Nghiên cứu sử dụng các chủng vi sinh vật phân lập từ nước biển xử lý nước thải nuôi tôm bằng phương pháp lọc sinh học

hát triển đặc biệt là nghề nuôi tôm. Năm 2001 sản lượng tôm đạt hơn 150.000 tấn và góp phần đưa làm ngạch suất khẩu thuỷ sản cả nước đạt khoảng 1,8 tỉ USD. Vì vậy, nuôi biển được đánh giá là nghề có nhiều và mũi nhọn trong chiến lược phát triển nuoi trồng thuỷ sản của nuớc ta trong tương lai [4]. Do lợi nhuận kinh tế mang lại rất cao nên nghề này ở nước ta đã phát triển một cách ồ ạt. Hiện nay, nghề nuôi tôm không những phát triển mạnh ở các tỉnh phía Nam mà còn phát triển mạnh ở các tỉnh phía Bắc. Tuy nhiên, trong những năm qua, nhiều hộ nuôi tôm đã gặp không ít khó khăn do nuôi tôm năng suất thấp, tôm chậm phát triển, thậm trí tôm chết hàng loạt... Nguyên nhân trực tiếp là do môi trường ao nuôi bị nhiễm bệnh và nguồn nước nuôi nhiễm bẩn,hơn nữa nước của ao nuôi không được sử lý mà trực tiếp đổ ra biển gây ô nhiễm nguồn nước biển. Vì vậy việc xử lý nước thải ao nuôi là vấn đề đang được các nhà khoa học và các quốc gia quan tâm nghiên cứu.Xử lý nước thải ao nuôi có rất nhiều biện pháp: Lý học, hoá học và sinh học. Nhưng, trong đó kết hợp giữa phương pháp lý học và phương pháp sinh học được đánh giá là biện pháp có hiệu quả cao nhất vì biện pháp này không gây độc hại tới môi trường và sức khoẻ con người. Ngày nay, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, vi sinh vật ngày càng khẳng định tiềm năng của mình trong các lĩnh vực ứng dụng khác nhau. Trong số vi sinh vật, quần thể vi sinh vật biển vẫn ít được quan tâm nghiên cứu ở Việt Nam. Nhưng trên thế giới các kết quả nghiên cứu vi khuẩn ưa mặn cho thấy, chúng có tiềm năng ứng dụng to lớn [13]. Các vi khuẩn ưa mặn có thể phát triển ở nồng độ muối cao do có nguy cơ nhiễm tạp ít. Chúng sinh trưởng và phát triển dễ dàng với nhu cầu dinh dưỡng đơn giản: phần lớn có thể sử dụng rộng rãi các hợp chất hữu cơ làm nguồn cung cấp cacbon và năng lượng [9]. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu sử dụng các chủng vi sinh vật phân lập từ nước biển xử lý nước thải nuôi tôm bằng phương pháp lọc sinh học”. Đề tài được tiến hành tại Phòng Công nghệ Lên men và Phòng Công nghệ Tảo thuộc Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm Khoa học tư nhiên và Công nghệ Quốc gia các với nội dung chính như sau: Phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật ưa mặn có hoạt tính sinh học cao từ ao nuôi tôm. Nghiên cứu cố định các chủng đã được tuyển chọn trên các chất mang khác nhau. Thử nghiệm khả năng xử lý nước thải nuôi tôm trong phòng thí nghiệm. Phần 1. Tổng quan tài liệu 1.1. Khái quát về hệ sinh vật biển Cũng như các quần thể khác, quần thể vi sinh vật biển sống trong môi trường có độ mặn cao cũng rất đa dạng. Chúng có nhiều cơ chế chuyển hoá khác nhau: quang dưỡng có oxy và không có oxy, dị dưỡng kị khí, lên men hoặc khử nitơ, khử sunphát...[5]. Tính đa dạng này giảm khi độ mặn của môi trường tăng. Trong những năm gần đây nhờ những thành tựu của khoa học kỹ thuật trong lĩnh vực nuôi cấy, sinh học phân tử người ta đã biết được bản chất của hiện tượng chịu mặn cũng như ưa mặn của vi sinh vật. ứng dụng của vi sinh vật ưa mặn được mở rộng trong công nghệ sinh học sản xuất Ectoin- một sản phẩm có liên quan trực tiếp tới khả năng thích nghi trong môi trường mặn của vi sinh vật. Từ các chủng vi sinh vật ưa mặn có hoạt tính sinh học, người ta đã chế tạo được nhiều chế phẩm sử dụng làm sạch nước thải nuôi tôm cá. Ví dụ chế phẩm sinh học có tên ACCECOBACAG – chế phẩm này dùng để xử lý môi trường nước ao nuôi tôm cá để loại thải khí độc ( NH3, H2S... ) và phân huỷ các chất hữu cơ. Trong chế phẩm này có các chủng vi khuẩn thuộc các loài: Bacillus subtillis, B. megaterium, B. polymyxa, Rumencoccus albus, Aspergillus oryzae... Người