Nghiên cứu sử dụng CO2 hòa tan để kéo dài thời gian tồn trữ sữa tươi nguyên liệu

Trường Đại Học Cần Thơ, quí thầy cô Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã truyền đạt những kiến thức bổ ích cho chúng em trong suốt thời gian học tập vừa qua. Em xin chân thành cảm ơn cô Dương Thị Phượng Liên đã tậntình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành tốt quyển báo cáo này. Xin chân thành cảm ơn cán bộ phụ trách phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, các bạn sinh viên Công Nghệ Thực Phẩm khóa 28 đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài luận văn. Kính chúc quí Thầy Cô và các bạn sức khỏe và thành công. Chân thành cảm ơn. Sinh viên thực hiện Ngô Khánh Thuận Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng ii TÓM TẮT Phần nội dung: “Nghiên cứu sử dụng CO2 hòa tan để kéo dài thời gian tồn trữ sữa tươi nguyên liệu” nhằmmục đích tìm ra thời gian sục CO2 ở áp suất nhất định, ứng với hàm lượng CO2 hòa tan thích hợp cho quá trình bảo quản sữa tươi nguyên liệu trong thời gian dài. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của CO2 hòa tanđến khả năng bảo quản sữa tươi nguyên liệu được tiến hành với ba thời gian sục CO2 là 5 phút, 10 phút và 15 phútở cùng áp suất 2Kg/cm2, so sánh với mẫu đối chứng pH =6,9, đối chứng pH bằng với pH của mẫu sục CO2 nhiều nhất và mẫu thanh trùng nhiệt ở 72oC trong 30 giây. Kết quả cho thấy: Sữa được xử lý bằng CO2 sẽ có thời gian tồn trữ dài hơn so với các mẫu không xử lý. Ở thời gian sục CO2 15 phút thì thời gian tồn trữ sữa tươi dài nhất do hàm lượng CO2 hòa tan cao nên có tác động kiềm hãm vi sinh vật tốt nhất. Tuy nhiên, chưa thấy được tác động đáng kể đến hoạt động của enzyme protease do vi sinh vật tạo thành. Trên cơ sở kết quả của thí nghiệm trên, chọn được thời gian sục CO2 thích hợp tồn trữ sữa tươi nguyên liệu là 15 phút, với chế độ xử lý này có thể giữ được sữa tươi nguyên liệu trong 26 ngày. Tiến hành khảo sát có sự khác biệt hay không khi sử dụng sữa bảo quản bằng CO2 hòa tan vào chế biến hai sản phẩm tiêu biểu từ sữa là sữa tiệt trùng và sữa lên men so với nguyên liệu sữa tươi và sữa được bảo quản bằng thanh trùng nhiệt, kết quả cho thấy: Không có sự khác biệt về tốc độ lên men cũng như giá trị cảm quan giữa mẫu sữa được bảo quản bằng CO2 hòa tan so với mẫu sữa tươi và sữa được bảo quản bằng xử lý nhiệt. Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn..................................................................................................................................i Tóm tắt.......................................................................................................................................ii Mục lục.....................................................................................................................................iii Danh sách hình ..........................................................................................................................v Danh sách bảng.........................................................................................................................vi Chương I Đặt vấn đề ...............................................................................................................1 Giới thiệu ..................................................................................................................................1 Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................................1 Chương I Lược khảo tài liệu .................................................................................................2 2.1 Thành phần hóa học của sữa ...............................................................................................2 2.1.1 Nước ................................................................................................................................2 2.1.2 Chất béo ...........................................................................................................................2 2.1.3 Các hợp chất chứa Nitơ ...................................................................................................3 2.1.4 Glucid ..............................................................................................................................5 2.1.5 Enzyme ............................................................................................................................6 2.1.6 Vitamin ............................................................................................................................7 2.1.7 Khoáng ............................................................................................................................7 2.1.8 Các hợp chất khác ............................................................................................................8 2.2 Vi sinh vật trong sữa ...........................................................................................................8 2.2.1 Vi khuẩn ..........................................................................................................................8 2.2.2 Nấm men .........................................................................................................................9 2.2.3 Nấm mốc .........................................................................................................................9 2.3 Tác động của CO2 hòa tanđối với vi sinh vật ..................................................................10 2.3.1 Tác động kìm hãm của CO2 hòa tanđối với vi khuẩn ...................................................10 2.3.2 Tácđộng của CO2 lên bào tử .........................................................................................10 2.3.3 Tác động của CO2 đối với enzyme ................................................................................11 2.4 Cơ chế tác động của CO2 đến sự phát triển của vi sinh vật ..............................................11 2.4.1 Sự chiếm chỗ của O2 bởi CO2 ........................................................................................11 2.4.2 Làm giảm pH của sữa ....................................................................................................12 2.4.3Ảnh hưởng trực tiếp của CO2 đến vi khuẩn ..................................................................12 2.5Ảnh hưởng của CO2 đến chất lượng sữa tươi nguyên liệu ...............................................13 2.5.1 Tác động của CO2 hòa tanđến sự phát triển của vi sinh vật trong sữa tươi ..................13 2.5.2 Tác động của CO2 hòa tanđến các biến đổi vật lý và sinh hóa của sữa tươi ................14 Chương II Phương tiện và phương pháp thí nghiệm ...........................................................16 3.1 Phương tiện thí nghiệm ....................................................................................................16 3.1.1 Nguyên liệu chính ..........................................................................................................16 3.1.2 Thiết bị ...........................................................................................................................16 3.1.3 