Nghiên cứu sản xuất Cellulase từ Aspergillus Oryzea

hệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng ii Luận văn tốt nghiệp đính kèm theo đây, với đề tài “NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CELLULASE TỪ ASPERGILLUS ORYZEA ”, do sinh viên TRẦN ĐÔNG BÁCH thực hiện và báo cáo đã được hội đồng báo cáo luận văn thông qua. Giáo viên hướng dẫn LÝ NGUYỄN BÌNH Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin cảm ơn quí thầy cô đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt những kiến thức quí báu trong suốt 5 năm đại học. Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã truyền đạt hành trang kiến thức và vốn sống bằng tâm huyết của mình. Xin gửi lòng biết ơn đến thầy Lý Nguyễn Bình đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành bài luận văn này. Chân thành cảm ơn sự đoàn kết và hỗ trợ của các bạn lớp Công nghệ Thực phẩm khóa 29 trong suốt 5 năm đại học và trong quá trình thực hiện luận văn. Cảm ơn những ai đã quan tâm, đóng góp ý kiến để bài luận văn hoàn chỉnh hơn. Xin chân thành cảm ơn ! Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng iv MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ..................................................................................................................... iii MỤC LỤC.......................................................................................................................... iv DANH SÁCH HÌNH ......................................................................................................... vi DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................................... vii TÓM LƯỢC.........................................................................................................................1 CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU...................................................................................................2 1.1. Đặt vấn đề..................................................................................................................2 1.2. Mục tiêu nghiên cứu..................................................................................................2 CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .............................................................................4 2.1. Sơ lược về enzyme cellulase .....................................................................................4 2.1.1 Đặc tính và cơ chế tác dụng cellulase..................................................................4 2.1.2 Hoạt lực của cellulase.........................................................................................6 2.2. Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính của cellulase ...........................................................7 2.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme ........................................................................7 2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất .........................................................................8 2.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ .....................................................................................8 2.2.4 Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme .......................................................10 2.2.5 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm ....................................................................10 2.2.6 Các chất hoạt hóa..............................................................................................12 2.3. Một số ứng dụng của cellulase trong công nghiệp..................................................12 2.3.1 Trong công nghiệp rượu bia .............................................................................12 2.3.2 Trong sản xuất thức ăn gia súc .........................................................................13 2.3.3 Trong công nghiệp dệt, giấy, ô nhiễm môi trường...........................................13 2.3.4 Trong kỹ thuật di truyền ...................................................................................13 2.4. Sản xuất cellulase từ vi sinh vật ..............................................................................13 2.4.1 Sinh tổng hợp cellulase ở vi sinh vật.................................................................13 2.4.2 Môi trường nuôi cấy .........................................................................................13 2.4.3 Giống vi sinh vật...............................................................................................14 2.4.4 Phương pháp nuôi cấy ......................................................................................16 2.4.5 Thu nhận enzyme..............................................................................................18 2.4.6 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự tổng hợp cellulase ..........................18 2.5. Kỹ thuật sản xuất cellulase từ vi sinh vật................................................................19 2.5.1 Sơ đồ kỹ thuật sản xuất chế phẩm cellulase ......................................................19 2.5.2 Thuyết minh qui trình ........................................................................................20 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng v CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................23 3.1. Vật liệu sản xuất ......................................................................................................23 3.2. Đối tượng nghiên cứu..............................................................................................23 3.3. Dụng cụ, hóa chất ....................................................................................................23 3.4. Phương pháp thí nghiệm .........................................................................................24 3.4.1 Quy trình thí nghiệm tham khảo........................................................................24 3.4.2 Tiến hành thí nghiệm.........................................................................................26 3.4.3 Phân tích thống kê .............................................................................................28 4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy đến sự tạo thành cellulase .....................................................................................................29 4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng điều kiện môi trường đến sự tạo thành enzyme cellulase ..........................................................................................................................34 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................41 5.1 Kết luận ....................................................................................................................41 5.2 Đề nghị .....................................................................................................................42 TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................43 PHỤ LỤC........................................................................................................................... vi Phương pháp kiểm tra hoạt tính cellulase ...................................................................... vi Kết quả thống kê thí nghiệm............................................................................................. vii Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khác nhau và thời gian nuôi cấy đến sự tạo thành cellulase ............................................................................... vii Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường khác nhau (pH, nhiệt độ, độ ẩm) nuôi cấy đến sự tạo thành cellulase......................................................................x Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng vi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Thành phần enzyme cellulase và tính chất đặc trưng mỗi loại ...............................5 Hình 2. Sơ đồ cơ chế tác dụng của phức hệ cellulase lên mạch cellulose ...........................6 Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng...........................................7 Hình 4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme..........................................8 Hình 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến tốc độ phản ứng của enzyme ............................9 Hình 6. Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme ...................................................10 Hình 7. Hình dạng nấm sợi ................................................................................................16 Hình 9. Máy phân tích ẩm..................................................................................................23 Hình 10. Máy đo pH ..........................................................................................................23 Hình 11. Qui trình thí nghiệm sản xuất cellulase...............................................................25 Hình 12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ....................................................................................26 Hinh13. