Nghiên cứu qui trình nhân giống vô tính hoắc hương (Pogostemon cablin) bằng phương pháp in vitro

nước ta không ổn định. Quá trình lưu giữ giống qua mùa hè gặp rất nhiều khó khăn, có năm bị mất giống nên một yêu cầu cấp thiết đặt ra là cần có một biện pháp giữ giống qua mùa hè để đảm bảo nguồn cây giống ổn định. Nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể đáp ứng được yêu cầu này và vì vậy chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính hoắc hương (Pogostemon cablin) bằng phương pháp in vitro”. Mục đích - yêu cầu của đề tài * Mục đích: - Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu in vitro cây hoắc hương - Nghiên cứu quy trình kỹ thuật nhân nhanh in vitro cây hoắc hương * Yêu cầu : Quy trình nhân giống phải tạo ra hệ số nhân giống cao, cây con khoẻ và đồng nhất di truyền. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài * ý nghĩa khoa học : Phát hiện được quy luật tác dụng của các yếu tố môi trường dinh dưỡng đối với quá trình phát sinh hình thái của hoắc hương để ứng dụng vào việc tạo cây giống có chất lượng cao. * ý nghĩa thực tiễn : Cung cấp một phương pháp nhân giống hoắc hương mới, tạo ra cây giống có chất lượng cao, nâng cao hiệu quả kinh tế của khâu trồng trọt và góp phần thúc đẩy sản xuất hoắc hương trở thành cây trồng có tính chất hàng hoá mới phục vụ cho việc phòng chống bệnh tật của cộng đồng và xuất khẩu. Phần i Tổng quan tài liệu 1.1. Giới thiệu khái quát về cây hoắc hương Hoắc hương còn gọi là quảng hoắc hương, thổ hoắc hương. Tên khoa học: Pogostemon cablin (Blaco) Benth. Thuộc họ hoa môi Lamiaceae (Labiatea). 1.1.1. Đặc điểm thực vật học Hoắc hương là một cây cỏ sống lâu năm, thân có phân nhánh, cao chừng 30cm đến 60cm. Trên thân có lông, lá có mùi thơm. Lá có cuống ngắn, phiến lá hình trứng hay hình thuốn, dài chừng 5-10cm, rộng 2,5 – 7cm, mép có răng cưa to, mặt dưới nhiều lông hơn. Hoa màu hồng tím nhạt mọc thành bông ở kẽ lá hay đầu cành. Tuy nhiên cây trồng ở Việt Nam hầu như không thấy có hoa và kết quả [3,4]. Ngoài loài hoắc hương kể trên, người ta còn dùng loài hoắc hương Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) O.Kuntze, cùng họ. Đó là một loại cỏ sống hàng năm, cao chừng 40-100cm. Lá hình trứng dài 2-8cm, rộng 1-5cm, đầu lá nhọn phía cuống hơi hình tim, cuống dài 1-4cm, mép có răng cưa thô, to. Hoa mọc thành vòng quanh thân ở đầu cành hay kẽ lá. Cánh hoa màu tím hay màu trắng. Mùa hoa tháng 6-7, mùa quả tháng 10-11. Cây này cũng có mọc ở nước ta nhưng ít phổ biến hơn loài trên. 1.1.2. Phân bố, thu hái và chế biến Cây hoắc hương được trồng nhiều nơi ở miền Bắc nước ta, chủ yếu lấy lá và cành làm thuốc. Nhiều nhất tại vùng Kim Sơn (Hà Nam), Hưng Yên. Tại Trung tâm nghiên cứu Trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội có trồng lưu giữ giống. Thường trồng bằng giâm cành, vì cây không có hoa quả [2]. Tại các nước khác tại vùng nhiệt đới Châu á và Châu Phi, hoắc hương được trồng rất quy mô để lấy lá cất tinh dầu. Những nước sản xuất hoắc hương nhiều nhất hiện nay là ấn Độ, Malaixia, Philippin, Mangat, Inđônêxia. Hàng năm tại Malaixia thu hoạch chừng 500 tấn lá khô hoắc hương để cất tinh dầu, chưa kể còn sản xuất chừng 700-1000 tấn lá để xuất cảng nữa. Tại Mangat, vào năm 1925 đã sản xuất chừng hơn 5 tấn lá khô để cất tinh dầu, chưa kể số lá dùng để cất tinh dầu tiêu thụ trong nội địa. Hiệu suất thu hoạch mỗi hecta hàng năm chừng 500 kg lá khô [10]. 