Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A

1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Thuốc lá (Nicotiana tabacum L) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Sản phẩm thu hoạch là lá tươi, phải thông qua giai đoạn chế biến đặc trưng (sấy, hong, phơi…) mới có thể dùng lá làm nguyên liệu sản xuất thuốc lá. Ngoài ra cây thuốc lá cũng được sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, dùng làm chế phẩm trừ sâu, axit hữu cơ, hạt dùng để chiết xuất dầu thực vật. Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá theo các hướng khác nhau được quan tâm ở các quốc gia lớn như Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Zimbawe…Một trong những hướng chọn tạo giống được quan tâm hiện nay là ứng dụng công nghệ biến đổi di truyền để chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại chính như kháng các bệnh virus khảm lá thuốc lá (TMV,CMV), virus xoăn lá thuốc lá (TLCV) hoặc kháng sâu (sâu xanh, sâu xám...). Ngoài khuynh hướng tạo tính kháng sâu của cây bằng gen cry mã hóa cho sự tạo nội độc tố δ trong pha sinh bào tử của vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt), gần đây các nhà khoa học đã phát hiện các gen vip (vegetative insecticidal protein - các protein sinh dưỡng diệt côn trùng) mã hóa cho các protein trong pha dinh dưỡng của chu trình phát triển vi khuẩn Bt và Bacillus cereus (Bc), chiết tách, nhân bản, xác định trình tự và thử hoạt tính sinh học. Kết quả cho thấy các protein Vip có hoạt lực và phổ tác dụng diệt côn trùng cao hơn rất nhiều lần các protein do gen cry mã hóa. Gen vip3 tạo protein có hoạt tính kháng sâu xám cao gấp 260 lần so với protein cry IA và có phổ hoạt động rộng như diệt được sâu xanh hại ngô, sâu xanh hại thuốc lá [12]. Ở Việt Nam, cây thuốc lá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao [7]. Vấn đề sâu bệnh hại trong sản xuất là một trong những nguyên nhân gây giảm năng suất và chất lượng của nguyên liệu, do vậy ứng dụng công nghệ biến đổi di truyền để chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại là một trong những hướng đi để giải quyết vấn đề đó. Viện Công nghệ Sinh học đã bước đầu chuyển thành công gen kháng bệnh vào cây thuốc lá (kháng bệnh khảm lá thuốc lá TMV, khảm lá dưa chuột CMV)… [2] nhưng chưa có nghiên cứu nào được công bố về sử dụng gen vip3A trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng sâu. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A” 1.2 Mục đích và yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu của đề tài: Tạo ra cây thuốc lá chuyển gen mang gen kháng sâu (vip3A) 1.2.2 Nội dung nghiên cứu: - Thiết kế vector chuyển gen mang gen vip3A. - Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumerfaciens. - Theo dõi, kiểm tra và đánh giá các dòng thuốc lá chuyển gen. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây thuốc lá Thuốc lá (Nicotiana tabacum L) là loại cây công nghiệp ngắn ngày có tầm quan trọng bậc nhất về kinh tế trên thị trường thế giới không chỉ đối với trên 33 triệu nông dân của trên 120 quốc gia, mà còn cho cả toàn bộ nền công nghiệp - từ các nhà máy chế biến, cuốn điếu, sản xuất phụ gia, phụ liệu đến cả hệ thống phân phối tiêu thụ, thậm chí cả một phần ngành sản xuất các vật tư nông nghiệp phục vụ cho cây thuốc lá như phân bón, thuốc bảo vệ thực vật [16], [20]... Với tổng diện tích trồng trọt khoảng 4,0 - 5,5 triệu ha trải khắp từ 60o vĩ Bắc đến 40o vĩ Nam và tổng sản lượng nguyên liệu thu được khoảng 6,5 - 8,5 triệu tấn (trong đó khoảng 3,5 - 4,5 triệu tấn thuốc lá vàng; khoảng 0,6 - 1,0 triệu tấn thuốc lá burley; trên 0,5 triệu tấn thuốc lá oriental; còn lại là các loại khác để sản xuất khoảng 6.000 tỷ điếu hàng năm [22], [47]. Theo Reed S. M. [41] thì cây thuốc lá được phân loại thuộc giới thực vật, phụ giới có phôi, ngành có mạch dẫn, phụ ngành dương, lớp thực vật hạt kín, lớp phụ 2 lá mầm, phân lớp Cúc, bộ Cà, họ Cà. Họ này có tới trên 85 chi với tổng số trên 1.800 loài. Một số loài trong họ này được trồng rộng rãi như khoai tây, cà chua, ớt, các loại cà và trong đó có chi Nicotiana. Đặc trưng của các loài trong họ này là trong thân và quả thường chứa alcaloid như solanin, atropin, scopalamin, nicotine... Chi Nicotiana được chia làm 3 chi phụ, 14 nhóm với tổng số tới 66 loài trong đó 45 loài có nguồn gốc ở Bắc và Nam Mỹ, 20 loài ở Australia và 1 loài ở Châu Phi. Phần lớn những loài này là cây thân bụi hàng năm, một số là cây lâu năm và 2 loài là cây bụi thân gỗ. Trong số 66 loài thuốc lá, có 2 loài chưa tìm thấy ở dạng hoang dại nhưng lại được trồng phổ biến làm thuốc lá là Nicotiana tabacum (N. tabacum) và N. rustica. Loài N. tabacum có số lượng nhiễm sắc thể lưỡng lưỡng bội (Dihaploid = 4n), có biến động lớn về kích thước lá, dạng ngọn lá, góc đóng lá so với thân, kiểu tai cuống lá, mầu sắc lá. Hoa tự chùm lưỡng tính mọc trên đỉnh sinh trưởng, hoa dài khoảng 5 cm, có 5 cánh với mầu từ hồng đến đỏ (N. tabacum) hay màu vàng đến vàng hơi xanh (N. rustica). Hoa thường tự thụ phấn trước khi nở và tỷ lệ tự thụ phấn đến 95%. Mỗi cây có thể cho 200 - 400 quả và mỗi quả có khả năng cho khoảng 2000 - 4000 hạt. Trong hạt chứa 32 - 42% dầu (Chủ yếu là Linoleic acid và Oleic acid), 20 - 30% protein. Trong 1 gam hạt có từ 10.000 - 15.000 hạt và hạt có khả năng sống rất lâu [16], [20], [22]. 2.1.1 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá Trong lịch sử, cây thuốc lá được trồng đầu tiên ở châu Mỹ từ hơn 6000 năm trước công nguyên và được sử dụng trong các nghi lễ tôn giáo, làm thuốc chữa bệnh [16], [22]. Thuốc lá là loài cây trồng có nguồn gốc Nhiệt đới và Á nhiệt đới, hương vị đặc biệt của nó đã được biết đến ở vùng Trung Mỹ có lẽ cách đây trên hai nghìn năm và trở nên phổ biến từ thế kỷ 15 [16], [20]. Sử viết về cây thuốc lá bắt đầu vào ngày 12 tháng 10 năm 1492, khi Christopher Columbus đặt chân lên bãi biển San Salvado ở Tây Ấn Độ Dương. Các thổ dân ở đó đã mang tới hoa quả và cả những nắm lá khô cho mùi thơm quyến rũ khi chúng được châm hút để mời đoàn thám hiểm [16], [20]. Người Tây Ban Nha bắt đầu trồng thuốc lá ở Haiti vào năm 1531 với nguồn hạt giống từ Mexico và sau đó việc trồng thuốc lá lan rộng tới các hòn đảo lân cận khác. Trồng trọt thuốc lá bắt đầu ở Cu Ba vào năm 1580, sau đó phát triển sang Guiana, Brazil [20] và dần dần phát triển trên các châu lục khác. Một số tài liệu đáng tin cậy cho rằng thuốc lá được trồng từ thời vua Lê Thần Tông (1660) bằng nguồn hạt giống của các thương nhân Tây Ban Nha. Năm 1876, nghề trồng thuốc lá ở Việt Nam chính thức khởi sự tại Gia Định, tiếp theo là Tuyên Quang (1899) và thuốc lá điếu bắt đầu được sản xuất tại Hà Nội cùng thời gian này. Năm 1935, giống thuốc lá vàng sấy Blond cash đầu tiên được du nhập và trồng thử ở An Khê, đến năm 1940 trồng thử ở Tuyên Quang, Ninh Bình... [22]. 