Nghiên cứu sản xuất kháng thể bại liệt trên Thỏ và đánh giá an toàn của vacxin bại liệt trong phòng thí nghiệm:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---------
--------- NGUYỄN THỊ NGA NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ BẠI LIỆT TRÊN THỎ VÀ ðÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN CỦA VẮC XIN BẠI LIỆT TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : THÚ Y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ THỊ LUÂN HÀ NỘI - 2008 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Nga Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LêI C¶M ¥N Trong qu¸ tr×nh häc tËp vµ hoµn thµnh luËn v¨n, víi sù nç lùc cña c¸ nh©n, t«i cßn nhËn ®−îc sù gióp ®ì, h−íng dÉn tËn t×nh cña nhiÒu c¸ nh©n vµ tËp thÓ. Nh©n dÞp hoµn thµnh luËn v¨n, cho phÐp t«i ®−îc bµy tá lßng biÕt ¬n vµ c¶m ¬n ch©n thµnh tíi: Ban Gi¸m hiÖu, c¸c thÇy c« gi¸o Khoa Sau §¹i häc, Khoa ch¨n nu«i Thó y – Tr−êng §¹i häc N«ng nghiÖp, c¸n bé Trung T©m Nghiªn cøu S¶n xuÊt V¾c xin vµ Sinh phÈm Y tÕ vµ ®Æc biÖt lµ c¸c c¸n bé phßng KiÓm ®Þnh chÊt l−îng V¾c xin (QC), nh÷ng ng−êi ®· gióp ®ì, t¹o ®iÒu kiÖn ®Ó t«i häc tËp, tiÕp thu kiÕn thøc trong ch−¬ng tr×nh häc. T«i xin bµy tá lßng biÕt ¬n s©u s¾c tíi. PGS.TS Lª ThÞ Lu©n – Phã Gi¸m ®èc Trung T©m Nghiªn cøu S¶n xuÊt V¾c xin vµ Sinh phÈm Y tÕ - Bé Y tÕ, ®· tËn t×nh gióp ®ì, h−íng dÉn t«i trong suèt thêi gian thùc hiÖn ®Ò tµi, còng nh− trong qu¸ tr×nh hoµn chØnh luËn v¨n tèt nghiÖp. C¶m ¬n . TS. NguyÔn H÷u Nam - Tr−ëng khoa thó y Tr−êng §¹i Häc N«ng nghiÖp I Hµ Néi ®· h−íng dÉn khoa häc vµ gióp ®ì t«i hoµn chØnh luËn v¨n. Xin c¶m ¬n. PGS. TS NguyÔn §¨ng HiÒn – Gi¸m §èc Trung T©m Nghiªn cøu S¶n xuÊt V¾c xin vµ Sinh phÈm y tÕ ®· t¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho t«i hoµn thµnh kho¸ häc vµ thùc hiÖn c¸c nghiªn cøu thÝ nghiÖm. C¶m ¬n s©u s¾c tíi gia ®×nh, ng−êi th©n vµ c¸c b¹n bÌ, ®ång nghiÖp ®· ®éng viªn, chia sÎ, gióp ®ì t«i v−ît qua mäi khã kh¨n trong suèt qu¸ tr×nh häc tËp, nghiªn cøu vµ hoµn thµnh luËn v¨n. Mét lÇn n÷a t«i xin tr©n träng c¶m ¬n ! T¸c gi¶ luËn v¨n NguyÔn ThÞ Nga Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DNA: Deroxyribonucleic acid (axit deroxyribo nucleic) RNA: Ribonucleic acid (axit ribonucleic) CCID50: Cell culture infective dose 50 (Liều gây nhiễm) CGI: Cell Goowth Index (Mẫu B tăng trưởng phát triển) CPE: Cytopathic Effect (Huỷ hoại tế bào) CFU: Clonial Forming Unit (ðám hoại tử) CT TCMR: Chương trình tiêm chủng mở rộng DMSO: Dymethyl Sulphoxide (Môi trường cất giữ tế bào) GLP: Good Laboratory Practive (Tiêu chuẩn thực hành tốt kiểm nghiệm) GM: Grow medium (Môi trường tăng trưởng) GMP: Good Manufacturing Practices (Tiêu chuẩn thực hành tốt sản xuất) HEP2C: Human Laryngocacynoma cincinnati (Tế bào ung thư thanh quản người) HIV: Human immunodeficiency virus (Virus suy giảm miễn dịch ở người) HTK: Huyết thanh khỉ IPV: Inactivated Polio vaccine (Vắc xin bại liệt bất hoạt) IgG: Immunoglobulin G (Globulin miễn dịch lớp G) IgM: Immunoglobulin M (Globulin miễn dịch lớp M) IgA: Immunoglobulin A (Globulin miễn dịch lớp A) LH: Lactabumin Hydrolysate trong ñệm Hanks LHE: Lactabumin Hydrolysate – Hanks - Eagle JVKT: Tế bào thận khỉ sơ sinh Xanh Châu phi PFU: Plasque forming unit (ðơn vị tạo ñám hoại tử) FBS: Fetal Bovine Serum (huyết thanh bê ) TCID50: Tissue culture infective dose 50 (liều gây nhiễm 50% tế bào) WHO: World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) MA104: Tế bào thận khỉ bào thai Rhesus Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv MM: Maintenance medium (Môi trường duy trì) MEM: Eagles Minimum Essential Medium (Môi trường Eagle tối thiểu) OPV: Oral Polio vaccine (Vắc xin bại liệt sống uống giảm ñộc lực) QA: Quality Assurance (Bảo ñảm chất lượng.) QC: Quality Control (Kiểm ñịnh chất lượng) SFV: Simian Foamy virus (Virus nước bọt ở khỉ) SIV: Simian immunodeficiency virus (Virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ) SV40: Siman Virus 40 (Virus 40 ở khỉ) Vero: Tế bào thận khỉ xanh Châu phi HGKT Hiệu giá kháng thể FCA Adjuvant Complexte Freund (tá dược toàn phần) FIA Adjuvant Incomplexte Freund (tá dược không toàn phần) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v MỤC LỤC 1. MỞ ðỞU 1 1.1. Tính cấp thiết của ñề tài 1 1.2. Mục ñích của ñề tài: 3 2. TỞNG QUAN TÀI LIỞU 4 2.1. Bệnh bại liệt do virus 4 2.2. Lịch sử phân bố 5 2.3. Ở Việt Nam 5 2.4. ðặc ñiểm virus bại liệt 5 2.5. Bệnh bại liệt ở người 13 2.6. Tiêu chuẩn Việt Nam về phương pháp kiểm tra tính an toàn của văcxin phòng bại liệt 16 2.7. Văcxin phòng bệnh bại liệt 18 2.8. Nghiên cứu sản xuất kháng thể bại liệt 21 3. ðỞI TỞỞNG, ðỞA ðIỞM, NỞI DUNG VÀ PHỞỞNG PHÁP NGHIÊN CỞU 23 3.1. ðối tượng nghiên cứu 23 3.2. ðịa ñiểm 23 3.3. Nội dung nghiên cứu 23 3.4. Phương pháp nghiên cứu 24 4. KỞT QUỞ - BÀN LUỞN 50 4.1. Kết quả nghiên cứu sản xuất kháng thể bại liệt 50 4.1.1. Kết quả sản xuất kháng nguyên bại liệt 50 4.1.2. Kết quả sản xuất kháng thể từ huyết thanh Thỏ lần thứ nhất 51 4.1.3. Kết quả sản xuất kháng thể từ huyết thanh Thỏ lần thứ hai 57 4.2. Kết quả kiểm tra tính an toàn văcxin bại liệt trong phòng thí nghiệm 63 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi 4.2.1. Kiểm tra nguyên liệu ñầu cho sản xuất văcxin bại liệt – khỉ sản xuất 63 4.2.2. Kết quả kiểm tra tế bào sử dụng cho sản xuất văcxin bại liệt trong bảy năm từ năm 2000 – 2006 65 4.2.3. Kết quả kiểm tra an toàn văcxin bán thành phẩm 70 4.3. Bàn luận 77 4.3.1. Nguyên liệu ñầu khỉ 77 4.3.2. Chất lượng tế bào 79 4.3.3. Hiệu giá kháng huyết thanh 81 5. KỞT LUỞN - KIỞN NGHỞ 84 5.1. Kết luận 84 5.2. Kiến nghị 85 TÀI LIỞU THAM KHỞO 87 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC HÌNH Hình 1. Hình Ởnh cỞa virus BỞi liỞt 4 Hình 2. Hình Ởnh minh hoỞ virus bỞi liỞt 6 Hình 3. Nuôi cỞy tỞ bào thỞn khỞ tiên phát 11 Hình 4. BiỞu hiỞn sỞt li bì 14 Hình 5. BỞnh có thỞ gây tàn phỞ suỞt ñỞi 14 Hình 6. ChỞn thỞ 25 Hình 7. Nuôi nhỞt cách ly mỞi con mỞt lỞng 25 Hình 8. ThỞ trỞỞc khi tiêm 26 Hình 9. ThỞ khi tiêm 26 Hình 10. ThỞ sau khi tiêm 26 Hình 11. VỞt sỞo tiêm trong da ThỞ sau 2 tuỞn 26 Hình 12. ChuỞn bỞ lỞy máu 27 Hình 13. VỞ trí lỞy máu 27 Hình 14. LỞy máu tỞ mũi 0 ñỞn mũi 4 27 Hình 15. LỞy máu toàn bỞ (mũi 5) 27 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC BẢNG BỞng 4.1. Các thông sỞ cho sỞn xuỞt kháng nguyên bỞi liỞt trên khỞ 50 BỞng 4.2. ThỞ tích kháng nguyên bỞi liỞt 50 BỞng 4.3. SỞ lỞỞng huyỞt thanh thu ñỞỞc cỞa lỞn thỞ nghiỞm thỞ 1 51 BỞng 4.4. HiỞu giá kháng thỞ týp II (lỞn 1) 52 BỞng 4.5. HiỞu giá kháng thỞ chéo (týp I) 54 BỞng 4.6. HiỞu giá kháng thỞ chéo (týp III) 56 BỞng 4.7. SỞ lỞỞng huyỞt thanh thu ñỞỞc cỞa lỞn thỞ nghiỞm thỞ 2 58 BỞng 4.8. HiỞu giá kháng thỞ týp II (lỞn 2) 58 BỞng 4.9. HiỞu giá kháng thỞ týp II lỞn 2 (Theo phỞỞng pháp tiêm bỞp ñùi) 60 BỞng 4.10. HiỞu giá kháng thỞ chéo (týp I ) 61 BỞng 4.11. KỞt quỞ kiỞm tra các test thỞ nghiỞm cho khỞ trong 7 năm (2000 - 2006) 64 BỞng 4.12. TỞ lỞ khỞ sỞch cho sỞn xuỞt vỞc xin bỞi liỞt 65 BỞng 4.13. ChỞt lỞỞng tỞ bào sỞ dỞng cho sỞn xuỞt vỞc xin bỞi liỞt 66 BỞng 4.14. KỞt quỞ kiỞm tra tác nhân ngoỞi lai trên nỞỞc nỞi nuôi tỞ bào sỞ dỞng cho sỞn xuỞt vỞc xin bỞi liỞt (mỞu 1) 67 BỞng 4.15. KỞt quỞ kiỞm tra tác nhân ngoỞi lai trên nỞỞc nỞi nuôi tỞ bào sỞ dỞng cho sỞn xuỞt vỞc xin bỞi liỞt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix (mỞu 2) 68 BỞng 4.16. ChỞt lỞỞng tỞ bào sỞ dỞng cho sỞn xuỞt văcxin bỞi liỞt 69 BỞng 4.17: ChỞt lỞỞng văcxin bỞi liỞt bán thành phỞm năm 2000-2006 72 BỞng 4.18. HiỞu giá và tính Ởn ñỞnh nhiỞt văcxin bỞi liỞt týp 1 74 BỞng 4.19. HiỞu giá và tính Ởn ñỞnh nhiỞt cỞa Văcxin bỞi liỞt týp 2 75 BỞng 4.20. HiỞu giá và tính Ởn ñỞnh nhiỞt cỞa Văcxin bỞi liỞt týp III 76 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… x DANH MỤC BIỂU ðỒ BiỞu ñỞ 1. HiỞu giá kháng thỞ týp II lỞn thỞ nhỞt 53 BiỞu ñỞ 2. HiỞu giá kháng thỞ chéo týp I 55 BiỞu ñỞ 3. HiỞu giá kháng thỞ chéo týp III 56 BiỞu ñỞ 4. HiỞu giá kháng thỞ týp II (theo phỞỞng pháp tiêm dỞỞi da) 59 BiỞu ñỞ 5. HiỞu giá kháng thỞ týp II (theo phỞỞng pháp tiêm bỞp ñùi) 60 BiỞu ñỞ 6. HiỞu giá kháng thỞ chéo týp I lỞn thỞ 2 62 BiỞu ñỞ 7: SỞ thay ñỞi hiỞu giá giỞa 2 nhiỞt ñỞ 74 BiỞu ñỞ 8: SỞ thay ñỞi hiỞu giá giỞa 2 nhiỞt ñỞ cỞa văcxin bai liỞt týp II 75 BiỞu ñỞ 9: thay ñỞi hiỞu giá giỞa 2 nhiỞt ñỞ cỞa văcxin bai liỞt týp III 76 1 1. MỞ ðẦU 1.1. Tính cấp thiết của ñề tài Bệnh bại liệt do Polio virus gây ra là một bệnh nhiễm trùng toàn thân, có biểu hiện lâm sàng với các mức ñộ nặng nhẹ khác nhau, gây tổn thương hệ thần kinh trung ương và ñôi khi gây biểu hiện liệt mềm cấp. Bệnh thường ñược gọi dưới tên Poliomyelitis (Polios: Chất xám, myelos: tủy sống), ñể mô tả tổn thương bệnh lý tại các nơron của chất xám, ñặc biệt tại sừng trước của hệ thần kinh tủy sống gây biểu hiện liệt mềm cấp. Bệnh bại liệt do virrus gây ra bởi 3 týp Polio khác nhau (týp I-II-III ), dựa vào tính khác biệt về kiểm tra huyết thanh trung hòa. Trước khi dùng văcxin ñại ña số các trường hợp liệt do virus Polio gây ra thuộc nhóm virus hoang dại [4], [5], [8], [12], [17], [19] và ñể lại di chứng liệt suốt ñời cho trẻ, ñặc biệt nghiêm trọng nếu như gây liệt hô hấp có thể dẫn tới tử vong. Bệnh bại liệt chưa có thuốc ñặc trị, nhưng rất may mắn cho nhân loại là ñã có vacxin phòng bệnh ñặc hiệu. ðó là vacxin bất hoạt của Salk (1950-1954) lần ñầu tiên ñược sử dụng ở Mỹ. Sau năm 1950 việc xuất hiện vacxin sống giảm ñộc lực của Sabin [9], [12], [20], [23], [99] ñã ñưa ñến cho con người khả năng sử dụng dễ dàng và có thể cho nhiều người uống cùng một lúc. Do vậy, tính ñến thời ñiểm hiện tại, văcxin này ñã ñược sử dụng trên toàn thế giới trong hơn 40 năm qua. Năm 1988, WHO ñã dựa vào những thành tựu do văcxin ñem lại ñể ñưa ra chương trình thanh toán bại liệt trên toàn Thế giới vào năm 2010. Việt Nam là một trong những nước thuộc khu vực Tây Thái Bình Dương, nằm trong vùng dịch bại liệt lưu hành cao, tập trung chủ yếu ở các tỉnh phía Nam nên trẻ em Việt Nam cũng ñã ñược thừa hưởng những thành quả nghiên cứu khoa học của Thế giới về việc có ñược một vacxin phòng bại liệt. GS.TSKH. Hoàng Thủy Nguyên là người ñầu tiên ñã áp dụng thành công công nghệ sản xuất văcxin Sabin ở Việt Nam vào những năm ñầu 1960, khi có vụ dịch bại liệt rất lớn xảy ra và 2 nhờ vậy, ñã cứu sống ñược sinh mạng của hàng triệu trẻ em Việt Nam. Từ ñó ñến nay, quy trình công nghệ sản xuất vacxin bại liệt ngày càng ñược hoàn thiện cả về số lượng và chất lượng, góp phần ñáng kể vào việc phòng chống bệnh bại liệt [9], [20], [21], [23], giảm tỷ lệ tử vong, từng bước khống chế và ñã tiến hành thanh toán bệnh bại liệt vào năm 2000 của Bộ Y Tế Việt Nam trong Chương trình Tiêm chủng mở rộng. Hiện nay, Chương trình Tiêm chủng mở rộng có ñặt hàng tại Trung Tâm nghiên cứu sản xuất văcxin và Sinh phẩm Y tế một số lượng vacxin bại liệt xấp xỉ 8 ~10.000.000 liều /năm, dành cho các trẻ mới sinh ñể phòng bệnh bại liệt. Việc sử dụng vacxin có hiệu quả ñã làm giảm nhanh chóng bệnh bại liệt ở hầu hết các nước phát