Nghiên cứu sản xuất Amylase từ Aspergillus oryzae

và truyền đạt những kiến thức quý báu suốt năm năm đại học. Xin chân thành cảm ơn quí thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã truyền đạt hành trang kiến thức và vốn sống bằng tâm huyết của mình. Xin gửi lòng biết ơn đến thầy Lý Nguyễn Bình đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đở tôi hoàn thành bài luận văn này. Chân thành cảm ơn sự đoàn kết và hổ trợ của các bạn lớp công nghệ thực phẩm khoá 28 trong suốt năm năm học và trong quá trình thực hiện luận văn. Cảm ơn những ai đã quan tâm, đóng góp ý kiến để bài luận văn hoàn chỉnh hơn. Chân thành cảm ơn! Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ ........................................................................................................ i MỤC LỤC............................................................................................................ ii DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................iv DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................v TÓM LƯỢC .........................................................................................................vi CHƯƠNG I GIỚI THIỆU ....................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề........................................................................................................1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu.........................................................................................2 CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................3 2.1 Cấu trúc phân tử của amylase...........................................................................3 2.1.1 Đặc tính và cơ chế tác dụng...........................................................................3 2.1.2 Hoạt lực của amylase ....................................................................................7 2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của amylase ..........................................7 a. Nồng độ cơ chất .................................................................................................7 b. Nồng độ enzyme ................................................................................................9 c. Nhiệt độ ...........................................................................................................10 d. pH môi trường ................................................................................................11 e. Các chất kìm hãm.............................................................................................12 e. Các chất hoạt hóa .............................................................................................13 2.2 Sản xuất amylase từ vi sinh vât ......................................................................13 2.2.1 Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật ............................................................13 2.2.2 Các yếu tố của môi trường ảnh hưởng đến sự tổng hợp amylase .................15 a. Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng ............................................................15 b. Ảnh hưởng của acid amin ...............................................................................16 c. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng ......................................................16 e. Ảnh hưởng của pH nguyên liệu ........................................................................17 f. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy ......................................................17 2.3 Kỹ thuật sản xuất amylase từ vi sinh vật.........................................................18 2.3.1 Sơ đồ kỹ thuật sản xuất chế phẩm amylase từ Asp. oryzae ..........................19 2.3.2 Thuyết minh quy trình.................................................................................19 2.4 Một số ứng dụng của amylase trong thực phẩm..............................................22 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng iii 2.4.1 Sản xuất rượu..............................................................................................22 2.4.2 Sản xuất bia.................................................................................................22 2.4.3 Sản xuất bánh mì.........................................................................................22 2.4.4 Sản xuất bánh kẹo .......................................................................................23 2.4.5 Sản xuất siro và các sản phẩm chứa đường..................................................23 CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............24 3.1 Vật liệu ..........................................................................................................25 3.2 Đối tượng nghiên cứu....................................................................................24 3.3 Dụng cụ, hóa chất ..........................................................................................24 3.4 Phương pháp thí nghiệm ................................................................................26 3.4.1 Qui trình thí nghiệm tham khảo...................................................................26 3.4.2 Thí nghiệm..................................................................................................26 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ...................................................................................30 4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khác nhau và thời gian nuôi cấy đến sự tạo thành amylase .......................................................................30 4.2 Ảnh hưởng điều kiện môi trường đến sự tạo thành amylase ...........................38 CHƯƠNG V KẾT LUẬN...................................................................................51 CHƯƠNG VI KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................52 TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................53 PHỤ LỤC Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng iv DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Cơ chế tác dụng của α- amylase lên tinh bột..............................................4 Hình 2: Tác dụng của glucoamylase lên tinh bột ....................................................6 Hình 3: Tác dụng của amylase lên tinh bột............................................................6 Hình 4: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzym................................8 Hình 5: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứng của amylase .......9 Hình 6: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng...............................9 Hình 7: Ảnh hưởng của nồng độ amylase đến thời gian phản ứng........................10 Hình 8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến tốc độ phản ứng của enzyme...............10 Hình 9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian phản ứng của amylase.................11 Hình 10: Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme.....................................11 Hình 11: Ảnh hưởng của pH đến thời gian phản ứng của enzyme .......................12 Hình 12: Máy đông khô .......................................................................................25 Hình 13: Máy phân tích ẩm..................................................................................25 Hinh 14: Thiết bị đo mật độ quang.......................................................................25 Hình 15: Máy đo pH ............................................................................................25 Hình 16: Tủ úm....................................................................................................25 Hình 17: Sơ đồ qui trình công nghệ tham khảo ....................................................26 Hình 18: Đồ thị biểu diễn hoạt tính amylase riêng................................................32 Hình 19: Đồ thị biểu diễn hoạt tính amylase tổng.................................................34 Hình 20: Đồ thị biểu diễn hoạt tính glucoamylase riêng .......................................36 Hình 21: Đồ thị biểu diễn hoạt tính glucoamylase tổng ........................................38 Hình 22: Đồ thị biểu diễn hoạt tinh amylase riêng................................................41 Hình 23: Đồ thị biểu diễn hoạt tinh amylase tổng.................................................44 Hình 24: Đồ thị biểu diễn hoạt tính glucoamylase riêng .......................................47 Hình 25: Đồ thị biểu diễn hoạt tính glucoamylase tổng ........................................50 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng v DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Ảnh hưởng của cơ chất đến sinh tổng hợp các amylase bởi nấm mốc Asp. oryzae ..................................................................................................................14 Bảng 2: Ảnh hưởng của bột ngô tới sinh tổng hợp amylase chủng Asp.oryzea .....15 Bảng 3: Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp các amylase......................15 Bảng 4: Ảnh hưởng của pH cám đến sinh tổng hợp amylase................................17 Bảng 5 Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo amylase của Asp. oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt ...................................................18 Bảng 6: Thành phần của cám mì và cám gạo........................................................20 Bảng 7: Thời gian nuôi cấy thích hợp của Asp. oryzae .........................................21 Bảng 8: Khối lượng môi trường và ẩm nuôi cấy...................................................28 Bảng 9: Ẩm nuôi cấy và khối lượng môi trường thu được....................................29 Bảng 10: Hoạt tính amylase riêng (đv/g)..............................................................31 Bảng 11: Hoạt tính amylase tổng (đv) ..................................................................33 Bảng 12: Hoat tính glucoamylase riêng (đv/g) .....................................................35 Bảng 13: Hoạt tính glucoamylase tổng.................................................................37 Bảng 14: Hoạt tính amylase riêng trung bình theo độ ẩm môi trường nuôi cấy.....39 Bảng 15: Hoạt tính α- amylase riêng trung bình theo nhiệt độ môi trường nuôi cấy ............................................................................................................................39 Bảng 16: Hoạt tính amylase riêng trung bình theo pH môi trường nuôi cấy .........39 Bảng 17: Hoạt tính amylase riêng ........................................................................40 