Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm kháng thể lòng đỏ chống Mycoplasma Gallisepticum và ứng dụng thử nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---------
--------- NGUYỄN THỊ TỊNH NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM KHÁNG THỂ LÒNG ðỎ CHỐNG MYCOPLASMA GALLISEPTICUM VÀ ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: TS. TRẦN THỊ LAN HƯƠNG Người giúp ñỡ khoa học : PGS.TS. TÔ LONG THÀNH HÀ NỘI - 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… i Lêi cam ®oan T«i xin cam ®oan c¸c sè liÖu, kÕt qu¶ nghiªn cøu trong luËn v¨n nµy lµ trung thùc vµ ch−a tõng ®−îc ai c«ng bè trong bÊt k× c«ng tr×nh nµo kh¸c. T«i xin cam ®oan r»ng c¸c th«ng tin, tµi liÖu trÝch dÉn trong luËn v¨n ®Òu ®−îc chØ râ nguån gèc. Hµ Néi, th¸ng 12 n¨m 2009 T¸c gi¶ luËn v¨n NguyÔn ThÞ TÞnh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… ii Lêi c¶m ¬n T«i xin tr©n träng c¶m ¬n TS.TrÇn ThÞ Lan H−¬ng, TS.T« Long Thµnh ng−êi ®· trùc tiÕp h−íng dÉn vµ gióp ®ì t«i hoµn thµnh ®Ò tµi nghiªn cøu nµy. T«i xin c¶m ¬n c¸c thÇy gi¸o, c« gi¸o tr−êng §¹i häc N«ng nghiÖp Hµ Néi ®· tËn t×nh gi¶ng d¹y, truyÒn ®¹t kiÕn thøc cho líp Cao häc Khãa 16 chuyªn ngµnh Thó y. T«i xin c¶m ¬n Ban l·nh ®¹o C«ng ty RTD, c¸n bé vµ nh©n viªn phßng C«ng nghÖ – RTD ®· t¹o ®iÒu kiÖn gióp ®ì t«i trong suèt thêi gian häc tËp, nghiªn cøu t¹i C«ng ty. Cuèi cïng, xin ®−îc dµnh t×nh c¶m s©u s¾c nhÊt tíi gia ®×nh, ng−êi th©n vµ b¹n bÌ ®· ®éng viªn t«i trong suèt thêi gian tham gia kho¸ häc nµy. Hµ Néi, th¸ng 12 n¨m 2009 T¸c gi¶ luËn v¨n NguyÔn ThÞ TÞnh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan…………………………………………………………………. i Lời cảm ơn………………………….……………………………………….. ii Danh mục các bảng trong luận văn…………………………………….…… iii Danh mục các biểu ñồ trong luận văn………………………………………. iv Danh mục các ảnh trong luận văn……………….………………..…….…… v Bảng các chữ viết tắt trong luận văn……………………………...……..….. vi MỞ ðẦU .............................................................................................................. 1 1. Tính cấp thiết của ñề tài .................................................................................... 1 2. Mục tiêu của ñề tài ............................................................................................ 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài ......................................................... 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3 1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh CRD ở gà trên thế giới và Việt Nam................ 3 1.2. Một số ñặc ñiểm cơ bản của mầm bệnh Mycoplasma gallisepticum ........... 7 1.3. Bệnh CRD ở gà ............................................................................................11 1.4. Cơ sở khoa học của việc sản xuất chế phẩm kháng thể lòng ñỏ chống MG ñể phòng, trị bệnh CRD ở gà ..............................................................................25 Chương 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................................................................30 2.1. Nội dung nghiên cứu....................................................................................30 2.2. Nguyên liệu nghiên cứu...............................................................................30 2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................31 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..........................40 3.1. Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm kháng thể lòng ñỏ chống Mycoplasma gallisepticum (MG) .......................................................................40 3.1.1. Quy trình gây tối miễn dịch cho gà ñẻ ...............................................40 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… iv 3.1.2. Xác ñịnh HGKTMG trong huyết thanh gà ñẻ sau mỗi lần tiêm miễn dịch................................................................................................................................51 3.1.3. Xác ñịnh diễn biến HGKTMG trong huyết thanh gà ñẻ sau khi gây tối miễn dịch ......................................................................................................................53 3.1.4. Xác ñịnh HGKTMG trong lòng ñỏ trứng của gà ñẻ sau khi gây tối miễn dịch................................................................................................................................55 3.1.5. Xác ñịnh mối tương quan giữa HGKTMG trong huyết thanh với HGKTMG trong lòng ñỏ trứng của gà ñẻ sau khi gây tối miễn dịch ...............57 3.2. Quy trình sản xuất chế phẩm KTLðMG…………………......................60 3.2.1. Thu hoạch trứng ..............................................................................................60 3.2.2. Các giai ñoạn trong quá trình sản xuất chế phẩm KTLðMG ................60 3.2.3. Sản xuất chế phẩm KTLðMG .......................................................................62 3.3. Xác ñịnh HGKTMG có trong chế phẩm KTLð………………………...63 3.4. Kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của chế phẩm KTLðMG……………………65 3.5. Kiểm tra chỉ tiêu an toàn của chế phẩm KTLðMG khi tiêm thử nghiệm trên gà………………………………………………………………………..67 3.6. Kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của chế phẩm KTLðMG……………………69 3.7. Xác ñịnh thời gian bảo quản chế phẩm KTLðMG……………………..71 3.8. Ứng dụng thử nghiệm chế phẩm KTLðMG trong phòng, trị bệnh CRD cho gà ở nước ta……………………………………………………………..73 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ……………..…………………………….........76 1. KẾT LUẬN……………………………………………………………….76 2. ðỀ NGHỊ………………………………………………………….............76 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………….……………………………......… 77 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… v DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Bảng 3.1. Quy trình gây tối miễn dịch MG cho gà ñẻ ........................................50 Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra HGKTMG trong huyết thanh gà ñẻ sau mỗi lần tiêm miễn dịch……………………………………………………………….51 Bảng 3.3. Kết quả xác ñịnh HGKTMG trong huyết thanh gà ñẻ sau khi gây tối miễn dịch…………………………………………………………………….54 Bảng 3.4. Kết quả xác ñịnh HGKTMG trong lòng ñỏ trứng của gà ñẻ sau khi gây tối miễn dịch…………………………………………………………….56 Bảng 3.5. Tương quan giữa HGKTMG trong huyết thanh gà ñẻ với HGKTMG trong lòng ñỏ trứng……………………………………………...58 Bảng 3.6. Một số chỉ tiêu, thông số kỹ thuật trong quá trình sản xuất chế phẩm KTLðMG……………………………………………………………..61 Bảng 3.7. Kết quả sản xuất chế phẩm KTLðMG sau 4 tháng thí nghiệm…..62 Bảng 3.8. Kết quả xác ñịnh HGKTMG trong chế phẩm KTLð………………...64 Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra vô trùng của chế phẩm KTLðMG……………..66 Bảng 3.10. Kết quả thử an toàn trên gà của chế phẩm KTLðMG…………..68 Bảng 3.11. Kết quả xác ñịnh hiệu lực của chế phẩm KTLðMG……………70 Bảng 3.12. Kết quả xác ñịnh thời gian bảo quản chế phẩm KTLðMG ở nhiệt ñộ 4 - 80C…………………………………………………………………….72 Bảng 3.13. Kết quả ñiều trị bệnh CRD ở gà bằng chế phẩm KTLðMG…... 74 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… vi DANH MỤC CÁC BIỂU ðỒ TRONG LUẬN VĂN Biểu ñồ 3.1. Biểu diễn HGKTMG trong huyết thanh của gà ñẻ ở 3 quy trình thí nghiệm ....................................................................................................................53 Biểu ñồ 3.2. Biến ñộng HGKTMG trong huyết thanh gà ñẻ sau khi gây tối miễn dịch…………………………………………………………………….55 Biểu ñồ 3.3. So sánh HGKTMG trong huyết thanh với HGKTMG trong lòng ñỏ trứng của gà ñẻ sau khi gây tối miễn dịch………………………………..59 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… vii DANH MỤC CÁC ẢNH TRONG LUẬN VĂN Ảnh 3.1. ðàn gà ñẻ ñược gây tối miễn dịch với MG………..………………59 Ảnh 3.2. Trứng từ gà ñược tối miễn dịch với MG…………………………..60 Ảnh 3.3. Lọ 100 ml kháng thể MYCO ……………………………………...63 Ảnh 3.4. Kiểm tra HGKTMG trong chế phẩm KTLð bằng phản ứng HI…..55 Ảnh 3.5. Bệnh tích gà bị bệnh do Mycoplasma gallisepticum gây ra……….75 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… viii BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CRD Chronic Respiratory Disease HA Hemagglutination HGKT Hiệu giá kháng thể HI Haemagglutination Inhibition KHKT Khoa học kỹ thuật KHNN Khoa học Nông nghiệp KN Kháng nguyên KNCð Kháng nguyên cường ñộc KT Kháng thể KT MYCO Kháng thể Mycoplasma gallisepticum KTLðMG Kháng thể lòng ñỏ Mycoplasma gallisepticum MG Mycoplasma gallisepticum RPA Rapid plate agglutination Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 1 MỞ ðẦU 1. Tính cấp thiết của ñề tài CRD (Chronic Respiratory Disease) còn gọi là bệnh viêm ñường hô hấp mạn tính của nhiều loại gia cầm nhưng phổ biến nhất là ở gà và gà tây. CRD là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ñối với gà, nhất là gà ñược nuôi theo phương thức công nghiệp. Bệnh làm giảm sức ñề kháng của gà, giảm chất lượng thịt của ñàn gà thịt. Mầm bệnh truyền lây qua trứng làm giảm tỷ lệ ñẻ, tăng tỷ lệ chết phôi trong quá trình ấp nở, làm giảm khả năng sinh trưởng và tiêu tốn nhiều thức ăn trên ñàn gà con. Bệnh thường ở dạng ẩn tính, tạo cơ hội cho các bệnh khác phát triển (ðào Thị Hảo, 2008 [7]. Bệnh có thể làm giảm tỷ lệ ñẻ của gà ñến 30%, giảm tỷ lệ ấp nở 14% và giảm tăng trọng ñến 16% (Phạm Văn ðông, 2002) [5]. Ở Việt Nam do ñiều kiện khí hậu nóng ẩm về mùa hè, mưa phùn gió bắc về mùa ñông, sự chênh lệch về nhiệt ñộ trong ngày khá cao dẫn ñến trạng thái cân bằng của cơ thể dễ bị phá vỡ, sức ñề kháng của con vật giảm lúc này mầm bệnh tồn tại trong cơ thể gặp ñiều kiện thuận lợi trỗi dậy, phát triển và gây bệnh. Trong những năm gần ñây ñã có nhiều công trình nghiên cứu về CRD như: ðiều tra tình hình nhiễm bệnh (ðào Thị Hảo, 1996) [6]; Sử dụng các loại kháng sinh ñể phòng trị bệnh (Nguyễn Hữu Vũ, 1996) [24]; Dùng vaccine phòng bệnh (Vũ Quang Hợp, 1997) [8]… Các công trình trên chỉ dừng lại ở từng khía cạnh, trong phạm vi một trại hoặc trong ñiều kiện còn hạn chế về thuốc và vaccine nên chưa mang tính toàn diện và ñồng bộ. Mặt khác, mỗi vùng ñịa lý khác nhau mang ñặc ñiểm dịch tễ ñặc thù riêng, do ñó biện pháp phòng trị bệnh cũng khác nhau. Hiện nay chưa có thuốc ñặc hiệu ñể ñiều trị CRD ở gà, dùng kháng sinh và Sunfamit chỉ có tác dụng chữa triệu chứng và phòng trị những bệnh nhiễm trùng kế phát. Hiệu quả ñiều trị của kháng sinh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 2 ñối với Mycoplasma không cao. Chưa có loại kháng sinh nào có thể loại bỏ hoàn toàn ñược mầm bệnh mà chỉ có tác dụng khống chế mầm bệnh Mycoplasma cũng như các loại mầm bệnh khác có khả năng bội nhiễm (Nhữ Văn Thụ và cộng sự, 2007) [22]. ðể góp phần hạn chế những thiệt hại về kinh tế do bệnh gây ra và ñưa ra phác ñồ phòng trị bệnh có hiệu quả, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm kháng thể lòng ñỏ chống Mycoplasma gallisepticum và ứng dụng thử nghiệm”. 