã trở thành phương tiện của các nhà chọn giống. Trên thế giới nhiều quốc gia đã thành lập những trung tâm phóng xạ để phục vụ công tác tạo giống. Thống kê của FAO/IAEA tính đến tháng 7/2007 tổng cộng đã có 2680 giống cây trồng đã được tạo ra băng phương pháp đột biến thực nghiệm trên phạm vi 60 nước (2009 có khoảng 3100 giống) trong đó chiếu xạ chiếm 88% (64% sử dụng tia gamma), các tác nhân hoá chất chiếm 10%, tác nhân khác là 2% [59]. Thành công của phương pháp chọn giống phóng xạ đã đạt được ở rất nhiều đối tượng cây trồng: cây lương thực, cây công nghiệp, cây ăn quả, cây cảnh, cây rau...Những đặc tính được cải tiến sau khi gây đột biến như rút ngắn chiều cao, chín sớm; tăng cường chống chịu sâu bệnh, thích ứng với điều kiện bất lợi của môi trường; đa dạng màu sắc và kiểu hình ở hoa và cây cảnh. Cùng với những phương pháp chọn tạo giống khác, xử lý đột biến phóng xạ đã trở thành công cụ hữu hiệu trong tạo giống cây trồng. Tại hội nghị di truyền quốc tế (1993) Sidorova và Morgun đã công bố việc tạo thành công 2 giống lúa mì mùa đông thông qua biến dị tái sinh từ callus và chiếu xạ tia gamma lên hạt [20]. Trong các cây công nghiệp thì cây họ đậu là đối tượng quan trọng có nhiều nghiên cứu thành công với kỹ thuật chọn giống phóng xạ. Năm 1965, Tedoradze XG đã sử dụng tia gamma liều 17Krad xử lý hạt đậu tương, chọn lọc qua nhiều thế hệ và thu được giống đậu tương chín sớm, chống chịu bệnh và năng suất vượt giống gốc 6,7 tạ/ha [48]. Ở Ấn Độ tác giả Kerketta V., Haque M.F. bằng xử lý phóng xạ lên hạt giống đậu tương Birsa 1 có vỏ hạt màu đen đã thu được những dòng đột biến có vỏ hạt màu nâu, trắng hoặc vàng sẫm, cho năng suất cao hơn giống gốc [32]. Tạo được giống đậu đỗ chống bệnh cũng là một thành công của phương pháp chiếu xạ. Tác giả Laseejan S., xử lý tia gamma liều 15-30 Krad lên hạt 11 giống và chọn lọc qua các thế hệ thu được 16 dòng cho sản lượng hạt cao và chống bệnh gỉ sắt [52]. Sonnino A. khi xử lý phóng xạ lên chồi cây khoai tây đã thu nhận được các đột biến cây lùn, thay đổi màu sắc củ và vỏ củ [52]. Trên đối tượng hoa, cây cảnh cũng thu được nhiều thành công từ chọn giống chiếu xạ. Trong những năm từ 1987-1989, các nhà chọn giống Ấn Độ đã tạo được 37 dạng đột biến ở hoa cúc, 14 dạng đột biến hoa hồng khác nhau về kích thước, màu sắc hoa [52]. Năm 2000, các tác giả Thái Lan đã tiến hành chiếu xạ cụm chồi hoa cúc bằng tia gamma ở các liều chiếu xạ là 10, 30, 50, 70, 90, 110 Gy. Kết quả thu được cho thấy liều chiếu xạ 10 Gy cho tỷ lệ sống cao nhất. Sau chiếu xạ đã tạo ra các cây cúc cho hoa có màu sắc kích thước và số lượng cánh hoa khác nhau trên cùng một bông hoa [52]. Tác giả Xiao-Shan Shen, Jue- Zhen Wan, Wei- Yi Luo và CS (2004) người Trung Quốc đã nghiên cứu ảnh hưởng của liều lượng chiếu xạ đến chồi đồng tiền trong các môi trường nuôi cấy M1, M2, M3 (là các môi trường tái sinh callus, môi trường tái sinh chồi, môi trường tạo rễ) trong in vitro. Vật liệu sử dụng để chiếu xạ là callus đồng tiền, kết quả tìm ra liều chiếu xạ gây chết callus đồng tiền là từ 8-9Krad và liều chiếu xạ có hiệu quả gây đột biến là 5-6Krad [52]. * Ở Việt Nam Ở Việt Nam các nhà khoa học đã ứng dụng nhanh chóng các phương pháp chọn giống đột biến vào công tác chọn giống cây trồng và đạt nhiều thành quả to lớn, góp phần nâng cao năng suất chất lượng cây lương thực, thực phẩm. Trong công tác chọn tạo giống lúa nước ta có nhiều kết quả đáng tự hào. Cho đến nay các nhà khoa học Việt Nam đã tạo được hơn 70 các giống đột biến trên các đối tượng lúa, ngô, đậu tương, cà chua, dâu tằm, hoa cúc, hoa hồng…trở thành nước thứ 4 về chọn tạo giống đột biến ở châu Á sau Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ. Trong đó nhiều ở giống lúa, ngô, đậu tương…[51]. Từ 1989 đến năm 2000, Viện Di truyền Nông nghiệp đã công bố 6 giống lúa quốc gia, trong đó giống DT10 được tạo ra nhờ xử lý tia gamma liều 20K lên hạt khô của giống C4-63. Cũng từ xử lý tia gamma liều 20Krad lên hạt khô của con lai F1 giữa giống TB1 và IR22 [18]. Năm 1992, Phạm Văn Ro bằng phương pháp phóng xạ đối với một số giống lúa như Tài nguyên đục, Tép hành đã chọn tạo được các giống có thời gian sinh trưởng ngắn hơn rất nhiều so với giống gốc. Năm 1994, Nguyễn Minh Công và Đào Xuân Tân tạo được 2 dòng đột biến từ nếp Quýt Bắc Ninh có hàm lượng protein cao hơn hẳn giống gốc bằng xử lý tia gamma lên hạt nảy mầm [3]. Nghiên cứu mới đây của Hoàng Quang Minh, Nguyễn Như Toản “Hiệu ứng chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60) lên hạt lúa và những biến đổi di truyền trong M1 và M2” đã rút ra kết luận: xử lý chiếu xạ tia gamma lên hạt lúa ướt (ngâm nước sau 20h) với 3 liều lượng 15Krad, 20Krad và 25Krad đã tạo ra hiệu ứng đột biến cao. Từ đó tạo nguồn vật liệu khởi đầu rất đa dạng và phong phú cho công tác chọn tạo giống lúa [17]. Chiếu xạ tia gamma liều 18Krad lên hạt giống đậu tương AK-04 có hạt màu xanh, tác giả Mai Quang Vinh, Trần Văn Lài và CS đã tạo chọn được dòng DT95 có