triển trên Thế giới. Việt Nam là một trong những nước sản xuất văcxin sống giảm ñộc lực, sản xuất trên tế bào thận khỉ tiên phát, vacxin ñảm bảo yêu cầu: An toàn - Hiệu lực. Sự an toàn của vacxin ñược kiểm tra và ñánh giá theo tiêu chuẩn quy ñịnh của Tổ chức Y Tế Thế giới. Việc ñánh giá chất lượng văcxin ñược chuyển từ các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm sang ñánh giá trên người ñã ñánh dấu một bước quan trọng trong lĩnh vực phát triển văcxin. Tổ chức y tế Thế giới ñã từng có những khuyến cáo về khả năng xảy ra “sự cố” khi virus bại liệt hoang dại xâm nhập các nước. Bởi vì, virus ñược phân bố ở mọi nơi, ở nguồn nước, trong thực phẩm không an toàn. Chúng cũng có thể có ở người sống ở vùng dịch di chuyển ñến. Việt Nam ñã ñạt ñược các tiêu chuẩn khắt khe và ñược WHO công nhận là Quốc gia thanh toán ñược bệnh bại liệt từ năm 2000. Nhưng chúng ta cũng không chủ quan và cần thiết ñề phòng về việc virus có thể xâm nhập. Hiện nay, không có phương pháp nào cho phép chữa trị bệnh lý này và chỉ có tiêm phòng văcxin là hiệu quả nhất. Từ trước ñến nay, chúng ta vẫn có chương trình cho trẻ uống văcxin phòng bại liệt hàng năm. Tất cả các trẻ dưới 5 tuối và toàn bộ trẻ ở vùng có nguy cơ cao (giáp biên giới) sẽ ñược uống ñủ 2 liều văcxin phòng bại liệt. Hàng năm Chương trình tiêm chủng mở rộng ñặt hàng với Trung tâm Nghiên cứu, Sản xuất Văcxin và Sinh phẩm Y tế số lượng 8.000.000 – 10.000.000 liều, chất lượng ổn ñịnh, hiệu quả. Vì vậy, trên cơ sở khoa học của việc sản xuất và kiểm nghiệm vacxin bại liệt, 3 chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu sản xuất kháng thể Bại liệt trên thỏ và ñánh giá tính an toàn của văcxin Bại liệt trong phòng thí nghiệm”. 1.2. Mục ñích của ñề tài: - Sản xuất kháng thể Bại liệt trên thỏ. - Xác ñịnh tính an toàn của vacxin bại liệt sản xuất tại Việt Nam năm 2000- 2006 trong phòng thí nghiệm. 4 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Bệnh bại liệt do virus Virus gây bệnh bại liệt có tên khoa học là Polio, ở người nó ñược gọi là Polio virus Hominis. Gọi là virus bại liệt hoang dại ñể chúng ta phân biệt virus gây bệnh bại liệt ở người với virus bại liệt dùng ñể sản xuất văcxin ñã ñược làm giảm ñộc lực. Virus này lây qua ñường tiêu hoá. Khi vào cơ thể, nó sẽ ở ruột. Nếu không có kháng thể chống ñỡ, Polio tiếp tục vào máu, lên não, phá hỏng tế bào thần kinh gây liệt các cơ tương ứng như chân, tay. Nặng nề hơn, nó có thể gây liệt cơ hô hấp. Với trường hợp liệt cơ hô hấp, tỷ lệ tử vong rất cao. Năm 1959, nước ta ñã từng xảy ra dịch bại liệt rất nặng nề. Bệnh có thể lây từ người sang người qua ñường tiêu hoá, qua thức ăn nhiễm virus bại liệt. Do vậy, việc giữ vệ sinh ăn uống là rất quan trọng cho phòng bệnh. Bệnh bại liệt do Polio virus là một bệnh nhiễm cấp tính rất nguy hiểm cho trẻ em. Bệnh có thể gây hậu quả liệt cơ vận ñộng ñể lại di chứng suốt ñời, ñặc biệt nghiêm trọng nếu như gây liệt hô hấp có thể ñe dọa ñến tính mạng. Bệnh do 3 týp virus khác nhau gây ra: Týp I, Týp II, Týp III, phổ biến nhất là týp I nó giữ vai trò chính trong việc gây bệnh bại liệt. Hình 1. Hình ảnh của virus Bại liệt 5 2.2. Lịch sử phân bố Virus bại liệt ñược phát hiện từ năm 1909 bởi Landsteiner và Popper ñã tiến hành thí nghiệm tiêm dịch tủy sống của một trẻ bi chết vì bại liệt vào não khỉ. Từ trước những năm 1950, việc nghiên cứu còn chậm do chưa tìm ra phương pháp ñơn giản ñể thí nghiệm. Từ sau năm 1950 cùng với những tiến bộ vượt bậc về virus học và kính hiển vi ñiện tử, phương pháp XQuang phóng xạ ñã cho phép xác ñịnh ñược hình thái cấu trúc của Virus bại liệt [5], [8], [10], [17], [19]. Theo thông báo của WHO, Bệnh bại liệt có mặt ở khắp mọi nơi chiếm khoảng 70% số trẻ trên Thế giới sống trong vùng có dịch bại liệt lưu hành. 2.3. Ở Việt Nam Là một trong những nước có tỷ lệ mắc bệnh bại liệt cao, tập trung chủ yếu ở các tỉnh phía Nam (VSPD-1994). ðã sản xuất ñược vacxin bại liệt uống giảm ñộc lực từ năm 1960 và ñã khống chế ñược các vụ dịch lớn và ñã ñược Tổ chức Y tế Thế giới công nhận là thanh toán thành công bệnh bại liệt từ năm 2000. ðể bảo vệ thành quả này, chương trình tiêm chủng mở rộng vẫn tiếp tục cung cấp văcxin cho trẻ dưới 1 tuổi (uống 3 liều trong những tháng ñầu ñời) uống nền phòng bệnh. Tuy nhiên, trước tình hình dịch bại liệt tái xuất ở các nước ðông Nam Á như Indonesia - một nước ñã thanh toán ñược bệnh này 10 năm nay và vẫn duy trì tiêm chủng mở rộng - Bộ y tế nhận ñịnh rằng nguy cơ xảy ra ñiều tương tự ở Việt Nam là khá cao. Theo khuyến cáo của Tổ Chức Y tế Thế giới, từ nay ñến 2010 tất cả các nước phải sử dụng vacxin bại liệt cho trẻ em (kể cả giảm ñộc lực hoặc bất hoạt). 2.4. ðặc ñiểm virus bại liệt 2.4.1. Phân loại virus Virus bại liệt có tên là virus Polio. Virus Polio là thành viên của nhóm virus ñường ruột thuộc họ Picornaviridae. Họ này gồm 3 nhóm: Nhóm Enterovirus, Nhóm Rhinovirus và các virus ñường ruột chưa ñược xếp loại [66], [71], [73], [82]. Trong nhóm Enterovirus bao gồm: 6 - Virus bại liệt: Týp 1, týp 2, týp III. - Virus Coxsakie A: Từ A1 – A24 (không có A23) - Virus Coxsakie B: Từ B1 – B6 - Virus Echo ở người: Từ 1- 34 (không có Echo 10 hoặc 28) - Một vài virus ñường ruột khác: Từ 68 – 71. Virus bại liệt ñược coi là thành viên quan trọng nhất trong nhóm này. Virus bại liệt bao gồm 3 týp kháng nguyên [58], [66], [73], [84], [95]. - Týp I: Tên gọi là Brunhilde với chủng ñại diện Mahoney (USA) và 1942 (Viện Pasteur Paris). - Týp II: Chủng gốc là Lansing với chủng ñại diện là MEF và 1523 (Viện Pasteur Paris). - Týp III: Chủng gốc là Leon với chủng ñại diện SauKett và 1266 (Viện Pasteur Paris) [5], [10], [12], [58], [66], [73]. Týp I là nguyên nhân chính của các vụ dịch lớn, thường gặp nhiều nhất và giữ vai trò chính trong việc gây bệnh bại liệt (chiếm 80% – 90%). Týp 2 và týp III thường ít gặp hơn (chiếm 4% - 10%) và phân bố rất khác nhau tùy theo từng nước và từng vùng ñịa lý. 2.4.2. Hình thái cấu tạo Hình 2. Hình ảnh minh hoạ virus bại liệt Dưới kính hiển vi ñiện tử, virus bại liệt có dạng hình cầu, cấu trúc 20 mặt [70], [81] ñường kính khoảng 27 – 30 ηm, không vỏ, trọng lượng phân tử 6,8 x 106 Dalton, bao gồm 1 protein capsit có cấu trúc bền vững bao bọc lấy ARN của virus. Capsit bao gồm 60 tiểu ñơn vị giống hệt nhau xếp ñối xứng 20 mặt, mỗi tiểu ñơn vị ñược cấu tạo gồm 4 chuỗi polipeptid là: VP1, VP2, VP3 và VP4 [81], [97]. 7 Bằng phương pháp nhiễm xạ tia X người ta ñã biết ñược cấu trúc chi tiết của hạt virion Polio hoàn chỉnh. Các chất hoạt mạch trên bề mặt của virion ñược cấu thành bởi polypeptid VP1, VP2, VP3, trong khi ñó VP4 nằm hoàn toàn bên trong hạt virus [70], [86]. Virus bại liệt có cấu trúc không gian 3 chiều, hình ña diện, có 3 cạnh ñối xứng nhau. 2.4.3. Tính chất hóa học Axit nucleic : Là ARN sợi ñơn dương, trọng lượng phân tử ≈ 2,5 x 106 Dalton, chiều dài 2,4 µl cuộn lại nằm trong vỏ capsid [12], [38], [46], [52], [60], [64], 1 polypeptid nhỏ (VPg) gắn vào ñầu cuối 5’, còn ñầu 3’ bị polyadenyl hóa. ARN của virus ñược phân thành 3 vùng chủ yếu [70], [81]: Vùng không phiên dịch ñầu 5’ Vùng không phiên dịch ñầu 3’ - ðầu 5’ bao gồm 740 bazơ chiếm khoảng 10% vật liệu di truyền. - ðầu 3’ bao gồm 70 bazơ chiếm khoảng 1% vật liệu di truyền Khung ñọc mở bao gồm 6635 nucleotide, chiếm khoảng 89% vật liệu di truyền. ðây là trung tâm di truyền của virus. Còn ñầu 5’ có liên quan ñến ñộc lực thần kinh và tính ổn ñịnh của virus [32], [33], [34], [35], [36], [42], [43], [44]. ARN của virus hoạt ñộng như một ARN thông tin (mARN) cho quá trình tổng hợp protein của virus, ñầu tiên là sự tổng hợp polyprotein lớn có trọng lượng phân tử 246 kDa, polyprotein lớn này tách thành 3 protein trung gian (P1, P2, P3) do tác dụng của men proteaza, là các protein chức năng của virus. Protein trung gian P1 sẽ tổng hợp nên protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3 và VP4). Protein trung gian P2 và P3 sẽ tổng hợp nên protein không cấu trúc (2A, 2B, Khoảng 7.450 bazơ Vùng 1 Vùng 2 Vùng 3 Vùng phiên dịch VPg Poly A 8 2C, 3AB, 3C, 3D). Protein 2A và 3C có chức năng như men proteaza của virus. Protein 3D là enzym polymeaza phụ thuộc ARN có chức năng sao chép ARN của virus theo ñường sợi trung gian nhạy cảm âm. Các protein: Protein của virus bại liệt bao gồm 4 loại từ VP1 ñến VP4. VP1 bao gồm 306 axit amin có trọng lượng phân tử 34 kDal VP2 bao gồm 272 axit amin có trọng lượng phân tử 30 kDal VP3 bao gồm 238 axit amin có trọng lượng phân tử 26 kDal VP4 có trọng lượng phân tử 7 kDal bao gồm 69 axit amin [37], [45]. Trong ñó VP1, VP2, VP3 tạo nên cấu trúc bề mặt của virus, còn VP4 nằm trong vỏ capsid và liên kết với axit nhân (ARN). Các protein bề mặt tạo nên các vị trí kháng nguyên trung hòa: 1, 2, 3 a và 3 b [60], [61], [80], [81]. Ngoài ra vỏ capsid còn có tác dụng bảo vệ axit nhân và quyết ñịnh khả năng hấp thụ của virus lên bề mặt tế bào thông qua các thụ thể ñặc hiệu [7], [14], [16]. Lipid: Virus bại liệt không chứa lipid. ðây là loại virus trần không có vỏ lipid. Do ñó, nó không bị tác ñộng bởi ether, cồn, phenol 1% và các thuốc tẩy thông dụng [5], [7], [10], [12], [14], [16]. Dựa vào tính chất này, người ta ñã sử dụng clorofom ñể xử lý bệnh phẩm trước khi phân lập virus mà không làm mất ñi hoạt tính của virus [4], [15], [17]. Tính bền vững với nhiệt ñộ: Nhiệt ñộ ảnh hưởng nhiều nhất ñến virus bại liệt, virus bại liệt bị bất hoạt hoàn toàn ở nhiệt ñộ 560C trong 30 phút, virus bị bất hoạt vào cuối tháng thứ 3 ở nhiệt ñộ 200C ñến 240C, virus ñược bảo tồn vài năm ở nhiệt ñộ -200C ñến -700C, virus giảm hiệu giá rất nhanh ở nhiệt ñộ 370C [29], [32], [40], [70]. Virus tăng tính bền với nhiệt khi có mặt của ion Canxi hoặc ion Magiê nồng ñộ 1M [59], [67], [75]. Dựa 9 vào tính chất này ở Việt Nam ñã sử dụng MgCl2 làm tăng sức bền của văcxin sống giảm ñộc lực. Tính bền vững với pH: Virus bại liệt bền vững với pH ở diện rộng từ pH=2 ñến pH=10. Nhờ tính chất này mà virus bại liệt tồn tại và phát triển ở pH=2, sinh sôi nảy nở trong ruột người ở pH=10. Các tính chất hóa học khác: Virus bị mất ñộc tính bởi formalin [11], [19], [21], nhưng tính chất kháng nguyên vẫn ñược bảo tồn, dựa vào tính chất này mà người ta ñã sản xuất văcxin bất hoạt của Salk. Virus bại liệt bị bất hoạt bởi tia cực tím và ñông khô [71], [82]. Vì vậy, người ta không sử dụng phương pháp ñông khô ñể bảo quản virus, ñồng thời trong khi nuôi cấy virus cũng không ñược bật ñèn tím. 2.4.4. Cấu tạo của kháng nguyên Kháng nguyên của hạt virus hoàn chỉnh có khả năng gây nhiễm trùng gọi là kháng nguyên D (hoặc còn gọi là kháng nguyên N). Khi hạt virus bị ñun nóng ở 500C – 600C thì hình thái của hạt virus bị thay ñổi và kháng nguyên D trở thành kháng nguyên C (hoặc còn gọi là kháng nguyên H) [5], [7], [10], [11], [12], [14], [16], [19], [21], [71]. Kháng nguyên D có hằng số lắng là 160S, còn kháng nguyên C có hằng số lắng là 80S – 90S [7], [11], [14], [16], [19], [21]. Kháng nguyên D là hạt virus hoàn chỉnh bao gồm cả ARN và vỏ capsid, còn kháng nguyên C chỉ là vỏ capsid không có axit nhân và VP4. Kháng nguyên D và C không có phản ứng miễn dịch chéo, hai kháng nguyên này ñược phát hiện bằng phản ứng kết hợp bổ thể và phản ứng miễn dịch kết tủa trên gel. Kháng nguyên D có chức năng tạo ra kháng thể trung hòa ñặc hiệu týp. Ngoài ra, nó còn có chức năng quan trọng khác là bám vào các thụ thể (Receptor) của tế bào 10 cảm thụ [70], [81]. Nhờ có chức năng này mà virus có thể xâm nhập vào bên trong tế bào cảm thụ ñể nhân lên, vận dụng chức năng này mà người ta sản xuất văcxin bằng phương pháp nuôi cấy trên tế bào cảm thụ. Trong sản xuất văcxin từ nuôi cấy tế bào ñã tạo ra số lượng lớn, chủ yếu là kháng nguyên D. Chính kháng nguyên D này là chỉ số ñể ñánh giá hiệu lực của văcxin bại liệt bất hoạt [78], [89] dựa vào ñơn vị kháng nguyên D. Kháng nguyên C là kháng nguyên chung cho tất cả các týp [70], [81], nó kích thích cơ thể tạo ra kháng thể kết hợp bổ thể [5], [10], [12]. Nếu dùng kháng nguyên này ñể chế tạo huyết thanh thì sẽ không thu ñược kháng thể trung hòa [7], [11], [14], [16], [19], [21]. Khi cơ thể bị nhiễm virus bại liệt sẽ tạo kháng thể trung hòa và kháng thể kết hợp bổ thể. Ở giai ñoạn cấp, huyết thanh bệnh nhân phản ứng mạnh với kháng nguyên C. Kháng nguyên D kích thích cơ thể tạo kháng thể ở giai ñoạn muộn hơn và tồn tại lâu trong máu [5], [7], [10], [11], [12], [14], [16], [19], [21]. 