2.1.2 Các đặc điểm thực vật học cây thuốc lá 2.1.2.1. Rễ thuốc lá Rễ thuốc lá là một hệ thống bao gồm: rễ cái (rễ trụ), rễ nhánh (rễ bên) và rễ hấp thu. Ngoài ra, thuốc lá còn có rễ bất định mọc ở cổ rễ, phần trên sát mặt đất. Rễ trụ được hình thành từ phôi rễ. Rễ nhánh được phát sinh từ trục của rễ cái, thường có độ xiên 30 - 40o. Rễ hấp thu được phát triển trên các rễ nhánh, có nhiệm vụ cung cấp nước và dinh dưỡng cho cây. Rễ bất định mọc từ thân, những rễ bất định ở phần sát gốc dễ phát sinh thành rễ hút khi độ ẩm không khí cao. Rễ thuốc lá tập trung dày đặc ở lớp đất 0 - 30 cm, phát triển theo các hướng. Rễ thuốc lá là cơ quan sinh tổng hợp nicotin. Nicotin được vận chuyển từ rễ và tích tụ trên thân, lá thuốc lá. 2.1.2.2 Thân cây Các dạng thuốc lá trồng có dạng thân đứng, tiết diện thân tròn, chiều cao thân cây có thể đạt từ 1 - 3 m, chia làm nhiều đốt, mỗi đốt mang một lá. Đường kính thân đạt 2 - 4 cm, nách lá trên thân có chồi sinh trưởng gọi là chồi nách. Có 2 loại chồi nách: chồi nách chính và chồi nách phụ. 2.1.2.3 Lá thuốc lá Trên thân chính của cây thuốc lá có nhiều lá. Số lượng lá trên cây thay đổi tuỳ theo giống. Lá thuốc lá có các hình dạng chủ yếu là: Hình trứng, hình tim, hình elip, hình mũi mác. Độ dày, màu sắc lá có thể thay đổi. Lớp ngoài của biểu bì có tầng cutin trong suốt và có lớp phấn sáp khi lá bắt đầu chín kỹ thuật. Lớp tế bào mô dậu và tế bào mô khuyết trong cấu trúc lá quyết định độ dày mỏng, độ đàn hồi của lá thuốc. Ở trên mặt lá còn có nhiều tuyến lông đa bào, có hình dạng và kích thước khác nhau. Các tuyến này chứa nhựa, hợp chất thơm tự nhiên và tích luỹ nhiều khi lá chín kỹ thuật. Trên mặt lá có gân chính và nhiều gân phụ. 2.1.2.4 Hoa Hoa thuốc lá là hoa đơn, lưỡng tính, có năm cánh, nhị cái ở giữa, xung quanh có 5 nhị đực thường mọc cao hơn nhị cái, thuộc loại hoa tự hữu hạn, được hình thành do sự phân hoá của đỉnh sinh trưởng thân. Chính giữa chùm hoa có hoa trung tâm và có các nhánh hoa mọc từ trục chính của chùm hoa. Phương thức thụ phấn của thuốc lá là tự phối (97 - 98%), còn lại có thể do thụ phấn chéo do gió hoặc côn trùng,.. 2.1.2.5 Quả và hạt Quả thuốc lá được hình thành trên đài hoa. Mỗi cây có 100 - 150 quả trên mỗi chùm hoa, có những cây hoặc những giống có tới 400 - 500 quả trên chùm hoa. Mỗi quả có hai ngăn, khi chín chúng thường tách ra. Hạt thuốc lá rất nhỏ, khối lượng 1000 hạt của các giống thuốc lá vàng sấy lò là 0,07 - 0,10 gam, trong mỗi gam hạt có từ 10.000 đến 15.000 hạt [14]. 2.1.3 Tình hình sâu bệnh hại Cây thuốc lá bị các loại bệnh hại chính là bệnh khảm lá thuốc lá do virus (TMV,CMV), bệnh xoăn lá thuốc lá do virus (TLCV), bệnh héo rũ vi khuẩn , đen thân, héo đốm cà chua.... Các loại sâu chính gây hại trên thuốc lá là sâu xanh (Helicoverpa assulta), sâu khoang (Prodenia litura), sâu xám (Agrotis ypsilon)... Ở Việt Nam, tuy chưa có số liệu chính xác nhưng nhiều chuyên gia cho rằng thiệt hại do bệnh và sâu đối với thuốc lá khoảng 25 - 30%. Nếu sản lượng hàng năm là 30.000 tấn với giá bình quân 12.000 đ/kg thì sâu bệnh hại đã lấy đi mất khoảng 100 tỷ đồng/năm và mỗi phần trăm thu lại được từ phần thiệt hại này trị giá hàng tỷ đồng [9]. 2.1.5 Giá trị của cây thuốc lá Thuốc lá là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Sản phẩm chính là lá thuốc lá, sử dụng làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thuốc lá trên toàn thế giới. Ngoài ra thuốc lá còn được sử dụng vào một số mục đích khác như: - Trồng nhóm Nicotiana rustica để chiết xuất từ lá hàm lượng nicotin từ 4 - 5 % để sản xuất thuốc trừ sâu Sulfat nicotin. - Từ thân và lá thuốc lá chiết xuất được sclareol và 13 epi - sclareol chống bệnh gỉ sắt cây họ đậu. - Từ lá thuốc lá chiết xuất axit nicotineic dùng cho công nghiệp dược phẩm. - Hạt thuốc lá chiết xuất 34 - 40% dầu phục vụ trong công nghiệp, sử dụng trong thực phẩm. - Thân chế tạo các loại giấy có chất lượng cao. - Hoa chiết xuất tinh dầu sản xuất nước hoa thuốc lá. - Một số phát hiện mới hiện nay, các nhà nghiên cứu đã kết luận thuốc lá giàu protein, hydratcacbon, chất béo và vitamin. - Protit thuốc lá chứa nhiều axit amin quan trọng, tính chất bổ dưỡng vượt cả Phomat Protein trong sữa [5]. 2.1.6 Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu 2.1.6.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thuốc lá nguyên liệu của thế giới Thuốc lá nguyên liệu tham gia thương mại trên thế giới chủ yếu được sản xuất ở các vùng từ 45o vĩ Bắc đến 30o vĩ Nam. Diện tích trồng thuốc lá trên thế giới trong những năm gần đây luôn duy trì ở mức khoảng 3,5 triệu ha [55]. Trong tổng sản lượng thuốc lá nguyên liệu trên 5 triệu tấn được sản xuất hàng năm, thuốc lá vàng sấy lò chiếm trên 60%, thuốc lá burley khoảng 15%, thuốc lá oriental gần 10% và một số chủng loại khác [48]. Bảng 2.1. Sản lượng các dạng thuốc lá nguyên liệu chủ yếu của thế giới giai đoạn 2004 - 2008 ĐVT: ngàn tấn Năm Vàng sấy Burley Oriental Nâu Tổng 2004 3757,1 886,4 350,9 195,9 5190,3 2005 4035,6 771,8 353,1 181,9 5342,4 2006 3948,5 725,3 268,5 182,1 5124,4 2007 3872,6 620,6 237,0 185,5 4915,7 2008 4185,9 743,5 259,0 184,3 5372,7 Nguồn: USDA (Tobacco World Markets and Trade june – 2008) [48] Số liệu ở bảng 2.1 cho thấy sản lượng các dạng thuốc lá chính của thế giới những năm qua tương đối ổn định, mặc dù ngành công nghiệp thuốc lá ở các nước chịu nhiều áp lực. 2.1.6.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thuốc lá lá ở Việt Nam Hiện nay, thuốc lá được trồng ở nhiều địa phương trong cả nước (27/64 tỉnh, thành phố) [7] với 3 chủng loại thuốc lá vàng sấy, nâu và burley trong đó thuốc lá vàng sấy là loại nguyên liệu được trồng nhiều nhất ở nước ta hiện nay chiếm tỷ trọng đến 90% sản lượng thuốc lá nguyên liệu sản xuất nội địa. Các địa phương trồng thuốc lá vàng sấy chủ yếu hiện nay là Cao Bằng, Lạng Sơn, BắcKạn, Gia Lai, Đắklăk, Tây Ninh, Ninh Thuận, Phú Yên. Tổng diện tích trồng thuốc lá vàng sấy trên cả nước hiện dao động ở khoảng 14 - 16 ngàn ha với sản lượng hàng năm ước đạt từ 22 - 26 ngàn tấn. Tại khu vực phía Bắc, năng suất đạt 1,5 - 1,8 tấn/ha. Năng suất bình quân tại các tỉnh phía Nam hiện nay đạt khoảng 1,8 - 2 tấn/ha [9], [15]. Bảng 2.2. Tình hình sản xuất TLNL vàng sấy của Việt Nam 2006 – 2008 TT Năm 2006 2007 2008 Địa điểm DT SL NS DT SL NS DT SL NS I Phía Bắc 5.875 8.912 1,52 5.615 8.737 1,56 7.066 11.144 1,58 II Phía Nam 9.683 17.184 1,77 7.564 13.725 1,81 6.165 11.229 1,82 Tổng /TB 15.558 26.096 1,68 13.18 22.462 1,70 13.23 22.373 1,69 Nguồn tài liệu: Tổng công ty thuốc lá Việt Nam [15] Ghi chú: DT: diện tích (ha); SL: sản lượng (tấn); NS: năng suất (tấn/ha) Số liệu bảng trên cho thấy sản lượng thuốc lá nguyên liệu vàng sấy trong nước trong những năm qua tương đối ổn định. Theo đánh giá của các chuyên gia, nguyên liệu thuốc lá vàng sấy của nước ta hiện nay có chất lượng tương đối tốt, có thể thay thế được nguyên liệu Trung Quốc. Vì vậy việc phát triển sản xuất thuốc lá nguyên liệu vàng sấy trong nước phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng nội địa là một việc làm cần thiết trong giai đoạn hiện nay. Nó vừa giúp cho ngành sản xuất thuốc lá trong nước chủ động được nguồn nguyên liệu đầu vào vừa tạo công ăn việc làm cho một bộ phận đông đảo bà con nông dân, tăng nguồn thu ngân sách và tiết kiệm được nguồn ngoại tệ cho nhà nước. 2.2. Chuyển gen ở thực vật - cơ sở khoa học của dề tài 2.2.1 Khái niệm chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật,...) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen [3], [12]. Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, nó khẳng định tính khách quan tự nhiên của vật chất di truyền: khả năng mã hoá cho các tính trạng nhất định, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền. Thông qua chuyển gen, các nhà sinh lý, hoá sinh và di truyền có thể nghiên cứu các quá trình điều khiển, thể hiện và ảnh hưởng của các yếu tố di truyền và ngoại cảnh lên hoạt động của gen. 2.2.2 Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển gen trực tiếp. 2.2.2.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp - Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện - Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm - Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn - Chuyển gen nhờ súng bắn gen - Chuyển gen nhờ silicon carbide 2.2.2.