khả năng sinh trưởng khoẻ và cho năng suất cao, có trường hợp tới 200% so với giống đối chứng [25]. Nước ta hiện nay có 44 giống cây trồng tạo ra nhờ các tác nhân gây đột biến vật lý và hoá học. Phần lớn các giống cây này tập trung trên đối tượng cây lương thực, cây công nghiệp...trên cây hoa vẫn còn hạn chế. Năm 2003, Đỗ Quang Minh, Nguyễn Xuân Linh đã bước đầu tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn tạo giống cúc bằng việc gây đột biến thực nghiệm từ việc chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60) trên chồi in vitro [16]. Năm 2005, Đào Thanh Bằng và cộng sự thuộc Viện DTNN đã chiếu xạ vào mô sẹo cây hoa cúc bằng tia gamma ở các liều lượng 1, 3, 5, 7 và 15Krad nhằm tăng phổ đột biến màu sắc hoa từ màu trắng ban đầu. Kết quả thu được cho thấy liều gây chết 50% về khả năng tái sinh chồi là 5Krad và thu được 3 thể đột biến về màu sắc: hoa màu hồng, hoa vàng và hoa có chóp cánh màu xanh [2]. Năm 2007, Viện Sinh học Nông nghiệp đã nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ lên callus đồng tiền, kết quả tìm ra liều gây chết là 12Krad và liều chiếu xạ có hiệu quả cho tỷ lệ sống và tỷ lệ đột biến cao là 6Krad. 2.3.3.2. Các nghiên cứu về tạo giống cây trồng bằng xử lý EMS Các tác giả Tulmann Neto và cộng sự (2004) [47], đã nghiên cứu ảnh hưởng gây đột biến của EMS lên giống cúc Dendranthema grandiflora Tzvelev. Các tác giả tiến hành thí nghiệm trên cuống nhỏ non của giống cúc cv. Ingrid (màu hồng thẫm) được xử lý với dung dịch EMS nồng độ 0,77 % trong 1h và 45 phút, sau đó ngâm trong nước 15 phút và làm sạch bề mặt. Tiếp theo đó, mẫu được cấy trên môi trường MS + 1 g/l hydrolyzed casein, 1 mg/l 6-benzylaminopurine (BAP) và 2 mg/l indole-3-acetic acid (IAA). Ước lượng có khoảng 910 mẫu thu được từ xử lý EMS cuống hoa cho kết quả ra hoa. Thí nghiệm thu được khoảng 40 dạng đột biến (chiếm 5,2%) cho màu sắc cánh hoa khác nhau (màu hồng cam, màu hồng nhạt, màu đồng, màu trắng, màu vàng và màu cam). Hầu hết chúng (89,6% tổng số) là đồng dạng về kiểu hình. Chen Wei và cộng sự (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS lên các phôi tiểu bào tử in vitro họ cải bắp (Brassica napus) cho thấy: Khi xử lý các tiểu bào tử của B.napusin vi tro ở các nồng độ 0; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; và 3,0 mM/l và các khoảng thời gian 12, 24 và 36 giờ), kết quả chỉ ra rằng số lượng hầu hết các sản phẩm phôi tiểu bào tử đều giảm xuống, tăng dần ở các nồng độ xử lý và các khoảng thời gian xử lý. Sản phẩm phôi giảm còn một nửa ở nồng độ 2,5 mM/l và khoảng thời gian 24 giờ. Ở mức này, các tiểu bào tử bị đột biến có giá trị rất quan trọng trong xử lý đột biến EMS in vitro B. napus [47]. Tác giả Luan và cộng sự (2007) [49], đã sử dụng EMS nhằm gây đột biến tăng tính chịu mặn của các giống Khoai lang ( Ipomoea batatas L.). Mẫu mô lá được sử dụng đem xử lý EMS ở nồng độ 0,5% trong thời gian 0,0; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0 giờ; sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 4 lần. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS + 200 mM NaCl nhằm chọn lọc các dòng tế bào đột biến và các dòng này sẽ được cấy chuyển 5 lần (20 ngày 1 lần). Sau đó các dòng chọn được được cấy chuyển sang môi trường tạo phôi vô tính MS + 4 mg/l ABA + 10 mg/l GA. Sau 15 ngày cấy chuyển sang môi trường MS + 0,05 mg/l ABA + 0,2 mg/l ZT. Các giống như ML1, ML2 và ML3 được phục tráng từ các dạng phôi vô tính thích hợp với xử lý EMS nồng độ 0,5 % trong 2 và 2,5 giờ. Các giống chọn tạo được có đặc tính chịu mặn hơn hẳn các giống gốc. Năm 1998, các tác giả thuộc Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long đã gây đột biến thành công giống lúa thơm Jasmine 85 bằng xử lý hóa chất EMS trong nuôi cấy mô. Thí nghiệm được thực hiện từ vụ hè thu năm 1998 đến năm 2001. Đặc điểm: Lúa Jasmine 85 có nguồn gốc từ Hoa Kỳ là giống đặc sản xuất khẩu của Hoa Kỳ được thế giới ưa chuộng. Khi trồng ở Việt Nam, lúa bị nhiễm sâu bệnh nên chi phí cao, không cạnh tranh lại với các nước khác, thị trường nội địa cũng khó tiêu thụ. Sau khi xử lý, thế hệ M1, các cá thể được trồng ở ruộng vào thời điểm có dịch rầy, phần lớn đều bị cháy rầy. Từ 59 cá thể này, kỹ sư Phạm Thị Hường tiếp tục chọn lọc đến thế hệ M5, tuyển chọn một số dòng đã thuần đưa vào so sánh năng suất, trong đó có 4 dòng OM 3566 - 14, OM 3566 - 15, OM 3566 - 16, và OM 3566 - 70 có triển vọng [50]. Theo thời báo Nông nghiệp Việt Nam (2001), tại Malaysia bằng cách lấy đỉnh sinh trưởng nuôi cấy tạo mô sẹo rồi dùng các tác nhân gây đột biến có thể là hóa chất như EMS 0,2% (Ethylmethane sulphonate), DMSO 2% (Dimethylsulfoxide) hoặc tia gama được điều chế từ Co60 đã chọn tạo thành công giống chuối FATON-1. Giống chuối FATON-1 có đặc điểm: từ khi trồng tới lúc thu hoạch khoảng 37 tuần (gần 9 tháng) sớm hơn giống gốc của nó là giống chuối Cavedish gần 6 tháng. Điều này đặc biệt có ý nghĩa do chuối (Musa sp) là cây sinh sản vô tính, nên việc cải