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 .....................................................................................28 Hình 14. Đồ thị biểu diễn hoạt tính cellulase riêng ...........................................................31 Hình 15. Đồ thị biểu diễn hoạt tính cellulase tổng ............................................................33 Hình 16. Đồ thị biểu diễn hoạt tính cellulase riêng ...........................................................36 Hình 17. Đồ thị biểu diễn hoạt tính cellulase tổng ............................................................40 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng vii DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Thành phần dinh dưỡng của cám .......................................................................14 Bảng 2. Các nguồn vi sinh vật để sản xuất enzyme...........................................................14 Bảng 3. Hoạt tính riêng của cellulase ................................................................................30 Bảng 4. Hoạt tính tổng của cellulase .................................................................................32 Bảng 5. Hoạt tính cellulase riêng trung bình theo nhiệt độ môi trường nuôi cấy..............34 Bảng 6. Hoạt tính cellulase riêng trung bình theo pH môi trường nuôi cấy......................34 Bảng 7. Hoạt tính cellulase riêng trung bình theo độ ẩm môi trường nuôi cấy.................35 Bảng 8. Hoạt tính cellulase riêng trung bình theo nhiệt độ_pH_độ ẩm môi trường..........35 Bảng 9. Hoạt tính cellulase tổng trung bình theo nhiệt độ môi trường nuôi cấy...............37 Bảng 10. Hoạt tính cellulase tổng trung bình theo pH môi trường nuôi cấy.....................37 Bảng 11. Hoạt tính cellulase tổng trung bình theo độ ẩm môi trường nuôi cấy................37 Bảng 12. Hoạt tính cellulase tổng trung bình theo nhiệt độ_độ ẩm_pH môi trường.........39 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 1 TÓM LƯỢC Cellulase là enzyme được sử dụng phổ biến trong chế biến thực phẩm: rượu bia, nước trái cây, trong chế biến thức ăn gia súc, trong công nghiệp dệt, giấy, trong kỹ thuật di truyền... Cellulase được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau: động vật, thực vật, nhưng sản xuất từ vi sinh vật thuận lợi và cho hoạt tính cao hơn cả. Vi sinh vật cho enzyme cellulase bao gồm: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc thậm chí cả nấm men nhưng nấm mốc là dễ nuôi và thường được sử dụng để sản xuất cellulase trong thực tế. Đề tài tiến hành nghiên cứu sản xuất cellulase từ Aspergillus oryzae gồm 2 thí nghiệm - Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần môi trường nuôi cấy + Môi trường 1: 75% cám + 15% trấu + 9% mùn cưa + 1% bột + Môi trường 2: 75% cám + 20% trấu + 4% mùn cưa + 1% bột Và nuôi cấy ở các mức thời gian khác nhau: : 30 giờ, 40 giờ, 45 giờ, 50 giờ. - Thí nghiệm 2: Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy + Nhiệt độ nuôi cấy: 25, 30, 35 0C. + Độ ẩm: 50, 55, 60 %. + pH: 4,5; 5,0; 5,5 Kết quả: môi trường 1, thời gian nuôi 40 giờ, nhiệt độ 300C, độ ẩm 50% và pH 5,0 cho hoạt tính cellulase cao nhất. Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 2 CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Enzyme là loại protein, xúc tác cho mọi phản ứng sinh học trong mọi tế bào của sinh vật. Enzyme rất quan trọng đối với cơ thể con người, nếu không có enzyme thì mọi sự chuyển hoá trong cơ thể con người bị đình trệ và con người không thể sống được. Ngoài ra nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghiệp chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, công nghệ gene và bảo vệ môi trường. Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzyme được phát triển rất mạnh từ đầu thế kỉ XX đến nay. Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại lợi nhuận rất lớn cho nhiều nước. Việt Nam là một trong những nước có nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzyme. Tuy nhiên, công nghệ enzyme của ta chưa thực sự phát triển do đây là một ngành đòi hỏi công nghệ cao. Trong tương lai, hứa hẹn đây sẽ là một ngành công nghiệp được đầu tư phát triển rộng bởi những ứng dụng và tính tiện lợi của nó trong nhiều lĩnh vực và đời sống. Sản xuất enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn so với động vật và thực vật do: - Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất nhanh - Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao - Vi sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp - Nguồn nguyên liệu vi sinh vật rẻ tiền và dễ tìm - Vi sinh vật có thể tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzyme khác nhau Enzyme cellulase là một trong những enzyme có vai trò quan trọng trong chuyển hóa vật chất hữu cơ có trong thiên nhiên, và có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp thực phẩm (rượu bia…), bảo vệ môi trường… Enzyme cellulase có thể được tổng hợp từ nhiều loài vi sinh vật khác nhau: nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn, thậm chí cả nấm men nhưng trong đó sản xuất từ nấm sợi là dễ và kinh tế nhất. Nhiều loài nấm sợi được sử dụng phổ biến để sản xuất cellulase là: Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus nigier, Trichoderma reesei… Đề tài sẽ tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất cellulase từ nấm mốc Aspergillus oryzae, cụ thể là điều kiện môi trường, pH, nhiệt độ, độ ẩm… để chọn lọc điều kiện sản xuất được cellulase nhiều, giá thành rẻ, phục vụ cho sản xuất. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Nội dung đề tài sẽ nghiên cứu những vấn đề sau: - Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến quá trình sản xuất cellulase - Xác định thời điểm vi sinh vật sản sinh ra cellulase nhiều nhất Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 3 - Khảo sát điều kiện môi trường (nhiệt độ, pH, độ ẩm) ảnh hưởng đến sự sản sinh ra cellulase. Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 4 CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU Enzyme cellulase tuy được nghiên cứu và ứng dụng chậm hơn nhiều so với các enzyme amylase, protease nhưng lại có vai trò rất quan trọng trong công nghiệp thực phẩm và bảo vệ môi trường. Cellulase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân cắt các liên kết glucoside trong phân tử cellulose, cho ra sản phẩm cuối cùng là glucose. Thực ra, cellulase là 1 phức hệ enzyme tùy theo tính chất và cơ chế tác dụng mà người ta chia ra 3 loại chủ yếu: cellobiohydrolase (ex-cellulase), endoglucanase (endo-cellulase), β–glucosidase (cellobiase). 2.1. Sơ lược về enzyme cellulase 2.1.1 Đặc tính và cơ chế tác dụng cellulase Một hệ thống enzyme thủy phân cellulase chứa đựng 3 thành phần chính: + Endo-p-glucanase (1,4-β-D-glucan glucanohydrolase, thường được viết tắt là Egl) phân cắt liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose, lichenin và β-Dglucan. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose. Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình, tác động yếu đến cellulose kết tinh. Các nhà khoa học chia chúng thành 2 loại Egl 1 và Egl 2 Egl 1 chứa 459 amino acid, trọng phân tử 48,212 kD Egl 2 chứa 418 amino acid, trọng lượng phân tử 42,2 kD. Các enzyme này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao. + Exo-p-glucanase (1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase, được viết tắt là Cbh) phân cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Enzyme này còn có 1 loạt tên khác như: cellobiohydrolase, exo glucanase, exocellulase, cellobiosidase và enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng. Bao gồm 2 loại: Cbh 1 và Cbh 2. Cbh 1 có trọng lượng phân tử 65 kD, điểm đẳng điện pI = 4,4 tác động lên cả cellulose vô định hình và cellulose kết tinh. Nhưng không tác động đến cellulose biến tính như carbon methyl cellulose (CMC), hydroxyethyl cellulose. Cbh 2 có trọng lượng phân tử 53 kD, pI = 5,0, không tác động lên CMC, có khả năng tác động đến cellulose hòa tan và không hòa tan. Cbh 1 chứa khoảng 496 amino acid, Cbh 2 chứa khoảng 471 amino acid. Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 5 + β-glucoside glucohydrolase: thủy phân từ cellobiose đến glucose. Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy. β-glucosidase là nhóm enzyme khá phức tạp, có khả năng hoạt động ở pH rất rộng (4,4 – 8,4) trọng lượng phân tử 50 – 98 kD, pI 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao. Hình 1. Thành phần enzyme cellulase và tính chất đặc trưng mỗi loại (Nguồn từ chemistry.umeche.maine.edu) • Phân cắt cellobiose và các oligosaccharides khác để sinh ra glucose • Tác dụng trên các liên kết cuối mạch cellulose • Sản phẩm là glucose hoặc cellobiose • Phân cắt ngẫu nhiên mạch cellulose • Sản phẩm là các oligosaccharide có độ dài khác nhau Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 6 Hình 2. Sơ đồ cơ chế tác dụng của phức hệ cellulase lên mạch cellulose (Nguồn từ 2.1.2 Hoạt lực của cellulase Khi sử dụng bất kỳ 1 chế phẩm enzyme nào cũng cần biết rõ hoạt lực xúc tác của nó. Đơn vị của hoạt lực hay còn gọi là hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả năng xúc tác được 1 micromol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn. Do tính đa dạng của enzyme, đặc trưng của cơ chất sử dụng, nên phương pháp xác định hoạt độ của enzyme cũng khác nhau. Các phương pháp kiểm tra hoạt tính cellulase: - Cơ chất thường sử dụng để xác định hoạt độ cellulase là: sợi bông, giấy, bột cellulose, hydrocellulase. Các dẫn xuất của cellulose (như CMC, oxyethyl cellulose). Đối với enzyme Cbh, cơ chất tốt nhất là CMC và oxyethyl cellulose) - Có nhiều phương pháp để xác định hoạt độ của cellulase và các phương pháp này dựa vào một trong các nguyên tắc sau + Xác định sự giảm trọng lượng cơ chất cellulose không hòa tan + Xác định sự giảm tính chất cơ học của các sợi hay các màng mỏng + Xác định sự thay đổi độ đục của dung dịch cơ chất Endocellulase Exocellulase Cellulose Cellobiase (β-glucosidase) Cellulose (tinh thể) Glucose Cellobiose hoặc cellotetrose Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 7 + Xác định sự tăng các nhóm khử tận cùng + Dùng phương pháp so màu để xác định sản phẩm hòa tan của cellulose. + Xác định bán kính vòng thủy phân trên môi trường thạch cellulose Các phương pháp thích hợp để xác định hoạt độ cellulase là các phương pháp xác định trực tiếp đơn vị hoạt động. Nồng độ enzyme trong dịch môi trường thường được biểu diễn bằng số đơn vị/ml. Độ hoạt động của enzyme được tính bằng đơn vị/ml môi trường hoặc g chế phẩm. Một đơn vị hoạt động là lượng enzyme phân giải cơ chất tạo thành 1 mg glucose sau 1 giờ tác dụng ở nhiệt độ 40oC, pH = 5,0 (Theo Công nghệ Enzyme, Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004). 2.2. Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính của cellulase 2.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Khi có đầy đủ cơ chất thì vận tốc của phản ứng enzym tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme. Ta có thể biểu diễn sự liên hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ enzym bằng biểu thức sau: V= k[E] Trong đó: V : Tốc độ phản ứng [E] : Nồng độ enzyme K : Hằng số tốc độ phản ứng Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng 0 Tố c độ ph ản ứn g (V ) Nồng độ [E] Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 8 Nồng độ enzyme càng lớn bao nhiêu thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều bấy nhiêu. Cũng có trường hợp khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng chậm. 2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Phản ứng khi có enzyme xảy ra ba giai đoạn: • Giai đoạn đầu: enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES. Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất. E + S ES • Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. • Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do. Hiện tượng này được xem xét trên cơ sơ phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất. Hình 4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme 2.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Cũng như các phản ứng hoá học thông thường, vận tốc phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên, do enzyme có bản chất là protein nên nó kém bền với nhiệt độ cho nên tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm dần và dẫn đến mức triệt tiêu. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC. Tại khoảng mà enzyme có thể tồn tại vận tốc phản ứng tăng từ 1,4-2 lần khi nhiệt độ tăng 10oC. Tố c độ ph ản ứn g (V ) Nồng độ cơ chất 0 Km 2 1 Vmax V Vmax Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 9 Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Q10 để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối thích của enzyme. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40-50oC. Nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau thì hoàn toàn khác nhau tuỳ thuộc vào nguồn gốc của chúng. Một số enzyme có nhiệt độ tối ưu ở 60oC, một số khác lại có nhiệt độ tối ưu ở 70oC. Enzyme cellulase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30- 45oC và bị vô hoạt ở 55- 62oC. Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm. Khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính. Ngược lại, ở nhiệt độ 0oC enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi tăng nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu. Nhiệt độ tối ưu của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH. Hình 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến tốc độ phản ứng của enzyme Đối với phần lớn enzyme cellulase thì khoảng nhiệt độ tối thích là 30-50oC, hoạt động mạnh ở 35-40oC. Khi nhiệt độ vượt quá 70oC thì enzyme này sẽ bất hoạt. (Theo Công nghệ Enzyme, Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Khi nhiệt độ cao thường gây cho enzyme mất hoạt tính. Phản ứng vô hoạt của enzyme dưới tác dụng của nhiệt độ thường biểu diễn theo phương trình bậc một. ln [ ][ ]0E E = - kt Trong đó: K: hằng số tốc độ phản ứng Tố c độ ph ản ứn g (V ) Nhiệt độ oC 0 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 10 E: nồng độ enzyme hoạt động ở thời gian t E0: nồng độ ban đầu của enzyme hoạt động Người ta thường sử dụng yếu tố nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thực phẩm. 2.2.4 Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH của môi trường, mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt là ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme. Hình 6. Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme Các enzyme từ các nguồn gốc khác nhau thì có pH tối thích khác nhau. Nhiều enzyme hoat động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên, cũng có nhiều enzyme hoạt động ở pH acid yếu. Một số khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid. Enzyme cellulase của Aspergillus có điểm đẳng điện và pH tối ưu nằm trong khoảng acid, hoạt động của cellulase đạt tối đa ở pH 4,5 và nhiệt độ 40oC. Đối với cellulase có nguồn gốc từ nấm mốc, pH hoạt động tối thích nằm trong khoảng 4,0-5,5. Người ta thường sử dụng ảnh hưởng của pH để điều hòa phản ứng trong bảo quản, chế biến lương thực, thực phẩm, trong tuyển chọn giống vi sinh vật,… 2.2.5 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm Chất kìm hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme. Các chất kìm hãm có thể là các ion kim loại, các anion, các hợp chất hữu cơ có phân tử nhỏ hoặc protein. Các chất kìm hãm có khả năng kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng giữa enzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được trạng thái cân bằng: Tố c độ ph ản ứn g 0 pH Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 11 E+ I EI Trong đó : E: enzyme I: chất kìm hãm K1, K-1: hằng số tốc độ phản ứng thuận nghịch Tùy thuộc vào bản chất tạo phức EI, bản chất của chất kìm hãm, người ta chia ra những chất kìm hãm sau:  Các chất kìm hãm cạnh tranh: các chất kìm hãm cạnh tranh là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch. Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Khi đó, chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động thì cơ chất sẽ không còn cơ hội tiếp cận với trung tâm này. Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và cơ chất làm giảm số lượng của các enzyme kết hợp với cơ chất. Do đó, cơ chất mất một phần khả năng tương tác, làm cho tốc độ phản ứng không tăng. Phản ứng trong trường hợp có chất cạnh tranh của phản ứng enzyme sẽ như sau: E + S ES E + P E + I EI P: Sản phẩm phản ứng  Các chất kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzyme ở vị trí khác với trung tâm hoạt động, làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme, làm giảm hoạt động xúc tác của nó dẫn đến giảm vận tốc phản ứng. Như vậy, phức hợp EI này sẽ làm thay đổi hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme. Sau khi kết hợp với chất kìm hãm để tạo thành phức hợp EI, enzyme vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất để tạo thành một phức hợp EIS như phản ứng sau: E + S ES E + P E + I EI ES + I EIS EI + S EIS  Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng: các sản phẩm phản ứng có thể đóng vai trò như chất kìm hãm không cạnh tranh. Nếu như phản ứng xảy ra do chất A và chất B, có sự K1 K -1 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 12 tham gia của enzyme để tạo thành sản phẩm P1 và P2 thì enzyme có ái lực với cả P1, P2 và cả chất A và chất B. Khi đó, sản phẩm P1 và P2 được xem như chất kìm hãm của enzyme.  Kìm hãm do thừa cơ chất: Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành chất kìm hãm phản ứng. Giả sử ta có phản ứng E + S ES E + P Nếu có cơ chất thứ hai tham gia và nó có khả năng đính vào một vị trí nào đó trên phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho enzyme không hoạt động, khi đó cơ chất thư hai này coi như chất kìm hãm. ES + S ESS 2.2.6 Các chất hoạt hóa Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme gọi là các chất hoạt hoá enzyme. Những chất hoạt hóa có tác dụng làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động trở thành hoạt động, từ hoạt động yếu trở thành hoạt động mạnh hơn. Các chất hoạt hóa thường có bản chất hóa học rất khác nhau, chúng có thể là: - Các chất hữu cơ phức tạp làm nhiệm vụ chuyển nhóm, chuyển gốc hóa học - Những chất có tác dụng phục hồi những nhóm hoạt động của trung tâm hoạt động enzyme - Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử proenzyme làm loại bỏ một vài đoạn peptid, tạo điều kiện cho các nhóm chức xích lại gần nhau để hình thành trung tâm hoạt động Ngoài ra, một số cation kim loại có bán kính từ 0,34 - 1,65 Ao ( Na+, K+, Ca2+, Mg2+ ) và các anion Cl-, Br-, I- cũng có tác dụng hoạt hóa enzyme. Trong quá trình hoạt hóa, các ion kim loại có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động, làm cầu nối giữa enzyme với cơ chất hoặc làm nhiệm vụ ổn định cấu trúc không gian cần cho sự xúc tác của enzyme. Những nguyên tố khoáng ( Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu,… ) có ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp cellulase của vi sinh vật. Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành enzyme này ở nhiều chủng. Nồng độ tối thích của Zn là._. 0,11 – 2,2 mg/l, Fe từ 2 – 10 mg/l, Mn từ 3,4 – 27,2 mg/l. (Theo Vi Sinh Vật học Công nghiệp, Nguyễn Đức Lượng, 2002) 2.3. Một số ứng dụng của cellulase trong công nghiệp 2.3.1 Trong công nghiệp rượu bia Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 13 Có vai trò quan trọng thủy phân hạt đại mạch trước khi dịch hóa phục vụ cho việc lên men sản xuất rượu bia. 2.3.2 Trong sản xuất thức ăn gia súc Cellulase kết hợp với pectinase thành phức hợp enzyme có thể tăng khả năng tiêu hóa cho gia súc đối với các loại thức ăn cứng, góp phần tận dụng tối đa vật liệu thừa thải làm thức ăn cho vật nuôi, hạ giá thành thức ăn. 2.3.3 Trong công nghiệp dệt, giấy, ô nhiễm môi trường Thủy phân cây bông trong dệt, thủy phân gỗ trong sản xuất giấy… Đặc biệt các chế phẩm cellulase thô được sử dụng nhiều trong xử lý ô nhiễm môi trường 2.3.4 Trong kỹ thuật di truyền Chế phẩm enzyme cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền. Người ta dùng enzyme phá vỡ thành tế bào thực vật 2.4. Sản xuất cellulase từ vi sinh vật 2.4.1 Sinh tổng hợp cellulase ở vi sinh vật Cellulase là 1 phức hệ bao gồm 3 loại enzyme cơ bản: Endo-β-glucanase (hay còn gọi là cellulase Cx) , exo-β-glucanase (hay còn gọi là cellulase C1), β-glucoside glucohydrolase (β-glucosidase). Trong thiên nhiên thì không có 1 loài vi sinh vật nào có khả năng cùng 1 lúc sinh tổng hợp ra tất cả các loại enzyme trong phức hệ này được. Ví dụ như trong nghiên cứu này thì loài nấm sợi Aspergillus chỉ có thể sản xuất phần lớn endo-β-glucanase và β-glucosidase còn dòng nấm Trichoderma sản xuất nhiều endo-β- glucanase và exo-β-glucanase. Do đó nếu muốn thủy phân cellulase một cách triệt để thì phải phối hợp nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Do đề tài nghiên cứu có hạn nên chúng tôi chỉ nghiên cứu về chủng mốc Aspergillus đồng thời sử dụng cơ chất CMC để khảo sát nó. 2.4.2 Môi trường nuôi cấy • Nguyên liệu Môi trường sử dụng nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme thường là cám gạo, hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc nảy mầm. Trong các loại nguyên liệu trên thì cám gạo, cám mì thường được sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại cám này có đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật phát triển. Mặt khác, khi tạo môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 14 chuyển trong khối nguyên liệu. Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là các muối ammonium, phosphat,… Trong nhiều trường hợp, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với lượng khoảng 15-25%. Thực chất, việc cho trấu vào là làm tăng độ xốp của môi trường, tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng môi trường. Khi nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme cellulase, người ta thường cho thêm vào mùn cưa hoặc bã mía (có chứa nhiều cellulose) như chất cảm ứng để làm tăng quá trình tổng hợp enzyme này. Bảng 1. Thành phần dinh dưỡng của cám ( Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) 1 2 3 4 5 6 Năng lượng Nước Protein thô Lipid Glucid tổng số Cellulose 350 – 426 KCal 12 – 14% 10 – 12,2% 20 – 22,7% 40,3 – 42% 6,3 – 7% 7 8 9 10 11 Tro Calcium Phospho Sắt Vitamin B1 6,0 – 6,5% 30 – 32 mg% 4,5 – 4,6 mg% 10 –14 mg% 0,96 –1 mg% • Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Trong quá trình chuẩn bị môi trường, điều quan trọng nhất là tạo được độ ẩm thích hợp. Độ ẩm thích hợp cho nhiều vi sinh vật khi nuôi cấy trong môi trường cám là 55-60%. Độ ẩm vượt quá 60% thường tạo điều kiện cho nhiều vi khuẩn phát triển, khi đó dễ xảy ra nhiễm vi sinh vật lạ. Nếu độ ẩm < 60% (thường 45-50%) thường gây hiện tượng tạo nhiều bào tử ở nấm sợi, và như vậy thì enzyme thu sẽ giảm hoạt tính rất mạnh. Sau khi chuẩn bị xong môi trường, ta tiến hành thanh trùng môi trường để tiêu diệt các vi sinh vật nhiễm vào môi trường mà có thể ức chế sự phát triển của giống vi sinh vật mà ta sẽ nuôi cấy. Thông thường, môi trường sẽ được thanh trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC trong thời gian 15-30 phút. Môi trường nuôi cấy sẽ được trãi đều vào các khay và tiến hành trộn giống vi sinh vật vào khối môi trường sao cho thật đều. Thời gian nuôi cấy nấm sợi để thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ, riêng đối với sản xuất cellulase là khoảng 36-48 giờ. 2.4.3 Giống vi sinh vật Bảng 2. Các nguồn vi sinh vật để sản xuất enzyme Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 15 Enzyme cellulase từ vi sinh vật được sản xuất dưới nhiều dạng khác nhau như dạng thô, dạng tinh khiết, dạng tinh thể. Tuy nhiên, chúng đều được sản xuất bằng hai phương pháp nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy bề sâu. Cellulase có thể sản xuất từ nhiều nguồn nấm mốc và vi khuẩn. Nguồn nấm mốc Enzyme Aspergillus melleus Protease A. niger Alpha-Amylase Endoarabinase Glucoamylase Hemicellulase Pectinase Xylanase Cellulase A. oryzae Alpha-Amylase Cellulase Glucoamylase Hemicellulase Lipase Pectinase Protease Penicillium emersonii Cellulase Glucanase Xylanase P. funiculosum Cellulase Cellobiase Glucosidase Dextranase Glucanase Glucoamylase Pectinase Xylanase Rhizopus niveus Glucoamylase Trichoderma harzianum Cellulase Glucanase Glucosidase Hemicellulase Xylanase Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 16 Trong luận văn này, tôi sẽ chọn nấm sợi Aspergillus oryzae với các cơ chất nuôi cấy thích hợp để sản xuất enzyme cellulase. Asp. oryzae thuộc lớp nang khuẩn Ascomycetes, bộ cúc khuẩn Plectascales, họ Aspergillaceae, giống Aspergillus là nấm mốc sinh sản vô tính bằng cách tạo thân quả hoặc cuống bào tử đính. Bào tử đính là tập hợp của những khuẩn ty cao xuất phát từ một tế bào lớn. Các nang quả phình to ở nang trên, chổ phình to có dạng hình cầu, hình bầu dục hoặc hình chùy được gọi là túi định. Xung quanh túi định có vô vàn những mầm nhỏ gọi là thể bình mọc ra khắp mọi hướng, ở phần cuối của các mầm này gọi là các bào tử đính. Aspergillus oryzae có bào tử đính màu vàng hoa cau. Hình 7. Hình dạng nấm sợi ( Nguồn từ 2.4.4 Phương pháp nuôi cấy Để nuôi cấy nấm Aspergillus oryzae sản xuất enzyme cellulase ta lựa chọn phương pháp nuôi cấy bề mặt với môi trường rắn. Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường hay trên bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm. Thông thường, môi trường dạng rắn với nguyên liệu chín là bột cám mì, bã củ cải, bột bắp nghiền, hạt thóc nẩy mầm, trấu và bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác (amonium sulfat, amonium clorua, amonium phosphat). Phương pháp này phát triển rất mạnh từ những năm 1970 đến nay. Những ưu điểm cơ bản của phương pháp nuôi cấy bề mặt: - Dễ thực hiện, quy trình công nghệ đơn giản Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 17 - Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm - Sản phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản - Khi bị nhiễm sinh vật lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường rắn khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt trãi qua các giai đoạn sau: • Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy, lúc này bào tử bắt đầu trương nở và hô hấp. Ở giai đoạn này có xảy ra nhiều biến đổi. + Nhiệt độ tăng rất chậm + Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa + Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi + Khối môi trường còn rời rạc + Enzyme mới bắt đầu được hình thành. • Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: + Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh, có thể nhìn rõ được sợi nấm + Môi trường được kết lại khá chặt + Độ ẩm môi trường giảm dần + Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể đạt tới 40-45oC + Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hóa mạnh của nấm sợi + Các enzyme được hình thành và enzyme nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ được tạo ra nhiều hơn + Lượng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh là tốt nhất. • Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-12 giờ. Lúc này nhiệt độ khối môi trường sẽ giảm dần, cường độ hô hấp giảm dần một cách rõ rệt. Màu sắc của sợi nấm bắt đầu thay đổi và thể hiện màu đặc trưng, enzyme hình thành và có hoạt tính mạnh nhất khi bào tử bắt đầu phát triển mạnh. Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 18 2.4.5 Thu nhận enzyme Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme. Chế phẩm này được gọi là chế phẩm thô vì ngoài thành phần enzyme ra chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong môi trường. Tùy theo mục đích sử dụng, ta có thể dùng chế phẩm thô này ngay không cần qua quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzyme. Khi enzyme được tách hết nước, sinh khối vi sinh vật và thành phần môi trường và chúng ở dạng tinh thể, ta thu được chế phẩm enzyme sạch. Để thu nhận được chế phẩm enzyme cellulase tinh khiết thì chế phẩm enzyme thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối ammonium sulfate. Dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa enzyme cellulase có thể là ethanol. Dung môi hữu cơ có tác dụng làm giảm hệ số điện môi của môi trường thì protein và enzyme bị kết tủa. Khi kết tủa bằng ethanol thì lượng ethanol sử dụng phải gấp 3-4 lần dịch chiết enzyme, nên khuấy đều để phân phối ethanol trong dung dịch. Khi có kết tủa thì lọc hoặc ly tâm để thu kết tủa, rửa kết tủa bằng rượu đậm đặc 2-3 lần để tách bớt nước trong kết tủa và sau đó đem sấy kết tủa. Ngoài ra, cũng có thể dùng muối trung tính là amonium sulfat để kết tủa enzyme vì độ hoà tan của muối rất cao, sự kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ, không làm biến tính enzyme, enzyme thu được có hoạt tính cao hơn so với các enzyme thu được bằng phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ. Tuy nhiên, khi sử dụng muối trung tính cũng có nhược điểm là lượng dung dịch dùng gấp 5-6 lần dịch chiết enzyme và không thể tái thu hồi được dung môi. Để đảm bảo chế phẩm enzyme thu được không mất hoạt tính nhanh, người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp. Độ ẩm cần đạt sau khi kết thúc quá trình sấy là <10 %W. Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi, ta thường sấy enzyme ở nhiệt độ 38-40oC. Ở nhiệt độ này phần lớn enzyme ít bị biến đổi. Còn nếu ta sấy ở nhiệt độ cao quá 40oC, enzyme rất dễ bị biến tính. 2.4.6 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự tổng hợp cellulase + Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng Nitơ tham gia vào quá trình tạo protein, acid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào vi sinh vật. Trong môi trường lên men nitơ thường được bổ sung dưới dạng muối nitrat, các hợp chất amon hoặc 1 số chất có nguồn gốc vi sinh vật. Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 19 + Ảnh hưởng của acid amin - Acid amin là những cấu tử hợp thành phân tử enzyme. Acid amin có ảnh hưởng tốt đến sinh lý vi sinh vật cũng như sinh tổng hợp enzyme do những nguyên nhân sau: - Acid amin có thể vừa là nguồn C vừa là nguồn N và năng lượng. - Acid amin có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kìm chế sinh tổng hợp enzyme. + Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng Những nguyên tố khoáng (Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu,…) có ảnh hưởng rõ đến khả năng tổng hợp cellulase của vi sinh vật. Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành enzyme này ở nhiều chủng. Nồng độ tối thích của Zn là 0,11-2,2 mg/l, Fe 2-10 mg/l, Mn 3,4-27,2 mg/l. + Ảnh hưởng của pH nguyên liệu Ph ban đầu của môi trường cũng ảnh hưởng không nhỏ tới sự phát triển của nấm mốc và sự tạo enzyme. Ở điều kiện pH 4,5 – 5 tạo điều kiện chọn lọc cho nấm mốc phát triển. Mỗi loại vi sinh vật có một pH tối thích nhất định, tại pH đó nó cho enzyme có hoạt tính cao nhất. Riêng đối với sản xuất cellulase từ nấm sợi thì pH tối thích khoảng 4,5-5. (Theo Vi Sinh Vật học công nghiệp, Nguyễn Đức Lượng, 2002) + Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường là 60-65% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm mà tăng quá 60-70 % sẽ làm giảm độ thoáng khí, cò thấp hơn 50-55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. + Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Chia ra làm 3 thời kì: - Thời kì 1: khoảng 10-14 h đầu bào tử trương nở bắt đầu nảy mầm. Thời kì này chưa hình thành enzyme, nhiệt độ nuôi tối ưu khoảng 23-30oC. - Thời kì 2: kéo dài 14-18 h, mốc phát triển nhanh, hô hấp mạnh. Thời kì này cần giữ ở 28-29oC. - Thời kì 3: khoảng 10-20 h. Thời kì này cần giữ nhiệt độ buồng nuôi tối ưu khoảng 30oC. 2.5. Kỹ thuật sản xuất cellulase từ vi sinh vật 2.5.1 Sơ đồ kỹ thuật sản xuất chế phẩm cellulase Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 20 2.5.2 Thuyết minh qui trình  Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy bề mặt của vi sinh vật tạo enzyme pectinmethylesterase gồm 60 - 70% là bột cám, 15-20% trấu, nguyên liệu chứa cơ chất cảm ứng tổng hợp enzyme cellulase tương ứng là 5 % mùn cưa và bổ sung amonium sulfat và amonium clorua 1%, Môi trường Trích ly bằng nước Lọc Kết tủa cellulase Ly tâm Sấy kết tủa Chế phẩm cellulase Nghiền và bảo quản Aspergillus oryzae Hình 8. Sơ đồ kỹ thuật sản xuất chế phẩm cellulase Thu dịch chứa enzyme Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 21 amonium phosphat 2%. Độ ẩm môi trường là 55-60% . Đem môi trường thanh trùng ở 121oC trong vòng 15 phút. Sau khi thanh trùng, môi trường được làm nguội và bắt đầu cấy giống vi sinh vật là Aspergillus oryzae vào môi trường đã được trộn đều, trải mỏng trên khay. Tiến hành nuôi nấm sợi trong tủ úm ổn định ở nhiệt độ khoảng 30oC. Trong khoảng 36 giờ thì kết thúc quá trình nuôi. Khi nấm sợi bắt đầu chớm tạo ra bào tử là thời gian enzyme được tạo ra nhiều nhất. Ta nên thu nhận chế phẩm enzyme thô ở giai đoạn này.  Trích ly enzyme Chiết tách enzyme từ môi trường rắn người ta thường dùng nước, các dung dịch muối trung tính,… có thể chiết tách được 90- 95% và trong nước chiết không chứa tạp chất không tan. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào một ít focmalin hoặc chất sát trùng khác. Chiết tách enzyme người ta dùng nước (25-28oC) và lọc, sau đó tủa enzyme bằng ethanol. Khi cho dung môi vào dung dịch enzyme làm giảm khả năng tan của nước bao quanh enzyme. Dung môi hữu cơ này làm giảm hằng số điện môi của môi trường, đẩy một lượng nước lớn. Vì vậy các enzyme, cũng như các chất có phân tử thấp trong hệ dung dịch nước dung môi sẽ tủa và lắng xuống. Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch cồn- nước phụ thuộc vào nồng độ cồn, nhiệt độ, pH, lực hút ion của dung dịch và tính chất enzyme của protein. Để tránh mất hoạt tính của enzyme, tất cả phải làm lạnh xuống 3-5oC. Khi trộn phải khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa lắng xuống phải ly tâm ngay. Dùng ethanol kết tủa có nồng độ 60-70% hoặc có thể dùng aceton 60% và giữ pH 5,5-5,6 bằng (NH4)2SO4 (600g/lít).  Ly tâm Là quá trình tách vật rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận enzyme, dung dịch này chứa enzyme ngoại bào. Phần lớn enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan. Như vậy, khi tiến hành ly tâm, dung dịch tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thô vì ngoài enzyme trong dung dịch còn có nước, protein không hoạt động và các chất hòa tan khác. Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, người ta thường tiến hành ly tâm lạnh (3- 5oC).  Sấy kết tủa Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 22 Dịch enzyme sau khi ly tâm, ở trạng thái này enzyme rất dễ biến tính vì còn nhiều nước. Để dễ bảo quản, ta tiến hành sấy kết tủa enzyme ở nhiệt độ < 40oC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5- 8%.  Nghiền và bảo quản Sau khi sấy, enzyme được nghiền mịn thành dạng bột cho vào bao bì kín (chai lọ hoặc túi polyetylen), bảo quản ở nhiêt độ lạnh. Chế phẩm enzyme này gọi là chế phẩm dạng rắn thô. Muốn có chế phẩm tinh khiết phải qua giai đoạn tinh chế. Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 23 CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu sản xuất Bao gồm cám, trấu, bột gạo, mùn cưa. 3.2. Đối tượng nghiên cứu Nấm sợi Apergillus oryzae 3.3. Dụng cụ, hóa chất + Các dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật: khay, đĩa petri… + Máy hút chân không, máy xay khô + Tủ ấm + Máy đo pH, đo độ ẩm + Một số dụng cụ và thiết bị khác. Hình 9. Máy phân tích ẩm Hình 10. Máy đo pH Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 24 Địa điểm tiến hành thí nghiệm: phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp&Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. 