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp - Chuyển gen nhờ virus - Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium được nghiên cứu từ những năm 1960 - 1970. Việc phát kiến ra Agobacterium tumefaciens (A.tumefaciens) có khả năng chuyển gen vào thực vật vào đầu những năm 1980 đã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng nhất của Công nghệ sinh học (CNSH) thực vật với những ưu điểm nổi trội: số bản sao của gen biến nạp được chuyển vào tế bào thực vật thấp (khoảng 1 - 2 gen, trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn), do vậy, giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen được chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao; tránh được sự hình thành của các cây chuyển gen khảm; kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện; không đòi hỏi thiết bị đắt tiền [13]. Phương pháp này đã khắc phục được những hạn chế chủ yếu của các phương pháp chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận được cây trồng có nhiều bản sao của một gen dẫn tới sự “nhiễu gen” và không bền vững của gen trong thực vật, tần số chuyển gen thấp, kết quả có thể thu được những cây mang thể khảm nghĩa là chỉ mang gen ở một số vị trí trên cây... Đặc biệt là khi nhược điểm của A. tumerfaciens chỉ chuyển gen trên cây hai lá mầm được khắc phục, việc chuyển gen vào cây một lá mầm trở thành hiện thực và được ứng dụng thành công thì phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ngày càng gây được sự quan tâm và dần trở thành một phương pháp chuyển gen được ưu tiên lựa chọn của các nhà khoa học và các nhà chọn tạo giống trên thế giới. * Đặc điểm chung của vi khuẩn A. tumefaciens Agrobacterium là các vi khuẩn đất nhuộm gram (-) gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương. Trong chi Agrobacterium thì A. tumerfaciens được sử dụng nhiều nhất cho việc chuyển gen. Phân loại khoa học: Giới Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Alpha Proteobacteria Bộ: Rhizobiales Họ: Rhizobiaceae Chi: Agrobacterium Loài: A. tumefaciens Danh pháp khoa học: Agrobacterium tumefaciens. (Smith & Townsend, 1907) [52]. A. tumerfaciens có khả năng chèn gen của mình vào thực vật và sau đó sử dụng bộ máy thực vật để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng. A. tumerfaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây - crown gall disease), khi đó các tế bào khối u ở thực vật có gắn một đoạn DNA từ vi khuẩn. Khi phân tích khối u cho thấy trong khối u có sự hình thành một số vật chất mới như: nopaline, octopine goi chung là opine. Các chất này không hề có trước đó và không hề có ở cây trồng thông thường. Như vậy vi khuẩn đã truyền vào cây qua vết thương một tác nhân gây bệnh cho cây và tác nhân này có bản chất là vật chất di truyền. Hình 2.1. Cấu trúc Ti- Plasmit (nguồn : Qua nghiên cứu người ta kết luận rằng tác nhân gây u này chính là Ti-plasmit có trong vi khuẩn A. tumerfaciens. Ti-plasmit này có đặc điểm chung như sau: Ti-plasmit là một plasmit được cấu tạo bao gồm một phân tử DNA kép, vòng tròn lớn có kích thước 200 kb, có khả năng tái bản độc lập với sự tái bản của DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Trên Ti-plasmit có đoạn T-DNA được giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border) có trình tự nucleotid tương tự nhau. T-DNA là đoạn nucleotit có kích thước 25 kb và mang hai loại gen: loại gen gây ung thư (oncogenic gene), loại này mã hoá cho một enzyme liên quan tới tổng hợp các auxin, cytokinin và hình thành khối u; loại thứ hai liên quan tới tổng hợp opine. Đoạn này được gọi là T-DNA (Tumor DNA) vì đây là đoạn sẽ được chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ NST và gây ra bệnh u. Trên Ti-plasmit còn có vùng vir chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp và tiêu hoá opine [13]. Khi cây nhiễm bệnh, do T-DNA nạp vào trong bộ gen của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại thức ăn, nhờ gen chuyển hoá opine trên Ti-plasmit. Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn: Thực vật khi bị thương sẽ tiết ra các chất độc vết thương có bản chất phenol: acetosyringon và hydroxyacetosyringon. Các chất này sẽ thu hút vi khuẩn tập trung vào vùng bị thương đồng thời chúng hoạt hoá các gen ở vùng vir là E, D, C, G, B, A, F và tạo ra các protein tương ứng. Các protein này có hai chức năng chính: cắt đứt bờ phải và bờ trái để giải phóng đoạn T-DNA, bao bọc và vận chuyển đoạn T-DNA vào tế bào thực vật và tiếp cận với genom cây chủ. Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A. tumerfaciens sang tế bào cây chủ được thực hiện bởi hoạt động của các gen vir A, B, C, D, E, G, F. Các gen này có vai trò quan trọng trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông qua tín hiệu hoá học acetosyringon (AS). Tín hiệu hoá học được nhận biết đầu tiên bởi vir A. Gen vir A sẽ tổng hợp nên một loại protein nằm trong màng tế bào để đáp ứng sự trao đổi chất của vết thương trên cây. Protein Vir A tự photphoryl hoá đồng thời làm cho protein Vir G được photphoryl hoá (Jin và CS 2001) và kích hoạt sao mã của các gen vir B, C, E, F, G, H (Ziemienowcz 2001). Hình 2.2. Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium (1). Agrobacterium nhận dạng và tấn công tế bào chủ;(2). Tổ hợp tín hiệu VirA/VirG của Agrobacterium cảm nhận những tín hiệu thực vật đặc trưng;(3). Sự hoạt hoá của vùng gen vir; (4). T-DNA được tách ra khỏi Ti-plasmit nhờ phức hợp protein VirD1/D2; (5). Sự tạo thành phức hợp VirD2-DNA (phức hợp-T chưa thành thục), cùng với một vài protein Vir khác, đi vào nguyên sinh chất tế bào chủ; (6). Sự kết hợp của VirE2 với sợi-T tạo thành phức hợp-T thành thục đi xuyên qua nguyên sinh chất tế bào chủ; (7). Phức hợp-T thành thục chủ động đi vào nhân tế bào chủ; (8). T-DNA bị hấp dẫn tới vị trí hợp nhất; (9). T-DNA tách khỏi các protein bảo vệ; (10). T-DNA hợp nhất vào bộ gen chủ. Tiếp đó các protein được mã hoá bởi vir D, vir E thực hiện chức năng giải phóng sợi T-DNA. Protein D2 cắt T-DNA tại vị trí 5’ của bờ phải và 3’ của bờ trái và giải phóng sợi T-DNA. Protein E2 bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của enzyme nuclease trong cây (Deng và cs 1998). Đồng thời thực hiện chức năng này có các protein Vir C1, Vir C 2 có tác dụng tăng cường việc giải phóng T-DNA. Sự chuyển phức hợp T-DNA do operon vir B đảm nhiệm. Vir B có chức năng tạo kênh xuyên qua màng tế bào giúp chuyển sợi đơn T-DNA vào nhân tế bào. Đồng thời protein Vir B4, Vir B11 có hoạt tính ATPase cung cấp năng lượng cho vận chuyển T-DNA (Zhu và cs 2000). Như vậy, thực chất đã có một hệ thống chuyển gen của vi khuẩn đất vào cây trồng tồn tại trong tự nhiên. Dựa vào cơ chế này con người lợi dụng vi khuẩn đất để chuyển các gen mong muốn cho mình trên cơ sở thiết kế lại hệ thống Ti-plasmit của vi khuẩn sao cho vẫn đảm bảo được chức năng chuyển gen nhưng không mang các gen gây độc cho cây. Người ta đã tạo ra các dạng vector mới để chuyển gen là những vector liên hợp (co-intergrate vector) và vector nhị thể (binary vector) [3], [4]. Hệ thống vector liên hợp (co-integrate vector) là kết quả của sự liên hợp hai loại plasmit: Ti-plasmit đã loại trừ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất opine nhưng vẫn giữ lại vùng vir và vùng bờ trái, bờ phải. Thay vào những gen bị cắt bỏ là đoạn tương đồng với một đoạn trên plasmit thứ hai (plasmit trung gian) để phục vụ cho việc liên hợp hai loại plasmit. Plasmit trung gian là một plasmit tách dòng từ vi khuẩn E.coli và có thể tái sinh được ở Agrobacterium. Plasmit này