Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng Pectinase ở một số chủng Bacillus

hư hướng dẫn khoa học cặn kẽ cho em trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Em xin gởi lời cảm ơn đến: Anh TRẦN QUỐC TUẤN Đã luôn động viên và hỗ trợ em rất nhiều trong công việc. Em vô cùng biết ơn các Thầy Cô khoa Sinh, trường Đại Học Sư Phạm tp Hồ Chí Minh, đặc biệt là TS. TRẦN THỊ THANH THỦY, đã truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và dành cho em sự giúp đỡ quý báu trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị và các bạn lớp cao học vi sinh K18 đã cùng tôi học tập, động viên và có những trợ giúp cần thiết đúng lúc cho tôi. Cuối cùng, con xin gởi lời biết ơn vô hạn đến Ba Mẹ đã yêu thương và luôn ủng hộ con tiếp bước trên con đường học vấn của mình. Tôi xin cam đoan các số liệu được trình bày trong phần kết quả của luận văn này là do chính bản thân tôi thực hiện không sao chép của người khác. Đặng Thị Mai Phương MỞ ĐẦU Đã từ lâu enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học và nghiện cứu khoa học. Việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm enzym có ý nghĩa rất lớn vì nó thúc đẩy các quy trình sản xuất, rút ngắn thời gian sản xuất, tối ưu hóa chất lượng sản phẩm, làm tăng hiệu xuất chế biến,…Vì vậy nâng cao hiệu quả kinh tế cho người sử dụng. Hiện nay người ta khai thác nhiều enzym từ vi sinh vật và được ứng dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất. So với nguồn khai thác enzym từ động vật và thực vật, nguồn enzym từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm như hoạt tính enzym cao, thời gian tổng hợp enzym từ vi sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất hoàn toàn theo qui mô công nghiệp. Trong số các enzym thì pectinase có ứng dụng khá rộng rãi chỉ sau amylase và protease. Trong ứng dụng, pectinase được chia làm hai nhóm chính là: pectinase acid và pectinase kiềm. Pectinase acid chủ yếu được thu nhận từ nấm mốc, được dùng trong li trích và chế biến các loại nước ép trái cây, rượu và tạo ra các sản phẩm đơn bào. Pectinase kiềm được li trích chủ yếu từ vi khuẩn và dùng trong chế biến các cây có sợi, trong công nghiệp giấy, xử lí nước thải và lên men trà, cà phê. Nhằm đa dạng hoá nguồn cung cấp enzym pectinase từ vi sinh vật và nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp pectinase, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng pectinase của một số chủng Bacillus ”. Mục tiêu của đề tài: - Nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp pectinase của một số chủng Bacillus - Nâng cao hiệu quả hoạt động của chế phẩm enzym pectinase từ các chủng Bacillus được chọn. Nội dung của đề tài bao gồm: - Xác định đường kính vòng phân giải pectin của enzym pectinase từ sáu chủng Bacillus. Từ đó chọn lọc một hoặc hai chủng có vòng phân giải lớn nhất - Nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc được trên những môi trường nuôi cấy khác nhau (không có chất cảm ứng và có chất cảm ứng) để thu nhận enzym pectinase. - Xác định và so sánh hoạt tính enzym pectinase trong canh trường vừa thu nhận được trong điều kiện có và không có chất cảm ứng. - Khảo sát loại nguyên liệu cảm ứng thích hợp nhất cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase cao. - Kháo sát nồng độ chất cảm ứng tối ưu cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase cao nhất. - Từ các nghiên cứu trên, chọn loại nguyên liệu cảm ứng và thời gian nuôi cấy tối ưu cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase ở các chủng vi khuẩn được chọn. - Khảo sát các điều kiện nuôi cấy khác(nhiệt độ, pH, nguồn nitơ) ảnh hưởng đến sinh tổng hợp pectinase ở các chủng vi khuẩn được chọn. - Tối ưu hoá các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, nguồn nitơ) bằng quy hoạch thực nghiệm nhằm thu được sản lượng pectinase cao. - Nuôi cấy thử nghiệm các chủng vi khuẩn Bacillus được chọn trên môi trường tối ưu hóa để kiểm tra mô hình tối ưu. - Khảo sát các điều kiện hoạt động tối ưu của enzym pectinase như: pH, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, thời gian phân hủy cơ chất và xác định sự ảnh hưởng của một số ion kim loại lên sự hoạt động của enzym. - Tách chiết, thu nhận xác định hoạt tính, xác định hiệu xuất thu nhận, hiệu suất hoạt tính các chế phẩm enzym pectinase từ canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc được. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ENZYM PECTINASE 1.1.1. Giới thiệu chung Lịch sử nghiên cứu pectinase bắt đầu từ khi người ta hiểu biết về cấu trúc pectin và cơ chế phân cắt pectin của những enzym này. [44] Trong nhiều thập niên gần đây việc sản xuất pectinase từ vi sinh vật đã trở nên phổ biến. Nhiều vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đều có khả năng sản xuất enzym pectinase. Người ta cũng đã chứng minh rằng: pectinase là một enzym cảm ứng có thể được sản xuất từ nhiều nguồn cacbon khác nhau (Aguilar, 1987; Maldonado, 1989; Frieddrich, 1994; Nair, 1995; Nair, 1997). [44] Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử người ta đã đẩy mạnh nghiên cứu việc tạo dòng và biểu hiện gen của enzym pectinase trong các tế bào chủ khác nhau (Whitehead, 1995; Surgey, 1996; Dalbogre, 1997; Yakoby, 2000); Tuy nhiên, tế bào chủ được sử dụng nhiều nhất vẫn là Saccharomyces (Gognies, 1999; Gognies, 2001) [44] Enzym pectinase là một nhóm enzym thuỷ phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic, galactose, methanol… Đây là nhóm enzym thứ ba được ứng dụng rộng rãi sau amylase và protease. [9] Enzym pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao và vi sinh vật. Ở thực vật bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, cỏ ba lá. Trong các loại cỏ khác thường chỉ có enzym pectinesterase.[16] Nhiệt độ tối ưu của enzym pectinase thường khoảng 45-550 C[52] 1.1.2. Các nghiên cứu trong và ngoài nước  Nghiên cứu trong nước Đã có nhiều đề tài nghiên cứu trong nước về enzym pectinase, các hướng nghiên cứu tập trung về cảm ứng, thu nhận, khảo sát các đặc tính, tinh sạch, cố định, và ứng dụng enzym pectinase trên đối tượng chủ yếu là vi nấm, đặc biệt từ Aspergillus.  Nghiên cứu ngoài nước Pectinase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới với nhiều khía cạnh rất đa dạng, trong đó điều hoà sinh tổng hợp enzym pectinase cũng được nghiên cứu và đựơc đăng trên nhiều tạp chí. Việc nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase được tiến hành nhiều trên đối tượng khác nhau như: Fusarium oxysporum (Guevara, 1997), Aspergillus japonicus (Maria, 2000), Botrytis cinerea (Wubben, 2000), Rhizopus stolonifer (Blandino, 2001), Aspergillus awamori (Blandino, 2001), Penicillium viridicatum (Dênis, 2002), Trichoderma reesei (Lisbeth, 2003), …Tuy nhiên đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất vẫn là Aspergillus niger (Aguillar, 1987; Maldonado, 1989; Solis-Pereira, 1993; Taragano, 1997; Caltisho, 2000). [18], [21], [22], [24], [27], [32], [34], [37], [45], [48] Ngày nay cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, đa số các chủng vi sinh vật dùng trong nuôi cấy thu nhận enzym pectinase đều là những chủng đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999; Bai, 2004). Nhiều công trình nghiên cứu đã tiến hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzym pectinase của các chủng vi sinh vật như: Couri và công sự (1995) đã nghiên cứu “ Sự thao tác gen trên chủng Aspergillus nhằm làm tăng sự sinh tổng hợp các enzym phân giải pectin “ hay Solis( 1997) đã “ Cải thiện việc sản xuất pectinase dùng các thể lai giữa các chủng Aspergillus” . [20], [23], [39], [46] Qua nghiên cứu các tác giả đều nhận thấy rằng các nguồn cacbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ gây ra ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzym pectinase (Leone, 1987; Solis- Pereira, 1993; Lisbeth, 2003). Enzym pectinase được tổng hợp cảm ứng mạnh trên môi trường có bổ sung pectin hay acid polygalacturonic và sự tổng hợp này bị hạn chế khi môi trường giàu acid galacturonic hoặc glucose (Asguilar, 1987; Taragano, 1997, Guevara, 1997). [18], [27], [31], [32], [45], [48] Theo thời gian nguồn cacbon sử dụng trong nuôi cấy nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng enzym pectinase cũng thay đổi. Vào những năm 90 các tác giả chủ yếu sử dụng các nguồn cabon tinh khiết và bổ sung riêng lẻ từng nguồn cacbon vào môi trường nuôi cấy (Aguillar, 1987; Leone, 1987). Năm 2000, trong công trình nghiên cứu ”Ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đến sự sinh tổng hợp pectinase của Aspergillus japonicus 586”, Maria và cộng sự đã kết hợp nhiều nguồn cacbon vào cùng một môi trường nuôi cấy như: pectin và glucose, pectin và glycerol,...gần đây các nghiên cứu đều hướng tới sử dụng các phế liệu, các chất thải công nông nghiệp để làm nguồn cơ chất sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase (Castilho, 2000; Blandino, 2001; Denis, 2002) [8],[21], [22], [24], [31], [37] 1.1.3. Cơ chất của enzym pectinase Pectin là cơ chất của enzym pectinase. Pectinase rất phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt trong giới thực vật. Về phương diện hoá học, pectin là polisaccharid dị thể mạch thẳng, mạch chính của phân tử do các acid galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết - 1,4 glucosid tạo nên. Các mạch bên của phân tử pectin gồm có rhamnose, arabinose, galactose và xylose. Các nhóm carboxyl* của acid galacturonic có thể được ester hoá một phần bằng các nhóm methyl và được trung hòa một phần hay hoàn toàn bằng các ion Na+, K+ hoặc NH4+, hay bị decacboxyl hoá …[30] Công thức nguyên của acid galacturonic: C6H10O7 Công thức cấu tạo của acid -galacturonic và khung cấu tạo phân tử pectin được giới thiệu ở hình 1.1. Hình 1.1: Cấu tạo của acid -galacturonic và khung cấu tạo của pectin Dựa vào loại biến đổi của khung sườn chính mà pectin được phân loại thành protopectin, acid pectic, acid pectinic, và pectin ( Be Miller, 1986). [30]  Protopectin Đây là dạng pectin nguyên thuỷ. Khi thuỷ phân giới hạn protopectin sẽ tạo ra pectin hay acid pectinic. Đôi khi, protopectin còn là một thuật ngữ dùng để mô tả các hợp chất không tan trong nước được tìm thấy trong các mô thực vật ( Kilara, 1982). [30] Protopectin là thành phần quan trọng của các chất gian bào, làm nhiệm vụ liên kết giữa các tế bào thực vật với nhau. Dưới tác dụng của acid (dung dịch HCl 0.03%), enzym protopectinase hay khi đun sôi, protopectin chuyển hoá thành pectin hoà tan. [16]  Acid pectic ( acid polygalacturonic) Acid pectic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl không đáng kể. Dạng muối của acid pectic gọi là pectat.  