ta cũng chứng minh rằng, các chế phẩm sinh học chế tạo từ các chủng vi sinh vật ưa mặn để xử lý nước thải nuôi tôm có nhiều ưu điểm hơn so với vi sinh vật không ưa mặn. 1.1.1. Khái quát về vi khuẩn ưa mặn 1.1.1.1. Vi khuẩn ưa mặn Các vi khuẩn ưa mặn được phân lập từ hai nguồn môi trường: môi trường biển và môi trường mặn không có nguồn gốc biển [6] . Dựa vào nồng độ muối tối ưu cho phát triển ta có thể xếp chúng vào các nhóm khác nhau. Kushner đã phân loại vi khuẩn ưa mặn như sau: - Vi khuẩn ưa mặn yếu: phát triển tốt ở nồng độ muối từ 0,2 -:- 0,5 M. - Vi khuẩn ưa mặn trung bình: phát triển tốt ở nồng độ muối từ 0,5 -:- 0,25M - Vi khuẩn cực kỳ ưa mặn: phát triển tốt ở nồng độ muối từ 2,5 -:- 5,2M. 1.1.1.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn ưa mặn Đặc điểm hình thái Vi khuẩn ưa mặn là những vi khuẩn đơn bào, cấu tạo đơn giản, mang nhiều dấu hiệu và tính chất của một cơ thể thực vật, có nhiều hình dạng khác nhau. Đa số vi khuẩn ưa mặn hiếu khí, Gram (+) đều có khả năng tạo sắc tố màu da cam, màu vàng, màu kem, màu hơi đỏ và nâu đỏ. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá Hầu hết các vi khuẩn ưa mặn đều là cơ thể dị dưỡng hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện mặc dầu chúng được phân lập từ mẫu nước biển láy từ độ sâu khá lớn. Sở dĩ chúng có thể tồn tại được ở độ sâu như vậy là nhờ khả năng có thể khử các hơp chất nitrat thành hơp chất nitrit như trong trường hợp của vi khuẩn Halomnas elongata [13]. Vi khuẩn ưa mặn có khả năng biến đổi đặc tính của chúng để thích nghi với từng điều kiện sống. Đây là mục tiêu nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới, đặc biệt là cơ chế thích nghi của vi sinh vật cũng như của hệ thống nội bào với môi trường có độ mặn dao động cao [7]. Chúng có thành tế bào dày, độ bền cơ học lớn. Để chống lại độ mặn cao và thường xuyên biến động trong môi trường, vi khuẩn hiếu khí ưa mặn cần phải thiết lập cân bằng thẩm thấu giữa môi trường bên ngoài và môi trường nội bào. Cân bằng này có thể được thiết lập nhờ sự tích tụ các muối, các phân tử hữu cơ hoà tan, hoặc đồng thời tích tụ theo cả hai cách trên. Ngoài ra, tế bào còn có khả năng kiểm soát sự dịch chuyển của nước từ trong ra ngoài và từ ngoài vào trong, giữ trạng thái thẩm thấu trong không gian nội bào. Nồng độ các ion trong nội bào phụ thuộc vào từng thời kỳ sinh trưởng của tế bào, ở giai đoạn phát triển bão hoà nồng độ ion lớn hơn ở giai đoạn phát triển logarit [13]. Nhu cầu về muối Tất cả các vi khuẩn ưa mặn đều cần muối cho sinh trưởng, phát triển và có khả năng chống chịu ở nồng độ muối cao. Đặc tính này biến đổi tuỳ thuộc vào từng loài khác nhau. Hơn nữa, các đặc tính này thay đổi theo nhiệt độ sinh trưởng, thành phần chât dinh dưỡng có trong môi trường [8]. Trong môi trường mà có các thành phần như: glucoza, glyxerol ở môi trường muối cao thì nó sẽ làm giảm nhu cầu về muối [13]. Khi nhiệt độ tăng thì nồng độ muối tối thiểu và tối ưu cho phát triển sẽ tăng [8]. Nhu cầu dinh dưỡng Vi khuẩn ưa mặn có nhu cầu dinh dưỡng khá đơn giản, khi ở nồng độ muối cao nhu cầu này khắt khe hơn. Trong môi trường có nồng độ muối cao, vi khuẩn ưa mặn phát triển tốt khi có mặt của các chất dinh dưỡng phức hợp. Hiện tượng này có thể là do sự tích tụ các hợp chất hoà tan thích hợp hay các hợp chất tiền chất của chúng trong tế bào hoặc là do quá trình sinh tổng hợp sản sinh ra các yếu tố tăng trưởng [12]. Cơ chế chịu mặn của vi khuẩn Một điều đặc biệt trong cơ chế hoạt động của vi sinh vật ưa mặn và chịu mặn là khả năng chống chịu trước một áp suất thẩm thấu lớn gây ra bởi nồng độ muối cao của môi trường xung quanh. Khả năng này của vi sinh vật có được là do: - Khả năng tích tụ trong dung dịch tế bào nhiều muối vô cơ mà điển hình là KCl đồng thời đẩy ion Na+ ra khỏi tế bào [11]. - Khả năng tích tụ các hợp chất hữu cơ hoà tan bằng cách thuỷ phân các hợp chất dự trữ, hấp thụ từ môi trường bên ngoài hay tích tụ chúng từ quá trình sinh tổng hợp [11]. - Thành phần protein trong vi khuẩn ưa mặn có tỉ lệ cao các gốc axit và tỉ lệ thấp các axitamin kị nước [13], ngoài ra còn một lớp solvat hoá bao bọc bên ngoài nhờ tương tác giữa protein - dung môi, protein - protein trong môi trường khắc nghiệt [7]. - Thành tế bào dày, độ bền cơ học cao. Toàn bộ cơ chế được minh hoạ ở hình 1. Hình 1: Vận chuyển ion trong tế bào vi khuẩn ưa mặn hiếu khí [11]. 1: Proton được đẩy ra ngoài qua con đường vận chuyển eletron hô hấp 2: Vận chuyển proton nhờ năng lượng ánh sáng 3: Tạo ATP nhờ enzym tổng hơp ATP 4: Đối cổng Na+ / H+ 5: Dịch chuyển nồng độ Na+ cùng với sự vận chuyển của các axit amin 6: Đơn cổng K+ hoạt động nhờ chênh lệch thế năng của màng. 7: Hệ thống vận chuyển Cl- không cần năng lượng ánh sáng kèm theo vận chuyển ion Na+ . 8: Halorhodopsin, bơm ion Cl- hoạt động nhờ năng lượng ánh sáng. 1.2. Cơ sở lý thuyết của xử lý nước thải nuôi tôm cá 1.2.1. Hàm lượng chất hữu cơ Trong nước thải ao nuôi tôm cá, hàm lượng các chất hữu cơ rất cao. Các chất này có nguồn gốc chủ yếu từ phân tôm, từ thức ăn thừa, xác của phiêu sinh vật [4]. Đặc trưng cho yếu tố này là COD và BOD. COD (nhu cầu oxy hoá học) là lượng oxy cần thiết oxy hoá toàn bộ các chất hữu cơ trong nước thành CO2 và nước [1]. BOD ( nhu cầu oxy sinh hoá ) là lượng oxy cần thiết để oxy hoá các chất hữu cơ dễ phân huỷ trong nước bằng các vi sinh vật (chủ yếu là vi khuẩn) hoại sinh hiếu khí. Quá trình này được gọi là quá trình oxy hoá sinh học, tác nhân chủ yếu là vi sinh vật chúng sử dụng oxy hoà tan trong nước. Quá trình này được tóm tắt như sau: CHO + O2 CO2 + H2O [1] vi sinh vật tế bào mới (tăng sinh khối) 1.2.2. Oxy hoà tan (DO) DO là hàm lượng oxy hoà tan trong nước, là một trong những chỉ tiêu quan trọng nhất của nước. Oxy không thể thiếu được đối với tất cả các sinh vật sống trên cạn cũng như dưới nước và duy trì quá trình trao đổi chất sinh ra năng lượng cho sự sinh trưởng, sinh sản và tái sản xuất [2]. Oxy là chất khí khó hoà tan trong nước, không tác dụng với nước về mặt hoá học. Độ hoà tan của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố: áp suất, nhiệt độ, và các đặc tính của nước (các thành phần hoá học, vi sinh, thuỷ sinh sống trong nước...). Khi thải các chất sử dụng oxy vào nguồn nước, quá trình oxy hoá chúng sẽ làm giảm nồng độ oxy hoà tan trong các nguồn nước náy, thậm chí có thể đe doạ sự sống của các loài cá tôm cũng như sinh vật sống ở trong nước. Hàm lượng oxy hoà tan là cơ sở của phép phân tích xác định nhu cầu oxy sinh hoá. Đó là thông số cơ bản để đánh giá mưc độ ô nhiễm của nước thải, nước thải càng ô nhiễm (có COD và BOD cao) thì gía trị DO càng nhỏ [2]. 1.2.3. Độ đục Độ đục trong nước do các hạt lơ lửng, các chất hữu cơ phân huỷ hoặc do giới thuỷ sinh gây ra. Độ đục làm giảm khả năng truyền ánh sáng trong nước, ảnh hưởng đến khả năng quang hợp của các sinh vật tự dưỡng trong nước, gây mất cảm quan. 1.2.4. Độ màu Nước trong tự nhiên sạch, không có màu. Nước bị nhiễm bẩn có rất nhiều màu khác nhau: Màu của nước ao nuôi tôm cá chủ yếu do các chất hữu cơ trong xác động thực vật phân rã tạo thành và do tảo gây ra. Ví dụ, như màu nước trong là do đất chua phèn, ít tảo. Màu vàng do tảo vàng phát triển làm độ pH thấp. Màu nâu đen do tảo giáp phát triển mạnh, màu xanh lam do tảo lam phát triển [3]. 