2.4.5. Tính chất miễn dịch học Miễn dịch thụ ñộng ñược truyền từ mẹ sang con. Kháng thể này chỉ xuất hiện ở trẻ sơ sinh, sau ñó giảm dần và biến mất khi trẻ ñược 6 tháng tuổi [10], [87], [98]. Miễn dịch chủ ñộng là sự ñáp ứng miễn dịch khi cơ thể bị nhiễm virus tự nhiên hoặc do dùng văcxin. ðây là loại miễn dịch quan trọng mà loài người ñã biết ứng dụng ñể phòng bệnh bằng cách dùng văcxin. Khi cơ thể bị nhiễm virus bại liệt tự nhiên hay dùng văcxin, cơ thể sẽ tạo ra miễn dịch ñặc hiệu chống lại sự xâm nhập của virus vào cơ thể. Kháng thể ñặc hiệu chủ yếu là miễn dịch dịch thể bao gồm các loại Ig miễn dịch như: IgM, IgG, IgA và IgA. Những người bị thiếu hụt miễn dịch, khi bị nhiễm virus bại liệt (kể cả virus văcxin Sabin ñều có nguy cơ mắc bệnh bại liệt [11], [19], [21]. Chính vì vậy mà văcxin Sabin bị chống chỉ ñịnh ñối với những người này. Còn ñối với văcxin IPV vẫn có thể dùng ñược khi người ñó có nguy cơ mắc bệnh cao. Một số yếu tố làm giảm khả năng miễn dịch tại chỗ như: những người cắt bỏ tuyến giáp và tuyến hạnh nhân [11], [19], [21]. Ở trong một số vụ dịch người ta thấy 11 trẻ em dưới 5 tuổi, phụ nữ có thai, trẻ suy dinh dưỡng có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn [19], [28], [33], [86], [97]. * Sự nhân lên của virus bại liệt trong tế bào cảm thụ: Bệnh bại liệt ñược mô tả sớm, năm 1840 Hein chứng minh và xếp bại liệt thành một bệnh riêng biệt. Năm 1949 Ender, Weller và Robbins ñã phát hiện ñược virus bại liệt có thể nhân lên trên tế bào bào thai người và tế bào thận khỉ. Bệnh bại liệt là một nhiễm trùng ñường ruột cấp tính do virus gây ra. Virus bại liệt ñặc biệt gây tổn thương các tế bào sừng trước tuỷ sống và các tế bào vận ñộng của thần kinh trung ương [11, 12]. Hình 3. Nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát Nuôi cấy tế bào giữ một vai trò quan trọng trong nghiên cứu virus bại liệt. Tế bào ñược sử dụng ñể phân lập, ñịnh týp, chuẩn ñộ hiệu giá và xác ñịnh tính kháng nguyên của virus. ðặc biệt tế bào còn ñược sử dụng ñể sản xuất văcxin bại liệt [11], [12]. Sự nhân lên của virus trong tế bào ñã ñược biết ñến từ năm 1913. Người ta dựa vào ñặc tính ưa thần kinh của virus mà các nhà nghiên cứu ñề nghị dùng mô não, tủy ñể phân lập virus. Năm 1949 Enders ñã thành công trong việc nuôi cấy virus bại liệt trên tế bào mô của ñộng vật có vú ở trong phòng thí nghiệm [19],[28], [33], [78], [89]. Năm 1954 với các công trình nghiên cứu ông ñã khẳng ñịnh virus bại liệt có khả năng nhân lên trong tế bào mô. Có hai loại tế bào nhạy cảm với virus bại liệt là: • Dòng tế bào thường trực • Dòng tế bào tiên phát Tế bào thường trực là loại tế bào có thể tách nhiều lần mà không ảnh hưởng ñến virus bại liệt, ñó là HEP2C (có nguồn gốc từ tế bào ung thư biểu mô thanh quản của người). 12 Tế bào tiên phát (hay còn gọi là tế bào Vero, có nguồn gốc từ thận khỉ xanh Châu Phi). Tế bào tiên phát là dòng tế bào tách trực tiếp từ mô ñộng vật như: Thận khỉ, thận thỏ,.... Tế bào thận khỉ tiên phát nhạy cảm nhất với virus bại liệt, dựa vào tính chất này mà các nhà nghiên cứu ñã sử dụng thận khỉ tiên phát ñể sản xuất văcxin sống giảm ñộc lực. Tế bào HEP2C ñược sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm ñể phân lập virus bại liệt và kiểm tra hiệu giá của văcxin ñơn týp, ña týp (ñặc biệt là HEP2C do Tổ chức y tế Thế giới cung cấp [86], [97]. * Quá trình nhân lên của virus bại liệt trong tế bào: Virus bại liệt chứa vật liệu di truyền là ARN sợi dương. Quá trình nhân lên của chúng có một số ñặc ñiểm khác với các loại virus khác là: - ARN của virus khi vào trong tế bào sẽ hoạt ñộng như ARN thông tin. - Quá trình này bao gồm 5 giai ñoạn: 1. Hấp phụ và xâm nhập 2. Hủy hoại capsid virus 3. Tổng hợp axit nucleic và protein capsid 4. Lắp ráp virus 5. Giải phóng virus 2.4.6. Khả năng gây bệnh thực nghiệm Năm 1909, lần ñầu tiên con người gây bệnh thực nghiệm ñối với bệnh bại liệt do Landsteiner và Poper thực hiện. Năm 1950, khỉ là ñộng vật duy nhất dùng ñể phân lập virus bại liệt [4], [15], [17] và các thử nghiệm có liên quan ñến virus bại liệt. Có rất nhiều loại khỉ nhạy cảm với virus bại liệt như: Loài tinh tinh, Khỉ Macacus rhesus, Cynomolgus, Cercopithecus,... [5], [10], [12]. ðường gây nhiễm là ñường não hoặc tủy sống (Riêng loài tinh tinh có thể gây nhiễm bằng ñường uống [11], [19], [21]. Thời gian ủ bệnh dài hay ngắn là khác nhau tùy thuộc vào các loài khác nhau và ñường gây nhiễm. Thường là từ 15 – 25 ngày sau gây nhiễm [83], [94]. Triệu trứng lâm sàng giống như bệnh bại liệt ở người. Xét nghiệm giải phẫu bệnh lý 13 tổ chức não và tủy sống cho thấy hình ảnh tổn thương ñiển hình. Các tế bào thần kinh vận ñộng bị phá hủy. Các chất nhiễm sắc thể bị ly giải, thể Nissl bị biến mất trong bào tương của tế bào thần kinh. Ngoài ra còn có hiện tượng thực bào tế bào thần kinh bởi thực trạng viêm nhiễm. Các bạch cầu ñơn nhân tập trung xung quanh các mao quản. Những tổn thương mạnh mẽ và rất ñặc hiệu thường thấy ở sừng trước tủy sống. ðể ñánh giá mức ñộ tổn thương do virus bại liệt, người ta giải phẫu con vật, quan sát các tổn thương ở não, hành tủy, tủy sống, các hạch thần kinh,.... Ngày nay, khỉ vẫn ñược dùng làm súc vật thí nghiệm [31], [33], [40], [41], [48], [57], [65], [72]. Trung tâm Nghiên cứu, Sản xuất Văcxin và Sinh phẩm Y tế ñã dùng khỉ Macaca Mulatta ñể kiểm tra tính an toàn của văcxin [2], [4]. 2.4.7. Sự biến ñổi vật liệu di truyền của virus bại liệt Cũng giống như virus chứa ARN khác, vật liệu di truyền của virus bại liệt có một tỷ lệ ñột biến nhất ñịnh. Người ta nhận thấy các virus nhân lên trong cùng một tế bào cũng không hoàn toàn ñồng nhất về mặt di truyền [47], [55], [58], [66], [77], [88]. Sự so sánh các vùng vật liệu di truyền bằng kỹ thuật PCR – RFLP ñã cho thấy các chủng phân lập ñược ở các vùng khác nhau hoặc ở các thời ñiểm khác nhau có các kiểu gen k._.hác nhau. Sự phát triển nhanh của virus bại liệt trong tự nhiên dẫn ñến sự biến ñổi của vật liệu di truyền [31], [33], [41]. Tuy nhiên sự biến ñổi này không ñều nhau. ñột biến hay xảy ra ở vùng không mã hóa ñầu 5’ từ 90 nucleotid nằm sát khung ñọc mở là bền vững [12]. Trong vùng ñọc mở, gen mã hóa cho protein VP1 có khả năng biến ñổi cao, nhưng những vùng mã hóa cho các protein không cấu trúc thì bền vững hơn [13], [22], [24], [90]. 2.5. Bệnh bại liệt ở người Bệnh bại liệt xâm nhập vào cơ thể qua ñường tiêu hóa và nhân lên tại ruột, tại các tổ chức lâm ba kế cận, chúng xâm nhập chủ yếu ở các nơron vận ñộng gây nhiễm trùng thể ẩn ( Bên ngoài không có biểu hiện gì, ở tình trạng người lành mang virus chiếm 99%). Nếu xâm nhập mạnh có thể gây bệnh nhẹ, làm cho bệnh nhân bị 14 sốt, khó chịu, buồn ngủ, ñau ñầu, buồn nôn, táo bón, ñau bụng và kèm các triệu chứng khác, bệnh nhân tự hồi phục sau vài ngày. Nếu bị nặng sẽ trở nên trầm trọng: Biểu hiện là bệnh viêm màng não vô khuẩn, ở trường hợp này khó chẩn ñoán vì virus bại liệt không phải là tác nhân duy nhất gây bệnh mà còn có các tác nhân khác, ñặc biệt là thành viên các nhóm virus ñường ruột [19], [26]. Bệnh nhân có một vài triệu chứng của bệnh, kèm theo ñau bụng và cứng cơ. Bệnh kéo dài từ 2 – 10 ngày, sau ñó hồi phục hoàn toàn. 2.5.1. ðặc ñiểm lâm sàng Hình 4. Biểu hiện sốt li bì Hình 5. Bệnh có thể gây tàn phế suốt ñời Thông thường khoảng 1% với các triệu chứng sau: - Thời kỳ ủ bệnh: Kéo dài từ 7- 14 ngày, có khi kéo dài ñến 35 ngày mà không có triệu chứng gì. - Thời kỳ phát bệnh: + Khởi phát: Bệnh nhân mệt mỏi, sốt nhẹ, ñau mình, ñau cơ, buồn nôn hoặc nôn, cứng cơ, ñôi khi có biểu hiện của viêm màng não vô khuẩn. + Triệu chứng: Liệt mềm, giảm trương lực cơ, liệt không ñối xứng và teo cơ nhanh, liệt có thể hồi phục ( tùy thuộc vào ñộc lực của virus), thời gian hồi phục có thể 1- 2 năm. Ngoài ra mức ñộ gây tổn thương của virus bại liệt ñối với hệ thần kinh trung ương mà có biểu hiện không ñiển hình ñặc biệt khác: 15 Thể liệt cơ hô hấp: Thường gặp ở người lớn, dễ gây tử vong. Thể liệt các dây thần kinh khác: Dây thần kinh sọ não, hay gặp là nhóm dây 7 dẫn ñến liệt mặt hoặc liệt các cơ vận nhãn. ðiều trị: - Hiện nay chưa có phương pháp ñiều trị ñặc hiệu. Chủ yếu là ñiều trị nâng ñỡ. Bệnh nhân bất ñộng hoàn toàn, dùng thuốc ñể tăng thể trạng. Trong giai ñoạn cấp của bệnh không ñược can thiệp bằng tiêm hoặc châm cứu. - ðiều trị phục hồi chức năng là vấn ñề rất quan trọng, nhằm hồi phục từng phần hoặc hoàn toàn di chứng bại liệt. 2.5.2. Chẩn ñoán phòng thí nghiệm Phân lập bệnh phẩm ñược thực hiện như sau: *Bệnh phẩm: Phân, nước ngoáy họng của bệnh nhân liệt mềm cấp Não của bệnh nhân chết không quá 6 – 8 giờ Thời gian lấy bệnh phẩm tốt nhất ñối với bệnh nhân còn sống là 1 – 2 tuần sau khi bị nhiễm bệnh, sau ñó gây nhiễm trên tế bào [1], [12]. *Tế bào dùng phân lập virus: Tế bào thận khỉ tiên phát và tế bào HEP2C ñể phân lập virus. Khi gây nhiễm virus phát triển trên tế bào cảm thụ và gây hủy hoại hoàn toàn tế bào trong vài ngày. Biểu hiện: Tế bào co lại, tách khỏi chai nuôi cấy [28], [76]. *ðịnh týp virus phân lập ñược: Sau khi gây nhiễm, cần xác ñịnh xem týp nào gây bệnh, dựa vào kháng thể ñặc hiệu và phương pháp trung hòa kháng nguyên. Virus bại liệt phân lập ñược gồm 3 týp là: TýpI, týp II, týp III, mỗi týp tương ứng với kháng thể ñặc hiệu của týp ñó. Dựa vào kháng thể ñặc hiệu, áp dụng phương pháp trung hòa kháng nguyên, người ta tìm ra virus phân lập ñược là týp nào trong 3 týp bại liệt hoặc không phải là virus bại liệt [12], [69], [81]. Virus bại liệt phân lập ñược có thể là virus bại liệt hoang dại hoặc virus bại liệt 16 văcxin. ðể phục vụ chương trình thanh toán bại liệt, Tổ chức Y tế Thế giới yêu cầu các phòng thí nghiệm xác ñịnh virus phân lập ñược ñể xác ñịnh xem là virus bại liệt hoang dại hay virus bại liệt Sabin, hiện nay phòng thí