2. Mục tiêu của ñề tài 2.1. Xây dựng ñược quy trình gây tối miễn dịch cho ñàn gà ñẻ trứng với Mycoplasma gallisepticum. 2.2. ðưa ra ñược quy trình sản xuất chế phẩm kháng thể lòng ñỏ Mycoplasma gallisepticum ñể phòng trị bệnh do Mycoplasma gallisepticum gây ra trên ñàn gà. 2.3. ðưa ra ñược phác ñồ phòng và trị bệnh do Mycoplasma gallisepticum gây ra trên ñàn gà. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài - Góp phần ñề ra biện pháp phòng trị bệnh CRD ở gà ñạt hiệu quả cao. - Chế phẩm kháng thể lòng ñỏ dùng phòng và trị bệnh CRD sẽ hạn chế sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh CRD ở gà trên thế giới và Việt Nam 1.1.1. Tình hình bệnh CRD ở gà trên thế giới Nguyên nhân chính gây bệnh CRD ở gà là do Mycoplasma gallisepticum (MG). Bệnh gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho ngành chăn nuôi, ñặc biệt là chăn nuôi gia cầm theo phương thức công nghiệp. Từ thập kỷ 70 cho ñến nay, bệnh CRD ở gà luôn ñược các nhà khoa học thú y quan tâm nghiên cứu ñể tìm ra những biện pháp phòng trị bệnh ñem lại hiệu quả kinh tế cao ñồng thời tạo ra ñược những giống gà sạch bệnh, kháng bệnh. Năm 1954, nhiều tác giả ñã nghiên cứu bệnh CRD ở gà tại một số nước trong khu vực châu Á cho thấy: bệnh là do Mycoplasma gallisepticum (MG) và Mycoplasma synoviae (MS) gây ra. Các tác giả ñã dùng vaccine MG nhược ñộc phòng bệnh ñạt hiệu quả kinh tế và tạo ra ñàn gà sạch bệnh (Sato, 1996) [68]. Năm 1979, Harbi và cộng sự [44] ñã thông báo về kết quả phân lập và giám ñịnh mầm bệnh ở gà bị mắc bệnh CRD tại Sudan là do MG. Năm 1984, Lin và cộng sự [57] ñã nghiên cứu ñánh giá khả năng tạo miễn dịch của các chủng vaccine nhược ñộc cho thấy các loại vaccine nhược ñộc có hiệu quả phòng bệnh CRD cho gà con. Tại Mỹ vào năm 1986, Mohammed và cộng sự [60] ñã dùng phản ứng ELISA ñể phát hiện kháng thể MG, MS trong lòng ñỏ trứng và trong huyết thanh gà, các tác giả cho thấy phản ứng này rất nhạy. Tác giả Bencina và cộng sự (1989) [28] ñã nghiên cứu thành công kỹ thuật chẩn ñoán nhanh MG và MS bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp ñể chẩn ñoán bệnh phẩm lấy từ ñường hô hấp trên của gà nghi mắc bệnh CRD tại Nam Tư. Các tác giả ñã xác ñịnh ñược tỷ lệ nhiễm MG và MS ở gà 12 tuần tuổi là 74% và 55% bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 4 tiếp. Năm 1990, tác giả Bradbury và cộng sự [30] ñã sử dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang ñể chẩn ñoán bệnh CRD ở gia cầm. Tại Nhật, vào năm 1989 tác giả Shimizu và cộng sự [69] ñã nghiên cứu thành công kỹ thuật dùng phản ứng ức chế hấp phụ hồng cầu bám dính ñể phát hiện kháng thể MG. Năm 1990 tại Úc, Morrow và Bell [62] chẩn ñoán bệnh CRD bằng phản ứng ELISA cho thấy có 20% số gà mắc bệnh do MG. Tác giả Fan và cộng sự (1995) [41] ñã nghiên cứu cho thấy: phản ứng PCR rất nhạy và có khả năng xác ñịnh ñược mầm bệnh khi không nuôi cấy phân lập ñược. Theo Shukla và cộng sự (1985) [71] khi kiểm tra MG ở 195 mẫu huyết thanh gà bằng phản ứng ngưng kết thấy 42,5% mẫu dương tính. Tác giả Barbour và cộng sự (1998) [27] ñã nghiên cứu sử dụng loại kháng sinh Enrofloxacin trong ñiều trị bệnh do MG và kết quả cho thấy Enrofloxacin có ñộ nhạy cao với MG. Theo Sumano và cộng sự (1998) [73] ñã sử dụng hai loại kháng sinh Enrofloxacin và Norfloxacin ñiều trị ñàn gà bị bệnh CRD, kết quả cho thấy hai loại kháng sinh này ñều ñạt hiệu quả tốt. Tác giả Jordan và cộng sự (1998) [49] ñã công bố kết quả khi sử dụng một số loại kháng sinh ñể ñiều trị ñàn gà bị bệnh do MG. Kết quả cho thấy: Valnemulin, Tiamulin, Tylosin, Enrofloxacin có tác dụng tốt hơn so với Lincomycin và Spectinomycin. Năm 1996, Jordan và cộng sự [48] ñã nghiên cứu hai loại kháng sinh Valnemulin và Tylosin ñể phòng bệnh CRD do MG, MS cho thấy hai loại kháng sinh này có hiệu quả phòng bệnh CRD do MG gây ra. Tại Mỹ, tác giả Branton và cộng sự (1997) [33] ñã nghiên cứu ảnh hưởng của MG (chủng F) và MS ñến tỷ lệ ñẻ, kích cỡ trứng cho thấy sự sai khác này không ñáng kể. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 5 Năm 1997, Kempf và cộng sự [50] ñã tiến hành nghiên cứu các phương pháp chẩn ñoán (phân lập, RPA, ELISA) bằng cách gây nhiễm chủng MG không ñiển hình cho gà. Kết quả cho thấy khó chẩn ñoán bằng các phương pháp trên ñối với MG ñã biến chủng. Tại ðài Loan vào năm 1994, Lin và cộng sự [58] ñã công bố có 21 loại kháng sinh mẫn cảm với Mycoplasma phân lập từ gia cầm. Nhờ áp dụng chương trình quốc gia khống chế bệnh CRD ở các nước tiên tiến trên thế giới như Mỹ, Hà Lan, ðức, Pháp... ñã tạo ra ñược những ñàn gà sạch bệnh, cung cấp trứng và gà giống an toàn bệnh CRD cho các cơ sở chăn nuôi. Hiện nay ở các nước này những ñàn gà có kết quả dương tính khi kiểm tra phát hiện có MG ñều không ñược dùng làm giống. 1.1.2. Tình hình bệnh CRD ở gà tại Việt Nam Ở Việt Nam, bệnh CRD ở gà công nghiệp ñược phát hiện ñầu tiên vào năm 1972 (ðào Trọng ðạt và cộng sự, 1978) [4]. ðến nay ñã có một số công trình nghiên cứu về bệnh như: Phan Lục và cộng sự (1994) [11]; Hồ ðình Chúc (1989) [3]; Nguyễn Ngọc Nhiên và cộng sự (1999) [15]. Các tác giả ñều cho rằng bệnh CRD ở Việt Nam chủ yếu ñều do chủng MG. Ở nước ta bệnh CRD xảy ra quanh năm do khí hậu thời tiết thay ñổi thất thường, ñiều kiện vệ sinh và chăm sóc nuôi dưỡng kém. Ngoài ra bệnh còn kết hợp với một số bệnh khác gây ra những vụ dịch lớn và có tỷ lệ chết cao, do vậy CRD là một trong những bệnh gây nhiều thiệt hại về kinh tế cho ngành chăn nuôi gà. Nguyễn Vĩnh Phước và Nguyễn Thị Như Nguyệt (1985) [17] khi nghiên cứu bệnh CRD ở gà công nghiệp tại một số tỉnh phía nam, cho thấy: tỷ lệ nhiễm MG từ 76,9 - 95,2%, bệnh thường bắt ñầu từ tháng 3 ñến tháng 4 và tăng dần, ñến tháng 7 và tháng 8 trở ñi bệnh giảm xuống. Theo Phạm Thị Thu Lan và cộng sự (1988) [10] khi theo dõi bệnh CRD ở xí nghiệp gà thành phố Nha Trang cho thấy tỷ lệ gà nhiễm bệnh là 27,84%. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 6 Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1985) [17]; Phạm Thị Thu Lan (1988) [10] việc sử dụng vaccine Lasota ñối với gà nhiễm MG ẩn tính thường xuất hiện triệu chứng theo 3 hướng: bệnh CRD phát ra dữ dội hoặc bệnh Newcastle có thể xảy ra hoặc có sự ức chế miễn dịch ñối với vaccine Newcastle. Ở ñàn gà 3 - 4 tuần tuổi, khi xuất hiện triệu chứng ñầu tiên của bệnh CRD nếu tiếp tục sử dụng vaccine Lasota theo ñịnh kỳ 30 - 35 ngày tuổi thì có tới 80% gà phát bệnh nặng. Hoàng Xuân Nghinh (1996) [13] ñã nghiên cứu biến ñổi bệnh lý ñường hô hấp ở gà trong bệnh ñường hô hấp mạn tính cho biết: triệu chứng lâm sàng, bệnh tích ñại thể của các cơ quan ở những gà chết sau khi gây bệnh thực nghiệm rất ñiển hình, ñặc trưng ñối với bệnh CRD gây ra do MG. Bệnh tích vi thể ở khí quản và phổi gà có sự biến ñổi bệnh lý rất ñặc trưng. Tác giả cũng ñã sử dụng Genta - tylo và Anti - CRD ñể ñiều trị bệnh CRD kết quả cho thấy: các triệu chứng lâm sàng của bệnh nhanh chóng mất ñi, tỷ lệ chết giảm nhưng gà vẫn còn bệnh tích của bệnh. ðào Thị Hảo (1996) [6] ñã nghiên cứu tình hình Mycoplasmosis trên ñàn gà công nghiệp tại Thụy Phương - Hà Nội cho biết: tỷ lệ nhiễm MG ở gà Goldline là 60,56%; Ross 208 là 28,15% và Tam Hoàng là 9,0%. Tỷ lệ nhiễm MG tăng lên theo lứa tuổi, vụ ñông xuân cao hơn vụ hè thu. Tỷ lệ nhiễm và hiệu giá kháng thể càng cao thì tỷ lệ ñẻ của gà càng giảm. Nguyễn Hữu Vũ (1996) [24] qua theo dõi bệnh CRD ở vùng Hà Tây, ðông Anh, Gia Lâm bằng phản ứng RPA ñã xác ñịnh: tỷ lệ nhiễm bệnh ở ñàn gà giống là 8,95% và tỷ lệ nhiễm ở ñàn gà thương phẩm là 51,5%. Tác giả ñã công bố kết quả ñiều trị bệnh CRD cho gà bằng các loại chế phẩm từ Tylosin, Tiamulin, Genta - tylo và Chlortylodexa tỷ lệ khỏi bệnh từ 83,60 - 94,50%. ðối với việc phòng bệnh CRD bằng Tylosin và Tiamulin cũng ñạt hiệu quả từ 92 - 95%. Tác giả Vũ Quang Hợp (1997) [8] ñã nghiên cứu tình hình nhiễm bệnh CRD tại xí nghiệp gà Lương Mỹ cho thấy: tỷ lệ nhiễm MG tăng lên theo lứa Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 7 tuổi (từ 7,14 - 22,71%) và khi sử dụng vaccine MG vô hoạt tiêm phòng cho ñàn gà ñạt hiệu quả kinh tế cao hơn so với gà không tiêm vaccine, giảm tỷ lệ gà mắc bệnh và chết do CRD (tỷ lệ chết 2,92 - 3,8% so với 8,5%), sản lượng trứng ở gà ñược tiêm vaccine cũng cao hơn so với gà không tiêm (119 - 121 quả so với 105 quả). Tác giả Nguyễn Hoài Nam (1999) [12] nghiên cứu bệnh CRD cho thấy: tỷ lệ mắc CRD tổng ñàn ở 3 cơ sở nuôi gà tập trung tại Hoà Bình và Hà Nội (1993 - 1996) biến ñộng từ 3,26 - 5,28%. Tỷ lệ phân lập ñược Mycoplasma từ gà có triệu chứng, bệnh tích CRD là 57,83% trên môi trường MB và 43,37% trên môi trường MA, mầm bệnh phân lập ñược là MG. Tác giả cũng ñã gây bệnh thực nghiệm cho gà bằng chủng phân lập ñược và dùng kháng sinh ñể ñiều trị ñạt tỷ lệ khỏi khá cao (Genta - tylo ñạt tỷ lệ khỏi là 86%, Anti - CRD ñạt tỷ lệ khỏi là 82%). Tỷ lệ nhiễm CRD ở ñàn gà bệnh là 61,64% và ở ñàn gà không có bệnh là 4,59%. Tỷ lệ tử vong chung tổng ñàn trung bình/năm dao ñộng từ 30,37 - 48,88% và tỷ lệ tử vong ở gà con mắc CRD cao hơn gà lớn là 2,8 lần. Tác giả Nhữ Văn Thụ và cộng sự (2001) [21] ñã nghiên cứu về phản ứng PCR cho thấy: chẩn ñoán CRD bằng phản ứng PCR cho kết quả cao hơn rất nhiều so với phương pháp RPA. Phương pháp PCR có thể xác ñịnh mầm bệnh có trong chất ñộn chuồng, nước uống cũng như trong phôi gà mà phương pháp RPA không thể xác ñịnh ñược. Tác giả ðào Thị Hảo (2008) [7] sử dụng kháng nguyên MG tự chế phát hiện bệnh CRD của 2 giống gà Lương Phượng và Tam Hoàng tại một số cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp cho thấy: tỷ lệ nhiễm bệnh CRD trung bình của 2 giống gà là 42,19%. 