1.2.5. Hàm lượng các chất rắn Các chất rắn có trong nước là: - Các chất vô cơ ở dạng các muối hoà tan hoặc các chất không tan ở dạng huyền phù hoặc lơ lửng. - Các chất hữu cơ có trong nước thải nuôi tôm, cá như xác của vi sinh vật, tảo, động vật nguyên sinh, động thực vật phù du... hoặc các chất hữu cơ tổng hợp như: phân bón, các chất thải công nghiệp. Chất rắn trong nước làm trở ngại cho việc sử dụng và lưu chuyển nước, gây trở ngại cho việc nuôi trồng thuỷ sản. 1.2.6. Độ pH pH là một trong những chỉ tiêu xác định đối với nước thải và nước cấp. Chỉ số này cho ta biết cần thiết phải trung hoà hay không và tính lượng hoá chất cần thiết cho quá trình xử lý đông keo tụ hoặc xử lý bằng phương pháp sinh học. Sự thay đổi chỉ số pH làm thay đổi quá trình hoà tan hoặc keo tụ làm tăng hoặc giảm tốc độ của phản ứng sinh hoá xảy ra trong nước. Độ pH trong nước ở các ao nuôi tôm, cá là điều đáng chú ý nhất vì nó ảnh hưởng đến tính độc và nồng độ của NH3 , H2S. NH3 và H2S là các chất độc được sinh ra từ quá trình phân huỷ các chất thải. Khí NH3 sinh ra do sự bài tiết của tôm, sự phân huỷ các chất đạm có trong các vật chất yếm khí và hiếu khí. Khí H2S chỉ sinh ra từ các hợp chất hữu cơ lắng tụ khi phân huỷ trong điều kiện yếm khí. Tính độc của NH3 và H2S tuỳ thuộc vào dạng tồn tại của chúng trong môi trường. NH3 và H2S ở dạng khí có tính độc cao hơn ở dạng ion. Khi pH cao, NH3 dạng khí nhiều và H2S dạng khí ít. pH thấp, NH3 dạng khí ít và H2S dạng khí nhiều. Đặc biệt khi pH 7,5 - 8,5 thì NH3 và H2S ở dạng độc là ít nhất [4]. 1.2.7. Hàm lượng nitơ Nitơ là nguyên tố chủ yếu của các vi sinh vật, động vật nguyên sinh và thực vật phát triển được coi là dinh dưỡng hoặc kích thích sinh học và có thể tồn tại ở các dạng chủ yếu sau: Nitơ hữu cơ ( N - HC ); nitơ amoniac (N - NH3); nitơ nitơrit ( N - NO2- ); nitơ nitơrat ( N - NO3- ); và nitơ tự do. Nitơ là nguyên tố chính xây dựng tế bào, tổng hợp protein lên số liệu về chỉ tiêu oxitnitơ sẽ rất cần thiết để xác định khả năng có thể xử lý một loại nước thải nào đó bằng biện pháp sinh học. Hàm lượng nitơ trong nước cũng được xem là chất chỉ thị tình trạng ô nhiễm của nước, vì NH3 là sản phẩm phân huỷ của các chất chứa protein. Nitơ không chỉ gây ra các vấn đề phì dưỡng mà khi chỉ tiêu N- NO3- trong nước cấp cho sinh hoạt vượt quá 45mg/l cũng có thể gây nguy hại cho sức khoẻ con người [2]. 1.2.8. Các phiêu sinh vật Phiêu sinh vật trong nước gồm: phiêu sinh động vật, phiêu sinh thực vật và vi sinh vật. Phiêu sinh thực vật (tảo) có những ảnh hưởng có lợi trong ao. Bên cạnh việc sử dụng các chất dinh dưỡng thừa trong ao, chúng còn có những ảnh hưởng sau: - Làm giảm cường độ ánh sáng trong ao. - Tạo ra oxy. - ảnh hưởng đến pH. - ổn định nhiệt độ. - Làm thức ăn cho tôm. Khi phát triển mạnh, chúng sẽ sử dụng đạm và lân làm giảm tính độc của các hợp chất có nitơ như NH3 và NO2. Tuy nhiên, khi các phiêu sinh thực vật này chết, chúng sẽ tạo ra lượng lớn các chất hữu cơ trong nước, làm giảm oxy hoà tan trong nước. Động vật nổi (phiêu sinh động vật): Động vật nổi là nguồn thức ăn quan trọng cho tôm. Động vật nổi sử dụng thực vật nổi làm thức ăn và khi chúng phát triển làm cho thực vật nổi suy tàn. Vi khuẩn : Vi khuẩn là thành phần quan trọng trong hệ sinh thái ao nuôi. Vi khuẩn có liên quan đến sự phân huỷ các chất hữu cơ thành các chất dinh dưỡng có tính độc như NH3 và NO2. Vi khuẩn cũng có vai trò trong việc hấp thụ các chất dinh dưỡng nói trên hoặc chuyển hoá chúng thành những dạng ít độc hơn. Một vài loài có thể gây hại trực tiếp cho tôm, nghiêm trọng nhất là các loài thuộc giống Vibrio. Ao nuôi nuôi thường có mật độ vi khuẩn cao, kể cả trong nước và lớp bùn đáy [4]. 