tiến giống chuối là rất khó khăn, vì không có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái trong phôi. Do đó việc cải tiến giống chuối chủ yếu dựa vào đột biến kết hợp với nuôi cấy mô. 2.3.3.3. Xử lý đột biến bằng kết hợp EMS và tia gamma Để tăng tần suất xuất hiện các biến dị, ngoài việc sử dụng các tác nhân gây đột khác nhau, nhiều tác giả đã sử dụng kết hợp nhiều tác nhân đột biến với nhau để tăng tần suất tạo biến dị. trong đó việc xử lý kết hợp giữa EMS và tia gamma được áp dụng rộng rãi và cho hiệu quả cao. Mohamed Khan (2006) đã xử lý gây đột biến trên cây thuốc phiện (papaver somniferrum), với 2 tác nhân gây đột biến là EMS và tia gamma. Tác giả đã tiến hành xử lý đột biến với từng tác nhân riêng rẽ và kết hợp hai tác nhân này lại với nhau và so sánh tỷ lệ biến dị thu được giữa các phương pháp xử lý. Các thí nghiệm được bố trí như sau: xử lý riêng tia gamma ở liều suất tốt nhất 5 Krad, xử lý riêng EMS ở các nồng độ từ 0,2% đến 1% và xử lý kép tia gamma ở 5 Krad kết hợp với EMS ở các nồng độ từ 0,2% đến 1%. Kết quả cho thấy tỷ lệ biến dị thấp nhất khi xử lý tia gamma ở 5 Krad tiếp theo là EMS ở nồng độ 0,4% và cao nhất là khi xử lý kết hợp giữa tia gamma và EMS ở công thức tia gamma 5Krad + 0,4% EMS. Điều này chứng tỏ việc xử lý kết hợp tia gamma và EMS là tăng tần suất xuất hiện biến dị một cách rõ ràng [55]. Nghiên cứu của Merill và cộng sự tiến hành gây đột biến trên hạt giống của cây đậu tương cũng cho kết quả tương tự. Các tác giả đã tiến hành xử lý riêng rẽ tia gamma và EMS với liều suất và nồng độ khác nhau, và xử lý kết hợp EMS và tia gamma. Kết quả cho thấy tỷ lệ nẩy mầm giảm khi tăng liều suất tia gamma cũng như tăng nồng độ EMS và giảm mạnh nhất là khi kết hợp xử lý tia gamma và EMS. Tuy nhiên tỷ lệ biến dị xuất hiên nhiều khi xử lý kết hợp giữa tia gamma và EMS cao nhất ở công thức tia gamma từ 30-45Krad + 0,2% EMS [55]. Để đánh giá hiệu quả của việc xử lý kết hợp tia gamma và EMS tác giả Aijaz Wani đã tiến hành các nghiên cứu trên cây đậu xanh. Các thí nghiệm bố trí lần lượt: tia gamma (150Gy, 200Gy, 300Gy và 400Gy), EMS (0,1; 0,2; 0,3% và 0,4%) và xử lý kết hợp (0,2% EMS + 200Gy; 0,2% EMS + 300Gy; 0,3% + 200Gy; 0,3% + 300Gy). Kết quả thu được các cá thể đột biến về cấu tạo diệp lục ở thế hệ M2 và tỷ lệ đột biến tăng khi tăng liều xử lý. Phương pháp gây đột biến hiệu quả nhất là khi sử dụng việc kết hợp EMS và tia gamma để xử lý [26]. 2.3.4. Nghiên cứu tạo giống cẩm chướng Hoa cẩm chướng (Dianthus spp) là loài hoa đẹp, đa dạng về màu sắc, bền, thuận lợi cho bảo quản và vận chuyển đi tiêu thụ, là loại hoa cắt có giá trị trên thị trường hoa tươi thế giới. Hoa cẩm chướng, hoa cúc và hoa hồng chiếm tới 50% thị phần của thị trường hoa cắt ( 2004).Vì vậy, việc chọn tạo giống mới của hoa cẩm chướng luôn được đặc biệt quan tâm nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường và mang lại lợi nhuận cao cho người sản xuất. Cùng với những phương pháp chọn tạo giống khác, phương pháp xử lý đột biến đã góp phần tạo nên sự phong phú và đa dạng về chủng loại của hoa cẩm chướng. Theo dữ liệu của Cơ quan Năng lượng nguyên tử quốc tế (IAEA), đến nay đã có tới 26 giống hoa cẩm chướng mới được tạo ra nhờ phương pháp xử lý đột biến phóng xạ và hóa chất ( Có thể liệt kê một số công trình nghiên cứu tạo giống cây cẩm chướng bằng phương pháp nêu trên như sau: Năm 1962, các tác giả người Mỹ đã sử dụng tia gamma để tạo đột biến trên giống UConn White Sim No.1 và đã thu được các dòng cẩm chướng đột biến về cấu trúc hoa. Năm 1972, các tác giả người Pháp đã sử dụng tia gamma để tạo đột biến trên giống Sim Feu Follet và đã thu được các dòng cẩm chướng đột biến về màu sắc hoa. Cũng trong năm này, các tác giả người Đức đã sử dụng EMS để tạo đột biến trên giống Enzett Barther Fruhl và đã thu được các dòng cẩm chướng đột biến về màu sắc hoa. Năm 1982, các tác giả người Pháp đã sử dụng tia gamma để tạo đột biến trên giống Maiella-lonchabi, Galatee-lonvego và đã thu được các dòng cẩm chướng của các giống Maiella-lonchabi, Galatee-lonvego đột biến có khả năng kháng lại nấm Fusarium. Năm 1983, các tác giả người Thái Lan đã sử dụng tia gamma để tạo được giống hoa cẩm chướng Chaichoompon có màu sắc khác lạ. Cũng trong năm này, các tác giả người Nhật đã sử dụng tia gamma để tạo được giống hoa cẩm chướng Scarlet Bell đột biến về màu sắc. Năm 1985, các tác giả người Đức đã thu được các giống cẩm chướng lùn khi xử lý tia gamma trên giống cẩm chướng Bonitas. Cùng năm này các tác giả Hà Lan đã thu được 6 giống hoa cẩm chướng có màu sắc mới nhờ xử lý tia X. Buiati và cộng sự (1985) đã sử dụng tia X (2500 và 5000 rad) chiếu vào đỉnh sinh trưởng và chồi ra rễ gây ra biến dị màu sắc hoa cẩm chướng Địa Trung Hải (giống Corrida). A.C.Cassells, C.Walsh và C.Periappuram (1993) đã nghiên cứu tạo đột biến trên cây cẩm chướng bằng cách sử dụng tia X. Vật liệu xử lý là các đoạn thân có mang các mắt ngủ của giống cẩm chướng Mysterre. Kết quả đã thu được