Hóa chất .........................................................................................................................16 3.2 Bố trí thí nghiệm ...............................................................................................................17 3.2.1 Thí nghiệm 1 ..................................................................................................................17 3.2.2 Thí nghiệm 2 ..................................................................................................................19 3.3 Phương pháp đo đạc - phân tích ......................................................................................20 3.4 Phương pháp phân tích số liệu ..........................................................................................20 Chương IV Kết quả thảo luận ...............................................................................................21 4.1Ảnh hưởng của phương pháp xử lí đến các chỉ tiêu chất lượng của sữa tươi nguyên liệu..................................................................................................................21 Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng iv 4.1.1Ảnh hưởng của phương pháp xử lí đến sự thay đổi pH của sữa trong thời gian bảo quản.......................................................................................................................22 4.1.2Ảnh hưởngcủa phương pháp xử lí đến sự thay đổi độ acid của sữa trong thời gian bảo quản.......................................................................................................................23 4.1.3 Ảnh hưởng của phương pháp xử lí đến sự thay đổi màu sắc của sữa trong thời gian bảo quản.......................................................................................................................23 4.1.4Ảnh hưởng của phương pháp xử lí đến sự thay đổi NH3 của sữa trong thời gian bảo quản.......................................................................................................................24 4.1.5Ảnh hưởng của phương pháp xử lí đến sự thay đổi mật số VSVTS trong thời gian bảo quản.......................................................................................................................25 4.2Ảnh hưởng của thời gian sục CO2 đến một số chỉ tiêu chất lượng của sữa tươi nguyên liệu..................................................................................................................25 4.2.1Ảnh hưởng của thời gian sục CO2 đến biến thiên pH ....................................................26 4.2.2Ảnh hưởng của thời gian sục CO2 đến biến thiên độ acid..............................................27 4.2.3Ảnh hưởng của thời gian sục CO2 đến màu sắc của sữa................................................27 4.2.4Ảnh hưởng của thời gian sục CO2 đến độ tăng mật số VSVTS.....................................28 4.3Ảnh hưởng của CO2 hòa tanđến tốc độ lên men ..............................................................30 4.4Ảnh hưởng của CO2 hòa tan sau một thời gian bảo quản đến giá trị cảm quan của sản phẩm sữa tiệt trùng .........................................................................................30 Chương V Kết luận và đề nghị..............................................................................................32 5.1 Kết luận.............................................................................................................................32 5.2 Đề nghị..............................................................................................................................32 Tài liệu tham khảo...................................................................................................................33 Phụ lục 1..................................................................................................................................vii Phụ lục 2...................................................................................................................................ix Phụ lục 3....................................................................................................................................x Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng v DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Sơ đồ phân bố các hợp chất chứa Nitơ trong sữa.........................................................3 Hình 2: Cấu trúc micele của casein..........................................................................................4 Hình 3: Công thức cấu tạo của đường lactose...........................................................................5 Hình 4:Ảnh hưởng của CO2 hòa tanđến pH của sữa nguyên liệu ở 38oC từ hai nông trại khác nhau..........................................................................................15 Hình 5: Máy cất đạm...............................................................................................................16 Hình 6: Máyđo màu clorimeter..............................................................................................16 Hình 7: Máyđo pH..................................................................................................................16 Hình 8: Sơ đồ bố trí sục CO2 .................................................................................................18 Hình 9: Giữ lạnh sữa trong bình inox chịu áp suốt quá trình sục CO2 .....................................................18 Hình 10:Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH của sữa theo phương pháp xử lí và thời gian bảo quản..........22 Hình 11:Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ acid của sữa theo phương pháp xử lí và thời gian bảo quản..................................................................................................23 Hình 12:Đồ thị biểu diễn sự thay đổi màu sắc của sữa theo phương pháp xử lí và thời gian bảo quản..................................................................................................23 Hình 13:Đồ thị biểu diễn sự thay đổi NH3 của sữa theo phương pháp xử lí và thời gian bảo quản..................................................................................................24 Hình 14:Đồ thị biểu diễn sự thay đổi mật số VSVTS của sữa theo phương pháp xử lí và thời gian bảo quản..................................................................................................25 Hình 15:Đồ thị biểu diễn biến thiên pH theo thời gian sục CO2 và thời gian bảo quản........26 Hình 16:Đồ thị biểu diễn biến thiên độ acid theo thời gian sục CO2 và thời gian bảo quản........ 27 Hình 17:Đồ thị biểu diễn sự thay đổi màu sắc theo thời gian sục CO2 và thời gian bảo quản........ 28 Hình 18:Đồ thị biểu diễn độ tăng mật số VSVTS theo thời giansục CO2 và thời gian bảo quản..................................................................................................28 Hình 19:Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa thời gian sục CO2 và các thành phần chất lượng của sữa.............................................................................29 Hình 20:Đồ thị biểu diễn độ acid sinh ra theo phương pháp xử lí và thời gian lên men........30 Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng vi DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần hóa học của một số loại sữa.....................................................................2 Bảng 2: Thành phần chất béo trong sữa bò ...............................................................................3 Bảng 3: Tỷ lệ thành phần -lactose anhydrous vàα-lactose monohydrate (theo khối lượng) tại các giá trị nhiệt độ khác nhau...................................................6 Bảng 4: Hàm lượng một số vitamin trong sữa bò .....................................................................7 Bảng 5: Thành phần một số nguyên tố vi lượng trong sữa bò ................................................. 