1.1.3. Thành phần hoá học Trong lá hoắc hương khô có chứa 0,5 – 0,6 % tinh dầu. Thành phần chủ yếu của tinh dầu hoắc hương là cồn Patchouli C15H26O, còn gọi là long não Patchouli, chất anđêhit xinamic, anđêhit benzoic, eugenola, cađinen C15H24 sesquitecpen và azulen [10]. Long não Patchouli là một rượu bậc ba, kết tinh dưới dạng tinh thể hình lục lăng, có khi kết tinh ngay trong tinh dầu. Trong tinh dầu cất từ lá cây mọc ở Hà Nội (Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự J.Ess. Oil Res. 2,99 – 100, March-april, 1989) đã thấy cồn Patchouli chiếm 32-38%. Ngoài ra còn 10 thành phần khác được phát hiện trong đó có a-bunesine và a-guaiene [10]. Có thể cất tinh dầu hoắc hương bằng lá tươi, nhưng tỉ lệ thấp, thường tinh dầu chỉ xuất hiện trong lá khô hoặc lá để thành đống cho hơi lên men và khô dần [4,10]. 1.1.4. Công dụng và liều dùng * Công dụng: - Trong y học nhân dân, hoắc hương là một vị thuốc làm mạnh dạ dày giúp sự tiêu hoá và ruột, dùng trong những trường hợp ăn không ngon, sôi bụng, đau bụng đi ngoài, hôi miệng. Còn dùng làm thuốc chữa cảm mạo, nhức đầu, mình mẩy đâu đớn, triệu chứng cảm cúm. Ngày dùng 6-12 gam dưới dạng thuốc sắc hay thuốc bột, dùng riêng hay phối hợp với vị thuốc khác [3]. - Trong kỹ nghệ nước hoa , hoắc hương là một nguyên liệu quý vì tinh dầu hoắc hương (Oil of Patchouli) là một tinh dầu thơm và định hương cao cấp. * Đơn thuốc có hoắc hương - Hoắc hương chính khí hay kiện tì chi tả tán: Hoắc hương 15 gam, tô diệp (lá tía tô) 10 gam, thương truật 8 gam, cam thảo 3 gam, trầm bì 5 gam, đại táo 4 quả, hậu phác 3 gam, phục linh 6 gam. Tất cả tán thành bột chia thành gói 8 – 10 gam. Chữa ăn uống không tiêu, đau bụng đi ngoài. Người lớn ngày uống 2-5 gói (tối đa), cách một giờ uống 1 gói. Trẻ con dưới 1 tuổi không nên uống. Trẻ con từ 2-3 tuổi mỗi lần dùng 1/3 gói, 8-10 tuổi dùng mỗi lần 1/2 gói [4]. - Đơn thuốc chữa ăn uống không tiêu, hay sôi bụng. Hoắc hương 12 gam, thạch xương bồ 12 gam, hoa cây đại 12 gam, vỏ bưởi đào đốt cháy 6 gam. Tất cả tán nhỏ. Trước bữa ăn 20 phút uống với nước nóng, mỗi lần 2 gam. Ngày uống 3 lần [4]. 1.2. Phương thức nhân giống cây trồng Nhân giống là quá trình tạo ra và phát triển có thể mới. Có 2 phương pháp nhân giống chính: Phương pháp hữu tính – dùng hạt và phương pháp vô tính – dựa vào khả năng tái sinh của một bộ phận nào đó của cây như lá, thân, rễ, mô hoặc tế bào. 1.2.1. Nhân giống hữu tính (bằng hạt) Phương pháp nhân giống này cho hệ số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển. Tuy nhiên, một số cây trồng nếu nhân giống bằng hạt có thể cho những cá thể con không hoàn toàn giống bố mẹ chúng cả về hình thái lẫn thành phần hoá học (Carlson, 1964)[14]. Đặc biệt, đối với cây thuốc, sự không đồng nhất về di truyền dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định về mặt chất lượng qua các thế hệ, gây khó khăn cho việc đưa nguyên liệu vào dây truyền sản xuất công nghiệp vì hàm lượng hoạt chất của nguyên liệu thay đổi thất thường. Ví dụ: ở cây tinh dầu việc nhân giống bằng hạt dẫn đến sự phân ly không những về hàm lượng mà còn cả về số lượng các thành phần hoạt chất. Theo Nilov (1963) cây lavanda khi nhân giống bằng hạt, có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu. Hàm lượng tinh dầu của cây con thay đổi từ 0,5 -11,3% hàm lượng lynalylacetat từ 11-87%. Trong những năm sau, nhiều tác giả đã đi đến kết luận là không nên nhân giống lavanda bằng hạt (Luzina 1983; Nicolaev, 1955) [1]. 