các cây cẩm chướng có sự đa dạng về màu sắc hoa, kiểu dáng lá. Tỷ lệ tạo cây biến dạng là 2%. Phân tích về kiểu gen cho thấy có sự sai khác so với cây trước khi tạo đột biến. Năm 1996, các tác giả thuộc phòng thí nghiệm thực vật thuộc công ty Kirin Brewery, Nhật Bản đã thu được giống cẩm chướng Mrs. Elegant thay đổi về kích thước hoa khi sử dụng tia gamma làm tác nhân đột biến. Năm 2002, các tác giả thuộc phòng thí nghiệm Akita Prefectural Agriculture, Nhật Bản đã thu được giống cẩm chướng Boh-red và Kirikami Red thay đổi về mầu sắc hoa khi sử dụng colchicine làm tác nhân gây đột biến [53]. Năm 2004, nhờ xử lý tia X các tác giả Nhật bản thuộc Plant Laboratory Kirin Brewery Co., Lt đã thu nhận đươc 02 giống cẩm chướng có hình thái và màu sắc hoa mới. Năm 2005, các tác giả thuộc phòng thí nghiệm Akita Prefectural Agriculture, Nhật Bản đã thu được giống cẩm chướng Yua-red thay đổi về màu sắc hoa khi sử dụng colchicine làm tác nhân gây đột biến và các tác giả thuộc Plant Laboratory Kirin Brewery Co., Lt tạo được 2 giống cẩm chướng có màu sắc mới nhờ xử lý ion phóng xạ [52]. Bằng phương pháp chọn dòng tế bào biến dị soma, Manisha Thakur (1999) đã tạo thành công giống hoa cẩm chướng có khả năng kháng lại vi khuẩn Fusarium oxysporum f. sp. Dianthi. Tác giả đã sử dụng các callus rắn có màu xanh được tạo từ các đoạn thân được cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/1 2, 4-D và 0,5 mg/l NAA. Callus được xử lý trên các nồng độ của Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Các callus sau chọn lọc được cấy trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/1 Kinetin và 0,5 mg/l NAA. Ra rễ trên môi trường MS + 2 mg/1 IBA. Cây tái sinh từ các tế bào chọn lọc được có khả năng kháng lại ở mức cao các vi khuẩn dại trong điều kiện đồng ruộng [48]. Rupali Mehta (2004) cũng xây dựng thành công quy trình tái sinh tạo callus và tái sinh phôi phục vụ chọn giống cẩm chướng. Để tái sinh tạo callus, mẫu cấy cẩm chướng được đặt trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/l NAA và 2 mg/l kinetin, môi trường tái sinh tạo chồi từ callus là MS + 0,2 mg/l BAP và 0,5 mg/l NAA, môi trường tạo rễ là MS lỏng + 2 mg/l IBA và 0,2% than hoạt tính. Bằng cách sử dụng kỹ thuật chọn lọc in vitro, tác giả đã tạo được các giống cẩm chướng có khả năng sinh tổng hợp phenol ở mức độ cao, lượng đường và protein giảm [35]. Như vậy, trên thế giới các nghiên cứu tạo giống cẩm chướng mới bằng cách xử lý đột biến đã được tiến hành khá lâu và rất thành công. Ở Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu xử lý đột biến trong chọn tạo giống cây trồng đã được cố giáo sư Lương Đình Của khởi xướng từ những năm 1960. Nhưng đến những năm 1980, hướng nghiên cứu này mới được phát triển tương đối có hệ thống và định hướng do cố tiến sĩ Phan Phải và cộng sự tiến hành trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau như: lúa, ngô, đậu, lạc, táo, cà chua, dưa hấu, hoa v.v. .. Phương pháp gây đột biến để tạo giống hoa có nhiều thuận lợi so với các cây trồng khác. Tuy nhiên, ở Việt Nam mới chỉ có rất ít công trình nghiên cứu tiến hành theo hướng này. Đào Thanh Bằng và cs (2004) tại Viện Di truyền Nông nghiệp đang nghiên cứu tạo hoa cúc đột biến bằng xử lý chiếu xạ. Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà lạt đã có một số nghiên cứu liên quan đến việc chiếu xạ một số cây sinh sản sinh dưỡng nhằm cải tạo giống theo hướng đa dạng hoá màu sắc ở hoa cúc và hoa cẩm chướng... Gần đây, Viện Sinh học Nông nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp I (2005) đang triển khai nghiên cứu xử lý đột biến bằng chiếu tia g và colchicine, EMS trên đối tượng hoa đồng tiền, hoa cẩm chướng và các cây hoa khác. Với EMS cho cây cẩm chướng thì khi tăng nồng độ EMS đã làm giảm khả năng sống, tăng tỷ lệ các chồi biến dị. Sau quá trình xử lý thì thu được 5 dạng chồi in vitro và đã đánh giá được sự sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của các dạng chồi đó [10]. Với tia gamma xử lý trên cây cẩm chướng cũng thu được các dạng chồi in vitro và đánh giá được sức sinh trưởng của các dạng chồi. Khi xử lý tia gamma thì tỷ lệ sống giảm, tỷ lệ chồi biến dị tăng khi tăng liều suất tia gamma. Trong đề tài này, chúng tôi bước đầu thử nghiệm tác động kết hợp của EMS và tia gamma lên cây hoa cẩm chướng hy vọng thu được những kết quả khả quan hơn nữa cho công tác chọn tạo giống cẩm chướng. 