nghiệm có 2 phương pháp: Phương pháp kháng thể ñơn dòng. Phương pháp sinh học phân tử. Kháng thể ñơn dòng ñược sản xuất từ tế bào lai có nguồn gốc từ tế bào lympho miễn dịch. Kháng thể ñơn dòng nhận biết ñược một kháng nguyên và một axit amin thay ñổi. Kháng thể ñơn dòng týp 1 ñược ñánh số từ 1 – 16, týp 2 từ 21 – 26 và týp III từ 31 – 36. Kháng thể 11, 12, 15 không trung hòa với virus týp 1 hoang dại, kháng thể 24 không tác dụng với virus týp 2 hoang dại, kháng thể 33 và 34 không phản ứng với virus týp III hoang dại [78]. Phương pháp sinh học phân tử còn gọi là phản ứng chuỗi men polymeraza (PCR) do Kary Mullis ñề ra năm 1985 và nhanh chóng ñược áp dụng trong nhiều nghiên cứu y sinh học khác nhau, ñể ño ñộ nhạy và khả năng khuyếch ñại rất lớn của nó [66], [78]. Phương pháp PCR cho phép nghiên cứu vùng vật liệu di truyền VP1 bao gồm 480 bazơ hay thay ñổi và phân biệt ñược virus hoang dại hay virus liên quan ñến văcxin [34], [52]. *Chẩn ñoán phân biệt: Cần có các chuyên gia ñầu ngành về thần kinh. Trên lâm sàng, bệnh bại liệt thường ñược phân biệt với: * Nhiễm các virus ñường ruột không phải là virus bại liệt nhưng có khả năng gây liệt như: virus ECHO và virus Coxsackie. * Liệt giả: Bị viêm dây thần kinh thứ phát do tiêm bắp. * Hội chứng Grullain Barre: Viêm dây thần kinh chấn thương, viêm tủy cắt ngang [27], [28]. * Chấn thương do ngã hoặc tai nạn xe cộ. 2.6. Tiêu chuẩn Việt Nam về phương pháp kiểm tra tính an toàn của văcxin phòng bại liệt Nguyên tắc: Phải kiểm tra tính an toàn ở tất cả các công ñoạn của quy trình sản 17 xuất theo tiêu chuẩn của Tổ Chức Y Tế Thế Giới. Bản chất của văcxin chính là virus và các thành phần ñược tách chiết từ chúng như: ñộc tố Polysaccharides, enzyme, chất ngưng kết hồng cầu (hemaglutinin),.... ñã ñược làm bất hoạt hoặc giảm ñộc lực, nhưng vẫn còn có tác dụng kích thích cơ thể tạo ra kháng thể ñặc hiệu chống lại tác nhân gây bệnh. ðây là thành phần chủ yếu của văcxin ñược gọi là kháng nguyên. Như vậy, văcxin phải ñảm bảo an toàn (nghĩa là không còn gây bệnh và tai biến), ñồng thời phải có hiệu lực (nghĩa là phải có khả năng kích thích cơ thể sản sinh kháng thể thích ứng ñặc hiệu trong huyết thanh và bảo vệ cơ thể không bị mắc bệnh ñó khi bị nhiễm tác nhân. Xuất phát từ yêu cầu ñó, một chế phẩm sinh học sau khi ñược chế tạo ñể sử dụng phòng bệnh cho người cần ñảm bảo an toàn và hiệu lực. Phương pháp ñánh giá tính an toàn và hiệu lực của văcxin: Chủng virus bại liệt: Chủng virus bại liệt dùng trong sản xuất văcxin bại liệt (uống) phải ñược xác minh bởi hồ sơ lý lịch, bao gồm thông tin về nguồn gốc của chủng và các phương pháp sử dụng ñể làm giảm ñộc lực. Chỉ những chủng ñã ñược cơ quan Kiểm ñịnh Quốc gia chấp thuận, mới ñược dùng . Hệ thống giống virus : Sản xuất văcxin phải dựa trên hệ thống giống virus. Giống virus dùng ñể sản xuất văcxin phải là giống dùng ñể chế văcxin gốc hay hệ thống giống virus chế, từ ñó theo phương pháp và ở lần cấy truyền từ chủng gốc virus ñã ñược chấp thuận bởi cơ quan Kiểm ñịnh Quốc gia. Giống virus phải ñược chế từ nuôi tế bào thận khỉ với những ñiều kiện thoả mãn những ñòi hỏi về ñộng vật sạch cần ñể sản xuất văcxin và chế phẩm sinh học. Một lượng lớn giống virus cần ñể riêng ra coi như nguyên liệu cơ bản mà người sản xuất sẽ dùng ñể sản xuất các mẻ văcxin. Tất cả các giống virus phải bảo quản ở nhiệt ñộ dưới – 600C. Khỉ dùng sản xuất văcxin phải ñược kiểm tra và thử nghiệm cẩn thận, phải ñược duyệt bởi Cơ quan Kiểm ðịnh Quốc Gia. Khỉ phải có tình trạng sức khỏe tốt, không ñược dùng cho các thí nghiệm trước ñó. Khỉ phải ñược nuôi trong chuồng ñủ tiêu chuẩn về vệ sinh và an toàn, thông thoáng, cách xa nơi sản xuất. Phải ñược kiểm tra 18 các tiêu chuẩn ñánh giá mức ñộ sạch dành cho sản xuất như: Không có kháng thể kháng virus SV40, không có virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ (SIV), không có kháng thể kháng virus Foamy, không có kháng thể bại liệt và không bị nhiễm vi khuẩn lao . Khỉ ñược nuôi cách ly trong thời gian 6 tuần trước khi sử dụng, chuồng nuôi phải ñảm bảo luôn luôn sạch sẽ chống lây nhiễm. Kiểm tra nuôi cấy tế bào sử dụng cho sản xuất văcxin: Vào ngày gây nhiễm virus, mỗi loại tế bào nuôi cấy nên ñược kiểm tra về sự hủy hoại gây nên bởi một tác nhân ngoại lai nào thì toàn bộ mẻ nuôi cấy ñó không ñược dùng ñể sản xuất văcxin. Mẫu nước nổi của nuôi cấy tế bào phải ñược kiểm tra trên nuôi cấy thận khỉ cùng loài, nhưng không phải cùng một con khỉ ñó (kiểm tra trên tế bào cùng loài khác). 2.7. Văcxin phòng bệnh bại liệt Văcxin, dù ở bất kỳ dạng tồn tại nào, cho dù ñó là văcxin nguyên thể, tức là văcxin chứa nguyên vẹn cả tế bào vi sinh vật, hay văcxin phân tử, tức là văcxin ñơn thuần chỉ chứa những thành phần protein có tính kích thích miễn dịch, ñều mang một chức năng chung là tạo miễn dịch cho cơ thể người và ñộng vật, phòng chống lại các bệnh truyền nhiễm và nhiều tác nhân gây hại khác. Nói ñến văcxin, phải nói ñến yếu tố quyết ñịnh tính miễn dịch của chế phẩm ñược chọn làm văcxin ñó. Yếu tố quyết ñịnh tính miễn dịch chính là thành phần protein ñặc biệt có trên bề mặt của tác nhân gây bệnh, hay trên bề mặt của chế phẩm văcxin của chính tác nhân gây bệnh ñó [11]. Thành phần ñặc biệt có bản chất là protein này ñược gọi là kháng nguyên (Antigene), do một gene hay một số gene của vi sinh vật quyết ñịnh tổng hợp nên. Những gene chịu trách nhiệm về việc sản xuất thành phần protein có tính kích thích miễn dịch ñược gọi là gene kháng nguyên. Gen kháng nguyên này, về nguyên tắc, có thể ñược tách ra, và ghép vào một hệ thống vector thích ứng nào ñó, sử dụng ñể biểu thị sản xuất protein của gene kháng nguyên ñó ñể làm văcxin. Tất cả phải ñược 19 lựa chọn phù hợp, mới có thể thu ñược protein có tính kích thích miễn dịch mong muốn ban ñầu như protein nguyên gốc. Protein tái tổ hợp ñược sản xuất ra, nhiều khi vẫn có thể có tính kháng nguyên và miễn dịch, nhưng không còn là văcxin chống lại tác nhân gây bệnh cần phòng trừ. Những văcxin ñược tạo ra bằng kỹ thuật gene như thế này (nghĩa là chịu sự thao tác trực tiếp về gene), ñược gọi là văcxin tái tổ hợp gene, hay vắn tắt là văcxin công nghệ gene. Thành phẩm văcxin thuộc loại này ñược coi là văcxin thế hệ mới. Những văcxin thuộc thế hệ cũ, là các loại văcxin tạo ra bằng các phương pháp cổ ñiển (truyền thống). ðể ñược là văcxin, thành phẩm ñã bị biến ñổi về bản chất (và cả về gene) nhưng không chịu sự thao tác trực tiếp. Dù thế nào chăng nữa, văcxin cổ ñiển hay văcxin thế hệ mới, nếu ñược ñịnh nghĩa về góc ñộ miễn dịch thì văcxin phải là các chế phẩm sinh học của vi sinh vật hay tế bào, chứa chính tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng (kể cả vật liệu di truyền), nếu ñược làm giảm ñộc lực hay vô ñộc bằng các phương pháp lý, hóa, hay sinh học (ñối với văcxin cổ ñiển), hoặc các phương pháp sinh học phân tử (ñối với văcxin thế hệ mới), lúc ñó chúng không còn khả năng gây bệnh ñối với ñối tượng ñược hưởng văcxin, nhưng khi ñưa vào cơ thể bằng các phương pháp khác nhau, ñều có khả năng kích thích cơ thể sinh miễn dịch thuộc các loại hình như miễn dịch dịch thể (humoral immunity) hay miễn dịch qua trung gian tế bào (cellular-mediated immunity). Như vậy nói ñến văcxin, là phải nói ñến khả năng gây miễn dịch. Một thành phẩm nào ñó tuy là chế phẩm sinh học nhưng không gây miễn dịch bảo vệ cơ thể như mong muốn thì không ñược coi là văcxin [11], [12]. *ðiều kiện cần của một văcxin : Một văcxin phải có ñủ 2 ñiều kiện chính: An toàn và có hiệu lực. An toàn: Là tiêu chuẩn ñánh giá khi sử dụng văcxin trên chính ñối tượng ñược hưởng, tức là văcxin không ñược gây bệnh và không ñược chứa các tác nhân ngoại lai. Hiệu lực: ðiều quan trọng nhất là văcxin phải có hiệu lực, tức là văcxin phải kích thích sinh miễn dịch cho cơ thể. Tính hiệu lực thực chất là mức ñộ biểu hiện gây miễn dịch của kháng nguyên. Văcxin có hiệu lực cao hay thấp, tức là nói ñến mức 20 ñộ gây miễn dịch của văcxin ñó. Văcxin sống giảm ñộc lực Một vài văcxin sống ñã ñáp ứng về cơ bản những tiêu chuẩn cho một văcxin lý tưởng. ðó là: Có khả năng tạo ra một sự bảo vệ suốt ñời với một phản ứng tối thiểu ở gần như toàn thể những người ñã nhận một hoặc hai liều văcxin. những văcxin loại này chứa các vi sinh vật, thường là các virus, chúng gây nhiễm các tế bào và nhân lên ở túc chủ, giống như sự nhân lên của vi sinh vật hoang dại gây ra nhiễm trùng tự nhiên. Như vậy vi sinh vật có trong văcxin sẽ gây ra một ñáp ứng miễn dịch của cơ thể giống như ñáp ứng với vi sinh vật hoang dại. Văcxin sống ñã ñược giảm ñộc lực, tức là khả năng gây bệnh của vi sinh vật hầu như ñược loại bỏ bằng các thủ thuật sinh học hay kỹ thuật. Các văcxin sống thường tạo ra cả hai loại miễn dịch: Miễn dịch dịch thể (Kháng thể) và miễn dịch tế bào (Tế bào lym pho T). Ở Việt Nam hiện ñã và ñang sản xuất, sử dung văcxin cổ ñiển.Văcxin sống giảm ñộc lực, còn ñược gọi là văcxin Sabin ñược sản xuất trên tế bào thận khỉ tiên phát hoặc tế bào thận khỉ thứ phát (Vero). Chủng của 3 týp dùng ñể sản xuất văcxin Sabin ñược nhận từ chủng giảm ñộc do Sabin cấy truyền và cải tạo từ chủng virus hoang dại. ðây là văcxin sử dụng rộng rãi trong chiến lược thanh toán bại liệt [23], [30], [34], [36], [38], [44]. Một số yếu tố trong sản xuất ảnh hưởng ñến chất lượng văcxin Có 3 dòng tế bào ñược sử dụng ñể sản xuất OPV hiện nay [10], [81], [89], ñó là: Tế bào thận khỉ tiên phát, Tế bào lưỡng bội người (MRC-5 hay W38) và Tế bào thường trực Vero. Các yếu tố chủ yếu của quá trình sản xuất ảnh hưởng ñến chất lượng văcxin là nhiệt ñộ nuôi cấy virus và thời gian nuôi cấy virus. Tế bào ñã gây nhiễm virus ñược nuôi cấy tại một nhiệt ñộ nhất ñịnh trong khoảng từ 330C – 340C và virus ñược gặt trong khoảng thời gian không quá 96 giờ sau khi gây nhiễm [10], [88], [99]. Một số yếu tố quan trọng khác trong quá trình sản xuất là ñộ kín của lớp tế bào, tuổi của tế bào tại thời ñiểm gây nhiễm. Tỷ lệ gây nhiễm virus, thành phần và pH của môi trường nuôi cấy virus [12], [88], [99]. Virus văcxin thu ñược từ tế 21 bào thận khỉ tiên phát hoặc tế bào người, ñược lọc ñể loại bỏ xác tế bào. Virus văcxin thu ñược từ tế bào Vero cần phải tiến hành bổ sung các công ñoạn tinh chế ñể loại bỏ các thành phần không cần thiết của tế bào [12], [75], [85]. Thông thường một số mẻ gặt ñơn của cùng một týp virus ñược trộn lại thành một loại văcxin bán thành phẩm. Tính bền vững của văcxin bại liệt sống uống giảm ñộc lực Văcxin Bại liệt sống giảm ñộc lực ( Oral Polio vaccine - OPV) OPV ñã ñược sử dụng rộng rãi vì rất dễ sử dụng và giá thành rẻ. OPV không chỉ tạo kháng thể trong huyết thanh mà còn tạo ra kháng thể tại chỗ ở ruột và nó tạo ra kháng thể bền vững giống như bị nhiễm virus trong tự nhiên. Tổ Chức Y Tế Thế Giới ñã dùng OPV cho chương trình tiêm chủng mở rộng trên toàn Thế giới. Khoảng trên 80% trẻ em dưới 1 tuổi trên Thế giới ñã ñược gây miễn dịch cơ bản bằng OPV và virus bại liệt hoang dại ñã không còn có thể hoành hành gây ñại dich ñược. Sự ñáp ứng kháng thể của trẻ sơ sinh thấp hơn so với những trẻ lớn hơn. Khoảng 70% số trẻ sơ sinh có ñáp ứng miễn dịch tại chỗ trong ống ruột và 30% ñến 50% trẻ sơ sinh tạo ñược kháng thể trong máu ñối với 1 hoặc 3 týp. Nhưng những trẻ này sẽ tạo ñược miễn dịch ñầy ñủ trong những lần tiêm chủng tiếp theo. 2.8. Nghiên cứu sản xuất kháng thể bại liệt ðể chủ ñộng nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước và hạ giá thành của sản phẩm là một trong những hướng phát triển mà các cơ sở nghiên cứu và sản xuất văcxin cần nhắm tới. Qua thực tế sản xuất văcxin bại liệt, việc xét nghiệm phân lập virus ñể chẩn ñoán xác ñịnh là rất cần thiết vì: ða số trẻ em nhiễm virus bại liệt không có biểu hiện lâm sàng, 5% có biểu hiện giống cảm cúm, bệnh nhi thường bị ñau ở các chi sắp bị liệt và xuất hiện liệt mềm trong những ngày cuối của tuần ñầu tiên. Trong một số trường hợp có thể liệt cơ hô hấp gây suy hô hấp và tử vong, còn những trường hợp qua khỏi ñể lại di chứng liệt suốt ñời. ðể việc chẩn ñoán xác ñịnh bệnh bại liệt thuận lợi, thì việc nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh là việc làm cần 22 thiết, các nghiên cứu sản xuất trên sẽ góp phần vào việc: Chẩn ñoán nhanh chính xác bệnh ñể can thiệp sớm, việc nghiên cứu trong phòng thí nghiệm sẽ có nhiều thuận lợi ñể thử nghiệm trung hòa ñộc tố, ñào thải chúng ra ngoài. Kháng huyết thanh có nguồn gốc ñộng vật, từ huyết thanh có kháng thể chống bệnh. Các huyết thanh này chứa rất nhiều kháng thể và gây ñược miễn dịch thụ ñộng cho người dùng sau vài giờ, nhưng thời gian ñược miễn dịch ngắn khoảng 8 – 15 ngày sau khi tiêm. Kháng huyết thanh là một sinh phẩm chứa các globuline miễn dịch ñặc hiệu thu ñược bằng phương pháp tinh chế huyết thanh thô, có xử lý với enzyme và kết tủa phân ñoạn trong muối ammonium sulfate cô ñặc bằng TFF và tẩy màu bằng acid Caprylic. Chế phẩm ñược bảo quản bằng Merthiolate 1/10.000. 23 3. ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ðể thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu sản xuất kháng thể bại liệt trên thỏ và ñánh giá tính an toàn của văcxin bại liệt trong phòng thí nghiệm”, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các ñối tượng là: Virus bại liệt chuẩn ñể sản xuất Văcxin do Viện Kitasato Nhật Bản cung cấp. Văcxin bại liệt ñơn týp và văcxin bại liệt tam liên (có cả 3 týp I, II, III). ðộng vật thí nghiệm (Khỉ tách tế bào, thỏ và chuột tiêm thử nghiệm,…). Tế bào, môi trường và dụng cụ nuôi tế bào. 3.2. ðỊA ðIỂM Phòng Kiểm ñịnh TTNCSX văcxin và Sinh phẩm Y tế (135 Lò ñúc và 418 Vĩnh Hưng- Hà Nội). Trại chăn nuôi khỉ ðảo Rều - Quảng Ninh. 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.3.1. Nghiên cứu sản xuất kháng thể bại liệt trên thỏ 3.3.1.1. Sản xuất kháng nguyên bại liệt. 3.3.1.2. Tạo kháng thể bại liệt trên thỏ. 3.3.1.3. Thu, xử lý và bảo quản huyết thanh thỏ. 3.3.2. Xác ñịnh tính an toàn của văcxin bại liệt trong phòng thí nghiệm 3.3.2.1. Kiểm tra nguyên liệu ñầu (khỉ) dùng cho sản xuất tế bào. 3.3.2.2. Kiểm tra tế bào dùng trong sản xuất văcxin 3.3.2.3. Kiểm tra an toàn văcxin bán thành phẩm 3.3.2.4. Kiểm tra 5 loạt văcxin tam liên sản xuất năm 2007 24 3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hiện nay, chúng tôi nghiên cứu sản xuất kháng thể bại liệt trên thỏ, dựa theo quy trình sản xuất văcxin bại liệt sống uống tại Trung tâm nghiên cứu sản xuất văcxin và Sinh phẩm y tế. Quy trình ñang nghiên cứu và thực hiện có tham khảo tài liệu của nước ngoài. 3.4.1. Sản xuất kháng thể bại liệt 3.4.1.1. Phương pháp sản xuất kháng nguyên bại liệt Chủng giống tế bào ñược Viện nghiên cứu bại liệt Nhật Bản cung cấp, nuôi cấy trên tế bào thận khỉ sạch (chưa sử dụng cho các thử nghiệm nào, không nhiễm các loại virus do WHO ñề ra) a) Nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát trên chai roux 225 cm2 * Nuôi tế bào trên chai 225 cm2 - Ly tâm hỗn dịch tế bào ở 1500 vòng/ phút trong 5 phút, chắt bỏ nước nổi. - Lấy 30ml môi trường ñã pha ở trên cho từ từ vào tuýp ñể ñánh tan tế bào. - Hút toàn bộ lượng hỗn dịch tế bào ñã ñánh tan vào chai môi trường ñã pha, trộn ñều và chia vào chai 225 cm2, mỗi chai 120ml. - ðậy chặt nút lắc ñều . - Nuôi ở nhiệt ñộ 370C. b) Tinh sạch kháng nguyên và pha kháng nguyên - Hộn các loạt kháng nguyên ñã sản xuất. - Ly tâm 4.000 vòng/40 phút ở 40C. - Lọc qua : 0,2 µm/0,45µm/0,8 µm. - Siêu lọc. - Siêu ly tâm 36.000 vòng/4 giờ/60C. - Siêu ly tâm 15.000 vòng 30 phút/60C. - Lọc qua 0,2 µm → cho vào ampul bảo quản ở - 800C - Pha kháng nguyên 106CCID/0,1ml 25 3.4.1.2. Tạo kháng thể bại liệt trên thỏ a) Chọn lọc thỏ Chọn những thỏ khoẻ mạnh, chưa sử dụng cho các thử nghiệm nào. Trọng lượng thỏ phải ñạt từ 1,8 kg ñến 2,2 kg. Thỏ ñược nuôi cách ly và theo dõi trong vòng 1 tuần về tình trạng sức khoẻ, vận ñộng, trọng lượng,…. Sau ñó mới chọn thỏ có tăng trọng bình thường (Tăng cân ñều, không nhanh quá hoặc quá chậm) ñể tiêm gây ñáp ứng miễn dịch. Hình 6. Chọn thỏ Hình 7. Nuôi nhốt cách ly mỗi con một lồng b) Phương pháp tiêm thỏ Có 2 phương pháp tiêm thỏ bao gồm: Phương pháp tiêm dưới da và tiêm bắp ñùi. * Phương pháp tiêm dưới da: - Thỏ ñủ tiêu chuẩn cho sử dụng tiêm kháng nguyên gây ñáp ứng miễn dịch cần tiêm trong da thỏ với các liều lượng tuỳ chọn. - Quy trình tiêm thỏ kéo dài trong 4 tuần gồm 3 mũi tiêm theo sơ ñồ dưới ñây: Nhập thỏ Gây nhiễm (M1) Gây nhiễm (M2) Gây nhiễm (M3) Lấy máu kiểm tra kháng thể bại liệt trước khi tiêm sau thời gian nuôi cách ly 1 tuần 1 tuần 2 tuần 1 tuần 26 + Tiêm mũi 1: vào ngày thứ 1 sau 1 tuần nuôi cách ly. Tiêm trong da 0,5 ml kháng nguyên + 0,5 ml tá dược toàn phần (FCA/thỏ) Hình 8. Thỏ trước khi tiêm Hình 9. Thỏ khi tiêm + Tiêm mũi 2: vào ngày thứ 14 Sau tiêm mũi 1 là 14 ngày, tiêm trong da 0,5 ml KN + 0,5 ml tá dược không toàn phần (FIA/thỏ) Hình 10. Thỏ sau khi tiêm Hình 11. Vết sẹo tiêm trong da Thỏ sau 2 tuần + Tiêm mũi 3: vào ngày thứ 21 Sau tiêm mũi 2 là 7 ngày, tiêm trong da 0,5 ml KN + 0,5 ml tá dược không toàn phần (FIA/thỏ) 27 * Phương pháp tiêm bắp ñùi: Phương pháp này về cơ bản giống phương pháp trên, song, vị trí tiêm dưới bắp ñùi và tỷ lệ liều lượng tiêm là 2,5 ml kháng nguyên + 2,5 ml tá dược. c) Thu huyết thanh thỏ Lấy máu, sau ñó chắt huyết thanh ñể kiểm tra ñáp ứng miễn dịch: Mo M1 M2 M3 M4 M5 Lấy máu từ mũi 1 ñến mũi 4 lần lượt theo các ngày thứ : 1 → 21 → 28 → 38 → 55 → 66 ngày sau khi tiêm kháng nguyên. Hình 12. Chuẩn bị lấy máu Hình 13. Vị trí lấy máu ðến ngày thứ 66 (sau tiêm mũi 3 là 38 ngày), lấy toàn bộ máu thỏ vào chai dẹt ñể ở nhiệt ñộ phòng 4 tiếng. Chắt huyết thanh lần 1 bảo quản 40C qua ñêm, sau ñó, chắt toàn bộ huyết thanh rồi ly tâm 3000rpm/20 phút. Bảo quản bằng cách cho vào týp nhựa 50 ml ở ( -300C). Hình 14. Lấy máu từ mũi 0 ñến mũi 4 Hình 15. Lấy máu toàn bộ (mũi 5) 2 tuần 1 tuần 10 ngày 17 ngày 11 ngày 28 e) Xử lý huyết thanh thỏ và bảo quản huyết thanh bại liệt - Ly tâm huyết thanh 3000 vòng/ 7 phút. Chắt phần huyết thanh phía trên. - Chứa huyết thanh trong týp nhựa 50 ml. Bảo quản huyết thanh vào tủ lạnh – 200C f) Xác ñịnh hiệu giá kháng thể bại liệt Các bước tiến hành Chuẩn bị mẫu Mỗi mẫu pha loãng 8 nồng ñộ : từ 10-1 → 10-2 cần 8 lọ pha loãng mẫu / 1 mẫu. Tiến hành pha loãng bậc 10, quá trình pha loãng theo sơ ñồ sau : 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8 Mẫu 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 ml MT 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 ml - MT : môi trường duy trì 2% BS (MEM 2% Bovin serum) - Nhỏ mẫu ñã pha loãng vào phiến 96 giếng. Nhỏ 100 µl/ giếng, mỗi nồng ñộ nhỏ 8 giếng (theo chiều dọc từ hàng A → hàng H theo sơ ñồ phiến). - Mỗi mẫu nhỏ 4 nồng ñộ từ 10 -5 → 10 -8 Nhỏ tế bào - Tế bào HEP2C ñược tách thành hỗn dịch tế bào - Pha hỗn dịch về nồng ñộ 105 tế bào / 1 ml. - Pha hỗn dịch tế bào bằng MEM 2% Bovin serum. - Nhỏ 100 µl hỗn dịch tế bào/ giếng và nhỏ vào tất cả các giếng. 29 - Dán kín phiến bằng băng dính. - Thao tác ñược tiến hành trong Hood vô trùng. - Nuôi ở 360C / 7 ngày. ðọc kết quả - Soi kính hiển vi tìm ñám huỷ hoại tế bào do virut vắc xin Bại liệt (CPE) - Giếng có hiện tượng tế bào co tròn có sự huỷ hoại: (+) Tính hiệu giá Kết quả ñược tính theo công thức Karber:       +−= 5,0log 50 N SDLCCID Trong ñó: - L là log của nồng ñộ pha loãng cao nhất có 100% có số giếng huỷ hoại. - D là sự chênh lệch log giữa các nồng ñộ pha loãng mẫu, ở ñây do pha loãng bậc 10 nên D = 1. - S là tổng số giếng huỷ hoại ở nồng ñộ pha loãng trong ñó không có 100% số giếng huỷ hoại. - N là số giếng gây nhiễm cho mỗi nồng ñộ pha loãng. Nhận ñịnh kết quả - Mỗi mẫu phải làm lặp lại 3 lần và tính hiệu giá trung bình. - Hiệu giá giữa các lần thực hiện cho phép dao ñộng 0,5 log10. - Mẫu KHT ñơn týp ñược chấp nhận khi hiệu giá pha loãng nhất có sự trung hoà giữa KN và KT 3.4.2. Xác ñịnh tính an toàn của vắc xin bại liệt trong phòng thí nghiệm 3.4.2.1. Phương pháp kiểm tra nguyên liệu ñầu vào – Khỉ dùng cho sản xuất tế bào a) Lấy máu khỉ: Lấy máu khỉ ở vị trí tĩnh mạch cẳng chân phải: 30 Chắt huyết thanh: - Ly tâm huyết thanh 3000 vòng/ 7 phút. Chắt phần huyết thanh phía trên. - Chứa huyết thanh trong eppendoft. - Huyết thanh sau khi chắt, bảo quản ở -200C và ñược chuyển về phòng thí nghiệm tại Hà Nội sẽ ñược sử dụng cho các thử nghiệm kiểm tra SIV, kháng thể Polio, Foamy, SV40 và Lao. - Kiểm tra các lô huyết thanh của khỉ theo số thứ tự, số thử nghiệm ñể chọn ra những khỉ sạch (âm tính) với các tiêu chí ñã ñề ra ñể ñưa vào sản xuất văcxin. b) Kiểm tra Lao trong huyết thanh khỉ bằng phương pháp tiêm Tuberculine dưới da: Tiến hành: - Tiêm 0,1 ml Tuberculin: cẳng tay trái. - Tiêm 0,1 ml NaCl 0,9%: cẳng tay phải. - Yêu cầu nốt tiêm phải nổi lên như hạt ngô. ðọc kết quả sau 72 giờ Nhận ñịnh kết quả: - Quan sát nốt tiêm: Tại vị trí tiêm nước muối sinh lý và vị trí tiêm Tuberculin có hay không có vết sẩn. - Phản ứng Tuber culin (-) khi: không có vết sẩn như nốt tiêm nước muối sinh lý. Hoặc nếu có thì ñường kính vết sẩn <10 mm. c) Phát hiện kháng thể Polio trong huyết thanh khỉ: - Bất hoạt huyết thanh khỉ ñã pha loãng 4 lần bằng NaCl 0,9% ở 560C / 30 phút bằng bể ñiều nhiệt. - Pha loãng bậc 10 virut Sabin chuẩn typ I, II và III (kháng nguyên typ I, II và III) ñể ñược nồng ñộ sử dụng là 1000 CCID50/0,1ml • Nhỏ kháng nguyên - Nhỏ kháng nguyên týp I : 0,05 ml / giếng : A1 - A12 ; B1 - B12 và H1 - H3 - Nhỏ kháng nguyên týp II : 0,05 ml / giếng : C1 - C12 ; D1 - D12 và H4 - H6 31 - Nhỏ kháng nguyên týp III : 0,05 ml / giếng : E1 - E12 ; F1 - F12 và H7 - H9 • Nhỏ huyết thanh khỉ (1 phiến nhỏ ñược 12 mẫu) - Nhỏ 0,05 ml / giếng × 7 giếng / 1 mẫu - Nhỏ dọc theo cột : 1A - 1G (mẫu 1) ; 2A - 2G (mẫu 2) ... • Nhỏ môi trường MEM 2% FBS - Nhỏ môi trường : 0,05 ml / giếng : G1 - G12 và H1 - H9 - Nhỏ môi trường : 0,1 ml / giếng : H10 - H12 - Ủ 370C / 3 giờ • Nhỏ tế bào - Sử dụng hỗn dịch tế bào 100.000 tế bào / 1 ml - Nhỏ 0,1ml hỗn dịch tế bào trên cho tất cả các giếng. - Ủ ở 360C / 7 ngày ðọc và nhận ñịnh kết quả: - Mẫu dương tính týp I : (có kháng huyết thanh bại liệt týp I) + Tại các giếng hàng A và B (nhỏ kháng nguyên týp I) + Có 2 giếng trên tổng số 2 giếng gây nhiễm týp tế bào