có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị phục vụ việc chọn lọc và có mặt đoạn tương đồng. Khi cho tương tác hai loại plasmit này với nhau chúng sẽ liên hợp qua sự trao đổi chéo giữa hai đoạn tương đồng và hình thành nên vector liên hợp. Vector liên hợp này nằm trong vi khuẩn A. tumefaciens và hoạt động theo cơ chế chuyển gen thông thường của vi khuẩn đất. Do tần số đưa plasmit trung gian từ E.coli sang Agrobacterium rất thấp (10-7-10-5) nên vector này ít được sử dụng (John Draper, 1882). Hệ thống vector nhị thể khác với vector liên hợp là chúng có hai vector (plasmit) cùng có mặt và hoạt động trong Agrobacterium. Một plasmit tách dòng từ E.coli trong đó có thiết kế vùng bờ trái và bờ phải, nằm giữa chúng là các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển. Plasmit thứ hai là Ti-plasmit cải tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái và bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữ lại vùng vir, plasmit này được gọi là plasmit hỗ trợ. Hệ thống vector này cũng hoạt động theo cơ chế chuyển gen của vi khuẩn đất Agrobacterium một cách rất hữu hiệu (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2005) [12]. Thiết kế vector Các nghiên cứu về vi khuẩn Agrobacterium và khả năng tự nhiên của chúng trong việc biến đổi vật chất sinh học của các tế bào thực vật bị nhiễm đã giúp các nhà khoa học thiết kế được những phân tử giúp chuyển gen mong muốn vào tế bào thực vật: T-DNA được giới hạn hai đầu bởi vùng biên (T-DNA borders), phần còn lại trong vùng biên sẽ không có chức năng gì trong quá trình chuyển gen. Nhờ vậy, có thể loại bỏ khả năng gây hại của T-DNA bằng cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong hai đầu vùng biên bằng các gen mong muốn. Khi các oncogene bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường và trong hầu hết các trường hợp, cho cây hữu thụ. Quá trình tổng hợp opine sử dụng các nguyên liệu của cây làm ảnh hưởng đến năng suất cuối cùng nên trong quá trình thiết kế cũng loại bỏ các gen tổng hợp opine. Ti-plasmit có kích thước lớn (200 - 800 kb) nên những đoạn DNA không cần thiết cũng phải được cắt bỏ để chèn vào đoạn DNA mục tiêu. Ngoài ra, Ti-plasmit không tự tái bản trong E.coli nên cần được bổ sung thêm gốc tái bản của E.coli. Cuối cùng, cần bổ sung các gen chỉ thị để chọn lọc cây và vi khuẩn. Các phân tử DNA kỹ thuật di truyền này được gọi chung là các vector. Như vậy, cấu trúc của một vector chuyển gen bao gồm: * Có gốc tái bản (ORI) có nguồn gốc từ vi khuẩn. * Vùng khởi động (promoter) có nguồn gốc từ thực vật. * Vùng kết thúc (terminator). * Vùng gắn gen chuyển vào (MCS). * Vùng chứa gen chọn lọc (để tách các tế bào chuyển gen). * Vùng chứa các gen báo cáo để biết được các gen chuyển vào có thành công không (gus, gfp - gen phát huỳnh quang). Quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens như sau: Bước 1: Thiết kế vector mang gen. Bước 2: Nhân dòng vector nhờ vi khuẩn E.coli. Bước 3: Chuyển vector tái tổ hợp vào A. tumerfacien. Bước 4: Lây nhiễm A. tumerfaciens chứa gen biến nạp với tế bào, mô thực vật để tiến hành quá trình chuyển gen sang mô, tế bào đích. Bước 5: Chọn lọc các mô, tế bào được biến nạp thành công. Bước 6: Tái sinh mô, tế bào biến nạp thành cây hoàn chỉnh. Sau đó, từ những cây chuyển gen thu được cần đánh giá sự ổn định di truyền qua các thế hệ, sử dụng phương pháp lai hữu tính để thu được con cái mang gen mong muốn. Đồng thời đánh giá tác động của cây chuyển gen để đưa ra sản xuất và cung cấp cho thị trường [13]. 2.2.2.3 Những thành tựu trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen trên thế giới Công nghệ sinh học phát triển đã tạo điều kiện để các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu chọn tạo giống kháng sâu bằng cách chuyển gen mã hoá các đặc tính mong muốn vào cây trồng. Năm 1980, những thí nghiệm chuyển gen đầu tiên nhờ vi khuẩn A. tumefaciens vào cây trồng đầu tiên được thực hiện. Năm 1986, các thử nghiệm đầu tiên trồng cây biến đổi gen trên đồng ruộng ở một số quốc gia. Năm 1990, chuyển gen bất dục đực cho ngô bằng súng bắn gen và thực phẩm biến đổi gen được chấp thuận ở Mỹ lần đầu tiên. Năm 1994, giống cà chua Flavor Saver mang gen chín chậm, là sản phẩm cây trồng chuyển gen đầu tiên được thương mại hoá. Năm 1998, lần đầu thành công việc chuyển đồng thời 10 gen vào một cây. Toàn cầu có 48 giống cây chuyển gen được phép thương mại hoá (trong đó Mỹ có 35 giống) [38]. Năm 1999, chuyển gen cho lúa có giá trị dinh dưỡng cao hơn. Diện tích trồng cây chuyển gen trên toàn cầu lớn hơn 40 triệu ha [11]. Năm 2006 được ghi nhận là năm đầu tiên của thập niên thứ hai của việc thương mại hóa cây trồng chuyển gen 2006 - 2015. Năm 2006, diện tích toàn cầu cây trồng chuyển gen tiếp tục tăng cao vượt ngưỡng 100 triệu ha (250 triệu mẫu Anh), khi lần đầu tiên hơn 10 triệu nông dân (10,3 triệu) tại 22 nước canh tác cây chuyển gen, cao hơn so với 90 triệu ha và 8,5 triệu nông dân tại 21 nước năm 2005. Tỷ lệ chấp nhận cao chưa từng thấy là minh chứng cho sự thật và sự tin tưởng của hàng triệu nông dân nhỏ và lớn vào cây trồng chuyển gen ở các nước công nghiệp và đang phát triển [51]. Năm 2007, Hoa Kỳ, Ac-hen-ti-na, Brazil, Canada, Ấn Độ và Trung Quốc tiếp tục là những nước trồng cây công nghệ sinh học (CNSH) chủ yếu trên thế giới. Hoa Kỳ là nước có diện tích canh tác cây trồng cây CNSH dẫn đầu thế giới, tuy nhiên tỉ lệ diện tích đất trồng cây CNSH của Hoa Kỳ so với toàn cầu đang giảm do diện tích canh tác cây trồng CNSH trên toàn cầu ngày một mở rộng [51]. Tám nước dẫn đầu trồng hơn 1 triệu ha, sắp xếp theo diện tích giảm dần là Hoa Kỳ (62,5 triệu ha), Ac-hen-ti-na (21 triệu ha), Brazil (15,8 triệu ha), Ấn Độ (7,6 triệu ha), Canada (7,6 triệu ha), Trung Quốc (3,8 triệu ha), Paraguay (2,7 triệu ha) và Nam Phi (1,8 triệu ha). Đậu tương CNSH là giống cây chính được trồng trong năm 2008 với diện tích 65,8 triệu ha, chiếm 53% diện tích đất trồng cây CNSH trên toàn cầu, tiếp theo là ngô CNSH (37,3 triệu ha, chiếm 30%), bông CNSH (15,5 triệu ha, chiếm 12%) và cải canola chuyển gen (5,9 triệu ha, chiếm 5% diện tích đất trồng cây CNSH trên toàn cầu). Hiện nay đã có 25 quốc gia cho phép trồng cây CNSH và 30 quốc gia khác đã cho phép nhập khẩu các sản phẩm CNSH sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, đưa tổng số nước phê chuẩn cây trồng cây CNSH lên 55 nước. Diện tích trồng tăng 74 lần từ năm 1996 đến nay đã khiến cây CNSH nhanh chóng trở thành công nghệ cây trồng được ứng dụng nhanh nhất. Trị giá toàn cầu của thị trường cây trồng sinh học trong năm 2008 là 7,5 tỷ USD với tổng giá trị tích luỹ đạt 50 tỷ USD từ năm 1996 đến 2008 [51]. 2.3 Giới thiệu chung về Bacillus thuringensis (Bt) 2.3.1 Lịch sử phát hiện độc tố Bt Shigetane Isiwata, nhà sinh học người Nhật Bản đã phát hiện ra vi khuẩn này năm 1901 từ ấu trùng tằm bị bệnh. Sau đó, Ernst Berliner (1911) đã phân lập vi khuẩn này từ ấu trùng Ephetia kuniella bị bệnh và đặt tên là Bacillus thuringensis (Bt), (vi khuẩn đất điển hình được phân lập ở vùng Thuringia, Đức) Đến năm 1915, Berliner đã phát hiện sự có mặt của tinh thể trong Bt nhưng hoạt tính của chúng chưa được xác định. Bảng phân loại Bt: [56] Giới: Eubacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Loài: thuringensis Bt là vi khuẩn được phân lập từ đất, có khả năng sinh ra các protein thể vùi dạng tinh thể trong quá trình sinh bào tử. Sau đó đến những năm của thập kỷ 50, các nhà khoa học mới phát hiện ra cấu trúc tinh thể của các độc tố gây tê liệt bộ máy tiêu hoá của côn trùng (Steinhaus, E.A, 1951) [44]. Hannay (1953) [31] đã phát hiện ra cấu trúc của các tinh thể gây độc cho côn trùng và đặt tên là nội độc tố δ. Một số loài vi khuẩn khác cũng có khả năng sinh ra các nội độc tố gây chết các loại côn trùng thuộc bộ cánh vảy, cánh cứng và._. bộ hai cánh. Chúng được sử dụng để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học trong suốt 40 thập kỷ qua (Lambert và Peferoen, 1992). Đã có 67 chế phẩm Bt được đăng ký với trên 450 công thức khác nhau (Shewry và Gutteridge, 1992) [54]. Gen mã hoá nội độc tố đã được nhân vô tính từ thập kỷ 80 (Schnepf và Whitley, 1981) [43], được chuyển vào cây thuốc lá và cây cà chua (Barton và cs, 1987; Vaeck và cs, 1987) để biểu hiện tính kháng côn trùng [54]. Từ đó cho đến nay có rất nhiều thành tựu nghiên cứu về cây chuyển gen cũng như các độc tố diệt côn trùng. 