1.2.2. Nhân giống vô tính Phương pháp này sử dụng khả năng tái sinh của các cơ quan dinh dưỡng khác nhau như thân, rễ, lá, mô hay tế bào. Nhân giống vô tính bao gồm nhân giống vô tính truyền thống (chiết, ghép, giâm) và nhân giống vô tính in vitro. Nhân giống vô tính tạo ra cây con đồng nhất về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ [11,12]. Gía trị to lớn nhất của phương pháp nhân giống vô tính là duy trì được những tính trạng quý hiếm qua các thế hệ và vì vậy tạo ra khả năng sản xuất nguyên liệu có tiêu chuẩn ổn định cho công nghiệp. Nhân giống vô tính còn có tác dụng rút ngắn thời gian từ khi trồng đến khi thu hoạch, tạo điều kiện tăng vụ, tăng sản phẩm và dẫn đến tăng hiệu quả kinh tế. Tuy nhiên, nhân giống bằng phương pháp vô tính truyền thống cũng có những nhược điểm nhất định, đặc biệt là sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu giống thường phổ biến và phức tạp. Sự lây nhiễm và tích tụ các ký sinh trùng đặc hiệu, nhất là virut, làm giảm năng suất và chất lượng cây trồng. Thiệt hại do hiện tượng này gây ra có thể thấy rất rõ ở khoai tây (Vũ Triệu Mân [5], Van de zaag, (1983)[17], và nhiều cây khác. 1.2.3. Nhân nhanh vô tính in vitro Là kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo vô trùng để tái sinh chúng thành cơ thể mới. 1.2.3.1. Cơ sở lý luận của nuôi cấy in vitro Nuôi cấy mô - tế bào thực vật đã hình thành một thế kỷ trước mà cơ sở của nó là giả thuyết về tính toàn năng của tế bào do nhà thực vật vật học người Đức Haberland G đề xướng (1902). Theo ông mỗi tế bào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, và có khả năng phát triển thành 1 cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Thực tế đã chứng minh khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn (Murashige, 1980) [16]. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là kết quả của các quá trình phân hoá và phản phân hoá. Tất cả các tế bào trong các cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Sự chuyển hoá tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hoá đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hoá tế bào. Còn quá trình phản phân hoá thì ngược lại, có nghĩa là tế bào đã phân hoá thành mô chức năng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia. 1.2.3.2. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro Ngày nay, người ta sử dụng 2 phương thức nhân giống chủ yếu là nuôi cấy mô phân sinh và nuôi cấy mô sẹo. * Nuôi cấy mô phân sinh Mô phân sinh bao gồm đỉnh chồi, đỉnh cành, đỉnh rễ … Đặc điểm của mô phân sinh là chứa các tế bào trẻ, phân chia mạnh, lại không bị virút xâm nhập. Vì vậy, mô phân sinh là mô duy nhất của cây sạch virut [11]. Để nuôi cấy mô phân sinh, có thể dùng môi trường White, Murashige và Skoog (1962), Gamborg… có bổ sung thêm vitamin, đường, các phytohoocmon. Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng trong các trường hợp: - Tạo ra những giống cây sạch virút từ những giống bị bệnh (phục tráng giống) - Nhân giống in vitro. - Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan. * Nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo là khối tế bào phát sinh vô tổ chức và có hình dạng không nhất định với màu vàng, trắng hoặc hơi xanh. Mô sẹo được hình thành từ các mô đỉnh sinh trưởng hay nhu mô và nuôi cấy trên môi trường giàu Auxin. Nguyên liệu để tạo mô sẹo là các phần non của cây, được đưa vào nuôi cấy trên các môi trường MS, Gamborg … và cần thiết thêm các chất thuộc nhóm Auxin [3]. Nuôi cấy mô sẹo được ứng dụng trong nhiều trường hợp: - Nhân giống in vitro ở những loài thực vật mà phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ít có hiệu quả hoặc không thực hiện được. - Làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhận các chất có hoạt tính sinh học … - Làm nguyên liệu cho chọn dòng tế bào : đột biến, chọn dòng chịu mặn… - Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan. 1.2.3.3. ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy Mẫu dùng trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật có thể là bất cứ mô, cơ quan nào của cây như: Chồi bên, phiến lá, cuống lá … Các cấu trúc phôi như lá mầm, các cơ quan tương tự như củ, căn hành. Kiểu gen là yếu tố quyết định tất cả các giai đoạn sinh trưởng trong quá trình nuôi cấy in vitro. Bên cạnh đó, kích thước, nguồn gốc và tuổi sinh lý của mẫu nuôi cấy cũng có ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của mô. Chồi đỉnh có khả năng sinh trưởng tốt hơn các mô có nguồn gốc từ chồi nách [8]. Mô lấy từ cây non có khả năng tái sinh cao hơn các mô lấy từ cây trưởng thành [7,11]. 1.2.3. 4. ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Thành công của nuôi cấy mô - tế bào phụ thuộc rất nhiều vào sự lựa chọn môi trường dinh dưỡng, bao gồm cả số lượng và chất lượng hoá chất sử dụng. Nhu cầu dinh dưỡng cho sinh trưởng tối ưu của các loài thường rất khác nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một cơ thể cũng có ít nhiều sai khác (Murashige and Skoog, 1962)[15]. Cho đến nay hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng nhân tạo đã được xây dựng và thử nghiệm có kết quả như môi trường MS (Murashige and Skook, 1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Vacxin and Went… trong đó môi trường MS được đánh giá phù hợp nhất với nhiều loại thực vật. * Các chất vô cơ chứa nitơ: Được bổ sung vào môi trường dưới dạng 2 dạng: nitrat (NO3-) và amon (NH4+) làm nguồn nitơ. Hầu hết các môi trường đều có lượng nitrat nhiều hơn amon và thường dùng ở nồng độ 25mM nitrat với 2 – 20mM amon [11]. * Carbon và nguồn năng lượng: Vì các mô nuôi cấy không hoàn toàn tự dưỡng nên việc bổ sung đường là cần thiết [8]. Nguồn cacbon được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô tế bào là saccharose. Glucose và các loại đường khác thường nghèo hiđratcarbon đối với cây [8]. * Vitamin: Hầu hết các tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cần thiết nhưng không đầy đủ về số lượng. Để mô có sức sinh trưởng tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin. Trong đó, thiamin (Vitamin B1) được sử dụng rộng rãi nhất. Các vitamin khác, đặc biệt là nicotinic acid (Vitamin B3), Pyridoxine (Vitamin B6) và canxipantothenate (Vitamin B5), biotin cũng được dùng để nâng cao sức sinh trưởng [7]. * Chất điều hoà sinh trưởng: Hiệu quả tác động của các chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ sử dụng và hoạt tính vốn có của nó, đồng thời phụ thuộc vào bản chất của mẫu nuôi cấy. Chất điều hoà sinh trưởng là thành phần quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy, từ những chất này người ta có thể chủ động điều khiển quá trình phát sinh hình thái của thực vật in vitro. Các chất điều hòa sinh trưởng gồm 2 nhóm chính là Auxin và Cytokinin: - Auxin kích thích hình thành mô sẹo, rễ bất định và sự giãn tế bào; chúng được sử dụng với nồng độ 10-1 – 10-6M tùy theo từng chất (2.4 – D, IAA, NAA, IBA) [7]. - Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, 2iP) những hoocmon này liên quan đến sự phân chia tế bào, phân hoá chồi từ mô sẹo hoặc từ cơ quan [18]. Cytokinin sử dụng với nồng độ 10-7 – 10-4M. Tỷ lệ Auxin/Cytokinin quyết định sự phân hoá mô theo hướng tạo rễ, chồi hay mô sẹo. * Chất dinh dưỡng hữu cơ: Một số hỗn hợp dinh dưỡng phức tạp gồm những chất không xác định như nước dừa, cốt dừa cà chua, chuối, khoai tây cũng được sử dụng để làm tăng sự phát triển của callus hay cơ quan của cây. * Agar: Đối với nuôi cây tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có thể bị chìm và sẽ chết vì thiếu oxy. Để khắc phục hiện tượng này, môi trường nuôi cấy được làm đặc bằng agar, một loại tinh bột được chế từ rong biển và mô được cấy trên bề mặt của môi trường, agar được sử dụng với nồng độ từ 0,6 đến 1%. * Độ pH: Độ pH của môi trường được điều chỉnh từ 5,5 đến 6,5 trước khi khử trùng. Nhìn chung, nếu pH cao sẽ làm môi trường bị cứng và nếu <5 thì agar khó đông. 1.2.3.5. ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy * Nhiệt độ: Nhiệt độ trong các phòng nuôi cấy in vitro thường được duy trì ở 25 ± 20C. ở nhiệt độ này, đa số thực vật nuôi cấy đều sinh trưởng, phát triển tốt. * ánh sáng: ánh sáng có ảnh hưởng mạnh đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy. Sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy phụ thuộc nhiều vào chu kỳ, cường độ, thành phần quang phổ ánh sáng (Read, 1990, Dooley, 1991). Cường độ ánh sáng từ 2000 đến 2500 lux được sử dụng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại mô [11]. 1.2.3.6. Quy trình nhân giống in vitro Hiện nay nhân giống in vitro đã được áp dụng cho rất nhiều loại thực vật. Murashige (1974) đã chia quy trình nhân giống in vitro thành 4 giai đoạn [1]. * Giai đoạn 1: Nuôi cấy khởi đầu (tái sinh chồi, cụm chồi) Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy phải đảm bảo yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh. Kết quả này phụ thuộc nhiều vào cách lấy mẫu và phương pháp khử trùng mẫu cấy. * Giai đoạn 2: Nhân nhanh chồi, cụm chồi trong điều kiện in vitro Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ Auxin/Cytokinin ngoại sinh được đưa vào môi trường nuôi cấy. Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định phương thức nhân nhanh bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích. * Giai đoạn 3: Tạo cây con hoàn chỉnh Đây là giai đoạn quan trọng, mục tiêu chính của giai đoạn này là tạo rễ. Tuy nhiên, có những loài không trải qua giai đoạn này vì rễ được hình thành đồng thời với quá trình nhân chồi. * Giai đoạn 4: Huấn luyện cây con, chuyển cây ra vườn ươm Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang trạng thái sống hoàn toàn tự dưỡng. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 – 3 tuần. Trong thời gian này phải đảm bảo điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, giá thể) phù hợp để cây con đạt tỉ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất. Hoa Rễ Phôi Thân Đỉnh sinh trưởng Lá Bao phấn Vật liệu vô trùng Mô Mầm Tế bào Chồi Cụm chồi Cây hoàn chỉnh Vườn ươm Đưa cây ra bầu đất Tạo rễ Nhân nhanh Tái sinh chồi Tạo mô sẹo Khử trùng Hình 1: Sơ đồ quy trình nhân giống thực vật in vitro 1.2.3.7. Nghiên cứu nhân giống hoắc hương Những năm gần đây, hoắc hương được khai thác liên tục và thường xuyên, nhu cầu đối với dược liệu hoắc hương ngày càng tăng do nhiều tác dụng chữa bệnh của nó. Do đó, trữ lượng của cây giảm sút nghiêm trọng, việc cung cấp nguyên liệu với số lượng lớn có chất lượng ổn định để sản xuất thuốc đang trở thành nhu cầu bức thiết. Trước đây, hoắc hương chủ yếu được trồng bằng phương pháp giâm cành truyền thống. Tuy nhiên, chưa có công trình nào công bố về kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro đối với cây thuốc này. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành đề tài này với mục đích nghiên cứu xây dựng một quy trình nhân giống in vitro tạo cây con phục vụ cho việc sản xuất nguyên liệu hoắc hương làm thuốc. * Quy trình nhân giống phải đảm bảo các yêu cầu : - Bảo toàn được những đặc tính di truyền của giống hoắc hương. - Đạt hệ số nhân giống cao để đưa ra ngoài sản xuất. - Có thể phục vụ cho việc nhân nhanh các loài hoắc hương có chất lượng cao. Phần ii Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1. Đối tượng nghiên cứu Nguồn vật liệu khởi đầu là giống hoắc hương được lấy từ vườn lưu giữ giống cây thuốc của Viện dược liệu. Các chồi được sử dụng làm vật liệu khởi đầu cho thí nghiệm tạo vật liệu khởi đầu cây giống bằng phương pháp in vitro. Môi trường dinh dưỡng là môi trường MS – 1962, các chất phụ gia như: Các chất điều tiết sinh trưởng, thạch, đường saccharose, than hoạt tính, nước dừa. ảnh 1 : Cây hoắc hương ngoài tự nhiên 2.2. Nội dung nghiên cứu * Giai đoạn khử trùng mẫu: Thí nghiệm 1: ảnh hưởng của HgCl2 0,07% ở các thời gian khác nhau tới tỷ lệ mẫu sống của cây hoắc hương. Công thức 1 : HgCl2 0,07 % trong 7 phút Công thức 2 : HgCl2 0,07 % trong 10 phút Công thức 3 : HgCl2 0,07 % trong 15 phút Thí nghiệm 2: ảnh hưởng của HgCl2 0,1% ở các thời gian khác nhau tới tỷ lệ mẫu sống của cây hoắc hương. Công thức 1 : HgCl2 0,1% trong 7 phút Công thức 2 : HgCl2 0,1 % trong 10 phút Công thức 3 : HgCl2 0,1% trong 15 phút * Giao đoạn tạo cụm chồi: Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP tới khả năng tạo cụm chồi của cây hoắc hương. Công thức 1 : MS (đối chứng) Công thức 2 : MS + 0,5 mg/l BAP Công thức 3 : MS + 1,0 mg/l BAP Công thức 4 : MS + 1,5 mg/l BAP Công thức 5 : MS + 2,0 mg/l BAP Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin tới khả năng tạo cụm chồi của cây hoắc hương. Công thức 1: MS (đối chứng) Công thức 2 : MS + 0,5 mg/l Kintetin Công thức 3 : MS + 1,0 mg/l Kintetin Công thức 4 : MS + 1,5 mg/l Kintetin Công thức 5 : MS + 2,0 mg/l Kintetin * Giai đoạn nhân nhanh Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và a- NAA tới khả năng nhân nhanh của cây hoắc hương. Công thức 1: MS (đối chứng) Công thức 2 : MS + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l a- NAA Công