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu Các giống hoa cẩm chướng Dianthus carryophylus - Giống màu trắng: White Tundra (giống số 4) - Giống màu đỏ: Nelson (giống số 6) 3.2. Vật liệu nuôi cấy Đoạn thân mang mắt ngủ của chồi in vitro. Đoạn thân được cắt thành từng đoạn nhỏ, dài khoảng 1 cm mang một mắt ngủ. 3.3. Nội dung nghiên cứu 3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến khả năng sống, sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma đến khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy CT1 (đối chứng 1): Không xử lý: 0Krad CT2 (đối chứng 2) : Chỉ chiếu xạ gamma: 3Krad CT3: Chiếu xạ gamma 3Krad + EMS 0,1%: 3Krad-0,1% CT4: Chiếu xạ gamma 3Krad + EMS 0,2% : 3Krad-0,2% CT5: Chiếu xạ gamma 3Krad + EMS 0,3% : 3Krad-0,3% CT6: Chiếu xạ gamma 3Krad + EMS 0,4% : 3Krad-0,4% CT7: Chiếu xạ gamma 3Krad + EMS 0,5% : 3Krad-0,5% 3.3.2. Nghiên cứu, đánh giá sự sinh trưởng và khả năng phục hồi của các chồi sau xử lý qua các lần cấy chuyển (3 lần) Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng sinh trưởng, phục hồi của các chồi sau xử lý qua các lần cấy chuyển. Các chồi phát sinh từ mẫu cấy được cấy chuyển 4 tuần 1 lần trên môi trường nhân nhanh chồi: MS +10% nước dừa + 1,0 ppm Kinetin CT Lần 1 Lần 2 Lần 3 Đối chứng 1: ) 0Krad CT II.1.1 CT II .1.2 CT II.1.3 Đối chứng 2 : 3Krad CT II.2.1 CT II.2.2 CT II.2.3 CT3: 3Krad - 0,1% CT II.3.1 CT II.3.2 CT II.3.3 CT4: 3Krad - 0,2% CT II.4.1 CT II.4.2 CT II.4.3 CT5: 3Krad -0,3% CT II.5.1 CT II.5.2 CT II.5.3 CT6: 3Krad -0,4% CT II.6.1 CT II.6.2 CT II.6.3 CT7: 3Krad - 0,5% CT II.7.1 CT II.7.2 CT II.7.3 3.3.3. Nghiên cứu khả năng tạo cây hoàn chỉnh của các chồi sau quá trình xử lý Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng ra rễ của các chồi qua 3 lần nhân ở môi trường ra rễ: MS + 0,5 ppm NAA + 0,5 g than hoạt tính/l. CT Lần 1 Lần 2 Lần 3 Đối chứng 1: 0Krad CT III.1.1 CT III .1.2 CT III.1.3 Đối chứng 2 : 3Krad CT III.2.1 CT III.2.2 CT III.2.3 CT3: 3Krad - 0,1% CT III.3.1 CT III.3.2 CT III.3.3 CT4: 3Krad - 0,2% CT III.4.1 CT III.4.2 CT III.4.3 CT5:3Krad - 0,3% CT III.5.1 CT III.5.2 CT III.5.3 CT6: 3Krad - 0,4% CT III.6.1 CT III.6.2 CT III.6.3 CT7: 3Krad - 0,5% CT III.7.1 CT III.7.2 CT III.7.3 3.3.4. Nghiên cứu sự sinh trưởng của các chồi sau xử lý trong điều kiện tự nhiên Thí nghiệm 4: Nghiên cứu sự sinh trưởng của các chồi sau xử lý trong điều kiện tự nhiên CT Nhà lưới Đối chứng 1: 0Krad CT IV.1 Đối chứng 2 : 3Krad CT IV.2 CT3: 3Krad - 0,1% CT IV.3 CT4: 3Krad - 0,2% CT IV.4 CT5: 3Krad - 0,3% CT IV.5 CT6: 3Krad - 0,4% CT IV.6 CT7: 3Krad - 0,5% CT IV.7 3.4. Phương pháp nghiên cứu. 3.4.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường cơ bản MS (Murahige & Skoog, 1962 với 6,2 g/l agar, 30 g/l saccarose và 100 mg/l innositol). Các thí nghiệm nhân nhanh, tạo cây hoàn chỉnh mẫu được nuôi cấy trong trụ miệng hẹp 250 ml. Tất cả các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh độ pH bằng 5,8 - 6,2 trước khi tiệt trùng và được khử trùng ở 1200C, 1,4 atm, trong thời gian 20 phút. Mẫu được nuôi cấy ở nhiệt độ 20 – 220C, ẩm độ 70%, cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày. Các thí nghiệm đưa cây ra ngoài vườn: Khi cây cao khoảng 3-4 cm, rễ dài 2-3 cm (3 tuần) thì rút nhẹ ra khỏi bình, rửa sạch môi trường bám dính ở rễ và được trồng trên các tấm xốp có đục lỗ vừa phải, sử dụng dung dịch khí canh Athura phun theo chu kỳ phù hợp từng giai đoạn. 3.4.2. Phương pháp xử lý đột biến in vitro Các chồi in vitro cây cẩm chướng được cắt bỏ lá, đoạn thân được cắt thành các mẫu có kích thước khoảng 1,0 cm chứa 01 mắt ngủ đem cắm vào đĩa Petri và đem đi chiếu xạ bằng tia gamma nguồn Co60 ở liều suất 3Krad. Sau chiếu xạ mẫu được cấy sang môi trường MS để chúng bật chồi. Tiếp theo cắt mẫu như trên và đem ngâm vào bình chứa dung dịch EMS được pha theo nồng độ đã định. Sau đó đưa các bình này vào máy lắc đặt trong bóng tối trong thời gian 1 giờ. Các mẫu sau khi xử lý đem rửa bằng nước cất vô trùng 5 lần sau đó đặt vào các đĩa petri có lót giấy thấm. Sau khi được làm sạch các mẫu được nuôi cấy trên môi trường nhân nhanh MS + 1 ppm Kinetin. Mỗi công thức tiến hành lặp lại 3 lần, số lượng mẫu là 100 mẫu/1lần nhắc lại. Nhằm đảm bảo hiệu lực của hoá chất chúng tôi pha hoá chất trước khi xử lý 30 phút. Để tiện cho việc tính toán và đảm bảo dung lượng mẫu thí nghiệm mỗi công thức xử lý 100 mẫu in vitro cho một lần nhắc lại, tiến hành 3 lần nhắc lại. Dung dịch EMS sau khi dùng xong được xử lý bằng NaOH 1N để làm mất hoạt tính trước khi loại thải. 3._.667 7 3 4.53333 SE(N= 3) 0.128761 5%LSD 14DF 0.390560 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 41SOLA 25/11/** 19:27 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SO LA 21 5.7433 1.0620 0.22302 3.9 0.0000 18.Số lá/chồi lần chuyển 2 giống số 4 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO LA FILE 42SOLA 25/11/** 19:48 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 SO LA LA LA LA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 14.2947 2.38245 36.64 0.000 2 * RESIDUAL 14 .910402 .650287E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 15.2051 .760255 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 42SOLA 25/11/** 19:48 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS SO LA 1 3 7.60333 2 3 6.67333 3 3 6.78667 4 3 6.68667 5 3 5.41000 6 3 5.37333 7 3 5.35333 SE(N= 3) 0.147228 5%LSD 14DF 0.446577 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 42SOLA 25/11/** 19:48 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SO