2.3.2 Các loại protein độc tố của Bt 2.3.2.1 Nội độc tố δ (cry) và cơ chế tác động của nội độc tố Bt + Phân loại: Do cấu trúc tinh thể tự nhiên của các protein nên chữ cry được sử dụng như thuật ngữ cho các protein và gen. Ban đầu, các nhà khoa học phân ra 4 nhóm gen độc tố theo sự tương đồng của trình tự gen và loài côn trùng đặc hiệu (Hofte H và Whiteley HR, 1989) [32]. Các gen cryI mã hoá protein 130 kDa, thường đặc hiệu với ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea). Các gen cryII mã hoá protein 70 kDa đặc hiệu với ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea) và hai cánh (Diptera). Các gen cryIII mã hoá protein nặng 70 kDa đặc hiệu với ấu trùng cánh cứng (Coleoptera). Các gen cryIV đặc hiệu với ấu trùng bộ hai cánh (Diptera). Sau đó có thêm nhóm cryV mã hoá các protein ấu trùng cánh cứng (Coleoptera) và ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea) (Tailor và cs, 1992) Ngày nay các gen mã hoá cho protein nội độc tố (gồm 140 gen đã được công bố) được xếp chung vào nhóm có khả năng diệt ấu trùng các bộ cánh vảy (Lepidoptea), hai cánh (Diptera) và cánh cứng (Coleoptera). + Cơ chế tác động của nội độc tố Bt Các protein dạng tinh thể sẽ hoà tan trong ruột của côn trùng có pH cao (môi trường kiềm), giải phóng ra các protein gọi là nội độc tố δ (Hoftey, H. và Whiteley, H.R, 1989) [33]. Mục tiêu chính của độc tố Bt là ruột giữa của côn trùng (Knowels, 1994) [34], [35]. Các tiền độc tố không hoạt động cho đến khi chúng bị hoà tan bởi các enzyme phân giải protein trong ruột côn trùng (Tojo và Aijawa, 1983; Gill và cs, 1992; Lee và cs, 1992; Milne và Kaplan, 1993) [29], [37], [39], [46]. Các độc tố gắn vào chất nhận đặc hiệu ở trong màng của tế bào biểu mô trụ. Sau khi gắn vào chất nhận, độc tố sẽ chèn vào màng nguyên sinh của tế bào để gây tổn thương cho côn trùng. Sau khi gắn với tế bào biểu mô ruột giữa, chuỗi xoắn kép có thể xâm nhập vào màng và hình thành kênh trao đổi ion (Knowels và Dow, 1993) [34]. Sự hình thành độc tố sẽ tạo thành các lỗ thủng trên màng tế bào biểu mô và làm mất cân bằng trao đổi ion nhanh chóng. Sự hình thành các kênh ion này phá huỷ thế màng (English và Slatin, 1992) [23], làm hoại tử ruột giữa, thoái hoá màng và biểu mô, cuối cùng là nhiễm trùng vi khuẩn sau khi côn trùng chết. Theo Knowles và Dow (1993) [34] độc tố Bt làm ngừng các kênh bơm ion K+ khiến các tế bào trụ bị trương lên và phá huỷ tính thẩm thấu. Sự ngắt quãng của toàn bộ ruột đã làm côn trùng chết đói hoặc nhiễm trùng đường tiêu hoá. 2.3.2.2. Độc tố sinh dưỡng diệt côn trùng (VIP) và cơ chế tác động + Phân loại: Theo Estruch và cs 1996; Warren 1997; Chen và cs 2003 [19], [24], [25], [26], [49] thì các protein sinh dưỡng diệt côn trùng được chia thành 2 nhóm chính: Nhóm liên hợp vip1 và vip2 đặc hiệu với côn trùng bộ cánh cứng Nhóm vip3 đặc hiệu với côn trùng bộ cánh vảy + Cơ chế tác động của VIP Theo Wu và cs, 1997 [50] thì protein Vip cũng hoạt động trong ruột giữa của côn trùng. Chúng gắn với chất nhận đặc hiệu và chèn vào màng ruột giữa của côn trùng và tạo thành các kênh ion, làm mất cân bằng sự trao đổi chất và gây tê liệt bộ máy tiêu hóa của côn trùng (Crickmore và cs, 1998) [21]. 2.4 Một số thành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thế giới Cây thuốc lá chuyển gen kháng chất diệt cỏ được tiến hành tại Mỹ và Pháp năm 1986. Cây thuốc lá là đối tượng được chuyển gen kháng sâu đầu tiên vào năm 1987 (Barton và cs, 1987; Fischoff và cs, 1987; Vaeck và cs, 1987) [28]. Trung Quốc là quốc gia đã thương mại hóa cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh (kháng virus khảm lá thuốc lá), kháng sâu (Zhao Rong min, Yang Ying Chang và cs, 1993). Wong và cs (1992) cũng đã tạo được cây thuốc lá chuyển gen cry1A(c) mRNA có độc tố cao gấp 10 - 20 lần so với cây thuốc lá chuyển gen dùng CaMV35S promoter, hàm lượng protein độc tố thu được chiếm gần 1% lượng protein hoà tan tổng số trong lá. Gen cryIII cũng được chuyển vào cây thuốc lá và cây khoai tây để kháng sâu Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata) (Perlak và cs, 1993) [40]. Gen cry1A(b) và cry1A(c) cũng được chuyển vào cây để phòng trừ côn trùng cánh vảy (Van der Salm và CS, 1994). 100% sâu xanh (H. virescens, H. zea và S. exigua) chết khi ăn lá của cây thuốc lá thuốc lá được chuyển gen cry2Aa2 (Kota và cs, 1999) [36]. Selvapandian và cs (1998) chuyển gen cry1Ia5 vào thuốc lá và cũng thể hiện tính kháng sâu xanh (H. armigera ) tương đương với gen cry1A(b) hoặc cry1A(c). Tuy nhiên do một số yếu tố khách quan mà sản phẩm nguyên liệu thuốc lá biến đổi gen bị hạn chế trên thế giới nên nhiều thông tin về thuốc lá chuyển gen chưa được đánh giá khách quan 2.5 Tình hình nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen trong nước Chủ trương của Việt Nam là cho phép trồng cây biến đổi gen và đẩy mạnh việc phát triển loại thực vật, động vật này [53]. Mới đây nhất, Thủ tướng chính phủ đã ký quyết định đồng ý về Chương trình trọng điểm và ứng dụng CNSH trong lĩnh vực NN - PTNT đến năm 2020. Do hệ thống tái sinh cây thuốc lá tương đối đơn giản và thời gian phân hóa từ mô đến cây hoàn chỉnh khá ngắn nên trong những nghiên cứu về chuyển gen các nhà khoa học thường chọn cây thuốc lá là cây mô hình. vì vậy những nghiên cứu về chuyển gen trên cây thuốc lá đã được tiến hành từ khá sớm. Nguyên Liên Chi và cs (1989) [6] đã chuyển thành công gen kháng kanamycin vào mô thuốc lá (N.tabacum) bằng vi khuẩn A.tumefaciens. Trần Phương Liên và cs (1994) [10] cũng công bố kết quả nghiên cứu biến nạp một số gen chọn lọc vào các dòng thuốc lá bằng cách sử dụng Ti-plasmit vector. Nguyễn Đức Thành và cs (1994) [11] đã tiến hành nghiên cứu chuyển gen lục lạp thuốc lá. Trần Đăng Kiên và cs (1999) [8] đã  nghiên cứu phương pháp biến nạp gen tạo giống thuốc lá có khả năng kháng sâu bệnh, trong đó đã xác định được mô lá là bộ phận tốt nhất biến nạp, nồng độ kanamycine (kan) 30 - 50 mg/l là tốt nhất cho quá trình sàng lọc mẫu sau biến nạp, đã tạo ra vector chứa gen Bt là Ti-plasmit/cry IA(c)/NOS, đã tạo được chủng A. tumefacciens chứa plasmit vector pCAMBIA 1300:UBI - cry IA(c) NOS. Vũ Thị Bản và cs (2007) [2] đã tiến hành nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá) và đã chuyển được gen CP mã hóa vỏ virus gây bệnh khảm lá thuốc lá vào giống thuốc lá K326 và giống C 9-1, thể hiện tính kháng bệnh TMV ở thế hệ T0. Cho đến nay chưa có công bố chính thức nào về những nghiên cứu chuyển gen kháng sâu vip3A vào cây thuốc lá ở Việt Nam. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu tạo cây thuốc lá mang gen kháng sâu vip3A. 