1.3. Xử lý nước thải ao nuôi tôm, cá bằng phương pháp sinh học. Phương pháp này dựa trên cơ sở nhờ hoạt động của vi sinh vật để phân huỷ các chất hữu cơ gây nhiễm bẩn. Trong nước thải, vi sinh vật sử dụng các chất hữu cơ và một số chất khoáng làm nguồn dinh dưỡng để xây dựng tế bào, sinh trưởng, sinh sản và tăng sinh khối. Quá trình phân huỷ các chất nhờ vi sinh vật gọi là quá trình oxy hoá sinh hoá. Nước thải để xử lý bằng phương pháp này cần không chứa các chất độc và tạp chất, các muối kim loại nặng hoặc nồng độ của chúng không vượt quá nồng độ cực đại cho phép, tỉ số BOD/COD ³ 0,5. Các chất hữu cơ có trong nước, phải là cơ chất dinh dưỡng, nguồn năng lượng và nguồn cacbon cho vi sinh vật. Với các hợp chất hyđrat cacbon, protein, lipit thường là cơ chất rất tốt cho vi sinh vật [2]. Bên cạnh các chất dễ bị phân huỷ trên, còn rất nhiều chất chỉ bị oxy hoá một phần hoặc thậm chí hoàn toàn không bị phân huỷ. Các chất hữu cơ tự nhiên như: lignin là khó bị phân huỷ, kitin chỉ bị phân huỷ một phần rất nhỏ. Các chất hữu cơ tổng hợp từ hyđrat cacbon, alcon, aldehyt, este... có chất bị phân huỷ chậm, có chất dường như không bị phân huỷ [2]. Để phân loại các phương pháp sinh học, người ta thường dựa trên phương thức hoạt động của các nhóm vi sinh vật khác nhau, song nhìn chung chúng có thể được chia thành ba nhóm chính sau: - Phương pháp xử lý yếm khí: Là phương pháp xử lý trong điều kiện không có oxy của không khí, các vi sinh vật tham gia vào quá trình này là các vi sinh vật yếm khí. - Phương pháp hiếu khí: Là phương pháp xử lý trong điều kiện bắt buộc phải có oxy. Các vi sinh vật tham gia vào quá trình này là các vi sinh vật hiếu khí để đảm bảo hoạt động sống của chúng cần cung cấp oxy liên tục và duy trì nhiệt độ trong khoảng 20 ữ 400C. - Phương pháp thiếu khí: Là phương pháp xử lý mà có mặt cả vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí. Có thể tóm tắt các phương pháp xử lý bằng sơ đồ hình 2 Các phương pháp sinh học xử lý nước thải Hiếu khí Aerobic Thiếu khí Anoxic Kỵ khí Anaerobic Bùn hoạt tính Đĩa quay sinh học Màng lọc sinh học Ao hồ ổn đinh nước thải Khử Nitrat Bể kỵ khí Bể lọc kỵ khí USBA Hình 2: Các loại hình công nghệ xử lý nước thải bằng biện pháp sinh học Dựa vào đặc điểm của nước thải và yêu cầu về mức độ làm sạch mà ta chọn phương pháp xử lý cho thích hợp. 1.3.1. Xử lý nước thải ao nuôi tôm, cá bằng phương pháp lọc sinh học Lọc sinh học là một tiến trình bao gồm một số quá trình sinh hoá quan trọng xảy ra trong bể lọc thực chất là các quá trình khoáng hoá, nitrate hoá và sự khử nitrate hoá bởi vì các vi sinh vật lơ lửng trong nước hay bám vào các vật liệu lọc của hệ thống lọc tạo ra lớp màng nhầy gọi là màng sinh học. Màng sinh học là tập hợp các vi sinh vật có độ dày từ 0,1 á 0,4mm và hơn nữa. Màu của nó thay đổi theo thành phần của nước thải, từ vàng xám đến nâu tối. Màng sinh học cũng gồm các vi khuẩn , nấm mốc và vi sinh vật khác [2]. Mục đích của lọc sinh học là thông qua vật liệu lọc làm gia tăng lượng vi sinh vật tham gia thực hiện quá trình khoáng hoá và nitrat hoá để chuyển đổi các dạng độc chất amonia và nitrit thành dạng nitrat vô hại. VSV Nước ao nuôi Khoáng hoá Nitrat hoá Sp vô hại Những vi khuẩn tham gia vào quá trình xử lý này là các loại trực khuẩn không tạo nha bào Gram ( - ), các loại vi khuẩn dị dưỡng. 1.3.1.1. Cơ chế hình thành màng sinh học Màng sinh học được tạo thành chủ yếu do các vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tuỳ tiện. Lớp ngoài cùng của màng là lớp hiếu khí thường có loài trực khuẩn như Bacillus, lớp trung gian là các vi khuẩn tuỳ tiện như: Alcaligenes, Flavolacterium... và cả Bacillus. Lớp sâu bên trong màng là các vi khuẩn kỵ khí như vi khuẩn khử lưu huỳnh, khử nitrat. 