Nghiên cứu sản xuất Pectinmethylesterase từ Aspergillus oryzae

đã tận tình hướng dẫn giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Xin chân thành cảm ơn quí thầy cô trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tận tình giảng dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức cũng như những kinh nghiệm bổ ích trong suốt quá trình học tập tại trường. Chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình. Cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Thực phẩm khoá 29 đã giúp đỡ, góp ý và cùng tôi học tập, chia sẻ những kinh nghiệm quý báu trong khoảng thời gian 5 năm học tập tại trường. Chân thành cảm ơn! Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng ii TÓM LƯỢC Nhờ khả năng phân cắt pectin mà enzyme pectinmethylesterase được ứng dụng nhiều trong ngành thực phẩm, với mục tiêu nghiên cứu để tìm ra những điều kiện thích hợp để sản xất PME từ nguồn vi sinh vật. Đề tài thực hiện “Nghiên cứu sản xuất pectinmethylesterase từ Aspergillus oryzae” được tiến hành khảo sát: - Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp để nấm mốc Aspergillus oryzae có khả năng tổng hợp PME mạnh nhất, tiến hành với 2 lần lặp lại - Thí nghiệm 2: Khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy như nhiệt độ nuôi cấy, độ ẩm, pH để thu được chế phẩm có hoạt tính cao nhất, tiến hành với 2 lần lặp lại - Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ pectin đến hoạt tính xúc tác của enzyme để xác lập phương trình Michaelis-Menten tiến hành với 2 lần lập lại. Qua quá trình thí nghiệm đã cho các kết quả như sau: - Thành phần môi trường: 70% cám + 25% trấu + 5% vỏ bưởi - Thời gian thu nhận chế phẩm thích hợp: 42 giờ - Nhiệt độ nuôi cấy: 37oC - Độ ẩm môi trường nuôi cấy: 55% - pH môi trường nuôi cấy: 5,5 - Vmax = 1,9592 ± 0,0356 và Km= 0,8523 ± 0,0835. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng iii MỤC LỤC
  Trang LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i TÓM LƯỢC................................................................................................................... ii MỤC LỤC..................................................................................................................... iii DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................... vi DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................. vii CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU............................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................ 2 CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ....................................................................... 3 2.1 Giới thiệu chung....................................................................................................... 3 2.1.1 Enzyme pectinmethylesterase............................................................................... 3 2.1.2 Nguồn tổng hợp pectinmethylesterase................................................................. 3 2.1.3 Giới thiệu về pectin............................................................................................... 4 2.2 Cấu trúc, tính chất và cơ chế hoạt động thủy phâncủa pectinmethylesterase.......... 6 2.2.1 Cấu trúc ................................................................................................................. 6 2.2.2 Tính chất ............................................................................................................... 6 2.2.3 Cơ chế hoạt động thủy phân ................................................................................. 7 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính xúc tác của pectinmethylesterase.......................... 8 2.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme .......................................................................... 8 2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ........................................................................... 9 2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ ...................................................................................... 10 2.3.4 Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme.......................................................... 11 2.3.5 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm....................................................................... 12 2.3.6 Ảnh hưởng của chất hoạt hoá.............................................................................. 13 2.4 Sản xuất pectinmethylesterase từ nấm mốc ........................................................... 14 2.4.1 Môi trường nuôi cấy............................................................................................ 14 Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng iv 2.4.2 Giống vi sinh vật ................................................................................................. 15 2.4.3 Phương pháp nuôi cấy......................................................................................... 17 2.4.4 Thu nhận enzyme ................................................................................................ 18 2.4.5 Kỹ thuật sản xuất pectinmethylesterase.............................................................. 19 a. Quy trình kỹ thuật sản xuất enzyme PME ............................................................... 19 b. Thuyết minh quy trình.............................................................................................. 20 2.4.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp hoạt tính của PME..................... 21 2.5 Một số ứng dụng của pectinmethylesterase ........................................................... 22 2.5.1 Trong sản xuất nước quả và rượu vang............................................................... 22 a. Tăng hiệu suất ép, thu nhận dịch quả ....................................................................... 23 b. Làm trong................................................................................................................. 26 c. Cải thiện cấu trúc...................................................................................................... 27 2.5.2 Trích ly dược liệu................................................................................................ 27 2.5.3 Trong chăn nuôi .................................................................................................. 28 2.5.4 Những bất lợi khi sử dụng chế phẩm enzyme..................................................... 28 CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM...................... 29 3.1 Phương tiện thí nghiệm.......................................................................................... 29 3.1.1 Địa điểm, thời gian.............................................................................................. 29 3.1.2 Vật liệu................................................................................................................ 29 3.1.3 Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................... 29 3.1.4 Thiết bị, hoá chất................................................................................................. 29 3.1.5 Môi trường nuôi cấy............................................................................................ 31 3.2 Phương pháp thí nghiệm ........................................................................................ 31 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy khác nhau đến sự tổng hợp pectinmethylesterase ................................................. 31 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm, nhiệt độ, pH môi trường đến sự tổng hợp pectinmethylesterase..................................................................................... 33 3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (pectin) đến hoạt tính của pectinmethylesterase để xác lập phương trình Michaelis-Menten ....................... 35 Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng v CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................... 36 4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khác nhau và thời gian nuôi cấy đến sự tạo thành pectinmethylesterase .......................................................... 36 4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng điều kiện môi trường đến sự tạo thành enzyme pectinmethylesterase .................................................................................................... 41 4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ pectin đến khả năng hoạt động của pectinmethylesterase. ................................................................................................... 48 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 50 5.1 Kết luận .................................................................................................................. 50 5.2 Đề nghị ................................................................................................................... 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................ 52 PHỤ LỤC.................................................................................................................... viii Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng vi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Sự phân cắt pectin của PME bắt đầu từ nhóm carboxyl ....... Error! Bookmark not defined. Hình 2. Cấu tạo pectin ........................................................................................................... 