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị 3.1.1 Vật liệu - Vật liệu thực vật: Giống thuốc lá K326 là giống thuốc lá nhập nội và đã được công nhận giống quốc gia, có một số đặc điểm chính như sau: Chiều cao trung bình: 160 - 175cm; thời gian sinh trưởng: 120 ngày; thời gian ra nụ 10%: 53 ngày; năng suất khô: 1,8 - 2,3 tấn/ha; chất lượng tốt. Hiện nay diện tích thuốc lá giống K326 chiếm khoảng 40% diện tích cây trồng thuốc lá trên cả nước. - Các vật liệu khác: + Các plasmit Plasmit Kích thước (bp) Đặc tính Nơi cung cấp pCR@ 2.1-TOPO 3900 Ampiciline Kanamycine hãng Invitrogen pBI121 13000 Kanamycine Phòng CNTBTV + Nguồn gen vip3A + Chủng khuẩn: Chủng DH5α (E.coli) và C58 (A. tumerfaciens) 3.1.2 Hoá chất, thiết bị - Các enzyme giới hạn: BamHI, SacI, EcoRI - Enzyme T4 ligase; T4 kinase do hãng Fermentas cung cấp - Các hoá chất khác: thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform, kanamycine.... và các hoá chất thông dụng khác - Thiết bị máy móc: Bộ kit tinh sạch DNA, pipetman, máy soi Gel (Bio - Rad), máy chụp ảnh, máy ly tâm, máy đo pH, bộ điện di, máy PCR, bể ổn nhiệt.... 3.2 Địa điểm và thời gian - Địa điểm: Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học - Thời gian: từ tháng 8 năm 2008 đến tháng 9 năm 2009 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen 3.3.1.1 Nuôi cấy và lưu giữ chủng khuẩn - Môi trường nuôi cấy LB (Luria and Betani) Yeast extract 5g/l Trypton 10 g/l NaCl 10 g/l Bacto agar(cho môi trường đặc) 15g/l pH 7 - Phương pháp nuôi cấy: Khuẩn giữ trong glycerol được lấy ra cấy lỏng trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh thích hợp. Nuôi lắc 200v/p ở 37oC qua đêm. Sau đó cấy ria trên đĩa petri chứa LB đặc có kháng sinh, nuôi ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. - Giữ chủng: Bổ sung glycerol vô trùng đến nồng độ cuối cùng là 15% vào 0,5 - 1ml dịch vi khuẩn lỏng mới nuôi qua đêm, trộn đều và bỏ nhanh vào nitơ lỏng và giữ chủng ở điều kiện -800C. 3.3.1.2 Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA plasmit của vi khuẩn E.coli a. Hoá chất sử dụng: Dung dịch I: - 50 mM glucose - 25 mM Tris HCl pH 8,0 - 10 mM EDTA pH 8,0 Dung dịch II: - 0,2 N NaOH - 1% SDS Dung dịch III: - 60 ml kali acetate 5M - 28,5 ml H2O Dung môi loại protein: - Phenol : chloroform : isoamyl alchohol (25:24:1) - chloroform : isoamyl alchohol (24:1) - TE 0,01M pH 8,0 b/ Quy trình: - Cấy chuyển một khuẩn lạc E.coli vào 3 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc, lắc qua đêm ở 37oC, 200 v/p. - Chuyển 2 ml dịch nuôi cấy vào các ống Eppendorf loại 2 ml và đem ly tâm 8000 v/p, 5phút, 4oC để thu tế bào. - Cặn được hoà trong 100 µl dung dịch I . - Bổ sung ngay 200 µl dung dịch II, đảo nhẹ nhàng - Bổ sung tiếp 150 µl dung dịch III, đảo nhẹ nhàng - Thêm 550 µl dung dịch Phenol : chloroform : isoamyl alchohol (25 : 24 : 1), đảo nhẹ nhàng - Ly tâm 12.000 v/p, 4oC, 15 phút. - Chuyển dịch nổi sang ống Eppendorf mới và chiết tiếp bằng chloroform : isoamyl alchohol (24:1) - Bổ sung 1ml cồn tuyệt đối và 10 µl 3M Sodium acetate, để lạnh -200C trong 3 giờ sau đó ly tâm 12.000v/p trong 15 phút để thu DNA - Rửa cặn bằng 0,2 ml cồn 70%, ly tâm 12.000 v/p trong 5 phút, làm khô và hoà cặn trong 40 µl TE 0,01M, giữ ở -200C - Bổ sung RNase vào mẫu đến nồng độ cuối cùng là 100 µg/ml, ủ mẫu ở 370C trong 1 giờ, chiết lại bằng chloroform : isoamyl alchohol (24:1) và tủa bằng cồn 100% - Điện di trên gel agarose 0,8% để xác định độ sạch của DNA. 3.3.1.3 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose Các đoạn DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng điện trường có điện thế và cường độ thích hợp a. Hoá chất sử dụng: Agarose 0,8%, dung dịch đệm TAE 1X (Tris HCl, EDTA ...); Ethidium bromide (EtBt) 10mg/ml, đệm tra mẫu 10X. b. Quy trình: - Chuẩn bị gel agarose: cho 0,8 g agarose vào 100 ml dung dịch TAE 1X, lắc đều và đun cho agarose tan hoàn toàn, để nguội đến khoảng 50 - 60oC, đổ dung dịch vào khay điện di có cài sẵn răng lược, để gel đông cứng, rút lược và đặt bản gel vào bể điện di, đổ dung dịch TAE ngập bản gel từ 1 - 2 mm - Tra mẫu và điện di: mẫu DNA được trộn với đệm tra mẫu 10X theo tỷ lệ 1: 10, mix đều và tra vào giếng, chạy điện di với thang DNA chuẩn để xác định trọng lượng phân tử DNA - Nhuộm bản gel: bản gel được lấy ra khỏi khuôn, ngâm 20 - 40 phút trong dung dịch nước có chứa EtBt, rửa lại bằng nước và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm trên máy soi DNA, ảnh được chụp bằng máy soi gel. 3.3.1.4 Tinh sạch DNA từ bảng gel agarose a. Dụng cụ và hoá chất: - Cột thôi gel; eppendorf; tip các loại... - Dung dịch QG (solubilization buffer), dung dịch PE (washing buffer), dung dịch EB (elution buffer) hoặc nước cất khử ion .. b. Tiến hành: Điện di trên gel agarose, nhuộm, soi trên bàn soi UV và cắt lấy đoạn gel chứa đoạn DNA quan tâm cho vào ống eppendorf. Bổ sung dung dịch QG theo tỷ lệ 1Vmẫu : 3VQG và ủ trong 50oC trong 15 phút. Sau khi gel tan hoàn toàn chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel, ly tâm cực đại trong 1 phút và loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 500 µl dung dịch QG, ly tâm 1 phút. Bổ sung tiếp 750 µl dung dịch PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Sau đó ly tâm cực đại 1 phút, đổ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại bỏ hết PE. Cuối cùng hoà tan DNA trong 30 - 50 µl nước cất. 3.3.1.5 Phương pháp xử lý với enzyme giới hạn Các vector được xử lý với enzyme giới hạn theo phản ứng: + Với một enzyme Thành phần Thể tích (µl ) - H2O 5,5 - Đệm 10X riêng của enzyme 1,0 - DNA plasmit 3,0 - Enzyme (10 U/l) 0,5 - Tổng thể tích phản ứng 10,0 + Với hai enzyme Thành phần Thể tích (µl ) - H2O 5,0 - Đệm 10X chung tối ưu cho hai enzyme 1,0 - DNA plasmit 3,0 - Enzyme 1 (10U/l) 0,5 - Enzyme 2 (10U/l) 0,5 - Tổng thể tích phản ứng 10,0 Phản ứng được ủ ở 37oC trong 3 -5 giờ. Sản phẩm cắt được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. 3.3.1.6 Phản ứng ghép nối đoạn gen với vector: Đoạn DNA cần nối ghép và vector đã được mở vòng được trộn lẫn với nhau theo tỷ lệ 3 : 1 về số lượng phân tử. T4 ligase được cho vào phản ứng với nồng độ 1 đơn vị/10µl phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được trộn theo thứ tự: Thành phần Thể tích (µl ) - H20 1,5 - Đệm T4 ligase 10X 1,5 - Đoạn gen cần gắn 7,0 - Vector đã mở vòng 3,0 - r ATP 1,0 - T4 ligase 1,0 - Tổng thể tích 15,0 Phản ứng được ủ qua đêm ở 14oC 3.3.1.7 Biến nạp DNA plasmit tái tổ hợp vào tế bào E.coli Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α được tiến hành theo Cohen và cộng sự (1972).Vi khuẩn dưới tác dụng của hoá chất hoặc điện trường trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ cho các phân tử ADN có thể chui vào. Chuẩn bị tế bào khả biến: Chủng khuẩn được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 37oC, sau đó lấy một khuẩn lạc đơn cấy vào 3 ml môi trường LB lỏng, lắc 200 v/p ở 37oC qua đêm. Chuyển 0,5 ml dịch khuẩn sang 50 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 200 v/p, 37oC khoảng 3 giờ cho đến khi OD 660nm đạt từ 0,6 - 0,8 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm đã giữ lạnh trên đá và ly tâm 6000 v/p, 10 phút. Thu cặn và hoà nhẹ nhàng trong 0,7 - 1,5 ml CaCl 2 0,1M . Chia vào mỗi ống eppendorf 50 µl dịch tế bào, bổ sung thêm 50 µl glycerol 60%, làm đông nhanh bằng nitơ lỏng và giữ ở -80 oC. Sau đó, các tế bào được phục hồi trong môi trường nuôi cấy và các thể biến nạp được phát hiện trên môi trường thích hợp. Cấy trải lên đĩa môi trường LB không có kháng sinh để kiểm tra. b. Biến nạp DNA plasmit vào tế bào khả biến E. coli bằng sốc nhiệt. - Bổ sung 5 µl ADN plasmit tiếp vào ống eppendorf chứa sẵn 100 µl tế bào khả biến đã