3.4. Phương pháp thí nghiệm Thí nghiệm sẽ được tiến hành theo qui trình, đầu tiên là chuẩn bị môi trường dùng cho thí nghiệm sau đó cấy chủng vi sinh vật cần nghiên cứu vào (phải đảm bảo môi trường đã được vô trùng trước), chờ đúng thời gian rồi thu nhận môi trường đem đi khảo sát hoạt tính enzyme thu được. Thí nghiệm tiến hành qua 2 giai đoạn: giai đoạn 1 sẽ khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường và thời gian nuôi đến hoạt tính cellulase rồi chọn kết quả tối ưu nhất để chuẩn bị cho giai đoạn 2: khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, độ ẩm môi trường đến hoạt tính cellulase. Rút ra được từ 2 giai đoạn thí nghiệm trên, ta sẽ có được tất cả các yếu tố tối ưu cần thiết để nuôi cấy nấm sợi cho enzyme có họat tính cao nhất nhằm có thể áp dụng vào trong sản xuất. 3.4.1 Quy trình thí nghiệm tham khảo Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 25 Hình 11. Qui trình thí nghiệm sản xuất cellulase Nguyên liệu môi trường Xử lý nguyên liệu Cellulase thô Nghiền mịn Hấp thanh trùng (1200C, 15 phút) Làm nguội Cho vi sinh vật vào nuôi cấy Thu nhận môi trường sau nuôi cấy Sấy lạnh Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 26 3.4.2 Tiến hành thí nghiệm Tiến hành 2 giai đoạn thí nghiệm Giai đoạn thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khác nhau và thời gian nuôi đến sự tổng hợp cellulase. - Mục đích: Xác định thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp để sản xuất cellulase có hoạt tính cao nhất - Nguyên liệu: - Cám, trấu, bột gạo, mùn cưa. - Tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm gồm có các nhân tố + Nhân tố A: thành phần môi trường nuôi • A1: 75% cám + 15% trấu + 9% mùn cưa + 1% bột • A2: 75% cám + 20% trấu + 4% mùn cưa + 1% bột + Nhân tố B: thời gian nuôi • B1: 30 giờ • B2: 40 giờ • B3: 45 giờ • B4: 50 giờ + Tổng cộng số nghiệm thức: 4x2 = 8 + Số lần lặp lại: 3 Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau Hình 12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 A1 A2 B1 B2 B3 B4 B1 B2 B3 B4 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 27 + Chuẩn bị mỗi mẫu 100 g, hấp thanh trùng và chuẩn pH, ẩm độ (pH từ 4,5-5,5; ẩm độ từ 60-65%). Tiến hành thí nghiệm theo qui trình. Nguyên liệu được xử lý, hấp thanh trùng sau đó nuôi cấy theo thời gian B với thành phần môi trường A. Sau đó thu enzyme và khảo sát hoạt tính (sử dụng cơ chất là hợp chất CMC). + Chỉ tiêu theo dõi: hoạt tính enzyme cellulase thu được + Kết quả tối ưu được chọn làm cơ sở cho thí nghiệm sau. Giai đoạn thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến sự tạo thành cellulase - Mục đích: Xác định điều kiện môi trường thích hợp cho sự phát triển và tạo thành cellulase - Nguyên liệu: kết quả tối ưu của thí nghiệm 1. - Tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm gồm có các nhân tố + Nhân tố C: pH của môi trường • C1: 4,5 • C2: 5,0 • C3: 5,5 + Nhân tố D: nhiệt độ nuôi • D1: 25oC • D2: 30oC • D3: 35oC + Nhân tố E: độ ẩm môi trường • E1: 55% • E2: 60% • E3: 65% * Tổng số nghiệm thức: 27 * Số lần lặp lại: 2 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 28 Thí nghiệm được tiến hành theo qui trình. Nguyên liệu được xử lý, hấp thanh trùng và sau đó trộn giống vi sinh vật rồi nuôi ở nhiệt độ D, độ ẩm môi trường E, pH môi trường F. Thu enzyme và khảo sát hoạt độ. + Chỉ tiêu theo dõi: hoạt tính cellulase thu được. Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau Hinh13. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 3.4.3 Phân tích thống kê Số liệu sau khi thu thập được tính toán và phân tích thống kê theo phương pháp ANOVA, sử dụng phần mềm thống kê StatGraphics Plus 4.0 Kết quả thống kê sẽ được thể hiện ở phần phụ lục. C2 C1 C3 D1 D2 D3 D1 D2 D3 D1 D2 D3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 29 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN Quá trình tạo enzyme của nấm mốc phụ thuộc và nhiều yếu tố, mỗi yếu tố có ảnh hưởng riêng đối với lượng cũng như hoạt tính enzyme tạo thành. Các yếu tố bao gồm: thời gian, thành phần môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, pH, độ ẩm,… Nấm mốc được cấy vào môi trường nuôi đã được thanh trùng, sau thời gian nuôi cấy, thu môi trường và thử hoạt tính cellulase tạo thành. Kết quả khảo sát các yếu tố thể hiện như sau: 4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy đến sự tạo thành cellulase Thí nghiệm được tiến hành bằng cách nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae trên các môi trường khác nhau, thu nhận môi trường sau nuôi cấy ở các khoảng thời gian khác nhau và đo hoạt tính enzyme thu được. Với: A1 là mẫu 75% cám + 15% trấu + 9% mùn cưa + 1% bột gạo A2 là mẫu 75% cám + 20% trấu + 5% mùn cưa + 1% bột gạo B1 là mẫu 30 giờ B2 là mẫu 40 giờ B3 là mẫu 45 giờ B4 là mẫu 50 giờ Hoạt tính cellulase riêng Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi và thời gian nuôi cấy đến hoạt tính riêng của cellulase được thể hiện ở bảng và hình sau: Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 30 Bảng 3. Hoạt tính riêng của cellulase Môi trường Thời gian nuôi (giờ) Môi trường- thời gian Hoạt tính cellulase riêng (đv/g) Hoạt tính cellulase riêng trung bình (đv/g) 16,5 15,9 30 A1B1 16,5 16,3f 44,23 38,16 40 A1B2 41,55 41,31a 32,4 30,4 45 A1B3 31,75 31,52bc 27,53 25,88 A1 (75% cám+ 15% trấu+9% mùn cưa+1% bột gạo 50 A1B4 26,25 26,55d 28,92cd 14,7 15,3 30 A2B1 15 15,0f 36,44 30,44 40 A2B2 34,1 33,66b 25,68 26,92 45 A2B3 28,5 27,03d 24,28 22,84 A2 ((75% cám+ 20% trấu+4% mùn cưa+1% bột gạo 50 A2B4 23,75 23,62e 24,83de Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 31 SỰ PHỤ THUỘC HOẠT TÍNH CELLULASE VÀO MÔI TRƯỜNG VÀ THỜI GIAN 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1 2 3 4 THỜI GIAN NUÔI CẤY H O Ạ T TÍ N H TR U N G BÌ N H A1 A2 Hình 14. Đồ thị biểu diễn hoạt tính cellulase riêng Ở Bảng 3, ta thấy ở hai kiểu môi trường nuôi cấy A1và A2, thu được enzyme có hoạt tính cellulase riêng trung bình khác biệt có ý nghĩa ở mức 5%. Ở Hình 14, ta thấy trên kiểu môi trường nuôi cấy A1 và A2 hoạt tính enzyme tăng dần khi thời gian nuôi cấy tăng từ 30 đến 40 giờ và sau đó giảm dần khi nuôi đến 50 giờ. Tuy nhiên, hoạt tính cellulase riêng trung bình thu được ở 40 giờ là cao nhất. Như vậy, 40 giờ là thời điểm nấm mốc sinh enzyme cho hoạt tính mạnh nhất Hoạt tính cellulase riêng cao nhất thu được trên kiểu môi trường A1 (75% cám, 15% trấu và 9% mùn cưa, 1% bột gạo) với thời gian nuôi cấy 40 giờ (41,31 đv/g). . Hoạt tính cellulase tổng Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi và thời gian nuôi cấy đến hoạt tính tổng của cellulase được thể hiện ở bảng và hình sau: 30 40 45 50 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 32 Bảng 4. Hoạt tính tổng của cellulase . Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) - Ý nghĩa của việc xác định hoạt tính tổng: Giúp đánh giá kết quả tổng quát hơn vì khối lượng môi trường cũng phụ thuộc vào thời gian, pH, nhiệt độ, độ ẩm và thành phần môi trường cũng như thời gian nuôi. Cách xác định hoạt tính tổng: hoạt tính tổng bằng hoạt tính riêng nhân với khối lượng môi trường sau nuôi cấy (Theo Công nghệ Enzyme, Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Môi trường Thời gian nuôi (giờ) Khối lượng môi trường sau nuôi cấy (g) Hoạt tính cellulase riêng (đv/g) Hoạt tính cellulase tổng (đv) Hoạt tính cellulase tổng trung bình (đv) 75,8 16,5 1250,70 76,4 15,9 1214,76 30 76,4 16,5 1260,60 1242,02f 76 44,23 3361,48 76,3 38,16 2911,61 40 77,2 41,55 3207,66 3160,25a 75 32,4 2430,00 78,1 30,4 2374,24 45 77,3 31,75 2454,28 2419,51b 78,2 27,53 2152,85 76,9 25,88 1990,17 A1 (75% cám+ 15% trấu+9% mùn cưa+1% bột gạo) 50 78,5 26,25 2060,63 1381,01c 2050,70de 76,6 14,7 1126,02 75,7 15,3 1158,21 30 79 15 1185,00 1156,41f 78,1 36,44 2845,96 77,3 30,44 2353,01 40 77,8 34,1 2652,98 2617,32b 77,6 25,68 1992,77 78 26,92 2099,76 45 78,3 28,5 2231,55 2108,03c 76,5 24,28 1857,42 75,7 22,84 1728,99 A2 (75% cám+ 20% trấu+4% mùn cưa+1% bột gạo) 50 77,8 23,75 1847,75 1811,39e 1923,29de Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 33 SỰ PHỤ THUỘC HOẠT TÍNH TỔNG VÀO MÔI TRƯỜNG VÀ THỜI GIAN 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 1 2 3 4 THỜI GIAN NUÔI CẤY H OẠ T TÍN H TỔ NG A1 A2 Hình 15. Đồ thị biểu diễn hoạt tính cellulase tổng Ta có hoạt tính cellulase tổng là tích của hoạt tính cellulasse riêng nhân với khối lượng môi trường thu được sau nuôi cấy được tính toán và thể hiện ở Bảng 4 và Hình 15. Ở Bảng 4, ta thấy cũng tương tự như hoạt tính cellulase riêng hoạt tính cellulase tổng trên hai kiểu môi trường A1 và A2 thu được có trung bình khác biệt, có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. . Ở Hình 15, ta thấy hoạt tính enzyme tăng nhanh theo thời gian đầu từ 30 đến 40 giờ nuôi cấy và đạt giá trị cực đại ở 40 giờ nuôi trên môi trường A1 và A2, sau đó giảm dần đến 50 giờ. Kết quả thống kê thí nghiệm được trình bày ở Bảng 4 cho thấy hoạt tính cellulase tổng thu được trên môi trường A1 khi nuôi trong 40 giờ có nghiệm thức thí nghiệm lớn nhất (3160,25 đv) tương ứng với hoạt tính enzyme thu được là cao nhất. 30 40 45 50 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 34 Tóm lại, môi trường A1 là môi trường tốt nhất để thu được cellulase có hoạt tính cao nhất và thời gian nuôi 40 giờ cho hoạt tính cao nhất. 4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng điều kiện môi trường đến sự tạo thành enzyme cellulase Thí nghiệm được tiến hành bằng cách nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae trên các môi trường khác nhau về độ ẩm, pH và nhiệt độ khi nuôi cấy. Sau đó tiến hành đo hoạt tính enzyme thu được. Hoạt tính cellulase riêng Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính riêng của cellulase Bảng 5. Hoạt tính cellulase riêng trung bình theo nhiệt độ môi trường nuôi cấy Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) theo phép thử XXX Ở nhiệt độ nuôi cấy 30oC (pH 5,0 và độ ẩm 55%), hoạt tính cellulase thu được là cao nhất. Trong khi ở nhiệt độ nuôi cấy 25oC, hoạt tính cellulase thu được là thấp nhất, sự khác biệt này là có ý nghĩa 5%. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến hoạt tính riêng của pectinmethylesterase Bảng 6. Hoạt tính cellulase riêng trung bình theo pH môi trường nuôi cấy pH Hoạt tính cellulase riêng trung bình (đv/g) 4,5 27,17c 5,0 32,84a 5,5 30,49b Ghi chú: các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05) theo phép thử XXX Ở pH môi trường 4,5, 5,0 và 5,5 cellulase riêng thu được có hoạt tính khác biệt có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%. Ở pH 5,0 (nhiệt độ 300C và độ ẩm 55%) cho hoạt tính riêng của cellulase cao nhất. Nhiệt độ (0C) Hoạt tính cellulase riêng trung bình (đv/g) 25 26,84c 30 33,4a 35 30,25b Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nôn._.hụ thuộc vào độ ẩm. SỰ PHỤ THUỘC CỦA HOẠT TÍNH VÀO ĐỌ ẨM Ở NHIỆT ĐỘ 35 VÀ PH 5,5. ANOVA Table for HOAT TINH 8 by MAU 8 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xvi Between groups 36.5733 2 18.2867 9.43 0.0509 Within groups 5.82 3 1.94 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 42.3933 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên thì P- value bằng 0,0509 chứng tỏ giữa các mẫu không có sự khác biệt ý nghĩa. Multiple Range Tests for HOAT TINH 8 by MAU 8 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 8 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C3D3E3 2 27.4 X C3D3E1 2 31.5 XX C3D3E2 2 33.3 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C3D3E1 - C3D3E2 -1.8 4.43264 C3D3E1 - C3D3E3 4.1 4.43264 C3D3E2 - C3D3E3 *5.9 4.43264 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Ở nhiệt độ 350C và pH 5,5 hoạt tính không phụ thuộc vào độ ẩm. SỰ PHỤ THUỘC HOẠT TÍNH VÀO NHIỆT ĐỘ Ở ĐỘ ẨM 50 % VÀ PH 4,5 ANOVA Table for HOAT TINH 9 by MAU 9 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 7.56333 2 3.78167 2.11 0.2673 Within groups 5.365 3 1.78833 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 12.9283 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy giá trị P- Value bằng 0,26 chứng tỏ giữa các mẫu không có sự khác biệt ý nghĩa. Multiple Range Tests for HOAT TINH 9 by MAU 9 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 9 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1D1E1 2 25.75 X C1D2E1 2 27.1 X C1D3E1 2 28.5 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1D1E1 - C1D2E1 -1.35 4.25584 C1D1E1 - C1D3E1 -2.75 4.25584 C1D2E1 - C1D3E1 -1.4 4.25584 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Ở độ ẩm 50% và pH 4.5 hoạt tính không phụ thuộc nhiệt độ. SỰ PHỤ THUỘC HOẠT TÍNH VÀO NHIỆT ĐỘ Ở ĐỘ ẨM 55 % VÀ PH 4,5 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xvii ANOVA Table for HOAT TINH 10 by MAU 10 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 9.64 2 4.82 1.15 0.4247 Within groups 12.52 3 4.17333 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 22.16 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy giá trị P- Value bằng 0,42 chứng tỏ giữa các mẫu không có sự khác biệt ý nghĩa. Multiple Range Tests for HOAT TINH 10 by MAU 10 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 10 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1D1E2 2 27.4 X C1D3E2 2 29.1 X C1D2E2 2 30.5 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1D1E2 - C1D2E2 -3.1 6.50134 C1D1E2 - C1D3E2 -1.7 6.50134 C1D2E2 - C1D3E2 1.4 6.50134 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Ở độ ẩm 55% và pH 4.5 hoạt tính không phụ thuộc nhiệt độ. SỰ PHỤ THUỘC HOẠT TÍNH VÀO NHIỆT ĐỘ Ở ĐỘ ẨM 60 % VÀ PH 4,5 ANOVA Table for HOAT TINH 11 by MAU 11 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 10.5733 2 5.28667 4.26 0.1328 Within groups 3.72 3 1.24 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 14.2933 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy giá trị P- Value bằng 0,42 chứng tỏ giữa các mẫu không có sự khác biệt ý nghĩa. Multiple Range Tests for HOAT TINH 11 by MAU 11 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 11 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1D1E3 2 24.1 X C1D2E3 2 24.8 X C1D3E3 2 27.2 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1D1E3 - C1D2E3 -0.7 3.54383 C1D1E3 - C1D3E3 -3.1 3.54383 C1D2E3 - C1D3E3 -2.4 3.54383 -------------------------------------------------------------------------------- Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xviii * denotes a statistically significant difference. Ở độ ẩm 60 % và pH 4.5 hoạt tính không phụ thuộc nhiệt độ. * Kết luận: Hoạt tính không phụ thuộc nhiệt độ ở pH 4,5. SỰ PHỤ THUỘC HOẠT TÍNH VÀO NHIỆT ĐỘ Ở ĐỘ ẨM 50 % VÀ PH 5,0 ANOVA Table for HOAT TINH 12 by MAU 12 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 67.36 2 33.68 19.36 0.0193 Within groups 5.22 3 1.74 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 72.58 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy giá trị P- Value bằng 0,01 chứng tỏ giữa các mẫu có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 1%. Multiple Range Tests for HOAT TINH 12 by MAU 12 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 12 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C2D1E1 2 26.9 X C2D3E1 2 30.7 X C2D2E1 2 35.1 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C2D1E1 - C2D2E1 *-8.2 4.19794 C2D1E1 - C2D3E1 -3.8 4.19794 C2D2E1 - C2D3E1 *4.4 4.19794 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Mẫu C2D2E1 có khác biệt cao nhất so với các mẫu khác. Ở pH = 5 và độ ẩm 50%, nhiệt độ nuôi 300C cho hoạt tính cao nhất SỰ PHỤ THUỘC HOẠT TÍNH VÀO NHIỆT ĐỘ Ở ĐỘ ẨM 55 % VÀ PH 5,0 ANOVA Table for HOAT TINH 13 by MAU 13 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 249.293 2 124.647 52.97 0.0046 Within groups 7.06 3 2.35333 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 256.353 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy giá trị P- Value bằng 0,004 chứng tỏ giữa các mẫu có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 1%. Multiple Range Tests for HOAT TINH 13 by MAU 13 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 13 Count Mean Homogeneous Groups Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xix -------------------------------------------------------------------------------- C2D1E2 2 29.5 X C2D3E2 2 33.4 X C2D2E2 2 44.7 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C2D1E2 - C2D2E2 *-15.2 4.88206 C2D1E2 - C2D3E2 -3.9 4.88206 C2D2E2 - C2D3E2 *11.3 4.88206 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Mẫu C2D2E2 có khác biệt cao nhất so với các mẫu khác. Ở pH = 5 và độ ẩm 55%, nhiệt độ nuôi 300C cho hoạt tính cao nhất SỰ PHỤ THUỘC HOẠT TÍNH VÀO NHIỆT ĐỘ Ở ĐỘ ẨM 60 % VÀ PH 5,0 ANOVA Table for HOAT TINH 14 by MAU 14 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 91.2133 2 45.6067 15.69 0.0258 Within groups 8.72 3 2.90667 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 99.9333 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy giá trị P- Value bằng 0,025 chứng tỏ giữa các mẫu có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 1%. Multiple Range Tests for HOAT TINH 14 by MAU 14 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 14 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C2D1E3 2 27.3 X C2D3E3 2 31.2 X C2D2E3 2 36.8 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C2D1E3 - C2D2E3 *-9.5 5.42574 C2D1E3 - C2D3E3 -3.9 5.42574 C2D2E3 - C2D3E3 *5.6 5.42574 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Mẫu C2D2E3 có khác biệt cao nhất so với các mẫu khác. Ở pH = 5 và độ ẩm 60%, nhiệt độ nuôi 300C cho hoạt tính cao nhất * Kết luận: Ở pH bằng 5,0 hoạt tính phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi ở mức ý nghĩa 1% và nhiệt độ nuôi 300C cho hoạt tính cao nhất. SỰ PHỤ THUỘC HOẠT TÍNH VÀO NHIỆT ĐỘ Ở ĐỘ ẨM 50 % VÀ PH 5,5 ANOVA Table for HOAT TINH 15 by MAU 15 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xx ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 39.6933 2 19.8467 9.22 0.0524 Within groups 6.46 3 2.15333 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 46.1533 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy giá trị P- Value bằng 0,05 chứng tỏ giữa các mẫu có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. Multiple Range Tests for HOAT TINH 15 by MAU 15 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 15 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C3D1E1 2 25.2 X C3D2E1 2 28.3 XX C3D3E1 2 31.5 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C3D1E1 - C3D2E1 -3.1 4.67 C3D1E1 - C3D3E1 *-6.3 4.67 C3D2E1 - C3D3E1 -3.2 4.67 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Mẫu C3D3E1 có khác biệt cao nhất so với các mẫu khác. Ở pH = 5,5 và độ ẩm 50%, nhiệt độ nuôi 350C cho hoạt tính cao nhất SỰ PHỤ THUỘC HOẠT TÍNH VÀO NHIỆT ĐỘ Ở ĐỘ ẨM 55% VÀ PH 5,5 ANOVA Table for HOAT TINH 16 by MAU 16 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 84.6533 2 42.3267 3.68 0.1556 Within groups 34.46 3 11.4867 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 119.113 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy giá trị P- Value bằng 0,1 chứng tỏ giữa các mẫu không có sự khác biệt ý nghĩa. Multiple Range Tests for HOAT TINH 16 by MAU 16 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 16 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C3D1E2 2 28.6 X C3D3E2 2 33.3 X C3D2E2 2 37.8 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C3D1E2 - C3D2E2 -9.2 10.786 C3D1E2 - C3D3E2 -4.7 10.786 C3D2E2 - C3D3E2 4.5 10.786 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. SỰ PHỤ THUỘC HOẠT TÍNH VÀO NHIỆT ĐỘ Ở ĐỘ ẨM 60 % VÀ PH 5,5 