4 Hình 3. Cấu tạo acid α-D-galacturonic.................................................................................. 4 Hình 4. Cấu trúc bậc II của PME cà chua và cà rốt ............................................................. 6 Hình 5. Phản ứng thuỷ phân pectin dưới sự xúc tác của PME.............................................. 7 Hình 6. Trung tâm hoạt động của PME từ cà rốt. Cơ chất là đơn vị acid methyl-ester D-galacturonic được gắn vào trung tâm hoạt động........................................................ 8 Hình 7. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng ............................................ 9 Hình 8. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme ........................................... 9 Hình 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến tốc độ phản ứng của enzyme............................ 10 Hình 10. Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme................................................... 11 Hình 11. Hình dạng nấm sợi................................................................................................ 16 Hình 12. Tác dụng của PME trong quá trình làm trong nước quả ...................................... 27 Hình 13. Cấu trúc của pectate calcium................................................................................ 27 Hình 14. Máy phân tích ẩm ................................................................................................. 30 Hình 15. Máy đo pH............................................................................................................ 30 Hình 16. Máy chuẩn độ acid-bazơ 785 TITRINO .............................................................. 30 Hình 17. Đồ thị hoạt tính PME riêng theo kiểu môi trường và thời gian nuôi ................... 38 Hình 18. Đồ thị hoạt tính PME tổng theo thời gian nuôi và kiểu môi trường nuôi ............ 40 Hình 19. Đồ thị biểu diễn hoạt tính PME riêng theo nhiệt độ, độ ẩm, pH.......................... 44 Hình 20. Đồ thị biểu diễn hoạt tính PME tổng theo nhiệt độ, độ ẩm, pH........................... 47 Hình 21. Đồ thị Michaelis-Menten về mối quan hệ [pectin]-PME.................................... 49 Hình 22. Phản ứng thuỷ phân pectin của PME .................................................................. viii Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng vii DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Hàm lượng pectin của một số loại quả và dịch quả ................................................. 5 Bảng 2. Thành phần dinh dưỡng của cám........................................................................... 14 Bảng 3. Các nguồn vi sinh vật để sản xuất enzyme ............................................................ 15 Bảng 4. Một số ví dụ về ứng dụng của enzyme trong ngành sản xuất thực phẩm.............. 22 Bảng 5. Hiệu quả xử lý nước táo và nước quả vả bằng chế phẩm enzyme pectinase......... 24 Bảng 6. Hoạt tính PME riêng theo ảnh hưởng của thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy ................................................................................................................................ 37 Bảng 7. Hoạt tính PME tổng theo ảnh hưởng của thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy ................................................................................................................................ 39 Bảng 8. Hoạt tính PME riêng trung bình theo nhiệt độ môi trường nuôi cấy..................... 41 Bảng 9. Hoạt tính PME riêng trung bình theo pH môi trường nuôi cấy ............................. 42 Bảng 10. Hoạt tính PME riêng trung bình theo độ ẩm môi trường nuôi cấy...................... 42 Bảng 11. Hoạt tính pectinmethylesterase riêng theo nhiệt độ, độ ẩm, pH.......................... 43 Bảng 12. Hoạt tính PME tổng trung bình theo nhiệt độ môi trường nuôi cấy.................... 44 Bảng 13. Hoạt tính PME tổng trung bình theo pH môi trường nuôi cấy ............................ 45 Bảng 14. Hoạt tính PME tổng trung bình theo độ ẩm môi trường nuôi cấy ....................... 45 Bảng 15. Hoạt tính pectinmethylesterase tổng theo nhiệt độ, độ ẩm, pH ........................... 46 Bảng 16. Hoạt tính PME riêng trung bình theo nồng độ pectin......................................... 48 Bảng 17. Hoạt tính PME riêng trung bình theo nồng độ pectin dựa trên phương trình Mischaelis-Menten....................................................................................................... 48 Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 1 CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Ứng dụng enzyme để hỗ trợ cho quá trình sản xuất trong chế biến thực phẩm đã trở nên phổ biến và quen thuộc. Bản chất của enzyme là những chất protein. Chúng được sản xuất ra bởi tế bào sống (động vật, thực vật, và vi sinh vật), là chất xúc tác cho các phản ứng sinh học. Một chức năng chính của enzyme trong hoạt động sống là xúc tác sự hình thành và cắt đứt các liên kết hóa học. Nghiên cứu, sản xuất enzyme và ứng dụng enzyme được phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ thứ XX đến nay. Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại những thuận lợi rất lớn. Việt Nam là một trong nhiều nước có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzyme. Ngày nay, do ưu thế về nhiều mặt vi sinh vật trở thành nguồn thu enzyme chủ đạo. Tùy mục đích sử dụng mà người ta sản xuất nhiều dạng chế phẩm: enzyme thô, enzyme bán tinh khiết, enzyme tinh khiết. Sản xuất enzyme từ vi sinh vật so với từ động vật và thực vật có rất nhiều ưu điểm như: - Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh - Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao - Vi sinh vật là giới sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo qui mô công nghiệp - Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo qui mô công nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm - Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau. Enzyme pectinmethylesterase (PME) ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm đặc biệt là đối với các sản phẩm từ rau quả và trong công nghệ sản xuất nước quả nhất là sản xuất nước quả trong. PME phân cắt nhóm methoxyl của pectin, có tác dụng làm trong dịch chiết ép, tăng hiệu suất ép, hiệu suất trích ly các chất trong tế bào thực vật, đảm bảo quá trình lọc diễn ra tốt hơn. Bên cạnh đó, trong sản xuất rau quả đóng hộp, PME cùng với sự hiện diện những cation hóa trị 2 (như: Ca++) sẽ tạo nên sự cứng chắc cho sản phẩm. Với những thuận lợi và sự cần thiết sản xuất enzyme, đề tài được thực hiện để nghiên cứu sản xuất enzyme pectinmethylesterase từ nấm mốc Aspergillus oryzae. Bởi những ứng dụng ngày càng rộng rãi của PME thì việc sản xuất ra enzyme này sẽ góp phần đưa công nghệ enzyme ngày càng phát triển, góp phần hạ giá thành chế phẩm enzyme, tạo điều kiện để mở rộng sản xuất enzyme trong thực tế, cải thiện được qui trình sản xuất, cải thiện điều kiện lao động, nâng cao chất lượng và hạ giá thành sản phẩm. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 2 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Trong điều kiện nuôi cấy với cơ chất và môi trường thích hợp từ nấm sợi Aspergillus oryzae có thể thu nhận được chế phẩm enzyme pectinmethylesterase. Do khả năng tổng hợp, hoạt tính enzyme phụ thuộc rất nhiều yếu tố trong khi nuôi cấy. Đề tài thực hiện thí nghiệm để khảo sát: - Ảnh hưởng của thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy đến quá trình tổng hợp pectinmethylesterase - Điều kiện môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, pH, độ ẩm) ảnh hưởng đến sự sản sinh ra enzyme pectinmethylesterase - Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính PME. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 3 CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung 2.1.1 Enzyme pectinmethylesterase Pectinmethylesterase (PME) (pectin pectylhydrolase, EC 3.1.1.11) là enzyme xúc tác sự thủy phân các polymer pectin. Enzyme này thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galacturonate nằm kề đơn vị không bị ester hóa, phân cắt các nhóm methoxyl (– OCH3) đứng cạnh các nhóm – COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol. Hiệu suất thủy phân pectin của enzyme này rất cao, có thể đạt 98%. Emzyme này còn có tên khác là pectinesterase (PE). Sự thủy phân pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme này vì vậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả. Enzyme PME cũng được ứng dụng nhiều trong quá trình chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả. Việc kiểm soát hoạt động của enzyme cũng có thể điều chỉnh được độ nhớt của sản phẩm (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004). 