vẫn phát triển bình thường. - Mẫu dương tính týp II : (có kháng huyết thanh bại liệt týp II) + Tại các giếng hàng C và D (nhỏ kháng nguyên týp II) + Có 2 giếng trên tổng số 2 giếng gây nhiễm týp tế bào vẫn phát triển bình thường. - Mẫu dương tính týp III : (có kháng huyết thanh bại liệt týp III) + Tại các giếng hàng E và F (nhỏ kháng nguyên týp III) + Có 2 giếng trên tổng số 2 giếng gây nhiễm týp tế bào vẫn phát triển bình thường. d) Phát hiện kháng thể SV40 trong huyết thanh khỉ bằng phương pháp trung hoà tế bào: Tiến hành: - Bất hoạt HTK (ñã pha loãng 4 lần bằng NaCl 0,9%) ở 560C/ 30 phút. - Kháng nguyên SV40 pha loãng 1000 TCID50 trong 0,1ml. - Lấy 0,4ml kháng nguyên SV40 ñã pha loãng + 0,4ml HTK 1/4 ñã bất hoạt rồi trộn ñều. Ủ ở 360C trong 2 giờ. 32 - Tế bào JVKT (ñã nuôi kín một lớp trên phiến 24 giếng) rửa 3 lần bằng PBS (-) trước khi sử dụng. - Gây nhiễm sản phẩm của bước 6 = 0,2ml trong một giếng. Mỗi mẫu gây nhiễm vào 2 giếng tế bào. - Hấp phụ ở 370C trong 30 phút. - Cho thêm 0,8ml môi trường Parker 2% FBS vào mẫu. - ðặt ở tủ ấm 370C nuôi trong 7 ngày, sau ñó ñọc kết quả trên kính hiển vi lật ngược. ðọc kết quả và nhận ñịnh kết quả: Chứng kháng nguyên: Tế bào có hiện tượng hủy hoại. Mẫu chứng KHT (-): Tế bào có hiện tượng hủy hoại. Mẫu chứng KHT (+): Tế bào một lớp, không có hiện tương hủy hoại. Mẫu âm tính: Tế bào có hình ảnh hủy hoại giống chứng KHT(-). Mẫu dương tính: Tế bào không bị hủy hoại giống chứng KHT(+). e) Phát hiện kháng thể virus tạo bọt Foamy trong huyết thanh khỉ bằng phương pháp huỳnh quang: Tiến hành: - Pha loãng mẫu huyết thanh khỉ 1/30 bằng PBS. Trộn ñều. - Nhỏ 15 µl mỗi mẫu vào mỗi giếng của bộ sinh phẩm (lamen). 15 µl huyết thanh chứng âm và chứng dương vào giếng chứng âm và chứng dương. - ðặt lamen vào giá cài và cho vào bể thuỷ tinh có chứa PBS (-) ñể rửa bằng máy khuấy từ có nam châm. Rửa 10 phút. Thực hiện 3 lần. - Pha loãng FITC 1/80 bằng PBS (-) - Nhỏ 15 µl FITC vào mỗi giếng. Ủ ở 370C/30 phút - ðặt lamen vào giá cài và cho vào bể thuỷ tinh có chứa PBS (-) ñể rửa bằng máy khuấy từ có nam châm. Rửa 10 phút. Thực hiện 3 lần. - Nhỏ dung dịch glycerin lên các giếng. ðọc kết quả và nhận ñịnh kết quả: ðọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang. - Chứng dương : Bắt ánh sáng huỳnh quang (mầu xanh) ở viền tế bào 33 - Chứng âm : Không bắt ánh sáng huỳnh quang ở viền tế bào - Mẫu dương tính: Có hình ảnh giống với giếng chứng (+) . d) Phát hiện kháng thể virus gây suy giảm miễn dịch SIV trong huyết thanh khỉ bằng phương pháp huỳnh quang: Tiến hành: - Cho 75µl dung dịch B vào giếng #1 của phiến 96 giếng, 25µl dung dịch B vào các giếng #2 và #3. - Thêm 25µl huyết thanh mẫu vào giếng #1, trộn bằng cách hút lên xuống 5 – 6 lần. Chuyển 25µl từ giếng #1 - giếng #2. Trộn (giống mô tả trộn ở giếng #1), chuyển 25µl từ giếng #2 - giếng #3, loại bỏ 25µl ở giếng #3 sau khi trộn. - Nhỏ 25µl dung dịch D (sau khi ñã hồi chỉnh) vào tất cả các giếng #2. Nhỏ 25µl dung dịch C (sau khi ñã hồi chỉnh) vào tất cả các giếng #3. - Vỗ nhẹ vào các góc phiến nhẹ nhàng 5 - 6 lần, ủ ở nhiệt ñộ phòng (15 - 300C) / 120 phút. ðọc kết quả: Quan sát hiện tượng ngưng kết bằng mắt thường, dựa vào các tiêu chí ñánh giá như bảng duới ñây : Bảng tiêu chí ñánh giá và nhận ñịnh kết quả Tiêu chuẩn xác ñịnh hiện tượng ngưng kết ðọc Kết luận Các hạt lắng xuống ñáy giếng, viền xung quanh lắng cặn nhẵn, gọn (-) âm tính Các._.ểm tra, chúng tôi ñánh giá toàn bộ các loạt tế bào trên ñều ñạt tiêu chuẩn của WHO ñề ra. Kết quả ở bảng 4 cho ta thấy: Trong các mẫu nước nổi không có các tác nhân ngoại lai như; Vi khuẩn, nấm và các virus gây huỷ hoại tế bào thận khỉ tiên phát, tế bào thận thỏ tiên phát, tế bào thận khỉ xanh châu phi (Vero) và tế bào ung thư thanh 80 quản người (HEP2C). Theo tiêu chuẩn của WHO và áp dụng vào bảng 4 kết quả ở trên ta thấy: Tất cả các mẫu trên ñều ñạt tiêu chuẩn về kiểm tra tác nhân ngoại lai trong nuôi cấy tế bào. Bảng 7 cho kết quả hiệu giá týp 1 bảo quản tại nhiệt ñộ quy ñịnh -200C, nhiệt ñộ kiểm tra tính ổn ñịnh của văcxin tam liên tại 370C trong 48h và sự chênh lệch hiệu giá giữa 2 nhiệt ñộ. Tại nhiệt ñộ -200C, văcxin bại liệt týp 1 có hiệu giá cao nhất là 6,30 lgCCID50/0,1ml và thấp nhất là 6,05 lgCCID50/0,1ml. Văcxin bại liệt týp 1 sau thời gian giữ tại 370C trong 48h, hiệu giá giảm và mức ñộ giảm dao ñộng từ 0,12 ñến 0,38 lgCCID50/0,1ml (Yêu cầu hiệu giá không ñược giảm hơn 0,5 Lg). Bảng 8 cho ta thấy kết quả của 6 loạt Văcxin tam liên sản xuất năm 2007, hiệu giá văcxin týp 2 dao ñộng trong khoảng từ : 5,24 → 5.42 lgCCID50/0,1ml khi ta bảo quản Văcxin tại nhiệt ñộ quy ñịnh -200C. Hiệu giá tương ứng tại nhiệt ñộ 370C/48h thấp hơn với hiệu giá dao ñộng trong khoảng 4,80 → 5,24 lgCCID50/0,1ml. ðộ chênh lệch giữa 2 nhiệt ñộ trên trong khoảng từ 0.18 → 0,44 lgCCID50/0,1ml (Yêu cầu của WHO hiệu giá không ñược giảm hơn 0,5 Lg). Bảng 9 cho ta thấy tại nhiệt ñộ chuẩn quy ñịnh là -200C, hiệu giá văcxin dao ñộng trong khoảng từ 5,49 ñến 5,74 lgCCID50/0,1ml. Hiệu giá Văcxin tại nhiệt ñộ 370C/48h dao ñộng trong khoảng từ 5,30 ñến 5,42 lgCCID50/0,1ml và ñộ chênh lệch hiệu giá giữa 2 loại nhiệt ñộ này từ 0,07 ñến 0,38 lgCCID50/0,1ml. Theo Tổ Chức Y Tế Thế Giới, hiệu giá văcxin từng týp trong văcxin thành phẩm tương ứng với týp I, II, III là 106,0, 105,0, 105,5(Word health Organization. Requirements for Poliomyelitis vaccine (oral). Tech. Rep. Ser. 1990.No.800, Annex 1.pp 31- 65). Với tiêu chuẩn này văcxin bại liệt sản xuất năm 2007 của Trung tâm Nghiên cứu, Sản xuất Văcxin và Sinh phẩm Y tế ñạt tiêu chuẩn Quốc tế. Virus văcxin bại liệt cũng như các loại virus khác ñều không ổn ñịnh với nhiệt. MgCL2 giúp văcxin ổn ñịnh nhiệt trong ñiều kiện nhiệt ñộ lên tới 370C. Theo Tổ Chức Y Tế Thế Giới, văcxin ñạt tiêu chuẩn quốc tế khi hiệu giá tại 370C/48h thấp hơn không quá 0,5 lgCCID50/0,1ml so với hiệu giá khi bảo quản tại ñiều kiện -200C [Nhiệt ñộ với hiệu giá văcxin Sabin sản xuất tại Việt Nam 1994, Tạp chí vệ sinh phòng dịch 81 tập V- số 4 [23,172,176- 1994] ; Ảnh hưởng của nhiệt ñộ với hiệu giá của văcxin phòng bệnh bại liệt sản xuất tại Việt Nam, tạp chí vệ sinh phòng dịch tập VII- số 1 [31,22,25- 1997] ; Tính ổn ñịnh của vacxin bại liệt sản xuất tại Việt Nam từ 2000- 2002, tạp chí y học thực hành- số 5 [452,20,21- 2003] ; Word health Organization. Requiments for Poliomyelitis vaccine(oral). Tech. Rep. Ser. 1990.No.800, Annex 1.pp 31- 65]. Với kết quả trên, cả 3 týp trong 5 loạt văcxin thành phẩm sản xuất năm 2007 ñạt tiêu chuẩn Tổ chức Y tế Thế giới về tính ổn ñịnh nhiệt (Word health Organization. Requirements for Poliomyelitis vaccine (oral). Tech. Rep. Ser. 1990.No.800, Annex 1.pp 31- 65). ðánh giá: - Hiệu giá týp I của 5 loạt ñều ≥ 106,0 CCID50/0,1ml và hiệu giá chênh lệch giữa 2 nhiệt ñộ ñều < 0,5 lg CCID50/0,1ml - Hiệu giá týp II của 5 loạt ñều ≥ 105,0 CCID50/0,1ml và hiệu giá chênh lệch giữa 2 nhiệt ñộ ñều < 0,5 lg CCID50/0,1ml - Hiệu giá týp III của 5 loạt ñều ≥ 105,5 CCID50/0,1ml và hiệu giá chênh lệch giữa 2 nhiệt ñộ ñều < 0,5 lg CCID50/0,1ml. Như vậy, Trung Tâm Nghiên cứu sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế ñã thực hiện nghiêm túc hướng dẫn của WHO và Trung Tâm Kiểm ñịnh Quốc gia về an toàn sản xuất vắc xin bại liệt sống uống từ chủng Sabin. 4.3.3. Hiệu giá kháng huyết thanh 4.3.3.1. Hiệu giá kháng huyết thanh lần thử nghiệm thứ 1 Kết quả kiểm tra kháng thể Bại liệt của thỏ trước khi tiêm mũi 1 nhằm ñảm bảo thỏ trước khi tiêm không có kháng thể bại liệt sẵn. Theo kết quả ở các bảng trên, Mo tất cả 7 thỏ ñều có hiệu giá kháng thể ≤2log2 với cả 3 týp I, II và III , ñủ tiêu chuẩn ñể tạo ñáp ứng miễn dịch. ðáp ứng miễn dịch của huyết thanh ñối với týp I của M1, M2, M3 có hiệu giá KHT từ 8log2, nhưng ñến M4, M5 lại có hiệu giá KHT thấp hơn trong khoảng ≤2log2 ñến 5log2 (ñồ thị vẽ theo log 2 CCID 50/0,1ml với P<0,05). Gây miễn dịch với týp II nhưng bản thân chúng sản sinh kháng thể chéo vì nó là một phần của kháng nguyên chung. 82 ðáp ứng miễn dịch của huyết thanh ñối với týp II của : M1, M2, M3 có hiệu giá KHT cao lên ñến 13log2(tương ứng với mức 13 ở ñồ thị) . M4 có hiệu giá KHT thấp hơn trong khoảng từ 6log2 ñến 12log2 . M5 có hiệu giá KHT tăng lên gần giống M1, M2, M3 là 13log2. Như vậy KHT ở mũi thứ 5 (ngày thứ 66 sau khi gây nhiếm mũi 1) có hiệu giá KHT ở mức cao và ổn ñịnh, khi 2 týp I và III thấp từ ≤2log2 ñến 5log2(duy nhất thỏ số 8 của lô 1 có hiệu giá KHT ñến 7log2, tương ñương với 7 trên ñồ thị). Thu hoạch KHT ở thời ñiểm này là thích hợp nhất. ðáp ứng miễn dịch của huyết thanh ñối với týp III của : M1, M2, M3 , M4 không ñều nhau nhưng cũng ở mức ≤2log2 ñến 10log2. M5 giảm thấp hơn trong khoảng ≤2log2 ñến 7log2. Với những kết quả thu ñược của 7 thỏ ở trên, ta thấy ở các thời ñiểm khác nhau thì giai ñoạn 66 ngày (tức mũi thứ 5) có hiệu giá KHT cao ñối với týp II và thấp với týp I và týp III. Nên thu hoạch KHT ở thời ñiểm này. Số liệu này còn hạn chế, ñể có thể ñưa ra phương pháp tối ưu trong việc sản xuất KHT cho cả 3 týp, cần thực hiện tiêm ñáp ứng miễn dịch với liều kháng nguyên và ñường tiêm khác nhau ñể chọn lựa. 4.3.3.2. Hiệu giá kháng huyết thanh sau lần thử nghiệm thứ 2 Khi kiểm tra hiệu giá kháng thể của týp I lần thử nghiệm thứ 2 ta thấy: ðáp ứng miễn dịch sinh ra ở týp 1 này có nhưng thấp, cụ thể ở mũi 0 cả 10 con thỏ ñều âm tính. ðiều này chứng tỏ lô thỏ này có thể dùng ñể sản xuất kháng thể bại liệt. Mũi thứ 2 sau tiêm 21 ngày, theo lý thuyết lúc này lượng kháng thể sinh ra là cao nhất , vì sau một thời gian tiềm tàng là 21 ngày, các tế bào lym pho hoạt ñộng và kích thích cơ thể sản sinh kháng thể. Nhưng vì ở ñây chúng tôi kích thích cơ thể thỏ ñể sản xuất kháng nguyên bại liệt týp 2 nhưng vẫn có hiện tượng kháng thể chéo (vẫn sản xuất ra kháng thể bại liệt týp nhưng hiệu giá thấp hơn týp 2) vì nó là một phần của kháng nguyên chung, kích thích cơ thể thỏ sản xuất KT týp khác 1 và 3 - như chúng ta ñã thấy ở bảng trên. Ở týp 2 này, hiệu giá kháng thể cao hơn rất nhiều so với 2 týp I và II, vì chủ yếu chúng tôi tập trung vào sản xuất KHT týp 2 nên hiệu giá rất khả quan. Ở lô thứ nhất 83 (Số tt của thỏ từ 1 ñến 5) hiệu giá KHT cao, ñạt tối ña 13log2 con thứ 4 (mũi 1 tức 21 ngày → hệ miễn dịch của thỏ này hoạt ñộng hiệu quả. Còn các con khác cũng nằm trong mức hiệu giá cao là 12log2 có 3 con, chỉ còn lại 1 con số 1 ở mức 10log2) Theo kết quả ở các bảng trên, Mo tất cả 10 thỏ ñều có nồng ñộ kháng thể ≤2log2 với cả 3 týp I, II và III chứng tỏ thỏ ñủ tiêu chuẩn ñể tạo ñáp ứng miễn dịch. ðáp ứng miễn dịch của huyết thanh ñối với týp I của M1có hiệu giá KHT cao nhất là 7log2 (con số 3, con số 10), còn lại ñều thấp nhưng ñến M2, M3, M4, M5 lại có hiệu giá KHT thấp hơn trong khoảng ≤2log2 ñến 6log2, tuy có cao hơn ñợt 1 song ñợt thứ 2 này hiệu giá KHT týp II ñồng ñều với tất cả các thỏ ñược gây nhiễm. ðáp ứng miễn dịch của huyết thanh ñối với týp II của : M1, M2, M3,M4 có hiệu giá KHT cao lên ñến 13log2 . M5 có hiệu giá KHT tăng lên gần giống M1, M2, M3 là 13log2. ðáp ứng miễn dịch của huyết