1.2. Một số ñặc ñiểm cơ bản của mầm bệnh Mycoplasma gallisepticum 1.2.1. Hình thái, cấu tạo của Mycoplasma gallisepticum (MG) MG là một loại vi sinh vật ña hình thái, có hình sợi, hình nhẫn, kích thước cực nhỏ từ 0,1 - 0,8 µm. Là loài trung gian giữa vi khuẩn và virus, nó Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 8 không có thành tế bào vững chắc và ñược bao bọc bởi màng plasma gồm các thành phần protein, glycoprotein, glycolipit và phospholipit. Do hình dạng luôn thay ñổi nên có thể qua ñược màng lọc 0,22 µm và là cơ thể sống có khả năng tự nhân ñôi (Razin, 1992) [67]. Hai hình dạng thường thấy nhất là hình quả lê và hình chai với cấu trúc ñầu chóp trên có các cơ quan bám dính giúp MG có khả năng bám vào thành tế bào vật chủ (Razin, 1992) [67]. Trong phân loại Mycoplasma thuộc lớp Mollicutes (mollis nghĩa là mềm, cutes là da, vỏ bọc). Hai ñặc ñiểm của MG khác biệt với các loại vi khuẩn khác là kích thước genome và thành phần các bazơ nitơ của MG có cả DNA và RNA, nó mang bộ gene nhỏ nhất trong tất cả các cơ thể sống tự do khoảng 600 kb (kilo base pairs) và có ít hơn 300 gene, tổng thành phần Guanine (G) và Cystosine (C) trong DNA thấp, ở một số loài tỷ lệ G + C thấp hơn 25 mol% và tỷ lệ ñó phân bố không ñều trên bộ gene, có vùng rất cao lại có những vùng rất thấp (Marois, 2001) [59]. Một cơ thể sống có kích thước và số lượng gene nhỏ như vậy nhưng nó cũng thể hiện là một mầm bệnh tương ñối hoàn chỉnh và thực hiện rất nhiều chức năng của một cơ thể sống, chứng tỏ tính tổ chức và sự ñiều hành bộ gene của MG khá hoàn chỉnh. Khi mới ñược phát hiện, người ta cho rằng MG là virus bởi vì nó có thể qua ñược màng lọc vi khuẩn một cách dễ dàng. Tuy nhiên, chúng không giống với virus ở chỗ chúng có thể sinh trưởng và phát triển trên môi trường nhân tạo không có tế bào. Sau ñó người ta còn nhầm MG với vi khuẩn dạng L (L - forms bacteria) mà dạng này cũng không có thành tế bào, không có sterols ở trong màng nguyên sinh chất và chúng có thể chuyển thành dạng có thành tế bào khi thay ñổi môi trường sống. 1.2.2. ðặc tính nuôi cấy của MG Nuôi cấy và phân lập MG rất khó vì nó ñòi hỏi chất lượng môi trường khá cao, trong môi trường thạch, khuẩn lạc có dạng trứng ốp lết, trong môi trường lỏng MG làm vẩn ñục nhẹ môi trường. ðể có ñược khuẩn lạc thuần Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 9 khiết trước hết phải nuôi cấy lặp lại nhiều lần trên môi trường thạch ñể chọn ra một khuẩn lạc thuần, ñặc trưng, sau ñó nuôi cấy trên môi trường nước thịt, môi trường nước thịt thường ñược sử dụng nuôi cấy MG ñể sản xuất kháng nguyên (Carpenter và cộng sự, 1981) [35]. MG làm tan hồng cầu ngựa hoàn toàn trong môi trường ñặc và gây ngưng kết hồng cầu gà, gà tây. MG cũng có thể nuôi cấy trên phôi gà (Zain, 1996) [81]. 1.2.3. Phân lập và xác ñịnh mầm bệnh MG có thể phân lập ñược từ ñường hô hấp của con vật như túi khí, phổi, dịch nhày, xoang, họng hoặc từ ñường sinh dục và buồng trứng, dịch hoàn, lỗ huyệt cũng như từ rất nhiều cơ quan khác. MG có thể tồn tại trong dịch mật. - Nuôi cấy phân lập: cấy bệnh phẩm vào môi trường nước thịt và thạch PPLO. Trong nước thịt MG mọc chậm, làm biến ñổi màu môi trường, không hình thành váng và ñóng cặn. Trên thạch MG mọc sau 24 giờ và mọc chậm hơn sau 48 giờ. - Phân lập MG qua phôi gà: tiêm bệnh phẩm vào túi lòng ñỏ phôi gà 6 - 7 ngày tuổi. Phôi có thể chết sau 4 - 8 ngày với những bệnh tích màng thai dày và khô dính vào bào thai và có thể bị xuất huyết lấm chấm, bào thai phát triển kém, thận nát, gan sưng (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [16]. 1.2.4. Phân loại Mycoplasma Phần lớn Mycoplasma sống ký sinh, chỉ sống và phát triển mạnh ở một số vật chủ cụ thể (dải thích nghi hẹp). Cùng với khả năng gây bệnh trên người và ñộng thực vật, Mycoplasma còn có mặt trong các chế phẩm sinh học như vaccine, môi trường nuôi cấy tế bào và gây ra những khó khăn rất lớn trong nghiên cứu cũng như trong công nghệ sinh học sử dụng tế bào nuôi cấy. Số loài Mycoplasma rất nhiều nhưng vì không có thành tế bào nên chúng không phát triển phong phú ñược. Cho ñến nay, hơn 100 loài gây bệnh cho người và ñộng vật ñã ñược phân lập và gây bệnh chủ yếu ở ñường hô hấp. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 10 Mầm bệnh Mycoplasma ở gia cầm ñược phân lập lần ñầu tiên năm 1935. Lúc ñầu, người ta phân thành vài chủng kháng huyết thanh sau ñó chúng ñược chia thành các loài và nuôi cấy phân lập chủ yếu trên gà và gà tây. Tuy nhiên, sự phân bố của Mycoplasma ở trên phạm vi toàn cầu và hầu hết các loài thuộc lớp chim ñều bị nhiễm Mycoplasma. Các nhà chuyên gia về chăn nuôi gia cầm và bệnh gia cầm thường chỉ quan tâm ñến những loài Mycoplasma liên quan ñến bệnh của gia cầm ñó là Mycoplasma gallisepticum (MG), Mycoplasma synoviae (MS), Mycoplasma meleagridis (MM) và Mycoplasma iowae (MI), chúng gây nên những bệnh như viêm ñường hô hấp mạn tính, rối loạn sinh sản... Tuy nhiên, các công ty xuyên quốc gia về tạo giống gia cầm ñã và ñang tiến hành những biện pháp cần thiết nhằm cố gắng loại trừ sự xâm nhiễm của các loài Mycoplasma chủ yếu như MG, MS và MM ở ñàn gà giống cấp 1. Những sự khác biệt khá lớn của các chủng thông qua khả năng xâm nhiễm, ñộc lực, xu hướng xâm nhập và ñặc biệt khả năng cư ngụ ở các tổ chức khác nhau như não, khớp, mắt, niêm mạc, phổi, túi khí, ổ nhớp, lỗ huyệt... các chủng khác nhau thì gây ra các triệu chứng lâm sàng, bệnh lý cũng khác nhau. Có những chủng gây tổn thương rất lớn ở phổi, túi khí hoặc giảm sản lượng trứng tuy nhiên có những chủng với ñộc lực trung bình cũng có thể gây ra triệu chứng lâm sàng nếu nó kết hợp với các yếu tố khác. Một số chủng có khả năng lan truyền rất mạnh ở trong ñàn chỉ bằng tiếp xúc thông thường, sau 4 tuần ñã có những ñáp ứng miễn dịch rất mạnh. Một số trường hợp cả ñàn mắc bệnh chỉ sau 1 - 2 tuần trong ñàn có con xuất hiện triệu chứng lâm sàng ñầu tiên. Trong khi ñó có những chủng khác thì lan truyền rất chậm, sản sinh kháng thể sau 16 tuần gây nhiễm. Hậu quả là bệnh có thể khác nhau từ rất nhẹ cho ñến rất nặng, có thể lây lan rất chậm hoặc rất nhanh. Việc chẩn ñoán ñôi khi gặp khó khăn do có thể gặp những chủng không ñặc trưng hoặc sự ñáp ứng miễn dịch của vật chủ ñối với mầm bệnh rất chậm. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 11 1.3. Bệnh CRD ở gà 1.3.1. Nguyên nhân gây bệnh và sức ñề kháng của mầm bệnh Trên thế giới bệnh ñược Nenxơn miêu tả ở bắc Mỹ năm 1936, ông gọi ñó là căn bệnh “Coryza” và ñặt tên cho căn bệnh là Coccobacillaris. Theo tác giả, mầm bệnh chỉ nuôi cấy ñược trong môi trường tế bào và trong bào thai trứng. Về sau Smit (1984); Mackham và Iăng (1952) ñã chứng minh, ñồng thời cũng ñược chính Nenxơn (1953) thừa nhận là các thể Coccobacillaris ñược tìm thấy trước kia chính là PPLO về sau ñược thống nhất gọi tên phổ thông là Mycoplasma (Freund, 1955) [42]. Năm 1957 Atlơ và cộng sự sau khi thực hiện nhiều thí nghiệm cho thấy trong thiên nhiên có nhiều chủng Mycoplasma nhưng chỉ có một số chủng nhất ñịnh có khả năng gây bệnh (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [16]. Bệnh hô hấp mạn tính ở gia cầm do nhiều loài gây ra (Lin và cộng sự, 1982 [56]) cho thấy có 4 loài gây bệnh ñiển hình là: Mycoplasma gallisepticum (MG); Mycoplasma synoviae (MS); Mycoplasma meleagridis (MM); Mycoplasma iowae (MI). Hầu hết các nhà nghiên cứu cho rằng: MG gây bệnh viêm ñường hô hấp mạn tính ở gà (Chronic Respiratory Disease hay CRD) và gây bệnh viêm xoang truyền nhiễm của gà tây (Infectius Sinusitis hay IS). Các ñặc ñiểm chính của bệnh là ho, chảy nước mũi, viêm xoang và những tổn thương rất nặng ở túi khí (Ley, 2003) [55]. Bệnh này ñược coi là một trong những vấn ñề ñược quan tâm ñối với gà thịt, gà giống và gà ñẻ thương phẩm. Những tổn thất do bệnh gây ra có thể rất lớn, ñối với gà thịt sự tụt giảm về tăng trọng có thể từ 20% - 30%, tụt giảm về hiệu quả chuyển hóa thức ăn khoảng 10% - 20%; tỷ lệ chết từ 5% - 10% và có ñến 10% - 20% tỷ lệ thịt xẻ phải loại thải trong các lò giết mổ. Ở ñàn gà giống và gà ñẻ, bệnh có thể làm tụt giảm 10% - 20% sản lượng trứng, tăng 5% - 10% tỷ lệ chết phôi (Ley, 1997) [54]; (Sato, 1996) [68]. Khi khẩu phần ăn kém chất lượng, mật ñộ nuôi cao, ñiều kiện vệ sinh chuồng trại kém thì những tổn thất kinh tế có thể cao hơn. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 12 MG ñề kháng rất yếu với hoá chất và các nhân tố vật lý. Các loại hoá chất sát trùng thông thường có thể tiêu diệt mầm bệnh nhanh chóng. MG mẫn cảm với Phenol, Formalin, Beta propiolactone và Merthiolate nhưng nó ñề kháng với Penicillin và Thallium acetate, chỉ cần 1 : 400 Thallium acetate cho thêm vào môi trường nuôi cấy MG có thể chống ñược tạp khuẩn và nấm. Thời gian tồn tại của MG ở ngoài cơ thể vật chủ (phân, lông...) khác nhau từ 1 - 14 ngày, ở lòng trắng trứng là 3 tuần ở 50C, 4 ngày ở tủ ấp, 6 ngày ở nhiệt ñộ phòng, ở lòng ñỏ mầm bệnh tồn tại 18 tuần ở 370C hoặc 6 tuần ở 200C (Chandiramani và Van Roekel, 1966) [36]. Trong huyễn dịch màng nhung niệu, mầm bệnh sẽ mất t._.ác dụng gây bệnh sau 1 giờ ở 460C, sau 20 phút ở 500C, hoặc 3 tuần ở 50C (Hoffstad, 1959) [46]. Tuy nhiên nhiều nhà nghiên cứu phát hiện thấy mầm bệnh trong dịch niệu nang vẫn có khả năng gây bệnh trong 4 ngày ở nhiệt ñộ nuôi cấy, 6 ngày ở nhiệt ñộ từ 20 - 250C và 32 - 60 ngày trong tủ lạnh (Olesiuk và cộng sự, 1952) [65]. Mầm bệnh có trong trứng gà sẽ bị tiêu diệt ở 450C trong thời gian 12 - 14 giờ, trong môi trường nước thịt nuôi cấy Mycoplasma bảo quản ở -300C, mầm bệnh tồn tại ñược 2 - 4 năm (Yoder và Hofstad, 1964) [77]. 1.3.2. Dịch tễ học MG chủ yếu gây bệnh ở gà và gà tây, tuy nhiên người ta cũng phân lập ñược mầm bệnh này ở gà lôi, gà gô (Bradbury, 2001) [31]. Ở công, trĩ, chim sẻ, chim cút, gà tây hoang dã, vịt, ñà ñiểu, một số loài còn ñược phân lập từ vịt và ngỗng (Ley, 1997) [54]. Trong thiên nhiên, nguồn bệnh chủ yếu là gà bệnh, gà mắc bệnh ở thể ẩn mang trùng và thải mầm bệnh ra ngoài môi trường (Christensen và cộng sự, 1994) [37]. ðường lây bệnh chủ yếu qua hô hấp, trong dịch mũi, miệng, mắt, khí quản, túi khí của gà chứa nhiều mầm bệnh, khi mầm bệnh khuếch tán vào không khí gà lành hít phải sẽ mắc bệnh. Ngoài phương thức lây lan mầm bệnh qua không khí, bụi, hơi nước, mầm bệnh còn lây lan do dụng cụ chăn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 13 nuôi, máng ăn, máng uống, phương tiện vận chuyển, người chăn nuôi ra vào trại… Một con ñường truyền lây bệnh khác ñó là sự truyền lây qua trứng, ở giai ñoạn cấp tính MG dễ dàng tiến ñến buồng trứng, tử cung và ñịnh cư ở ñó, những con gà mái này sẽ ñẻ ra trứng nhiễm bệnh. MG còn ñược tìm thấy ở trong tinh dịch của gà trống bị bệnh, vì vậy sự truyền lây có thể từ gà trống truyền cho gà mái (Yoder, 1964) [77]. Bệnh gây ra chủ yếu ở gà 4 - 8 tuần tuổi là nặng nhất, gà lớn hơn bị bệnh mạn tính và truyền bệnh cho gà con qua trứng. Khi con vật bị nhiễm MG thì ñược coi là mang khuẩn suốt ñời bởi vì mầm bệnh có khả năng thay ñổi cấu trúc kháng nguyên nhờ vậy nó có thể tạo ra sự thay ñổi liên tục về sự biểu hiện của kháng nguyên bề mặt và tránh ñược sự tấn công của hệ thống miễn dịch của vật chủ. Những ñàn gà ñang mang mầm bệnh MG khi gặp các tác ñộng bất lợi khác từ môi trường như nồng ñộ amoniac cao, thời tiết thay ñổi ñột ngột, các mầm bệnh như virus Newcastle, Gumboro, cúm, virus viêm thanh khí quản truyền nhiễm, Heamophilus paragallinarum, E.coli thì có thể làm tăng bài tiết mầm bệnh MG. 1.3.3. Cơ chế sinh bệnh Sau khi xâm nhập vào cơ thể, mầm bệnh ký sinh ở ñường hô hấp, tuỳ theo sức ñề kháng của cơ thể mà bệnh phát triển theo các chiều hướng khác nhau. Nếu sức ñề kháng của cơ thể tốt hoặc mầm bệnh chưa ñủ khả năng gây bệnh thì mầm bệnh cư trú tại ñường hô hấp trên. Nếu sức ñề kháng cơ thể giảm sút do thời tiết thay ñổi ñột ngột, chế ñộ chăm sóc và nuôi dưỡng kém hoặc mắc bệnh khác thì mầm bệnh phát triển và gây bệnh. Nếu mầm bệnh xâm nhập với số lượng lớn, sức ñề kháng của cơ thể kém bệnh có thể xuất hiện ngay. Tuỳ theo thể trạng sức khoẻ ñàn gà, mùa vụ mà thời gian nung bệnh có thể dài hoặc ngắn khác nhau. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 14 Trong thực nghiệm các nhà nghiên cứu tìm thấy thời kỳ ủ bệnh thay ñổi từ 6 - 12 ngày ñối với gà và gà tây từ 6 - 10 ngày. Do các ñiều kiện tự nhiên, người ta khó xác ñịnh ñược chính xác thời gian phát bệnh. Khi mầm bệnh xâm nhập vào vật chủ, nó chui vào giữa các nhung mao niêm mạc ñường hô hấp hoặc ñường sinh dục, phần “blebs” cơ quan bám dính của vi khuẩn gắn vào phần ñuôi sialic của thụ thể sialoglycoprotein hoặc sialoglycolipit của tế bào vật chủ. Sự bám dính này ñủ chắc ñể nó không bị ñào thải ra ngoài bởi nhu ñộng và quá trình tiết dịch của niêm mạc. Vì nó không có thành tế bào nên cũng có hiện tượng hòa nhập màng tế bào vật chủ và màng nguyên sinh của vi khuẩn. Các enzyme thủy phân, neuraminidase, peroxidase, heamolysin và các loại ñộc tố khác ñược ñưa vào tế bào vật chủ. Những tác ñộng ñó có thể dẫn tới tế bào bị tổn thương, thoái hóa và cơ thể có những ñáp ứng miễn dịch và sốt. Hơn nữa, có sự thâm nhập của tế bào ñơn nhân tới phần mô bào của hạ niêm mạc, một số lượng lớn tế bào lympho và ñại thực bào thẩm xuất dẫn tới có sự dày lên của phần tổ chức bị tấn công. Mầm bệnh gây tổn thương các cơ quan hô hấp, tuần hoàn ở phổi làm rối loạn toàn bộ cơ thể con vật. Mầm bệnh có thể kết hợp với một số vi khuẩn, virus khác làm tổn thương niêm mạc ñường hô hấp, con vật gầy sút nhanh rồi chết (Archibald, 1944) [26]. Khi mầm bệnh từ ñường hô hấp theo máu xâm nhập vào buồng trứng, ống dẫn trứng, mầm bệnh sẽ tăng nhanh về số lượng gây phá huỷ tế bào trứng làm cho tỷ lệ ñẻ của gà giảm ñi rõ rệt và khi cho ấp nở tỷ lệ phôi chết cao. Khi có mặt vi khuẩn E.coli cùng với mầm bệnh gây bệnh CRD ở trong buồng trứng sẽ làm cho gà con chết nhiều hơn sau khi nở ra. Người ta thấy nhiều trường hợp gà mắc bệnh CRD thường xuất hiện các bệnh Newcastle, viêm thanh khí quản truyền nhiễm, ñặc biệt là E.coli (Fabricant, 1962) [40]. Khi xuất hiện bệnh ghép CRD với E.coli và virus gây viêm phế quản truyền nhiễm thì túi khí bị viêm nặng, mức ñộ bệnh và thời gian bị bệnh tăng lên rõ rệt. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 15 1.3.4. Triệu chứng Triệu chứng lâm sàng của bệnh do MG gây ra có thể biểu hiện rất khác nhau, tuỳ thuộc vào cường ñộ, ñộc lực của mầm bệnh và sức ñề kháng của cơ thể, thời gian nung bệnh có thể biến ñổi từ 4 - 21 ngày, trung bình khoảng một tuần. Có rất nhiều yếu tố ngoại cảnh như nhiệt ñộ, ñộ ẩm, ánh sáng, ñộ thông thoáng, vệ sinh, chăm sóc, stress, mật ñộ nuôi… sử dụng kháng sinh ñể phòng bệnh cũng ảnh hưởng ñến thời gian nung bệnh. Trong tự nhiên, thời kỳ ủ bệnh có khác nhau từ 3 - 38 tuần (Stipkovits, 1996) [72]. Trong những ñàn gà bị nhiễm bệnh qua trứng, những biểu hiện lâm sàng có thể phát triển và biểu hiện từ giai ñoạn 3 - 6 tuần tuổi còn những trường hợp khác thì phát triển ở giai ñoạn chuẩn bị sinh sản. Trong trường hợp ñàn gà bị nhiễm bệnh từ trứng nhưng ñược xử lý bằng kháng sinh và ñược nuôi trong ñiều kiện tốt thì những biểu hiện lâm sàng không thể hiện cho ñến khi ñàn gà bị kết hợp với những mầm bệnh khác hoặc các yếu tố stress xuất hiện. Dấu hiệu lâm sàng ñầu tiên của gà là kém ăn, chảy nước mắt, nước mũi, nước mũi lúc ñầu loãng sau ñặc dần, con vật há mỏ ra ñể thở vì ngạt mũi. Một số con trong ñàn hắt hơi, ho, vẩy mỏ, khò khè, con vật vẫn còn ăn ñược, ñôi khi viêm kết mạc mắt (Ley, 2003) [55]. ðiều này cũng ñược tác giả Nguyễn Ngọc Nhiên và cộng sự (1999) [15] công bố khi gây bệnh thực nghiệm cho gà: niêm mạc mắt xung huyết, ñỏ, nước mắt ñặc dần sau thành sợi fibrin tích tụ lại to dần và lồi lên ở giữa tròng mắt. Mắt bị viêm kết mạc, giác mạc bị loét, mắt có mủ và con vật có thể bị mù. Con vật bị viêm lan từ mũi ra các xoang xung quanh, viêm ñường hô hấp, ñầu có thể bị biến dạng do bị viêm mắt, viêm mũi. Sau khi các xoang ñầu bị viêm thì niêm mạc hầu, khí quản và túi khí cũng bị viêm. Con vật thở khò khè, có âm ran phế quản, mào tím bầm, kiệt sức rồi chết. Thỉnh thoảng có những trường hợp mất ñiều hòa thần kinh, què, sưng khớp, kém ăn, mỏ và chân khô… Những dấu hiệu không ñặc trưng phổ biến như giảm tốc ñộ sinh trưởng, giảm năng suất ñẻ trứng, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 16 giảm khả năng chuyển hóa thức ăn… Những triệu chứng lâm sàng thường nặng hơn ở con trống, gà tây biểu hiện nặng hơn ở gà. Tỷ lệ chết phụ thuộc vào lứa tuổi, con non bị ảnh hưởng nhiều hơn con trưởng thành và ở nhiệt ñộ càng thấp bệnh càng nặng và thời gian bị bệnh kéo dài hơn. Tỷ lệ chết khoảng 5 - 12% nhưng cũng có khi tỷ lệ chết lên tới 30% (Nguyễn Thị Hương và Lê Văn Năm, 1995) [9]. Gà lớn thường mắc bệnh ở thể ẩn, triệu chứng lâm sàng không rõ, bệnh xảy ra chậm và kéo dài nhiều tháng. Dấu hiệu ñặc trưng nhất là khi thở có tiếng ran, thở khò khè, viêm mũi một bên hoặc hai bên, gà chảy nước mắt, nước mũi, vảy mỏ, tiêu hoá kém và gầy sút (Ley, 2003) [55]. Ở gà ñẻ, sản lượng trứng giảm và trong trường hợp không có biểu hiện lâm sàng nhưng thấy tăng tỷ lệ chết của phôi và gà nở ra chậm, ñôi khi thấy có triệu chứng thần kinh. Gà ñẻ bị chết nhiều là do các loại vi khuẩn cộng phát gây nên. Bệnh CRD thường ghép với một số bệnh khác như tụ huyết trùng, thương hàn, E.coli và chết rải rác trong các ngày. Nhiều ñàn gà có phản ứng huyết thanh học dương tính nhưng không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, ñặc biệt khi chúng nhiễm bệnh ở tuổi còn non và cơ thể một phần ñã hồi phục (Levisohn, 2000) [53]. ðối với gà trống khi mắc bệnh thường có tiếng kêu khàn, có dấu hiệu bệnh rõ rệt hơn và bệnh thường nặng. Gà thịt thường mắc bệnh nặng và hay kết hợp với các bệnh khác. Tỷ lệ chết ở ñàn gà lớn không ñáng kể nhưng ảnh hưởng tới khả năng tăng trọng và tỷ lệ ñẻ. Gà thịt tỷ lệ chết thấp khi không kết hợp với các bệnh khác, chết nhiều nhất là 30% nếu có bệnh ghép và ñặc biệt là vào những tháng cuối năm. Ở gà tây, lúc ñầu thường thấy có chất dịch tiết của mũi và mắt. Gà thường bị viêm xoang mũi nặng, nhiều con mắt sưng to không mở ñược gây khó khăn cho việc ăn uống và gà gầy sút nhanh. Nhiều ñàn gà giống có hiện tượng ñẻ rơi trứng, tỷ lệ ñẻ giảm nhiều và gây tổn thất về kinh tế (Mohammed, 1987) [61]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 17 1.3.5. Bệnh tích * Bệnh tích ñại thể: Gà bị bệnh CRD xác chết gầy và nhợt nhạt do thiếu máu, có dịch viêm cata ở mũi, khí quản, các túi khí. Niêm mạc mũi và các xoang cạnh mũi sưng phù chứa ñầy dịch nhớt màu vàng hay vàng xám. Thành các xoang dưới mắt phù, xoang chứa dịch ñặc có fibrin. Niêm mạc họng xung huyết, sưng, ñôi chỗ bị xuất huyết phủ nhiều niêm dịch trong. Phổi thuỷ thũng, mặt phổi phủ fibrin, rải rác một số vùng bị viêm, hoại tử. Thành các túi hơi bị dày lên, thuỷ thũng. Xoang túi hơi chứa ñầy một chất dịch màu sữa, nếu bệnh chuyển thành mạn tính thì chất chứa quánh lại, cuối cùng thành một chất khô, bở, màu vàng, bệnh tích này xảy ra ở cả túi hơi vùng ngực và vùng bụng. Ngoài ra gà bệnh còn bị viêm ngoại tâm mạc, viêm quanh gan và viêm phúc mạc, lách có thể hơi sưng. Theo thông báo của Domermuth và cộng sự (1967) [38] cho thấy: MG còn gây viêm ống dẫn trứng ở gà và gà tây. Trong những trường hợp bệnh nặng và ghép E.coli, trên các màng bao tim, gan, lách có lớp màng giả trắng ñục. * Bệnh tích vi thể: Hoàng Xuân Nghinh và cộng sự (1999) [14] cho biết: khi quan sát tiêu bản vi thể thấy có bệnh tích biểu hiện rõ ở khí quản và phổi. Khí quản: tăng sinh và tróc tế bào biểu mô, có sự thâm nhiễm các tế bào ñơn nhân và tăng sinh các tuyến nhày. Hình thành các vùng tăng sinh tế bào lympho dưới màng nhày niêm mạc, các ống tuyến dịch của biểu mô dài ra rõ rệt và rất có ý nghĩa trong việc chẩn ñoán. Phổi: viêm, xuất hiện các nang lympho, các tổn thương dạng hạt. Mô phổi có sự tăng sinh lympho, có hiện tượng viêm phổi với các tế bào khổng lồ. Ở bào thai chết thấy màng thai dày, khô dính vào bào thai và có thể bị xuất huyết lấm chấm. Bào thai phát triển kém, thận nát, gan sưng. Khí quản và phổi tích tụ fibrin ñã bị bã ñậu hóa, thành túi hơi dày ra. ðôi khi thấy khớp Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 18 xương sưng, tổ chức liên kết dưới da và các cơ quan thực thể bị xuất huyết, phủ tạng hoại tử lấm chấm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [16]. 1.3.6. Chẩn ñoán bệnh CRD * Chẩn ñoán lâm sàng Các dấu hiệu lâm sàng và ñặc ñiểm tổn thương của ñường hô hấp chưa thể khẳng ñịnh con vật có bị nhiễm MG hay không. Việc chẩn ñoán sự nhiễm bệnh MG phải ñược khẳng ñịnh bằng các kết quả phòng thí nghiệm mà có thể thực hiện bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Có 2 cách ñể khẳng ñịnh con vật nhiễm bệnh, chúng ta có thể kiểm tra trực tiếp sự có mặt của mầm bệnh ở cơ thể vật chủ thông qua bệnh phẩm hoặc chúng ta có thể kiểm tra sự nhiễm bệnh thông qua ñáp ứng của vật chủ ñối với mầm bệnh ñó là kiểm tra kháng thể ñặc hiệu. * Chẩn ñoán vi khuẩn học Bệnh CRD thường là một bệnh kế phát nên việc phân lập ñược căn bệnh chưa phải là ñã ñược kết quả cuối cùng. Hơn nữa việc phân lập không phải lúc nào cũng thành công vì hầu hết các bệnh phẩm trong bệnh hô hấp mạn tính ñều thấy MG, một căn bệnh không ñặc hiệu. Vì thế song song với chẩn ñoán vi khuẩn học, kiểm tra huyết thanh học sẽ giúp ta ñạt ñược kết quả tin cậy hơn. Ngoài ra, mặc dù ñã tìm thấy sự hiện diện của Mycoplasma việc chẩn ñoán tiếp tục ñể tìm ra căn bệnh chính, căn bệnh tiên phát vẫn phải tiến hành. Kiểm tra bằng kính hiển vi: bệnh phẩm lấy ở hốc mắt, xoang mũi, niêm mạc khí quản và bệnh tích ở phổi, thành các túi hơi… phiết kính, nhuộm giemsa có thể thấy căn bệnh là các cầu trực khuẩn nhỏ li ti, kích thước 0,25 x 0,5 µm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [16]. Nuôi cấy, phân lập: dùng tăm bông hoặc que cấy ñã vô trùng lấy dịch ở lỗ mũi ñể phân lập. Môi trường nuôi cấy phải có các chất bổ trợ, có 10 - 15% huyết thanh ngựa hoặc lợn, có chất chống tạp khuẩn như Thallium acetate 1/400 và Penixilin 2000UI/ml (Branton và cộng sự, 1984) [32]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 19 Sự phân lập MG từ dịch rỉ viêm ñược cấy vào túi lòng ñỏ phôi thai gà 7 ngày tuổi cũng rất có ý nghĩa, những môi trường cấy chuyển ñể phân lập phải vô khuẩn. Sự chết phôi sẽ xảy ra sau 5 - 7 ngày và sự tổn thương túi lòng ñỏ phải ñiển hình. * Chẩn ñoán huyết thanh học Chẩn ñoán huyết thanh học là phương pháp cơ bản và quan trọng nhất trong chẩn ñoán MG. Phản ứng huyết thanh học dương tính cùng với tiểu sử bệnh và các dấu hiệu lâm sàng ñiển hình sẽ cho phép chẩn ñoán ñúng trong quá trình phân lập và giám ñịnh mầm bệnh. Phương pháp này cho kết quả nhanh và chính xác nhất phát hiện ñược kháng thể từ huyết thanh, lòng ñỏ trứng hoặc thậm chí từ dịch mật (Bencina và cộng sự, 1991) [29]. - Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính - RPA: phản ứng này không tốn kém, dễ thực hiện. Có thể làm phản ứng ngưng kết trong ống nghiệm với huyết thanh gà nghi mắc bệnh hay lòng ñỏ trứng. Kháng thể có trong máu từ 2 - 6 tuần sau khi xuất hiện triệu chứng ñầu tiên và biến mất từ 2 - 12 tuần sau khi gà khỏi bệnh. - Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà - HI: MG có ñặc tính ngưng kết hồng cầu gà nên sau khi phân lập ñược căn bệnh có thể kiểm tra ñặc tính này. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu thực hiện bằng kháng nguyên MG có sẵn trong phòng thí nghiệm, kháng thể là huyết thanh gà nghi mắc bệnh. Sự ức chế ngưng kết hồng cầu thể hiện sự có mặt của kháng thể chống lại MG. Phép thử ñược thực hiện với cả huyết thanh, huyết tương hoặc từ lòng ñỏ trứng, phản ứng nhằm kiểm tra kháng thể IgG. Kháng thể ñược phát hiện trong trường hợp này có thể tồn tại ñến vài tháng. Phản ứng này rất ñặc hiệu, không có hiện tượng phản ứng chéo với MS hoặc với các loài Mycoplasma khác nhưng ñộ nhạy của phản ứng thấp. Phản ứng HI thể hiện tính ña dạng kháng nguyên rất cao mà sử dụng kỹ thuật enzyme cắt hạn chế cũng không phát hiện ñược. Hiệu giá HI phụ thuộc vào các chủng vi khuẩn ñược sử dụng trong phép thử. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 20 Tuy nhiên, sự phối hợp sử dụng RPA và HI có thể mang lại những thông tin quan trọng trong việc xác ñịnh sự lây nhiễm của Mycoplasma trong ñàn: + Tỷ lệ dương tính thấp khi RPA thấp hơn 30% và HI thấp hơn 3% - 10%, ñiều ñó chỉ ra rằng ñàn gà mới bị nhiễm bệnh. + Tỷ lệ dương tính cao ở cả 2 phản ứng chứng tỏ ñàn gà bị nhiễm bệnh từ 3 - 8 tuần. + Tỷ lệ dương tính RPA thấp, tỷ lệ dương tính HI cao thể hiện ñàn gà bị nhiễm bệnh 3 - 6 tháng trước ñây. - Phản ứng ELISA: ñang ñược sử dụng nhiều ñể phát hiện kháng thể ñặc hiệu MG. Talkington và cộng sự (1985) [74] ñã sử dụng phản ứng ELISA ñể xác ñịnh kháng thể MG và MS trong huyết thanh gà. Các tác giả ñều cho rằng: phản ứng ELISA có thể sử dụng ñể chẩn ñoán huyết thanh học ñối với bệnh do MG gây ra và phản ứng này có ñộ nhạy cao, nhưng khi kháng thể bị khử hoạt tính, phản ứng không còn ñặc hiệu nữa. * Kỹ thuật PCR: ñược sử dụng nhiều ở các nước phát triển, ở nước ta cũng ñã ứng dụng PCR trong chẩn ñoán nhanh bệnh CRD do MG (Nhữ Văn Thụ và cộng sự, 2001) [21]. * Chẩn ñoán phân biệt Trên cơ sở ñặc ñiểm dịch tễ học, triệu chứng hô hấp mạn tính cùng những biến ñổi giải phẫu bệnh lý khi mổ khám xác chết có thể cho kết luận dịch bệnh tại chỗ. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp cũng có thể bị nhầm lẫn với một số bệnh truyền nhiễm ñường hô hấp do các biến ñổi bệnh lý tương tự nhau. Về mặt lâm sàng cần phân biệt với các bệnh: - Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm của gà (Bronchitis Infectiosa ganinarum): thường xảy ra ở những ñàn gà con dưới 6 tuần tuổi. Nếu gà ñẻ bị bệnh sẽ có triệu chứng cấp tính, tỷ lệ mắc bệnh cao. Triệu chứng hô hấp thể hiện ở phần sâu hơn của ñường hô hấp, một số trường hợp gà bị sưng hầu, sản lượng trứng tụt giảm ñột ngột. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 21 - Bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm của gà (Laryngotracheitis Infectiosa ganinarum): bệnh khó chẩn ñoán và dễ nhầm với Mycoplasmosis khi bệnh ở thể nhẹ, ñộc lực của virus yếu hay vừa. Trong trường hợp này có thể kiểm tra tổ chức học bệnh tích niêm mạc khí quản ñể phát hiện thể bao hàm Seifried, ñồng thời có thể phân lập virus ñể xác ñịnh bệnh. Bệnh xảy ra không có bệnh ghép và không viêm các xoang hô hấp. - Bệnh ñậu gà (Variola avium): Mycoplasmois có thể nhầm với bệnh ñậu thể yết hầu. Trong bệnh ñậu, màng giả ở niêm mạc miệng, hầu thường dày, tràn lan và khó bóc. Ngoài ra trong ổ dịch, sớm muộn trên ñàn gà một số con có các mụn ñậu ngoài da. - Bệnh thiếu vitamin A: trong trường hợp bị bệnh nhẹ chỉ có thể bằng phương pháp phân tích hàm lượng vitamin A mới ñịnh ñược bệnh. Nếu bệnh nặng, các ống ñổ ra của tuyến tiêu hoá trong cuống mề bị dị dạng, dày lên rồi hoá sừng (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [16]. 1.3.7. Phòng bệnh Bệnh CRD gây tổn thất khá lớn về kinh tế trong chăn nuôi gia cầm. Bệnh không nổ ra trên phạm vi lớn cũng như không tạo thành ổ dịch nên nhiều người còn ñánh giá thấp tác hại của bệnh. Mầm bệnh truyền qua trứng cho thế hệ sau, vì vậy việc phòng ngừa, quản lý, khống chế và ñiều trị bệnh là những khâu rất cần thiết. Các bước phòng chống bệnh ñược xây dựng dựa trên các biện pháp khác nhau, khâu ñầu tiên phải nâng cao ñiều kiện vệ sinh chuồng trại, thường xuyên kiểm tra trong ñàn sự có mặt hoặc tồn tại của mầm bệnh cũng như khả năng lây nhiễm bệnh bằng phương pháp kiểm tra thích hợp. ðảm bảo mật ñộ chuồng nuôi, khẩu phần dinh dưỡng, thực hiện vệ sinh tiêu ñộc chuồng trại theo ñịnh kỳ, vệ sinh nguồn nước, dụng cụ chăn nuôi, phương tiện vận chuyển, sát trùng máy ấp và vỏ trứng… nhằm tiêu diệt mầm bệnh phát sinh và lây lan. Một trong các biện pháp quan trọng là tiêm phòng bằng vaccine. Cho ñến nay, việc phòng bệnh bằng vaccine mới ñược thực hiện ñối với mầm bệnh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 22 MG. Có 2 loại vaccine có sẵn ngoài thị trường là vaccine nhược ñộc và vaccine vô hoạt. Gà ñược tiêm vaccine ñã hạn chế việc sử dụng kháng sinh ñể ñiều trị, giảm thiệt hại trong sản xuất. Vaccine sống sử dụng những chủng có ñộc lực yếu hoặc không có ñộc lực còn vaccine vô hoạt thường sử dụng các chủng có ñộc lực cao. * Vaccine nhược ñộc: ñàn gà ñược miễn dịch với MG sẽ có khả năng chống lại với bệnh hô hấp mạn tính, viêm túi khí và sự tụt giảm sản lượng trứng gây ra bởi MG. ðàn gà trứng thương phẩm thường ñược dùng vaccine ở tuần tuổi 12 ñến 16. Vấn ñề thiết yếu là việc sử dụng vaccine phải ñược tiến hành trước khi gà bị nhiễm bệnh ngoài tự nhiên. Trong trường hợp những nơi có nguy cơ mắc bệnh cao, việc chủng vaccine có thể ñược tiến hành lúc gà 2 - 4 tuần tuổi. Việc dùng vaccine bằng phương pháp phun sương nên thực hiện cẩn thận ñể mọi cá thể trong ñàn ñều nhận ñược vaccine. Trong ñàn gà biểu hiện về ñường hô hấp có thể xuất hiện 5 - 7 ngày sau khi dùng vaccine. ðàn gà sau khi chủng 3 - 4 tuần thì nên kiểm tra bằng phản ứng RPA ñể khẳng ñịnh rằng tất cả các cá thể trong ñàn ñều ñược chủng vaccine. * Vaccine MG vô hoạt: ñưa vaccine vào cơ thể bằng con ñường tiêm bắp, tiêm dưới da với liều 0,5 ml/con, thường dùng vào lúc tuần tuổi 16 - 18 ñối với gà ñẻ thương phẩm. Vaccine ñược bảo quản ở 2 - 8oC cho ñến lúc sử dụng, tránh ánh sáng trực tiếp và không ñược ñông lạnh. Theo Yoder (1979) [78] khi dùng vaccine MG vô hoạt kết quả cho thấy: gà con ñề kháng ñược mầm bệnh, gà ñẻ thương phẩm chống ñược hội chứng trứng non. Vaccine MG vô hoạt ñã ñược sản xuất bán nhiều trên thị trường và sử dụng theo ñường tiêm dưới da. Hildebrand và cộng sự (1983) [45] tiếp tục nghiên cứu cho thấy vaccine này có tác dụng bảo vệ chống lại hiện tượng viêm túi khí và thiệt hại do giảm sản lượng trứng. Mặt khác, vaccine còn có tác dụng chống lại mầm bệnh cư trú ở khí quản của gà (Talkington và cộng sự, 1985) [74]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 23 Tác giả Lin (1984) [57] ñã nghiên cứu về vaccine MG vô hoạt và vaccine nhược ñộc cho thấy: vaccine MG vô hoạt ổn ñịnh, khả năng tạo miễn dịch tốt hơn và tăng sản lượng trứng ñối với gà ñẻ. Việc sử dụng vaccine Nobivac MG vô hoạt tiêm cho gà rất có lợi, không gây nhiễm bệnh cho gà và mầm bệnh không có nguy cơ trở lại cường ñộc; cả hai khả năng này có thể xảy ra khi sử dụng vaccine MG nhược ñộc. Tuy nhiên việc chi phí ñể sản xuất vaccine vô hoạt cao hơn vaccine nhược ñộc nên giá thành cũng cao hơn. Do vậy, vaccine vô hoạt thường ñược dùng ñể tiêm cho ñàn gà giống bố mẹ. Những gà gây nhiễm thí nghiệm ñược tiêm bắp hai liều vaccine vô hoạt có chất hydroxit nhôm cho thấy mức ñộ tổn thương ở khí quản nhẹ hơn nhiều và mầm bệnh nhanh chóng bị loại trừ khỏi khí quản so với gà không ñược tiêm vaccine. Một thí nghiệm khác ñã ñược tiến hành bằng cách dùng vaccine vô hoạt theo ñường tiêm khí quản, tiêm bắp thịt, tiêm dưới da cho ñàn gà bố mẹ ñều có ñáp ứng miễn dịch tương tự nhau. ðối với gà dùng vaccine ở liều lượng thấp, kháng thể tạo ra sẽ không ñủ ñể cơ thể gà chống ñược mầm bệnh cường ñộc (Nakamura và cộng sự, 1995) [64]. 1.3.8. ðiều trị Từ những năm 1960 người ta ñã trộn các loại kháng sinh hay hoá dược vào thức ăn hay hoà vào nước cho uống hoặc tiêm trực tiếp cho gia cầm, kết quả cho thấy triệu chứng bệnh CRD cũng như tỷ lệ chết do bệnh gây ra ñã giảm. Nhiều tác giả khẳng ñịnh việc bổ sung vào thức ăn, nước uống một lượng thuốc nhất ñịnh ñã có khả năng phòng ñược bệnh, giảm thiệt hại kinh tế, tạo khả năng cho gà con phát triển bình thường. Tuy nhiên không nên lạm dụng thuốc kháng sinh trong ñiều trị bệnh vì những gà bệnh nặng thường không ñiều trị triệt ñể, không loại trừ hết mầm bệnh, việc ñiều trị ñôi khi phải kéo dài cả tháng. Cần phải tuân theo những nguyên tắc sử dụng thuốc kháng sinh ñể tránh sự kháng thuốc, tăng hiệu quả ñiều trị cũng như ñảm bảo an toàn thực phẩm. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 24 Hamdy (1970) [43] cho biết: kết hợp Lincomycin và Spectinomycin có hiệu quả kìm hãm viêm túi khí ở gà con. Jordan và Knight (1984) [47] ñã sử dụng Kitasamycin, Tiamulin và Tylosin ñể ngăn chặn nhiễm MG ở mức thấp nhất. Tác giả Kempf và cộng sự (1997) [51] cho biết: khi sử dụng Tilmicosin ñiều trị cho ñàn gà gây bệnh thực nghiệm, ở liều thấp có tác dụng kìm hãm sự phát triển của MG và ở liều cao không phát hiện thấy gà có phản ứng huyết thanh học dương tính vào ngày thứ 21 sau khi gây nhiễm. Kempf và cộng sự (1998) [52] ñã gây bệnh thực nghiệm cho gà con 14 ngày tuổi với MG, sau ñó dùng Difloxacin hoặc Enrofloxacin kết quả cho thấy: dùng Difloxacin với liều 7,5 mg/kg trong 5 ngày có hiệu quả chống lại sự nhiễm MG gây bệnh và Difloxacin (hoặc Enrofloxacin) với liều 10 mg/kg có hiệu quả ñiều trị triệu chứng bệnh CRD. Timms và cộng sự (1989) [75] ñã nghiên cứu hiệu quả của Chlortetracyline trong việc ngăn chặn bệnh CRD gây ra bởi E.coli và MG. Các tác giả ñã sử dụng Chlortetracyline trộn vào thức ăn hoặc hoà vào nước uống cho ñàn gà thí nghiệm, kết quả cho thấy: ñàn gà ñã giảm các triệu chứng lâm sàng, giảm tỷ lệ chết, giảm hiện tượng viêm túi khí và tổn thương. Shryock và cộng sự (1994) [70] dùng Bentonite và Tilmicosin trộn vào thức ăn cho gà bị bệnh CRD do MG, kết quả làm giảm bệnh tích viêm túi khí. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2009) [1] ñã công bố một số loại thuốc kháng sinh của công ty RTD có thể sử dụng ñiều trị bệnh CRD cho gà: - RTD - Myco: Trị bệnh ñường hô hấp cho gia súc, gia cầm, ho hen, chảy nước mắt, nước mũi. - RTD - Tylosin 98%: Phòng và trị các bệnh ñường hô hấp gây ra do Mycoplasma ở gà, suyễn, viêm phổi, màng phổi ở lợn. - RTD - Hen gà + Suyễn lợn: Phòng trị bệnh ỉa chảy, thương hàn, CRD - RTD - Linco SP20: Trị bệnh ñường hô hấp ở gia cầm, ho hen, khò khè, chảy nước mắt, nước mũi, vảy mỏ. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 25 - RTD - Viêm phổi phế E300: Trị bệnh ñường hô hấp ở gia súc, gia cầm, ho hen, khò khè, sốt cao, chảy nước mắt, nước mũi, vảy mỏ. - RTD - Tiamulin 10%: Trị suyễn, viêm phổi truyền nhiễm, hồng lị ở lợn, CRD, viêm xoang mũi truyền nhiễm ở gia cầm. Ở ñàn gà nghi ngờ bị nhiễm bệnh nên sử dụng thuốc ở liều phòng bệnh. Việc phòng bệnh có thể tiến hành ở tuần ñầu, hoặc 3 - 5 tuần tuổi. Ở ñàn gà giống phải tiến hành ñiều trị triệt ñể ñể giảm khả năng truyền bệnh qua trứng. 1.4. Cơ sở khoa học của việc sản xuất chế phẩm kháng thể lòng ñỏ chống MG ñể phòng, trị bệnh CRD ở gà 1.4.1. Miễn dịch chống MG Cũng như nhiều bệnh truyền nhiễm khác, miễn dịch chống bệnh CRD có nhiều loại nhưng phổ biến nhất là miễn dịch tiếp thu chủ ñộng và miễn dịch tiếp thu bị ñộng. * Miễn dịch tiếp thu chủ ñộng Là loại miễn dịch thu ñược sau khi con vật nhiễm bệnh nhưng qua khỏi hoặc sau khi tiêm vaccine. Trong bệnh CRD người ta có thể tạo miễn dịch chủ ñộng cho ñàn gà bằng cách sử dụng vaccine nhược ñộc hoặc vaccine vô hoạt. Theo Morow và cộng sự (1998) [63] việc dùng vaccine nhược ñộc MG có khả năng kích thích tạo miễn dịch cho gà với MG cường ñộc. Vì vậy, những gà ñược tiêm vaccine có thể chống lại bệnh ñường hô hấp, viêm túi khí và giảm sản xuất trứng do MG gây ra. Theo Evans và Hafez (1992) [39] việc dùng vaccine cho ñàn gà giống ñã làm giảm khả năng lây truyền MG qua trứng. Theo Turner và Kleven (1998) [76] việc dùng vaccine cho gà mái giống ñã hạn chế ñược bệnh CRD ở gà con nuôi thịt. Theo Hildebrand và cộng sự (1983) [45] vaccine vô hoạt thường ñược sử dụng cho gà mái dò thương phẩm ñể tạo miễn dịch bảo hộ, giảm khả năng truyền lây MG qua trứng, hạn chế tụt giảm sản xuất trứng do nhiễm MG trong Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 26 những cơ sở chăn nuôi gà ñẻ nhiều ñộ tuổi. Tuy nhiên ñộ dài miễn dịch chưa ñược nghiên cứu kỹ, phần lớn các ñàn sử dụng vaccine chỉ có ñộ dài bảo hộ 1 - 2 tháng sau khi tiêm vaccine (Papazisi và cộng sự, 2000) [66]. * Miễn dịch bị ñộng Ở gia cầm, miễn dịch bị ñộng có thể có ñược khi: - Gia cầm mẹ có miễn dịch truyền kháng thể dịch thể ñặc hiệu (IgG) cho gia cầm non qua lòng ñỏ trứng. - ðưa kháng thể dịch thể ñặc hiệu có sẵn từ ngoài vào. Gà mẹ có miễn dịch, lượng kháng thể có trong huyết thanh cao so với lượng kháng thể có trong lòng ñỏ trứng. Người ta có thể sử dụng kháng thể trong lòng ñỏ ñể thay thế cho kháng thể có trong huyết thanh. Gà mẹ có miễn dịch, lớp kháng thể IgG theo máu ñến ống dẫn trứng, qua lớp biểu mô ñi vào túi lòng ñỏ của quả trứng trong giai ñoạn trứng hình thành. 1.4.2. Tính kháng kháng sinh và hoá dược của vi sinh vật Khả năng kháng thuốc của vi sinh vật ñược nhiều tác giả ñề cập từ lâu. ðến nay vấn ñề này càng trở lên nghiêm trọng bởi việc lạm dụng kháng sinh và hoá dược trong trị bệnh dẫn ñến hiệu quả ñiều trị thấp, thậm chí nhiều liệu pháp kháng sinh ñã bị vô hiệu hoá. Các vi sinh vật gây bệnh có thể chứa một hay nhiều gen sản xuất ra các loại protein kháng lại một số loại kháng sinh và hoá dược nằm trên plasmid R. Các plasmid R có trong tế bào một số vi khuẩn, hầu hết trong số chúng ñều là các vi khuẩn gây bệnh cho người hoặc ñộng vật. Khả năng truyền các gen kháng thuốc của một số vi sinh vật phát triển rất mạnh theo phương thức truyền dọc và truyền ngang xảy ra giữa vi khuẩn cùng loài hay khác loài. Cơ chế hoạt ñộng của các plasmid R giúp tế bào vi khuẩn hình thành tính kháng thuốc theo các phương thức sau: - Làm thay ñổi vị trí mà các kháng sinh và dược chất bám vào ñể tác ñộng. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 27 - Làm cho kháng sinh và dược chất trở lên vô hoạt. 1.4.3. Biện pháp phòng trị bệnh bằng chế phẩm sinh học trên thế giới Cùng với các biện pháp miễn dịch thụ ñộng phòng tiêu chảy cho lợn con qua sữa ñầu của lợn mẹ hay sử dụng globulin miễn dịch từ huyết thanh ngựa, còn có thể sử dụng một lượng thích hợp kháng thể ñặc hiệu khác loài chống lại các chủng E.coli ñộc có tác dụng khống chế có hiệu quả tiêu chảy ở lợn (Yolken và cộng sự, 1988 [80]; Yokoyama và cộng sự, 1992 [79]). Các tác giả cho biết: trứng gà ñược miễn dịch chỉ lấy phần lòng ñỏ sấy khô thành dạng bột, từ 10 gam lòng ñỏ tối miễn dịch ban ñầu sau khi tinh chế lượng vật chất khô thành phần IgG thu ñược ñạt 15 mg ở ñộ tinh khiết 93,8%. Giá trị vật chất khô (mg) IgG tinh khiết Phương pháp tinh chế IgG Protein Lipid IgG % Lòng ñỏ trứng 1240 3470 65 5,2 Phương pháp phù nổi 323 9 4._. bộ Tr iệ u ch ứ n g, bệ n h tíc h Tỷ lệ số n g (% ) Tỷ lệ a n to àn (% ) 10 35 1 D ướ i d a - - 10 0 10 0 10 35 2 D ướ i d a - - 10 0 10 0 I 10 35 3 D ướ i d a - - 10 0 10 0 10 35 1 D ướ i d a - - 10 0 10 0 10 35 2 D ướ i d a - - 10 0 10 0 II 10 35 3 D ướ i d a - - 10 0 10 0 10 35 1 D ướ i d a - - 10 0 10 0 10 35 2 D ướ i d a - - 10 0 10 0 II I 10 35 3 D ướ i d a - - 10 0 10 0 G à ñố i c hứ n g 10 35 - - 10 0 G hi ch ú: (-) : kh ôn g có ph ản ứn g Tr ườ n g ð ại họ c Nô n g n gh iệ p H à N ội – Lu ận vă n th ạc sỹ kh o a họ c n ôn g n gh iệ p… … … … … 60 (+ ): có ph ản ứn g Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 61 Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của một số tác giả: Yokoyama (1992) [79] sử dụng kháng thể lòng ñỏ chứa globulin ñặc hiệu từ gà ñẻ ñược tối miễn dịch hoàn toàn không gây phản ứng cho lợn sơ sinh khi uống. Sử dụng an toàn trong cả trường hợp lợn con bị cắt nguồn sữa ñầu. Phan Thanh Phượng và ðặng Thị Thủy (2008) [19] cho biết: chế phẩm bột lòng ñỏ trứng gà phòng trị bệnh E.coli và tụ huyết trùng lợn khi qua ñường ruột của con non thẩm thấu vào hệ tuần hoàn, tuy kháng thể qua ñường ruột bị các men tiêu hoá phá huỷ nhưng vẫn ñạt ở mức nhất ñịnh ñể có thể bảo vệ cho con non. 3.6. Kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của chế phẩm KTLðMG Hiệu lực là một trong những chỉ tiêu quan trọng nhất ñể ñánh giá chất lượng của một loại chế phẩm. Khi chế phẩm ñã ñảm bảo hai chỉ tiêu vô trùng và an toàn, nhất thiết phải ñảm bảo chỉ tiêu hiệu lực thì chế phẩm mới ñược phép sử dụng. ðể kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của chế phẩm, chúng tôi dùng phương pháp công cường ñộc cho gà. Thí nghiệm ñược tiến hành 2 ñợt, mỗi ñợt thí nghiệm dùng 20 gà ñang trong ñộ tuổi mẫn cảm với mầm bệnh MG (30 - 35 ngày tuổi), trong ñó 10 gà thí nghiệm và 10 gà ñối chứng. Gà thí nghiệm ñược tiêm chế phẩm KTLðMG, sau 24 giờ tiêm chủng MG cường ñộc. Gà ñối chứng không ñược tiêm chế phẩm KTLðMG, chỉ tiêm chủng MG cường ñộc. Tất cả gà ñược nuôi dưỡng chăm sóc chu ñáo, theo dõi số con sống, số con chết trong vòng 3 tuần. Kết quả thu ñược ñược chúng tôi trình bày ở bảng 3.11. Kết quả bảng 3.11 cho thấy: Ở lần thí nghiệm I, sau 21 ngày theo dõi trong số 10 gà thí nghiệm có 3 gà chết (chiếm 30%) và 7 gà sống, tỷ lệ bảo hộ là 70%. Ở lần thí nghiệm II, trong số 10 gà thí nghiệm có 2 gà chết (chiếm 20%) và 8 gà sống, tỷ lệ bảo hộ là 80%. Tr ườ n g ð ại họ c Nô n g n gh iệ p H à N ội – Lu ận vă n th ạc sỹ kh o a họ c n ôn g n gh iệ p… … … … … 62 Bả n g 3. 11 . K ết qu ả x ác ñị n h hi ệu lự c củ a ch ế ph ẩm K TL ð M G Li ều tiê m (m l/c o n ) K ết qu ả ð ối tư ợ n g n gh iên cứ u Lầ n TN Số gà th eo dõ i (co n ) Ch ế ph ẩm KT Lð M G M G Cð V ị t rí tiê m Số gà ch ết (co n ) Số gà số n g (co n ) Tỷ lệ bả o hộ (% ) I 10 1 0, 5 D ướ i d a 3 7 70 , 00 G à th í n gh iệ m II 10 1 0, 5 D ướ i d a 2 8 80 , 00 I 10 - 0, 5 D ướ i d a 7 3 30 , 00 G à ñố i c hứ n g II 10 - 0, 5 D ướ i d a 9 1 10 , 00 G hi ch ú: - K TL ð M G : kh án g th ể lò n g ñỏ M G - M G Cð : M G cư ờn g ñộ c Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 63 Lô gà ñối chứng không tiêm chế phẩm mà tiêm chủng MG cường ñộc, theo dõi trong vòng 21 ngày thấy tất cả gà ñều ốm, biểu hiện các triệu chứng ngày càng nặng. Lúc ñầu gà kém ăn, ủ rũ, xù lông, sã cánh, thở khò khè, sau ñó thở khó khăn, chảy nước mắt nước mũi, ho hen kéo dài, tiêu hóa, hấp thu thức ăn kém, cuối cùng là bỏ ăn rồi chết. Tỷ lệ sống sót rất thấp (10 - 30%) nhưng vẫn trong tình trạng mang trùng, bệnh biểu hiện ở thể mạn tính, tỷ lệ chết rất cao (70 - 90%). Qua kiểm tra hiệu lực bằng phương pháp thử thách công cường ñộc có thể nhận xét: chế phẩm ñạt tiêu chuẩn về hiệu lực, tỷ lệ bảo hộ cao (70 - 80%). 3.7. Xác ñịnh thời gian bảo quản chế phẩm KTLðMG Chế phẩm KTLðMG ñược sản xuất từ lòng ñỏ trứng gà nên thành phần chủ yếu là protein. Protein rất dễ bị biến ñổi bởi nhiệt ñộ, ánh sáng, ñộ ẩm, pH… Vì vậy, chế phẩm KTLðMG phải bảo quản trong ñiều kiện nhất ñịnh ñể ñảm bảo sản phẩm luôn ñạt tiêu chuẩn cả về cảm quan và chất lượng. Chế phẩm KTLðMG sau khi sản xuất ñược bảo quản ở nhiệt ñộ 4 - 80C. Vấn ñề ñặt ra là trong ñiều kiện bảo quản ở nhiệt ñộ này chế phẩm giữ ñược chất lượng trong thời gian bao lâu. ðể biết ñược ñiều này tại các thời ñiểm sau 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 tháng sản xuất chúng tôi tiến hành lấy mẫu kiểm tra các chỉ tiêu: trạng thái bên ngoài, vô trùng, an toàn, hiệu giá kháng thể MG. Kết quả thu ñược ñược trình bày ở bảng 3.12. Kết quả bảng 3.12 cho thấy: lô chế phẩm KTLðMG ñược bảo quản ở ñiều kiện nhiệt ñộ 4 - 80C, sau 06 tháng vẫn ñảm bảo các tiêu chuẩn ban ñầu, hiệu giá kháng thể MG vẫn ñạt ñược HI ≥ 5log2. ðến tháng thứ 7, các chỉ tiêu: vô trùng, an toàn của chế phẩm vẫn ñạt tiêu chuẩn, nhưng trạng thái bên ngoài của chế phẩm ñã bị thay ñổi, chế phẩm không còn màu, mùi ñặc trưng của lòng ñỏ trứng, hiệu giá kháng thể MG ñã giảm, HI < 5log2 không ñủ ñể bảo hộ ñàn gà chống MG. Như vậy, kết quả nghiên cứu trên cho thấy: chế phẩm KTLðMG ñược bảo quản ở nhiệt ñộ 4 - 80C và hạn sử dụng là 06 tháng kể từ ngày sản xuất. Tr ườ n g ð ại họ c Nô n g n gh iệ p H à N ội – Lu ận vă n th ạc sỹ kh o a họ c n ôn g n gh iệ p… … … … … 64 Bả n g 3. 12 . K ết qu ả x ác ñ ịn h th ờ i g ia n bả o qu ản ch ế ph ẩm K TL ð M G ở n hi ệt ñộ 4 - 80 C K ết qu ả C hỉ tiê u Ti êu ch u ẩn ba n ñ ầu 1 th án g 2 th án g 3 th án g 4 th án g 5 th án g 6 th án g 7 th án g Tr ạn g th ái bê n n go ài N hũ dị ch có m àu v àn g ñặ c tr ưn g, kh ôn g v ón cụ c + + + + + + - V ô tr ùn g K hô n g n hi ễm kh u ẩn , n ấm m ốc sa u n u ôi cấ y 24 , 48 , 72 gi ờ + + + + + + + A n to àn A n to àn tr ên gà + + + + + + + H iệ u gi á H I ≥ 5l o g2 + + + + + + - G hi ch ú : (+ ) : ñạ t Tr ườ n g ð ại họ c Nô n g n gh iệ p H à N ội – Lu ận vă n th ạc sỹ kh o a họ c n ôn g n gh iệ p… … … … … 65 (-) : kh ôn g ñạ t Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 66 3.8. Ứng dụng thử nghiệm chế phẩm KTLðMG trong phòng, trị bệnh CRD cho gà ở nước ta Qua các kết quả nghiên cứu trên cho thấy: chế phẩm KTLðMG tiêm cho gà an toàn, có HGKT thụ ñộng trong máu cao, có khả năng phòng và trị bệnh CRD ở gà. Chúng tôi ứng dụng thử nghiệm, dùng chế phẩm ñể phòng và trị bệnh CRD cho gà do MG gây ra ở một số trại chăn nuôi gà theo hướng công nghiệp. Tại khu chăn nuôi gà gia công ở xã ðồng Lư, huyện Quốc Oai, Hà Nội, ñàn gà ñang nuôi ñược 30 ngày tuổi bị ốm. Quan sát thấy một số con có biểu hiện kém ăn, bỏ ăn, chảy nước mắt, nước mũi, ho, vẩy mỏ, thở khò khè, cánh sã, lông xù xơ xác. Một vài con chết, mổ khám kiểm tra bệnh tích thấy: xác chết gầy, ñường dẫn khí chứa nhiều dịch nhớt màu vàng hay vàng xám, niêm mạc họng xung huyết, ñôi chỗ bị xuất huyết phủ nhiều niêm dịch trong. Phổi có chứa nhiều bọt khí, rải rác một số vùng bị viêm và hoại tử. Thành các túi khí dày, thủy thũng, bên trong chứa ñầy chất dịch màu sữa. Căn cứ vào triệu chứng, bệnh tích, ñặc ñiểm dịch tễ của bệnh, chúng tôi kết luận ñàn gà trên bị bệnh CRD do Mycoplasma gallisepticum gây ra, chúng tôi ñã chọn ñược 161 gà bị bệnh, tiến hành chia lô theo 3 phác ñồ ñiều trị. Kết quả ñiều trị ñược trình bày ở bảng 3.13. Phác ñồ I làm ñối chứng: không sử dụng chế phẩm KTLðMG mà ñiều trị bệnh bằng kháng sinh với số lần dùng thuốc là 2 lần/ngày và thời gian ñiều trị từ 4 - 5 ngày. Kết quả ñiều trị cho tỷ lệ khỏi bệnh rất thấp (68%). Phác ñồ II: sử dụng chế phẩm KTLðMG ñể ñiều trị bệnh, dùng 1 lần/ngày, sau 3 - 5 ngày ñiều trị tỷ lệ khỏi bệnh ñạt 76%. Phác ñồ III: sử dụng chế phẩm KTLðMG kết hợp với kháng sinh ñể ñiều trị, dùng thuốc 1 lần/ngày, sau 3 - 4 ngày ñiều trị tỷ lệ khỏi bệnh cao nhất (83,6%). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 67 Bảng 3.13. Kết quả ñiều trị bệnh CRD ở gà bằng chế phẩm KTLðMG Kết quả Phác ñồ Thuốc ñiều trị Liều dùng (ml/kgP) ðường tiêm Số gà mắc bệnh (con) Số lần dùng thuốc /ngày Liệu trình (ngày) Số gà khỏi bệnh Tỷ lệ (%) I Tylosine VitaminB1 VitaminC Bắp 50 2 4 - 5 34 68,0 II Chế phẩm KTLðMG Dưới da 50 1 3 - 5 38 76,0 III Chế phẩm KTLðMG Tylosine VitaminB1 VitaminC Dưới da Bắp 61 1 3 - 4 51 83,6 Như vậy, việc dùng kháng sinh ñể ñiều trị bệnh cũng có hiệu quả nhưng tỷ lệ khỏi bệnh chỉ ñạt 68%, trong khi ñó dùng chế phẩm KTLðMG cho tỷ lệ khỏi bệnh khá cao 76%, nếu dùng kết hợp với kháng sinh tylosine tỷ lệ khỏi bệnh ñạt 83,6%. Với tỷ lệ khỏi bệnh là 76% (theo phác ñồ II) và 83,6% (theo phác ñồ III) chúng tôi có thể khẳng ñịnh chế phẩm KTLðMG có tác dụng tốt trong việc khống chế và tiêu diệt mầm bệnh MG. Bệnh CRD ở gà là bệnh truyền nhiễm mạn tính vì vậy ñể loại bỏ hoàn toàn ñược mầm bệnh trong cơ thể gà là rất khó. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 68 Theo kết quả nghiên cứu của Nhữ Văn Thụ và cộng sự (2007) [22] cho biết: chưa có loại kháng sinh nào có thể loại bỏ hoàn toàn ñược mầm bệnh mà chỉ có tác dụng khống chế mầm bệnh Mycoplasma cũng như các loại mầm bệnh khác có khả năng bội nhiễm. Mặt khác, sau khi sử dụng kháng sinh Mycoplasma có khả năng tái nhiễm hoặc nhờn thuốc. Nguyễn Hữu Vũ (1996) [24] ñã công bố kết quả ñiều trị bệnh CRD cho gà bằng các loại chế phẩm từ Tylosin, Tiamulin, Genta - tylo và Chlortylodexa tỷ lệ khỏi bệnh từ 83,60 - 94,50%. ðối với việc phòng bệnh CRD bằng Tylosin và Tiamulin cũng ñạt hiệu quả từ 92 - 95%. Nguyễn Hoài Nam (1999) [12] nghiên cứu bệnh CRD cho thấy: khi gây bệnh thực nghiệm cho gà bằng chủng phân lập ñược và dùng kháng sinh ñể ñiều trị ñạt tỷ lệ khỏi khá cao (Genta - tylo ñạt tỷ lệ khỏi là 86%, Anti - CRD ñạt tỷ lệ khỏi là 82%). Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy: khi sử dụng chế phẩm KTLðMG phòng trị bệnh CRD ở gà nên kết hợp với kháng sinh ñể rút ngắn thời gian ñiều trị, giảm số lần tiêm trong ngày, chi phí cho ñiều trị bệnh thấp nhất nhưng mang lại hiệu quả kinh tế cao nhất. Túi khí dày và ñục, có nhiều bọt Viêm màng bao tim và màng bao quanh gan Ảnh 3.5. Bệnh tích gà bị bệnh do Mycoplasma gallisepticum gây ra Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 69 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN Từ kết quả nghiên cứu của ñề tài chúng tôi có một số kết luận như sau: 1/ Ứng dụng quy trình III ñể gây tối miễn dịch cho gà với MG. Quy trình gây tối miễn dịch cho gà với MG như sau: - Dùng vaccine MG - Bac vô hoạt, tiêm bắp cho gà 3 lần (lần 1: 0,5 ml/con; lần 2: 1 ml/con; lần 3: 1 ml/con) mỗi lần tiêm cách nhau 1 tuần. - 14 ngày sau dùng chủng MG cường ñộc tiêm dưới da cho gà liều 0,5ml/con. 2/ Quy trình sản xuất chế phẩm KTLðMG - Thu trứng lấy lòng ñỏ (lòng ñỏ có hiệu giá HI ≥ 10log2). - Pha lòng ñỏ trứng với dung môi theo tỷ lệ: 26/74 (lòng ñỏ/dung môi). - Chỉ lấy chế phẩm KTLðMG có hiệu giá HI ≥ 5log2. 3/ Chế phẩm KTLðMG sản xuất từ lòng ñỏ trứng của gà ñược gây tối miễn dịch ñạt các chỉ tiêu: vô trùng, an toàn và hiệu lực. 4/ Chế phẩm KTLðMG ñược bảo quản ở nhiệt ñộ 4 - 80C có hạn sử dụng 06 tháng kể từ ngày sản xuất. 5/ Dùng chế phẩm KTLðMG ñiều trị bệnh CRD ở gà cho hiệu quả ñiều trị cao. 2. ðỀ NGHỊ - Chế phẩm KTLðMG chúng tôi chế ñược có hiệu giá kháng thể rất cao (HI ≥ 8,33log2). Vì vậy, cần nghiên cứu công thức pha chế ñể giữ ñược hiệu giá kháng thể MG của thành phẩm trong thời gian dài. - Do thời gian và ñiều kiện không cho phép nên chúng tôi mới tiến hành ứng dụng thử nghiệm ñiều trị trên diện hẹp. Vì vậy, cần tiếp tục thử nghiệm chế phẩm trong phòng, trị bệnh CRD trên gà ở mọi lứa tuổi và ứng dụng ñiều trị bệnh CRD trong chăn nuôi trên diện rộng. - Chế phẩm ñã ñược Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I kiểm tra ñạt tiêu chuẩn: vô trùng, an toàn và hiệu lực. Vì vậy, có thể ứng dụng sản xuất chế phẩm kháng thể từ lòng ñỏ trứng gà chống MG. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2009), Danh mục thuốc Thú y ñược phép lưu hành tại Việt Nam, Hà Nội, tháng 3, tr. 75 - 83. 2. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2009), Danh mục vaccine, chế phẩm sinh học, vi sinh vật, hóa chất dùng trong thú y ñược phép lưu hành tại Việt Nam, Hà Nội, tháng 3, tr. 11 - 12. 3. Hồ ðình Chúc, Trần Kim Vạn (1989), Phòng chống bệnh CRD ở gà công nghiệp bằng Tylosin chiết xuất và kháng sinh, Báo cáo Khoa học, tr. 2 - 12. 4. ðào Trọng ðạt, Nguyễn Văn Quang, Nguyễn ðức Dụ (1978), Bệnh Mycoplasmosis ở ñàn gà nước ta, Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật Thú y, Nhà xuất bản Nông nghiệp, tr. 143 - 150. 5. Phạm Văn ðông (2002), Tình hình nhiễm CRD (Chronic Respiratory Disease) ở gà công nghiệp vùng hữu ngạn sông Hồng và biện pháp phòng trị, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Viện Thú y, Hà Nội. 6. ðào Thị Hảo (1996), Nghiên cứu một số ñặc ñiểm dịch tễ học bệnh Mycoplasmosis trên ñàn gà công nghiệp và biện pháp phòng trị, Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, Viện Thú y, Hà Nội. 7. ðào Thị Hảo (2008), Phân lập, xác ñịnh một số ñặc tính sinh học của Mycoplasma gallisepticum và chế kháng nguyên, kháng huyết thanh chẩn ñoán, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Viện Thú y, Hà Nội. 8. Vũ Quang Hợp (1997), Nghiên cứu tình hình bệnh CRD (Chronic Respiratory Disease) tại Xí nghiệp gà Lương Mỹ và biện pháp phòng trị, Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp. 9. Nguyễn Thị Hương và Lê Văn Năm (1995), 60 câu hỏi ñáp dành cho người chăn nuôi gà công nghiệp, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội, tr. 50 - 70. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 71 10. Phạm Thị Thu Lan, Trần Thị Hạnh, Nguyễn Văn Thiện (1988), "Tình hình nhiễm bệnh CRD trên ñàn gà công nghiệp ở thành phố Nha Trang và biện pháp phòng trừ", tạp chí KHKT Thú y, tr. 50 - 52. 11. Phan Lục, Nguyễn Thuý Hồng, Nguyễn Thị Tuyết Minh, ðặng Thị Tám, Trần Văn Tuyến, Tạ Ngọc Sính (1994), ðiều tra nghiên cứu tỷ lệ nhiễm Mycoplasma ở ñàn gà công nghiệp các tỉnh phía Bắc từ 1990 - 1994, Báo cáo Khoa học phần Thú y 1995, tr. 179 - 195. 12. Nguyễn Hoài Nam (1999), Nghiên cứu dịch tễ học bệnh viêm ñường hô hấp mạn tính (CRD) ở gà giống và các biện pháp phòng trị, Luận án Tiến sĩ Khoa học Nông nghiệp. 13. Hoàng Xuân Nghinh (1996), Nghiên cứu biến ñổi bệnh lý ñường hô hấp ở gà trong bệnh ñường hô hấp mạn tính, Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp. 14. Hoàng Xuân Nghinh, Phan Thanh Phượng, Trương Văn Dung, Cù Hữu Phú, ðỗ Ngọc Thuý (1999), Nghiên cứu biến ñổi bệnh lý ñường hô hấp ở gà trong bệnh ñường hô hấp mạn tính, Báo cáo Khoa học Chăn nuôi Thú y 1998 - 1999, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, tr. 154 - 166. 15. Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú, Lê Văn Tạo, Hoàng Xuân Nghing, ðào Thị Hảo, Nguyễn Hoài Nam (1999), Kết quả phân lập Mycoplasma gây bệnh hô hấp mạn tính ở gà, Báo cáo khoa học Chăn nuôi Thú y 1998 - 1999, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, tr. 144 - 153. 16. Nguyễn Vĩnh Phước (1978), Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 380 - 386. 17. Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Thị Như Nguyện (1985), "ðiều tra cơ bản bệnh CRD trên ñàn gà công nghiệp ở một số tỉnh phía Nam", tạp chí KHKT Thú y, tháng 5/1985, tr. 8 - 15. 18. Phan Thanh Phượng, ðặng Thị Thuỷ (2008), "Phòng bệnh bằng kháng thể E.coli ñược chiết tách từ lòng ñỏ trứng gà dạng bột", tạp chí KHKT Thú y, 15(5), tr. 95 - 96. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 72 19. Phan Thanh Phượng, ðặng Thị Thuỷ (2008), "Nghiên cứu biến ñộng hiệu giá kháng thể thụ ñộng trong cơ thể lợn ñược sử dụng kháng thể dạng bột và dạng ñông khô phòng trị bệnh E.coli và tụ huyết trùng lợn", tạp chí KHKT Thú y, 15(6), tr. 56 - 59. 20. Tô Long Thành (2007), "Kháng thể - các khái niệm cơ bản", tạp chí KHKT Thú y, 14(4), tr. 63 - 70. 21. Nhữ Văn Thụ, Lê Thị Thuý, Võ Văn Sự, Lê Minh Sắt, Phạm Thị Dung, Nguyễn Văn Hậu, Phạm Doãn Lân, Nguyễn ðăng Vang (2001), Hoàn thiện và ứng dụng PCR trong chẩn ñoán nhanh và bước ñầu ñiều tra dịch tễ bệnh do Mycoplasma gallisepticum, Thông tin Khoa học kỹ thuật chăn nuôi, (3), Viện Chăn Nuôi. 22. Nhữ Văn Thụ, Phan Thanh Phượng, Cù Hữu Phú, ðào Thị Hảo, Trương Quang Lâm (2007), "Ứng dụng kỹ thuật PCR ñể xác ñịnh hiệu quả ñiều trị kháng sinh ñối với mầm bệnh Mycoplasma ở gà", tạp chí KHKT Thú y, 14(3), tr. 20 - 26. 23. Tạ Thị Vịnh và cộng sự (1994), "Thử nghiệm chế phẩm huyết thanh siêu mẫn trên lợn con mới sinh ñể nâng cao khả năng phòng bệnh phân trắng lợn con", tạp chí KHKT Thú y, 1(3), tr. 63 - 66. 24. Nguyễn Hữu Vũ (1996), Tình hình bệnh hô hấp mạn tính của gà, ứng dụng các chế phẩm chứa tylosin và tiamulin trong ñiều trị, Luận án Phó Tiến sĩ Khoa học Nông nghiệp. II. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 25. Ansari A.A., Taylor R.F & Chang T.S. (1983), Application of enzyme- linked immunosorbent assay for detecting antibody to Mycoplasma gallisepticum infections in poultry, Avian Diseases, 27, tr. 21 - 35. 26. Archibald R.M. (1944), Determination of citrulline and allantoin and demonstration of citrulline in blood plasma, J. Biol. Che, 156, tr. 121 - 127. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 73 27. Barbour E.K., & Hamadeh S., Talhouk R., Sakr W. & Darwish R. (1998). Evaluation of enrofloxacin - treatment program against Mycoplasma gallisepticum infection in broiler, Prev Vet Med, 35, tr. 91 - 99. 