LA 21 6.2695 0.87193 0.25501 4.1 0.0000 19.Số lá/chồi lần chuyển 3 giống số 4 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO LA FILE 43SOLA 25/11/** 20:40 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 SO LA LA LA LA LA LA LA LA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 9.11936 1.51989 42.01 0.000 2 * RESIDUAL 14 .506534 .361810E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 9.62590 .481295 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 43SOLA 25/11/** 20:40 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS SO LA 1 3 7.55000 2 3 7.30667 3 3 7.45333 4 3 7.38667 5 3 6.41333 6 3 6.11000 7 3 5.87333 SE(N= 3) 0.109819 5%LSD 14DF 0.333107 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 43SOLA 25/11/** 20:40 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SO LA 21 6.8705 0.69375 0.19021 2.8 0.0000 20.Số chồi/mẫu lần chuyển 1 giống số 6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO CHOI FILE 61SCHOI 26/11/** 12:13 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 SO CHOI CHOI CHOI CHOI CHOI CHOI CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 2.34636 .391060 42.22 0.000 2 * RESIDUAL 14 .129667 .926192E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 2.47603 .123801 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 61SCHOI 26/11/** 12:13 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS SO CHOI 1 3 1.60333 2 3 1.92000 3 3 1.95000 4 3 2.06667 5 3 1.94667 6 3 1.90333 7 3 1.02000 SE(N= 3) 0.555635E-01 5%LSD 14DF 0.168537 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 61SCHOI 26/11/** 12:13 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SO CHOI 21 1.7729 0.35185 0.96239E-01 5.4 0.0000 21.Số chồi/mẫu lần chuyển 2 giống số 6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO CHOI FILE 62SOCHOI 26/11/** 12:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 SO CHOI CHOI CHOI CHOI CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 1.02479 .170798 45.23 0.000 2 * RESIDUAL 14 .528667E-01 .377619E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 1.07766 .538829E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 62SOCHOI 26/11/** 12:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS SO CHOI 1 3 1.62000 2 3 1.83000 3 3 1.75000 4 3 1.92333 5 3 1.85667 6 3 1.84333 7 3 1.22667 SE(N= 3) 0.354786E-01 5%LSD 14DF 0.107614 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 62SOCHOI 26/11/** 12:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SO CHOI 21 1.7214 0.23213 0.61451E-01 3.6 0.0000 22.Số chồi/mẫu lần chuyển 3 giống số 6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO CHOI FILE 63SOCHOI 26/11/** 12:27 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 SO CHOI CHOI CHOI CHOI CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 .673857 .112310 22.90 0.000 2 * RESIDUAL 14 .686668E-01 .490477E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 .742524 .371262E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 63SOCHOI 26/11/** 12:27 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS SO CHOI 1 3 1.61000 2 3 1.72000 3 3 1.55000 4 3 1.63667 5 3 1.60333 6 3 1.52333 7 3 1.12333 SE(N= 3) 0.404342E-01 5%LSD 14DF 0.122646 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 63SOCHOI 26/11/** 12:27 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SO CHOI 21 1.5381 0.19268 0.70034E-01 4.6 0.0000 23.Chiều cao chồi lần chuyển 1 giống số 6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHIEUCAO FILE 61CAO 26/11/** 8: 0 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 CHIEUCAO LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 .327295 .545492E-01 4.82 0.007 2 * RESIDUAL 14 .158333 .113095E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 .485628 .242814E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 61CAO 26/11/** 8: 0 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS CHIEUCAO 1 3 1.91000 2 3 1.78667 3 3 1.96333 4 3 1.93667 5 3 1.76000 6 3 1.68667 7 3 1.60667 SE(N= 3) 0.613990E-01 5%LSD 14DF 0.186237 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 61CAO 26/11/** 8: 0 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CHIEUCAO 21 1.8071 0.15583 0.10635 5.9 0.0074 24.Chiều cao chồi lần chuyển 2 giống số 6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHIEUCAO FILE 62CAO 26/11/** 8:50 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 CHIEUCAO LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 .138362 .230603E-01 2.67 0.061 2 * RESIDUAL 14 .120867 .863333E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 .259229 .129614E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 62CAO 26/11/** 8:50 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS CHIEUCAO 1 3 1.85000 2 3 1.79333 3 3 1.95667 4 3 1.88667 5 3 1.83000 6 3 1.75333 7 3 1.69000 SE(N= 3) 0.536449E-01 5%LSD 14DF 0.162717 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 62CAO 26/11/** 8:50 