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xxi ANOVA Table for HOAT TINH 17 by MAU 17 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 94.44 2 47.22 13.34 0.0321 Within groups 10.62 3 3.54 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 105.06 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy giá trị P- Value bằng 0,03 chứng tỏ giữa các mẫu có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. Multiple Range Tests for HOAT TINH 17 by MAU 17 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 17 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C3D1E3 2 26.8 X C3D3E3 2 27.4 X C3D2E3 2 35.5 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C3D1E3 - C3D2E3 *-8.7 5.98774 C3D1E3 - C3D3E3 -0.6 5.98774 C3D2E3 - C3D3E3 *8.1 5.98774 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Mẫu C3D2E3 có khác biệt cao nhất so với các mẫu khác. Ở pH = 5,5 và độ ẩm 60%, nhiệt độ nuôi 300C cho hoạt tính cao nhất * Kết luận: Hoạt tính có phụ thuộc vào nhiệt độ ở pH 5,5. Nhiệt độ 300C cho hoạt tính cao nhất. SỰ PHỤ THUỘC CỦA HOẠT TÍNH THEO PH Ở NHIỆT ĐỘ 25 VÀ ĐỘ ẨM 50 % ANOVA Table for HOAT TINH 19 by MAU 19 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 3.01 2 1.505 0.98 0.4691 Within groups 4.585 3 1.52833 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 7.595 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy P- value bằng 0,46 chứng tỏ giữa các mẫu không có sự khác biệt ý nghĩa. Multiple Range Tests for HOAT TINH by MAU -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C3D1E1 2 25.2 X C1D1E1 2 25.75 X C2D1E1 2 26.9 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1D1E1 - C2D1E1 -1.15 3.93433 C1D1E1 - C3D1E1 0.55 3.93433 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xxii C2D1E1 - C3D1E1 1.7 3.93433 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Ở nhiệt độ 250C và độ ẩm 50 %, hoạt tính không phụ thuộc pH. SỰ PHỤ THUỘC CỦA HOẠT TÍNH THEO PH Ở NHIỆT ĐỘ 25 VÀ ĐỘ ẨM 55 % ANOVA Table for HOAT TINH 1 by MAU 1 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 4.44 2 2.22 1.37 0.3778 Within groups 4.86 3 1.62 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 9.3 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy P- value bằng 0,37 chứng tỏ giữa các mẫu không có sự khác biệt ý nghĩa. Multiple Range Tests for HOAT TINH 1 by MAU 1 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 1 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1D1E2 2 27.4 X C3D1E2 2 28.6 X C2D1E2 2 29.5 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1D1E2 - C2D1E2 -2.1 4.0506 C1D1E2 - C3D1E2 -1.2 4.0506 C2D1E2 - C3D1E2 0.9 4.0506 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Ở nhiệt độ 250C và độ ẩm 55 %, hoạt tính không phụ thuộc pH. SỰ PHỤ THUỘC CỦA HOẠT TÍNH THEO PH Ở NHIỆT ĐỘ 25 VÀ ĐỘ ẨM 60 % ANOVA Table for HOAT TINH 2 by MAU 2 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 11.3733 2 5.68667 1.61 0.3355 Within groups 10.62 3 3.54 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 21.9933 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy P- value bằng 0,33 chứng tỏ giữa các mẫu không có sự khác biệt ý nghĩa. Multiple Range Tests for HOAT TINH 2 by MAU 2 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 2 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1D1E3 2 24.1 X Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xxiii C3D1E3 2 26.8 X C1D3E3 2 27.2 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1D1E3 - C1D3E3 -3.1 5.98774 C1D1E3 - C3D1E3 -2.7 5.98774 C1D3E3 - C3D1E3 0.4 5.98774 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Ở nhiệt độ 250C và độ ẩm 60 %, hoạt tính không phụ thuộc pH. SỰ PHỤ THUỘC CỦA HOẠT TÍNH THEO PH Ở NHIỆT ĐỘ 300C VÀ ĐỘ ẨM 50 % ANOVA Table for HOAT TINH 3 by MAU 3 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 74.4533 2 37.2267 27.11 0.0120 Within groups 4.12 3 1.37333 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 78.5733 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy P- value bằng 0,01 chứng tỏ giữa các mẫu có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 1%. Multiple Range Tests for HOAT TINH 3 by MAU 3 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 3 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1D2E1 2 27.1 X C3D2E1 2 28.3 X C2D2E1 2 35.1 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1D2E1 - C2D2E1 *-8.0 3.72949 C1D2E1 - C3D2E1 -1.2 3.72949 C2D2E1 - C3D2E1 *6.8 3.72949 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Mẫu C2D2E1 có sự khác biệt cao nhất so các mẫu khác. Ở nhiệt độ 300C và độ ẩm 50%, hoạt tính cao nhất ở pH 5,0. SỰ PHỤ THUỘC CỦA HOẠT TÍNH THEO PH Ở NHIỆT ĐỘ 35 VÀ ĐỘ ẨM 50 % ANOVA Table for HOAT TINH 4 by MAU 4 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 201.693 2 100.847 7.32 0.0701 Within groups 41.32 3 13.7733 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 243.013 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy P- value bằng 0,0501 chứng tỏ giữa các mẫu không có sự khác biệt ý nghĩa. Multiple Range Tests for HOAT TINH 4 by MAU 4 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xxiv -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 4 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1D2E2 2 30.5 X C3D2E2 2 37.8 XX C2D2E2 2 44.7 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1D2E2 - C2D2E2 *-14.2 11.8108 C1D2E2 - C3D2E2 -7.3 11.8108 C2D2E2 - C3D2E2 6.9 11.8108 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Ở nhiệt độ 350C và độ ẩm 50 %, hoạt tính không phụ thuộc pH. SỰ PHỤ THUỘC CỦA HOẠT TÍNH THEO PH Ở NHIỆT ĐỘ 30 VÀ ĐỘ ẨM 60 % ANOVA Table for HOAT TINH 5 by MAU 5 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 173.453 2 86.7267 33.10 0.0090 Within groups 7.86 3 2.62 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 181.313 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy P- value bằng 0,009 chứng tỏ giữa các mẫu có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 1%. Multiple Range Tests for HOAT TINH 5 by MAU 5 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 5 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1D2E3 2 24.8 X C3D2E3 2 35.5 X C2D2E3 2 36.8 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1D2E3 - C2D2E3 *-12.0 5.15124 C1D2E3 - C3D2E3 *-10.7 5.15124 C2D2E3 - C3D2E3 1.3 5.15124 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Mẫu C2D2E3 có sự khác biệt cao nhất so các mẫu khác. Ở nhiệt độ 300C và độ ẩm 60%, hoạt tính cao nhất ở pH 5,0. SỰ PHỤ THUỘC CỦA HOẠT TÍNH THEO PH Ở NHIỆT ĐỘ 30 VÀ ĐỘ ẨM 60 % ANOVA Table for HOAT TINH 6 by MAU 6 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xxv Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 9.65333 2 4.82667 1.74 0.3156 Within groups 8.34 3 2.78 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 17.9933 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy P- value bằng 0,31 chứng tỏ giữa các mẫu không có sự khác biệt ý nghĩa. Multiple Range Tests for HOAT TINH 6 by MAU 6 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 6 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1D3E1 2 28.5 X C2D3E1 2 30.7 X C3D3E1 2 31.5 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1D3E1 - C2D3E1 -2.2 5.3062 C1D3E1 - C3D3E1 -3.0 5.3062 C2D3E1 - C3D3E1 -0.8 5.3062 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Ở nhiệt độ 300C và độ ẩm 60 %, hoạt tính không phụ thuộc pH. SỰ PHỤ THUỘC CỦA HOẠT TÍNH THEO PH Ở NHIỆT ĐỘ 35 VÀ ĐỘ ẨM 55 % ANOVA Table for HOAT TINH 7 by MAU 7 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 24.0933 2 12.0467 4.60 0.1220 Within groups 7.86 3 2.62 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 31.9533 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy P- value bằng 0,12 chứng tỏ giữa các mẫu không có sự khác biệt ý nghĩa. Multiple Range Tests for HOAT TINH 7 by MAU 7 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 7 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1D3E2 2 29.1 X C3D3E2 2 33.3 X C2D3E2 2 33.4 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1D3E2 - C2D3E2 -4.3 5.15124 C1D3E2 - C3D3E2 -4.2 5.15124 C2D3E2 - C3D3E2 0.1 5.15124 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Ở nhiệt độ 350C và độ ẩm 55 %, hoạt tính không phụ thuộc pH. Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xxvi SỰ PHỤ THUỘC CỦA HOẠT TÍNH THEO PH Ở NHIỆT ĐỘ 35 VÀ ĐỘ ẨM 60 % ANOVA Table for HOAT TINH 7 by MAU 8 Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 24.0933 2 12.0467 4.60 0.1220 Within groups 7.86 3 2.62 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 31.9533 5 Căn cứ vào bảng ANOVA trên ta thấy P- value bằng 0,12 chứng tỏ giữa các mẫu không có sự khác biệt ý nghĩa. Multiple Range Tests for HOAT TINH 7 by MAU 8 -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD MAU 8 Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- C1D3E3 2 29.1 X C3D3E3 2 33.3 X C2D3E3 2 33.4 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- C1D3E3 - C2D3E3 -4.3 5.15124 C1D3E3 - C3D3E3 -4.2 5.15124 C2D3E3 - C3D3E3 0.1 5.15124 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Ở nhiệt độ 350C và độ ẩm 60 %, hoạt tính không phụ thuộc pH. Trường Đại học Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 năm 2008 27 ._.