28. Bencina D., Dorrer D., Mrzel I., Svetlin A. (1989), Rapid diagnosis of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae infection by two- Color direct immunofluorescence on clinical material from upper espiratory tract of poultry, Praxis Veterinary Zagreb, 37:2, tr. 171 - 179, 26 ref. 29. Bencina D. & Bradbury J.M. (1991), Indirect immunoperoxidase assay for the detection of chiken Mycoplasma infections, Avian Pathology, 20, tr. 113 - 124. 30. Bradbury J.M., McCarthy J.D & Metwali A.Z. (1990), Micro - immunofluorescence for the serological diagnosis of avian Mycoplasma infections, Avian pathology, 19, tr. 213 - 222. 31. Bradbury J.M., Yavari C.A., Dare C.M. (2001), Mycoplasma and respiratory disease in pheasants and partridges, Avian Pathology, 30[4], tr. 391 - 396. 32. Branton S.L., H. Gerlach and S.H. Leven (1984), Mycoplasma gallisepticum isolation in layers, Poult Sci, 63, tr. 1917 - 1919. 33. Branton S.L., Lott B.D., Austin F.W. & Pharr G.T. (1997), Effect drinking water containing ammonium chloride or sodium bicarbonate on Mycoplasma gallisepticum isolation in experimentally infected broiler chickens, Avian Diseases, 41, tr. 930 - 934. 34. Branton S.L., Lott B.D., Maslin W.R., Boyle C.R & Pharr G.T. (1997), The effects of F strain Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae and the dual infection in commercial layer hens over a 44-week laying cycle when challenged before beginning of lay. I. Egg production and selected egg quality parameters, Avian Diseases, 41, tr. 832 - 837. 35. Carpenter T.E., Mallinson E.T., Miller K.F., Gentry R.F. and Schwartz L.D. (1981), Vaccinnation with F Strain Mycoplasma gllisepticum to reduce production losses in layer chickens, Avian Diseases, 25, tr. 404 - 409. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 74 36. Chandiramani N.K.II., Van Roekel et al (1966), Viability studies with Mycoplasma gllisepticum under different environmental conditions, Poult Sci, 45, tr. 1029 - 1044. 37. Christensen N.H., Yavari C.A., Mcbain A.J. & Bradbury J.M. (1994), Investigations into the survival of Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae and Mycoplasma iowae on materials found in the poultry house environment, Avian Pathology, 23, tr. 127 - 143. 38. Domermuth C.H., W.B. Gross and R.T. Dubose (1967), Mycoplasmalsalpingitis of chickens and turkeys, Avian Diseases, 11, tr. 393 - 398. 39. Evans R.D. & Hafez Y.S. (1992), Evaluation of a Mycoplasma gallisepticum strain exhibiting reduced virulence for prevention and control of poultry mycoplasmosis, Avian Diseases, 36, tr. 197 - 201. 40. Fabricant J. et al (1962), Experimental production of complicated CRD infection, Avian Diseases, 6, tr. 13 - 23. 41. Fan H.H., Kelven S.H., Jackwood M.W. (1995), Application of Mycoplasma gallisepticum, Avian Diseases, Oct-Dec; 39(4); tr. 729 - 735. 42. Freund E.A. (1955), Order X. Mycoplasmatales, tr. 914 - 926. 43. Hamdy A.H. (1970), Therapeutic effect of lincospection on airsacculitis in chickens, Avian Diseases, 14, tr. 706 - 714. 44. Harbi M.M., Mustafa A., Salih M.M. (1979), Isolation and identification of Mycoplasma gallisepticum from indigenous chickens in the Sudan, Sudan Journal of Veterinary Research 1.51; 5 ref. 45. Hildebrand D.G., Page D.E. and Berg J.R. (1983), Mycoplasma gallisepticum laboratory and field studies evaluating the safety and efficacy of an inactivated MG bacterin, Avian Diseases, 27, tr. 792 - 802. 46. Hoffstad M.S. (1959), Chronic Respiratory Disease, Disease of poultry Iowa State Univ Press, Ames, 4th, tr. 320 - 330. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 75 47. Jordan P.T.W. and D. Knight (1984), The minimum inhibitory concentration of kitasamycin, tylosin and timulin for Mycoplasma gallisepticum and their protective effect on infected chicks, Avian Patho, 13, tr. 151 - 162. 48. Jordan P.T.W. & Horrocks B.K. (1996), The minimum inhibititory concentration of tilmicosin and tylosin for Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae and a comparison of their efficacy in the control of Mycoplasma gallisepticum infection in broiler chicks, Avian Diseases, 40, tr. 326 - 334. 49. Jordan P.T.W., Forrester C.A., Ripley P.H. & Burch D.G. (1998), In vitro and in vivo comparison of valnemulin, tiamulin, tylosin, enrofloxacin and lincomycin/spectinomycin against Mycoplasma gallisepticum, Avian Diseases, 42, tr. 738 - 745. 50. Kempf I., Gesbert F. & Guittet M. (1997), Experimental infection of atypical Mycoplasma gallisepticum strain: comparison of diagnostic method, Research in Veterinary Science, 63, tr. 211 - 213. 51. Kempf I., Reeve-Johnson L., Gesbert F. & Guittet M. (1997), Efficacy of tilmicosin in the control of experimental Mycoplasma gallisepticum infection in chickens, Avian Diseases, 41, tr. 802 - 807. 52. Kempf I., van den Hoven R., Gesbert F., Guittet M. (1998), Efficacy of difloxacin in growing broiler chickens for the control of infection due to pathogenic Mycoplasma gallisepticum, Zentralbl Veterinarmed, 45, tr. 305 - 310. 53. Levisohn S. and Kleven S.H. (2000), Avian mycoplasmosis (Mycoplasma gallisepticum). In: Diseases of Poultry: world trade and public health implications. C.W. Beard and S. McNulty, Eds, Office International des Epizooties, Paris, France, tr. 425 - 442. 54. Ley D.H., McLaren J.M., Miles A.M., Barnes H.J., Miler S.H. & Franz G. (1997), Transmissibility of live Mycoplasma gallisepticum vaccine strains ts-11 and 6/85 from vaccinated layer pullets to sentinel poultry, Avian Diseases, 41, tr. 187 - 194. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 76 55. Ley D.H. (2003), Mycoplasma gallisepticum infection, In “Disease of Poultry”, (Saif Y.M., Beranes H.J., Glisson J.R., Fadly A.M., McDougald L.R. and Swayne D.E (Ed.), Iowa State Press, Ames, tr. 722 - 744. 56. Lin M.Y. & Kleven S.H. (1982), Cross- immunonity and antigenic relationships among five strains of Mycoplasma gallisepticum in young Leghorn chickens, Avian Diseases, 26, tr. 496 - 507. 57. Lin M.Y & Kleven S.H. (1984), Evaluation of attenuated strains of Mycoplasma gallisepticum as vaccines in young chickens, Avian Diseases, 28, tr. 88 - 99. 58. Lin M.Y., Chiang Y.C., Lin K.Y. & Sung H.T. (1994), Susceptibility of avian mycoplasma isolated in Taiwan to 21 antimicrobial agents, Chung Hua Min Kuo Wei Sheng Wu Chi Mein I Hsueh Tsa Chih, 27, tr. 70 - 79. 59. Marois C., Dufour - Gesbert F., Kempf I. (2001), Molecular differentiation of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma immitans strains by pulsed-field gel electrophoresis and random amplifed polymophic ADN, J.Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health, 48(9), tr. 695 - 703. 60. Mohammed H.O., Carpenter T.E., Yamamoto R. & Ormayyer H.B. (1986), Comparison of egg yolk and serum for the detection of Mycoplasma gallisepticum and M.synoviae antibodies by enzyme- linked immunosorbent assay, Avian Diseases, 30, tr. 398 - 408. 61. Mohammed H.O., Carpenter T.E. & Yamamoto R. (1987), Economic impact of Mycoplasma gallisepticum and M. synoviae in commercial layer focks, Avian Diseases, 31, tr. 477 - 482. 62. Morrow C.J., Bell I.G., Walker S.B., Markham P.F., Thorn B.H., Whithear K.G. (1990), Isolation of Mycoplasma synoviae from infectious synovitis of chickens, Australia Veterinary Journal, 67:4, tr. 121 - 124, 22 ref. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 77 63. Morrow C.J., Markham J.F., Whithear K.G. (1998), Production of temperature-sensitive clone of Mycoplasma synoviae as live vaccines, Avian Diseases, 42(4), tr. 667 - 670. 64. Nakamura T., Hoshi S., Nagasawa Y. & Ueda S. (1995), The effect of route of inoculation on protection by killed vaccines in chickens, Avian Diseases, 39, tr. 507 - 513. 65. Olesiuk O.M. and H.Van Roekel (1952), Cultural attributes of the chronic respiratory disease agent, Proc 24th Annu Conf Northeast Lab Workers in Pullorum Disease Control. 66. Papazisi L., Troy K.E., Gorton T.S., Liao X. and Geary S.J. (2000), Analusis of cytadherence-deficient, Gap A-negative Mycoplasma gallisepticum strain R, Infect, Immun, 68, tr. 6643 - 6649. 67. Razin S. (1992), Mycoplasma taxonomy and ecology. In Mycoplasma: molecular biology and pathogenesis, (Maniloff R.N.M.J., Finch L.R. and Baseman J.B.), American Society for Microbiology, Washington, D.C., 3 - 22. 68. Sato S. (1996), Avian mycoplasmosis in Asia, Rev. Sci. Tech, 15(4), tr.1555-1567. 69. Shimizu T., Nagatomo H. (1989), An adhesion-hemadsorption inhibition test for the detection of serum antibody to Mycoplasma, Japanese journal of Veterinary Sciense, 51:3, tr. 491 - 495, 3 ref. 70. Shryock T.R., Klink P.R., Readnour R.S. & Tonkinson L.V. (1994), Effect of bentonite incorporated in a feed ration with tilmicosin in the prevention of induced Mycoplasma gallisepticum airsacculitis in broiler chickers, Avian Diseases, 38, tr. 501 - 505. 71. Shukla S.K., Kumar M., Joshi H.C. (1985), Sero - Prevalence of Mycoplasma gallisepticum infection in poultry, Indial Journal of Veterinary Medicine, 5:12, tr. 115 - 117, 7 ref. 72. Stipkovits L., Kempf I., (1996), Mycoplasmas in poultry, Rev. Sci. Tech, 15(4), tr. 1495 - 1525. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 78 73. Sumano L.H., Ocampo C.L., Brumbaugh G.W. & Lizarraga R.E. (1998), Effectiveness of two fluoroquinolones for the treatment of chronic respiratory disease outbreak in broilers, Br Poult Sci, 39, tr. 42 - 46. 74. Talkington F.D. and Kleven S.H. (1985), Evaluation of protection against colonization of the trachea following administration of Mycoplasma gallisepticum bacterin, Avian Diseases, 29, tr. 988 - 1003. 75. Timms L.M., Marshall R.N. & Breslin M.F. (1989), Evaluation of the efficacy of chlortetracycline for the control chronic respiratory disease caused by Escherichia coli and Mycoplasma gallisepticum, Rev Vet Sci, 47, tr. 377 - 382. 76. Turner K.S. and Kleven S.H. (1998), Eradication of live F strain Mycoplasma gallisepticum vaccine using live ts-11 on a multiage commercial layer farm, Avian Diseases, 42, tr. 404 - 407. 77. Yoder H.W.Jr. and Hofstad M.S. (1964), Characterization of avian Mycoplasma, Avian Diseases, 8, tr. 481 - 512. 78. Yoder H.W.Jr. (1979), Serologic response of chickens vaccinated with inactivated preparations of Mycoplasma gallisepticum, Avian Diseases, 23, tr. 493 - 506. 79. Yokoyama H., Robertc.Peranta, Royer Diaz. Sada Kosende, Yutaka Ikemori and Yoshikatsn Kodama (1992), Passive protactive effect of chicken egg youk immunoglobuline against epxperimental enterotoxigenic E.coli infectionin neonata piglets. 80. Yolken R.H., Leiser F., Wee S.B., Miskeeff R. and Volderfecht (1988), Antibodies to rota viruses in chicken eggs, apotential source of antiviral immuno globulins suiable for human consumption, Pediatries, 81, tr. 291 - 295. 81. Zain M.Z. and Bradbury J.M. (1996), Optimising the conditions for the isolation of Mycoplasma gallisepticum collected on applicator swabs, Veterinary Microbiology, 49, tr. 45 - 57. ._.