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CHIEUCAO 21 1.8229 0.11385 0.92916E-01 5.0 0.0608 25.Chiều cao chồi lần chuyển 3 giống số 6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHIEUCAO FILE 63CAO 26/11/** 8:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 CHIEUCAO LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 .228333 .380555E-01 6.16 0.003 2 * RESIDUAL 14 .864667E-01 .617619E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 .314800 .157400E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 63CAO 26/11/** 8:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS CHIEUCAO 1 3 1.95667 2 3 1.83000 3 3 2.01000 4 3 2.00333 5 3 1.86333 6 3 1.76667 7 3 1.73000 SE(N= 3) 0.453732E-01 5%LSD 14DF 0.137627 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 63CAO 26/11/** 8:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CHIEUCAO 21 1.8800 0.12546 0.78589E-01 4.2 0.0026 26.Số lá/chồi lần chuyển 1 giống số 6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO LA FILE 61SOLA 26/11/** 8:17 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 SO LA LA LA LA LA LA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 1.23571 .205952 4.21 0.013 2 * RESIDUAL 14 .685467 .489619E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 1.92118 .960590E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 61SOLA 26/11/** 8:17 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS SO LA 1 3 5.39667 2 3 4.85333 3 3 5.58667 4 3 5.55333 5 3 5.38667 6 3 5.40667 7 3 5.08333 SE(N= 3) 0.127752 5%LSD 14DF 0.387501 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 61SOLA 26/11/** 8:17 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SO LA 21 5.3224 0.30993 0.22127 4.2 0.0127 27.Số lá/chồi lần chuyển 2 giống số 6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO LA FILE 62SOLA 26/11/** 8:38 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 SO LA LA LA LA LA LA LA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 1.00585 .167641 4.82 0.007 2 * RESIDUAL 14 .486467 .347476E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 1.49231 .746157E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 62SOLA 26/11/** 8:38 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS SO LA 1 3 5.34333 2 3 4.90333 3 3 5.60667 4 3 5.50333 5 3 5.41333 6 3 5.31667 7 3 5.15333 SE(N= 3) 0.107622 5%LSD 14DF 0.326442 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 62SOLA 26/11/** 8:38 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SO LA 21 5.3257 0.27316 0.18641 3.5 0.0074 28.Số lá/chồi lần chuyển 2 giống số 6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO LA FILE 63SOLA 26/11/** 9: 9 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 SO LA LA LA LA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 .312848 .521413E-01 1.90 0.151 2 * RESIDUAL 14 .384333 .274524E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 .697181 .348590E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 63SOLA 26/11/** 9: 9 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS SO LA 1 3 5.41333 2 3 5.25667 3 3 5.59000 4 3 5.49333 5 3 5.43667 6 3 5.30333 7 3 5.23000 SE(N= 3) 0.956598E-01 5%LSD 14DF 0.290157 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 63SOLA 26/11/** 9: 9 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SO LA 21 5.3890 0.18671 0.16569 3.1 0.1509 29.Chiều cao cây hoàn chỉnh giống số 4 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHIEUCAO FILE 43CAORE 12/11/** 19:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 CHIEUCAO LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 7.21063 1.20177 81.75 0.000 2 * RESIDUAL 14 .205800 .147000E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 7.41643 .370821 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 43CAORE 12/11/** 19:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS CHIEUCAO 1 3 4.87000 2 3 4.66000 3 3 4.33000 4 3 3.76000 5 3 3.62000 6 3 3.54000 7 3 3.17000 SE(N= 3) 0.700001E-01 5%LSD 14DF 0.252326 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 43CAORE 12/11/** 19:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CHIEUCAO 21 3.9929 0.60895 0.12124 3.0 0.0000 30.Số lá/cây hoàn chỉnh giống sô 4 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO LA FILE 43LARE 12/11/** 13:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 SO LA LA LA LA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 25.4660 4.24433 54.44 0.000 2 * RESIDUAL 14 1.09147 .779620E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 26.5575 1.32787 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 43LARE 12/11/** 13:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS SO LA 1 3 11.8167 2 3 11.6200 3 3 10.2300 4 3 10.1200 5 3 9.32000 6 3 9.30000 7 3 8.69000 SE(N= 3) 0.161206 5%LSD 14DF 0.488973 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 43LARE 12/11/** 13:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SO LA 21 10.157 1.1523 0.27922 2.7 0.0000 