8 Bảng 6: Ảnh hưởng của CO2 trên sự phát triển của một số loài vi khuẩn...............................10 Bảng 7: Phương pháp phân tích các chỉ tiêu ...........................................................................20 Bảng 8: Kết quả phân tích thành phần của nguyên liệu..........................................................21 Bảng 9: Ảnh hưởng của phương pháp xử lí đến các chỉ tiêu chất lượng................................21 Bảng 10: Ảnh hưởng của thời gian sục CO2 đến các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu..................26 Bảng 11: Ảnh hưởng của phương pháp xử lí đến độ tăng độ acid của sữa lên men ...............30 Bảng 12: Kết quả đánh giá cảm quan chất lượng sữa tiệt trùng theo phương pháp xử lí.......31 Bảng 13. Bảng điểm đánh giá sự khác biệt giữa mẫu chuẩn R và mẫu được ghi ám số.........36 Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 1 CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ Giới thiệu Sữa là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng rất hoàn hảo, chứa hầu hết cácchất dinh dưỡng cần thiết cho con người như: protein, glucide, lipid, khoáng, các vitamin,.. Chính vì vậy mà sữa cũng là môi trường thuận lợi cho các vi sinh vật sinh sản và phát triển. Có rất nhiều loài vi sinh vật có nguồn gốc khác nhau có thể có mặt trong sữa và gây hư hỏng cho sữa. Từ sữa có thể chế biến được rất nhiều sản phẩm như yaourt, bơ, phomát,…Chất lượng các sản phẩm này phụ thuộc rất lớn vào chất lượng sữa nguyên liệu. Vì vậy, việc bảo quản tốt sữa nguyên liệu trước khi đưa vào chế biến là công đoạn rất cần thiết nhằm hạn chế sự hư hỏng do vi sinh vật gây ra. Có một số phương pháp thường được sử dụng như: thanh trùng sơ bộ, acid hóa sữa bằng acid hữu cơ, sử dụng carbon dioxide hòa tan (CO2 hòa tan). Gần đây, phương pháp sử dụng CO2 hòa tan để bảo quản sữa nguyên liệu được ứng dụng rất rộng rãi do khả năng kiềm hãm vi sinh vật của nó cũng như không làm biến đổi một số thành phần dinh dưỡng có trong sữa. Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát ảnh hưởng của CO2 hòa tanđến khả năng bảo quản sữa tươi nguyên liệu, đồng thời so sánh hiệu quả của cách bảo quản này với bảo quản bằng phương pháp thanh trùng thông thường sử dụng ở nhà máy. - Khảo sát khả năng sử dụng sữa bảo quản bằng CO2 hòa tan trong chế biến các sản phẩm tiêu biểu từ sữa. Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 2 CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Thành phần hóa học của sữa Hàm lượng các thành phần trong sữa có thể dao động trong một khoảng rộng và phụ thuộc vào các yếu tố di truyền (loại, giống động vật cho sữa), yếu tố môi trường (loại thức ăn, nhiệt độ, mùa trong năm,..), yếu tố về sinh lý (tuổi, sức khỏe,..). Bảng 1:Thành phần hóa học của một số loại sữa Nguồn sữa Protein (%) Casein (%) Whey protein (%) Chất béo (%) Cacbohyrat (%) Tro (%) Người 1,2 0,5 0,7 3,8 7,0 0,2 Ngựa 2,2 1,3 0,9 1,7 6,2 0,5 Bò 3,5 2,8 0,7 3,7 4,8 0,7 Trâu 4,0 3,5 0,5 7,5 4,8 0,7 Dê 3,6 2,7 0,9 4,1 4,7 0,8 Cừu 5,8 4,9 0,9 7,9 4,5 0,8 2.1.1 Nước Nước là thành phần chiếm tỷ lệ rất cao trong sữa. Theo Koeing, lượng nước trong sữa dao động trong khoảng 80,32 –90,37%. Nước là dung môi hòa tan các chất hữu cơ và vô cơ, là môi trường cho các phản ứng hóa học xảy ra. Nước tồn tại ở hai dạng - Nước tự do chiếm khoảng 96 - 97% tổng lượng nước. - Nước liên kết chiếm tỉ lệ rất nhỏ, chỉ khoảng 3 - 4% tổng lượng nước. Hàm lượng nước liên kết phụ thuộc vào thành phần nằm trong hệ keo: protein, các phosphatid, polysaccharide. 2.1.2 Chất béo Chất béo là thành phần quan trọng nhất trong sữa, chiếm khoảng 4% trong sữa. Hầu hết các chất béo sữa đều có dạng hình cầu, đường kính dao động từ 0,1 - 20m. Trong 1ml sữa có khoảng 10 - 15 tỉ hạt cầu béo, nên có thể xem sữa là hệ nhũ tương D/N. Các hạt cầu béo đều được bao bọc bởi một lớp màng có chiều dày 8 - 10nm, có vai trò làm bền hệ nhũ tương trong sữa và bảo vệ không cho các hạt béo kết hợp lại với nhau. Thành phần của lớp màng này gồm có protein, phospholipid và enzyme phosphatase. Các hạt cầu béo có thành phần chủ yếu là glyceride, phospholipid, các acid béo tự do, cholesterol, và một số vitamin tan trong dầu: A, D, E, K. Chất béo sữa được phân làm hai loại - Chất béo đơn giản: Trong công thức phân tử chỉ có C, H, O. - Chất béo phức tạp: Ngoài C, H, O còn có N, P, S,... Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 3 Bảng 2:Thành phần chất béo trong sữa bò Thành phần Hàm lượng (% so với tổng khối lượng chất béo) Ghi chú Chất béo đơn giản - Triglyceride - Diglyceride - Monoglyceride - Cholesteride - Ceride 98,5 95 - 96 2 - 3 0,1 0,03 0,02 Ester của acid béo và cholesterol Ester của acid béo và rượu cao phân tử Chất béo phức tạp 1,0 - Cholesterol - Acid béo tự do - Hydrocarbon - Vitamin A, D, E, K - Rượu: phytol, .. 0,3 0,1 0,1 vết vết 2.1.3 Các hợp chất chứa Nitơ Các hợp chất chứa nitơ trong sữa bò (100%) Protein (95%) Các hợp chất chứa nitơ phi protein Acid amin tự do Casein (75 - 85%) Whey (15 - 25%) Nucleotide αs-casein -lactoglobulin Ure -casein α-lactalbumin Acid uric -casein Proteose-peptone -casein Serum-albumin Immunoglobulin Hình 1: Sơ đồ phân bố các hợp chất chứa Nitơ trong sữa Đáng chú ý ở đây là thành phần protein vì nó chiếm đến 95% các hợp chất chứa nitơ trong sữa bò. Không chỉ vậy, thành phần cũng như tính chất của protein sữa rất phức tạp và ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng sữa. Protein trong sữa bao gồm: casein, whey và phần trên màng hạt béo. Casein Casein là thành phần protein chủ yếu có trong sữa. Chúng tồn tại dưới dạng micele. Mỗi micele chứa khoảng 65% nước, phần còn lại là các loại casein và khoáng (gồm calci, magie, phosphate và citrate). Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 4 Hình 2: Cấu trúc micele của casein Mỗi micele do khoảng 400 - 500 tiểu micele hợp thành. Tiểu micele có dạng hình cầu, đường kính dao động trong khoảngtừ 10 - 15nm bao gồm khoảng 10 phân tử casein kết hợp lại với nhau. Thành phần các casein αs, và trong tiểu micele có thể thay đổi theo những tỉ lệ khác nhau. Các phân tử αs và-casein tập trung tại tâm tiểu micele tạo nên vùng ưa béo, còn phân tử -casein nằm ở vùng biên tiểu micele Trong cấu trúc micele, các tiểu micele liên kết với nhau nhờ các muối phosphate calci và sự tương tác giữa các gốc kị nước. Kích thước micele tùy thuộc vào hàm lượng ion Ca2+ có trong sữa và thường dao động trong khoảng 0,2–0,4m. Phân tử -casein có hai đầu: đầu ưa béo sẽ tương tác với αs và-casein, đầu ưa nước sẽ hướng ra ngoài vùng biên micelle. Do vậy mà chính các phân tử -casein làm cho micelle hòa tan được trong sữa dưới dạng dung dịch keo và ổn định cấu trúc của micelle trong sữa. Nếu vì một lý do nào đó mà -casein tách ra khỏi micele hoặc bị lấy đi phần ưa nước của nó thì các ion Ca2+ sẽ liên kết các micele lại với nhau và tạo nên hiện tượng đông tụ casein. Whey Whey ( protein nước sữa ) ở trạng thái hòa tan trong nước, nên còn được gọi là protein hòa tan. Whey bao gồm rất nhiều protein phức tạp như: albumin, globulin, globulin miễn dịch,..có giá trị dinh dưỡng cao. Khi gia nhiệt > 63oC trong thời gian dài thì whey có thể phản ứng và kết hợp với casein. - -lactoglobulin: Có dạng hình cầu. Các gốc phân cực, không phân cực, ion hóa phân bố đều trong phân tử; còn các gốc ưa béo tập trung ở bên trong phân tử nên- lactoglobulin ít tương tác hay kết hợp với các phân tử khác. -lactoglobulin chiếm khoảng 7 - 12% tổng khối lượng protein trong sữa. -α-lactalbumin: Cũng là protein có dạng hình cầu. Trong phân tử có chứa nguyên tử calci và là một protein có giá trị dinh dưỡng cao vì thành phần các acid amin trong phân tử của nó rất cân đối. α-lactalbumin chiếm khoảng 2 - 5% tổng khối lượng protein trong sữa. Tiểu micele Đầu ưa nước của -casein Phosphate -casein Tương tác kỵ nước Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 5 - Proteose-peptone: Là sản phẩm thủy phân từ -casein bởi plasmine. Đến nay, người ta đã tìm thấy ba phân đoạn Proteose-peptone khác nhau. Proteose-peptone chiếm khoảng 2 - 4% tổng khối lượng protein trong sữa. - Serum-albumin: Là một protein có nguồn gốc từ máu, không là đặc trưng cho sữa. Thành phần của nó rất phức tạp, bao gồm 542 gốc acid amin. Serum-albumin rất nhạy cảm với nhiệt độ. Serum-albumin chiếm khoảng 0,7 –1,3% tổng khối lượng protein trong sữa. - Immunoglobulin (globulin miễn dịch): Được tổng hợp từ bạch cầu Lymphocyte B. Có thể bị kết tủa bởi magie sunfat hoặc amon sunfat. Hàm lượng Immunoglobulin trong sữa thường rất thấp, chỉ chiếm khoảng 1,9 –3,3% tổng khối lượng protein trong sữa. Ngoài ra, trong sữa còn có các protein màng với hàm lượng rất thấp. Protein màng tạo nên một lớp màng mỏng bao xung quanh các hạt béo, góp phần ổn định hệ nhũ tương sữa. 2.1.4 Glucid Thành phần glucid trong sữa chủ yếu là đường lactose, chiếm khoảng 5% trong sữa tươi. Lactose có độ ngọt thấp hơn nhiều so với các loại đường khác. Nếu như độ ngọt của saccharose được đánh giá với chỉ số là 100 thì độ ngọt của lactose chỉ đạt 16. Lactose có thể bị thủy phân tạo thành glucose và galatose bởi enzyme -galatosidase (lactase) Hình 3: Công thức cấu tạo của đường lactose Trong sữa, đường lactose tồn tại dưới hai dạng - Dạng α-lactose monohydrate C12H22O11.H2O (phân tử α-lactose ngậm một phân tử nước). - Dạng -lactose anhydrous C12H22O11 (phân tử -lactose khan). Tỷ lệ hàm lượng giữa α-lactose monohydrate và -lactose anhydrous trong sữa phụ thuộc vào giá trị pH và nhiệt độ của sữa. Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 6 Bảng 3:Tỷ lệ thành phần -lactose anhydrous và α-lactose monohydrate (theo khối lượng) tại các giá trị nhiệt độ khác nhau Nhiệt độ dung dịch (oC) 15 20 50 70 90 Tỷ lệ giữa -lactose anhydrous và α-lactose monohydrate 1.63 1.59 1.51 1.45 1.40 Các đường đơn giản như glucose, fructose, saccharose có nhiều trong các loại thực vật, còn lactose thì chỉ có duy nhất trong sữa động vật nên còn được gọi là đường sữa. Ngoài lactose, trong sữa bò còn chứa glucose (70 mg/l), galactose (20 mg/l) và một số hợp chất glucid chứa nitơ như N-acetyl glucosamine, N-acetyl galactosesamine,... với hàm lượng rất thấp (chỉ ở dạng vết). 2.1.5 Enzyme Enzyme đầu tiên được tìm thấy trong sữa là lactoperoxydase, và hiện nay đã có hơn 60 enzyme khác nhau được tìm thấy trong sữa. Chúng có thể là do tuyến vú tiết ra hoặc do các vi sinh vật hiện diện trong sữa tổng hợp nên. Sự có mặt của các enzyme trong sữa là nguyên nhân gây biến đổi thành phần hóa học của sữa trong quá trình bảo quản, từ đó làm giảm chất lượng hay làm hư hỏng sữa. Tuy nhiên, có một số enzyme như lactoperoxydase hay lysozyme lại có vai trò kháng khuẩn, chúng tham gia vào việc ổn định chất lượng sữa nguyên liệu. Sự đa dạng và hoạt tính cao của enzyme tỉ lệ thuận với hàm lượng vi sinh vật có trong sữa. - Lactoperoxydase: Enzyme này do tuyến vú tiết ra nên nó luôn tồn tại trong sữa. Tuy vậy, lactoperoxydase cũng có thể do Leucocyte tổng hợp thành. Lactoperoxydase xúc tác phản ứng chuyển hóa hydrogen peroxide (H2O2) thành các chất oxy hóa khác. Nó có pH tối thích 6,8 và hàm lượng trung bình trong sữa nguyên liệu khoảng 30 mg/l. Lactoperoxydase bị vô hoạt ở 80oC trong vài giây. - Lipase: Enzyme này xúc tác phản ứng thủy phân triglyceride thành các acid béo tự do và glycerol. Quá trình phân giải tiếp các acid béo này làm cho sữa có mùi ôi. Lipase có pH tối thích 8,9 và còn hoạt tính ở 4 - 5oC. Tuy nhiên, lipase sẽ bị vô hoạt ở chế độ HTST. - Catalase: Được tìm thấy trong protein màng bao xung quanh các cầu béo. Enzyme này xúc tác phản ứng phân hủy H2O2 thành nước và oxy. Catalase có pH tối thích ở khoảng pH trung tính. Catalase bị vô hoạt ở 75oC trong 1 phút hoặc ở 65 - 68oC trong 30 phút. Sữa từ các động vậtkhỏe mạnh chứa rất ít catalase, còn động vật bị bệnh thì hoạt tính catalase rất cao, nên catalase còn được xem là chất chỉ thị sữa từ động vật bị viêm nhiễm. - Protease: Có hai loại protease là protease acid và protease kiềm được tiết ra từ tuyến vú. Chúng thường ở dạng liên kết với casein và cũng kết tủa ở pH = 4,6. Các enzyme protease xúc tác phản ứng thủy phân protein tạo thành proteose-peptone, peptide và các acid amin tự do. pH tối thích của protease kiềm khoảng 7,5 –8,0, còn của protease acid là 4,0. Protease bị vô hoạt hoàn toànở 80oC sau 10 phút. Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 7 - Phosphatase: Các phosphatase tìm thấy trong sữa chủ yếu thuộc nhóm phosphomonoesterase. Chúng xúc tác phản ứng thủy phân liên kết ester giữa acid phosphoric và glycerin. Có hai dạng phosphatase trong sữa là phosphatase acid và phosphatase kiềmcó pH tối thích tương ứng là 4,7 và 9,6. Thường trong sữa chỉ tồn tại dạng phosphatase kiềm và phosphatase sẽ bị phá hủy hoàn toàn bởi chế độ HTST. - Lysozyme: Là một glucosaminidase (còn được gọi là muramidase) cũng là một trong số các enzyme bền nhiệt. Nó xúc tác phản ứng thủy phân mucopolysaccharide có trong màng tế bào vi khuẩn, từ đó gây phân hủy tế bào nên enzyme này đóng vai trò như một chất kháng khuẩn. Lysozyme trong sữa bò hoạt động ở pH tối thích là 7,9 và có hàm lượng trung bình 130g/l, thấp hơn trongsữa người khoảng 3000 lần (400mg/l) 2.1.6 Vitamin Sữa chứa hầu hết các vitamin trong tự nhiên bao gồm các vitamin hòa tan trong nước (các vitamin nhóm B,..) và các vitamin hòa tan trong chất béo (A, D, K, E). Vitamin hiện diên trong sữa với hàm lượng tương đối thấp, đặc biệt là vitamin D. Với chế độ gia nhiệt trong quá trình chế biến thì các loại vitamin hoà tan trong chất béo A, D và cùng các vitamin hoà tan trong nước B2, B3, B5, H tương đối bền. Còn các vitamin C, B1, B6, B12, acid folic đều bị ảnh hưởng bởi chế độ gia nhiệt ở những mức độ khác nhau. Vì vậy để thành phần các vitamin cân đối và hoàn hảo hơn, người ta thường bổ sung thêm một số loại vitamin cần thiết trong quá trình chế biến các sản phẩm từ sữa. Bảng 4: Hàm lượng một số vitamin trong sữa bò Vitamin Hàm lượng (mg/._.l) Vitamin Hàm lượng (mg/l) A 0,2–2,0 D 0,375–0,5 E 0,75–1,0 K 80 B1 0,44 B12 4,3 B2 1,75 C 20 B3 0,94 Biotine 30 B5 3,46 Acid folic 2,8 B6 0,5 2.1.7 Khoáng Hàm lượngchất khoáng trong sữa dao động trong khoảng từ 8 - 10g/l và tồn tại trong sữa dưới dạng hòa tan hoặc dung dịch keo (kết hợp với casein). Trong sữa chứa gần 25 nguyên tố đa lượng và 10 nguyên tố vi lượng. Nó bao gồm các nguyên tố Ca, Mg, K, Fe, Cu, Co, Ni, I, Cl, P, S, Al, Pb, Sn, Ag, As,…Trong đó chiếm hàm lượng cao nhất là Ca, P và Mg. Một phần do chúng tham gia vào cấu trúc micele, phần còn lại tồn tại dưới dạng muối hòa tan trong sữa. Các nguyên tố khác như K, Na,..