2.1.2 Nguồn tổng hợp pectinmethylesterase PME có thể tổng hợp từ nguồn thực vật và vi sinh vật. + Thực vật PME có nhiều trong hầu hết các loại trái cây. Đặc biệt có nhiều trong cà chua, chuối, cam, táo,…PME ở thực vật thường tồn tại dạng đồng phân, tỷ lệ giữa các dạng đồng phân thay đổi theo sự tăng trưởng của quả. Ví dụ: ở cà chua tồn tại 2 dạng đồng phân là PME1 và PME2. Khi quả trong giai đoạn trái bắt đầu chín, PME1 và PME2 đều tăng nhưng ở giữa giai đoạn chín thì PME1 giảm xuống, PME2 tiếp tục tăng đến cuối quá trình chín. +Vi sinh vật Hình 1. Sự phân cắt pectin của PME bắt đầu từ nhóm carboxyl Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 4 Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. - Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus terrus, Aspergillus saitoi, Penicillium glaucum, Penicillium chrysogenum, Penicillium expanam, Penicillium Cilrimim, Fusarium monniliforme,… - Nấm men: Saccharomyces fragilis - Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella aerogenes, Erwinia,… Thông thường, pectinase được tạo ra từ nấm mốc thủy phân pectin mạnh hơn pectinase từ thực vật. 2.1.3 Giới thiệu về pectin Pectin là polimer của α-D-galacturonic acid nối với nhau nhờ liên kết α-1,4. Trong đó các nhóm acid của acid galactose bị ester hóa một phần bằng rượu metylic. Tùy thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối lượng phân tử từ 80000-200000. Pectin không hòa tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác. Pectin hoà tan trong nước, ammoniac, dung dịch kiềm, carbonate natri và trong glycerine nóng. Hình 2. Cấu tạo pectin Hình 3. Cấu tạo acid α-D-galacturonic Pectin là tên chung được gọi cho các hỗn hợp chứa các thành phần rất khác nhau, trong đó acid pectinic là thành phần chủ yếu. Các pectin tự nhiên định vị trong thành tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polysaccharide và protein để tạo thành các protopectin không tan. Có thể phân hủy để làm cho pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong môi trường acid. Vì thế, các pectin tan thu nhận được là kết quả của sự phân hủy phân tử pectin không tan và chúng không đồng dạng với nhau. Pectin phân bố rộng rãi trong nhiều loại thực vật và tồn tại ở cả 3 dạng: pectin hoà tan, acid pectinic và protopectin. Pectin có trong vách tế bào thực vật, là một phức hệ sợi nhỏ trong tự nhiên. Độ bền của pectin cao nhất tại pH 3÷4. - Pectin hòa tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin, trong tự nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của acid polygalacturonic được ester hoá bằng Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 5 methanol. Pectin được ester hoá cao sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong dung dịch đường có nồng độ 65%. - Acid pectinic là acid polygalacturonic có một phần nhỏ các nhóm carboxyl được ester hóa bằng methanol. Pectinate là muối của acid pectinic. Acid pectic là acid polygalacturonic đã hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm methoxyl, tức là trong đó có chứa một nhóm carboxyl tự do trên một đơn vị acid galacturonic. Pectate là muối của acid pectic. - Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hoá học phức tạp. Trong thành phần pectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca2+, Mg2+, các gốc acid phosphoric, acid acetic và đường. Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải phóng pectin hòa tan. Bảng 1. Hàm lượng pectin của một số loại quả và dịch quả ( Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Stt Nguồn pectin Pectin (%) Chất ester hoá (%) Stt Nguồn pectin Pectin (%) Chất ester hoá (%) 1 Nho 0,2-1 10-65 6 Vỏ chanh 32,0 50-65 2 Dịch nho 0,01-0,09 - 7 Thịt chanh 25,0 - 3 Táo 0,5-1,6 70-90 8 Vỏ cam Vỏ lụa Dịch quả 20,0 29,0 16,0 4 Dịch táo 20,0 - 9 Củ cải đường 30,0 5 Khối nghiền nho đen 1,6 - Các chất protein có trong bào tương, màng tế bào và gian bào. Pectin chứa polygalacturonic acid, araban và galactan. Trong đó lượng acid polygalacturonic chiếm tới 40-60%. Khi thủy phân, pectin tách thành hai phần: - Phần trung tính-phức chất galactanoaraban - Phần acid-acid pectic. Trong bào tương, pectin nằm ở dạng hoà tan. Trong màng tế bào và gian bào, chúng nằm ở dạng không hòa tan gọi là protopectin. Protopectin ở màng gian bào có chứa lượng kim loại khá cao và một lượng nhóm methoxyl đủ để làm protopectin bền vững. Còn protopectin ở màng tế bào chứa một lượng kim loại không nhiều, có độ methoxyl Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 6 hoá cao. Vì thế, tế bào thực vật có khả năng trương nở tốt (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004). Pectin thương mại có hàm lượng acid galacturonic thường hơn 75% và độ ester hóa từ 30 – 80 %. 2.2 Cấu trúc, tính chất và cơ chế hoạt động thủy phâncủa pectinmethylesterase 2.2.1 Cấu trúc PME có 2 dạng cấu trúc bậc I và bậc II. Ở cấu trúc bậc I, PME là một chuỗi acid amin cao. Trung tâm hoạt động cố định gồm các acid amin: 2 acid aspartic, arginine, 2 glutamine và các acid amin có nhân thơm liên kết với khớp phản ứng. Cấu trúc bậc II của PME là dạng cấu trúc β-helix. Đây là cấu trúc dạng vòng xoắn có gấp nếp β-helix theo hướng phải, bao gồm 3 chuỗi β-sheet song song và có những đoạn dạng vòng được kéo ra từ lõi của vòng xoắn, nó tạo ra một vùng sâu giống như khe nứt. Khe nứt thường tạo nên bởi những gốc có vòng thơm và 2 gốc aspartate, tương ứng với trung tâm hoạt động của PME (Jenkins et al., 2001; Johansson et al., 2002; D’Avino et al., 2003). Hình 4. Cấu trúc bậc II của PME cà chua và cà rốt 2.2.2 Tính chất Enzyme PME thủy phân cắt liên kết ester giữa methanol và nhóm carboxyl của acid galacturonic. Pectinmethylesterase sẽ thủy phân trước nhất là nhóm methylester nằm giữa 2 nhóm carboxyl tự do. Và sau đó sẽ thủy phân lần lượt các liên kết ester dọc theo phân tử pectin. Kết quả là tạo thành acid pectinic, acid pectic và methanol. PME cà chua PME cà rốt Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 7 Hình 5. Phản ứng thuỷ phân pectin dưới sự xúc tác của PME PME có tính đặc hiệu cao đối với nhóm methylester của acid polygalacturonic. Các ester khác chỉ bị tấn công rất chậm, còn các nhóm methylester của acid polymanuronic thì không hề bị tấn công. PME nguồn gốc thực vật khử ester của pectin từ đầu khử hoặc không khử, hoặc gần với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn, tạo ra các khối acid galacturonic không bị ester hoá rất mẫn cảm với calcium. Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH khác nhau. Nếu enzyme thu được từ nguồn vi sinh vật thì pH tối ưu là 4,5-5,5, còn nếu là nguồn thực vật thì có pH tối ưu là 5,0-8,5. PME thường được hoạt hóa bởi các ion Ca++ và Mg++. 2.2.3 Cơ chế hoạt động thủy phân Enzyme PME thủy phân các liên kết ester của các đơn vị ester galacturonic tạo thành polymer mang điện tích âm và methanol. Khi enzyme hoạt động không phải toàn bộ cấu trúc enzyme tham gia hoạt động xúc tác mà chỉ có trung tâm hoạt động của enzyme tham gia phản ứng. Trung tâm hoạt động của enzyme do cấu trúc của enzyme tạo ra. Ví dụ: Ở cà rốt trung tâm hoạt động của PME nằm ở vùng lõm với 2 gốc acid ở trung tâm, Asp136 và Asp157. Từ cấu trúc của nó, cơ chế hoạt động là như sau: Asp157 có liên kết hydro gắn với cả oxy và Arg225. Arg225 được xem là một phần tử ái điện tử tấn công chủ yếu vào nhóm carbon từ carboxymethyl và carbonyl của pectin. Asp136 liên kết với Phe160, có tính acid trong giai đoạn đầu phản ứng và methanol được tách ra. Tiếp theo, Asp 136 có khả năng phản ứng như một base tách hydro của một phân tử nước để cắt liên kết hóa trị giữa cơ chất và Asp157 và phục hồi lại trung tâm hoạt động cho enzyme. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 8 Hình 6. Trung tâm hoạt động của PME từ cà rốt. Cơ chất là đơn vị acid methyl-ester D-galacturonic được gắn vào trung tâm hoạt động * Pectinase thương mại Enzyme thương mại là các chế phẩm enzyme của nấm mốc, được điều chế chủ yếu từ các loài Aspergillus. Chúng thường là hỗn hợp của các PE, PG và PL, hemicellulase và endo-β-glucanase (C-x-cellulase). Các enzyme pectinase đóng vai trò quan trọng trong quá trình chế biến nước ép trái cây. Một số chế phẩm được sử dụng trong chế biến ra và quả: Pectinex Ultra SP-L, Pectinex 3XL và Pectinex AR, Visscozyme120L. Sử dụng chế phẩm enzyme có thể xem là một trong những phương hướng tiến bộ có triển vọng nhất của sản xuất nước quả và nước uống không cồn. Khi ấy cần phải lựa chọn các chế phẩm enzyme có chứa một lượng nhất định các phức hợp enzyme. Ngoài ra, chế phẩm enzyme sử dụng cũng cần phải thỏa mãn các yêu cầu công nghệ sản xuất từng loại sản phẩm cụ thể không chỉ về dạng phản ứng xúc tác mà cả điều kiện tác dụng tức là pH, nhiệt độ, độ ổn định và một số yếu tố khác. 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính xúc tác của pectinmethylesterase 2.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Khi có đầy đủ cơ chất thì vận tốc của phản ứng enzym tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme. Ta có thể biểu diễn sự liên hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ enzyme bằng biểu thức sau: V= k[E] Trong đó: V : Tốc độ phản ứng [E] : Nồng độ enzyme Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 9 Hình 7. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng Nồng độ enzyme càng lớn bao nhiêu thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều bấy nhiêu. Cũng có trường hợp khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng chậm. 2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Phản ứng khi có enzyme xảy ra ba giai đoạn: • Giai đoạn đầu: enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES. Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất. E + S ES • Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. • Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do. Hiện tượng này được xem xét trên cơ sơ phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất. Hình 8. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt t._.ính enzyme 0 Tố c độ ph ản ứn g (V ) Nồng độ [E] Tố c độ ph ản ứn g (V ) Nồng độ cơ chất 0 Km 2 1 Vmax V Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 10 2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Cũng như các phản ứng hoá học thông thường, vận tốc phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ. Tuy nhiên, do enzyme có bản chất là protein nên nó kém bền với nhiệt độ cho nên tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm dần và dẫn đến mức triệt tiêu. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC. Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Q10 để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối thích của enzyme. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40- 50oC. Nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau thì hoàn toàn khác nhau tuỳ thuộc vào nguồn gốc của chúng. Một số enzyme có nhiệt độ tối ưu ở 60oC, một số khác lại có nhiệt độ tối ưu ở 70oC. Enzyme pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30- 45oC và bị vô hoạt ở 55-62oC (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004). Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm. Khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính. Ngược lại, ở nhiệt độ 0oC enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu. Nhiệt độ tối ưu của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH. Hình 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến tốc độ phản ứng của enzyme Đối với enzyme phần lớn enzyme PME thì khoảng nhiệt độ tối thích là 35-60oC, hoạt động mạnh ở 45-50oC. Khi nhiệt độ vượt quá 70oC thì enzyme này sẽ bất hoạt. Tố c độ ph ản ứn g (V ) Nhiệt độ oC 0 Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 11 Khi nhiệt độ cao thường gây cho enzyme mất hoạt tính. Phản ứng vô hoạt của enzyme dưới tác dụng của nhiệt độ thường biểu diễn theo phương trình bậc một. ln [ ][ ]0E E = - kt Trong đó: K: hằng số tốc độ phản ứng E: nồng độ enzyme hoạt động ở thời gian t E0: nồng độ ban đầu của enzyme hoạt động Người ta thường sử dụng yếu tố nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thực phẩm. 2.3.4 Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH của môi trường, mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt là ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme. Hình 10. Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme Các enzyme từ các nguồn gốc khác nhau thì có pH tối thích khác nhau. Nhiều enzyme hoat động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên, cũng có nhiều enzyme hoạt động ở pH acid yếu. Một số khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid. Enzyme pectinesterase của Aspergillus có điểm đẳng điện và pH tối ưu nằm trong khoảng acid, hoạt động của PE đạt tối đa ở pH 4,5 và nhiệt độ 40oC. Khi pH > 7, pectin tự khử nhóm ester và tăng cường độ hoạt động của PME. Đối với pectinase có nguồn gốc từ nấm mốc, pH hoạt động tối thích nằm trong khoảng 3-5 (Nguyễn đức Lượng và ctv, 2004). Tố c độ ph ản ứn g 0 pH Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 12 PME thực vật có pH tối thích khoảng 6,0-8,0. Ở pH này, có sự tương tác mạnh mẽ giữa enzyme tích điện dương và nhóm carboxyl tự do của polygalacturonic là sản phẩm của quá trình thủy phân pectin. Người ta thường sử dụng ảnh hưởng của pH để điều hòa phản ứng trong bảo quản, chế biến lương thực, thực phẩm, trong tuyển chọn giống vi sinh vật,… 2.3.5 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm Chất kìm hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme. Các chất kìm hãm có thể là các ion kim loại, các anion, các hợp chất hữu cơ có phân tử nhỏ hoặc protein. Các chất kìm hãm có khả năng kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng giữa enzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được trạng thái cân bằng: E+ I EI Trong đó : E: enzyme I: chất kìm hãm K1, K-1: hằng số tốc độ phản ứng thuận nghịch Tùy thuộc vào bản chất tạo phức EI, bản chất của chất kìm hãm, người ta chia ra những chất kìm hãm sau:  Các chất kìm hãm cạnh tranh: các chất kìm hãm cạnh tranh là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch. Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Khi đó, chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động thì cơ chất sẽ không còn cơ hội tiếp cận với trung tâm này. Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và cơ chất làm giảm số lượng của các enzyme kết hợp với cơ chất. Do đó, cơ chất mất một phần khả năng tương tác, làm cho tốc độ phản ứng không tăng. Phản ứng trong trường hợp có chất cạnh tranh của phản ứng enzyme sẽ như sau: E + S ES E + P E + I EI  Các chất kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzyme ở vị trí khác với trung tâm hoạt động, làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme, làm giảm hoạt động xúc tác của nó dẫn đến giảm vận tốc phản ứng. K1 K -1 Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 13 Như vậy, phức hợp EI này sẽ làm thay đổi hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme. Sau khi kết hợp với chất kìm hãm để tạo thành phức hợp EI, enzyme vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất để tạo thành một phức hợp EIS như phản ứng sau: E + S ES E + P E + I EI ES + I EIS EI + S EIS  Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng: các sản phẩm phản ứng có thể đóng vai trò như chất kìm hãm không cạnh tranh. Nếu như phản ứng xảy ra do chất A và chất B, có sự tham gia của enzyme để tạo thành sản phẩm P1 và P2 thì enzyme có ái lực với cả P1, P2 và cả chất A và chất B. Khi đó, sản phẩm P1 và P2 được xem như chất kìm hãm của enzyme.  Kìm hãm do thừa cơ chất: Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành chất kìm hãm phản ứng. Giả sử ta có phản ứng E + S ES E + P Nếu có cơ chất thứ hai tham gia và nó có khả năng đính vào một vị trí nào đó trên phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho enzyme không hoạt động, khi đó cơ chất thứ hai này coi như chất kìm hãm. ES + S ESS 2.3.6 Ảnh hưởng của chất hoạt hoá Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme gọi là các chất hoạt hoá enzyme. Những chất hoạt hóa có tác dụng làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động trở thành hoạt động, từ hoạt động yếu trở thành hoạt động mạnh hơn. Các chất hoạt hóa thường có bản chất hóa học rất khác nhau, chúng có thể là: - Các chất hữu cơ phức tạp làm nhiệm vụ chuyển nhóm, chuyển gốc hóa học - Những chất có tác dụng phục hồi những nhóm hoạt động của trung tâm hoạt động enzyme - Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử proenzyme làm loại bỏ một vài đoạn peptid, tạo điều kiện cho các nhóm chức xích lại gần nhau để hình thành trung tâm hoạt động - Ngoài ra, một số cation kim loại có bán kính từ 0,34 - 1,65 Ao ( Na+, K+, Ca2+, Mg2+ ) và các anion Cl-, Br-, I- cũng có tác dụng hoạt hóa enzyme. Trong quá Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 14 trình hoạt hóa, các ion kim loại có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động, làm cầu nối giữa enzyme với cơ chất hoặc làm nhiệm vụ ổn định cấu trúc không gian cần cho sự xúc tác của enzyme. Đối với PME, ion kim loại phản ứng với nhóm mang điện tích âm (nhóm carboxyl) để enzyme tấn công liên kết ester. Ở nồng độ cao, ion kim loại ức chế hoạt động của enzyme. Ion Na+, Ca++, các loại muối NaCl, KCl, CaCl2 hoạt hóa enzyme này, các ion hóa trị 3 và 4 thì kìm hãm hoạt tính của chúng (Jans.Tkacz, 2004). Với NaCl, nồng độ tối ưu cho hoạt động PME là 0,2M. Và trong những ion hóa trị 2, Calci là một trong những ion quan trọng nhất. Ion Calcium làm tăng khả năng hoạt động của PME khi ở nồng độ thấp 5-25nM, còn khi lên đến nồng độ cao sẽ làm tốc độ phản ứng giảm có thể do hình thành gel pectate. Hoạt động PME đạt tối đa khi CaCl2 ở nồng độ 20nM. 2.4 Sản xuất pectinmethylesterase từ nấm mốc 2.4.1 Môi trường nuôi cấy • Nguyên liệu Môi trường sử dụng nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme thường là cám gạo, hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc nảy mầm. Trong các loại nguyên liệu trên thì cám gạo, cám mì thường được sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại cám này có đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật phát triển. Mặt khác, khi tạo môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu. Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là các muối ammonium, phosphat,…(Nguyễn Đức Lượng, 2001). Trong nhiều trường hợp, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với lượng khoảng 20-25%. Thực chất, việc cho trấu vào là làm tăng độ xốp của môi trường, tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng môi trường. Khi nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme pectinase, thường cho vào môi trường bột cà rốt (bột cà rốt chứa nhiều pectin) như chất cảm ứng để làm tăng quá trình tổng hợp enzyme này. Bảng 2. Thành phần dinh dưỡng của cám ( Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) 1 2 3 4 5 6 Năng lượng Nước Protein thô Lipid Glucid tổng số Cellulose 350 – 426 KCal 12 – 14% 10 – 12,2% 20 – 22,7% 40,3 – 42% 6,3 – 7% 7 8 9 10 11 Tro Calcium Phospho Sắt Vitamin B1 6,0 – 6,5% 30 – 32 mg% 4,5 – 4,6 mg% 10 –14 mg% 0,96 –1 mg% Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 15 • Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Trong quá trình chuẩn bị môi trường, điều quan trọng nhất là tạo được độ ẩm thích hợp. Độ ẩm thích hợp cho nhiều vi sinh vật khi nuôi cấy trong môi trường cám là 60%W. Độ ẩm vượt quá 60%W thường tạo điều kiện cho nhiều vi khuẩn phát triển, khi đó dễ xảy ra nhiễm vi sinh vật lạ. Nếu độ ẩm < 60%W (thường 45-50%W) thường gây hiện tượng tạo nhiều bào tử ở nấm sợi, và như vậy thì enzyme thu sẽ giảm hoạt tính rất mạnh. Sau khi chuẩn bị xong môi trường, ta tiến hành thanh trùng môi trường để tiêu diệt các vi sinh vật nhiễm vào môi trường mà có thể ức chế sự phát triển của giống vi sinh vật mà ta sẽ nuôi cấy. Thông thường, môi trường sẽ được thanh trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC trong thời gian 15-30 phút. Môi trường nuôi cấy sẽ được trải đều vào các khay và tiến hành trộn giống vi sinh vật vào khối môi trường sao cho thật đều. Thời gian nuôi cấy nấm sợi để thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. 