thanh ñối với týp III của : M1, M2, M3 , M4 không ñều nhau và thấp nhưng cũng ở mức ≤2log2 ñến 7log2. M5 giảm thấp hơn trong khoảng ≤2log2 ñến 6log2. Với những kết quả thu ñược của 10 thỏ ở trên, ta thấy ở vào thời ñiểm 66 ngày (tức mũi thứ 5) có hiệu giá KHT cao ñối với týp II và thấp với týp I và týp III. Qua biểu ñồ phân type của kháng thể ta thấy: ðường ñưa kháng nguyên theo lối thứ nhất (trong da 3 lần) → Cho ta lượng kháng thể ổn ñịnh hơn ñường ñưa kháng nguyên theo lối thứ 2 (trong da và bắp ñùi). Các lớp Ig tiếp nhận và sinh kháng thể ở các ñộng vật có khác nhau nên mức ñáp ứng miễn dịch cũng khác nhau (hàm lượng kháng thể). Như vậy qua 2 phương pháp thử nghiệm nghiên cứu sản xuất kháng thể Bại liệt trên thỏ cho chúng ta thấy lối ñưa thứ nhất (tiêm 3 mũi trong da) cho kết quả cao hơn. 84 5. KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Từ kết quả nghiên cứu “Nghiên cứu sản xuất kháng thể bại liệt trên thỏ và ñánh giá tính an toàn của văcxin bại liệt trong phòng thí nghiệm” chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Bước ñầu triển khai thực hiện thử nghiệm sản xuất kháng nguyên trong phòng thí nghiệm, tại Trung Tâm nghiên cứu sản xuất văcxin và Sinh phẩm y tế ñã cho kết quả: Chủng virus có hiệu giá tương ñối cao và ổn ñịnh so với chủng virus chuẩn do Nhật Bản cung cấp ñể sản xuất văcxin. Hiện nay, nước ta chưa có ñộng vật thí nghiệm SPF (sạch, ñáp ứng ñược với các chỉ tiêu kỹ thuật về ñộng vật dùng cho các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm trên Thế giới), cho nên mức ñáp ứng miễn dịch giữa các thỏ không ñồng nhất (hiệu giá kháng thể của các thỏ còn lệch nhau tương ñối lớn) trong týp gây miễn dịch và các týp chéo. 2. Thử nghiệm sản xuất kháng thể bại liệt trên thỏ, bước ñầu ñã có kết quả khả quan. Hai lần thử nghiệm sản xuất kháng thể bại liệt ñã ñạt ñược hiệu giá kháng thể khá cao. Qua hai phương pháp thử nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng nên thực hiện theo phương pháp thứ nhất (tiêm kháng nguyên trong da 3 lần), hiệu giá kháng thể của các thỏ sản sinh ra là cao nhất, có hiệu giá các týp chéo thấp ở thời ñiểm 66 ngày. Hy vọng trong một tương lai gần, chúng tôi sẽ nghiên cứu thử nghiệm ñể cho ra sản phẩm là kít chẩn ñoán nhanh bệnh bại liệt ñể cung cấp cho các tuyến y tế tuyến huyện và xã, giúp cho công tác thăm khám, chẩn ñoán tại các cơ sở này phát hiện virus bại liệt hoang dại lưu hành (nếu có), giúp cho công tác phòng bệnh của Chương trình tiêm chủng mở rộng ñạt hiệu quả. 3. Kiểm tra nguyên liệu ñầu giai ñoạn 2000 – 2006, cho thấy trong 819 con khỉ Trung tâm tiến hành kiểm ñịnh có 521 con ñạt tiêu chuẩn cho sản xuất văcxin chiếm 60%. Khỉ trước khi ñược sử dụng phải có giấy chứng nhận khỉ sạch do phòng kiểm ñinh cung cấp theo các tiêu chí của các test thử nghiệm dựa trên cơ sở GMP – WHO. 85 4. Toàn bộ 139 loạt tế bào trong bảy năm từ 2000 - 2006 của Trung tâm ñều không nhiễm vi khuẩn, nấm và tác nhân ngoại lai. ðạt tiêu chuẩn của WHO và Trung tâm Kiểm ñịnh Quốc gia. 5. Kiểm ñịnh 113 loạt văcxin bán thành phẩm, trong ñó các týp sản xuất ñược thống kê bảng (17) ñã cho thấy: Việc sản xuất văcxin của Trung tâm ñược thực hiện trong môi trường hết sức vô trùng. Các thử nghiệm (kiểm ñịnh) rất nghiêm ngặt, từ khâu ñịnh týp nhận dạng ñến thử vô trùng và các test thử nghiệm, cuối cùng là kiểm tra an toàn trên ñộng vật thí nghiệm theo yêu cầu của Trung tâm kiểm ñịnh Quốc gia và WHO ñề ra. 6. Chênh lệch hiệu giá về nhiệt ñộ của 5 lô văcxin thành phẩm bảo quản và sử dụng ñạt tiêu chuẩn của WHO và Trung tâm Kiểm ñịnh Quốc gia. 7. Trung tâm Nghiên cứu, Sản xuất Văcxin và Sinh phẩm Y tế ñã thực hiện nghiêm túc hướng dẫn của WHO về chọn lọc nguyên liệu ñầu (khỉ và tế bào thận khỉ) sản xuất văcxin bại liệt từ chủng Sabin. 139 loạt tế bào sản xuất trong bảy năm tại trung tâm ñạt tiêu chuẩn GMP của Trung tâm Kiểm ñịnh Quốc gia và WHO. ðã ñạt tiêu chuẩn chất lượng của DðVN-III, WHO (TRS 904, 2002), các TCCS. 139 loạt vắc xin OPV ñã ñược Viện KðQG cấp phép xuất xưởng. 5.2. Kiến nghị 1. Trong thời gian tới, cần tiếp tục thực hiện gây nhiễm kháng nguyên týp I và týp III ñể nghiên cứu tổng hợp, ñánh giá hiệu giá kháng thể và ñưa ra quy trình chuẩn sản xuất kháng thể, ñể có thể tự kiểm soát nguyên liệu cần cho công việc thực hiện các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, tiến tới tự chủ ñộng nguyên liệu, hạ giá thành sản phẩm của văcxin. 2. Cần chủ ñộng về nguồn ñộng vật thí nghiệm vì hiện nay hầu hết ñộng vật thí nghiệm không ñạt chỉ tiêu kỹ thuật dùng cho thử nghiệm. Kết quả thử nghiệm gây nhiễm kháng nguyên bại liệt týp II vừa qua cho thấy: thỏ sau khi tiêm kháng nguyên từ 3 ñến 5 tuần, có hiện tượng ghẻ xuất hiện ở tai và kẽ móng chân. Nên chủ ñộng tiêm phòng ký sinh trùng cho thỏ trước khi gây nhiễm 1 tuần ( tiêm Ivemectine) ñối với thỏ dùng cho sản xuất kháng thể. 86 3. Do thời gian có hạn, nhóm nghiên cứu cần thêm thời gian ñể gây nhiễm các týp còn lại (I và III), các thử nghiệm ñịnh týp, nghiên cứu thử nghiệm ñể sản xuất kít thử phục vụ cho công tác kiểm ñịnh trong nước, chủ ñộng nguồn nguyên liệu và hạ giá thành sản phẩm./. 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. TIẾNG VIỆT: 1. ðoàn Thị Ngọc Anh (1991) Các vi rus gây bệnh cho người - Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh y học . Nhà xuất bản văn hoá Hà Nội, Tr218-228. 2. ðoàn Thị Ngọc Anh, Nguyễn Văn Mẫn, Phạm Ngọc Anh, Nguyễn Hiền Thanh, Trần Xuân Phúc (1989) Sự ñáp ứng kháng thể bại liệt ở trẻ dưới 12 tháng tuổi sau khi uống ñủ 3 liều văcxin Sabin trong năm tiêm chủng mở rộng 1989 – Công trình nghiên cứu khoa học - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Tr 319-323. 3. ðoàn Thị Ngọc Anh, Hoàng Thuỷ Nguyên, Nguyễn Văn Mẫn, Trần Văn Tiến (1992) ðánh giá hiệu quả ñáp ứng miễn dịch của văcxin phòng Bại liệt sản xuất tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương năm 1990. Tạp chí vệ sinh phòng dịch tập 2 số 3, Tr 30-35. 4. Bộ Y Tế (1992) Tiêu chuẩn Việt Nam cho văcxin phòng bại liệt sống, uống, TCVN 903-1992. 5. Chương trình tiêm chủng mở rộng (1995) . Tính bền vững của văcxin, Tr 26-33. 6. Lê Trung Dũng (2001) . Sử dụng phương pháp trung hoà vi lượng ñể phát hiện kháng thể bại liệt có trong huyết thanh khỉ dùng cho sản xuất và kiểm ñịnh văcxin bại liệt, Tr 7-8. 7. Lê Văn ðiệt và cộng sự (1992). Hiệu quả văcxin bại liệt uống tam liên sản xuất theo chỉ tiêu năm 1991 . Tạp chí VSPD 1992 tập 2 số 3, Tr 34. 8. Lê Văn ðiệt (1992). ðánh giá chất lượng văcxin bán thành phẩm sản xuất tại Việt Nam năm 1991. Tạp chí vệ sinh phòng dịch tập 5 số 4, Tr 17-23. 9. Lê Thị Song Hương và cộng sự (1999). Nghiên cứu hiệu lực văcxin phòng bại liệt uống sản xuất tại Trung Tâm Khoa học sản xuất Văcxin Sabin trên thực ñịa Hải Phòng. ðề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ - 1999 . 10. Lê Văn Hiệp (2006). Văcxin học - Những vấn ñề cơ bản. Nhà xuất bản y học, 88 Tr 239-247. 11. Hội Y học dự phòng Việt Nam(2003). Phát hiện Mycoplasma trên tế bào nuôi dùng ñể sản xuất và kiểm ñịnh. Tạp chí Y học dự phòng, tập XIII số 6(63) năm 2003, Tr 75-78. 12. Nguyễn Hữu Hồng (1993). Bài giảng vi sinh y học. Nhà xuất bản y học. 13. Nguyễn Như Hiền, Trịnh Xuân Hậu (1998). Tế bào học . Nhà xuất bản ðại học Quốc Gia Hà Nội. 14. Lê Thị Luân (1997). Tính ổn ñịnh của văcxin bại liệt uống sản xuất tại Việt Nam từ năm 1993 ñến 1996 và ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñối với hiệu giá văcxin tam liên . Luận án Phó tiến sĩ khoa học Y dược. 15. ðoàn Xuân Mượu (1997). Vi rut học tập 2. Nhà xuất bản y học Hà nội. 16. Nguyễn Văn Mẫn, Trần Minh Cánh, Nguyễn Thị Quỳ (1995). Sản xuất văcxin phòng bại liệt uống tại Trung tâm Khoa học sản xuất Văcxin Sabin. Chất lượng và hiệu quả. Tạp chí vệ sinh phòng dịch và Công nghệ sinh học, Tr 178-183. 17. Hoàng Thuỷ Nguyên, ðặng ðức Trạch, Ninh ðức Dụ, Nguyễn Hồng ðiệt, Nguyễn Thị Kê, Lê Thị Oanh (1975). Vi sinh Y học . Nhà xuất bản Y học. 18. Hoàng Thuỷ Nguyên, Nguyễn Trung Thành, Huỳnh Ngọc Tính và cộng sự (1967). Tình hình bệnh bại liệt ở miền Bắc Việt Nam sau 6 năm gây miễn dịch rộng rãi bằng văcxin sống uống giảm ñộc lực. Y học Việt Nam, Tr 3-11. 19. Nguyễn Hiền Thanh (1996) . Giám sát vi rút học những trường hợp liệt mềm cấp tính do virus Polio gây nên trong năm 1991 – 1994 ở miền Bắc Việt Nam. Luận án Phó tiến sĩ Y dược . 20. Nguyễn Thị Hiền, ðoàn Thị Ngọc Anh, Nguyễn Văn Mẫn, Phạm Ngọc Oanh, Nguyễn Thị Hiền Thanh, Trần Xuân Phúc (1994). Một số nhận xét về kết quả phân lập virus Polio ở những bệnh nhân liệt mềm của Hà Nội năm 1991. Tạp chí vệ sinh phòng dịch, tập 4 số 3, Tr 74. 21. Phạm Ngọc Thạch, Võ Tố, Hoàng Thuỷ Nguyên (1960). Việc gây miễn dịch rộng rãi chống bệnh bại liệt cho các trẻ em ở nước Việt Nam dân chủ 89 cộng hoà bằng văcxin làm với các giống siêu vi trùng giảm ñộc lực của Sabin. Tạp chí Y học Việt Nam, Tr 3-16. 22. Tiêm chủng mở rộng Quốc gia (1993). Bại liệt - tỷ lệ mắc và chết từ năm 1976 – 1983. Hội nghị ñánh giá TCMR 1981 – 1993 . Bộ Y Tế, Tr 84. 23. Trung tâm kiểm ñịnh sinh vật phẩm - Bộ Y tế (1992). Tiêu chuẩn Việt Nam về văcxin phòng chống bại liệt uống, số 903. 24. Nguyễn Thu Vân (1999). Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn Việt Nam cho văcxin Bại liệt sống uống giảm ñộc lực sản xuất tại Trung tâm khoa học sản xuất Văcxin Sabin trong giai ñoạn 1997 – 1998. BYT, Tr 25. 25. WHO. ðòi hỏi ñối với văcxin bại liệt uống (1988). Phụ chương VI. Thư viện Viện Vệ sinh dịch tễ Hà Nội, Tr 9-22. 26. WHO. Tiêm chủng cho trẻ em trên Thế giới. Chương trình TCMR tháng 5/1987 số 5. Thư viện Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương. 27. WHO (1993). Cơ sở miễn dịch học của tiêm chủng / Miễn dịch học ñại cương. WHO /EPI / Gen /93. 11. Thư viện Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương. 28. Lê Thanh Hoà (2005). Virus học nâng cao (ADVANCED VIROLOGY). Chương trình giảng dạy cao học . Viện công nghệ sinh học. 29. Bước ñầu nghiên cứu sự nhân lên của chủng Sabin trên tế bào thận khỉ bào thai khỉ Macaca Mulatta (2006). Tạp chí y học dự phòng, tập XVI, số 2(80)2006, Tr 83. TIẾNG ANH : 30. Aronoff, Hughes, Kohl, Speck, Wald (1987). Advances in pediatric Infectious Diseases. Year Book Medical Publishers, Inc. Volumme 2, pp57-78 . 31. Balannt J, Guilott S, Candrea A, Delpeyroux F, Crainic R (1991). The natural genomic variability of Poliovirus analyzed by a restriction fragment length Polymorphism Assay. Virology, 1991, pp 184, 645-654. 32. Benyish – Melnick M, Melnick JL, Rawls WE, Et all (1967). Studies of the immunogenicity, communicability and geentic stability of oral Poliovaccine administered during the winter. Am J Epidemiol, pp 86, 112-136 . 90 33. Bordie M, Park W. H (1936). Active immunization against Poliomyelitis. Am.J.Pubilic Health, pp 26, 119-125 . 34. Brown F (ed) (1996). New Approaches to Stabilisition of Vaccine potency. Dev Biol Stand. Basel, Karger, Vol 87, pp 155-160. 35. Christodoulou, C., F.Colbere – Garapin, A. Macadam. Mapping of mutations associated with neurovirulence in monkeys infected with sabin 1 Poliovirus revertants selected at hight temperature .J. Virol, pp 64. 