đóng vai trò là chất điện ly. Các nguyên tố vi lượng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành sữa cũng như chất lượng các sản phẩm. Việc sử dụng các nguyên tố vi lượng trong khẩu phần ăn của bò có khả năng làm Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 8 tăng hàm lượng của chúng trong sữa. Một số nguyên tố độc hại như Pb, As,. đôi khi cũng được tìm thấy trong sữa bòở dạng vết. Bảng 5:Thành phần một số nguyên tố vi lượng trong sữa bò Nguyên tố Hàm lượng(mg/l) Nguyên tố Hàm lượng(mg/l) Zn 2–5 Mo 0,05–0,08 Si 1,5–7,0 F 0,1–0,2 Al 0,5–1,0 Se 0,01–0,05 Fe 0,2–0,5 Cr 0,01–0,02 Cu 0,02–0,15 Co 0,0005–0,001 I 0,015–0,05 Pb 0,04–0,08 Mn 0,03–0,05 As 0,03–0,05 2.1.8 Các hợp chất khác Trong sữa bò, ngoài những thành phần nêu trên, còn có chứa các chất khí, chủ yếu là CO2, O2 và N2 với hàm lượng tổng cộng từ 5 - 6% thể tích sữa. Chúngtồn tại ở 2 dạng chủ yếu là dạng hòa tan và dạng liên kết. Ngoài ra, người ta còn phát hiện trong sữa tồn tại một số hợp chất có thể gây độc cho người như các kim loại nặng, nitrate, các độc tố vi sinh vật,..ở dạng vết. 2.2 Vi sinh vật trong sữa 2.2.1 Vi khuẩn Vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn quan trọng nhất trong công nghiệp chế biến sữa. Nhóm này chuyển hóa đường lactose có trong sữa thành acid lactic. Ngoài ra, chúng còn tạo thành một số sản phẩm phụ có tác dụng nâng cao chất lượng sản phẩm, đặc biệt là các chất mùi như ester, các acid dễ bay hơi,..Dựa vào các chất được hình thành, người ta chia vi khuẩn lactic thành hai nhóm: Nhóm vi khuẩn lactic đồng hình và nhóm vi khuẩn lactic dị hình. - Streptococcus lactic: Lên men đồng hình hiếu khí, nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng là 30 - 35oC. Đặc tính sinh hóa quan trọng của chúng là lên men glucose, galactose, lactose, dextrin nhưng không lên men saccharose. - Streptococcus cremoris: Lên men dị hình, phát triển tốt ở 20 - 25oC. Chúng làm cho sữa đông tụ và bị nhớt. Tuy nhiên, Streptococcus cremoris thường làm cho sản phẩm có mùi dễ chịu và có độ chua thấp hơn nên ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến bơ. - Các vi khuẩn sinh hương: Đây là nhóm vikhuẩn lactic có khả năng tạo ra trong sữa nhiều sản phẩm acid dễ bay hơi (acid acetic, acid propionic,..) và các chất thơm khác (diacetyl, ester,...). Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng là 30 - 35oC. Đa số các vi khuẩn này sinh ra enzyme citritase nên có khả năng lên men acid citric. Có ba loại vi khuẩn sinh hương điển hình là: Streptococcus citrovorus, Streptococcus paracitrovorus và Streptococcus diacetylactic. Đáng kể là Streptococcus Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 9 diacetylactic tạo thành diacetyl làm cho sữa có mùi dễ chịu. Nhóm vi khuẩn sinh hương này thường được sử dụng phối hợp với Streptococcus lactic và Streptococcus cremoris trong chế biến sữa chua, phomát và bơ. - Vi khuẩn gây đắng: Đặc trưng là Streptococcus liquefacien có tính chất giống Streptococcus lactic. Chúng thực hiện quá trình pepton hóa làm cho sản phẩm có vị đắng. Vi khuẩn propionic Vi khuẩn này đóng vai trò quan trọngtrong quá trình chế biến phomat. Các acid acetic, propionic được hình thành trong quá trình lên men làm cho phomat có mùi vị thơm ngon hơn.Ngoài ra, một số chủng của nhóm này còn có khả năng sinh ra vitamin B12. Vi khuẩn gây thối Nhóm vi khuẩn này chia làm hai loại - Loại hiếu khí: Bacterium fluorescen, Proteus vulgaris, Bacillus subtilis. - Loại yếm khí: Bacterium putrificus, Bacterium botulinus,... Nhóm này không lên men đường sữa. Chúng có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào trong môi trường sữa. Protease sẽ xúc tác quá trình thủy phân protein, giải phóng pepton, các acid tự do và amoniac. Pepton làm cho sữa có vị đắng, amoniac làm cho sữa có phản ứng kiềm. Vài giống vi khuẩn gây thối có khả năng sinh tổng hợp lipase ngoại bào. Enzyme này xúc tác quá trình thủy phân các chất béo trong sữa và làm cho sữa có mùi ôi. Đáng chú ý hơn cả trong nhóm này là Pseudomonas fluorescens. Các protease và lipase được sinh tổng hợp từ loài này rất bền nhiệt. Chúng là nguyên nhân chính gây nên quá trình phân giải protein (proteolysis) và lipid (lipolysis), làm hư hỏng sữa một cách nhanh chóng. 2.2.2 Nấm men Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thường gặp các giống nấm men sinh bào tử và không sinh bào tử. Chúng lên men đường lactose thành carbon dioxide và rượu. Đây là phản ứng sinh hóa quan trọng trong quá trình hình thành một số sản phẩm sữa chua. Thường thì nấm men không phân hủy lactose được, nhưng vi khuẩn lactic trong sữa chuyển hóa lactose thành glucose và galactose, sau đó nấm men sẽ lên men các đường đơn này tạo thành các sản phẩm cần thiết cho các sản phẩm sữa lên men. Một số nấm men thuộc họ Mycoderma có khả năng tạo thành enzyme phân hủy protein và lipid tạo nên vị đắng trong các sản phẩm sữa. 2.2.3 Nấm mốc Nấm mốc có khả năng phân giải protein và lipid nên thường gây vị đắng trong các sản phẩm sữa. Nấm mốc thường phát triển tiếp theo nấm men, vì thế chỉ thấy trong sữa hư hỏng hoặc phomai mềm. Tất cả nấm mốc thường hiếu khí, thích nghi với môi trường acid và đặc biệt là môi trường đã bị vi khuẩn lactic acid hóa. Chúng không phát triển trong sữa tươi mà phát Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 10 triển trong sữa chua và làm kiềm hóa sữa. Trong sữa thường thấy một số loại nấm mốc sau - Endomyces lactic: Tạo màng trắng trên bề mặt phomai, bơ, cũng có thể mọc sâu trong sản phẩm ở lớp gần bề mặt. - Mucor, Aspergillus, Penicillium, Clad-Osprium: Thường tạo nên những vệt màu khác nhau trên bề mặt bơ, phomai và gây mùi ôi cho sản phẩm. - Odium lactic: Tạo nên trên bề mặt váng chua một lớp trắng, và thường gây mùi ôi trong sữa. 2.3 Tác động của CO2 hòa tanđối với vi sinh vật 2.3.1 Tác động kìm hãm của CO2 hòa tanđối với vi khuẩn CO2 hoà tan vào môi trường sẽ làm chậm sự phát triển của các vi khuẩn gram dương và gram âm. Việc ảnh hưởng như thế nào trên từng pha phát triển của chúng phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật (bảng 6). Giai đoạn làm quen với môi trường (lag phase) của một số loài vi khuẩn sẽ kéo dài khi tăng nồng độ CO2. Giai đoạn phát triển nhanh (log phase) của vi khuẩn cũng thay đổi theo nồng độ CO2 sử dụng. Tốc độ phát triển cực đại của một số loài vi khuẩn giảm theo nồng độ CO2. Bảng 6:Ảnh hưởng của CO2 trên sự phát triển của một số loài vi khuẩn Vi sinh vật CO2(mM) Thời gian đạt tốc độ phát triển cực đại (giờ) Thời gian nhân đôi mật số (giờ) Thời gian giai đoạn làm quen môi trường (giờ) P, fluorescens 0,4 11,2 27,1 33,6 46,3 11,7 21,1 22,7 27,3 37,5 2,7 2,4 2,3 3,4 3,4 3,3 13,3 15,0 16,0 26,1 E, coli 0,5 49,4 47,6 53,8 4,7 5,5 29,4 38,1 L, monocytogenses 0,5 49,4 22,6 44,4 2,2 3,0 15,2 34,4 Enterococcus faecalis 0,5 51 51,8 50,7 5,5 4,0 33,6 37,6 B, cereus 0,5 47,1 61,4 33,9 37,6 44,4 2,4 2,9 5,3 26,1 28,1 26,7 B, licheniformis 0,5 49,4 48,4 54,1 5,3 5,2 30,9 36,7 Nguồn: Dairy Processing improving quality (Gerrit Smit, 2003) 2.3.2 Tác động của CO2 lên bào tử CO2 hòa tan có thể làm suy giảm sự sinh sản của bào tử trong sữa nguyên liệu (Hambleton và Rigby, 1970). Guirguis và cộng sự (1984) kết luận rằng: CO2 hòa tan trong sữa làm giảm pH đến khoảng 5,86 sẽ làm cho tốc độ sinh sản của bào tử Bacillus cereus giảm đến 74%. Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 11 Ngoài ra, người ta cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của CO2 đến khả năng sinh sản và việc tạo thành các độc tố của Clostridium botulinum. Việc hòa tan CO2 trong sữa đến nồng độ 18,2 mM sẽ làm giảm đáng kể sự sinh sản của C.botulinum. Thêm vào đó, nếu sữa được tồn trữ < 6oC sẽ không tồn tại ngoại độc tố botulin do C.botulinum tiết ra (Glass và cộng sự, 1999). 2.3.3 Tác động của CO2 đối với enzyme Cơ chế kìm hãm hoạt động của CO2 lên enzyme không được nghiên cứu nhiều như đối với vi khuẩn nhưng các nhà nghiên cứu cũng có kết luận rằng: CO2 có tác động lên enzyme tương tự như tác động lên vi khuẩn, tức là CO2 hòa tan ở nồng độ càng cao thì càng có khả năng kìm hãm hoạt động của enzyme, thậm chí có thể làm vô hoạt enzyme. Chẳng hạn như CO2 hòa tan trong sữa ở nồng độ 30 mM (tồn trữ ở 7oC)có thể làm giảm 50% khả năng tạo protease do P.fluorescens sinh tổng hợp nên (Rowe, 1988). Gần đây hơn thì Habulin và Knez (2001) cũng đã có kết luận tương tự trên. Sau 5 ngày bảo quản sữa không xử lý CO2 có khả năng tạo lipase cao hơn 85% so với sữa có sử dụng CO2 hòa tan. Kết quả này có thể là do có sự tăng độ hòa tan của CO2 trong lipid. Khi nồng độ CO2vượt quá ngưỡng tới hạn (100bar) có thể giảm 50% hoạt tính lipase. Quá trình xử lý CO2 kết hợp với áp suất cao là nguyên nhân có thể làm giảm đáng kể hoạt động của enzyme. Áp suất khoảng 310 MPa có thể gây ra những biến tính không thuận nghịch đối với cấu trúc bậc I của protein ở nhiệt độ phòng (Hendrickx, Ludikhuyze và cộng sự, 1998). Balney và cộng sự (1993) đã nghiên cứu và kết luận rằng ở áp suất thấp hơn, khoảng 207 - 208 MPa sẽ làm biến tính thuận nghịch protein. Tuy nhiên, gần đây hơn, Knor, Hendrickx cùng cộng sự (2002) đã chứng minh được hầu hết các enzyme tồn tại trong sữa không có sự hiện diện của CO2 đều có thể bị vô hoạt ở áp suất 207 - 608 MPa ở nhiệt độ phòng. Vì vậy, chỉ riêng áp suất thì không thể giải thích hoàn toàn cho khả năng làm vô hoạt enzyme của CO2. Một nguyên nhân khác là do mỗi enzyme đều có một pH tối thích riêng và pH tối thích này thường nằm trong vùng acid yếu, trung tính hoặc kiềm yếu. CO2 hòa tan vào sữa sẽ làm giảm pH của sữa, làm thay đổi khả năng tiếp nhận cơ chất của enzyme và chính vì vậy mà làm vô hoạt enzyme. 2.4 Cơ chế tác động của CO2 đến sự phát triển của vi sinh vật Đã có rất nhiều nghiên cứu ảnh hưởng của CO2 đối với vi sinh vật và người ta đãđưa ra các cơ chế kìm hãm sự phát triển vi sinh vật do CO2 hòa tan như sau: - Oxi bị thay thế do CO2 thêm vào. - CO2 thêm vào làm giảm pH của sữa. -Ảnh hưởng trực tiếp của CO2 đến vi khuẩn. 2.4.1 Sự chiếm chỗ của O2 bởi CO2 Khi CO2 được hòa tan vào sữa sẽ đẩy O2 ra khỏi sữa, đây cũng chính là nguyên nhân kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn hiếu khí. Tuy nhiên, đây không phải là phương thức kìm hãm chính. Người ta đã làm thí nghiệm với Pseudomonas Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 12 fluorescens: Giữ không đổi nồng độ O2 thì thấy rằng sự phát triển của P.fluorescens chậm dần khi gia tăng nồng độ CO2. 2.4.2 Làm giảm pH của sữa Khi CO2 hòa tan vào sữa thì có một chuỗi phản ứng xảy ra và sẽ làm giảm pH của sữa do sự tồn tại của các ion H CO2 + H2O  H2CO3  HCO3+ H CO32+ 2H CO2 sẽ phản ứng với nước tạo thành acid carbonic. Sau đó acid carbonic sẽ phân ly thành ion bicarbonate và H, và cuối cùng thành ion carbonate. Chính CO2 và ion H là nguyên nhân chính kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn. Tuy vậy, bicarbonate và carbonate cũng có tác động kìm hãm vi khuẩn nhưng yếu hơn. Sự cân bằng của phương trình phản ứng trên phụ thuộcvào pH của dung dịch. Ở pH thấp, phản ứng xảy ra chủ yếu theo hướng về bên trái. Do đó, pH của môi trường CO2 hoà tan vào cũng như khả năng đệm của dung dịch đó có ảnh hưởng lớn đến khả năng ức chế vi sinh vật. 2.4.3Ảnh hưởng trực tiếp của CO2 đến vi khuẩn Tác dụng ức chế vi khuẩn do ảnh hưởng trực tiếp của CO2 xảy ra theo các thuyết sau đây - CO2 hoà tan vào lipid của màng tế bào gây ra những ảnh hưởng bất lợi đến độ ổn định của chúng (Nilsson và cộng sự, 2000). - Phản ứng hydrate hoá của CO2 làm giảm pH gây nênứng suất giữa môi trường và nội bào (Wolfe, 1980). - CO2 như một chất chuyển hoá từ nhiều con đường chuyển hoá sinh học gây nên sự tiêu tốn năng lượng không cần thiết của tế bào (Dixon và cộng sự, 1987). - CO2 có thể làm thay đổi và điều chỉnh các đặc tính lý hoá của enzyme (King, Nagel, 1975). Tùy vào môi trường phát triển, loại vi sinh vật và trạng thái vật lý mà chúng sẽ chịu tác động kết hợp thích hợp của các cơ chế trên. Phân tử CO2 không phân cực nên chúng tan trong lipid tốt hơn so với trong nước. Khi CO2 tiếp xúc với màng tế bào vi khuẩn, nó sẽ hòa tan vào lớp kép lipid và làm tăng độ lỏng của màng tế bào, tạo điều kiện cho tế bào chất của vi khuẩn tiếp xúc với môi trường bên ngoài có pH thấp, gây độc cho tế bào. Tùy vào nồng độ CO2 và áp suất mà CO2 cuối cùng có thể hòa tan vào tế bào chất của vi khuẩn (đây là môi trường có pH trung tính), làm giảm pH của tế bào chất dẫn đến làm thay đổi gradient pH, tạo ứng suất lên tế bào và làm xé rách màng tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn có thể sống sót trong môi trường acid nhưng với một điều kiện là pH nội bào phải được duy trìở mức trung tính. Chính vì vậy mà tế bào phải duy trì gradient pH giữa môi trường bên trong và bên ngoài tế bào. Điều này được thực hiện nhờ tế bào có khả năng bơm đẩy Htừ bên trong ra bên ngoài tế bào. Do khả năng thẩm Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 13 thấu cao của CO2 qua màng tế bào nên hệ thống bơm bị áp chế và làm cho pH nội bào giảm xuống, làm biến tính protein nội bào và dẫn đến ức chế vi khuẩn. Dillow (1999) cũng đã khẳng định rằng nguyên nhân chính dẫn tới ức chế vi khuẩn là do làm giảm pH nội bào. Ballestra (1996) nêu rằng: Quá trình tích lũy CO2ở vách tế bào dưới mức gây chết là nguyên nhân dẫn tới giai đoạn ổn định của vi khuẩn. Khi lượng CO2 được tích lũy ở tế bào tiến tới điểm tới hạn thì sự giảm pH nội bào đủ làm biến tính protein nội bào sẽ là nguyên nhân làm chết tế bào. Tăng nhiệt độ và nồng độ CO2 sẽ làm tốc độ khuếch