2.4.2 Giống vi sinh vật Bảng 3. Các nguồn vi sinh vật để sản xuất enzyme Nguồn nấm mốc Enzyme Aspergillus melleus Protease A. niger Alpha-Amylase Endoarabinase Glucoamylase Hemicellulase Pectinase Xylanase Cellulase A. oryzae Alpha-Amylase Cellulase Glucoamylase Hemicellulase Lipase Pectinase Protease Penicillium emersonii Cellulase Glucanase Xylanase P. funiculosum Cellulase Cellobiase Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 16 Glucosidase Dextranase Glucanase Glucoamylase Pectinase Xylanase Rhizopus niveus Glucoamylase Trichoderma harzianum Cellulase Glucanase Glucosidase Hemicellulase Xylanase Enzyme pectinmethylesterase từ vi sinh vật được sản xuất dưới nhiều dạng khác nhau như dạng thô, dạng tinh khiết, dạng tinh thể. Tuy nhiên, chúng đều được sản xuất bằng hai phương pháp nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy bề sâu. PME có thể sản xuất từ nhiều nguồn nấm mốc và vi khuẩn. Trong luận văn này, chọn giống VSV là nấm sợi Aspergillus oryzae với các cơ chất nuôi cấy thích hợp để sản xuất enzyme PME. Asp. oryzae thuộc lớp nang khuẩn Ascomycetes, bộ cúc khuẩn Plectascales, họ Aspergillaceae, giống Aspergillus là nấm mốc sinh sản vô tính bằng cách tạo thân quả hoặc cuống bào tử đính. Bào tử đính là tập hợp của những khuẩn ty cao xuất phát từ một tế bào lớn. Các nang quả phình to ở nang trên, chổ phình to có dạng hình cầu, hình bầu dục hoặc hình chùy được gọi là túi định. Xung quanh túi định có vô vàn những mầm nhỏ gọi là thể bình mọc ra khắp mọi hướng, ở phần cuối của các mầm này gọi là các bào tử đính. Aspergillus oryzae có bào tử đính màu vàng hoa cau (Nguyễn Văn Mùi, 2001). Hình 11. Hình dạng nấm sợi Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 17 2.4.3 Phương pháp nuôi cấy Để nuôi cấy nấm Aspergillus oryzae sản xuất enzyme PME ta lựa chọn phương pháp nuôi cấy bề mặt với môi trường rắn. Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường hay trên bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm.Thông thường, môi trường dạng rắn với nguyên liệu chín là bột cám mì, bã củ cải, bột bắp nghiền, hạt thóc nẩy mầm, trấu và bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác (amon sulfat, amon clorua, amon phosphat). Phương pháp này phát triển rất mạnh từ những năm 1970 đến nay. Những ưu điểm cơ bản của phương pháp nuôi cấy bề mặt: - Dễ thực hiện, quy trình công nghệ đơn giản - Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm - Sản phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản - Khi bị nhiễm sinh vật lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường rắn khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt trãi qua các giai đoạn sau: • Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy, lúc này bào tử bắt đầu trương nở và hô hấp. Ở giai đoạn này có xảy ra nhiều biến đổi. + Nhiệt độ tăng rất chậm + Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa + Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi + Khối môi trường còn rời rạc + Enzyme mới bắt đầu được hình thành. • Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: + Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh, có thể nhìn rõ được sợi nấm + Môi trường được kết lại khá chặt + Độ ẩm môi trường giảm dần + Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể đạt tới 40-45oC + Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hóa mạnh của nấm sợi Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 18 + Các enzyme được hình thành và enzyme nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ được tạo ra nhiều hơn + Lượng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh là tốt nhất. • Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-12 giờ. Lúc này nhiệt độ khối môi trường sẽ giảm dần, cường độ hô hấp giảm dần một cách rõ rệt. Màu sắc của sợi nấm bắt đầu thay đổi và thể hiện màu đặc trưng (Nguyễn Đức Lượng, 2001). 2.4.4 Thu nhận enzyme Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme. Chế phẩm này được gọi là chế phẩm thô vì ngoài thành phần enzyme ra chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong môi trường. Tùy theo mục đích sử dụng, ta có thể dùng chế phẩm thô này ngay không cần qua quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzyme. Khi enzyme được tách hết nước, sinh khối vi sinh vật và thành phần môi trường và chúng ở dạng tinh thể, ta thu được chế phẩm enzyme sạch. Để thu nhận được chế phẩm enzyme PME tinh khiết thì chế phẩm enzyme thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối ammonium sulfat. Dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa enzyme PME có thể là ethanol. Dung môi hữu cơ có tác dụng làm giảm hệ số điện môi của môi trường thì protein và enzyme bị kết tủa. Khi kết tủa bằng ethanol thì lượng ethanol sử dụng phải gấp 3-4 lần dịch chiết enzyme, nên khuấy đều để phân phối ethanol trong dung dịch. Khi có kết tủa thì lọc hoặc ly tâm để thu kết tủa, rửa kết tủa bằng rượu đậm đặc 2-3 lần để tách bớt nước trong kết tủa và sau đó đem sấy kết tủa. Ngoài ra, cũng có thể dùng muối trung tính là amon sulfat để kết tủa enzyme vì độ hoà tan của muối rất cao, sự kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ, không làm biến tính enzyme, enzyme thu được có hoạt tính cao hơn so với các enzyme thu được bằng phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ. Tuy nhiên, khi sử dụng muối trung tính cũng có nhược điểm là lượng dung dịch dùng gấp 5-6 lần dịch chiết enzyme và không thể tái thu hồi được dung môi. Để đảm bảo chế phẩm enzyme thu được không mất hoạt tính nhanh, người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp. Độ ẩm cần đạt sau khi kết thúc quá trình sấy là <10 %W. Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi, ta thường sấy enzyme ở nhiệt độ 38-40oC. Ở nhiệt độ này phần lớn enzyme ít bị biến đổi. Còn nếu ta sấy ở nhiệt độ cao quá 40oC, enzyme rất dễ bị biến tính. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 19 2.4.5 Kỹ thuật sản xuất pectinmethylesterase a. Quy trình kỹ thuật sản xuất enzyme PME Trích ly bằng nước Asp. oryzae Trộn giống vi sinh vật Lọc Kết tủa Ly tâm Sấy kết tủa Chế phẩm enzyme Nghiền và bảo quản Nguyên liệu môi trường Hấp thanh trùng Làm nguội Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 20 b. Thuyết minh quy trình  Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy bề mặt của vi sinh vật tạo enzyme pectinmethylesterase gồm 60 -70% là bột cám, 20-25% trấu, nguyên liệu chứa cơ chất cảm ứng tổng hợp enzyme pectinase tương ứng là 5 % bột cà rốt hoặc vỏ bưởi và bổ sung amon sulfat và amon clorua 1%, amon phosphat 2%. Độ ẩm môi trường là 60-65% . Đem môi trường thanh trùng ở 121oC trong vòng 15 phút. Sau khi thanh trùng, môi trường được làm nguội và bắt đầu cấy giống vi sinh vật là Aspergillus oryzae vào môi trường đã được trộn đều, trãi mỏng trên khay. Tiến hành nuôi nấm sợi trong tủ úm ổn định ở nhiệt độ khoảng 37oC. Trong khoảng 36 giờ thì kết thúc quá trình nuôi. Khi nấm sợi bắt đầu chớm tạo ra bào tử là thời gian enzyme được tạo ra nhiều nhất. Ta nên thu nhận chế phẩm enzyme thô ở giai đoạn này (Nguyễn Đức Lượng, 2003).  Trích ly enzyme Chiết tách enzyme từ môi trường rắn người ta thường dùng nước, các dung dịch muối trung tính,… có thể chiết tách được 90- 95% và trong nước chiết không chứa tạp chất không tan. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào một ít focmalin hoặc chất sát trùng khác. Chiết tách enzyme người ta dùng nước (25-28oC) và lọc, sau đó tủa enzyme bằng ethanol. Khi cho dung môi vào dung dịch enzyme làm giảm khả năng tan của nước bao quanh enzyme. Dung môi hữu cơ này làm giảm hằng số điện môi của môi trường, đẩy một lượng nước lớn. Vì vậy các enzyme, cũng như các chất có phân tử thấp trong hệ dung dịch nước dung môi sẽ tủa và lắng xuống. Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch cồn-nước phụ thuộc vào nồng độ cồn, nhiệt độ, pH, lực hút ion của dung dịch và tính chất enzyme của protein. Để tránh mất hoạt tính của enzyme, tất cả phải làm lạnh xuống 3-5oC. Khi trộn phải khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa lắng xuống phải ly tâm ngay. Dùng ethanol kết tủa có nồng độ 60-70% hoặc có thể dùng aceton 60% và giữ pH 5,5-5,6 bằng (NH4)2SO4 (600g/lít). Khi kết tủa bằng ethanol, chế phẩm enzyme thu được có độ tinh khiết khoảng 90%, còn nếu dùng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75%. Khi kết tủa bằng ammonium sulfat có độ bão hòa bằng 0,2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase, khi độ bão hòa là 0,9-1 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintranseliminase và exopolygalacturonase. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 21  Ly tâm Là quá trình tách vật rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận enzyme, dung dịch này chứa enzyme ngoại bào. Phần lớn enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan. Như vậy, khi tiến hành ly tâm, dung dịch tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thô vì ngoài enzyme trong dung dịch còn có nước, protein không hoạt động và các chất hòa tan khác. Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, thường tiến hành ly tâm lạnh (3- 5oC) (Nguyễn Đức Lượng, 2001).  