Bảng 18: Hoạt tính amylase tổng trung bình theo độ ẩm môi trường nuôi cấy......41 Bảng 19: Hoạt tính amylase tổng trung bình theo nhiệt độ môi trường nuôi cấy...42 Bảng 20: Hoạt tính amylase tổng trung bình theo pH môi trường nuôi cấy ..........42 Bảng 21: Hoạt tính amylase tổng .........................................................................43 Bảng 22: Hoạt tính glucoamylase riêng trung bình theo độ ẩm môi trường nuôi cấy ............................................................................................................................44 Bảng 23: Hoạt tính glucoamylase riêng trung bình theo nhiệt độ môi trường nuôi cấy .......................................................................................................................45 Bảng 24: Hoạt tính glucoamylase riêng trung bình theo pH môi trường nuôi cấy.45 Bảng 25: Hoạt tính glucoamylase riêng................................................................46 Bảng 26: Hoạt tính glucoamylase tổng trung bình theo độ ẩm môi trường nuôi cấy ............................................................................................................................47 Bảng 27: Hoạt tính glucoamylase tổng trung bình theo nhiệt độ môi trường nuôi cấy .......................................................................................................................48 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng vi Bảng 28: Hoạt tính glucoamylase tổng trung bình theo pH môi trường nuôi cấy..48 Bảng 29: Hoạt tính glucoamylase tổng.................................................................49 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng vii TÓM LƯỢC Amylase là enzyme được sử dụng phổ biến trong chế biến thực phẩm như rươu, bia, bánh mì, kẹo… Amylase được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó sản xuất từ vi sinh vật có nhiều thuận lợi và thu được hoạt tính khá cao. Tên đề tài thực hiện nghiên cứu nghiên cứu sản xuất amylase từ Aspergillus oryzae tiến hành nghiên cứu hoạt tính enzyme thu được với hai thí nghiệm, - Thí nghiệm 1 khảo sát thành phần môi trường: 75% cám + 20% trấu + 5% bột, 75% cám + 15% trấu + 10% bột; bột bổ sung: bột bắp, bột gạo, bột năng và thời gian nuôi cấy: 30 giờ, 40 giờ, 50 giờ, 55 giờ, tiến hành với 2 lần lặp lại. - Thí nghiệm 2 khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy gồm nhiệt độ nuôi cấy: 25oC, 30oC, 35oC; độ ẩm: 50%, 55%, 60%; pH: 4,5, 5, 5,5 tiến hành với 2 lần lại. Kết quả: - Thí nghiệm 1: hoạt tính amylase thu được cao nhất trên môi trường nuôi cấy có thành phần 75% cám + 20% trấu + 5% bột với bột bổ sung là bột gạo trong thời gian nuôi cấy là 50 giờ. - Thí nghiệm 2: điều kiện môi trường nuôi cấy tốt nhất để có hoạt tính amylase cao nhất là môi trường có độ ẩm 55%, pH bằng 5 và nhiệt độ nuôi cấy là 30oC. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 1 CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường. Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzyme được phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ XX đến nay. Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại những lợi nhuận rất lớn cho nhiều nước. Việt Nam là một trong những nước có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzyme. Tuy nhiên, công nghệ enzyme của ta chưa thực sự phát triển. Trong tương lai, đây sẽ là một trong những ngành công nghiệp được đầu tư phát triển rộng rãi bởi những ứng dụng và tính tiện lợi của nó trong nhiều lĩnh vực của sản xuất và đời sống. Sản xuất enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn so với động vật và thực vật đó là: - Tốc độ sinh sản vi sinh vật rất mạnh - Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao - Vi sinh vật là giới sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo qui mô công nghiệp - Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme rẽ tiền và dễ kiếm - Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau. Cùng với những ứng dụng phổ biến và quan trọng của amylase thì việc tạo ra nguồn amylase là rất cần thiết. Amylase tồn tại trong động vật, thực vật và vi sinh vật. Ở động vật, amylase có trong tuyến nước bọt và tuyến tụy. Ở thực vật, amylase thu nhận từ hạt nẩy mầm trong đó từ malt với số lượng nhiều nhất, chủ yếu dùng để sản xuất bia. Hiện tại, sản xuất amylase từ vi sinh vật là một phương pháp phổ biến, dễ thực hiện. Các chủng vi sinh vật thường sử dụng như Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus niger… Với tiềm năng như vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase từ vi sinh vật, cụ thể là nghiên cứu trên đối tượng vi nấm Aspergillus oryzae để thu amylase với số lượng nhiều, hoạt độ cao và giá thành rẻ…phục vụ sản xuất. Amylase được ứng dụng khá rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Do đó, nghiên cứu sản xuất enzyme amylase, ta có thể cải tiến được nhiều qui trình chế biến, nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm hoặc rút ngắn được thời gian sản xuất. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 2 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Quá trình nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzea sản xuất amylase chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố với những mức độ khác nhau. Nội dung nghiên cứu trong đề tài này: - Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi đến quá trình sản xuất amylase - Xác định thời điểm vi sinh vật sản sinh ra amylase nhiều nhất - Khảo sát điều kiện môi trường (nhiệt độ, pH, độ ẩm) ảnh hưởng đến sự sản sinh ra enzyme amylase. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 3 CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU Amylase là một enzyme rất thông dụng. Nó có cả trong thực vật, động vật và vi sinh vật. Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Persoz đã tách được chất phân giải tinh bột từ đại mạch nẩy mầm. Các tác giả đã dùng rượu đề kết tủa nó trong dịch chiết malt và thu được enzyme ở dạng bột, đồng thời đặt tên là diastase (xuất phát từ tiếng Hi Lạp có nghĩa là phân giải). Sau này theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột được gọi là amylase. Amylase thuộc nhóm enzyme thuỷ phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharid với sự tham gia của nước. Amylase thuỷ phân tinh bột, dextrin, glycogen thành glucose, maltose và dextrin. Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase ra các loại sau: α- amylase, β- amylase, glucoamylase (γ- amylase), olgo-1,6- glucosidase (dex- trinase…) 2.1 Cấu trúc phân tử của amylase 2.1.1 Đặc tính và cơ chế tác dụng α- amylase (α- 1,4 glucan- 4- glucanhydrolase, EC 3.2.1.1) Đặc tính:: α- amylase có nguồn gốc khác nhau có thành phần acid amin khác nhau, mỗi loại α- amylase có một tổ hợp acid amin đặc hiệu riêng, khá giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và acid aspartic. Tâm hoạt động chứa các nhóm -COOH và -NH2. α- amylase là một metaloenzyme, trong phân tử đều chứa từ 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, song không ít hơn 1- 6 nguyên tử gam Ca/mol. Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi enzyme thì α- amylase mất hết khả năng thuỷ phân cơ chất vì Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 2, 3 của enzyme. Ngoài duy trì cấu hình hoạt động của enzyme, Ca còn có tác dụng đảm bảo cho α- amylase có độ bền cực lớn đối với các tác động gây biến tính và sự phân huỷ bởi các enzyme phân giải protein. α- amylase kém bền trong môi trường acid nhưng bền nhiệt hơn so với các loại enzyme khác. Tất cả α- amylase đều bị kìm hãm bởi kim loại nặng như Cu2+, Hg2+. α-amylase của động thực vật và vi sinh vật được hoạt hoá bởi các ion đơn hoá trị, từ nguồn thực vật thì nó lại được hoạt hoá bởi ion hoá trị II. Cơ chế tác dụng: α- amylase có khả năng phân cắt liên kết α-1,4 glycoside ở bất kỳ vị trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa. Do đó, được gọi là enzyme nội phân (endoenzyme). Quá trình thủy phân này trãi qua nhiều giai đoạn: - Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số cơ chất bị thuỷ phân nhanh tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 4 - Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hoá) các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bị thuỷ phân tiếp tục tạo ra các tetra-, trimaltose. Các chất này bị thuỷ phân rất chậm bởi α- amylase cho tới disaccharide và monosacharide. Dưới tác dụng của α- amylase, amylose sẽ bị phân giải khá nhanh tạo thành oligosaccharide gồm 6- 7 gốc glucose. Các oligosaccharide này bị phân cắt tiếp tục tạo ra các sản phẩm các maltotetrose, maltotriose, maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm thuỷ phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α- amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì α– amylase không phân cắt được liên kết α-1,6 glucoside ở chổ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng cũng là 72% maltose, 19% glucose, các dextrin phân tử thấp và các izomaltose 8%. Cơ chế tác dụng của α- amylase lên tinh bột được trình bày ở Hình 1. Hình 1: Cơ chế tác dụng của α- amylase lên tinh bột β- amylase (α- 1,4- glucan- maltohydrolase, EC 3.2.1.2) Đặc tính : β- amylase là một albumin. Tâm xúc tác của nó chứa các nhóm –SH và nhóm –COOH cùng với vòng imidazol của các gốc histidin. β- amylase là enzyme ngoại phân (exoenzyme) có ái lực với các liên kết α-1,4 glucoside cách đầu không khử của mạch một liên kết α-1,4 glucoside. β- amylase hiện diện phổ biến trong thực vật, rất bền khi không có ion Ca2+, bị kìm hãm bởi ion Cu2+,Hg2+, urea, iođoacetamie, iodin, ozon...pH tối thích trong dung dịch tinh bột thuần khiết của β- amylase là 4,6 còn trong dung dịch nấu (không sôi) là 5,6. β- amylase chịu nhiệt kém hơn α- amylase nhưng bền với acid hơn, bị bất hoạt ở nhiệt độ 70oC, nhiệt độ tối thích trong dung dịch tinh bột thuần khiết của β- amylase là 40- 50oC, song trong dịch nấu là 60- 65oC. Cơ chế tác dụng : β- amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α-1,4 glucoside trong tinh bột, glycogen và polysaccharid phân cắt tuần tự từng gốc maltose từ đầu không khử. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 5 β- amylase phân cắt 100% amylose thành maltose và 54-58% amylopectin thành maltose. Quá trình thuỷ phân amylopectin được tiến hành từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng. Mỗi nhánh ngoài có từ 20-26 gốc glucose sẽ tạo thành được 10-13 phân tử maltose. Khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6 glucoside thì β- amylase ngừng tác dụng còn lại là dextrin, α-dextrin cho màu tím đỏ với iodine, độ nhớt của dung dịch giảm chậm. γ- amylase (α-1,4 glucan- glucohydrolase, EC 3.2.1.3) Đặc tính : là enzyme ngoại phân (exoenzyme) nó thuỷ phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose. Glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 glucoside lẫn α-1,6 glucoside. Enzyme này mang nhiều tên gọi khác nhau: glucoamylase, amyloglucosidase, taka- amylase Bac, γ- amylase, maltulase... Khi thuỷ phân, glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4 glucoside trong polysaccharide, tách lần lượt từng gốc glucose một từ đầu không khử. Ngoài thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside và α-1,6 glucoside, γ- amylase còn có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,2 glucoside và α-1,3 glucoside (Sawaskia 1960, Ueyama và cộng sự,1965, Watanabe, Fukimbara 1965, 1966). Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, amylopectin, dextrin cuối, panose, isomaltose và maltose tới glucose (Azarova 1981; Jerebtxov, Pankratov,1977; Dobrolinxkaia, Rodzevit, 1974; Logina Karpukhina, 1978). Các cơ chất có cấu tạo phân nhánh (amylopectin, glucogen, β-dextrin) bị glucoamylase tấn công với vận tốc khá lớn. Cơ chế tác dụng của glucoamylase được trình bày trong Hình 2. Amylose Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 6 Hình 2: Tác dụng của glucoamylase lên tinh bột Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng pH 3,5- 5,5 và nhiệt độ 50oC. Nó bền với tác dụng của acid hơn các α- amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không được bảo vệ bởi ion Ca2+. Cơ chế tác dụng chung của amylase được mô tả trong Hình 3. Hình 3: Tác dụng của amylase lên tinh bột Amylopectin Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 7 2.1.2 Hoạt lực của amylase Khi sử dụng bất kỳ một chế phẩm enzyme nào cũng cần biết rõ hoạt lực xúc tác của nó. Đơn vị của hoạt lực hay còn gọi là hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả năng xúc tác được một micromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. Các chế phẩm có hoạt tính phân giải tinh bột thường chứa nhiều loại enzyme amylase. Vì vậy, hoạt lực tổng hợp của chúng phản ánh tác dụng của tất cả các amylase có trong chế phẩm. Do tính đa dạng của enzyme, đặc trưng của cơ chất sử dụng, nên phương pháp xác định hoạt độ của enzyme cũng rất khác nhau. Để xác định hoạt độ của các amylase có thể dùng một trong các phương pháp sau: Đo sự biến thiên độ nhớt của dung dịch bằng nhớt kế khi cho amylase tác dụng lên hồ tinh bột, khi đó các mạch phân tử cơ chất bị cắt ngắn, độ nhớt của dung dịch giảm dần. Đo mật độ quang của dung dịch khi thực hiện phản ứng màu với iod. Khi có amylase thì các sản phẩm phân giải của tinh bột sẽ cho màu khác nhau với iod. Đo lượng đường maltose hoặc glucose tạo thành sau khi cho enzyme tác dụng lên cơ chất. Hệ enzyme amylase có các hoạt độ đặc trưng sau: - Hoạt độ của enzyme α- amylase theo Rukhliadeva dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme có trong dịch chế phẩm nghiên cứu tới các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iod bằng máy so màu quang phổ sẽ tính được hoạt độ của enzyme. Đơn vị hoạt độ của α- amylase là lượng enzyme chuyển hóa được một gam tinh bột tan thành dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 300C trong một giờ. - Hoạt độ glucoamylase đặc trưng cho khả năng chế phẩm thủy phân tinh bột đến glucose. Muốn xác định được cần đo được lượng glucose tạo thành. Glucose trong hỗn hợp các đường thường được xác định bằng các phương pháp đặc hiệu. Đơn vị hoạt độ của glucoamylase là lượng chế phẩm enzyme khi tác dụng lên tinh bột ở 30oC và pH tối thích trong 1 giờ tạo ra 1mg glucose (xác định bằng phương pháp Zikhetar- Bleyer) hay cũng trong những điều kiện nhiệt độ và pH tương tự làm giải phóng được 1 micromol glucose (xác định bằng phương pháp glucooxydase). - Hoạt độ đường hóa phản ánh khả năng của các enzyme amylase đường hóa tinh bột đến các đường khử. Đơn vị hoạt độ đường hóa là lượng chế phẩm enzyme trong 1 giờ ở 30oC và pH thích hợp làm phân giải được 1 gam tinh bột thành đường khử khi mức độ thủy phân cơ chất không vượt 30%. - Hoạt độ maltose đặc trưng cho khả năng thủy phân maltose tới glucose của chế phẩm enzyme. Đơn vị hoạt độ maltose là lượng chế phẩm enzyme phân giải được 1 gam maltose tới glucose trong vòng 1 giờ ở 30oC, độ thủy phân maltose trong phản ứng này không vượt quá 30%. 2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của amylase a. Nồng độ cơ chất Phản ứng khi có enzyme xảy ra ba giai đoạn: Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 8 Giai đoạn đầu enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES. Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất. Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do. Hiện tượng này được xem xét trên cơ sơ phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất. Ở trường hợp này xảy ra ba giai đoạn khác biệt: - Ở giai đoạn đầu, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất. - Ở giai đoạn kết tiếp tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. - Ở giai đoạn tiếp theo, nếu nồng độ cơ chất vượt qua ngưỡng cực đại của tốc độ phản ứng thì tốc độ phản ứng không có khả năng tăng theo. Ở giai đoạn này các enzyme đã bão hòa cơ chất do đó nó không thểcó tốc độ phản ứng cao hơn được (Hình 4) Hình 4: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzym Trong Hình 5, ta thấy sự phụ thuộc tuyến tính của thời gian phản ứng vào nồng độ cơ chất theo chiều hướng tăng nồng độ cơ chất sẽ kéo dài thời gian phản ứng thuỷ phân của amylase. Tốc độ phản ứng 0 Km Nồng độ cơ chất 2 1 Vmax Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 9 Hình 5: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứng của amylase b. Nồng độ enzyme Trong trường hợp thừa cơ chất, nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độ phản ứng. Sự tăng tốc độ phản ứng trong tế bào sinh vật lại phụ thuộc rất nhiều vào khả năng điều hòa của gen. Nhìn chung tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính với lượng enzyme theo Hình 6. Tốc độ phản ứng V= k[E] Trong đó: V : Tốc độ phản ứng [E] : Nồng độ enzyme Hình 6: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng Thời gian phản ứng của amylase sẽ giảm nếu như nồng độ amylase tăng lên theo Hình 7. 0 Tốc độ phản ứng Nồng độ enzyme Nồng độ cơ chất (%) Th ời gi a n th ủy ph ân Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 10 Hình 7: Ảnh hưởng của nồng độ amylase đến thời gian phản ứng c. Nhiệt độ Bản chất của enzyme là protein. Do đó, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của chúng. Tốc độ phản ứng của enzyme chỉ có thể tăng ở giới hạn nhiệt độ nào đó mà protein chưa bị phá vỡ cấu trúc. Đa số enzyme đều mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC. Tại khoảng nhiệt độ mà enzyme có thể tồn tại vận tốc phản ứng tăng từ 1,4- 2 lần khi nhiệt độ tăng 10oC. Nhiệt độ ứng với vận tốc enzyme cực đại gọi là nhi._.ệt độ tối thích. Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau tuỳ thuộc vào nguồn gốc của chúng. Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào nhiệt độ được biểu diễn trên Hình 8. Đại lượng biểu thị cho ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng của enzyme là hệ số nhiệt Q10. Hệ số này càng lớn, phản ứng khó xảy ra ở nhiệt độ thường. Hệ số Q10 của phản ứng enzyme là 1- 2 Hệ số Q10 của phản ứng hóa học là 2- 3 Từ hệ số Q10 có thể tính được năng lượng hoạt hóa của phản ứng enzyme. Hình 8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến tốc độ phản ứng của enzyme Nồng độ enzyme (%) Th ời gi a n th ủy ph ân Tốc độ Phản ứng Nhiệt độ oC 0 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 11 Hình 9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian phản ứng của amylase Ở Hình 9, ta thấy nhiệt độ tăng cao thì thời gian phản ứng càng rút ngắn. Tuy nhiên, ở một nhiệt độ giới hạn nào đó thì phản ứng sẽ chậm lại do sự biến tính dần protein của enzyme với nhiệt, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì enzyme không hoạt động nữa. d. pH môi trường Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH môi trường; mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. Hình 10: Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hay trung tính; chỉ có một số ít có pH tối thích trong vùng acid hay kiềm mạnh (Hình 10) pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến độ bền của protein enzyme. Do đó tốc độ của phản ứng enzyme sẽ tăng dần đến giá trị cực đại và sau đó sẽ giảm dần. Đa số enzyme bền ở pH 5÷ 9. Độ bền của enzyme sẽ tăng nếu có mặt cơ chất và coenzyme hoặc Ca2+… Đối với amylase, pH hoạt động tối thích nằm trong khoảng 5,8- 6,0 ở đây thời gian thủy phân của nó thấp nhất (Hình 11). Tốc độ phản ứng 0 pH Nhiệt độ (oC) Th ời gi a n th ủy ph ân Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 12 Hình 11: Ảnh hưởng của pH đến thời gian phản ứng của enzyme e. Các chất kìm hãm Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hoá học, cấu tạo hoá học và tính chất vật lý của chúng. Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm một số chất như những ion kim loại Ca2+, Mg2+, …, các chất vô cơ, hữu cơ và cả protein. Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào. Các chất này có thể kìm hãm thuận nghịch hay không thuận nghịch. Phản ứng enzyme [E] và chất kìm hãm [I] nhanh chóng đạt đến cân bằng: E+ I EI Trong đó : K1, K-1: hằng số tốc độ phản ứng.
Các chất kìm hãm cạnh tranh Các chất kìm hãm cạnh tranh có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Do đó chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả là một số chổ kết hợp cần thiết ở enzyme bị chất kìm hãm chiếm mất. Do đó cơ chất mất một phần khả năng tương tác, làm cho tốc độ phản ứng không tăng. Phản ứng cạnh tranh có thể biểu thị như sau: E + I EI E + S ES E + P
Các chất kìm hãm không cạnh tranh Kiểu cạnh tranh trên là hiện tượng chiếm đoạt trung tâm hoạt động trong cấu trúc enzyme, nhưng kiểu kìm hãm cạnh tranh lại xảy ra hoàn toàn khác hẳn. Ở đây chất kìm hãm sẽ kết hợp với enzyme ở vị trí không phải là trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả là chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme. K1 K -1 Th ời gi a n th ủy ph ân Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 13 Như vậy phức hợp EI này sẽ làm thay đổi hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme. Sau khi kết hợp với chất kìm hãm để tạo thành phức hợp EI, chúng vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất để tạo thành một phức hợp EIS như phản ứng sau: E + S = ES E + P E + I = EI ES + I = EIS EI + S = EIS
Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng Các sản phẩm được tạo thành do các phản ứng enzyme tham gia có thể tạo thành chất kìm hãm tốc độ của chính phản ứng đó. Thí dụ: nếu có một phản ứng kiểu S1 + S2 = P1 + P2 Do tính thuận nghịch của phản ứng trên, các enzyme có ái lực với P1 và P2 tương đương với S1 và S2. Trong trường hợp như thế P1 + P2 được coi như chất kìm hãm với S1 và S2.