Acid pectinic Acid pectinic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl cao. Dạng muối của acid pectinic gọi là pectinat ( Kilara, 1982). Acid pectinic khi tồn tại riêng lẻ có một đặc tính rất độc đáo là hình thành dạng geo với đường và acid, hoặc với một số hợp chất khác như muối canxi( nếu hàm lượng methyl vừa đủ thấp)[30]  Pectin Pectin là tên chung để chỉ một hỗn hợp gồm nhiều thành phần khác nhau mà trong đó acid pectic là thành phần chủ yếu. [30] Bảng 1.1: Hàm lượng pectin trong các loại trái cây [55] Trái cây Hàm lượng pectin (% trọng lượng tươi) Táo 0,71-0,84 Chuối 0,59-1,28 Cà rốt 1,17-2,29 Nho 0,09-0,28 Bưởi 3,30-4,50 Chanh 2,80-2,99 Cam 2,34-2,38 Mơ 0,71-1,32 1.1.4. Phân loại[30] Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzym pectinase được chia thành 3 nhóm chính: - Pectinesterase - Các emzim khử mạch polymer - Protopectinase Sơ đồ 1.1: Sơ đồ phân loại enzym pectinase[30] 1.1.5. Cơ chế hoạt động của enzym pectinase  Trung tâm hoạt động của enzym pectinase Enzym polygalacturonase(pectinase) chứa một vùng có 8-10 vòng xoắn kép β quay về phía phải; trong đó 2 vòng sẽ tạo một khe liên kết với cơ chất. người ta nghiên cứu thấy rằng trung tâm hoạt động của enzym này có chứa 2 axit amin Aspartic và Lysine. Người ta cũng thấy rằng có một Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đấn khả năng xúc tác của enzym. [53] 1.1.5.1. Pectinesterase(PE) Pectinesterase còn được gọi là pectinmethyl hydrolase, xúc tác sự khử ester hoá nhóm methoxyl của pectin, tạo thành acid pectic. Enzym này hoạt động đặc hiệu với nhóm methyleste của acid galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic không bị este hoá. [30] Pectinase Pectinesterase Emzim khử polymer Protopectinase PMG PG PE PE PE Hydrolase Lyase PMGL PGL Endo-PM G Exo-PM G Endo-PG Exo-PG Endo-PM G L Endo-PG L Exo-PG L Exo-PM G L Hình 1.2: Cơ chế hoạt động của enzym pectinesterase(PE) [13] 1.1.5.2. Protopectinase Protopectinase hoà tan protopectin, tạo thành các pectin hoà tan có mức độ polymer hoá cao. [30] 1.1.5.3. Các enzym khử mạch polymer Chia làm 2 tiểu nhóm: a. Enzym thủy phân liên kết glycoside( Hydrolase)  Polymethylgalacturonase (PMG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao. Polymethylgalacturonase gồm 2 loại: - Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin. Hình 1.3: Cơ chế hoạt động của Endo-polymethylgalacturonase (Endo-PMG)[13] -Exo-PMG: phân cắt lần lượt liên kết α-1-4-glycosid của pectin từ đầu không khử của mạch pectin Hình 1.4: Cơ chế hoạt động của Exo-polymethylgalacturonase (Exo-PMG)[13]  Polygalacturonase(PG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic (acid polygalacturonic), gồm 2 loại: - Endo-PG: còn gọi là poly(1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, xúc tác thuỷ phân ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid trong phân tử acid pectic Endo-PMG COOCH3 COOCH3 COOCH3 Exo-PMG COOCH3 Hình 1.5: Cơ chế hoạt động của Endo-polygalacturonase (Endo-PG)[13] - Exo-PG: còn gọi là poly(1,4-α-D-galacturonide) glalacturonohydrolase, xúc tác thuỷ phân lần lượt liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử. Hình 1.6: Cơ chế hoạt động của Exo-polygalacturonase (Exo-PG)[13] b. Enzym cắt (Lyase): Năm 1960, P.Abersheim, lần đầu tiên đưa ra thông báo về phân hủy phân tử pectin không bằng con đường thủy phân. Enzym tham gia vào quá trình đó gọi là pectate lyase. Cơ chế hoạt động của các enzym lyase phân cắt pectin( pectate lyase) được đưa ra như sau: các pectate lyase sẽ đóng góp tối thiểu ba nhóm cấu trúc xúc tác: P+: vô hiệu hóa lực hút của nhóm cacboxylic; B: là một căn cứ tách các proton từ C-5, và A: thực hiện công việc cuối cùng là chuyển giao các proton đến các oxy glycosidic, để lại một liên kết đôi giữa C-4 và C-5.[69] COOH COOH Endo-PG COOH COOH COOH Exo-PG COOH Hình 1.7: Cơ chế hoạt động của các enzym lyase phân cắt pectin [69] Các enzym lyase phân cắt pectin bao gồm:  Polymethylgalacturonate lyase (PMGL): Xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao, có hai loại: - Endo-PMGL: còn gọi là poly(methoxygalacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4- glycosid của pectin. - Exo- PMGL: xúc tác phá vỡ từng nấc phân tử pectin.  Polygalacturonate lyase (PGL): xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic. Có 2 loại: - Endo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4- glycosid của acid pectic. - Exo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide) exolyase, xúc tác phân cắt lần lượt liên kết α-1-4- glycosid của acid pectic từ đầu không khử. 1.1.6. Ứng dụng pectinase Trong lĩnh vực ứng dụng, pectinase được chia làm 2 nhóm chính là : pectinase acid và peatinase kiềm. Pectinase acid chủ yếu thu nhận từ nấm mốc, được dùng trong ly trích và chế biến các loại trái cây, rượu và tạo ra các sản phẩm đơn bào. Pectinase kiềm được ly trích chủ yếu từ vi khuẩn được dùng trong chế biến các loài cây có sợi, trong công nghiệp giấy, xử lí nước thải, lên men trà, cà phê. [30] Bảng 1.2: Một vài ví dụ về pectinase acid và pectinase kiềm của vi sinh vật Vi sinh vật Loại pectinase Aspergillug niger CH4 Endo-pectinase Exo-pectinase Penicillium frequentans Endo-PG Sclerotium rolfsii Endo-PG Pe ct in as es a ci d Rhizoctonia solani Endo-PG Rhizoctonia solani Endo-PG Mucor pusilus PG PG Clostridium thermosaccharolyticum Polygalacturonate hydrolase Bacillus sp. RKG PGL Bacillus sp. NT-33 PG Bacillus polymxa PG Bacillus pumilis PATE Amuloca sp. Pectate lyase Bacillus sp. P-4-N PG Penicillium italicum PMGL Bacillus sp. DT7 PMGL PMGL Pe ct in as es k iềm Bacillus subtilis PAL (Nguồn: Kashyap et al., 2001) 1.1.6.1. Ứng dụng trong công ngiệp nước ép trái cây và rượu vang Pectinase được dùng rộng rãi trong công nghiệp nước ép trái cây và rượu vang. Pectinase được bổ sung nhằm làm tăng hiệu suất li trích nước ép và làm trong nước ép trái cây. Trong công nghiệp nước ép trái cây, người ta thường tạo ra hai loại nước ép là nước ép trong và nước ép đục (hay purée). Phương pháp tạo nước ép trong thường dùng để tạo nước ép táo, lê, nho, dâu,… Phương pháp tạo nước ép đục được dùng để sản xuất nước ép các loại citrus như cam, chanh, bưởi và nước ép xoài, mơ, ổi, đu đủ, thơm chuối,.. Sơ đồ 1.2: Quy trình sản xuất nước ép trái cây[30]  Nước ép trong: Trong quá trình sản xuất nước ép trong, enzym pectinase được bổ sung hai lần (xem sơ đồ 1.2): + Lần một: pectinase có tác dụng làm lỏng lẻo cấu trúc màng tế bào thực vật, giúp làm trong hiệu quả li trích nước ép. + Lần hai: pectinase được bổ sung cùng với một số enzym khác (nếu cần thiết) nhằm làm trong nước ép trái cây.  Nước ép đục hay purée: Quá trình sản xuất nước ép đục chỉ cần bổ sung enzym pectinase một lần đầu tiên (xem sơ đồ 1.2) nhằm làm tăng hiệu quả trích li nước ép. Để ổn định độ đục của nước ép, sau khi ép người ta xử lí nhiệt dịch ép để làm bất hoạt enzym. [30] 1.1.6.2. Dùng làm mềm mô thực vật (Maceration) và cô lập protoplast Trong chu trình sinh sản của thực vật, người ta không thể dùng phương pháp thao tác gen truyền thống để đưa nhiều tổ hợp các đặc tính mong muốn vào tế bào. Ngày nay, người ta sử dụng một phương pháp hiệu quả với thực vật bậc cao là dung hợp các protoplast( tế bào trần) cô lập từ tế bào soma(tế bào sinh dưỡng) trong điều kiện invitro và sau đó phát triển nó thành thực vật lai. Đây có thể là một công cụ Trái cây Nghiền Ép Ly tâm Ly tâm Lọc Cô đặc Nước ép trái cây Bổ sung pectinase lần một Bổ sung pectinase lần một Bổ sung các enzym khác hữu hiệu để làm tăng sự đa dạng gen và tổ hợp các đặc điểm không có trong tự nhiên (Gleba, 1978) Đầu tiên, người ta làm mềm mô thực vật bằng cách sử lí với enzym pectinase, sau đó tiếp tục xử lí với enzym cellulase để chuyển mô này thành protoplast. Nồng độ của enzym là pectinase 0,5%(W/V) và cellulase 5%(W/V), chỉnh pH 5,6 bằng HCl 2N (Tanabe, 1968; Bock, 1983).[ 30] 1.1.6.3. Xử lí nước thải có chứa pectin Nước thải từ công nghiệp chế biến các loại citrus rất giàu pectin. Lượng citrus này chỉ bị vi sinh vật phân hủy trong quá trình xử lí bùn (Tanabe và cộng sự, 1986). Năm 1987, Tanabe và cộng sự đã thử nghiệm một quy trình xử lí nước thải mới bằng cách sử dụng những vi sinh vật ưa kiềm. Chủng Bacillus sp. (GIR 621) được phân lập từ đất của họ có khả năng sản xuất ra enzym endopectat lyase ngoại bào trong môi trường kiềm pH 10,0. Người ta chứng minh rằng chủng vi khuẩn này có khả năng loại bỏ hữu hiệu pectin ra khỏi nước thải. Erwinia carotovora cũng có khả năng tiết endopectat lyase, cũng có tác dụng xử lí nước thải giàu pectin( Tanabe, 1986), tuy nhiên do chúng có khả năng gây bệnh thực vật nên người ta chỉ xử lí gián tiếp bằng enzym phân giải pectin được sản xuất ra từ vi khuẩn này. 1.1.6.4. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy Việc làm giấy là một quá trình lọc liên tục các huyền phù và những phần mịn của sợi, các chất độn vô cơ như đất sét, CaCO3 để tạo thành các phiến giấy. Vì vậy quá trình lọc sẽ ngày càng bị hạn chế do việc thoát nước qua các phiến lọc sẽ ngày càng giảm. Để giải quyết vấn đề này, người ta dùng các khung lọc có kích thước đủ lớn, tuy nhiên những lỗ này cũng làm cho những phần mịn và những chất độn đi qua. Trong công nghiệp làm giấy hiện đại người ta thêm một số chất trợ giúp thẩm tích vào bột giấy để giữ những phần mịn và những chất độn trong các phiến giấy và làm tăng tốc độ thoát nước. Ngày nay, công nghiệp giấy và bột giặt đã bắt đầu đùng enzym pectinase để giải quyết những vấn đề trên trong quá trình sản xuất. [30] Do enzym pectinase kiềm của Bacillus sp. và Erwinia carotovora có tác dụng làm mềm hóa mạnh nên nó được dùng để giầm sợi libe của cây Misumata( Tanabe và Kobayashi, 1987). Những sợi libe đã được giầm này được dùng để sản xuất giấy Nhật như giấy Washi, giấy Wagami, ..( Horikoshi, 1990). Hiệu quả khi giầm bột giấy với vi khuẩn cao tương tự như phương pháp nấu với tro-soda thông thường. [43] 1.1.6.5. Ứng dụng trong quá trình trích li dầu thực vật Trước đây, dầu từ hạt cây cải dầu (Canola), phôi dừa , hạt hoa hướng dương, hạt cọ, quả ôliu được sản xuất theo kiểu truyền thống bằng cách li trích dung môi hữu cơ. Dung môi thường được sử dụng là hexan, một chất có khả năng gây ra ung thư. Ngày nay người ta sử dụng các enzym phân hủy vách tế bào thực vật, trong đó hệ enzym pectinase , để li trích dầu thực vật theo phương pháp li trích với nước. Các enzym này có tác dụng làm hóa lỏng các thành phần cấu trúc vách tế bào của cây có chứa dầu. Gần đây enzym phân hủy vách tế bào đã được dùng trong quá trình li trích dầu ôliu. Các enzym này được thêm vào trong quá trình nghiền hạt ôliu, do đó dầu được phóng thích ra dễ dàng trong quá trình tiếp theo(West, 1996). Ví vậy, việc xử lí enzym làm tăng sản lượng của dầu ôliu. Sự tăng sản lượng này phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, và liều lượng enzym được dùng. [30] 1.1.6.6. Ứng dụng trong lên men trà và cà phê Pectinase đóng vai trò quan trọng trong lên men trà, cà phê. Trong quá trình lên men cà phê, người ta dùng các vi sinh vật phân giải pectin để loại bỏ lớp vỏ nhầy khỏi hạt cà phê( ba phần tư lớp vỏ nhầy này là pectin). Enzym thương mại được phun vào hạt với liều lượng 2-10 g/tấn ở 15-20 0C. Khi được xử lí với enzym pectinase, giai đọan lên men của quá trình chế biến cà phê được thúc đẩy và giảm từ 40-80 giờ còn khoảng 20 giờ. Do việc xử lí cá phê với enzym thương mại thì đắt và không kinh tế nên người ta dùng lớp vỏ nhầy của cà phê thải ra để nuôi vi khuẩn sinh enzym pectinase. Canh trường sau khi lên men được lọc và sau đó phun vào hạt ( Amorim, 1997; Carr,1985; Godfray, 1985). Pectinase nấm mốc được dùng trong chế biến trà. Việc xử lí enzym thúc đẩy quá trình lên men mặc dù liều lượng của enzym phải được đều chỉnh cẩn thận để tránh tổn hại đến lá trà. Việc thêm enzym pectinase cũng cải thiện tính tạo bọt của bột trà bằng cách phân hủy pectin trà (Carr, 1985). [30] 1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS 1.2.1. Vị trí phân loại [51] Cohn (1872) phân loại Bacillus như sau: Bacillus thuộc Giới : Bacteria Nghành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Bacillales Họ : Bacillaceae Giống : Bacillus Hình 1.8: Đặc điểm hình thái của Bacillus[51] 1.2.