31.Số rễ cây hoàn chỉnh giống số 4 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO RE FILE 43SORE 12/11/** 20:38 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 SO RE RE RE RE RE RE RE RE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 28.2623 4.71039 90.66 0.000 2 * RESIDUAL 14 .727400 .519571E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 28.9897 1.44949 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 43SORE 12/11/** 20:38 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS SO RE 1 3 11.9500 2 3 11.2000 3 3 10.3500 4 3 10.0200 5 3 9.41000 6 3 8.91000 7 3 8.41000 SE(N= 3) 0.131602 5%LSD 14DF 0.399178 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 43SORE 12/11/** 20:38 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SO RE 21 10.036 1.2039 0.22794 2.3 0.0000 32.Độ dài rễ cây hoàn chỉnh giống số 4 BALANCED ANOVA FOR VARIATE DAI RE FILE 43DAIRE 12/11/** 19:10 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 DAI RE RE RE RE RE RE RE RE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 1.08803 .181338 36.86 0.000 2 * RESIDUAL 14 .688666E-01 .491904E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 1.15690 .578448E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 43DAIRE 12/11/** 19:10 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS DAI RE 1 3 2.16000 2 3 2.02000 3 3 2.08000 4 3 2.06467 5 3 1.81000 6 3 1.71000 7 3 1.48000 SE(N= 3) 0.404930E-01 5%LSD 14DF 0.122824 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 43DAIRE 12/11/** 19:10 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | DAI RE 21 1.9038 0.24051 0.70136E-01 3.7 0.0000 33.Chiều cao cây hoàn chỉnh giống số 6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHIEUCAO FILE 63CAORE 12/11/** 19:27 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 CHIEUCAO RE RE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 5.28283 .880471 40.70 0.000 2 * RESIDUAL 14 .302867 .216334E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 5.58570 .279285 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 63CAORE 12/11/** 19:27 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS CHIEUCAO 1 3 4.12000 2 3 4.10333 3 3 4.05000 4 3 4.02000 5 3 3.32000 6 3 3.16000 7 3 2.82000 SE(N= 3) 0.849183E-01 5%LSD 14DF 0.257576 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 63CAORE 12/11/** 19:27 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CHIEUCAO 21 3.6562 0.52847 0.14708 4.0 0.0000 34.Số lá/cây hoàn chỉnh giống số 6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO LA FILE 63LARE 12/11/** 19:41 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 SO LA LA LA RE RE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 22.3468 3.72447 76.00 0.000 2 * RESIDUAL 14 .686069 .490049E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 23.0329 1.15164 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 63LARE 12/11/** 19:41 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS SO LA 1 3 10.5000 2 3 10.1200 3 3 8.67000 4 3 8.34000 5 3 8.12000 6 3 8.04333 7 3 7.55000 SE(N= 3) 0.127808 5%LSD 14DF 0.387671 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 63LARE 12/11/** 19:41 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SO LA 21 8.7633 1.0731 0.22137 2.5 0.0000 35.Số rễ cây hoàn chỉnh giống số 6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO RE FILE 63SORE 12/11/** 20:52 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 SO RE RE RE RE RE RE RE RE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 21.5645 3.59409 79.63 0.000 2 * RESIDUAL 14 .631868 .451334E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 22.1964 1.10982 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 63SORE 12/11/** 20:52 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS SO RE 1 3 11.3100 2 3 10.9200 3 3 10.1200 4 3 9.92000 5 3 9.11000 6 3 8.72000 7 3 8.42333 SE(N= 3) 0.122656 5%LSD 14DF 0.372043 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 63SORE 12/11/** 20:52 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SO RE 21 9.7890 1.0535 0.21245 2.2 0.0000 36.Độ dài rễ cây hoàn chỉnh giống số 6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE DAI RE FILE 63DAIRE 12/11/** 21: 6 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 DAI RE RE RE RE RE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT 6 2.24991 .374986 64.65 0.000 2 * RESIDUAL 14 .811998E-01 .579999E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 2.33111 .116556 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 63DAIRE 12/11/** 21: 6 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------------- CT NOS DAI RE 1 3 2.55000 2 3 1.93000 3 3 2.01000 4 3 1.91000 5 3 1.72000 6 3 1.65000 7 3 1.43000 SE(N= 3) 0.439696E-01 5%LSD 14DF 0.133370 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 63DAIRE 12/11/** 21: 6 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | DAI RE 21 1.8857 0.34140 0.76158E-01 4.0 0.0000 ._.