1.3.1.2. Quá trình oxy hoá xảy ra trên lớp màng sinh học Khi dòng nước chảy trùm lên lớp màng sinh học, các chất hữu cơ dễ bị phân huỷ sẽ được hấp thụ vào màng sinh học, bị phân huỷ bởi các vi sinh vật hiếu khí tạo thành CO2 và nước, oxy trong thức ăn đồng hoá được vận chuyển và khuyếch tán qua bề dày lớp màng sinh học cho tới chừng nào mà các đám tế bào ở sâu nhất không tiếp xúc được với oxy và thức ăn đồng hoá trực tiếp nữa. Sau một thời gian nhất định sẽ xuất hiện phân tầng giữa lớp hiếm khí chồng lên lớp kỵ khí. ở lớp ưa khí có sự khuyếch tán oxy, lớp kỵ khí sâu hơn không có sự khuyếch tán oxy. Trong quá trình xử lý, chất bị hấp thụ chuyển hoá thành sản phẩm của quá trình trao đổi chất là CO2 sẽ được thoát ra qua màng chất lỏng. Oxy hoà tan được bổ xung bằng cách hấp thụ từ ngoài không khí. Nước thải ra ngoài thiết bị đã được làm sạch. Khi không còn nguồn hữu cơ cacbon từ bên ngoài thì các vi sinh vật ngay sát bề mặt chất mang bắt đầu bước vào giai đoạn hô hấp nội bào (quá trình tự oxy hoá) và mất khả năng bám chặt vào bề mặt chất mang. Khi đó nước thải rửa xói lớp màng nhầy khỏi bề mặt chất mang và một lớp màng mới lại bắt đầu sinh trưởng. Cứ như thế, hết lớp màng này tróc ra lại có lớp màng mới xuất hiện. Nước thải liên tục được làm sạch. 1.3.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lọc sinh học Nhiệt độ. Tốc độ phản ứng oxy hoá sinh hoá tăng khi nhiệt độ tăng xong trong thực tế nhiệt độ nước thải trong hệ thống xử lý được duy trì trong khoảng 20 ữ 300C . Khi nhiệt độ tăng quá ngưỡng trên có thể làm cho các vi khuẩn bị chết, còn ở nhiệt độ quá thấp, tốc độ làm sạch sẽ bị giảm và quá trình thích nghi của vi sinh vật với môi trường mới bị chậm lại, các quá trình nirat hoá hoạt tính keo tụ và lắng bùn bị giảm hiệu suất. Còn trong phạm vi tối ưu, khi nhiệt độ tăng, quá trình phân huỷ các chất hữu cơ tăng gấp hai đến ba lần. Tuy nhiên, khi nhiệt độ nước thải tăng thì độ hoà tan của oxy trong nước bị giảm. Do đó, để duy trì nồng độ oxy hoà tan trong nước người ta thường tiến hành sục khí mạnh vào liên tục [2]. Các nguyên tố dinh dưỡng và vi lượng Để có phản ứng sinh hoá, nước thải cần chứa hợp chất của các nguyên tố dinh dưỡng và vi lượng. Đó là các nguyên tố N, S, P, K, Mg, Ca, Na, Fe, CL, Mn, Mo,Ni, Co, Zn, Cu... trong đó N, P, K là các nguyên tố chủ yếu, cần được đảm bảo một lượng cần thiết trong xử lý sinh hoá. Hàm lượng các nguyên tố không cần phải định mức vì chúng có trong nước thải đủ cho nhu cầu của các vi sinh vật. Khi thiếu nitơ nâu dài, ngoài việc cản trở quá trình sinh hoá các chất bẩn hữu cơ còn tạo ra bùn hoạt tính khó lắng. Khi thiếu photpho dẫn đến sự phát triển của vi khuẩn dạng sợi, là nguyên nhân chính làm cho bùn hoạt tính bị phồng lên, khó lắng và bị cuốn ra khỏi hệ thống xử lý, làm giảm sinh trưởng của bùn hoạt tính và giảm cường độ của quá trìmh oxy hoá. Hàm lượng các nguyên tố dinh dưỡng phụ thuộc vào thành phần của nước thải và tỷ lệ giữa chúng được xác định bằng thực nghiệm. Để tính toán sơ bộ người ta lấy tỷ lệ BOD : N : P = 100:5:1, tỷ lệ này chỉ đúng cho ba ngày đầu. Còn khi quá trình xử lý kéo dài để tránh giảm hiệu suất ủa bùn hoạt tính cần giảm lượng nitơ và photpho trong nước thải. Khi quá trình xử lý kéo dài 20 ngày thì tỷ lệ BOD : N: P cần giữ 200: 5: 1.[2] Oxy hoà tan Trong bể lọc sinh học có cả vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí, nhưng vi khuẩn hiếu khí chiếm ưu thế trong các bể lọc được xục khí tốt. Trái lại thì hoạt động của bể lọc sẽ bị ngăn cản khi thiếu oxy và thiếu sự tuần hoàn của nước qua bể lọc. Khi oxy giảm thì vi khuẩn kỵ khí phát triển làm giảm khả năng lọc và tạo ra sản phẩm độc H2S, NH4OH, CH4... Bề mặt vật liệu lọc Các vi sinh vật cần cho sự nitrat hoá bám vào vật liệu lọc nhiều hơn hàng trăm lần so với các vi sinh vật sống lơ lửng trong nước. Vì vậy, yếu tố rất quan trọng cho việc lọc sinh học là diện tích bề mặt vật liệu lọc, nơi mà hầu hết các quá trình nitrat hoá xảy ra. Vật liệu lọc hình góc cạnh giúp cho sự lưu tốc nước dễ dàng và kích thước nhỏ giúp cho vi khuẩn bám vào nhiều hơn vật liệu lọc có kích thước lớn [4]. Các chất độc Khả năng lọc phụ thuộc vaò số lượng các vi sinh vật mà các chất độc ảnh hưởng đến khả năng sống của chúng. Khi có mặt các loại chất độc như các hoá chất, thuốc diệt