Sấy kết tủa Dịch enzyme sau khi ly tâm, ở trạng thái này enzyme rất dễ biến tính vì còn nhiều nước. Để dễ bảo quản, ta tiến hành sấy kết tủa enzyme ở nhiệt độ < 40oC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5- 8%.  Nghiền và bảo quản Sau khi sấy, enzyme được nghiền mịn thành dạng bột cho vào bao bì kín (chai lọ hoặc túi polyetylen), bảo quản ở nhiêt độ lạnh. Chế phẩm enzyme này gọi là chế phẩm dạng rắn thô. Muốn có chế phẩm tinh khiết phải qua giai đoạn tinh chế. 2.4.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp hoạt tính của PME • Độ ẩm Độ ẩm cao ảnh hưởng đến độ thoáng khí, thấp quá sẽ kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi cũng như khả năng tạo enzyme. • Nhiệt độ nuôi Nhiệt độ cao quá hoặc thấp quá đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi, kéo theo sự giảm hoạt lực của enzyme. • Thời gian nuôi Thời gian nuôi để thu được lượng enzyme lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt tính enzyme. Đối với nấm sợi Aspergillus oryzae, sự tạo enzyme cực đại thường kết thúc khi nấm bắt đầu sinh đính bào tử (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004). Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 22 • pH Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt thường ít ảnh hưởng do môi trường có dung dịch đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi trong quá trình nuôi. Tuy nhiên, pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của nấm sợi và sự tạo thành enzyme. Đa số nấm sẽ phát triển tốt và tạo ra enzyme trong môi trường acid yếu, nên có thể dùng HCl, H2SO4 và acid lactic làm ẩm môi trường. 2.5 Một số ứng dụng của pectinmethylesterase 2.5.1 Trong sản xuất nước quả và rượu vang Bảng 4. Một số ví dụ về ứng dụng của enzyme trong ngành sản xuất thực phẩm (Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa, 2007) Ngành sản xuất thực phẩm Enzyme sử dụng Ghi chú Chế biến quả, SX dịch quả Các enzyme phân giải thành tế bào: pectin lyase, pectin methylesterase, polygalacturonase, arabanase, các hemicellulase, các amylase acid của nấm mốc và glucoamylase Các enzyme này đều tách từ Aspergillus. Sử dụng các pectinase làm tăng chất lượng, năng suất, tạo được nhiều loại sản phẩm mới từ quả, kéo dài thời gian bảo quản, giữ màu bền. Bánh nướng α-amylase, xylanase, protease, lipase, và một số oxidoreductase, transglutaminase Các enzyme nhằm đảm bảo chất lượng bột nhão dùng làm bánh, cải thiện mùi vị và màu sắc của sản phẩm. Làm phomat Enzyme làm đông sữa, chủ yếu là các asparticprotease như: chymosin, mucorpepsin, endo thiapepsin, Ngoài ra còn dùng lipase, lysozyme Lipase, lysozyme cũng có vai trò làm chín phomat, tăng hương vị, chất lượng phomat. Chế biến sữa β-galactosidase thuỷ phân lactose trong sữa thành glucose và galactose. Hai đường này có độ ngọt lớn hơn lactose. - Sản xuất sữa không có lactose cho những người thiếu lactase bẩm sinh. - Làm tăng độ ngọt của các loại nước uống từ sữa, sữa chua. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 23 Trong sản xuất nước quả và rượu vang, việc sử dụng enzyme là một tiến bộ khoa học lớn. Một trong những nguyên nhân chính gây ra sự thành lập chất có hại trong nước trái cây và rượu vang là do sự hiện diện các hợp chất pectic đặc biệt là pectin, các chất này nằm ở thành tế bào được phóng thích khi trái cây bị nghiền nhão. Các chế phẩm enzyme sử dụng trong sản xuất nước quả có tác dụng làm trong dịch chiết ép (nhất là đối với những quả có nhiều pectin, độ nhớt cao), tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cô đặc dịch quả, làm tăng hiệu suất ép, hiệu suất trích ly các chất trong tế bào thực vật. Việc thu nhận nước quả từ trước đến nay chủ yếu bằng phương pháp ép. Nếu pectin còn nhiều sẽ theo vào nước quả gây ra hiện tượng nước quả bị đục, có độ keo cao và rất khó lọc trong. a. Tăng hiệu suất ép, thu nhận dịch quả Trong tế bào của quả nước chiếm khoảng 90-95%. Nếu ta chỉ nghiền sau đó ép thì ta chỉ có thể thu nhận được khoảng 60-70% là tối đa. Bởi vì khi nghiền ép, trong phần nước quả thu được sẽ kéo theo lượng lớn thịt quả, chủ yếu là pectin. Pectin là thành phần quan trọng của vách tế bào có nhiệm vụ bảo vệ các thành phần bên trong tế bào, giữ dịch bào trong tế bào không thoát ra. Khi ta cho enzyme pectinase vào, hiệu suất ép sẽ tăng 15-30% vì PME sẽ thuỷ phân pectin tách động lên vách tế bào làm dịch bào thoát ra. Lúc đầu PME sẽ phân cắt nhóm methyl của pectin tạo điều kiện cho hoạt động của enzyme polygalacturonase (PG). Polygalacturonase sẽ phân cắt chuỗi pectin thành các đoạn ngắn hơn. Nhiều trường hợp, hiệu suất ép tăng đến 50%. Pectin cũng chính là một trong những nguyên nhân làm cho dịch quả có tính nhớt. Độ nhớt dịch quả cao là trở ngại lớn cho quá trình lọc hay ly tâm. Vì vậy việc sử dụng enzyme để cắt pectin thành những phần tử nhỏ hơn sẽ góp phần đáng kể làm giảm độ nhớt của dịch quả. Dịch quả thu được khi xử lý bằng pectinase sẽ trong hơn, khả năng lọc sẽ tốt hơn và hiệu quả kinh tế rất rõ. Liều lượng enzyme được sử dụng được tạo lập tuỳ theo loại quả và điều kiện công nghệ (nhiệt độ, thời gian tác dụng, loại hình ép). Thường chúng được dùng với liều lượng 100-150 g/tấn thịt quả. Hoặc dùng liều lượng chế phẩm enzyme tinh khiết cho vào là 0,03-0,05%, chế phẩm thô là 0,5-2%. Nhiệt độ duy trì cho quá trình thủy phân là 43-45oC. Thời gian thủy phân là 4-8 giờ. Trong sản xuất nước quả từ nho, do nho là loại quả chứa nhiều dịch và đường , trong thịt quả có chứa nhiều pectin vì vậy dễ gây đục hoặc nếu thu nhận dịch quả trong thường không có hiệu suất cao. Chính vì thế người ta phải xử lí nước nho bằng chế phẩm enzyme. Lượng enzyme sử dụng trong trường hợp làm nát nho là 0,2% so với khối lượng nho trong sản xuất. Còn sau khi nho đã làm nát, người ta cũng xử lí Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 24 enzyme với liều lượng 0,2% so với khối lượng nho. Thời gian xử lí bằng enzyme là 3 giờ ở nhiệt độ 45oC. Bằng phương pháp xử lí này người ta đã làm tăng hiệu suất thu nhận dịch nho từ 65,9 lên 77,3% đối với nho trắng và từ 66 lên 82,2% đối với nho đỏ (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004). Còn trong sản xuất nước táo và nước quả vả, sử dụng enzyme sẽ làm tăng hiệu suất tách dịch quả lên 20-25%. Hoạt động chính của enzyme endo-polygalacturonase, pectimetylesterase và pectin lyase giúp quá trình ép là thủy phân các khung xương chính của pectin, phá vỡ thành tế bào làm các tế bào khó liên kết lại với nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra. Khi xử lý nước quả bằng enzyme đối với nước táo, người ta thường cho thêm ascorbic acid vào để chống quá trình oxy hoá. Trong sản xuất nước táo, khi sử dụng chế phẩm pectinase đã mang lại hiệu quả cao. Bảng 5. Hiệu quả xử lý nước táo và nước quả vả bằng chế phẩm enzyme pectinase ( Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Stt Loại nước quả Hiệu suất nước quả (%) Hàm lượng chất khô (%) Độ acid chẩn (%) Pectin (%) Chất chát (%) Đường (%) Điểm đánh giá cảm quan 1 Nước quả từ táo a-Không chế phẩm enzyme b-Có chế phẩm enzyme 71,2 78,8 10,2 11,5 0,53 0,62 0,33 0,15 0,04 0,02 6,7 8,0 4,5 4,8 2 Nước quả vả a-Không chế phẩm enzyme b-Có chế phẩm enzyme 49,2 72,4 8,5 10,2 0,91 1,16 0,26 0,12 0,09 0,16 5,62 7,4 3,8 4,3 Bên cạnh việc sử dụng enzyme để thuỷ phân pectin làm tăng hiệu suất thu hồi khi ép lấy dịch quả thì sự thuỷ phân một phần tế bào bởi enzyme cũng tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách chiết các chất màu, chất thơm và góp phần cải thiện chất lượng cảm quan của dịch quả. Hoạt động thủy phân pectin bởi enzyme đã được ứng dụng trong việc làm giảm độ nhớt nước trái cây vì thế làm tăng nồng độ các thành phần chất chiết đến các giá trị Brix cao hơn như bình thường có thể. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 25 Khi sử dụng PME cần lưu ý là hoạt động của PME cũng sẽ bị ức chế bởi nồng độ cao của đường. Khi nước ép cô đặc đến 60oBx enzyme sẽ không hoạt động nhưng lại có thể hoạt động sau khi hoàn nguyên (pha loãng trong nước). Sơ đồ công nghệ thu nhận dịch quả có ứng dụng enzyme Quả Rửa Nghiền nát Th._.ngoài nồng độ pectin đến hoạt tính xúc tác của PME nên tôi xin đề nghị thêm: - Nghiên cứu để bảo quản chế phẩm enzyme PME : sấy lạnh,… - Sử dụng chế phẩm enzyme vào chế biến thực phẩm: nước quả trong, nước giải khát, rau quả đóng hộp,… - Nghiên cứu sản xuất pectinmethylesterase từ vi khuẩn hay loại nấm mốc khác - Nghiên cứu sự tổng hợp PME trên các nguyên liệu khác: cám ngô, cám mì, bã củ cải,… - Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố: nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme, … đến khả năng hoạt động xúc tác của PME. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Hữu Thuận, Dương Thị Phương Liên, Bùi Thị Quỳnh Hoa (2004), Bài giảng sinh hóa thực phẩm. Chiêm Thị Bích Vân ( 2007), Nghiên cứu sản xuất amylase từ Aspergillus oryzae, luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Công nghệ Thực phẩm, Đại học Cần Thơ. Đặng Thị Thu và ctv, Công nghệ enzyme, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật. Hà Thanh Toàn (2002), Bài giảng kỹ thuật các quá trình sinh học. Nguyễn Đức Lượng (2002), Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Đức Lượng và ctv (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Đức Lượng (2001), Công nghệ sinh học, NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Thị Như Phương (2003), Khảo sát ảnh điều kiện hoạt động của chế phẩm enzyme pectinase đến chất lượng sản phẩm nước chuối trong, luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Công nghệ Thực phẩm, Đại học Cần Thơ. Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hoá sinh học, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa, Enzyme và ứng dụng, NXB Giáo Dục. Phạm Thế Dương Thanh Thảo (2007), Nghiên cứu chế biến và bảo quản chế phẩm Koij nếp than, luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Công nghệ Thực phẩm, Đại học Cần Thơ. Trần Minh Tâm (2000), Công nghệ vi sinh ứng dụng, NXB Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. Tiếng Anh Jans.Tkacz (2004), Advances in Fungal Biotechnology for Industry, Agriculture and Medicine, NewYork, pp 237-283. Ly Nguyen B. (2004), The combined pressure temperature stability of plant pectin methylesterase and their inhabitor, Docteraasproefschrift Nr. 630 aan de Faculteit Bio- ingenieurswetenschappen van de KU. Leuven. 2k40tcpgpmo.alexandra. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng viii PHỤ LỤC Phương pháp đo hoạt tính PME + Nguyên tắc: Hoạt tính PME được xác định dựa vào quá trình giải phóng nhóm - OCH3 của phân tử pectin tạo ra acid polygalacturonic và methanol. Lượng acid sinh ra được đo bằng phương pháp chuẩn độ acid-base bằng chuẩn độ acid-base tự động 785- Titrino. Hình 22. Phản ứng thuỷ phân pectin của PME Đơn vị hoạt độ của PME là lượng enzyme cần dùng cho phản ứng phân cắt pectin để tạo ra 1µmol nhóm -OCH3 trong thời gian một phút. + Dung dịch pectin, hoá chất và dịch chiết enzyme - Pha dung dịch pectin (3,5g/l) để xác định hoạt tính PME: lấy 3,425g NaCl pha vào 400ml nước cất. Đun sôi và khuấy đều trên máy khuấy từ. Cho 1,75g pectin theo dòng cồn 90 độ vào dung dịch nước muối này. Tiếp tục khuấy đều dung dịch khoảng 1 phút sau đó tiến hành làm nguội. Dung dịch sau khi làm nguội sẽ được điều chỉnh về thể tích là 500ml bằng nước cất rồi chỉnh pH dung dịch về 7,0. Pectin sau khi pha được giữ ở tủ mát và sử dụng tối đa trong vòng 1 tuần. - Pha dung dịch pectin ở các nồng độ khác nhau dùng cho thí nghiệm 3: tương tự cân 7g pectin để cho vào 40ml nước muối đun sôi. Ta được dung dịch pectin với nồng độ 15g/l. Muốn được pectin với các nồng độ nhỏ hơn ta sẽ dùng nước muối (6,85g/l) để pha loãng các dung dịch pectin thu được pectin ở các nồng độ (12,5-10-7,5-5-4-3,5- 2,5-1,5-1)g/l. - Dung dịch NaOH 0,01N: được pha từ dung dịch NaOH 0,1N. - Dung dịch HCl 0,1N - Dung dịch đệm HCl ở pH bằng 4,5, 5 và 5,5: sử dụng HCl 0,1N điều chỉnh sử dụng máy đo pH. PME 2H2O Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng ix - Dịch chiết enzyme: Cân 20g môi trường thu được sau nuôi cấy chuyển toàn bộ vào cốc 250ml, bổ sung 100ml nước cất. Khuấy đảo định kì trong thời gian 1 giờ. Trích lấy dịch chiết enzyme. + Tiến hành: Lấy 30 ml dung dịch pectin (nồng độ 3,5 g/l có chứa 0,117 M NaCl, pH 7,0) cho vào cốc phản ứng; khởi động thiết bị chuẩn độ tự động, sau khi có tín hiệu, cho tiếp vào cốc chuẩn độ một 1ml enzyme PME cần xác định hoạt tính. Hoạt tính của enzyme PME được máy xác định thông qua việc ghi liên tục thể tích NaOH chuẩn dùng để trung hòa lượng carboxyl được giải phóng trong dung dịch. + Kết quả: Bảng số liệu và đồ thị về thể tích NaOH sử dụng được xuất ra ở máy tính sau khi thiết bị chuẩn độ có tính hiệu dừng. - Từ đồ thị và bảng số liệu tìm hệ số góc bước nhảy thay đổi thể tích NaOH. - Nhân với 60 ta được hoạt tính của enzyme PME. Lưu ý: khi đồ thị không thể hiện được sự thay đổi của thể tích NaOH thì cần thay đổi tốc độ bơm NaOH về lớn hơn hoặc nhỏ hơn. - Cách thu nhận vỏ bưởi dùng làm cơ chất: vỏ bưởi tươi được gọt bỏ phần vỏ xanh chứa nhiều tinh dầu bên ngoài sau đó đem sấy khô rồi xây nhuyễn để dùng làm cơ chất trong quá trình nuôi nấm mốc để tạo PME. Phương trình Michaelis-Menten Tìm phương trình biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ pectin đến hoạt tính PME dựa vào phương trình Michaelis-Menten [ ] [ ]SK SVV m + × = max Trong đó: V: Hoạt tính enzyme (đv/g) Vmax: Hoạt tính cực đại Km: Hằng số Michaelis-Menten (hằng số nhạy cảm) [S]: Nồng độ cơ chất (pectin) Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng x Kết quả thống kê thí nghiệm Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khác nhau và thời gian nuôi cấy đến sự tạo thành pectinmethylesterase Hoạt tính pectinmethylesterase riêng Analysis Summary Dependent variable: Hoat tinh PME rieng Factors: Thanh phan moi truong Thoi gian Number of complete cases: 24 Multiple Range Tests for Hoat tinh PME rieng by Thanh phan moi truong -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A1 8 0.9095 X A2 8 1.16337 XX A3 8 1.381 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- A1 - A2 -0.253875 0.292506 A1 - A3 *-0.4715 0.292506 A2 - A3 -0.217625 0.292506 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Analysis of Variance for Hoat tinh PME rieng - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:Thanh phan moi t 0.891001 2 0.445501 7.03 0.0095 B:Thoi gian 4.50869 3 1.5029 23.73 0.0000 INTERACTIONS AB 0.635604 6 0.105934 1.67 0.2110 RESIDUAL 0.760053 12 0.0633378 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 6.79535 23 -------------------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xi Multiple Range Tests for Hoat tinh PME rieng by Thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 30 6 0.505667 X 48 6 1.03517 X 36 6 1.40767 X 42 6 1.65667 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 30 - 36 *-0.902 0.337756 30 - 42 *-1.151 0.337756 30 - 48 *-0.5295 0.337756 36 - 42 -0.249 0.337756 36 - 48 *0.3725 0.337756 42 - 48 *0.6215 0.337756 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Analysis Summary Dependent variable: Hoat tinh PME rieng Factor: Thanh phan MT_thoi gian Number of observations: 24 Number of levels: 12 ANOVA Table for Hoat tinh PME rieng by Thanh phan MT_thoi gian Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 6.0353 11 0.548663 8.66 0.0004 Within groups 0.760054 12 0.0633378 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 6.79535 23 Multiple Range Tests for Hoat tinh PME rieng by Thanh phan MT_thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A1_30 2 0.093 X A2_30 2 0.6385 XX A3_30 2 0.7855 X A1_48 2 0.943 XX A2_48 2 1.0215 XXX A1_36 2 1.0415 XXX A3_48 2 1.141 XXXX A2_42 2 1.347 XXX A3_36 2 1.535 XXX A1_42 2 1.5605 XXX A2_36 2 1.6465 XX A3_42 2 2.0625 X -------------------------------------------------------------------------------- Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xii -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- A1_30 - A1_36 *-0.9485 0.548343 A1_30 - A1_42 *-1.4675 0.548343 A1_30 - A1_48 *-0.85 0.548343 A1_30 - A2_30 -0.5455 0.548343 A1_30 - A2_36 *-1.5535 0.548343 A1_30 - A2_42 *-1.254 0.548343 A1_30 - A2_48 *-0.9285 0.548343 A1_30 - A3_30 *-0.6925 0.548343 A1_30 - A3_36 *-1.442 0.548343 A1_30 - A3_42 *-1.9695 0.548343 A1_30 - A3_48 *-1.048 0.548343 A1_36 - A1_42 -0.519 0.548343 A1_36 - A1_48 0.0985 0.548343 A1_36 - A2_30 0.403 0.548343 A1_36 - A2_36 *-0.605 0.548343 A1_36 - A2_42 -0.3055 0.548343 A1_36 - A2_48 0.02 0.548343 A1_36 - A3_30 0.256 0.548343 A1_36 - A3_36 -0.4935 0.548343 A1_36 - A3_42 *-1.021 0.548343 A1_36 - A3_48 -0.0995 0.548343 A1_42 - A1_48 *0.6175 0.548343 A1_42 - A2_30 *0.922 0.548343 A1_42 - A2_36 -0.086 0.548343 A1_42 - A2_42 0.2135 0.548343 A1_42 - A2_48 0.539 0.548343 A1_42 - A3_30 *0.775 0.548343 A1_42 - A3_36 0.0255 0.548343 A1_42 - A3_42 -0.502 0.548343 A1_42 - A3_48 0.4195 0.548343 A1_48 - A2_30 0.3045 0.548343 A1_48 - A2_36 *-0.7035 0.548343 A1_48 - A2_42 -0.404 0.548343 A1_48 - A2_48 -0.0785 0.548343 A1_48 - A3_30 0.1575 0.548343 A1_48 - A3_36 *-0.592 0.548343 A1_48 - A3_42 *-1.1195 0.548343 A1_48 - A3_48 -0.198 0.548343 A2_30 - A2_36 *-1.008 0.548343 A2_30 - A2_42 *-0.7085 0.548343 A2_30 - A2_48 -0.383 0.548343 A2_30 - A3_30 -0.147 0.548343 A2_30 - A3_36 *-0.8965 0.548343 A2_30 - A3_42 *-1.424 0.548343 A2_30 - A3_48 -0.5025 0.548343 A2_36 - A2_42 0.2995 0.548343 A2_36 - A2_48 *0.625 0.548343 A2_36 - A3_30 *0.861 0.548343 A2_36 - A3_36 0.1115 0.548343 A2_36 - A3_42 -0.416 0.548343 A2_36 - A3_48 0.5055 0.548343 A2_42 - A2_48 0.3255 0.548343 A2_42 - A3_30 *0.5615 0.548343 A2_42 - A3_36 -0.188 0.548343 A2_42 - A3_42 *-0.7155 0.548343 A2_42 - A3_48 0.206 0.548343 A2_48 - A3_30 0.236 0.548343 A2_48 - A3_36 -0.5135 0.548343 A2_48 - A3_42 *-1.041 0.548343 A2_48 - A3_48 -0.1195 0.548343 A3_30 - A3_36 *-0.7495 0.548343 A3_30 - A3_42 *-1.277 0.548343 A3_30 - A3_48 -0.3555 0.548343 A3_36 - A3_42 -0.5275 0.548343 A3_36 - A3_48 0.394 0.548343 A3_42 - A3_48 *0.9215 0.548343 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xiii Hoạt tính của pectinmethylesterase tổng Analysis Summary Dependent variable: Hoat tinh PME tong Factors: Thanh phan moi truong Thoi gian Number of complete cases: 24 Analysis of Variance for Hoat tinh PME tong - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:Thanh phan moi t 4517.26 2 2258.63 5.64 0.0187 B:Thoi gian 20272.1 3 6757.37 16.88 0.0001 INTERACTIONS AB 2897.5 6 482.916 1.21 0.3668 RESIDUAL 4802.55 12 400.212 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 32489.4 23 -------------------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple Range Tests for Hoat tinh PME tong by Thanh phan moi truong -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A1 8 62.8051 X A2 8 82.6111 XX A3 8 96.2194 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- A1 - A2 -19.806 21.794 A1 - A3 *-33.4142 21.794 A2 - A3 -13.6082 21.794 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xiv Multiple Range Tests for Hoat tinh PME tong by Thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 