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus là nhóm vi khuẩn gram dương, có hình que( trực khuẩn). Chúng có khả năng hình thành nội bào tử có hình oval hoặc hình cầu. [51] Bảng 1.3: Đặc điểm các nhóm vi khuẩn Bacillus theo khoá phân loại của Priest [47] Nhóm % G + C Đặc điểm bào tử Đặc điểm sinh lí, sinh hoá Đại diện I 38-54 Phình, hình oval Kỵ khí không nghiêm ngặt, không lên men đường sinh axit B. polymyxa II 33-45 Không phình, hình oval Hiếu khí hoặc hiếu khí không nghiêm ngặt, không lên men đường sinh axit B. subtilis III 39-55 Phình, hình oval Hiếu khí nghiêm ngặt, không lên men đường sinh axit B. brevis IV 36-42 Phình, hình cầu Hiếu khí nghiêm ngặt, một số lên men đường sinh axit B. sphaericus V 39-69 Phình hoặc không, oval Nhiệt độ thích hợp để phát triển: 500C Themophiles VI 52-60 Chịu nhiệt, chịu axit AlicycloBacillua 1.2.3. Đặc điểm sinh thái của Bacillus  Sự phân bố của vi khuẩn Bacillus Phần lớn vi khuẩn Bacillus cư trú trong đất. Một số sống hoại sinh, chúng tiết ra những enzym thuỷ phân cellulose, tinh bột, glucan, pectin và protein. Đại đa số vi khuẩn này thuộc nhóm B. subtilis ( B. cereus, B. licheniformis, B. megaterium, B. pumilus, B. subtilis) và nhóm B. sphaericus. Số lượng vi khuẩn Bacillus quyết định độ phì của đất. Thông thường, đất trồng trọt chứa khoảng 10- 100 triệu cfu/1g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang, vi khuẩn Bacillus rất hiếm. Ngoài những vi khuẩn kể trên, trong đất giàu dinh dưỡng còn có các loài: B. alvei. B. macerans, B. polymyxa. Sự có mặt của vi khuẩn sinh bào tử gắn liền với tính chất đặc trưng của chúng. Ví dụ: trong đất kiềm, có nhiều vi khuẩn ưa kiềm, vi khuẩn ưa nhiệt chiếm ưu thế ở những vùng đất có nhiệt độ cao.[49] Nước và bùn cửa sông có mặt bào tử và tế bào Bacillus, phần lớn là Bacillus nhóm II, đặc biệt B. firmus, và B. lentus thường được phân lập từ nước chứa nhiều natri clorua. Tuy nhiên, số lượng vi khuẩn loại này thường rất ít, nhất là những nơi có nồng độ muối khá cao. Bacillus có mặt ở đại dương tiêu biểu B. firmus, B. licheniformis, B. subtilis và B. marinus.  Bacillus ưu nhiệt, ưa lạnh, ưa kiềm, ưa axit Một trong những đặc điểm hấp dẫn và lôi cuốn sự chú ý đến vi khuẩn Bacillus trong lĩnh vực công nghệ sinh học là khả năng chịu nhiệt, chịu lạnh, chịu axit, chịu kiềm của chúng. Ngay từ đầu thế kỉ, nhiều Bacillus ưu nhiệt đã được mô tả và phân loại. Theo Gordon[42], Bacillus ưu nhiệt có tên B. coagulans, B. stearothermophilus, B. brevis, B. kaustophilus, B. thermodenitrificans. Từ lâu, enzym Bacillus đặc biệt là -amylase của Bacillus ưa nhiệt được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm và công nghiệp dệt [3]. Enzym của Bacillus ưu nhiệt thường chịu được nhiêt độ cao hơn enzym của Bacillus ưu nhiệt trung bình (trừ -amylase chịu nhiệt của B. licheniformis). Nhiều enzym chịu nhiệt đã được đưa ra thị trường như: protease trung tính, lipaza, pullulanaza. Người ta cũng tách được dòng gen tổng hợp - amylase của B. stearothermophilus và biểu hiện tính trạng di truyền trong vi khuẩn ưu nhiệt trung bình giúp giải quyết nhiều vấn đề trong lên men công nghiệp. Bởi thế Bacillus ưu nhiệt là đối tượng nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực: sản phẩm công nghệ, tách dòng gen, nguồn gen có lợi. Đối lập với Bacillus ưu nhiệt, Bacillus ưa lạnh ít được quan tâm hơn. Nhiệt độ để phát triển thích hợp của Bacillus ưa lạnh là: 0-150C, cao nhất: 200C. Bacillus có khả năng phát triển trong môi trường có pH cao (8-9) được gọi là Bacillus ưa kiềm. Đối với Bacillus ưa kiềm bắt buộc, pH thích hợp: 10 hoặc cao hơn. Chúng không phát triển trong môi trường có pH trung tính. Ứng dụng chính của nhóm Bacillus ưa kiềm trong lĩnh vực công nghệ sinh học là sản xuất enzym công nghiệp. Protease của B. licheniformis có những tính chất như: chịu nhiệt, chịu pH và chịu tác nhân oxy hoá được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giặt, chất tẩy. 1.2.4. Đặc điểm sinh lí của Bacillus Phần lớn Bacillus là những vi khuẩn dị đưỡng hoá năng, thu năng lượng do oxy hoá các hợp chất hữu cơ. Một số vi khuẩn ưa nhiệt tự dưỡng không bắt buộc: (B. schlegelli) có khả năng phát triển trong môi trường chỉ có CO2 và CO là nguồn cacbon duy nhất. Một số loài Bacillus (B. subtilis) có khả năng sử dụng các chất vô cơ, trong khi một số loài khác (B. sphaericus, B. cereus) cần các hợp chất hữu cơ (vitamin, axit amin) cho sự sinh trưởng. Đặc biệt Bacillus gây bệnh côn trùng (B. popilliae, B. lentimorbus) có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: NA, NB. [19] 1.2.4.1. Quan hệ với oxy Bacillus có khả năng phát triển và sinh bào tử trong điều kiện hiếu khí, trao đổi năng lượng thông qua quá trình lên men hoặc hô hấp hiếm khí. Phần lớn Bacillus nhóm I kỵ khí không bắt buộc, lên men hầu hết các loại đường. Bacillus nhóm II phần lớn hiếu khí, chỉ một vài loài lên men. B. licheniformis lên men glucoza, sản phẩm chính của quá trình lên men glucoza là : butanediol, glycerol, ethanol, format, acetat, succinate, pyruvat và CO2. B. cereus và B. thurigiensis cũng có khả năng lên men glucoza, tạo ra butanediol và acid. Riêng B. subtilis rất bí ẩn, chúng là những vi khuẩn hiếu khí nghiêm ngặt nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy, sinh axetoin và 2,3-butaediol từ pyruvat bằng con đường axetolactat. Chúng cũng có thể tái sinh NAD- từ phản ứng axetoin thành butanediol. Đến nay vẫn chưa giải thích lý do tại sao chúng không phát triển mạnh trong điều kiện kỵ khí như B. cereus hoặc B. licheniformis. Bacillus nhóm III và VI nhìn chung hiếu khí bắt buộc, không phát triển khi thiếu oxy, nhưng một vài loài khử nitrat bằng phản ứng nitrat kỵ khí. 1.2.4.2. Chuyển hoá cacbon Nhiều loài Bacillus tiết enzym ngoại bào chịu trách nhiệm chuyển hoá các hợp chất cao phân tử trong môi trường (những chất không thể chuyển vào tế bào vì quá lớn) thành các chất có trọng lượng phân tử thấp làm nguồn cabon và năng lượng. Một số enzym ngoại bào phổ biến của Bacillus được tóm tắt ở bảng 1.3. Amylase và protease có lẽ là hai nhóm enzym quan trọng nhất của chủng Bacillus. Bảng 1.3: Một số enzym ngoại bào của Bacillus[38], [40] Enzym Tên chủng Bacillus -Amylase B. amyloliquefaciens, B. caldolyticus, B. coagulans B. licheniformis, B. macerans, B. stearothermophilus B. subtilis, B. subtilis var. amylosacchariticus, Alkalophilic Bacillus spp. β-Amylase B. megaterium, B. polymyxa, Alkalophilic Bacillus spp. Cellulase B. subtilis, B. brevis, B. firmus, B. polymyxa, B. pumilus B. subtilis Chitinase B. circulans Chitosanase Bacillus sp. R-4 Pectate lyase B. circulans, B. polymyxa, B. pumilus, B. sphaericus B. stearothermophilus, B. subtilis, Alkalophilic Bacillus spp. Xylanase B. amyloliquefaciens, B. firmus, B. polymyxa, B. subtilus B. subtilis var. amylosacchariticus Alkalophilic protease Alkalophilic Bacillus spp. Serine-metal protease B. liche._.niformis, B. pumilus Serine protease B. licheniformis, B. pumilus, B. subtilis B. subtilis var. amylosacchariticus Metal protease Metal protease B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. licheniformis B. megaterium, B. polymyxa, B. subtili, B. subtilis var. amylosacchariticus B. thermoproteolyticus, B. thuringiensis Halophilic protease Bacillus sp. Esterase B. subtilis Aminopeptidase B. licheniformis, B. subtilis Tổng hợp enzym ngoại bào của Bacillus được điều khiển bởi cơ chế kiểm tra phức tạp. Hệ thống 2 thành phần protein DegS/DegU kiểm tra tổng hợp enzym ngoại bào (-amylase, β- glucanase, cellulase, xynalase và protease) của Bacillus subtilis và những loài khác đã được công bố[17], [26]. Đường phân tử thấp trong môi trường có thể là sản phẩm của hoạt động enzym ngoại bào được chuyển vào tế bào B. subtilis bằng những con đường khác nhau. CPTS (cabohidrat phosphotransferase system) là hệ thống chính chuyển đường vào tế bào. CPTS gồm hai thành phần : protein nguyên sinh chất và protein đặc trưng đường (sugar-specific protein) ở trong màng. Trong một số trường hợp khác, đường chuyển vào tế bào dưới dạng đường photphat [28] . Những loại đường chuyển vào tế bào bằng CPTS: fructose, sucrose, manitol. Những loại đường không chuyển vào tế bào bằng con đường CPTS: arabinose, glucose, glycerol, maltose, sorbitol, xylose. Riêng đường mannose, raffinose và salicin chuyển vào tế bào chưa được nghiên cứu chi tiết. B. sphaericus và một số loài nhóm III và IV hiếu khí nghiêm ngặt chúng không chuyển hoá hidrat cacbon. Nhiều enzym tham gia quá trình chuyển hoá con đường Embden-Mayerhof không có trong loài B. sphaericus. Thực tế B. sphaericus không thể chuyển hóa hoặc vận chuyển đường hexose hay đường pentose, chúng sử dụng axetat và axit hữu cơ làm nguồn cacbon và năng lượng. 1.2.5. Một vài ứng dụng quan trọng của Bacillus 1.2.5.1. Độc tố diệt côn trùng Một số Bacillus có khả năng tổng hợp thể vùi bào tử bên trong quá trình hình thành bào tử. Thể vùi được cấu thành từ tiền độc tố protein (có tên -endotoxin đối với B. thuringiensis). Thể vùi có hình dạng và kích thước khác nhau. Khi côn trùng ăn phải thể vùi(thường là bào tử), chúng được hòa tan và tiền độc tố trở thành độc tố làm cho ấu trùng ngừng ăn và cuối cùng chết.  Bacillus tổng hợp độc tố diệt côn trùng B. popilliae là một trong những Bacillus sinh độc tố diệt côn trùng được nghiên cứu và ứng dụng đầu tiên [19]. Thực tế B. popilliae chỉ có thể phát triển và sinh bào tử trong ruột ấu trùng bị nhiễm, nhưng người ta cho rằng loài vi khuẩn này tồn lưu liên tục trong đất. B. sphaericus sinh độc tố kép gồm 2 polipeptid có tác dụng gây độc với ấu trùng của một số loài muỗi [29] . Protein này được tổng hợp trong quá trình hình thành bào tử giống protein tiền độc tố của B. thuringiensis. Phần lớn các nghiên cứu đang tiến hành với các chủng thuộc loài B. thuringiensis sinh protein thể vùi trong quá trình hình thành bào tử. Thể vùi có hình dạng khác nhau(hình tháp, hình thoi, hình oval). Ngay cả trong cùng một chủng, đôi khi cũng xuất hiện thể vùi dưới dạng khác nhau. Khi ở thể dinh dưỡng, thể vùi nằm kề với bào tử, nhưng ở một vài chủng, chúng nằm ở màng ngoài của bào tử [33] . Trong tất cả các trường hợp, khi tế bào bị tan, thể vùi và bào tử đều thoát ra ngoài. Phần lớn các chủng B. thuringiensis phân lập được ngiên cứu về tác dụng gây bệnh với côn trùng bộ cánh vảy, nhưng một số tiền độc tố cũng có tác dụng với bộ hai cánh, bộ cánh cứng và có thể cả giun tròn [35]. Bên cạnh đó, một vài chủng B. thuringiensis tiết độc tố - exotoxin bản chất không phải protein. Độc tố này được thử nghiệm với ruồi và không được ứng dụng rộng rãi như -endotoxin. 