Kìm hãm do thừa cơ chất Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành chất kìm hãm phản ứng. Giả sử ta có phản ứng: E + S ES E + P Nếu có cơ chất thứ hai tham gia vào, và nó có khả năng đính vào một vị trí nào đó trên phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho chúng không hoạt động, khi đó phức hệ này coi như chất kìm hãm. ES + S = ESS e. Các chất hoạt hóa Các chất hoạt hoá có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzyme. Các chất hoạt hoá enzyme có bản chất hóa học rất khác nhau. Chúng có thể là các anion, các ion kim loại ở ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng tuần hoàn của Mendeleev, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp làm nhiệm vụ chuyển hydro, các chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme, các chất có khả năng phục hồi nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme. 2.2 Sản xuất amylase từ vi sinh vât 2.2.1 Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình enzyme liên quan mật thiết với nhau. Quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ của enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường. Hai quá trình này không phải bao giờ cũng trùng khớp nhau về thời gian, nhất là trong phương pháp nuôi chìm. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 14 Ở một số vi sinh vật, quá trình tổng hợp amylase tiến hành song song với quá trình sinh trưởng, nghĩa là quá trình tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng sinh khối. Trong trường hợp này, sinh tổng hợp amylase kết thúc ở pha logarit. Cùng đồng thời với sự ngừng sinh trưởng và bắt đầu pha ổn định tiếp sau khi nuôi Bac. subtilis, Bac. slearother mophillus. Tuy nhiên, theo nhiều tác giả, sự tạo thành amylase cực đại thường xảy ra sau khi quần thể tế bào vi sinh vật đạt điểm sinh trưởng. Trong trường hợp này sinh trưởng của vi sinh vật hầu như không kèm theo sự tích lũy enzyme amylase trong canh trường, chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự tổng hợp enzyme cực lớn (Bac. subtilis). Nhiều tác giả lại cho rằng quá trình tổng hợp amylase trên màng tế bào (Nomura, 1958) và người ta lập luận rằng ở gần màng tế bào tập trung enzyme phân hủy, nó ở trạng thái không hoạt động chừng nào amylase chưa được tạo thành. Khi bắt đầu tổng hợp amylase, enzyme phân hủy trở nên hoạt động và làm biến đổi cấu trúc màng tế bào tới độ cho phép các phân tử amylase đứt ra ngoài môi trường được. Song thật ra, amylase ngoại bào được tổng hợp liên tục và độc lập với amylase nội bào. Người ta cho rằng sự tổng hợp các enzyme amylase bắt đầu khi mà việc tạo protein của tế bào đã kết thúc hoặc gần kết thúc và cạnh tranh với quá trình này. Quá trình sinh tổng hợp amylase ngoại bào và sự tạo các enzyme xúc tác quá trình tự phân tế bào là quá trình độc lập do điều kiện sinh trưởng. Nồng độ tinh bột và nguồn carbon khác nhau cũng có ảnh hưởng đến sự tao thành các enzyme riêng biệt của hệ enzyme amylase khi nuôi chủng Asp.oryzae. Ảnh hưởng này được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1: Ảnh hưởng của cơ chất đến sinh tổng hợp các amylase bởi nấm mốc Asp. oryzae Hoạt độ của enzyme amylase, đv/100ml Hoạt độ của enzyme amylase, đv/100ml Nguồn carbon α –amylase Oligo-1,6 glucosidase Nguồn carbon α –amylase Oligo-1,6 glucozidase Tinh bột % Bột 6 300 800 Ngô 250 760 4 220 800 Mì 250 760 2 110 800 Mì đen 300 770 1 70 710 Đậu nành Vết 810 (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Để đảm bảo có hoạt lực α –amylase cao cần có 6% tinh bột, còn muốn hoạt lực oligo-1,6 glucosidase cao cần 2% tinh bột. Bột đậu nành ức chế hoàn toàn sinh tổng hợp α –amylase, nhưng lại kích thích sinh tổng hơp mạnh mẽ oligo-1,6 glucosidase. Nuôi Asp. oryzae trong môi trường có chứa bột ngô cũng tạo nhiều amylase ngoại bào (Bảng 2). Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 15 Bảng 2: Ảnh hưởng của bột ngô tới sinh tổng hợp amylase chủng Asp.oryzea Hàm lượng bột ngô trong môi trường (%) Hoạt độ amylase đv/100ml pH môi trường Hàm lượng bột ngô trong môi trường (%) Hoạt độ amylase đv/100ml pH môi trường 8 6 5 330 330 250 8,1 8,1 8,0 4 2 213 195 8,0 7,6 (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) 2.2.2 Các yếu tố của môi trường ảnh hưởng đến sự tổng hợp amylase a. Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng Nitơ tham gia vào quá trình tạo protein, acid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào vi sinh vật. Trong môi trường lên men nitơ thường được bổ sung dưới dạng muối nitrat, các hợp chất amon hoặc một số chất có nguồn gốc vi sinh vật. Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Theo mức độ tiêu thụ muối, môi trường bị acid hoá, quá trình dịch mạnh về phía tổng hợp tích cực glucoamylase và ức chế tổng hợp α- amylase. Fenikxova và cộng tác viên đã tiến hành thí nghiệm với NH4H2PO4 và thấy rằng sinh tổng hợp α- amylase giảm đi 10 lần mà sự tạo thành glucoseamylase hầu như không bị ảnh hưởng. Kết quả thể hiện ở Bảng 3. Bảng 3: Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp các amylase Hoạt độenzyme sau 6 ngày nuôi đv/100ml Nguồn nitơ Liều lượng muối, % theo N α- amylase glucoamylase NaNO3 NaNO3 (NH4)2SO4 NH4NO3 NH4NO3 NH4H2PO4 0,30 0,15 0,15 0,15 0,30 0,30 145 26 - 98 45 5,5 8000 3300 - 4100 4900 8000 (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Sự tạo thành glucoamylase cũng như amylase cực đại thường thấy ở các nồng độ nitơ cao (0,25%- 0,4%). Tỷ lượng giữa carbon và nitơ trong môi trường, tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và nitơ có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp sinh khối vi sinh vật và sự tạo thành amylase. Chỉ khi nào trong môi trường có đủ lượng carbon và nitơ cần thiết mới tích luỹ được enzyme cực lớn. Sự thiếu hụt cấu tử này không được bù đắp bằng sự dư thừa cấu tử kia. Tỷ lượng tối ưu của carbon và nitơ (C:N) cho sự sinh tổng hợp amylase là 10:1÷ 40:1. Nói cách khác hàm lượng C trong môi trường phải 10- 40 lần hơn hàm lượng nitơ. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 16 b. Ảnh hưởng của acid amin Acid amin là những cấu tử hợp thành phân tử enzyme. Acid amin có ảnh hưởng tốt đến sinh lý của vi sinh vật cũng như sinh tổng hợp enzyme amylase do các nguyên nhân sau: Acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn carbon, nguồn nitơ, và là nguồn năng lượng. Nhiều vi sinh vật có thể đồng hoá trực tiếp acid amin (Kônvalov, 1967). Một số acid amin riêng lẽ (acid glutamic, acid aspatic…) đóng vai trò vô cùng quan trọng trong trao đổi acid amin cụ thể là sinh tổng hợp nhiều acid amin khác trong quá trình chuyển amine hóa (Araiet và ctv, 1968). Nhiều acid amin tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong nước như acid pantotenic, biotin, acid folic,… các vitamin này có ý nghĩa sinh học rất lớn. Ngoài ra có những nhân xét cho rằng sự tổng hợp ARN trong tế bào một số vi sinh vật phụ thuộc vào sự có mặt của acid amin trong môi trường nuôi. Acid amin có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh tổng hợp enzyme. Một số acid amin kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp các amylase, một số thì ức chế quá trình này, một số thì không có ảnh hưởng gì cả. Chẳng hạn, sự tổng hợp α- amylase khi nuôi chủng Asp. awamori 78-2 được kích thích bởi hai acid amin là acid glutamic và tyrosine. Sự tổng hợp glucoamylase được tăng cường bằng 4 acid amin: acid glutamic, tyrosine, acid aspatic và β- alanine. c. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng Các nguyên tố đa vi lượng có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật. Mg2+ có ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzyme. MgSO4 sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp mọi amylase bởi nấm sợi. Khi đó sự tổng hợp α- amylase bị ức chế hoàn toàn, còn lượng glucoamylase giảm xuống hàng chục lần (Fenikxova, Muxaeva, 1967). Nồng độ tối ưu của muối này cho sinh tổng hợp α- amylase và glucoamylase là 0,05%, thiếu muối này không ảnh hưởng đến sự tạo thành oligo- 1,6- glucosidase (Silov, 1967). Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (nucleic acid phospholipide) và nhiều coenzyme (adenosine-phoshat, thiamine), đồng thời để phosphoril hóa glucid trong quá trình oxy hoá sinh học. Phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi và các vi sinh vật khác, do vậy mà tăng cường tổng hợp các enzyme amylase. Các muối phosphate thường được dùng với nồng độ cao tới 0,15M. Hoạt độ α- amylase và oligo-1,6- glucosidase tăng khi có 0,1% KH2PO4, còn hoạt độ glucoamylase tăng cực đại khi có 0,2% muối này. Calcium cần cho sự tổng hợp và ổn định α- amylase hoạt động vì nó là cấu tử không thể thiếu được của enzyme này. Nó còn có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác động của protease (Hsiu, 1964). Muốn tích lũy nhiều α- amylase cần có lượng Ca trong môi trường là 0,01- 0,05%. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 17 Lưu huỳnh kích thích tạo amylase (S có trong thành phần các acid amin quan trọng như methionine, cystein, cystine). Lưu huỳnh với hàm lượng 0,07g/ml môi trường là thích hợp nhất cho Asp. oryzae 3-9-15 tạo amylase (300-350 đv/100ml). Giảm hàm lượng lưu huỳnh tới 0,004% thì hoạt lực amylase giảm xuống hai lần. Ngoài Ca2+, trong phân tử α- amylase của Bac. subtilis còn có chứa ion Zn2+. Zn2+ có mặt trong enzyme của α- amylase của Bac. subtilis. Coban có tác dụng kích thích tổng hợp amylase. Trong tế bào có khoảng 50 tỷ protein, song chỉ có một số nguyên tử coban, trong tế bào có thể giảm tới một nguyên tử coban, nhưng tế bào vẫn còn sống, còn nếu tế bào không có coban thì tế bào sẽ chết (Purmal, 1963). Magan, đồng, thuỷ ngân kìm hãm sinh tổng hợp ở vi sinh vật pH môi trường. e. Ảnh hưởng của pH nguyên liệu Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt pH môi trường ảnh hưởng ít, do môi trường có dung lượng đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi mấy trong quá trình nuôi. Tuy nhiên pH ban đầu của môi trường cũng có ảnh hưởng không nhỏ tới sự phát triển của nấm mốc và sự tạo enzyme (Bảng 4). Bảng 4: Ảnh hưởng của pH cám đến sinh tổng hợp amylase pH Hoạt độ enzyme trong mốc thành phẩm đv/g Môi trường Các chất làm ẩm cám mì tới độ ẩm 60% Trước thanh trùng Sau thanh trùng Mốc thành phẩm α- amylase oligo-1,6- glucosidase Maltase Nước máy HCl (0,1N) HCl (0,2N) HCl (0,25N) HCl (0,3N) 6,0 5,0 4,5 4,0 3,6 6,1 6,7 6,8 6,1 6,0 6,4 6,7 6,8 6,1 6,0 25,0 27,3 24,7 10,4 8,7 1008 1230 1172 1100 1130 130 134 127 134 133 (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Đối với Asp. Awamori pH ban đầu là 6,3 thì nấm mốc tạo α- amylase cực lớn. Nếu pH ban đầu là 3 thì nấm sợi sẽ tạo nhiều oligo-1,6- glucosidase và α- 1,4- amyloglucosidase, còn pH là 7,4 thì sinh tổng hợp cả Bac. sublilis enzyme đều giảm (Grigorev, 1968). Đối với vi khuẩn pH tốt nhất để tạo enzyme là 6,6- 7,4. f. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường là 58- 60% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong quá trình nuôi. Độ ẩm mà tăng quá 55- 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50- 55% thì kìm hãm sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như sự tao amylase. Sự thay đổi độ ẩm của môi trường nuôi cấy đến hoạt độ của amylase thể hiện trong Bảng 5. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 18 Bảng 5 Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo amylase của Asp. oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt 20 giờ 34 giờ 42 giờ Phương án thí nghiệm Độ ẩm % Hoạt độ amylase * Độ ẩm % Hoạt độ amylase * Độ ẩm % Hoạt độ amylase * Khay để hở 27,8 15,0 23,8 18,0 22,0 20,5 Khay đậy nắp 46,4 20,4 42.4 32,9 42,4 36,7 (*): đv/g canh trường khô (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) 2.3 Kỹ thuật sản xuất amylase từ vi sinh vật Amylase vi sinh vật được sản xuất dưới nhiều dạng khác nhau như dạng thô, dạng tinh khiết cao, dạng tinh thể. Tuy nhiên, chúng đều được sản xuất bằng hai phương pháp nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy bề sâu. Amylase có thể sản xuất từ nhiều nguồn nấm mốc và vi khuẩn. Trong đó Asp. oryzae là chủng nấm mốc được sử dụng phổ biến để sản xuất amylase. Asp. oryzae thuộc lớp nang khuẩn Ascomycetes, bộ cúc khuẩn Plectascales, họ Aspergillaceae, giống Aspergillus. Là nấm mốc sinh sản vô tính bằng cách tạo thân quả hoặc cuống bào tử đính. Bào tử đính là tập hợp của những khuẩn ty cao xuất phát từ một tế bào lớn. Các nang quả phình to ở nang trên, chổ phình to có dạng hình cầu, hình bầu dục hoặc hình chuỳ được gọi là túi định. Tử túi định có vô vàn những mầm nhỏ gọi là thể bình mọc ra khắp mọi hướng, ở phần cuối của các mầm này gọi là các bào tử đính. Aspergillus oryzae có bào tử đính màu vàng hoa cau. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 19 2.3.1 Sơ đồ kỹ thuật sản xuất chế phẩm amylase từ Aspergillus oryzae Etanol 2.3.2 Thuyết minh quy trình Từ môi trường nuôi cấy bề mặt, chủng nấm mốc Asp. oryzae được nuôi cấy trên môi trường cám mì, cám gạo đã được tiệt trùng, sau đó enzyme trích ly bằng nước và lọc, dùng ethanol để kết tủa amylase, tiếp tục ly tâm và sấy kết tủa thu được chế phẩm và có thể nghiền nhỏ đem sử dụng dần.
Thành phần môi trường nuôi cấy Cấu tử chính của môi trường vi sinh vật tạo amylase bằng phương pháp bề mặt là cám mì, cám gạo. Cám mì và cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi vi sinh vật không cần bổ sung thêm các chất khác. Thành phần của cám mì và cám gạo được trình bày ở Bảng 6. Môi trường Trích ly bằng nước Lọc Kết tủa amylase Ly tâm Sấy kết tủa Chế phẩm amylase Nghiền và bảo quản Asp. oryzae Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 20 Bảng 6: Thành phần của cám mì và cám gạo Hàm lượng (%) Thành phần Cám mì Cám gạo Tinh bột Protein Methionine Cystin Arginin Lysin Tryptophan Chất béo Cellulose Các nguyên tố tro: Na K Ca P 16- 22 10- 12 0,19 0,3 1 6 0,3 3- 4 10,3 0,09 1 0,16 0,94 20 10- 14 10- 15 8- 10 37- 59 Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng đến hoạt lực của amylase, nên dùng cám tốt, mới, không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc, cấu tử được đưa vào có thể là chất làm xốp môi trường hoặc làm giàu thêm các chất sinh trưởng mà cám không có đủ, thường là mầm mạch (15- 20%), trấu (2- 25%), mùn cưa (5- 10%)... Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử vi sinh vật khác nên cần phải thanh trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa vi sinh vật ngoại lai. Nuôi cấy Asp. oryzae bằng phương pháp bề mặt trên môi trường cám gạo… có bổ sung thêm một số dinh dưỡng đặc trưng khác như N, P, Ca, Mg… Nhiệt độ nuôi Toàn bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia làm ba thời kỳ: Thời kỳ trương và nẩy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10- 11giờ đầu, đối với vi khuẩn 3- 4 giờ). Trong thời kỳ này phải đốt nóng không khí trong phòng nuôi và giữ cho nhiệt độ phòng không thấp hơn 23- 30 oC. Độ ẩm tương đối của không khí là 96- 100 %. Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (kéo dài trong vòng 4- 18 giờ). Ở giai đoạn này nấm mốc phát triển rất mạnh tạo ra một lượng nhiệt sinh lý rất lớn. Kết quả là trong sợi nấm đang mọc nhiệt độ tăng lên đến 37- 40oC, đôi khi cao hơn đến 47oC. Vì vậy, phải hạ nhiệt độ phòng nuôi giúp cho nấm mọc đều và đẹp. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 21 Thời kỳ tạo enzyme amylase mạnh mẽ (kéo dài từ 10- 20 giờ). Trong thời kỳ này các quá trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự tỏa nhiệt giảm mạnh. Các enzyme amylase được tổng hợp mạnh mẽ. Theo Rodxevits (Pozerur, 1967). Trong một ngày đầu ở giai đoạn sinh trưởng thứ nhất và thứ hai, Asp. oryzae chỉ tạo được có 7,5- 8%, trong 12 giờ sau, hoạt lực của α- amylase tăng 9- 12 lần, hoạt lực đường hóa tăng hai lần và hoạt lực của oligo-1,6-glucosidase tăng lên 10 lần. Nhiệt độ tối thích cho nấm mốc sinh trưởng là 28- 30oC. Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn: tùy thuộc vào tính chất sinh lý của từng chủng vi sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzyme mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất cứ lúc nào thấy cần thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì làm giảm hoạt lực của enzyme. Trong điều kiện sản xuất thoáng khí tốt thì thời gian nuôi có thể tích lũy amylase cực đối với các chủng nấm mốc như sau: Bảng 7: Thời gian nuôi cấy thích hợp của Asp. oryzae Chủng Thời gian nuôi (giờ) Asp. oryzae- 476 24- 25 Asp. oryzae- KC 30- 36 Asp. oryzae 8F1 24- 30 Trích ly enzyme Chiết tách enzyme từ môi trường rắn người ta thường dùng nước, các dung dịch muối trung tính, … có thể chiết tách được 90- 95% và trong nước chiết không chứa tạp chất không tan. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào một ít focmalin hoặc chất sát trùng khác. Chiết tách enzyme người ta dùng nước (25- 28oC) và lọc, sau đó tủa enzyme bằng ethanol. Khi cho dung môi vào dung dịch enzyme làm giảm khả năng tan của nước bao quanh enzyme. Dung môi hữu cơ này làm giảm hằng số điện môi của môi trường, đẩy một lượng nước lớn. Vì vậy các enzyme, cũng như các chất có phân tử thấp trong hệ dung dịch nước dung môi sẽ tủa và lắng xuống. Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch cồn – nước phụ thuộc vào nồng độ cồn, nhiệt độ pH, lực hút ion của dung dịch và tính chất enzyme của protein. Để tránh mất hoạt tính của enzyme, tất cả phải làm lạnh xuống 3- 5oC. Khi trộn phải khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa lắng xuống phải ly tâm ngay. Dùng ethanol kết tủa có nồng độ 60- 70% hoặc có thể dùng aceton 60% và giữ pH 5,5- 5,6 bằng (NH4)2SO4 (600g/lít). Ly tâm Là quá trình tách vật rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận enzyme, dung dịch này chứa enzyme ngoại bào. Phần lớn enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan. Như vậy, khi tiến hành ly tâm, dung dịch tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thô vì ngoài enzyme trong dung dịch còn có nước, Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 22 protein không hoạt động và các chất hòa tan khác. Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, người ta thường tiến hành ly tâm lạnh (3- 5oC). Sấy kết tủa Dịch enzyme sau khi ly tâm, ở trạng thái này enzyme rất dễ biến tính vì còn nhiều nước. Để dễ bảo quản, ta tiến hành sấy kết tủa enzyme ở nhiệt độ < 40oC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5- 8%. Nghiền và bảo quản Sau khi sấy, enzyme được nghiền mịn thành dạng bột cho vào bao bì kín, bảo quản ở nhiêt độ lạnh. 2.4 Một số ứng dụng của amylase trong thực phẩm 2.4.1 Sản xuất rượu Người ta dùng amylase làm tác nhân đường hoá trong công nghiệp sản xuất rượu cho phép tiết kiệm hàng vạn tấn nguyên liệu (đại mạch) loại tốt, rút ngắn quá trình sản xuẩt, tiết kiệm được sản xuất, bởi amylase thuỷ phân sâu sắc tinh bột thành đường lên men trong thời gian ngắn. Amylase không những quan trọng trong quá trình đường hoá mà còn cả giai đoạn xử lý nhiệt nguyên liệu nữa. Việc sử dụng amylase để dịch hoá tinh bột ở nhiệt độ 85- 90oC cho phép chỉ có thể hoàn toàn dùng hơi thứ cấp cho đun sơ bộ và làm dịu chế độ nấu. Điều này làm giảm chi phí hơi cho gia nhiệt và giảm bớt tổn thất tinh bột. Vì vậy, làm cho hiệu quả sản xuất tăng. 2.4.2 Sản xuất bia Trong công nghệ sản xuất bia, người ta thường sử dụng amylase có trong mầm đại mạch để thuỷ phân tinh bột. Nguyên liệu chính là đại mạch nẩy mầm loại tốt. Khác với rượu ở đây mức độ đường hoá trong nguyên liệu thấp hơn. Cần có dextrin chưa đường hoá làm cho bia có hương vị. Việc chuyển hoá tinh bột và các nước chiết của nguyên liệu này do amylase đảm nhiệm. Do đó trong quá trình dịch hoá và đường hoá thì enzyme có ý nghĩa và vai trò quan trọng bậc nhất. Việc bổ sung amylase vào trong quá trình sản xuất bia để làm tăng hiệu suất thu hồi cho từng giai đoạn. Do đó, việc sử dụng amylase trong sản xuất bia có hiệu suất cao sẽ: Giảm tổn thất tinh bột và các chất hoà tan khi cho hạt nẩy mầm, làm tăng hiệu suất chất hoà tan lên 0,6 % (tức là tiết kiệm được 0,9 % đại mạch). Giảm giá thành nguyên liệu hạt vì sử dụng nguyên liệu thay thế như gạo, bắp... những nguyên liệu này không nẩy mầm. Giảm chi phí lao động cho sản xuất malt. Tất cả các yếu tố trên làm cho giá bia giảm xuống. 2.4.3 Sản xuất bánh mì Bánh mì là một loại thực phẩm quen thuộc. Trong bánh mì, enzyme được xem như một chất phụ gia cho vào quá trình làm bánh để tăng chất lượng bánh mì. Enzyme có tác dụng làm tăng nhanh thể tích bánh, màu sắc đẹp và mùi thơm hơn. Trong sản xuất bánh mì người ta sử dụng cả α- amylase và β- amylase. Các enzyme này Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 23 tham gia thuỷ phân tinh bột để tạo thành đường. Nhờ đó nấm men Saccharomyces cerevisase sẽ dể dàng chuyển hoá chúng thành cồn, CO2 làm tăng thể tích bánh tạo màu sắc và hương vị tốt cho bánh. Việc sử dụng amylase cho phép sử dụng bột mì kém phẩm chất để làm bánh hoặc có thể giảm bớt tới 50% đường cho thêm vào bánh trong sản xuất bánh mì ngọt. 2.4.4 Sản xuất bánh kẹo Sử dụng amylase và protease vào chế biến bột trong quá trình sản xuất bánh quy. Các enzyme này hoạt động làm tăng đường khử và acid amin. Đường khử và các acid amin có trong khối bột đó sẽ cùng tham gia vào các phản ứng oxy hoá- khử, phản ứng Maillard và kết quả là tạo cho bánh có mùi, vị và màu hấp dẫn. 2.4.5 Sản xuất siro và các sản phẩm chứa đường Công nghệ sản xuất siro đường fructose từ bột bắp bằng phương pháp enzyme phát triển mạnh trên thế giới nhất là Châu Âu và Châu Mỹ. Theo phương phát này, phôi bắp sẽ được xử lý bằng SO2 và vi khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm ra và enzyme sẽ được sử dụng sau khi bột đã được hoà tan vào nước. Ở giai đoạn gia nhiệt người ta cũng cho một lượng nhỏ α- amylase vào để dịch tinh bột có độ nhớt thấp tránh hiện tượng cháy khét. Sau đó cho lượng còn lại vào giai đoạn đường hoá, các enzyme này giúp quá trình đường hoá được dễ dàng. Tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 24 CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu: Bao gồm cám, trấu, bột gạo, bột bắp, bột năng. 3.2 Đối tượng nghiên cứu Nấm sợi Aspergillus oryzae lấy từ viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học trường ĐH Cần Thơ. 3.3 Dụng cụ, hóa chất - Các dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật, khay - Máy hút chân không, máy xay khô - Tủ ấm. - Máy đo pH, đo độ ẩm - Máy đo mật độ quang - Một số dụng cụ và thiết bị khác. Địa điểm tiến hành thí nghiệm: phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 25 Hình 12: Máy đông khô Hình 13: Máy phân tích ẩm Hinh 14: Thiết bị đo mật độ quang Hình 15: Máy đo pH Hình 16: Tủ úm Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 26 Hóa chất: dung dịch tinh bột, amoni sulfat, dung dịch đệm acetate, thuốc thử Fehling I, II, dung dịch iod, dung dịch Na2S2O3, acid sulfuric 25%, dung dịch KI 30%, acid HCl 0,1N. Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự sinh tổng hợp enzyme amylase của nấm Asp. oryzae trên môi trường theo phương pháp nuôi cấy bề mặt với thành phần môi trường gồm cám, trấu và bột gạo, tinh bột, bột bắp. Và khảo sát hoạt tính của α- amylase theo Rukhliadeva, glucoamylase theo phương pháp vi lượng của V.Y. Rodzevich, O.P. Korenbiakina. 3.4 Phương pháp thí nghiệm 3.4.1 Qui trình thí nghiệm tham khảo Hình 17: Sơ đồ qui trình công nghệ tham khảo 3.4.2 Thí nghiệm a) Thí nghiêm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khác nhau và thời gian nuôi đến sự tổng hợp amylase Xử lí nguyên liệu Hấp thanh trùng (120oC, 15 phút) Làm nguội Nuôi cấy vi sinh vật Thu nhận môi trường sau nuôi cấy Nghiền mịn Amylase thô Nguyên liệu môi trường Sấy lạnh Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 27 - Mục đích: xác định thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp để sản xuất amylase có hoạt tính và sản lượng cao nhất. - Nguyên liệu: cám, trấu, bột gạo, tinh bột, bột bắp - Tiến hành thí nghiệm + Ch._.324.0 16.04 0.0000 AC 253522.0 6 42253.6 8.65 0.0000 BC 223286.0 3 74428.8 15.24 0.0000 ABC 363518.0 6 60586.4 12.41 0.0000 RESIDUAL 117189.0 24 4882.89 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 1.34488E7 47 -------------------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xv Multiple Range Tests for Htinh rieng glucoamylase by Bot -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Bot Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- Bnang 16 998.875 X Bbap 16 1127.77 X Bgao 16 1322.82 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- Bbap - Bgao *-195.058 50.9897 Bbap - Bnang *128.89 50.9897 Bgao - Bnang *323.947 50.9897 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Htinh rieng glucoamylase by Thanh phan MT nuoi cay -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 10 24 1063.16 X 5 24 1236.49 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 5 - 10 *173.332 41.6329 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Htinh rieng glucoamylase by Thoi gian nuoi cay -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 30 12 575.877 X 55 12 823.525 X 40 12 1392.81 X 50 12 1807.07 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 30 - 40 *-816.934 58.8779 30 - 50 *-1231.2 58.8779 30 - 55 *-247.648 58.8779 40 - 50 *-414.262 58.8779 40 - 55 *569.286 58.8779 50 - 55 *983.548 58.8779 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xvi ANOVA Table for Htinh glucoamylase rieng by Kieu MT_Tgian nuoi_Bot Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 1.33316E7 23 579633.0 118.71 0.0000 Within groups 117189.0 24 4882.89 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 1.34488E7 47 Multiple Range Tests for Htinh glucoamylase rieng by Kieu MT_Tgian nuoi_Bot -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A2/30/Bnang 2 252.84 X A1/30/Bnang 2 376.531 XX A2/30/Bbap 2 469.011 XX A1/55/Bnang 2 557.118 XX A1/30/Bbap 2 627.735 XX A2/55/Bbap 2 669.234 XX A2/55/Bnang 2 767.411 XX A1/30/Bgao 2 858.509 XX A2/30/Bgao 2 870.635 XXX A2/55/Bgao 2 939.897 XX A1/55/Bgao 2 944.2 XX A1/55/Bbap 2 1080.8 XX A2/40/Bgao 2 1161.46 X A1/40/Bnang 2 1363.37 X A2/40/Bnang 2 1396.62 XX A2/50/Bnang 2 1539.9 XX A1/40/Bbap 2 1573.29 X A2/40/Bbap 2 1749.54 X A2/50/Bbap 2 1749.55 X A1/50/Bnang 2 1754.18 X A1/50/Bbap 2 1843.85 XX A1/40/Bgao 2 1853.47 XX A2/50/Bgao 2 1953.52 XX A1/50/Bgao 2 2004.25 X -------------------------------------------------------------------------------- Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xvii Hoạt tính glucoamylase tổng Analysis of Variance for Htinh tong glucoamylase - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:Bot 6.31326E9 2 3.15663E9 109.77 0.0000 B:Thanh phan MT nu 9.05585E8 1 9.05585E8 31.49 0.0000 C:Thoi gian nuoi c 9.52439E10 3 3.1748E10 1103.99 0.0000 INTERACTIONS AB 2.7091E8 2 1.35455E8 4.71 0.0188 AC 4.62708E9 6 7.7118E8 26.82 0.0000 BC 1.11908E9 3 3.73026E8 12.97 0.0000 ABC 5.03522E9 6 8.39203E8 29.18 0.0000 RESIDUAL 6.90182E8 24 2.87576E7 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 1.14205E11 47 -------------------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple Range Tests for Htinh tong glucoamylase by Bot -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Bot Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- Bnang 16 89749.0 X Bbap 16 109549.0 X Bgao 16 116907.0 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- Bbap - Bgao *-7357.34 3913.1 Bbap - Bnang *19800.5 3913.1 Bgao - Bnang *27157.8 3913.1 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Htinh tong glucoamylase by Thanh phan MT nuoi cay -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 10 24 101058.0 X 5 24 109745.0 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 5 - 10 *8687.08 3195.03 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xviii Multiple Range Tests for Htinh tong glucoamylase by Thoi gian nuoi cay -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 30 12 50521.6 X 55 12 73541.3 X 40 12 140166.0 X 50 12 157378.0 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 30 - 40 *-89644.6 4518.45 30 - 50 *-106856.0 4518.45 30 - 55 *-23019.7 4518.45 40 - 50 *-17211.5 4518.45 40 - 55 *66624.9 4518.45 50 - 55 *83836.4 4518.45 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ANOVA Table for Htinh glucoamylase tong by Kieu MT_Tgian nuoi_Bot Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 1.13515E11 23 4.93544E9 171.62 0.0000 Within groups 6.90182E8 24 2.87576E7 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 1.14205E11 47 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xix Multiple Range Tests for Htinh glucoamylase tong by Kieu MT_Tgian nuoi_Bot -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A2/30/Bnang 2 22717.7 X A1/30/Bnang 2 33831.3 X A2/30/Bbap 2 40663.3 XX A1/55/Bnang 2 50057.1 XX A1/30/Bbap 2 56370.6 XX A2/55/Bbap 2 60318.0 XX A2/55/Bnang 2 67378.8 XX A1/30/Bgao 2 73505.5 XX A2/30/Bgao 2 76041.3 XX A2/55/Bgao 2 82673.3 X A1/55/Bgao 2 83051.8 X A1/55/Bbap 2 97768.8 X A2/40/Bgao 2 101744.0 X A1/40/Bnang 2 122498.0 X A2/40/Bnang 2 125486.0 XX A1/50/Bbap 2 136169.0 XX A2/50/Bnang 2 138360.0 X A1/50/Bnang 2 157662.0 X A2/40/Bbap 2 158106.0 X A2/50/Bbap 2 160223.0 X A1/40/Bgao 2 166386.0 XX A1/40/Bbap 2 166776.0 XX A2/50/Bgao 2 172866.0 XX A1/50/Bgao 2 178986.0 X -------------------------------------------------------------------------------- Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xx Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng điều kiện môi trường đến sự tạo thành amylase Hoạt tính α- amylase riêng Analysis of Variance for Htinh rieng amylase - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:Am nuoi cay 478.566 2 239.283 527.84 0.0000 B:Nhiet do 186.478 2 93.2388 205.68 0.0000 C:pH 165.254 2 82.6269 182.27 0.0000 INTERACTIONS AB 181.806 4 45.4515 100.26 0.0000 AC 270.439 4 67.6099 149.14 0.0000 BC 160.944 4 40.2359 88.76 0.0000 ABC 99.8336 8 12.4792 27.53 0.0000 RESIDUAL 12.2399 27 0.453329 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 1555.56 53 -------------------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple Range Tests for Htinh rieng amylase by Am nuoi cay -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Am nuoi cay Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 60 18 77.8522 X 50 18 82.0013 X 55 18 85.1199 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 50 - 55 *-3.11866 0.460498 50 - 60 *4.14908 0.460498 55 - 60 *7.26774 0.460498 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xxi Multiple Range Tests for Htinh rieng amylase by Nhiet do -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 35 18 79.6053 X 25 18 81.2627 X 30 18 84.1054 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 25 - 30 *-2.84271 0.460498 25 - 35 *1.65745 0.460498 30 - 35 *4.50016 0.460498 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Htinh rieng amylase by pH -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4.5 18 79.1929 X 5.5 18 82.7066 X 5 18 83.0739 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 4.5 - 5 *-3.88096 0.460498 4.5 - 5.5 *-3.51362 0.460498 5 - 5.5 0.367344 0.460498 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ANOVA Table for Htinh rieng amylase by Nhiet do_Do am_pH Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 1670.21 26 64.239 141.69 0.0000 Within groups 12.2411 27 0.453375 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 1682.45 53 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xxii Multiple Range Tests for Htinh rieng amylase by Nhiet do_Do am_pH -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 35/60/4.5 2 71.7054 X 35/50/4.5 2 74.1788 X 25/60/5.5 2 74.5226 X 35/50/5.0 2 75.1978 XX 25/55/4.5 2 76.4635 XX 30/60/5.5 2 76.5788 XXX 35/60/5.0 2 77.3342 XX 25/60/5.0 2 77.4379 XX 35/60/5.5 2 77.8615 XX 30/60/4.5 2 79.1195 XX 25/50/5.0 2 80.2553 XX 30/50/4.5 2 80.7491 X 30/60/5.0 2 81.5112 XX 30/55/4.5 2 81.5914 XX 35/50/5.5 2 82.2342 XX 25/55/5.5 2 82.5573 XX 25/50/4.5 2 83.4292 XX 35/55/4.5 2 84.3295 XX 25/60/4.5 2 84.5986 XX 25/50/5.5 2 84.836 X 30/55/5.5 2 86.9791 X 25/55/5.0 2 87.2639 X 30/50/5.0 2 87.7546 X 30/50/5.5 2 89.3764 X 35/55/5.5 2 89.4131 X 35/55/5.0 2 91.3714 X 30/55/5.0 2 93.2887 X -------------------------------------------------------------------------------- Hoạt tính α- amylase tổng Analysis of Variance for Htinh tong amylase - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:Am nuoi cay 1.04731E7 2 5.23656E6 2480.25 0.0000 B:Nhiet do 1.19208E7 2 5.96041E6 2823.10 0.0000 C:pH 673867.0 2 336934.0 159.59 0.0000 INTERACTIONS AB 1.8612E6 4 465301.0 220.39 0.0000 AC 1.38297E6 4 345742.0 163.76 0.0000 BC 354742.0 4 88685.5 42.01 0.0000 