30 6 39.179 X 48 6 69.9535 X 36 6 96.387 X 42 6 116.661 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 30 - 36 *-57.208 25.1655 30 - 42 *-77.4823 25.1655 30 - 48 *-30.7745 25.1655 36 - 42 -20.2743 25.1655 36 - 48 *26.4335 25.1655 42 - 48 *46.7078 25.1655 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Analysis Summary Dependent variable: Hoat tinh PME tong Factor: Thanh phan MT_thoi gian Number of observations: 24 Number of levels: 12 ANOVA Table for Hoat tinh PME tong by Thanh phan MT_thoi gian Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 27686.9 11 2516.99 6.29 0.0018 Within groups 4802.55 12 400.212 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 32489.4 23 Multiple Range Tests for Hoat tinh PME tong by Thanh phan MT_thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A1_30 2 6.892 X A2_30 2 50.5775 X A3_30 2 60.0675 XX A1_48 2 62.4075 XX A2_48 2 71.2235 XXX A1_36 2 71.5975 XXX A3_48 2 76.2295 XXX A2_42 2 97.3965 XX A3_36 2 106.317 XX A1_42 2 110.324 XX A2_36 2 111.247 XX A3_42 2 142.264 X -------------------------------------------------------------------------------- Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xv -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- A1_30 - A1_36 *-64.7055 43.5879 A1_30 - A1_42 *-103.432 43.5879 A1_30 - A1_48 *-55.5155 43.5879 A1_30 - A2_30 *-43.6855 43.5879 A1_30 - A2_36 *-104.355 43.5879 A1_30 - A2_42 *-90.5045 43.5879 A1_30 - A2_48 *-64.3315 43.5879 A1_30 - A3_30 *-53.1755 43.5879 A1_30 - A3_36 *-99.4245 43.5879 A1_30 - A3_42 *-135.372 43.5879 A1_30 - A3_48 *-69.3375 43.5879 A1_36 - A1_42 -38.726 43.5879 A1_36 - A1_48 9.19 43.5879 A1_36 - A2_30 21.02 43.5879 A1_36 - A2_36 -39.6495 43.5879 A1_36 - A2_42 -25.799 43.5879 A1_36 - A2_48 0.374 43.5879 A1_36 - A3_30 11.53 43.5879 A1_36 - A3_36 -34.719 43.5879 A1_36 - A3_42 *-70.6665 43.5879 A1_36 - A3_48 -4.632 43.5879 A1_42 - A1_48 *47.916 43.5879 A1_42 - A2_30 *59.746 43.5879 A1_42 - A2_36 -0.9235 43.5879 A1_42 - A2_42 12.927 43.5879 A1_42 - A2_48 39.1 43.5879 A1_42 - A3_30 *50.256 43.5879 A1_42 - A3_36 4.007 43.5879 A1_42 - A3_42 -31.9405 43.5879 A1_42 - A3_48 34.094 43.5879 A1_48 - A2_30 11.83 43.5879 A1_48 - A2_36 *-48.8395 43.5879 A1_48 - A2_42 -34.989 43.5879 A1_48 - A2_48 -8.816 43.5879 A1_48 - A3_30 2.34 43.5879 A1_48 - A3_36 *-43.909 43.5879 A1_48 - A3_42 *-79.8565 43.5879 A1_48 - A3_48 -13.822 43.5879 A2_30 - A2_36 *-60.6695 43.5879 A2_30 - A2_42 *-46.819 43.5879 A2_30 - A2_48 -20.646 43.5879 A2_30 - A3_30 -9.49 43.5879 A2_30 - A3_36 *-55.739 43.5879 A2_30 - A3_42 *-91.6865 43.5879 A2_30 - A3_48 -25.652 43.5879 A2_36 - A2_42 13.8505 43.5879 A2_36 - A2_48 40.0235 43.5879 A2_36 - A3_30 *51.1795 43.5879 A2_36 - A3_36 4.9305 43.5879 A2_36 - A3_42 -31.017 43.5879 A2_36 - A3_48 35.0175 43.5879 A2_42 - A2_48 26.173 43.5879 A2_42 - A3_30 37.329 43.5879 A2_42 - A3_36 -8.92 43.5879 A2_42 - A3_42 *-44.8675 43.5879 A2_42 - A3_48 21.167 43.5879 A2_48 - A3_30 11.156 43.5879 A2_48 - A3_36 -35.093 43.5879 A2_48 - A3_42 *-71.0405 43.5879 A2_48 - A3_48 -5.006 43.5879 A3_30 - A3_36 *-46.249 43.5879 A3_30 - A3_42 *-82.1965 43.5879 A3_30 - A3_48 -16.162 43.5879 A3_36 - A3_42 -35.9475 43.5879 A3_36 - A3_48 30.087 43.5879 A3_42 - A3_48 *66.0345 43.5879 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xvi Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng điều kiện môi trường đến sự tạo thành PME Hoạt tính PME riêng theo nhiệt độ, pH, độ ẩm Analysis Summary Dependent variable: Hoat tinh PME rieng Factors: Nhiet do pH Do am Number of complete cases: 54 Analysis of Variance for Hoat tinh PME rieng - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:Nhiet do 4.74282 2 2.37141 23.28 0.0000 B:pH 0.4229 2 0.21145 2.08 0.1450 C:Do am 2.72912 2 1.36456 13.40 0.0001 INTERACTIONS AB 0.168164 4 0.0420409 0.41 0.7979 AC 0.88384 4 0.22096 2.17 0.0995 BC 0.908825 4 0.227206 2.23 0.0922 ABC 0.223941 8 0.0279927 0.27 0.9688 RESIDUAL 2.74994 27 0.10185 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 12.8295 53 -------------------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple Range Tests for Hoat tinh PME rieng by Nhiet do -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 32 18 1.12956 X 42 18 1.33194 X 37 18 1.8345 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 32 - 37 *-0.704944 0.218273 32 - 42 -0.202389 0.218273 37 - 42 *0.502556 0.218273 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xvii Multiple Range Tests for Hoat tinh PME rieng by pH -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 5.5 18 1.32094 X 4.5 18 1.43756 X 5 18 1.5375 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 4.5 - 5 -0.0999444 0.218273 4.5 - 5.5 0.116611 0.218273 5 - 5.5 0.216556 0.218273 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Hoat tinh PME rieng by Do am -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Do am Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 50 18 1.15633 X 60 18 1.43267 X 55 18 1.707 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 50 - 55 *-0.550667 0.218273 50 - 60 *-0.276333 0.218273 55 - 60 *0.274333 0.218273 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Analysis Summary Dependent variable: Hoat tinh PME rieng Factor: Nhiet do_pH_do am Number of observations: 54 Number of levels: 27 ANOVA Table for Hoat tinh PME rieng by Nhiet do_pH_do am Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 10.0796 26 0.387677 3.81 0.0005 Within groups 2.74994 27 0.10185 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 12.8295 53 Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xviii Multiple Range Tests for Hoat tinh PME rieng by Nhiet do_pH_do am -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 32_4.5_50 2 0.682 X 42_4.5_50 2 0.86 XX 32_5_50 2 0.8625 XX 32_5.5_50 2 0.8935 XXX 32_5.5_60 2 1.022 XXXX 32_5.5_55 2 1.1505 XXXX 37_5.5_60 2 1.16 XXXX 42_5_50 2 1.1785 XXXXX 42_5.5_55 2 1.26 XXXXXX 32_4.5_55 2 1.275 XXXXXX 42_5.5_50 2 1.2785 XXXXXX 32_5_60 2 1.325 XXXXXX 37_4.5_50 2 1.3305 XXXXXX 32_4.5_60 2 1.39 XXXXX 42_5.5_60 2 1.4 XXXXX 42_5_60 2 1.4065 XXXXX 42_4.5_60 2 1.4815 XXXXXX 42_5_55 2 1.5225 XXXXX 32_5_55 2 1.5655 XXXX 42_4.5_55 2 1.6 XXXX 37_5_50 2 1.66 XXXX 37_5.5_50 2 1.6615 XXXX 37_5_60 2 1.825 XXXX 37_4.5_60 2 1.884 XXXX 37_5.5_55 2 2.0625 XXX 37_4.5_55 2 2.435 XX 37_5_55 2 2.492 X -------------------------------------------------------------------------------- Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xix Hoạt tính PME tổng theo nhiệt độ, pH, độ ẩm nuôi cấy Analysis Summary Dependent variable: Hoat tinh PME tong Factors: Nhiet do pH Do am Number of complete cases: 54 Analysis of Variance for Hoat tinh PME tong - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:Nhiet do 11294.7 2 5647.34 9.56 0.0007 B:pH 3331.98 2 1665.99 2.82 0.0772 C:Do am 24527.6 2 12263.8 20.77 0.0000 INTERACTIONS AB 1384.66 4 346.166 0.59 0.6754 AC 2667.65 4 666.913 1.13 0.3636 BC 4397.58 4 1099.4 1.86 0.1462 ABC 1230.86 8 153.857 0.26 0.9734 RESIDUAL 15944.8 27 590.548 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 64779.9 53 -------------------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple Range Tests for Hoat tinh PME tong by Nhiet do -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 32 18 89.0011 X 42 18 97.5879 X 37 18 123.059 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 32 - 37 *-34.0579 16.6207 32 - 42 -8.58683 16.6207 37 - 42 *25.4711 16.6207 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xx Multiple Range Tests for Hoat tinh PME tong by pH -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 5.5 18 94.3049 X 4.5 18 101.927 XX 5 18 113.416 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 4.5 - 5 -11.4889 16.6207 4.5 - 5.5 7.62222 16.6207 5 - 5.5 *19.1112 16.6207 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Hoat tinh PME tong by Do am -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Do am Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 50 18 73.1063 X 60 18 117.097 X 55 18 119.445 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 50 - 55 *-46.3384 16.6207 50 - 60 *-43.9906 16.6207 55 - 60 2.34783 16.6207 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Analysis Summary Dependent variable: Hoat tinh PME tong Factor: Nhiet do_pH_do am Number of observations: 54 Number of levels: 27 ANOVA Table for Hoat tinh PME tong by Nhiet do_pH_do am Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 48835.1 26 1878.27 3.18 0.0020 Within groups 15944.8 27 590.548 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 64779.9 53 Luận văn Tốt nghiệp khoá 29 năm 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xxi Multiple Range Tests for Hoat tinh PME tong by Nhiet do_pH_do am -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 32_4.5_50 2 47.0385 X 42_4.5_50 2 57.4895 XX 32_5_50 2 58.2115 XXX 32_5.5_50 2 64.091 XXXX 42_5_50 2 73.554 XXXXX 37_4.5_50 2 78.1115 XXXXX 42_5.5_50 2 81.743 XXXXX 32_5.5_60 2 86.383 XXXXXX 32_5.5_55 2 86.8675 XXXXXX 37_5.5_60 2 88.5225 XXXXXX 42_5.5_55 2 93.569 XXXXXX 37_5.5_50 2 98.0845 XXXXX 32_4.5_55 2 98.204 XXXXX 37_5_50 2 99.6335 XXXXX 42_4.5_55 2 107.608 XXXXX 42_5_55 2 112.56 XXXX 42_5.5_60 2 115.928 XXX 32_5_60 2 116.29 XXX 42_5_60 2 116.635 XXX 42_4.5_60 2 119.205 XXXX 32_4.5_60 2 121.944 XXXX 32_5_55 2 121.981 XXXX 37_5.5_55 2 133.555 XXX 37_4.5_60 2 135.649 XXX 37_4.5_55 2 152.096 XX 37_5_60 2 153.317 XX 37_5_55 2 168.562 X -------------------------------------------------------------------------------- ._.