1.2.5.2. Kháng sinh polipeptid của Bacillus Sự hình thành bào tử của Bacillus thường xảy ra đồng thời với quá trình sinh hóa khác như tổng hợp protein tinh thể trong trường hợp B. sphaericus, B. thuringiensis hay tổng hợp một số chất kháng khuẩn bản chất polipeptid (baxitraxin, tyroxidin, gramixidin, polymixin). Nhiều kháng sinh polipeptid được mô tả chi tiết về tính chất hóa học và chức năng. Căn cứ vào thành phần cấu tạo và chức năng tác dụng mà người ta chia kháng sinh polipeptid thành 3 lớp: - Adeine: kháng sinh polipeptid mạch thẳng, ức chế sinh tổng hợp màng tế bào vi khuẩn - Baxitraxin:kháng sinh mạch vòng, có tác dụng ức chế sinh tổng hợp màng tế bào. - Gramixidin, polymixin, tyroxidin: cấu trúc mạch thẳng hoặc vòng có tác dụng sửa đổi cấu tạo và chức năng của màng [36] Baxitraxin là nhóm quan trọng nhất. Baxitraxin là một loại kháng sinh bản chất polipeptid gồm 12 loại axit amin được tổng hợp từ loài vi khuẩn B. licheniformis và B. subtilis. Baxitraxin bao gồm các đơn vị baxitraxin riêng rẽ có kí hiệu A, A1, B, C, D, E, F1, F2, F3, G, trong đó baxitraxin A chiếm phần lớn (37%)trong các chế phẩm được tạo ra bằng lên men các chủng B. licheniformis. Baxitraxin có công thức tổng quát: C66H103O16N17S, trọng lượng phân tử 1420 Da. Baxitraxin có hoạt tính sinh học đa dạng: kích thích phân giải tế bào, tạo tế bào trần, ngăn cản sự đồng hóa các axit amin tổng hợp mucopeptid thành tế bào. Ngoài ra, baxitraxin còn ức chế hoạt động một số enzym và ức chế sự phát triển của chủng B. licheniformis dưới một số điều kiện nhất định. Tuy nhiên nồng độ kháng sinh đủ để ức chế B. licheniformis cao hơn nhiều nồng độ kháng sinh để ức chế vi sinh vật nhạy cảm. Baxitraxin có hiệu lực chống các vi khuẩn Gram+ như: Actinomyces, Clostridium, Staphylococus, Haemophilus, Neisseria, Coorynebacterium, Diplococcus, Pneumococi nhưng không có hiệu lực với các vi khuẩn Gram ưa khí trừ Gonococi và Menigococi [4] Baxitraxin được ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm để bảo quản thịt cá, trong y học điều chế thuốc chữa bệnh, đặc biệt Zn-baxitraxin là một trong 7 loại kháng sinh được ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi để kích thích tăng trọng và phòng chống bệnh. 1.3. SỰ CẢM ỨNG SINH TỔNG HỢP ENZYM 1.3.1. Hiện tượng cảm ứng Hiện tượng cảm ứng là hiện tượng làm tăng sự tổng hợp enzym trong tế bào, khi bổ sung một chất nào đó vào môi trường nuôi cấy thì thì sự tổng hợp enzym phân giải cơ chất đó sẽ tăng lên đáng kể. Hiện tượng cảm ứng thường biểu hiện rất nhạy cảm ở vi sinh vật, hơn hẳn ở động vật, thực vật.[11] 1.3.2. Đặc điểm của sự cảm ứng Hiện tượng của sự cảm ứng có tính đa hướng và tính hợp đồng. Đặc điểm này được thể hiện ở chỗ: một chất cảm ứng có thể cùng một lúc gây ra sự tổng hợp cảm ứng của một vài enzym. Chẳng hạn chất tổng hợp cảm ứng β- galactosidlactose (hoặc chất cảm ứng tương tự của nó) ngoài khả năng gây ra sự tổng hợp cảm ứng enzym β- galactosidase còn đồng thời gây ra sự tổng hợp cảm ứng của hai enzym khác nữa là galactosid permease (có tác dụng chuyển cơ chất qua màng tế bào) và galactosid transferase. Cả 3 loại enzym này được thực hiện có tính chất hợp đồng về số lượng. Sự cảm ứng thường có tính chất dây chuyền. Trong một hệ thống bao gồm nhiều phản ứng, cơ chất đầu tiên của hệ thống có thể cảm ứng quá trình tổng hợp tất cả các enzym xúc tác cho quá trình chuyển hóa nó. Điều này được thực hiện theo cơ chế sau: trước hết chất cảm ứng làm tăng quá trình tổng hợp enzym tương ứng, sau đó sản phẩm của phản ứng này lại cảm ứng tổng hợp enzym thứ hai để phân giải nó, tiếp theo sản phẩm thứ hai lại cảm ứng tổng hợp cho enzym thứ ba.[11] Hiện tượng cảm ứng thường có tính chất đặc hiệu, ví dụ: khi thêm DL serin vào môi trường nuôi cấy E. coli thì enzym D-serindeaminase được tổng hợp tăng lên 200 lần, trong khi hàm lượng L- serindeaminase chỉ tăng 4 lần, còn L-threonindeaminase thì không thay đổi. Nhưng khi thêm L- threonin vào cũng môi trường ấy thì sự tổng hợp L- threonindeaminase lại chiếm ưu thế. [2] 1.3.3. Lịch sử nghiên cứu sự cảm ứng sinh tổng hợp enzym Jacob, Monod và cộng sự là những người đầu tiên nghiên cứu về sự điều hòa biểu hiện gen. Khi tiến hành nghiên cứu trên operon Lac, họ đã chứng minh được rằng: + Sự điều hòa 3 enzym có liên quan trong chu trình lactose (được mã hóa trong operon Lac) xảy ra ở mức độ biểu hiện gen chứ không phải bằng cách hoạt hóa tiền chất enzym. + Chất cảm ứng tác động vào chất kìm hãm sự phiên mã chứ không phải bằng cách hoạt hóa một “protein cảm ứng”. Sau đó, Gilber và Muller-Hill, những người đã cô lập được chất kìm hãm operon Lac, đã chứng minh in vitro rằng chất kìm hãm này đã gắn vào một vị trí trên ADN đặc hiệu nằm gần promoter của operon Lac. Sau đó, Record và cộng sự đã chứng minh rằng sự liên kết giữa chất kìm hãm operon Lac với DNA hoàn toàn là liên kết tĩnh điện. Năm 1970, Riggs và cộng sự đã chứng minh rằng chất kìm hãm operon Lac nhận biết đích operator của nó với một tốc độ nhanh hơn nhiều so với một phản ứng được điều khiển bằng sự truyền tin. Berg và cộng sự đã phân tích định lượng. Họ đã đưa ra 3 cơ chế xác định làm thế nào chất ức chế xác định vị trí operon của nó. Ba cơ chế đó là sự trượt, sự chuyển đổi hai giai đoạn, và sự di chuyển từ nơi này qua nơi khác[41] 1.3.4. Mô hình cảm ứng operon Lac 1.3.4.1. Cấu trúc operon Lac Dựa vào chức năng của các gen tham gia vào quá trình tổng hợp protein có thể phân thành các loại gen như sau: + Gen Promoter (P): đứng trước gen operator, là vị trí liên kết RNA polymerase. Promoter điều khiển việc nhận biết vị trí khởi đầu phiên mã của RNA polymerase. Ở vi khuẩn, hai trình tự consensus quan trọng trong promoter là TATAAT ( ở vị trí -10) và TTGACA ( ở vị trí -35). Hình 1.9: Cấu trúc của Operon Lac [66] + Gen điều hòa(i): gen này mã hóa cho một protein đặc biệt gọi là chất kìm hãm (repressor). Chất kìm hãm có vai trò “đóng mở” gen operator. Do đó, gen điều hòa có thể kiểm tra quá trình sao chép gen cấu trúc thông qua chất kìm hãm này. Protein kìm hãm được tạo thành từ bốn chuỗi polypeptid (homotetramer). Trên protein kìm hãm có hai vị trí liên kết: một gắn với một trình tự gồm 24 cặp base của operator trong operon Lac và một gắn với chất cảm ứng lactose. Protein kìm hãm gắn với DNA chủ yếu bằng liên kết tĩnh điện được tạo thành giữa các acid amin tích điện dương của protein (ví dụ; Lys, Arg, …) với khung sườn deoxyribose-phosphat tích điện âm của DNA. + Gen operator (O): Ở cạnh nhóm gen cấu trúc, đảm bảo cho quá trình sao mã các gen cấu trúc theo cơ chế ‘đóng mở” tựa công tắc của một dãy đèn. Quá trình sao chép chỉ có thể tiến hành khi gen Promoter của gen điều hòa(Pi) Gen điều hòa(i) Promoter của gen cấu trúc(Plac ) Gen cấu trúcOperator Operon Lac operator ở trạng thái “mở” (không kết hợp với một chất nào cả) và ngừng lại khi nó bị đóng ( kết hợp với một chất đặc biệt gọi là chất kìm hãm). Các gen cấu trúc cùng với gen operator tạo thành một đơn vị sao chép sơ cấp gọi là operon. Sự tổng hợp ARNm được bắt đầu ở một đầu của operon và chuyển qua gen cấu trúc đến đầu kia của operon. + Gen cấu trúc (S): Gen cấu trúc mã hóa enzym (hay protein) cần được tổng hợp. Các gen mã hóa các enzym được xắp xếp liền nhau thành một nhóm trên ADN. Chúng làm khuôn để tổng hợp phân tử ARN thông tin ( mARN) để từ đó tổng hợp nên phân tử protein tương ứng. Trong operon Lac có ba gen cấu trúc:  Gen Z: Mã hóa cho enzym β-galactosidase (β-gal). Enzym này thủy phân lactose thành glucose và galactose. Khi được cảm ứng bằng lactose, số lượng enzym β-galactosidase tăng từ hầu như bằng không lên đến khoảng 2% trọng lượng của tế bào.[67],[68]  Gen Y: Mã hóa cho gen permease. Enzym này làm tăng tính thấm của màng tế bào với các β- galactosid. Permease vận chuyển lactose từ môi trường nuôi cấy qua màng tế bào chất để vào bên trong của tế bào. [67],[68]  Gen A: Mã hóa cho enzym transacetylase. Chức năng của enzym này chưa được hiểu rõ. [67],[68] + CAP: là một trình tự gồm 16 cặp base nằm phía trước promoter, là vị trí mà protein CAP (catabolite activator protein) gắn với DNA. Protein CAP hay còn gọi là protein CRP(cAMP receptor protein) có khả năng hoạt hóa sự biểu hiện của operon Lac. Giống như chất kìm hãm, trên protein CAP có hai vị trí: một gắn với cAMP và một gắn với trình tự CAP trên ADN. Protein CAP chỉ có thể gắn với DNA khi ở trạng thái phức hợp với cAMP. Phức hợp này sẽ gắn vào một vùng nằm phía trước của vùng sẽ liên kết với RNA polymerase (promoter) và che phủ vị trí gắn của chất kìm hãm trên operator. Vì vậy, chất kìm hãm không gắn được vào trên operator, nên thúc đẩy sự phiên mã của RNA polymerase. Việc gắn phức hợp cAMP-CRP vào operon Lac kích thích hạt động của RNA polymerase lên gấp từ 20 đến 50 lần. [67],[68] 1.3.4.2. Sự cảm ứng operon Lac [11], [61], [68] Sự cảm ứng bởi cơ chất ở operon Lac là một quá trình điều hòa phiên mã (điều hòa ở mức độ gen). [61] Năm 1961, Jacob và Monob đã đưa ra mô hình cảm ứng ở operon Lac gồm 5 bước như sau:  Bước 1: Gen điều hòa (gen i) mã hóa tạo ra protein kìm hãm có khả năng gắn vào operator và ức chế sự phiên mã của các gen cấu trúc.  Bước 2: Một chất cảm ứng có phân tử lượng nhỏ tạo ra phức hợp với chất kìm hãm và làm biến đổi chất kìm hãm.  Bước 3: Phức hợp chất cảm ứng-chất kìm hãm không gắn được vào operator.  Bước 4: Sự lỏng lẻo này tạo điều kiện thuận lợi cho sự phiên mã các gen cấu trúc.  Bước 5: Trình tự RNA thông tin được dịch mã thành protein  Khi môi trường nuôi cấy không có chất cảm ứng Trong môi trường nuôi cấy không có chất cảm ứng (lactose), gen điều hòa (gen i) tạo ra protein kìm hãm. Protein này được tổng hợp không có một sự điều chỉnh nào nhưng tồn tại một lượng không đáng kể (khoảng 10-20 phân tử trong tế bào). Protein kìm hãm có ái lực lớn với operator và gắn vào vùng operator của operon Lac, ngăn cản RNA polymerase phiên mã operon Lac. Vì vậy thông tin di truyền trên DNA không được sử dụng. [11] Hình 1.10: Hoạt động của Operon Lac trong môi trường nuôi cấy không có chất cảm ứng[66]  Khi môi trường nuôi cấy có chất cảm ứng Khi có chất cảm ứng trong môi trường nuôi cấy, chất cảm ứng gắn vào protein kìm hãm và làm thay đổi hình dạng của protein này; vì vậy, nó không có khả năng gắn vào operator của operon. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho enzym RNA polymerase trượt trên operon và tiến hành quá trình phiên mã. RNA thông tin được tạo ra trong quá trình phiên mã sẽ tạo ra các enzym β- galactosidase, permaese và transacetylase. [11] Hình 1.11: Hoạt động của Operon Lac trong môi trường nuôi cấy có chất cảm ứng[66] Thực tế trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật, khi môi trường có chứa glucose, chất ức chế operon Lac sẽ gắn vào vùng operator của operon Lac và ngăn cản sự phiên mã. Tuy nhiên, khi có chất cảm ứng của operon Lac (lactose, allolactose,…), chất cảm ứng này sẽ gắn với protein ức chế, vì vậy, nó không có Protein kìm hãm Không có chất cảm ứng Lactose Phiên mã Có chất cảm ứng khả năng tương tác với vùng operator của operon. RNA polymerase có thể gắn vào vùng promoter và tiến hành phiên mã operon đó. Khi môi trường có glucose, operon Lac vẫn bị kìm hãm mặc dù vẫn có chất cảm ứng lactose trong môi trường. Sự kìm hãm này duy trì cho đến khi nguồn glucose cạn kiệt. Sự kìm hãm operon Lac như trên gọi là sự kiềm hãm dị hóa. Sự kiềm hãm dị hóa là do mức độ cAMP thấp trong môi trường có nguồn glucose dồi dào. Vì vậy, nếu ta thêm cAMP vào môi trường giàu glucose thì sự kiềm hãm operon Lac sẽ được giảm đi. Khi lượng glucose trong môi trường giảm thì lượng cAMP sẽ tăng lên , đồng thời, làm tăng gắn chất cảm ứng vào protein kìm hãm Lac; Vì vậy làm tăng sự phiên mã của operon Lac. [68] 1.3.5. Chất cảm ứng Trong số các enzym do vi sinh vật tổng hợp, một số enzym bình thường chỉ được tổng hợp với một lượng rất ít , nhưng hàm lượng của chúng có thể tăng gấp lên nhiều lần khi chúng ta cho thêm một số chất nhất định vào môi trường nuôi cấy. Monob và Cohn (1952) gọi các enzym này là enzym cảm ứng. Chất gây nên hiệu quả này gọi là chất cảm ứng. Chất cảm ứng là cơ chất đặc hiệu của enzym hay những chất tương tự như cơ chất hoặc những sản phẩm trung gian của quá trình biến đổi các chất.[68], [11] 1.3.6. Sinh tổng hợp enzym cảm ứng Cơ thể sống tự tổng hợp cho mình những hệ thống enzym theo nhu cầu và khả năng của cơ thể. Trong cơ thể sống, sự tổng hợp enzym xảy ra một cách liên tục để đổi mới cho những enzym đã bị già cỗi thoái hóa, hoặc thay thế những enzym đã mất đi, hoặc tăng thêm số lượng cho nhu cầu phát triển của cơ thể. Có những enzym được tổng hợp nên với tốc độ ổn định và tồn tại với số lượng ổn định, không phụ thuộc vào trạng thái chuyển hóa của cơ thể; những enzym này được gọi là enzym cấu tạo. Nhưng cũng có những enzym bình thường tồn tại với số lượng tương đối ít, nhiều khi khó phát hiện, chỉ khi có nhu cầu cần thiết thì sự tổng hợp enzym đó mới được thực hiện, làm tăng số lượng lên một cách đột ngột, đó là hiện tượng tổng hợp cảm ứng của enzym và enzym này gọi là enzym cảm ứng. [1] Muốn tổng hợp được enzym cảm ứng cần phải có 4 điều liện sau: a. Có gen tương ứng trong nhiễm sắc thể của tế bào. b. Có đầy đủ các nguyên liệu để xây dựng enzym đó (các acid amin và các hợp phần của coenzym nếu enzym đó gồm hai cấu tử). c. Năng lượng cần thiết cần cho việc tổng hợp enzym. d. Chất cảm ứng. Nếu không có chất cảm ứng thì dù có đủ ba điều kiện trên thì cũng không tổng hợp được enzym. Như vậy, ta có thể coi việc có chất cảm ứng là việc rất cần để thu được những enzym mong muốn. Trong công nghiệp sản xuất enzym, cần phải lựa chọn những chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong môi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất. [11] Hiện tượng tổng hợp cảm ứng của enzym xảy ra khi có chất gây cảm ứng được đưa vào cơ thể. Những enzym cảm ứng thường là những enzym thủy phân (hydrolase). Hiện tượng tổng hợp cảm ứng của enzym thường thấy ở vi sinh vật và ở loài có vú. Ở vi sinh vật, hiện tượng tổng hợp cảm ứng thường thấy nhất là hiện tượng tổng hợp cảm ứng β- galctosidase (một enzym thủy phân các chất β- galactosid) ở E.coli. Ở động vật có vú cũng gặp hiện tượng tổng hợp cảm ứng của nhiều enzym như : tryptophan dioxygenase, threonin dehydrase, invertase,...Hiện tượng tổng hợp cảm ứng ở vi sinh vật có thể xảy ra vài ba phút sau khi cho chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy. Trái lại, ở động vật, hiện tượng này xảy ra chậm hơn nhiều và nồng độ enzym cảm ứng sau nhiều giờ, nhiều ngày, có khi cả tháng mới tăng lên rõ rệt. [1] Sự cảm ứng của enzym là một cơ chế dự bị để đảm bảo cho sự chuyển hóa của tế bào được thực hiện một cách bình thường khi có những thay đổi không thuận lợi trong thành phần của môi trường. [1] Qua nhiều thí nghiệm với nhiều cơ chất khác nhau, người ta nhận thấy những hợp chất cacbon dễ dàng được vi sinh vật đồng hóa có tác dụng kìm hãm và ức chế quá trình tổng hợp enzym cảm ứng. Sự tổng hợp cảm ứng chỉ thấy ở các môi trường không chứa nguồn cacbon dễ đồng hóa (ví dụ: glucose). Ngay khi sự cảm ứng đã bắt đầu ta cũng có thể ngăn cản hiện tuợng này bằng cách cho thêm glucose vào môi trường. Người ta gọi đó là hiệu ứng glucose. [1] Ví dụ: Khi bổ sung glucose vào môi trường sẽ xảy ra hiện tượng ức chế và kìm hãm quá trình sinh tổng hợp amylase. Vì vậy trong sản xuất không nên thêm vào môi trường các nguồn cacbon dễ đồng hóa hoặc chỉ thêm vào một lượng rất hạn chế để tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển lúc đầu mà thôi.[11] 1.3.7. Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzym Thông tin về sự tổng hợp enzym hay bất kì một protein nào đều đã được mã hóa trong nhân tế bào. Vì vậy sự điều hòa sinh tổng hợp enzym (hay protein) có thể xảy ra ở mức độ gen. Cơ chế điều hòa luôn diễn ra theo nguyên tắc tiết kiệm và đạt hiệu quả cao nhất. [1] Sự tổng hợp cảm ứng enzym bởi cơ chất và ức chế tổng hợp enzym bởi sản phẩm cuối cùng là hai quá trình liên quan mật thiết với nhau và được điều hòa trong quá trình phiên mã (điều hòa ở mức độ gen). Cơ chế điều hòa quá trình sinh tổng hợp cảm ứng enzym được giải thích theo học thuyết operon ở E.coli nổi tiếng của Jacob nà Monod năm 1961 (đã được trình bày ở mục 1.3.4). Theo học thuyết này cơ thể sống chỉ tạo ra một lượng đáng kể những enzym cảm ứng khi có mặt chất cảm ứng. Còn những enzym bản thể thường xuyên được tạo thành với mức độ đáng kể hoặc tối đa cả trên môi trường không có chất cảm ứng mà enzym tác dụng. [61] Ngoài cơ chế điều hòa enzym ở mức độ gen như đã trình bày ở trên, trong quá trình sống của tế bào còn có kiểu điều hòa ở mức độ enzym theo nguyên tắc liên kết ngược hay còn gọi là cơ chế dị lập thể (alosteric) điều hòa tổng hợp các chất trao đổi. Sự tổng hợp phần lớn các sản phẩm trao đổi chất thường xảy ra ở nhiều giai đoạn, ở mỗi giai đoạn được thực hiện bởi một enzym xác định. Enzym này khác với những enzym khác ở chỗ ngoài khả năng tác động lên chất cảm ứng còn có tính nhạy cảm với sản phẩm cuối cùng. Sản phẩm cuối cùng được tích tụ trong tế bào tới một nồng độ xác định sẽ ức chế hoạt động của enzym đầu tiên làm cho cả chuỗi phản ứng bị ngừng lại. Enzym tuy vẫn được tổng hợp nhưng bị bất hoạt. Kết quả là tế bào tạm ngừng tổng hợp sản phẩm cuối cùng cho tới khi nào nồng độ chất này không còn dư. Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzym theo nguyên tắc liên kết ngược xảy ra như sau: enzym ở giai đọan đầu kết hợp với sản phẩm cuối cùng làm biến dạng bề mặt hoạt động, do đó nó không còn khả năng xúc tác phản ứng trong chuỗi phản ứng. Người ta gọi biến dạng này là biến dạng dị lập thể và những hệ thống enzym có thể bị biến dạng bởi các chất chuyển hóa được gọi là hệ thống dị lập thể. [11] Dẫn chứng cho quá trình điều hòa dị lập thể là quá trình sinh tổng hợp valin từ acid pyruvic qua bốn giai đoạn nhờ bốn enzym xúc tác tương ứng (hình 1.10). Khi sản phẩm cuối cùng là valin đạt được nồng độ cao nó sẽ tác dụng với enzym ban đầu, làm nó biến dạng và mất hoạt động. [11] Hình 1.12: Sự điều hòa enzym theo nguyên tắc liên kết ngược( biến dạng dị lập thể) [11] Acid pyruvic Acid α- acetolactic Acid α, β- dioxyisovaleric Acid α- cetoisovaleric Valin Enzym I Ức chế enzym Enzym IV Enzym III Enzym II Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Chủng vi sinh vật nghiên cứu: Các chủng Bacillus do phòng thí nghiệm, bộ môn Sinh hóa, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. 2.1.2. Nguyên liệu sử dụng làm cơ chất - Pectin (hãng Merck) - Cà rốt - Vỏ bưởi 2.1.3. Môi trường nuôi cấy  Môi trường giữ giống: MT MPA Cao thịt :5g NaCl :5g Pepton :5g Thạch :20g Nước cất :1lít pH :7,0- 7,2  Môi trường cảm ứng tổng hợp enzym pectinase: MT Czapeck- Dox pectin Pectin :5 g NaNO3 :2g K2HPO4 :1g KCl : 0.5g MgSO4.7H2O : 0.5g Cao nấm men :1g Agar :20g Nước cất : 1lít  Môi trường sản xuất enzym pectinase: MT bán rắn có bổ sung chất cảm ứng Trấu : 20% Cám : 80% Chất cảm ứng : bổ sung từ 1g- 5g chất cảm ứng vào 100g môi trường Độ ẩm ban đầu : 50- 55% 2.2. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT Dụng cụ: thước đo khuẩn lạc, bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, diêm quẹt, que trang, que cấy, giấy lọc, giấy báo cũ, bông mỡ, bông thấm nước, đũa khuấy, phễu, ống đong, nồi nấu môi trường, lò điện, vải lọc … Thiết bị: Nồi hấp vô trùng Tủ cấy vô trùng Tủ sấy Tủ ấm Tủ lạnh Máy đo pH Máy li tâm Cân phân tích điện tử Máy chụp ảnh kỹ thuật số Máy nghiền mẫu Máy đo độ ẩm Máy đo quang phổ UV / Visible Spectrophometre Hóa chất và vật liệu Cao thịt, pepton, cao nấm men, pectinase, agar, cồn, trấu, cám. NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KCl, Lugol và các hóa chất khác sử dụng trong từng phương pháp sẽ nêu cụ thể. 2.3. PHƯƠNG PHÁP 2.3.1. Phương pháp cấy truyền và giữ giống Trên môi trường ghi ở mục 2.1.3. Tiến hành cấy truyền định kì một tháng một lần, để tủ ấm 30- 370C từ 2-3 ngày, sau đó giữ tủ lạnh 2-40C. Trước khi sử dụng phải cấy truyền sang ống thạch mới. [8][2] 2.3.2. Phương pháp xác định sơ bộ khả năng tổng hợp enzym pectinase bằng cách đo đường kính vòng phân giải Nguyên tắc: Cho enzym tác dụng lên cơ chất trong môi trường thạch, cơ chất bị phân hủy, độ đục môi trường giảm, môi trường trở nên trong suốt. Độ lớn của phần môi trường trong suốt phản ánh khả năng hoạt động của enzym.  Phương pháp này chỉ định tính enzym, chỉ đánh giá sơ bộ khả năng tổng hợp pectinase chứ chưa xác định chính xác hoạt độ pectinase. Sử dụng phương pháp cấy chấm điểm trên môi trường ghi ở mục 2.1.3 đã tiệt trùng . Đem ủ 48 h ở 370 C. Sau khi khuẩn lạc có đường kính khoảng 3mm, nhỏ dung dịch lugol vào đĩa, kiểm tra vòng phân giải. Sau đó kết luận các chủng Bacillus đem nghiên cứu có tạo enzym pectinase hay không, nhiều hay ít. [4] [5] [6] 2.3.3. Phương pháp nuôi cấy Bacillus Sau khi hấp khử trùng, các erlen chứa môi trường bán rắn ở mục 2.1.3 được để nguội. Giống vi khuẩn Bacillus được giữ trong ống thạch nghiêng được cấy vào trong các erlen. Cho vào 10ml nước cất vô trùng vào ống thạch nghiêng, hòa đều. Dùng que thủy tinh khuấy nhẹ để các tế bào và bào tử Bacillus hòa lẫn trong nước. Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 600nm. Cho vào mỗi erlen chứa 10g môi trường nuôi cấy một thể tích dịch huyền phù sao cho đạt mật độ tế bào là 105- 106 tế bào / 1g canh trường. Nuôi cấy ở các điều kiện (nhiệt độ, pH,…) thích hợp theo từng thí nghiệm, độ ẩm 50- 60%.[8] 2.3.4. Phương pháp chiết dung dịch enzym từ canh trường nuôi cấy vi khuẩn Cho vào mỗi erlen 50ml nước cất, khuấy trộn trong 30 phút và lọc lấy dịch lọc. đem dịch lọc li tâm 7000vòng/ phút trong 15 phút, thu phần dịch trong bên trên và đem xác định họat tính enzym pectinase trong dung dịch enzym thu được. [21] 2.3.5. Xác định hoạt độ pectinase theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS (acid 3,5-dinitrosalicylic) [25] [50]  Phương pháp so màu Phương pháp so màu là phương pháp phân tích dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định. Dùng phương pháp so màu chủ yếu để xác định lượng nhỏ các chất. Phân tích bằng phương pháp này mất ít thới gian so với các phương pháp hóa học khác.  