để trên đá 30 phút, giữ trên đá 30 phút. - Sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây rồi chuyển ngay sang giữ trong đá 5 phút. - Bổ sung 0,5 ml môi trường SOC, nuôi lắc 200 v/p ở 37oC trong 1 giờ. - Cấy trải dịch tế bào lên trên đĩa LB đặc có bổ sung kháng sinh thích hợp và nuôi qua đêm ở 37oC. 3.3.2 Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens bằng xung điện - Chuẩn bị tế bào A. tumefaciens khả biến trong các cuvet đã khử trùng. - Đặt các ống cuvet đã khử trùng vào đá. - Bổ sung 5 µl plasmit tái tổ hợp vào 100 µl đựng sẵn tế bào A. tumefaciens khả biến - Đảo nhẹ, đặt trong đá trong 5 phút, chuyển dịch sang ống cuvet mới - Xung điện: 2,5kw; 25 µF và 400 Ω trong 4 - 5 µs - Chuyển ngay ống dịch vào đá, sau 5 phút, bổ sung 1 ml môi trường YEP, mix nhẹ và chuyển các tế bào sang ống eppendorf 2ml, nuôi lắc trong 28oC trong 1 giờ - Cấy trải 100 µl tế bào vào đĩa chứa môi trường chọn lọc và nuôi từ 24- 48 giờ. 3.3.3 Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens (theo Topping, 1998 ) Các môi trường sử dụng trong nuôi cấy cây thuốc lá chuyển gen Môi trường Thành phần cơ bản MS Môi trường cơ bản MS (Murashige & Skoog 1962) Tái sinh chồi (GM) MS + 1 mg/l BAP + 30g/l Sacrose + 8g/l agar. pH = 5,8 Ra rễ (RM) MS + 0,1 mg/l IBA + 30g/l Sacrose + 8g/l agar. pH = 5,8 Chọn lọc chồi (GM Kan 50) GM + 400 mg/l cefo + 50 mg/l kan+ 8g/l agar. pH = 5,8 Chọn lọc cây (RM Kan 50) RM + 400 mg/l cefo + 50 mg/l kan + 8g/l agar. pH = 5,8 Quy trình tái sinh cây thuốc lá từ mảnh lá Môi trường tái sinh đa chồi (GM) Môi trường ra rễ (RM) Môi trường trấu cát (1: 1) Mảnh lá thuốc lá (MS) 3.3.3.1 Tạo dịch huyền phù A.tumerfaciens Chủng vi khuẩn A.tumerfaciens có chứa vector quan tâm bảo quản trong glycerol trong điều kiện lạnh sâu (-80oC) được cấy sang môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi lắc 200 v/p trong điều kiện 37oC qua đêm, sau đó cấy vạch trên môi trường LB đặc có kháng sinh thích hợp, nuôi trong điều kiện tối, 28oC trong 2 ngày. Chọn một khuẩn lạc tròn, đều, đứng độc lập để cấy chuyển sang 2 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi lắc 200 v/p, 37oC trong 7 - 8 giờ, hút 1ml dịch khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi qua đêm (16 - 20 giờ) nuôi lắc 200 v/p trong điều kiện 37oC. Dịch khuẩn thu được có OD660nm từ 0,6 - 1 là đủ điều kiện để biến nạp 3.3.3.2 Biến nạp Từ những cây thuốc lá invitro, chọn những lá bánh tẻ, cắt các mảnh lá có kích thước khoảng 1cm2 và đặt trong môi trường tái sinh đa chồi (GM) trong 2 ngày. Sau 2 ngày nuôi cảm ứng trên GM, các mảnh lá được chuyển sang môi trường MS lỏng (khoảng 5 ml), đổ dịch huyền phù vi khuẩn vào bình chứa các mảnh lá và lắc nhẹ nhàng. Sau 10 phút gắp các mảnh lá lên giấy thấm vô trùng, thấm khô và cấy lên môi trường GM , đồng nuôi cấy 2 ngày, sau đó cấy chuyển các mẫu sang môi trường tái sinh đa chồi chọn lọc GM Kan 30. 3.3.3.3 Chọn lọc chồi sau biến nạp Từ những cụm chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc, chọn những cụm chồi phân hoá mạnh, tách các cụm chồi có kích thước khoảng 0,5 - 1cm2 cấy chuyển sang môi trường tái sinh đa chồi có bổ sung kháng sinh thích hợp để tiếp tục chọn lọc chồi tái sinh. 3.3.3.4 Tái sinh cây hoàn chỉnh Từ những cụm chồi phân hoá mạnh, chọn tách những chồi độc lập, có 2 - 3 lá phân hoá rõ ràng, dài từ 2 - 3 cm cấy sang môi trường ra rễ chọn lọc (RM Kan 50). Sau 3 tuần, từ những cây tái sinh hoàn chỉnh và phát triển tốt trên môi trường ra rễ chọn lọc tiếp tục cấy chuyển sang môi trường ra rễ chọn lọc lần 2 để thu cây hoàn chỉnh. 3.3.3.5 Ra cây trên giá thể trấu cát: Từ những dòng trên môi trường ra rễ chọn lọc những dòng sinh trưởng phát triển mạnh, cao 5 - 7 cm để ra cây vào giá thể trấu : cát (tỉ lệ 1:1). Sau 14 ngày chuyển các dòng vào chậu đất trong nhà lưới. 3.3.4 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR Sau khi trồng vào bầu đất, cây hồi phục và ra lá mới thì tiến hành lấy mẫu lá để phân tích cây chuyển gen. 3.3.4.1 Quy trình tách chiết DNA tổng số từ lá thuốc lá a. Hoá chất sử dụng: Thành phần dung dịch đệm Shorty buffer: 0,2 M Tris - HCl, pH = 9,0 0,4 M LiCl 25 mM EDTA 1% SDS Nước de ion b. Quy trình - Nghiền mẫu lá trong Eppendorf loại 2 ml bằmg Nitơ lỏng thành dạng bột mịn - Bổ sung 500 µl dịch đệm “Shorty buffer” - Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút - Hút 350 µl dịch nổi chuyển sang Eppendorf loại 1,5 ml có chứa sẵn 35 µl iso-propanol - Mix bằng cách đảo ngược các ống - Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút - Loại dịch nổi - Bổ sung 700 µl cồn 70%/ống - Ly tâm 13.000 v/p trong 5 phút - Loại bỏ dịch nổi - Làm khô bằng không khí - Bổ sung 50 µl nước đề ion, lắc nhẹ cho mẫu tan 3.3.4.2 Phản ứng PCR - Thành phần 1 phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) Nước cất hai lần 10,3 Đệm (10X) 2,0 MgCl2 2,0 dNTPs 1,6 Taq polymerase 0,5 Primer F 0,8 Primer R 0,8 DNA mẫu 2,0 Tổng 20,0 - Chương trình thực hiện phản ứng PCR Bước Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ 1 Biến tính 94 3 phút Từ bước 2 đến bước 4 thực hiện 35 chu kỳ 2 Biến tính 94 * 3 Bắt cặp * * 4 Kéo dài 72 * 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ Ghi chú: *các thông số thay đổi theo cặp mồi đặc hiệu Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, lặp lại 3 lần, mỗi thí nghiệm bao gồm 50 mẫu. Thí nghiệm được đặt trong điều kiện ánh sáng điện 2000 Lux, 16 giờ sáng/8 giờ tối, nhiệt độ trong phòng duy trì ở mức 26oC. 3.4 Các chỉ tiêu theo dõi ∑ số mảnh lá tái sinh đa chồi Tỷ lệ mảnh lá tái sinh đa chồi (%) = x 100 ∑ số mảnh lá biến nạp ∑ số cụm chồi tiếp tục tái sinh đa chồi Tỷ lệ cụm chồi tái sinh (%) = x 100 ∑ số cụm chồi sau biến nạp ∑ số chồi ra rễ Tỷ lệ cây ra rễ (%) = x 100 ∑ số chồi đưa vào chọn lọc ∑ số cây sống sót Tỷ lệ cây sống sót (%) = x 100 ∑ số cây đưa ra 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A Để tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen vip3A, việc thiết kế vector mang gen vip3A để chuyển vào cây trồng là một bước quan trọng trong toàn bộ quá trình tạo cây chuyển gen. 35S gus NOST BamHI SacI S¶n phÈm PCR vip3A vip3A BamHI SacI Bam HI & SacI BamHI SacI 35S NOST BamHI SacI T4 ligase 35S NOST vip3A Sơ đồ 4.1: Sơ đồ thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A Gen vip thuộc nhóm gen mã hoá protein Vip (vegetative insecticidal protein) (protein có trọng lượng phân tử 80 - 90 kDa) xuất hiện trong pha sinh trưởng sinh dưỡng và sinh sản của chu trình phát triển của vi khuẩn Bt, gây độc với hầu hết côn trùng bộ cánh vảy (Lepidoptea), ngoài ra còn gây độc đối với một số côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera) và hai cánh (Diptera). Trong nhóm gen vip thì gen vip3A được đặc biệt quan tâm nghiên cứu vì chúng mã hóa cho các protein có hoạt lực diệt sâu mạnh cùng với phổ hoạt động rộng. Protein Vip3A có thể kháng cả một số côn trùng thuộc bộ cánh vảy mà protein Cry hầu như không có tác dụng. Gen sử dụng trong thí nghiệm là kết quả phân lập của nhóm nghiên cứu thuộc Phòng công nghệ tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học. Gen mã hóa cho protein có kích thước 2369 bp, mã hoá 793 axít amin, được công bố trên ngân hàng gen quốc tế (mã số AJ971413). 