tán CO2 vào tế bào nhanh hơn và thời gian ức chế vi khuẩn vì thế cũng sẽ giảm. Ngoài ra, tác động ức chế vi khuẩn còn là do ảnh hưởng của áp suất. Việc thay đổi áp suất sẽ dẫn tới việc làm rách vách tế bào vi khuẩn. Enomoto, Nakamura và cộng sự (1997) đã kết luận rằng: Khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn luôn diễn ra trong suốt quá trình tăng và giảm áp suất do CO2. Ballestra (1996) đã quan sát vách tế bào vi khuẩn E.coli trước và sau khi xử lý CO2ở 5MPa, 40oC trong 4giờ và thấy rằng hơn 75% tế bào bị xé rách có thể nhìn thấy được. Tức là còn lại gần 25% tế bào có vách tế bào còn nguyên. Tuy vậy, chỉ có 1% là quan sát thấy được. Điều này có nghĩa là có thể còn có những lỗ thủng bị xé rách quá nhỏ trên vách tế bào mà không thể quan sát dưới kính hiển vi được. Cơ chế tác động của CO2 lên bào tử không được biết rõ. Bào tử có một lớp màng mỏng được gắn chặt vào bên dưới của một chuỗi lớp bao bọc bằng protein. Những lớp bọc này xốp (Setlow và Johnson, 1997) và có thể là CO2 bị hoà tan vào màng của bào tử, dẫn đến kết quả làm cho bào tử nhạy cảm hơn với ứng suất bên ngoài môi trường như nhiệt hay sự tăng độ loãng của màng (Enfors và Molin, 1978). Tác động của CO2 cũng phụ thuộc vào nhiệt độ do ảnh hưởng đến khả năng hoà tan của CO2. Trong sữa CO2 có thể hoà tan đến nhiệt độ 38oC, do đó có thể sử dụng CO2 hoà tan để giữ chất lượng nguyên liệu cũng như sản phẩm trong quá trình bảo quản và phân phối. 2.5Ảnh hưởng của CO2 đến chất lượng sữa tươi nguyên liệu 2.5.1 Tác động của CO2 hòa tanđến sự phát triển của vi sinh vật trong sữa tươi Ảnh hưởng trên vi khuẩn tổng số CO2 hòa tan trong sữa nguyên liệu được trữ lạnh ở 4 - 7oC có thể làm giảm tốc độ phát triển của vi khuẩn tổng số xuống khoảng 10 lần so với không sữa không có CO2 hòa tan. Trong sữa có chất lượng tốt hay không tốt thì sự phát triển của vi khuẩn gây hư hỏng cũng đều được kìm hãm khi CO2 được hòa tan vào. Chẳng hạn, vi khuẩn tổng số ban đầu lần lượt là 7,8*103 cfu/ml và 1,6*105 cfu/ml. Sau khi hòa tan vào 30 mM CO2 thì sau hai ngày, vi khuẩn tổng số vẫn <106 cfu/ml. Tổng vi khuẩn hiếu khí trong sữa tươi bảo quản ở 7oC với 25 –27 mM CO2 có thời gian cho giai đoạn phát triển chậm là 72 giờ, trong khi mẫu đối chứng không có CO2 thời gian này là 24 giờ (Roberts và Torrey, 1988). Vi khuẩn ưa lạnh Vi khuẩn ưa lạnh trong sữa nguyên liệu rất nhạy cảm với CO2 (King và Mabbitt, 1982). Chẳng hạn sữa tươi bảo quản ở 7oC sau 6 ngày với lượng CO2 là 25 mM sẽ Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 14 chứa khoảng 2,5*103 cfu/ml, thấp hơn nhiều so với mẫu đối chứng không sử dụng CO2. Giai đoạn làm quen môi trường của vi khuẩn ưa lạnh trong sữa bảo quản ở 4oC là 6 ngày với mẫu có 30 mM CO2 trong khi thời gian này của mẫu không có CO2 là 2 ngày (King và Mabbitt, 1982). Một số nhà nghiên cứu khác đã không khảo sát ảnh hưởng của nồng độ CO2 trực tiếp đến tổng vi khuẩn ưa lạnh mà thay vào đó là nghiên cứu ảnh hưởng của sự giảm pH do CO2 thêm vào đến vi khuẩn nhóm này. Kết quả cho thấy khi giảm pHtừ 6,8 đến 6,0, tổng vi khuẩn ưa lạnh là 3,1*105cfu/ml sau khi giữ 4 ngày ở 7oC, trong khi ở mẫu đối chứng giá trị này là 2*107 cfu/ml (Sierra và cộng sự, 1996). CO2 cũng ảnh hưởng đến vi khuẩn ưa lạnh thủy phân chất béo. Do đặc tính không phân cực của CO2 cho phép nó hoà tan nhiều trong cấu tử béo, làm tăng nồng độ CO2 trong chất béo sữa làm cho nguồn carbon đặc biệt cần thiết không thể đi vào tế bào vi khuẩn ưa lạnh thủy phân chất béo nên chúng gặp điều kiện môi trường sống khó khăn so với các vi sinh vật khác. Coliforms Sự phát triển của Coliforms trong sữa bị ức chế bởi CO2. Sau 4 ngày bảo quản ở 4oC, sữa tươi được acid hóa đến pH = 6,0 bằng CO2 có tổng số coliforms là 3,2*102 cfu/ml so với mẫu đối chứng không có CO2 là 3,2*103 cfu/ml (Ruas –Madiedo, 1996). Hàm lượng CO2 hòa tan trong sữa càng nhiều thì sự ức chế càng lớn. Vi khuẩn kỵ khí CO2 có ảnh hưởng ức chế đối với vi sinh vật kỵ khí (Enfors và Molin, 1980). Sữa tươi chứa 26,5 mM CO2 giữ ở 7oC sau 6 ngày có tổng vi khuẩn kỵ khí là 5,0*105 cfu/ml trong khi mẫu đối chứng không có CO2 là 3,2*108 cfu/ml (Roberts và Torrey, 1988). 2.5.2 Tác động của CO2 hòa tanđến các biến đổi vật lý và sinh hóa của sữa tươi Tác động đến thành phần hóa học của sữa CO2 hòa tan không làm thay đổi độ ổn định của các vitamin tan trong dầu khi giữ sữa tươi ở 7oC sau 7 ngày (Sierra và cộng sự, 1996). Các acid hữu cơ và tỷ lệ giữa casein và whey trong sữa giữ lạnh ở 4oC (xử lý CO2 đến pH = 6) không thay đổi (Ruas Madiedo, 1996). Hàm lượng béo và protein cũng không thay đổi trong sữa có CO2 hòa tan. Độ hấp thu ở bước sóng tương ứng với lactose có gia tăng là do CO2 cũng được hấp thu ở bước sóng này. Ảnh hưởng đến casein Mặc dù CO2 hòa tanở nồng độ cao sẽ có khả năng kìm hãm vi khuẩn cũng như hoạt động của enzyme, nhưng với nồng độ quá cao thì sẽ ảnh hưởng đến casein trong sữa. Vì casein sẽ hoàn tan kémở pH < 4,6 và sẽ làm cho sữa bị kết tủa. Do vậy, nếu CO2 hòa tan trong sữa nhiều đến mức làm giảm pH sữa < 4,6 thì casein sẽ bị kết tủa. Sự mất ổn định của casein cũng cần đượcquan tâm về khía cạnh có thể làm tắc nghẽn thiết bị trao đổi nhiệt trong quá trình thanh trùng hay tiệt trùng do sự đóng bám thành phần này trên bề mặt trao đổi nhiệt. Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 15 Ảnh hưởng đến pH của sữa Khi CO2 hòa tan vào sữa sẽ xảy ra phản ứng hydrat hóa tạo thành acid carbonic, làm giảm pH của sữa. Sự thay đổi pH của sữa theo nồng độ CO2 được thể hiện ở hình 4. Hình 4: Ảnh hưởng của CO2 hòa tan đến pH của sữa nguyên liệu ở 38oC từ hai nông trại khác nhau Ảnh hưởng đến điểm đóng băng của sữa (FP –Freezing Point) CO2 làm giảm pH của sữa, dẫn đến giảm tính ổn định của phức chất casein, do đó các muối calcium và phospho cũng có thể di chuyển từ micele casein vào pha nước. Hàm lượng chất tan tăng dẫn đến làm giảm điểm đóng băng của sữa (Gevaudan và cộngsự, 1996). Sự gia tăng hàm lượng chất tan dẫn đến sự giảm điểm đóng băng theo tuyến tính từ FP ban đầu trong sữa tươi không có CO2 là -0,543oC đến -0,59oC trong sữa có 1000 ppm CO2, theo phương trình hồi qui như sau: (Ma và cộng sự, 2001) FP = - 0,5434 –0,000051 * [CO2] (R2 = 0,98) Trong đó FP là điểm đóng băng (oC) [CO2] là nồng độ CO2 tính bằng ppm. Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 16 CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Phương tiện thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ. Thời gian thực hiện 12 tuần 3.1.1 Nguyên liệu chính Sữa tươi được thu mua tại Tổ 7, Lợi Vũ A, Phường An Bình, TP. Cần Thơ CO2 hòa tanđược mua tại công ty MITAGAS, đường Mậu Thân nốidài, TP. Cần Thơ 3.1.2 Thiết bị Thiết lập hệ thống sục khí CO2 pH kế Máy đo màu Colorimeter Áp kế Tủ cấy, tủ ủ Cân điện tử Máy cất đạm Tủ lạnh Một số dụng cụ và thiết bị thí nghiệm khác 3.1.3 Hóa chất Dung dịch chuẩn độ acid: NaOH 0,1N Môi trường nuôi cấy: Plate Count Agar Methyl da cam Hình 5: Máy cất đạm Dung dịch chuẩn độ H2SO4 0,1N Một số hoá chất khác Hình 6: Máyđo màu clorimeter Hình 7: Máy đo pH Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 17 3.2 Bố trí thí nghiệm 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của CO2 hòa tan đến khả năng bảo quản sữa tươi nguyên liệu, so sánh kết hợp với phương pháp bảo quản bằng nhiệt Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian sục CO2, từ đó tìm ra nồng độ CO2 hòa tan thích hợp cho việc bảo quản sữa nguyên liệu, đồng thời so sánh hiệu quả bảo quản bằng CO2 hòa tan và bằng nhiệt. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Sữa tươi  Làm sạch  Xử lý  Không xử lý Xử lý sục CO2 (4oC) Thanh trùng nhiệt (72oC, 30 giây) pH = 6,8 pH = (A3) A1 A2 A3  Bảo quản (4oC)  Phân tích Tiến hành thí nghiệm Sữa tươi thu mua từ hộ chăn nuôi mới thu hoạch được kiểm tra các chỉ tiêu chất lượng và làm sạch. Nhóm mẫu không xử lý được chuẩn bị với 2 giá trị pH là 6,9 (của sữa tươi bình thường chất lượng tốt) và pH bằng với pH của mẫu sục CO2 nhiều nhất. Điều chỉnh pH bằng acid vô cơ (HCl). Nhóm mẫu xử lý bằng biện pháp sục CO2 được chuẩn bị với cùng áp suất sục CO2 là 2Kg/cm2 và thay đổi thời gian sục CO2 với 3 mức độ thời gian tương ứng với mẫu A1, A2 và A3 lần lượt là 5 phút, 10 phút và 15 phút. Mẫu xử lý nhiệt ở nhiệt độ 72oC trong thời gian 30 giây. Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 18 Các chỉ tiêu phân tích Hàm lượng CO2 hòa tan và pH của các mẫu A1, A2 và A3 sau khi sục CO2. Kiểm tra định kỳ sau mỗi 2 ngày các mẫu bảo quản thông qua các chỉ tiêu: - Chỉ tiêu vật lý: pH, độ trắng. - Chỉ tiêu hóa học: Độ acid, NH3. - Chỉ tiêu vi sinh: VSV tổng số. - Chỉ tiêu cảm quan: Màu sắc, trạng thái, mùi. Thí nghiệm được tiến hành với 2 lần lặp lại Hình 8: Sơ đồ bố trí sục CO2 Hình 9: Giữ lạnh sữa trong bình inox chịu áp suốt quá trình sục CO2 Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 19 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng sử dụng sữa bảo quản bằng CO2 vào chế biến các sản phẩm từ sữa Mục đích thí nghiệm:Khảo sát có sự khác biệt về chất lượng hay không khi sử dụng sữa bảo quản bằng CO2 trong sản xuất các sản phẩm tiêu biểu từ sữa so với nguyên liệu sữa tươi và sữa bảo quản bằng cách thanh trùng nhiệt. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Nguyên liệu B1 B2 B3 Chế biến sản phẩm tiêu biểu từ sữa Sữa tiệt trùng Sữa lên men Đánh giá, so sánh Tiến hành thí nghiệm Trên cơ sở thí nghiệm 1, sau khi xác định được thời giansục CO2 và thời gian bảo quản tối ưu cho sữa, mẫu này được chọn là mẫu B1 trên sơ đồ bố trí thí nghiệm. Mẫu B2 là mẫubảo quản bằng phương pháp thanh trùng với cùng thời gian bảo quản với mẫu B1. Mẫu B3 tương ứng với nguyên liệu sữa tươi mới thu mua. Các mẫu nguyên liệu B1, B2 và B3 nêu trên được dùng chế biến sữa tiệt trùng và sữa lên men. Sản phẩm tương ứng từ các nhóm nguyên liệu này được đánh giá và so sánh chất lượng. Các chỉ tiêu đánh giá - Sản phẩm sữa tiệt trùng: đánh giá các chỉ tiêu cảm quan: màu sắc, mùi, vị và trạng thái của sản phẩm. - Sản phẩm sữa lên men: Theo dõi tốc độ sinh acid (tốc độ lên men). Thí nghiệm được tiến hành với 2 lần lặp lại Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 20 3.3 Phương pháp đo đạc - phân tích Bảng 7: Phương pháp phân tích các chỉ tiêu STT Chỉ tiêu xác định Phương pháp phân tích 1 CO2 hòa tan Phụ lục 1 2 pH Sử dụng pHkế 3 Màu sắc Sử dụng máy đo màu colorimeter 4 Độ acid (oT) Dùng dung dịch chuẩn NaOH 0,1N để trung hòa hết các acid có trong 100ml sữa với phenolphtalein làm chất chỉ thị màu 5 NH3 Phương pháp Kjeldahl 6 Vi sinh vật tổng số Phương pháp đếm đĩa 7 Đánh giá cảm quan Phương pháp so sánh đa 3.4 Phương pháp phân tích số liệu Sử dụng chương trình thống kê Statgraphic plus 4.0 và R2.3.0 để xử lý thống kê số liệu. Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 21 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN Bảng8: Kết quả phân tích thành phần của nguyên liệu 4.1Ảnh hưởng của phương pháp xử lí đến các chỉ tiêu chất lượng của sữa tươi nguyên liệu Bố trí thí nghiệm với 3 thời gian sục khí CO2 vào sữa nguyên liệu là 5 phút, 10 phút, 15 phút ở cùng 1 áp lực sục khí là 2kg/cm2 (theo thí nghiệm thăm dò), so sánh với hai mẫu đối chứng là mẫu không sục CO2 có pH nguyên thủy của sữa (6,9) và mẫu không sục CO2 được điều chỉnh pH bằng pH của mẫu sục CO2 cao nhất (6.42) bằng acid vô cơ và mẫu xử lí nhiệt ở nhiệt độ 72oC trong thời gian 30 giây. Kết quả thống kê về độ tăng độ acid, độ giảm pH, màu sắc, NH3 và độ tăng mật số vi sinh vật tổng số (VSVTS) theo thời gian bảo quản được thể hiện qua bảng9. Thời gian bảo quản được kết thúc khi có bất kỳ mẫu nào có số lượng vi sinh vật vượt quá tiêu chuẩn cho phép (Theo tiêu chuẩn EU thì sữa được tồn trữ hơn 36 giờ không tồn tại vi sinh vật tổng số vượt quá 200.000cfu/ml, The Council of the European Union). Do đó, thời gian bảo quản thống kêở bảng 9 được tính trong 8 ngày. Bảng 9:Ảnh hưởng của phương pháp xử lí đến các chỉ tiêu chất lượng Phương pháp xử lí pH Độ tăng độ acid (*) Độ giảm pH (**) Màu sắc (L) NH3 (g/l) Độ tăng mật số VSVTS (***) Đối chứng pH = 6,9 6,90 1,00b 0,09b 76,25c 0,32a 32,56c Đối chứng pH = 6,42 6,42 0,95b 0,07ab 74,96a 0,31a 32,18c Xử lí nhiệt 6,90 0,50a 0,05a 75,9b 0,32a 9,75ab Sục CO2 5 phút 6,63 1,30bc 0,13c 78,00d 0,32a 17,33b Sục CO2 10 phút 6,53 1,63c 0,14c 78,50e 0,32a 11,69ab Sục CO2 15 phút 6,42 1,40c 0,13c 79,05f 0,31a 5,50a (Các chữcái giống nhau biểu thị sự không khác biệt ý nghĩa theo cột) (*) Được tính bằng hiệu số giữa độ acid ở các ngày tiếp theo và độ acid ở ngày đầu tiên. (**) Được tính bằng hiệu số giữa pH ở ngày đầu tiên và pHở các ngày tiếp theo. (***) Được tính bằng thương số giữa mật số vi sinh vật ở các ngày tiếp theo và mật số vi sinh vật ở ngày đầu tiên. Thành phần Hàm lượng (%) Chất béo 3,08 Đường 4,6 Protein 3,14 Chất khô tổng số 11,5 Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 22 4.1.1Ảnh hưởng của phương pháp xử lí đến sự thay đổi pH của sữa trong thời gian bảo quản 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7 0 2 4 6 8 10 Thời gian bảo quản (ngày) pH Đối chứng pH = 6,9 Đối chứng pH = 6,42 Xử lí nhiệt Sục CO2 5 phút Sục CO2 10 phút Sục CO2 15 phút Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH của sữa theo phương pháp xử lí và thời gian bảo quản Dựa vào kết quả thống kê bảng 9 và đồ thị trên cho thấy: Sữa được xử lý bằng các phương pháp khác nhau có khuynh hướng chung là pH của sữa đều giảm dần theo thời gian bảo quản nhưng có khác biệt ý nghĩa giữa các mẫu. Điều này có thể được giải thích rằng: Đối với mẫu đối chứng pH = 6,9, mẫu đối chứng pH = 6,42 và mẫu xử lí nhiệt thì sau thời gian bảo quản do vi sinh vật phát triển nên làm giảm pH. Còn đối với mẫu sục CO2, do pH ban đầu của sữa trước khi sục CO2 cao nênở ngày đầu tiên chỉ một phần CO2 hòa tan kết hợp với nước để hình thành nên acid carbonic và xảy ra một chuỗi phản ứng để tạo thành các ion H+ làm giảm pH sữa CO2 + H2O  H2CO3  HCO3+ H CO32+ 2H Mặc dù pHở ngày đầu đã thấp (so với pH = 6,9) nhưng so với pH để phản ứng trên đạt trạng thái cân bằng thì vẫn còn cao nên CO2 tiếp tục kết hợp với nước và xảy ra chuỗi phản ứng trên nên làm giảm pH sữa, tạo nên sự khác biệt ý nghĩa so với các mẫu không sục CO2. Luận văn tốt nghiệp khóa 28 - năm 2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm –Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng 23 4.1.2 Ảnh hưởng của phương pháp xử lí đến sự thay đổi độ acid của sữa trong._.