Nguyên tắc Cho enzym tác dụng với cơ chất là pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic được hiện màu với thuốc thử DNS (acid dinitrosalicylic) và đem đo mật độ quang ở bước sóng 575nm.  Định nghĩa đơn vị hoạt tính Một đơn vị họat tính pectinase là lượng enzym cần thiết để giải phóng một µmol acid D-galacturonic từ pectin trong một phút ở 370C, pH = 4,2.  Hóa chất - Dung dịch đệm acetat 0,1 M, pH 4,2 (dung dịch đệm thí nghiệm) - Thuốc thử DNS: + Dung dịch A: hòa tan trong 300g muối Na-K tartrat kép vào 500ml nước cất. + Dung dịch B: hòa tan trong 10g acid 3,5-dinitrosalicylic vào trong 200ml dung dịch NaOH 2M. Thuốc thử DNS dùng cho phản ứng: trộn dung dịch với dung dịch B, thêm nước cất đủ 1 lít. Chỉ pha chế dung dịch thuốc thử trước khi sử dụng. Giữ trong chai nâu và tránh CO2. - Dung dịch D-galacturonic chuẩn 100 µmol/ml. - Dung dịch pectin 1%: đun nóng 100ml dung dịch đệm thí nghiệm. Trong khi đun và khuấy, cho từ từ 1g pectin, đun và khuấy đến khi tan. Dung dịch trong và có dạng keo. Không đun sôi dung dịch. Làm lạnh và thêm nuớc cho đủ 100ml. Bảo quản ở 40C. - Dung dịch enzym: hòa tan một lượng enzym nhất định trong dung dịch đệm và bảo quản trong ngăn đá.  Cách tiến hành Cho vào ống nghiệm : - 0,5ml dung dịch pectin 1% pha trong đệm acetat 0,1M pH 4,2. - 0,5ml dung dịch enzym pha trong đệm acetat. Lắc đều và ủ ở 370 trong 60 phút. Thêm 3ml thuốc thử DNS, trộn đều và đun sôi chính xác trong 15 phút, sau đó làm lạnh nhanh trong bồn nước lạnh. Thêm 1ml nước cất , lắc đều và đo mật độ quang ở bước sóng 575nm. Đồng thời thực hiện mẫu thử không bằng cách thay 0,5ml dung dịch enzym bằng 0,5ml dung dịch đệm acatat.  Dựng đường chuẩn Xây dựng đường chuẩn với acid D-galacturonic chuẩn có nồng độ từ 0 đến 250mg/ml. Bảng 2.1 : Xây dựng đường chuẩn với acid D-galacturonic (mg/ml). Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Dd acid D-galacturonic 100 mg/ml 0 1 2 3 4 5 Dung dịch đệm(ml) 5 4 3 2 1 0 Nồng độ acid D-galacturonic (mg/ml) 0 1 2 3 4 5 Vẽ đồ thị biểu diễn mật độ quang(OD) theo nồng độ acid D-galacturonic (mg/ml).  Tính kết quả Hoạt độ của enzym pectinase được tính theo công thức sau với đơn vị quốc tế UI: HđPe = (UI/g hay ml) X.n m Trong đó: X: lượng acid D-galacturonic được suy ra từ đường chuẩn(mg/ml) m: khối lượng canh trường(g) n: độ pha loãng HđPe: hoạt độ enzym pectinase (UI/g) 2.3.6. Định lượng pectin theo phương pháp Ca-pectat[13]  Nguyên tắc Dùng kiềm để xà phòng hóa hoàn toàn lượng pectin có trong mẫu vật, chuyển pectin sang dạng acid pectic, rồi dùng CaCl2 để tác dụng với acid này tạo dạng kết tủa Ca-pectat. Sấy khô kết tủa trên giấy đến trọng lượng không đổi, cân kết tủa khô rồi suy ra lượng pectin.  Hóa chất - Dung dịch CH3COOH 1N - Dung dịch NaOH 0,1N - Dung dịch CaCl2 2N: cân 230g pha trong 1 lít nước cất, lọc cẩn thận.  Cách tiến hành Cân 20g nguyên liệu (chứa pectin), giã nhỏ cho vào 100ml nước cất, gia nhiệt tứ 40-450 C, sau 2-3 giờ, lấy dung dịch chiết lần một, tương tự thực hiện lần 2, lần 3 sao cho tổng thể tích dung dịch chiết là 200ml. Lấy 20ml dung dịch này cho vào bình cầu rồi thêm 100ml dung dịch NaOH 0,1 N, để yên 7giờ (có thể qua đêm) sau đó thêm 50ml dung dịch CH3COOH 1N, qua 5 phút lại cho dung dịch CaCl2 2N để yên 1giờ. Đem đun sôi 5 phút, lọc qua giấy lọc đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi, rửa kết tủa Ca- pectat bằng nước cất nóng cho đến khi không còn ion Cl- (dùng dung dịch AgNO3 1% để thử). Sau khi rửa sạch kết tủa, cho giấy lọc vào chén, sấy khô ở 1050C cho đến trọng lượng không đổi. Sự khác nhau về trọng lượng giấy lọc và giấy lọc có kết tủa cho ta biết trọng lượng của Ca-pectat. Vì hàm lượng của canxi trong Caxi-pectat là 8% nên khi tính hàm lượ._.ấm men(%) Mức yếu tố x1 x2 x3 Mức trên(+) 50 8 5 Mức dướ(-) 25 4 1 Mức gốc(0) 35,25 6 3 Điểm sao(+) 55,5 8,4 5,6 Điểm sao(-) 19,5 3,6 0,4 Bảng 3.16: Ma trận thực nghiệm của chủng Bs4 Biến mã hoá Thí nghiệm song song Thí nghiệm x1 x2 x3 Y1 Y2 Y Sy2 1 + + + 389,697 388,795 389,246 0,406802 2 - + + 301,887 301,275 301,581 0,187272 3 + - + 264,203 264,147 264,175 0,001568 4 - - + 175,703 174,581 175,142 0,629442 5 + + - 353,669 355,245 354,457 1,241888 6 - + - 224,804 224,758 224,781 0,001058 7 + - - 230,959 229,531 230,245 1,019592 8 - - - 100,555 99,751 100,153 0,323208 S2y 9,86 9 + 0 0 400,379 401,123 400,751 0,276768 10 - 0 0 251,984 250,264 251,124 1,4792 11 0 + 0 524,287 524,271 524,279 0,000128 12 0 - 0 279,271 277,571 278,421 1,445 13 0 0 + 502,389 500,457 501,423 1,866312 14 0 0 - 452,412 451,124 451,768 0,829472 15 0 0 0 550,73 550,172 550,451 0,155682 Tính đồng nhất phương sai của thông số tối ưu được kiểm tra bằng cách áp dụng chuẩn Kohren G0 = = = 0,19 Chuẩn Kohren được tra ở mức nghĩa  = 0,05 và bậc tự do f = 1(tra bảng 6 phân vị phân bố Kohren với Gp-1 với p = 0,05) Gp = 0,471 G0 < Gp Như vậy là phương sai đồng nhất, tức là các thí nghiệm được tiến hành với cùng một sai số như nhau. Sau khi phân tích ANOVA, phương trình hồi quy được dùng như là một mô hình tiên đoán sản lượng pectinase thu được. Sản lượng pectinase có thể được tiên đoán từ mô hình sau: Y = -2431,01+ 69,93x1 + 437,83x2 + 127,74x3 – 0,08x1x2 + 0,08x2x3 – 0,39x1x3 -0,85x12 – 33,2x22 - 16,87x32 (2) Trong đó Y là hoạt độ pectinase( UI/g CT); x1, x2, x3 lần lượt là nhiệt độ, pH, tỉ lệ cao nấm men(%). Hệ số hồi quy(R2) tính được là 0,9892. Điều này thể hiện rằng có 98,92% số liệu thực nghiệm tương thích với số liệu tiên đoán theo mô hình. Thông thường, giá trị R2 lớn hơn 0,75 thể hiện mô hình tương thích với thực nghiệm. Giá trị R2 tiên đoán là 0,9892 phù hợp với R2 điều chỉnh là 0,9399( độ lệch 0,0493 < 0.2). F tính = 25,36 lớn hơn nhiều so với F05(K1= 10, K2=13) = 2,67 nên hệ số tương quan kép thực sự tồn tại Giá trị của hàm đáp ứng của mỗi thí nghiệm được tính toán từ mô hình tiên đoán và phù hợp 98,92% so với số liệu thực nghiệm. Kết quả được trình bày trong bảng 3.15. Giá trị tiên đoán cao nhất ở các thí nghiệm đã được thực hiện theo mô hình là 579,378UI/g CT. Bảng 3.17: Hoạt độ pectinase theo mô hình tối ưu ở chủng Bs4 Biến mã hoá Thí nghiệm x1 x2 x3 Y thực nghiệm Y mô hình 1 + + + 410,121 399,021 S2y max 1,87 0100 200 300 400 500 600 700 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Stt thí nghiệm Ho ạt độ e nz im p ec tin as e( U I/g C T) Y mô hình Y thực nghiệm 2 - + + 301,581 316,161 3 + - + 264,175 256,556 4 - - + 175,142 165,272 5 + + - 354,457 368,980 6 - + - 224,781 246,773 7 + - - 250,142 227,850 8 - - - 100,153 97,220 9 + 0 0 456,124 393,775 10 - 0 0 251,124 240,062 11 0 + 0 524,279 476,197 12 0 - 0 278,421 300,077 13 0 0 + 501,423 499,519 14 0 0 - 451,768 431,155 15 0 0 0 550,451 579,379 Đồ thị 3.7: Sự tương thích giữa Y thực nghiệm và Y mô hình tối ưu ở chủng Bs4 Nhận xét:Từ đồ thị ta thấy đường phân bố của Y thực nghiệm và Y mô hình bám sát nhau, thể hiện mức độ tin cậy của mô hình tiên đoán sản lượng pectinase Bs4 (2) Từ mô hình hoạt độ của enzym pectinase , các điểm tối ưu được tìm bằng cách đạo hàm Y theo lần lượt các biến được một hệ phương trình bậc một 3 biến số: Y'(X) = 0 = 66,93 – 1,7x1- 0,08x2 – 0,39x3 Y'(X) = 0 = 437,83 - 0,08x1 – 66,4x2 + 0,08x3 Y'(X) = 0 = 127,74-0,39x1 + 0,08x2 – 33,74x3 Giải hệ phương trình thay vào công thức tính toán được sản lượng pectinase tối ưu đạt được (616,653 UI/g CT về mặt lí thuyết với 98,71%) ở các giá trị của các yếu tố: cao nấm men(3,3%), pH(6,5), nhiệt độ(40,1 0C) 3.8. THỬ NGHIỆM MÔ HÌNH TỐI ƯU TRÊN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY BÁN RẮN Thí nghiệm nhằm mục đích kiểm tra kết quả lí thuyết của tối ưu hoá. Từ kết quả tối ưu hoá trên, chúng tôi tiến hành nuôi cấy hai chủng vi khuẩn Bacillus ở điều kiện sau:  Chủng Bl2 (Bacillus licheniformis) - Khối lượng canh trường: 10g - Thời gian nuôi cấy: 72h - Lượng giống cho vào canh trường: 106 tế bào/g canh trường - Độ ẩm 50-60% - Cơ chất cảm ứng: cà rốt - Nguồn nitơ cao nấm men 3,3% - pH: 6,1 - Nhiệt độ: 37,7 0C  Chủng Bs4( Bacillus subtilis) - Khối lượng canh trường: 10g - Thời gian nuôi cấy: 96h - Lượng giống cho vào canh trường: 106 tế bào/g canh trường - Độ ẩm 50-60% - Cơ chất cảm ứng: cà rốt - Nguồn nitơ cao nấm men 3,3% - pH: 6,5 - Nhiệt độ: 40,1 0C Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.18 Bảng 3.18: Hoạt độ pectinase của hai chủng Bs4 và Bl2 khi nuôi cấy trên môi trường tối ưu. Chủng Bacillus OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase thực nghiệm (UI/g CT) Hoạt độ pectinase mô hình (UI/g CT) S2 Bl2 0,354 2,507 695,906 694,489 1,00 Bs4 0,313 2,228 618,552 616,653 1,80 Như vậy: Đối với chủng Bl2, sau khi tối ưu hoá hoạt độ enzym đạt được là 695,909 UI/g CT( gấp 1,07 lần so với trước khi tối ưu). Đối với chủng Bs4, sau khi tối ưu hoá hoạt độ enzym đạt được là 618,552 UI/g CT( gấp 1,06 lần so với trước khi tối ưu). Từ đây chúng tôi thấy được mô hình tối ưu là môt mô hình có ý nghĩa quan trọng gia tăng sản lượng sản phẩm sinh học trong lên men. 3.9. THU NHẬN PECTINASE THÔ TỪ CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY HAI CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS Tiến hành nuôi cấy hai chủng vi khuẩn Bl2 và Bs4 trên môi trường bán rắn theo mục 2.3.3, ở các điều kiện nuôi cấy tối ưu theo mục 3.7. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4. Quá trình tủa enzym bằng cồn lạnh được thực hiện theo mục 2.3.7. Kết quả được trình bày trong bảng 3.24. Bảng 3.19: Kết quả thu nhận enzym thô Bl2 Bs4 Khối lượng canh trường(g) 150 150 Tổng hoạt tính(UI) 108 071,7 102 472,8 Tổng khối lượng trước khi sấy(g) 12,17 10,34 Tổng khối lượng sau khi sấy(g) 7,12 6,53 Tỉ lệ thu nhận chế phẩm pectinase/ canh trường (%) 4,75 4,35 Tổng hoạt tính(UI) 78 421,15 73 306,93 Hiệu suất(%) 72,56 71,54 Hiệu suất thu hồi pectinase thô ở chủng Bl2 đạt 72,56%, ở chủng Bs4 đạt 71,56% tổng hoạt tính. Có thể giải thích nguyên nhân làm cho hiệu suất thu hồi không cao là: i) Nguyên nhân từ thiết bị. Do hạn chế về thiết bị nên chúng tôi phải li tâm bằng máy li tâm thường ở nhiệt độ phòng với dung dịch kết tủa đã được làm lạnh trước. Sau khi li tâm, nhiệt độ tăng lên. Đấy có thể là một nguyên nhân gây biến đổi enzym trong quá trình li tâm làm giảm hoạt tính của tủa enzym. ii) Nguyên nhân từ hiệu suất thu hồi của phương pháp kết tủa bằng cồn. Do thời gian có hạn nên chúng tôi chỉ thực hiện tủa enzym ở tỉ lệ 3 cồn/1 dung dịch chiết enzym. Đây là tỉ lệ tham khảo từ các đề tài nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzym pectinase khác. Chúng tôi chưa nghiên cứu sâu về vấn đề này. Vì vậy kết quả này chưa phải là kết quả tối ưu để tủa petinase từ canh trường nuôi cấy Bl2 và Bs4. iii) Các enzym sau khi tủa hoặc tinh sạch có xu hướng kết tụ lại. Điều này ảnh hưởng rất nhiều đến hoạt tính ủa enzym do các trung tâm phản ứng bị vùi lấp vào bên trong và không phục hồi được sau khi hoà tan trở lại. 3.10. KHẢO SÁT MỘT VÀI ĐẶC ĐIỂM CỦA PECTINASE BS4 VÀ BL2 3.10.1. Khảo sát giá trị pH thích hợp cho hoạt động của enzym Thí nghiệm nhằm xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzym. Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở điều kiện nuôi cấy tối ưu như đã xác định ở trên. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Các phản ứng enzym được tiến hành ở điều kiện: - Nhiệt độ 370 C - Nồng độ cơ chất: 1% - Thời gian phản ứng: 60 phút Tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH đối với hoạt độ pectinase theo mục 2.3.9.1. Kết quả được trình bày ở bảng 3.19 và đồ thị 3.8 Bảng 3.20: Sự biến thiên hoạt độ pectinase của hai chủng Bacillus theo giá trị pH Chủng Bacillus pH OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase (UI/g CT) 5 0,217 1,511 1,294 359,195 6 0,308 2,335 2,027 562,665 7 0,362 2,887 2,525 700,995 8 0,325 2,536 2,211 613,648 9 0,273 2,207 1,934 536,942 10 0,205 1,543 1,338 371,409 Bl2 11 0,176 1,013 0,837 232,339 5 0,103 0,997 0,894 248,068 6 0,212 1,658 1,446 401,388 Bs4 7 0,276 2,077 1,801 499,838 8 0,32 2,603 2,283 633,634 9 0,297 2,455 2,158 599,121 10 0,231 2,103 1,872 519,732 11 0,124 1,352 1,228 340,967 Đồ thị 3.8: Sự biến thiên hoạt độ pectinase của hai chủng Bacillus theo giá trị pH Nhận xét: Ở chủng Bl2, pH tối ưu ở pH 7 với giá trị hoạt độ enzym pectinase là: 700,995 UI/g CT. Đối với chủng Bl2, hoạt độ enzym đạt giá trị tối ưu ở pH 8 với giá trị hoạt độ là 633,634 UI/g CT, khi giá trị pH vượt 8 thì hoạt độ enzym giảm, đến pH 11 hoạt độ enzym chỉ còn 340,957 UI/g CT( bằng 54% so với pH tối ưu) chứng tỏ enzym petinase Bl2 là một enzym chịu kiềm. 3.10.2. Khảo sát nồng độ cơ chất thích hợp cho hoạt động của enzym Thí nghiệm nhằm xác định nồng độ cơ chất thích hợp cho hoạt động của enzym. Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở điều kiện nuôi cấy tối ưu như đã xác định ở trên. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Các phản ứng enzym được tiến hành ở điều kện: - Thời gian phản ứng: 60 phút, pH: 7( với Bl2), 8 (với Bs4), nhiệt độ: 370C Tiến hành khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất đối với hoạt độ pectinase theo mục 2.3.10.2. Kết quả được trình bày ở bảng 3.20 và đồ thị Bảng 3.21: Sự biến thiên hoạt độ pectinase theo nồng độ cơ chất Chủng Bacillus Nồng độ cơ chất(%) OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase (UI/g CT) Bl2 0,5 0,271 1,675 1,404 389,729 700,995 633,634 0 100 200 300 400 500 600 700 800 5 6 7 8 9 10 11 pH Ho ạt độ e nz im p ec tin as e (U I/g C T) Bl2 Bs4 1 0,362 2,887 2,525 700,995 1,5 0,365 2,922 2,557 709,785 2 0,325 2,645 2,320 643,905 2,5 0,275 2,135 1,860 516,401 3 0,205 1,543 1,338 371,409 3,5 0,169 1,013 0,844 234,282 4 0,101 0,812 0,711 197,455 0,5 0,212 1,658 1,446 401,388 1 0,32 2,605 2,285 634,1892 1,5 0,297 2,377 2,080 577,2843 2 0,32 2,057 1,737 482,258 2,5 0,176 1,512 1,336 370,8536 3 0,111 1,207 1,096 304,233 Bs4 3,5 0,104 1,050 0,946 262,595 Đồ thị 3.9: Sự biến thiên hoạt độ pectinase theo nồng độ cơ chất Nhận xét: Ở chủng Bl2 , hoạt độ enzym pectinase tối ưu ở nồng độ cơ chất pectin 1,5% với giá trị hoạt độ là 709,785 UI/g CT; ở chủng Bs4, hoạt độ pectinase tối ưu ở nồng độ cơ chất pectin 1% với giá trị hoạt độ là 634,189 UI/g CT) 3.10.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzym Thí nghiệm nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzym. Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở điều kiện nuôi cấy tối ưu như đã xác định ở trên. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Các phản ứng enzym được tiến hành ở điều kện: 709,785 634,189 0 100 200 300 400 500 600 700 800 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 Nồng độ cơ chất(%) Ho ạt độ e nz im p ec tin as e( UI /g C T) Bl2 Bs4 720,333 683,507 0 100 200 300 400 500 600 700 800 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Nhiệt độ(0C) H oạ t đ ộ e nz im p ec tin as e( U I/g C T) Bl2 Bs4 - Thời gian phản ứng: 60 phút - pH: 7( với Bl2), 8 (với Bs4) - Nồng độ cơ chất: 1,5% với chủng Bl2, 1% với chủng Bs4 Tiến hành khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đối với hoạt độ pectinase theo mục 2.3.10.3. Kết quả được trình bày ở bảng 3.21 và đồ thị 3.10 Bảng 3.22: Sự biến thiên hoạt độ pectinase theo nhiệt độ Chủng Bacillus Nhiệt độ (0C) OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase (UI/g CT) 30 0,214 1,038 0,824 228,823 35 0,236 1,494 1,258 349,202 40 0,35 2,727 2,377 659,912 45 0,365 2,936 2,571 713,671 50 0,372 2,967 2,595 720,333 55 0,289 2,273 1,984 550,636 60 0,254 1,801 1,547 429,424 65 0,221 1,577 1,356 376,498 Bl2 70 0,199 1,132 0,933 258,894 30 0,185 0,755 0,570 158,223 35 0,214 1,277 1,063 294,980 40 0,269 2,033 1,764 489,752 45 0,328 2,610 2,282 633,542 50 0,339 2,715 2,376 659,542 55 0,345 2,807 2,462 683,507 60 0,245 1,954 1,709 474,485 65 0,186 1,572 1,386 384,733 Bs4 70 0,115 0,927 0,812 225,492 Đồ thị 3.10: Sự biến thiên hoạt độ pectinase theo nhiệt độ Nhận xét: Nhiệt độ tối ưu cho hoạt độ của enzym pectinase ở chủng Bl2 là 500C, lúc đó hoạt độ enzym đạt được là 720,333 UI/g CT. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym pectinase Bs4 là 55 0 C với giá trị hoạt độ của enzym là 683,507 UI/g CT. Như vậy pectinase Bs4 là enzym có khả năng chịu nhiệt tốt hơn pectinase Bl2. 3.10.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên lượng D- galaturonic tạo thành Thí nghiệm nhằm xác định thời gian phản ứng của enzym pectinase hai chủng Bacillus để tạo ra lượng D- galaturonic nhiều nhất. Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở điều kiện nuôi cấy tối ưu như đã xác định ở trên. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Các phản ứng enzym được tiến hành ở điều kện: - pH: 7( với Bl2), 8 (với Bs4) - Nồng độ cơ chất: 1,5% với chủng Bl2, 1% với chủng Bs4 - Nhiệt độ: 500C( với chủng Bl2), 550C( với chủng Bs4) Tiến hành khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng đối với hoạt độ pectinase theo mục 2.3.10.4. Kết quả được trình bày ở bảng 3.22 và đồ thị 3.1 Bảng 3.23: Sự biến thiên hoạt độ pectinase theo thời gian phản ứng Chủng Bacillus Thời gian (phút) OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase (UI/g CT) 10 0,214 1,038 0,824 228,823 20 0,236 1,494 1,258 349,202 30 0,35 2,727 2,377 659,912 40 0,365 2,936 2,571 713,671 50 0,372 2,967 2,595 720,333 60 0,289 2,273 1,984 550,636 70 0,254 1,801 1,547 429,424 80 0,221 1,577 1,356 376,498 Bl2 90 0,199 1,132 0,933 258,894 Đồ thị 3.11: Sự biến thiên hoạt độ pectinase theo thời gian Nhận xét: Ở cả 2 chủng Bl2 và Bs4, hoạt độ enzym pectinase đều đạt giá trị cực đại tại 60 p 3.9.5. Khảo sát ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt độ của enzym pectinase Thí nghiệm nhằm xác định khảo sát ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt độ của enzym pectinase. Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở điều kiện nuôi cấy tối ưu như đã xác định ở trên. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Các phản ứng enzym được tiến hành ở điều kện: - pH: 7( với Bl2), 8 (với Bs4) - Nồng độ cơ chất: 1,5% với chủng Bl2, 1% với chủng Bs4 - Nhiệt độ: 500C( với chủng Bl2), 550C( với chủng Bs4) - Thời gian phản ứng: 60 phút Tiến hành khảo sát ảnh hưởng một số ion kim loại đối với hoạt độ pectinase theo mục 2.3.10.5. Kết quả được trình bày ở bảng 3.23 Bảng 3.24: Ảnh hưởng hưởng một số ion kim loại đối với hoạt độ pectinase 10 0,185 0,755 0,570 158,223 20 0,214 1,277 1,063 294,980 30 0,269 2,033 1,764 489,752 40 0,328 2,610 2,282 633,542 50 0,339 2,715 2,376 659,542 60 0,345 2,807 2,462 683,507 70 0,245 1,954 1,709 474,485 80 0,186 1,572 1,386 384,733 Bs4 90 0,115 0,927 0,812 225,492 719,778 684,340 0 100 200 300 400 500 600 700 800 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Thời gian(phút) H oạ t đ ộ e nz im p ec tin as e( U I/g C T) Bl2 Bs4 Chủng Bacillus Ion kim loại OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase (UI/g CT) Tỷ lệ % Không bổ sung 0,37 2,962 2,592 719,408 100,00 Mg2+ 0,387 3,217 2,830 785,566 109,20 Ca2+ 0,365 3,078 2,713 753,088 104,68 Mn2+ 0,254 1,751 1,497 415,637 57,77 Bl2 Zn2+ 0,201 1,276 1,075 298,404 41,48 Không bổ sung 0,342 2,805 2,463 683,692 100,00 Mg2+ 0,343 2,896 2,553 708,767 103,67 Ca2+ 0,351 2,997 2,646 734,490 107,43 Mn2+ 0,235 1,604 1,369 379,921 55,57 Bs4 Zn2+ 0,267 1,757 1,490 413,602 60,49 Nhận xét: Kết quả cho thấy Mg2+ và Ca2+ có tác dụng làm tăng hoạt tính enzym pectinase của cả 2 chủng Bl2 và Bs4. Mn2+ và Zn2+ có tác dụng ức chế hai enzym này. Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN Qua các kết quả thu được, chúng tôi rút ra được một số kết luận sau: 1. Cả sáu chủng Bacillus tiến hành thí nghiệm chọn lọc đều có khả năng tổng hợp pectinase, nhưng mạnh nhất là hai chủng  Chủng Bl2 : Bacillus licheniformis  Chủng Bs4: Bacillus subtilis 2. Khi bổ sung chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy hai chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis thì hoạt độ enzym tăng rõ rệt. Chứng tỏ enzym pectinase là enzym cảm ứng. 3. Các nguyên liệu cảm ứng khác nhau sẽ gây ra hiệu quả cảm ứng sinh tổng hợp pectinase khác nhau. 4. Với chất cảm ứng pectin, nồng độ 3% là thích hợp nhất cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase của hai chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis. 5. Cà rốt là nguyên liệu cảm ứng thích hợp cho việc sinh tổng hợp pectinase của vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis. 6. Đã tối ưu hoá các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, tỉ lệ cao nấm men) cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase của hai chủng vi khuẩn :  Chủng Bl2 : Bacillus licheniformis: - Nguồn nitơ cao nấm men 3,3% - pH: 6,1 - Nhiệt độ: 37,7 0C  Chủng Bs4( Bacillus subtilis) - Nguồn nitơ cao nấm men 3,3% - pH: 6,5 - Nhiệt độ: 40,1 0C 7. Xác định được điều kiện hoạt động tối ưu của enzym pectinase ở hai chủng vi khuẩn Bacillus:  Chủng Bl2 : Bacillus licheniformis: - pH: 7 - Nồng độ cơ chất: 1,5% - Nhiệt độ: 500C - Thời gian phản ứng: 60phút  Chủng Bs4: Bacillus subtilis - pH: 8 - Nồng độ cơ chất: 1% - Nhiệt độ: 550C - Thời gian phản ứng: 60phút 8. Ion Mg2+ và Ca2+ có tác dụng làm tăng hoạt tính, ngược lại, Mn2+ và Zn2+ có tác dụng ức chế enzym pectinase của cả 2 chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis 9. Hiệu suất thu nhận của enzym pectinase từ hai chủng vi khuẩn là: Bacillus licheniformis là 72,56%, Bacillus subtilis là 71,54% 10. Trong hai chủng vi khuẩn Bacillus được chọn lọc thí nghiệm thì Bacillus licheniformis có hoạt độ pectinase cao hơn Bacillus subtilis. Hoạt độ cao nhất xác định được ở chủng Bacillus licheniformis ở các thí nghiệm đã được tiến hành là 720,333 UI/g CT (gấp 1,05 lần hoạt độ pectinase của vi khuẩn Bacillus subtilis: 683,507 UI/g CT). Tuy nhiên pectinase của Bacillus subtilis lại có khả năng chịu kiềm và chịu nhiệt tốt hơn pectinase của Bacillus licheniformis. 