ABC 738560.0 8 92320.0 43.73 0.0000 RESIDUAL 57005.1 27 2111.3 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 2.74623E7 53 -------------------------------------------------------------------------------- Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xxiii Multiple Range Tests for Htinh tong amylase by Am nuoi cay -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Am nuoi cay Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 50 18 5951.56 X 60 18 6811.86 X 55 18 6945.33 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 50 - 55 *-993.774 31.4265 50 - 60 *-860.301 31.4265 55 - 60 *133.474 31.4265 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Htinh tong amylase by Nhiet do -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 25 18 5931.39 X 35 18 6728.44 X 30 18 7048.9 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 25 - 30 *-1117.51 205.048 25 - 35 *-797.049 205.048 30 - 35 *320.459 205.048 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Htinh tong amylase by pH -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4.5 18 6420.43 X 5.5 18 6599.05 XX 5 18 6689.26 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 4.5 - 5 *-268.828 205.048 4.5 - 5.5 -178.62 205.048 5 - 5.5 90.2084 205.048 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xxiv ANOVA Table for Htinh tong amylase by Nhiet do_Do am_pH Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 2.65563E7 26 1.02139E6 483.81 0.0000 Within groups 57001.1 27 2111.15 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 2.66133E7 53 Multiple Range Tests for Htinh tong amylase by Nhiet do_Do am_pH -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 25/50/5.0 2 5358.64 X 25/50/4.5 2 5504.66 X 25/55/4.5 2 5546.67 XX 25/50/5.5 2 5605.96 X 35/50/4.5 2 5874.22 X 35/50/5.0 2 5903.78 X 25/60/5.5 2 6001.31 X 35/50/5.5 2 6021.18 X 30/50/4.5 2 6044.88 X 25/55/5.5 2 6094.38 XX 25/60/5.0 2 6143.15 X 25/55/5.0 2 6363.29 X 30/50/5.0 2 6543.86 X 35/60/4.5 2 6604.78 X 30/50/5.5 2 6706.81 X 25/60/4.5 2 6764.5 X 35/60/5.0 2 6907.5 X 35/55/4.5 2 6929.36 X 35/60/5.5 2 6930.45 X 30/55/4.5 2 7057.65 X 30/60/5.5 2 7112.64 X 30/60/4.5 2 7334.38 X 30/55/5.5 2 7439.32 X 35/55/5.5 2 7479.41 X 30/60/5.0 2 7508.0 X 35/55/5.0 2 7643.21 X 30/55/5.0 2 7692.59 X -------------------------------------------------------------------------------- Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xxv Hoạt tính glucoamylase riêng Analysis of Variance for Htinh rieng glucoamylase - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:Am nuoi cay 912248.0 2 456124.0 94.28 0.0000 B:Nhiet do 1.07572E6 2 537861.0 111.18 0.0000 C:pH 812073.0 2 406037.0 83.93 0.0000 INTERACTIONS AB 355312.0 4 88828.0 18.36 0.0000 AC 122062.0 4 30515.6 6.31 0.0010 BC 663169.0 4 165792.0 34.27 0.0000 ABC 226238.0 8 28279.8 5.85 0.0002 RESIDUAL 130620.0 27 4837.79 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 4.29745E6 53 -------------------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple Range Tests for Htinh rieng glucoamylase by Am nuoi cay -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Am nuoi cay Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 50 18 835.976 X 60 18 895.153 X 55 18 1136.48 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 50 - 55 *-300.502 47.5712 50 - 60 *-59.1762 47.5712 55 - 60 *241.326 47.5712 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Htinh rieng glucoamylase by Nhiet do -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 35 18 792.746 X 25 18 937.811 X 30 18 1137.05 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 25 - 30 *-199.241 47.5712 25 - 35 *145.065 47.5712 30 - 35 *344.306 47.5712 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xxvi Multiple Range Tests for Htinh rieng glucoamylase by pH -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4.5 18 793.878 X 5.5 18 983.229 X 5 18 1090.5 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 4.5 - 5 *-296.622 47.5712 4.5 - 5.5 *-189.35 47.5712 5 - 5.5 *107.272 47.5712 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ANOVA Table for Htinh rieng glucoamylase by Nhiet do_Do am_pH Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 4.13689E6 26 159111.0 32.84 0.0000 Within groups 130804.0 27 4844.61 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 4.26769E6 53 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xxvii Multiple Range Tests for Htinh rieng glucoamylase by Nhiet do_Do am_pH -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 25/50/4.5 2 598.636 X 25/50/5.5 2 637.819 XX 35/50/4.5 2 663.16 XXX 35/60/4.5 2 690.713 XXX 35/50/5.0 2 702.394 XXXX 25/60/4.5 2 762.572 XXXX 35/60/5.0 2 769.62 XXXX 35/55/4.5 2 781.917 XXX 25/60/5.0 2 801.758 XXXX 30/50/4.5 2 836.036 XXX 30/55/4.5 2 852.545 XX 25/50/5.0 2 870.189 XX 30/50/5.5 2 870.862 XX 35/55/5.5 2 872.821 XX 30/60/4.5 2 875.258 XX 35/50/5.5 2 886.603 XX 35/60/5.5 2 897.89 XXX 30/60/5.5 2 905.317 XXX 35/55/5.0 2 939.962 XX 25/60/5.5 2 1034.61 XX 25/55/4.5 2 1115.86 X 25/55/5.0 2 1296.86 X 30/60/5.0 2 1318.63 XX 25/55/5.5 2 1321.99 XX 30/55/5.5 2 1421.14 XX 30/50/5.0 2 1458.09 X 30/55/5.0 2 1695.58 X -------------------------------------------------------------------------------- Hoạt tính glucoamylase tổng Analysis of Variance for Htinh tong glucoamylase - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:Am nuoi cay 8.62128E9 2 4.31064E9 147.27 0.0000 B:Nhiet do 9.03008E9 2 4.51504E9 154.26 0.0000 C:pH 4.99606E9 2 2.49803E9 85.35 0.0000 INTERACTIONS AB 1.365E9 4 3.4125E8 11.66 0.0000 AC 7.80199E8 4 1.9505E8 6.66 0.0007 BC 4.10342E9 4 1.02585E9 35.05 0.0000 ABC 1.45708E9 8 1.82135E8 6.22 0.0001 RESIDUAL 7.90273E8 27 2.92694E7 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 3.11434E10 53 -------------------------------------------------------------------------------- Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xxviii Multiple Range Tests for Htinh tong glucoamylase by Am nuoi cay -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Am nuoi cay Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 50 18 60998.9 X 60 18 78540.3 X 55 18 91852.7 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 50 - 55 *-30853.8 3700.22 50 - 60 *-17541.4 3700.22 55 - 60 *13312.4 3700.22 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Htinh tong glucoamylase by Nhiet do -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 35 18 67036.0 X 25 18 68971.6 X 30 18 95384.4 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 25 - 30 *-26412.8 3700.22 25 - 35 1935.61 3700.22 30 - 35 *28348.4 3700.22 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Htinh tong glucoamylase by pH -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4.5 18 64490.1 X 5.5 18 79098.8 X 5 18 87803.1 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 4.5 - 5 *-23313.0 3700.22 4.5 - 5.5 *-14608.7 3700.22 5 - 5.5 *8704.3 3700.22 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 năm 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng xxix ANOVA Table for Htinh tong glucoamylase by Nhiet do_Do am_pH Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 3.13044E10 26 1.20401E9 41.01 0.0000 Within groups 7.92787E8 27 2.93625E7 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 3.20971E10 53 Multiple Range Tests for Htinh tong glucoamylase by Nhiet do_Do am_pH -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 25/50/4.5 2 39498.0 X 25/50/5.5 2 42147.1 XX 35/50/4.5 2 52515.6 XX 35/50/5.0 2 55145.0 XX 25/50/5.0 2 58102.5 XXX 25/60/4.5 2 60975.3 XXX 30/50/4.5 2 62585.6 XXXX 25/60/5.0 2 63603.4 XXXXX 35/60/4.5 2 63621.6 XXXXX 35/55/4.5 2 64250.1 XXXX 35/50/5.5 2 64917.1 XXXX 30/50/5.5 2 65349.5 XXXX 35/60/5.0 2 68742.4 XXX 35/55/5.5 2 73011.5 XXX 30/55/4.5 2 73745.1 XX 35/60/5.5 2 79921.2 X 25/55/4.5 2 80944.4 X 30/60/4.5 2 81136.4 X 35/55/5.0 2 81607.5 X 25/60/5.5 2 83317.4 X 30/60/5.5 2 84085.8 XX 25/55/5.0 2 94566.8 XX 25/55/5.5 2 97589.4 X 30/50/5.0 2 108730.0 X 30/60/5.0 2 121459.0 X 30/55/5.5 2 121550.0 X 30/55/5.0 2 143209.0 X -------------------------------------------------------------------------------- ._.