4.1.1 Thiết kế mồi Để nhân thành công một gen, điều kiện đầu tiên là có cặp mồi đặc hiệu của gen đó. Cặp mồi đặc hiệu V2.1 và V2.2 được thiết kế để nhân gen vip3A dựa trên cơ sở trình tự gen vip3A đã được công bố (phụ lục 2). Ngoài ra mồi V2.3 được thiết kế thêm để kiểm tra sự có mặt của gen vip3A trong cây sau khi chuyển gen. Các mồi này có những trình tự và thông số cần thiết thể hiện trên bảng 4.1. Bảng 4.1. Trình tự và những thông số liên quan của cặp mồi nhân gen vip3A STT Trình tự mồi Tm %GC Vị trí gắn V2.1 5'-GCGGATCCATGAACAAGAATAATACTAA-3' 61oC 42,8 1 - 20 V2.2 5'-CGGAGCTCTTACTTAATAGAGCATCGTA-3' 62,5oC 42,8 2350-2370 V2.3 5'-GGAGAGCCATCCTTTTTTACTT-3' 55oC 40,9 579 - 605 Trên cặp mồi nhân vip3A được thiết kế thêm điểm cắt của 2 enzyme giới hạn là BamHI và SacI để phục vụ cho việc thiết kế vector chuyển gen sau này. Mồi xuôi (V2.1) gắn từ vị trí 1 đến vị trí 20, mồi ngược (V2.2) gắn từ vị trí số 2370 về vị trí số 2350, mồi ngược V2.3 gắn từ vị trí 605 về vị trí số 579. GGATCC: điểm cắt của enzyme giới hạn BamHI GAGCTC: điểm cắt của enzyme giới hạn SacI 4.1.2 PCR nhân đoạn gen vip3A và tinh sạch sản phẩm PCR Theo lý thuyết, nếu ta cung cấp cặp mồi đặc hiệu thì sẽ nhân chính xác được đoạn gen nằm giữa hai mồi đó. Cặp mồi được thiết kế để nhân toàn bộ gen vip3A có kích thước 2370 bp, nếu phản ứng PCR xảy ra đặc hiệu thì theo lý thuyết sẽ thu được băng duy nhất có kích thước khoảng 2,4 kb. 2,4 kb 2,0 kb 2,5 kb 1 2 Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy đoạn DNA mã hoá protein Vip3A đã được nhân lên một cách đặc hiệu, chỉ tạo ra một sản phẩm duy nhất có kích thước khoảng 2,4 kb, phù hợp với kích thước gen vip3A dự kiến. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch theo bộ Kit thôi gel (Gel purification Kit) của hãng Bioneer và điện di kiểm tra sản phẩm sau khi tinh sạch. Kết quả được thể hiện trên hình 4.1. Hình 4.1: Kết quả điện di tinh sạch sản phẩm PCR nhân gen vip3A 1: marker 2: Tinh sạch sản phẩm PCR nhân gen vip3A Ảnh chụp cho thấy một băng duy nhất có kích thước 2,4 kb, không có vạch phụ chứng tỏ sản phẩm sau tinh sạch đạt yêu cầu để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. 4.1.3 Ghép nối đoạn gen vip3A vào vector tách dòng Sản phẩm tinh sạch PCR được gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng pCR@ 2.1-TOPO của hãng Invitrogen được cung cấp ở dạng mạch thẳng có bazơ thiamin nhô ra ở đầu 3'. Do đặc tính của Taq - polymerase nên sản phẩm PCR có đến hơn 70% là có thêm bazo Adenin ở đầu 3' do vậy việc liên kết giữa gen và vector có hiệu quả cao. Phản ứng nối ghép được ủ qua đêm ở nhiệt độ 14oC để thu plasmit tái tổ hợp. 4.1.4 Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Sản phẩm của phản ứng ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α theo phương pháp sốc nhiệt (Cohen và cộng sự, 1972), sau đó được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin (100 µg/l), X- gal (100 µg/l) và chất cảm ứng IPTG 0,1M, nuôi qua đêm. Kết quả được thể hiện trên hình 4.2. Hình 4.2 : Kết quả biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Trên đĩa nuôi cấy thu được cả khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng. Khuẩn lạc xanh là do trong vector pCR@ 2.1-TOPO có chứa gen lacZ, nếu hoạt động bình thường sẽ tổng hợp enzyme β - galactosidase và dưới sự cảm ứng của IPTG chuyển hoá cơ chất X - gal thành hợp chất có màu xanh. Đó là những vi khuẩn không có đoạn DNA ngoại lai chèn vào. Khuẩn lạc trắng là do gen lacZ đã bị đoạn gen DNA ngoại lai chèn vào giữa nên không tổng hợp được enzyme β - galactosidase và đây có thể là những khuẩn lạc có thể chứa plasmit tái tổ hợp. 4.1.5 Chọn lọc plasmit tái tổ hợp Việc kiểm tra xem các khuẩn lạc có chứa các plasmit tái tổ hợp hay không là việc rất quan trong để chọn vật liệu chính xác cho các thí nghiệm tiếp theo. Chọn ngẫu nhiên 10 dòng khuẩn lạc trắng, nuôi lỏng và tách chiết DNA plasmit, điện di trên agarose 0,8%, sau đó cắt kiểm tra bằng hai enzyme BamHI và SacI. Kết quả điện di sản phẩm cắt thể hiện trong hình 4.3. Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmit 1: Marker 2 - 11: Các plasmit tách từ khuẩn lạc trắng được cắt bằng BamHI và SacI : 12: Plasmit tách từ khuẩn lạc xanh được cắt bằng EcoRI 13: Plasmit tách từ khuẩn lạc trắng đối chứng không cắt Các plasmit tái tổ hợp được tách từ khuẩn lạc trắng sau khi được cắt bằng hai enzyme giới hạn BamHI và SacI cho ra hai băng DNA có kích thước khác nhau, băng trên có kích thước khoảng 3,9 kb, là kích thước của vector pCR@ 2.1-TOPO, băng ở phía dưới có kích thước khoảng 2,4 kb, tương đương với kích thước sản phẩm PCR của gen vip3A. Như vậy chứng tỏ điểm cắt hai enzyme BamHI và SacI đã có mặt trong hai đầu đoạn gen vip3A. Khuẩn lạc xanh được cắt bằng enzyme EcoRI thì cho một băng duy nhất có kích thước 3,9 kb. Như vậy có thể kết luận việc nối ghép sản phẩm PCR và vector tách dòng đã đạt kết quả mong muốn. Chọn một dòng khuẩn lạc dương tính đã được kiểm tra chính xác trình tự gen vip3A để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo. 4.1.6 Tạo vector chuyển gen mang gen vip3A Vector pBI121 có kích thước 13,0 kb được thiết kế dựa trên cấu trúc của vector pBIN19, một vector chuyển gen vào thực vật. Vector pBI121 mang một vị trí cắt duy nhất của BamHI và SacI ở hai đầu gen gus (phụ lục 3) Plasmit tái tổ hợp cũng có vị trí cắt duy nhất của hai enzyme giới hạn BamHI và SacI nên chúng tôi tiến hành cắt đồng thời vector pBI121 và plasmit tái tổ hợp bằng enzyme BamHI và SacI. Theo lý thuyết thì sản phẩm cắt của pBI121 sẽ có hai băng tương ứng với kích thước khoảng 11,2 kb và 1,8 kb (kích thước của gen gus). Sản phẩm cắt của plasmit tái tổ hợp sẽ có hai băng khoảng 3,9 kb (tương ứng với kích thước của vector pCR@2.1 gốc) và 2,4 kb (kích thước của gen vip3A). Kết quả điện di thể hiện trên hình 4.4. Đường chạy số 2 là kết quả cắt của plasmit tái tổ hợp tương ứng với kích thước khoảng 3,9 kb và 2,4 kb. Đường chạy số 3 là sản phẩm cắt của pBI121, chỉ xuất hiện hai băng có kích thước tương ứng là 11,2 kb và 1,8 kb. Như vậy kết quả cắt enzyme hoàn toàn phù hợp với dự đoán theo lý thuyết, chứng tỏ kết quả cắt enzyme tốt. Hình 4.4: Sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI& SacI 1: Marker 2: Vector tách dòng 3: Vector pBI121 Trên sản phẩm cắt của pBI121 thôi và tinh sạch đoạn gel có kích thước 11,2 kb (vector pBI121 đã loại bỏ gen gus). Trên sản phẩm cắt của vector tái tổ hợp thôi và tinh sạch đoạn gel có kích thước 2,4 kb (gen vip3A). Hai sản phẩm này sẽ được sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng ghép nối bằng enzyme T4 ligaza và biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5a, cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh Kan nồng độ 25 mg/l và ủ ở 37oC qua đêm. Chọn ngẫu nhiên 14 dòng khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường có kháng sinh chọn lọc, tách plasmit, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen vip3A nhằm tìm ra chính xác dòng khuẩn lạc mang vector pBI121 tái tổ hợp mong muốn. Kết quả điện di sản phẩm PCR được thể hiện trên hình 4.5. Kết quả trên hình 4.5 cho thấy chỉ có duy nhất dòng số 13 xuất hiện băng có kích thước 2,4 kb, tương ứng với kích thước của gen vip3A chứng tỏ dòng số 13 mang cấu trúc vector pBI121/vip3A tái tổ hợp. Hình 4.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR từ 14 dòng khuẩn lạc cặp mồi đặc hiệu V1.2/V2.2 1: marker; 2 - 15: 14 dòng khuẩn lạc Tách plasmit của dòng số 13 để dùng làm vật liệu tiến hành phản ứng cắt kiểm tra bằng BamHI và SacI. Kết quả điện di sản phẩm cắt của dòng khuẩn lạc số 13 được thể hiện trên hình 4.6. Trên đường chạy số 2 xuất hiện hai băng: một băng có kích thước 11,2 kb (kích thước của pBI121 đã cắt gen gus); một băng có kích thước 2,4 kb (kích thước gen vip3A), phù hợp với dự đoán lý thuyết. Từ những kết quả trên có thể kết luận chính xác dòng khuâ._.