4.2. ĐỀ NGHỊ Từ những kết quả nghiên cứu đạt được ở trên , để làm tăng hiệu quả ứng dụng của đề tài này, chúng tôi đề nghị tiếp tục nghiên cứu thêm các hướng sau: 1. Nghiên cứu thêm sự ảnh hưởng của các nguyên liệu cảm ứng khác nhất là các phế phụ liệu của nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm để sinh tổng hợp enzym pectinase của hai chủng vi khuẩn trên, nhằm tận dụng nguồn phế phụ liệu công nông nghiệp và nâng cao giá trị sử dụng của các phế phụ liệu này. 2. Tinh sạch, xác định thành phần, khối lượng phân tử hệ enzym pectinase của hai chủng vi khuẩn này. 3. Nghiên cứu thêm về hệ enzym hydrolase của hai chủng vi khuẩn này. TÀI LIỆU THAM KHẢO  TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Hữu Chấn (1996), Enzym và xúc tác sinh học, Nxb Y Học, Hà Nội. [2] Phạm Thị Ánh Hồng(2003), kĩ thuật sinh hóa, Nxb đại học quốc gia TP.HCM. [3] Trương Phước Thiên Hoàng (2007), Khảo sát hoạt tính một số hệ enzym thủy phân amylase, cellulase, pectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ các loại đất khác nhau thuộc khu vực Miền Đông Nam Bộ. Luận văn Thạc sĩ Sinh [4] Nguyễn Đình Lạc, Trần Văn Sỹ, Võ Thị Thứ và ctv, 1990. Nghiên cứu kĩ thuật sản xuất baxitraxin phục vụ chăn nuôi. Đề tài cấp nhà nước. mã số 52D – 01 – 16. Chương trình Công nghệ sinh học. [5] Lương Đức Phẩm, Tăng Thị Chính, Trần Đình Mẫn.1995. Nghiên cứu thu nhận - amylase chịu nhiệt theo phương pháp bề mặt với chủng Bacillus. Tạp chí Khoa Học Và Công Nghệ, 1:15-20. [6] Lê Hồng Phú (2003), Nghiên cứu sinh tổng hợp enzym pectinase và cellulase từ Aspergillus niger và ứng dụng trong sản xuất phân hữu cơ, Luận án thạc sĩ Khoa Sinh Học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP. HCM. [7] Lê Thị Hồng Nga(2005), Nghiên cứu sự sinh tổng hợp cảm ứng pectinase và cellulase của một số chủng nấm mốc, Luận án thạc sĩ Khoa Sinh Học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP. HCM. [8] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm công nghệ sinh học (tập 2- thí nghiệm vi sinh vật học). NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh [9] Nguyễn Đức Lượng(2002), Công nghệ vi sinh, tập 2, Nxb đại học quốc gía TP. HCM. [10] Đặng Thị Thu (2002), Công nghệ enzym, Nxb Khoa Học Và Kỹ Thuật, Hà Nội. [11] Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng (1978), vi sinh vật tổng hợp, Nxb Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội. [12] Đồng Thị Thanh Thu (1998), Giáo trình sinh hóa cơ bản, Tủ sách Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM [13] Nguyễn Quang Tâm(2002), Nghiên cứu một số enzim pectinase hòa tan và enzim pectinase cố định thu nhận từ các chủng nấm mốc, Luận văn Thạc Sĩ Khoa Học Sinh Học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp. HCM [14] Lê Đức Ngọc(1998), xử lí số liệu và kế hoạch hóa thực nghiệm, Đại học Khoa Học Tự Nhiên. Đại học Quốc gia Hà Nội. [15] Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Thượng Lệnh, Văn Đức Chính (1997), Thực tập lớn sinh hóa, Nxb Đại học Quốc gia TP. HCM. [16] Lê Ngọc Tú, Nguyễn Chúc (1975), Men và công nghệ thực phẩm, Nxb Khoa Học Và Kĩ Thuật, Hà Nội [17] Lê Ngọc Tú (1982), Enzym vi sinh vật, tập 1, Nxb Khoa Học Và Kỹ Thuật, Hà Nội.  TIẾNG ANH [18] Aguillar, G.; Huitron, C. (1987), “ Stimulation of production of extracellular pectinolytic activities of Aspergillus sp.. by galacturonic acid and glucose additions”, Enz. Microbiol. Technol., 9, pp. 690-696. [19] Bulla J.A, Costilow R, Sappe E.S.1978. Biology of Bacillus popilliae. Adv. Appl. Microbiol. 23: 1- 18. [20] Bai, Z.H.; Zhang, H.X.; Qi, H.Y. Peng, X.W. (2004), “ pectinase production by Aspergillus niger using wastewater in solid state fermentation for eliciting plant disease resistance”, Bioresource Technology, 95, pp. 49-52. [21] Blandino, A.; Dravillas, K.; Cantero, D.; Pandiella, S>S; Webb, C. (2001), “Utilisation of whole wheat flour for the production of extracellular pectinase by fungal strains”, Process Biochemistry, 37, pp. 497-503. [22] Castilho, L.R.; Medronho, R>A.; Alves, T.L.M. (2000), “ Prodution and extraction of pectinase obtained by solid state fermentation of agroindustrial residues with Aspergillus niger”, Bioresource Technology, 71, pp. 45-50. [23] Couri, S.; Terzi, S.D.C; Pinto, D.A.S (2000), “ Hydrolytic enzyme production in solid state fermentation by Aspergillus niger3T5B8”, Process Biochemistry, 36, pp. 255-261. [24] Dênis Silva (2002), “Pectinase production by Penicillium viridicatum RFC3 by solid state fermentation using agricultural waste and agro-inductrial byproducts” 33,pp. 318-324. [25] Droby, S.;Wisniewski,M.E; Cohen,L.; Weiss, B.; Touitou, D.; Eilam, Y.; Chaulutz, E(1997), “ Influence of CaCl2 on Penicillium digicatum, Grapefruit Peel tissue, and Biocontrol Activity of Pichia guilliermondii”, phytopathology, 87, pp.310-315. [26] Bourret R.B, Borkovich K. A, Simon M. I. 1991. Signal transduction pathways involving protein phosphoylation in prokaryotes. Annu. Rev. Biochem. 60: 401-422. [27] Guevara, M.A.; Gonzalez-Jen, M.T.; Estevez P. (1997), “Multiple forms of pectic lyases and polygalacturonase from Fusarium oxysporum f.sp redicais lycopersici: Regulation of their synthesis by galacturonic acid”, Canadian J. Microbiol., 43, pp.245-253. [28] Meadow N. D, Fox D. K, Roseman. S. 1990. The bacterial phosphoenolpyruvate glucose phosphotransferase system. Anmu. Rev. Biochem. 59: 497-592. [29] Baumann P, Clark A. M, Baumann. L, Broadwell H. A. 1991. Bacillus sphaericus as a mosquito pathogen. Properties of the organisms and its toxins Microbiol. Rev.55: 425-436 [30] Kashyap, D.R.; Vohra P.K., Chopra, S.; Tewari,R.(2001), “Application of pectinase in the commercial sector: a review”, Bioresource Technology, 77,pp. 512-227. [31] Leone, G.; Heuvel, J.; Van Den Heuvel J. (1987), “Regulation by carbohidrates of the sequential in vitro production of pectic enzymes by Botrytis cinerea”, Canadial J. Bot.,6,pp. 2133-2141. [32] Lisbeth Olsson, Kim P. Hansen (2003), “influence of the carbon source on production of cellulase, hemicellulase and pectinase by Trichoderma reesei Rut C-30”, Enzym and Microbial Technology, 33, pp. 612-619. [33] Aronson A. I and Fitz J. 1976. Structure and morphogenesis of the bacterial spore coat. Bacteriol. Rev. 40: 360-402. [34] Maldonado, M.C.; Saad, A.M.S.; Callieri, D.A.S. (1989), “Regulatory aspects of the synthesis of polygalacturonase and pectinesterase by Aspergillus niger:, Si. Aliments, 9, pp. 101-110. [35] Edwards D.L, Payner J, Soares G. G. 1990. Novel isolates of Bacillus thuringiensis having activity against Nematodes. U.S. Patent 4: 734-948 [36] Stanier J. Y, Ingraham. J. L, Wheellis M. L, Paninter D, R. 1990. General Microbiology, Macmilan Education Ltd. Fith adition: 475-486. [37] Maria, T.F.S.; José L.F.L (2000), “Carbon sources effect on Pectinase production from Aspergillus japonicus 586”, Brazilian Journal of Microbiology, 31(4). [38] Matsuzaki, H., K. Yamane, K. Yamaguchi, Y.Nagata, and B. Maruo. 1974. Hybrid a-amylases produced by transformants of Bacillus subtilis. I. Purification and characterization of extracellular a-amylases produced by the parental strains and transformants. Biochim. Biophys. Acta 356:235- 247. [39] Octavio L.; Jesús Aguirre (1999), “Pectinase production by a diploid construct from two Aspergillus niger overproducing mutants”, Enzym and Microbial Technology, 25, pp. 103-108. [40] Shinke, R., H. Nishira, and N. Mugibayashi. 1974. Isolation of -amylase producing microorganisms. Agr. Biol. Chem. 38:665-666.. [41] Peter H. von Hippel (2004), “Completing the view of transcriptional Regulation”, Science, 35,pp.350-352. [42] Gordon R. E, Hayner W. C, Pang N. H.C.1973. The genus Bacillus, United states Department of Agriculture. Washington. D.C. [43] Reid, I.; Ricard, M. (2000), “Pectinase in papermaking: solving retention problems in mechanical pulps bleached with hydrogen peroxide”, Enzym and Microbial Techolog, 26, pp.115-123. [44] Sathyanarayana, N.G; Panda, T. (2003), “Purification and biochemichal properties of microbial pectinase – a review”, Process biochemistry, 38, pp. 985-996. [45] Solis- Pereira, S.; Favela-Torres, E.; Viniegra-Gonzales, G.; Gutierrez-Rofas, M. (1993), “Effect of different carbon source on the synthesis of pectinase by Aspergillus niger in submergered and solid state fermentation”, Appl. Microbiol. Biothnol., 39, pp. 36-41. [46] Solis, S.; Flores, M.E.; Huitron, C (1997), “ Improvement of pectinase production by interspecific hybrids of Aspergillus Strain”, Lett. Appl. Microbiol,24,pp. 77-81. [47] Priest G.F.Fellow G. M, Tood. C. 1998. A Numerical classification of the genus Bacillus. J. Gen. Microbiol. 134: 1847-1882. [48] Taragano, V.; Sachez, V.E.; Pilosof, A.M.R. (1997), “Combined effect of water activity depression and glucose addition on pectinases and protease production by Aspergillus niger”, Biotechnol.Lett., 19,pp. 223-226. [49] Priest G.F. 1993. Genus Bacillus. In: Bacteriology 1: 368-397. Edited by Rehm H. J and Reed G in cooperation with puhler A and Stadler P. Weinherm. [50] Wang, G.;Michailides, T.J.;Bostock,R.M(1997), “ improved detection of polygalcturonase activity due to mucor piriformis with a modified dinitrosalicylic acid reagent” phytopathology, 87,pp. 161- 163.  INTERNET [51] [52] [53] [54] state-fermentation-conditions [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] PHỤ LỤC 1. ĐỒ THỊ CHUẨN ACID GALACTURONIC ĐỂ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PECTINASE THEO PHƯƠNG PHÁP SO MÀU THUỐC THỬ DNS Bảng 1: Tương quan giữa giá trị OD575nm và nồng độ acid D-galacturonic (mg/ml) Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Nồng độ mg/ml 0 1 2 3 4 5 OD575nm 0,003 0,140 0,295 0,431 0,582 0,724 OD575nm 0 0,137 0,292 0,429 0,579 0,721 Đồ thị 1: Tương quan giữa giá trị OD575nm và nồng độ acid D-galacturonic (mg/ml) 2. MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN LUẬN VĂN 2.1. Vòng phân giải pectin bởi pectinase ở sáu chủng Bacillus y = 0,1441x R2 = 0,9999 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ D-galacturonic(mg/ml) O D Hình 1: Sự phân giải pectin bởi pectinase B. aureus trên môi trường Czapeck-Dox pectin. Hình 2: Sự phân giải pectin bởi pectinase B. subtilis(BS1) trên môi trường Czapeck-Dox pectin. Hình 3: Sự phân giải pectin bởi pectinase B. subtilis(Bs3) trên môi trường Czapeck-Dox pectin. Hình 4: Sự phân giải pectin bởi pectinase B. licheniformis( Bl2) trên môi trường Czapeck-Dox pectin. Hình 5: Sự phân giải pectin bởi pectinase B. subtilis (BS4) trên môi trường Czapeck-Dox pectin. Hình 6: Sự phân giải pectin bởi pectinase B. subtilis (BS2) trên môi trường Czapeck-Dox pectin 2.2 Thu chế phẩm petinase thô từ canh trường nuôi cấy hai chủng Bacillus Hình 7: Tủa enzim ở chủng B. licheniformis (Bl2) bằng cồn Hình 8: Tủa enzim ở chủng B. subtilis (Bs4) bằng cồn Hình 9: Enzim sau khi sấy khô ở chủng B. licheniformis (Bl2) Hình 10: Enzim sau khi sấy khô ở chủng B. subtilis ( Bs4) ._.