cá, oxymetaxilin, cloraphenin, sulfamít, KMnO4, CuSO4... khả năng lọc sẽ ảnh hưởng theo hai cách sau: - Sự tăng trưởng và phát triển của vi sinh vật trong bể lọc bị giảm và có khả năng làm chết vi sinh vật. - Không gây ảnh hưởng tăng trưởng và phát triển của vi sinh vật nhưng ảnh hưởng đến sự biến dưỡng của tế bào vi sinh vật làm giảm khả năng lọc [4]. Độ mặn nhiều vi khuẩn trong bể lọc chịu được sự thay đổi độ mặn khá dễ dàng, dù rằng sự ức chế hoạt động đo lường được. Nếu có sự thay đổi lớn đột ngột, như khi độ mặn tăng 0,5% hay giảm 0,8% không ảnh hưởng đến quá trình nitrat hoá. Ngoài ra giá trị pH cũng ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tạo men trong tế bào và quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng vào tế bào. Đối với đa số vi sinh vật khoảng giá trị pH tối ưu là từ 6,8 ữ 8,5. Phần 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu 2.1.1. Chủng giống vi sinh vật Gồm 12 chủng: NH4-1, NH4-2, NH4-3, NH4-4, NH4-5, NH4-6, NH4-7, NH4-8, NH4-9, NH4-10, NH4-12 được phân lập từ mẫu nước ao nuôi tôm Đồ Sơn. 2.1.2. Hoá chất 2.1.2.1. Hoá chất xác định DO Dung dịch đệm phốt phát: Hoà tan 8,5g KHPO4 + 21,75g K2HPO4 + 33,4 g Na2HPO4.7H2O + 1,7gNH4Cl trong 500 ml nước cất rồi định mức đến 1 lít. Dung dịch MgSO4: Hoà tan 22,5g MgSO4.7H2O trong 200ml lít nước cất rồi định mức đến 1lít. Dung dịch CaCl2: Hoà tan 27,5 g CaCl2 trong 300ml nước cất rồi định mức đến 1lít. Dung dịch FeCl3 : Hoà tan 0,25g FeCl3.6H2O trong 200ml nước cất rồi định mức đến 1lít. Dung dịch MnSO4: Hoà tan 480g MnSO4.4H2O trong 200ml nước cất rồi định mức đến 1lít. Dung dịch I- trong kiềm: Hoà tan 700g KOH và 150g KI trong 1 lít nước cất. Thêm vào dung dịch này 10g NaN3 đã hoà tan trong 40 ml nước cất. Dung dịch hồ tinh bột 1%: Hoà tan 1g hồ tinh bột trong 100ml nước cất mới sôi, để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm vào đó vài giọt focmandehyt để bảo quản. Dung dịch Na2S2O3 0,025N: Hoà tan 6,205g Na2S2O3.5H2O trong 200ml nước cất mới sôi, để nguội đến nhiệt độ phòng rồi định mức đến 1lít bằng nước cất và bổ sung 0,4g NaOH để bảo quản. 2.1.2.2. Hoá chất xác định BOD5 Giống hoá chất xác định DO. 2.1.2.3. Hoá chất xác định COD Dung dịch muối mohr 0,1N: Hoà tan 39g Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O tinh khiết trong 200ml nước cất. Thêm 20ml H2SO4 đặc, để nguội rồi định mức đến 1lít bằng nước cất. Dung dịch H2SO4 đặc có thêm 22g Ag2SO4 cho một chai 9 lít . Ag2SO4 tinh khiết. H2SO4 98% tinh khiết. Chỉ thị axit phenylanthranilic 1% Hoà tan 0,2g axit phenyl anthranilic trong 100ml dung dịch Na2CO3 0,2% . 2.1.2.4. Hoá chất xác định NH4+ Dung dịch NH4Cl: Cân 0,2965g NH4Cl (tinh khiết) đã được sấy khô ở nhiệt độ 105-1100C sau đó pha bằng 1 lít nước cất 2 lần. Thuốc thử: Nessler : Hoà tan 80mg KI và 115 mg HgI2 bằng 500ml nước cất hai lần, trộn đều cho tan . Thêm vào dung dịch này 500ml dung dịch NaOH ( 6N). Để lắng kết tủa vài ngày trong chỗ tối. Gạn lấy dung dịch trong xuốt vào chai tối màu (dung dịch này có màu vàng yếu). Dung dịch Xe-nhiet. Hoà tan 50g kali natritactrat (KNaC4H4O6) trong 80ml nước cất hai lần, sau đó định mức đến 100ml bằng nước cất hai lần, đổ dung dịch này ra cốc thuỷ tinh, thêm vào dung dịch 5ml dung dịch NaOH (10%). Đun dung dịch này trên bếp từ 5 ữ 10 phút. 2.1.3. Thiết bị, máy móc Bảng 2. các thiết bị và máy móc cần thiết: 1- Tủ ấm Trung Quốc 2- Máy lắc Việt Nam 3- Tủ cấy vô trùng Việt Nam 4- Nồi hấp thanh trùng Trung Quốc 5- Cân điện tử Nhật Bản 6- Tủ lạnh Nhật Bản 7- Máy đo pH Thuỵ Điển Và các dụng cụ cần thiết khác 2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật Môi trường Số 1 (g/l): Cao thịt : 5 Pepton : 10 Nước biển : 1000ml PH = 6,9á 7 Môi trường Số 2 (MPA)g/l: Cao thịt : 5 Pepton : 10 Nước biển : 1000ml Agar : 20g pH = 6,9 á 7 Môi trường Số 3 (g/l): CaCO3 : 5 NH4Cl : 0,5 K2HPO4 : 0,05 Nước biển : 400ml Bổ sung thêm nước cất đến 1000ml. Môi trường Số 4 (g/l): CaCO3 : 5 NH4Cl : 0,5 K2HPO4 : 0,05 Agar : 20g Nước biển : 400ml Bổ sung thêm nước cất đến 1000ml. Môi trường Số 5 (g/l): NaCl : 25 MgSO4.7H2O : 12.5 Cao men : 10 Pep ton : 2,5 Xitrat natri : 3 NH4Cl : 2 KNO3 : 2 Na2HPO4 : 0,5 NaH2PO4 : 0,3 Nước biển : 1000 ml 2.2. Phương pháp 2.2.1. Các phương pháp vi sinh 2.2.1.1. Xác định số lượng vi sinh vật * Nguyên tắc: Nhỏ giọt canh trường lên trên bề mặt môi trường thạch thích hợp. Mỗi một vi sinh vật sẽ phát triển thành một khuẩn lạc. Số khuẩn lạc trên bề mặt thạch chính là số khuẩn lạc ban đầu. Cách làm: Pha loãng một cách tuần tự từ 1 ml (1g) của mẫu theo tỷ lệ thích hợp. Dùng pipet đã thanh trùng lấy dịch đã pha loãng ở trên nhỏ vào hộp Petri đã có môi trường (mỗi mẫu pha loãng dùng hai hộp). ủ các hộp này trong tủ ấm ở 300C á 320C kéo dài 24 giờ. Đếm số lượng khuẩn lạc trên mặt thạch và tính toán kết quả trên lượng mẫu ban đầu. Số lượng vi sinh vật tổng số được tính theo công thức sau : ồ C (n1+n2.10-1+…..+n.10-n-1).d.m N = (CFU/g), (CFU/ml) , Trong đó: ồC: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các hộp petri. n1: số khuẩn lạc trong hộp Petri ở tỷ lệ pha loãng lần 1. n2: số khuẩn lạc trong hộp Petri ở tỷ lệ pha loãng lần 2. n: số khuẩn lạc trong hộp Petri ở tỷ lệ pha loãng lần n. d : tỷ lệ pha loãng lần 1. m : lượng mẫu ban đầu. 2.2.1.2 Quan sát hình thái và cấu tạo của vi khuẩn * Phương pháp nhuộm Gram. Nguyên tắc : Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một quá trình hấp phụ, khả năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan đến muối Magie của axit ribonucleic. Khi nhuộm phức tạp, muối này có phản ứng với thuốc thử loại triphenylmetan (gelatinviolet cryatan violet hoặc metylviolet) chịu được tác dụng của cồn. Nghĩa là không mất màu dưới tác dụng của cồn, những vi sinh vật như vậy gọi là vi khuẩn Gram (+), ngược lại những vi sinh vật không giữ được màu khi xử lý, như vậy gọi là vi khuẩn Gram (-).[ 14], [15]. * Cách tiến hành nhuộm. - Làm tiêu bản vi sinh vật. Cố định vết bôi. Nhuộm bằng tím gential (gential violet) bằng cách nhỏ tím gential lên vết bôi. Giữ trong 1 đến 2 phút. Đổ hết thuốc nhuộm đi, nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản để trong 1 phút. Đổ hết thuốc nhuộm đi rồi nhúng vào cồn 95 0 trong 30 ữ 40 giây Rửa lại bằng nước. Làm khô vết bôi. Nhuộm bổ sung bằng dung dìch Fuchsin loãng trong 1 ữ 2 phút. Rửa lại bằng nước, đợi khô sau đó đem quan sát dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu. Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) có màu tím, Gram (-) có màu hồng. 2.2.1.3. Phân lập vi khuẩn ưa mặn có hoạt tính sinh học * Phân lập vi khuẩn ưa mặn có hoạt tính phân huỷ NH4+. Lấy 1 ml mẫu, đem đi pha loãng bằng nước muối sinh lý vô trùng 0,85% ở các độ pha loãng khác nhau. Lấy 0,1 ml từ mỗi độ pha loãng nhỏ vào hộp Petri chứa môi trường Số (4) trang đều và nuôi trong tủ ấm ở 300 C trong 24 giờ. Sau đó tách các khuẩn lạc riêng rẽ thuần khiết sang ống thạch nghiêng. * Tuyển chọn vi khuẩn ưa mặn phân huỷ NH4. Sau khi các khuẩn lạc riêng rẽ, dùng que cấy tách lấy các chủng này cấy vào môi trường Số 3 và sau 24 giờ xác định nồng độ NH+4 còn lại và chọn các chủng có khả năng phân huỷ NH4+ nhiều nhất. 2.2.2. Các phương pháp hoá học. 2.2.2.1. Xác định DO. Xác định nồng độ oxy hoà tan trong nước nguồn cũng như trong nước thải người ta thường dùng phương pháp Winkler. Phương pháp phân tích này dựa vào quá trình oxy hoá Mn2+ thành Mn4+ trong môi trường kiềm và Mn4+ lại có khả năng oxy hoá I- thành I2 tự do trong môi trường axit. Như vậy lượng I2 được giải phóng tương đương với lượng oxy hào tan có trong nước. Lượng Iot này được xác định bằng phương pháp chuẩn độ bằng dung dịch Nat._.