36. Chumakov K.M., Dragunsky E.M., Norwood L.P., et al (1994). Consistent selection of mutation in the 5’-untranslated region of Oral Poliovirus vaccine upon passaging In Vitro. Journal of Medical Virology, pp 79-85. 37. Chumakov K.M., Norwood L.P., Parker M.L., et al. (1992). RNA Sequence Variants in Live Poliovirus Vaccine and their relation to neurovirulence. Journal of Virology, Feb.1992, pp 66-70. 38. Chumakov K.M., Powers L. B., Noonan K.E., Roninson I.B., Levenbook I.S., (1991). Correlation between amount of virus nucleotide sequence and the monkey test for accep tability of OPV. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, pp 199- 203. 39. Edwin H.L., David A.L., Evelyne T.L., (1995). Diagnstic proceduces for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections. 7th. Edition. Chapter 17, pp 279-297. 40. Egashira Y., N.uchida and H. Shimojo (1967). Evaluation of Sabin live Poliovirus vaccine in Japan. V. Neurovirulence of virus strains derived from vaccines and their contract. J.Mde.Dci. Biol 1967, pp 281-302. 41. Enders JF., Weller TH., Robbins FC. (1949). Cultivation of Lansing strain of Poliomyelitis virus in culture of various human embryonic tissues. Science 1949 -109, pp 85-87. 42. Evans, D.M.A, G. Dunn, P.D.Minor, G.C.Schild, A.J.Cann, G.Stanway, J.W.Almond, K.Currey and J.V.Maizel, Jr (1985). Increased neurovirulence associated with a single nucleotide change in a noncoding region of the Sabin type 3 Poliovirus genome. Nature (London), pp 548-550. 91 43. Francis TM Jr, Korns RF, Voight RBm Boisen M, Hemphill FM, Napier JA, Tolchinsky E (1995). An ecaluation of the 1954 poliomyelitis vaccine trials (Summary report). Am J Public Health, pp 45 . 44. Francis TM Jr, Korns RF, Voight RBm Boisen M, Hemphill FM, Napier JA, Tolchinsky E, Wenner HA, Diamond EL (1957). Evaluation of the 1954 Field Trial of the Poliomyelitis Vaccine .(Finan report). Ann arbor, University of Michigan. 45. Furione M, Guillot S, Otelea D, Balanant J, Candrea A, Crainic R. (1993). Polioviruses with Natural Recombinant Genomes Isolated from Vaccine-Associated Paralitic poliomyelitis. Virology 196, pp 199-208. 46. Ghedon Y and S. E. Rbertson (1994). Interrupting the transmision of wild poliovirusses with vaccine vaccine immunological considerations. Bulletin of the World Health Organization, pp 973-983. 47. Global pouliomyelitis Eradication by the year (2000). Manual for the virological investigation of poliomyelitis. World health organization. 48. Hashizume S. (1975).Basic of new attenuated vaccina strain LC16m8. J.clinical Virol, pp 229-235. 49. Holland J.J., Spindler K, Horodiski F, Grabau E, Nichol S, Vandeplo S (1982). Rapid evolution of RNA genomes. Science 1982, pp 251. 50. Howe H.A (1952). Duration of immunity in chimpanzees vaccinated with formalin inactvatde poliomyelitis virus. Fed Proc 1952, pp 11, 471-472. 51. Kwamura N, Kohara M, Abe S, Komatsu T, Tago K, Arita M, Nomoto A (1989). Determinants in the 5’noncoding region of poliovirus Sabin 1 RNA that influence the attenuation phenotype. J.Virol 1989, pp 63, 1302-1309. 52. Kitamura N, B.L. Semler, P.G.Rothberg, G.R.Larsen, C.J.Adler, A.J. Domer, E.A.Emini, R.Hanecak, J.J.Lee, S.Vander Werf, S.W.Anderso and Wimmer. (1981). Primary structure gene organization and polipeptide xepression of poliovirus RNA. Nature (London), pp 547-553. 53. Kohara M, Abe S, Komatsu T, Tago K, Arita M, Nomoto A (1988). 92 Arecombinant virus between the Sabin 1 and Sabin 23 vaccine strains of poliovirus as a possible candidate for a naw type 3 poliovirus live vaccine strain. J. Virol. 1988, pp 62. 54. Kohara M,Omata T, Kameda A, Semler B.L, Itoh H, Wimmer E, NomotoA (1985). In vitro phenotypic markers of a poliovirus recombinant constructed from infectious cDNA clones of the neurovirulent Mahoney and attenuated Sabin 1 satrains. J. Virol, pp 53, 786-792. 55. Kolmer J.A (1936) .Vacccination againt acute anterior poliomyelitis. Am Public Health, pp 126-135 . 56. Loring H.S, Schrwerdt C.E, Lawrence N, Anderson J.C (1947). Preparation of formaldehyde – Inactivated poliomyelitis virus and its use as immumizing agent in cotton rats. Science 1947, pp 104-105. 57. Macadam A.T, Stone D.M, Almond J.W, and Minor P.D (1994). The 5’noncoding region and virulence of poliovirus vaccine strains. Trends in microbiology, pp 449-453. 58. Melnick J.L (1990). Enteroviruses. Polioviruses, Coxsackieviruses, Echoviruses and newer enteroviruse. Virology. New York, pp 739-794. 59. Melnick J.L , Ashkenazi A, Midulla VC, et al (1963). Immunogenic potency of MgCl-stabilized oral poliovaccine. JAMA 1963, pp 406-408. 60. Minor P.D, Feguson M, Evan DMA, Almond J.W and Icenogle J.P (1986). Antigenic structure of poliovirus of serotype 1,2 and 3. J.Gen.Virol, pp 67. 61. Minor P.D, John A, Ferguson M,Icenogle J.P (1986). Antigenic and molecularevolution of vaccine stran of type 3 poliovirus duting the period of excretion byprimaty vaccine. J.Gen.Virol, pp 693-725. 62. Montagnon B , Fanget B, Vincent – Falquet JC (1984). 63. Industrial scale production of inactivated poliovirus vaccine prepared by culture of Vero cells and microcarrier. Rev Infect Dis 1984, pp 341-344. 64. Montagnon B.J (1989). Polio and Rabies vaccine produced in continuous celltines: reality for vero cell line. Dev Biol Stand, pp 27-48 . 93 65. Morgan I.M (1948). Immunization of monkeys with formalin-inactivated Poliomyelitis viruses. Am J Hyg, pp 394-406. 66. Nathanson N, Laugmuir AD (1963). The cutter incident . Poliomyelitis forlowing the formaldehyde-inactivated poliovirus vaccination in the United States during the sping of 1955. Am J Hyg, pp 78-81. 67. Nomoto A, Lizuka N, Kohara M, Arita M (1988). Strategy for construction of live picornabirus vaccines. Vaccine, pp 134-137. 68. Nomoto A, Omata T, Toyoda H, Kuge S, Horoe H, Kataoka Y, Genba Y, Nakano Y, Imura N (1982). Complete nucleotide sequence of the attenuated poliovirus Sabin 1 strain genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, pp 79, 93-97. 69. Omata T, Kohara M, Kuge S, Komatsu T (1986). Geneticanalysis of the attenuation phenotype of poliovirus type 1. J.Virol, pp 348-358. 70. Researcher’s Associates The National Institute of Health (1996). Vaccine handbook. Maruzen- Tokyo. 71. Rueckert R.R (1985). Picornaviruses and the replication. In Fields (ed), Virology. New York, pp 705-738. 72. Salk J, Bennett BL, Lewis LJ, Ward EN, Youngner JS (1953). Studies in human subjects on active immunization against poliomyelitis. I.A preliminary report of experiment in progress .JAMA, pp 151. 73. Salk J, Gori JB (1960). A review of the retical experimental and practical considerations in the use of formaldehyde for the inactivation of poliovirus. Ann NY Acad Svi, pp 609-637 . 74. Salk J, Stoeckel PH, Van Wezel A, et al (1982). Antigen content of inactivatde poliovirus vaccine for use in a one or two dose regimen. Ann Clin Res, pp 204-212. 75. Salk J (1955). Vaccination against paralytic poliomyelitis. Performance and prospects. Am J Public Health, pp 575-596. 76. Sangar D, Pipkin P.A, Wood D.J, Minor P.D (1999). Examination of Poliovirus vaccine preparation for SV 40 Sequences. Biologycals, pp 1-10. 94 77. Smith W.M, Chambers V.C, Evans C.A (1950). Growth of neurotropic viruses in extraneural tissues ; Preliminary report on the propagation of poliomyelitis virus ( Lansing and Hof. Strains) in cultures of human testicular tissue. NW med, pp 368-373. 78. Stanley J. Cryz , Jr (1991). Vaccines and Immunotherapy. Mc Graw-Hill, Inc. 79. Research Paper. Standardized detection of Simian virus 40 by real-time quantitative polymerase chain reaction in pediatric malignancies – Pediatric Hematology. 80. Simian Foamy Virus (SFV) – Public Health Agency of Canada. 81. FSD HIV 1/2 PA. Passive particle agglutination test for the detection of antibodies HIV – 1 and/ or HIV – 2 in human serum or plasma. 82. Van Wezel A (1967). Growth of cell strains and primary cells on microcarriers in homogeneous culture. Nature, pp 64-65. 83. Waw tt H.V (1992). Incubation of poliomyelitis as canculatde from the time of entry into the centtral nervous system via the peripheral netvepath ways. Rev. Infect. Dis, pp 444-449. 84. White D.O, Fennev F. Picornaviridae. Medical Virology, 1994: 381-391. 85. WHO consultative Group on Poliomyelitis vaccines (1985). Report to World Health Organization. 86. WHO. Manual for the virological investigation of Poliomyelitis (1990).WHO/EPI/CDS/POLIO/90.1. 87. WHO. Expended program on Immunization Poliomyelitis in 1988, 1989 and 1990. Wkly Epidem. Rec. 1992, pp 113-120. 88. Wood D.J and Macadam A.J. Laboratory tests for Live attenuated Poliovirus Vaccine. Biological 1997, pp 3-15. 89. World Health Organization. Requirements for Poliomyelitis vaccine (oral). Technical report series 1990, pp 30-86. 90. Yang C.F, De L, Holloway B.P, Pallansch M.A, Kew O.M. Detection and 95 identification of vaccine – related Polioviruses Polimerase chain reaction. Virus Res. 1991, pp 159-179. 91. Sangar D., Pipkin P.A., Wood D.J., Minor P.D., Examination of Poliovirus vaccine preparations for SV40 sequences. Biological 1998, pp 26, 245. 92. Who. Technical Report series. No 771. Requirements for Poliomyelitis vaccine (oral), requirements for biological Substances No.7. 1987, pp 117-118. 93. WHO. Technical Report series. No 904. 2002, pp 43. 94. WHO. Recommandations for Biological substances No.2,Revised 2000, annex 4, pp 46. 95. WHO Technical Report Series, No.904, 2002. 96. WHO. Manual laboratory menthods for potency testing of vaccines used in the WHO expanded Progamme on Immunization. 97. WHO. Recommendation for continuous cell lines used for Biological substance.1987. Tech. Rep. Ser.745. 98. Ghedon, Y., S.E. Rbertson. Interrupting the transnision of wild Polioviruses with vaccine Immunological consideratione. 99. Henry Too (2002), CSF a handbook for swine practitioners. Copyright by Merial Asia Private Limited. 57A Science Park Drive, Singapore. 100. psu. Edu/courses/biotc 489/notes/mycoplas.htm (12/23/2004). Detection and Control of Mycoplasma. 101. dsmz. de/mutz/mutzmyco.htm.(1/26/2005).Mycoplasma Detection and Elimination. DSMZ. 96 PHỤ LỤC: HÌNH ẢNH MINH HỌA Chọn lọc thỏ Nuôi và chăm sóc thỏ Lấy máu tĩnh mạch tai thỏ Gây miễn dịch dưới da Lấy máu toàn bộ (ngày 66) Chắt huyết thanh 97 Kiểm tra tế bào Hep2C Kiểm tra hiệu giá kháng thể Bất hoạt kháng huyết thanh Tủ ấm nuôi tế bào (nhiệt ñộ 360C) ðọc kết quả Kết quả hiệu giá 98 Khỉ nuôi phục vụ sản xuất và kiểm ñịnh Lấy máu kiểm tra nguyên liệu ñầu khỉ Mổ khỉ sạch lấy thận Lấy thận tách nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát Trẻ uống vắc xin phòng bại liệt 99 Chuyển tế bào vào phòng nuôi phục vụ sản xuất và kiểm ñịnh Phòng nuôi cấy tế bào Thử vô trùng bằng Thiogluconate và Soybean Casein Kiểm tra nuôi cấy tế bào Bể ñiều nhiệt Tách tế bào thử nghiệm vắc xin ._.