thức 3 : MS + 1,0 mg/l BAP + 0,2 mg/l a- NAA Công thức 4 : MS + 1,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l a- NAA Công thức 5 : MS + 2,0 mg/l BAP + 0,2 mg/l a- NAA Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường tới khả năng nhân nhanh của cây hoắc hương. Công thức 1: MS + 10g đường Công thức 2 : MS + 20g đường Công thức 3 : MS + 30g đường Công thức 4 : MS + 40g đường * Giai đoạn ra rễ: Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của a- NAA tới khả năng ra rễ của cây hoắc hương. Công thức 1: Môi trường MS ( đối chứng) Công thức 2: Môi trường MS + 0,5 mg/l a- NAA Công thức 3: Môi trường MS + 1,0 mg/l a- NAA Công thức 4: Môi trường MS + 1,5 mg/l a- NAA Công thức 5: Môi trường MS + 2,0 mg/l a- NAA Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ của cây hoắc hương. Công thức 1: Môi trường MS (đối chứng) Công thức 2: Môi trường MS + 0,5 mg/l IBA Công thức 3: Môi trường MS + 1,0 mg/l IBA Công thức 4: Môi trường MS + 1,5 mg/l IBA Công thức 5: Môi trường MS + 2,0 mg/l IBA * Giai đoạn vườn ươm Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ra cây tới tỷ lệ sống của cây hoắc hương STT Giá thể Cát Đất Cát + Đất (tỉ lệ 1:1) 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu Mẫu cấy là chồi đỉnh và chồi nách được rửa bằng nước xà phòng loãng cho sạch bụi bẩn bên ngoài. Rửa lại bằng nước cất nhiều lần sau đó khử trùng bằng HgCl2 ở các nồng độ và thời gian khác nhau. Mỗi công thức bố trí 50 mẫu, ba lần nhắc lại. * Môi trường nuôi cấy - Môi trường cơ bản MS – 1962 có cải tiến. - Môi trường có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng với các tổ hợp ở các nồng độ khác nhau. - Độ pH của môi trường được điều chỉnh tới 5,8 rồi được khử trùng hơi ở nhiệt độ 1210C trong thời gian 25 phút. * Điều kiện nuôi cấy - Các dụng cụ được sử dụng trong nuôi cấy: dao, kéo, panh cấy được vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn. - Tủ cấy được vô trùng bằng đèn tử ngoại 15 – 20 phút sau đó được lau sạch bằng cồn 700C. - Phòng nuôi nhân tạo có quang chu kỳ 14 giờ sáng/10 giờ tối. - Cường độ ánh sáng = 2000 lux - Nhiệt độ phòng nuôi: 25 ± 20C 2.3.2. Bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm trong phòng được bố trí trong các ống nghiệm và các bình tam giác có dung tích 250 ml. Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại theo dõi 10 cây. 2.3.2.1. Các chỉ tiêu theo dõi. Tổng mẫu chết sau cấy Tỷ lệ mẫu chết (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy Tổng số mẫu nhiễm Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy Tổng số mẫu sống Tỷ lệ mẫu sống(%) = x 100 Tổng số mẫu cấy Tổng số mẫu tái sinh Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy Tổng số chồi Số chồi TB/mẫu cấy) = Tổng số cây theo dõi 2.4. Phương pháp sử lý số liệu Kết quả nghiên cứu được sử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excel [6]. Phần iii Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1. Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu Khử trùng là khâu bắt buộc trong quá trình nuôi cấy in vitro. Do đó, ngoài việc lựa chọn giống sạch bệnh trước khi đưa vào nuôi cấy mẫu phải được khử trùng bằng hoá chất với thời gian thích hợp để loại bỏ nấm và vi khuẩn nhưng không làm chết mẫu. Đặc biệt, hoá chất khử trùng có độc tính cao, dễ gây chết hại cả mẫu nuôi cấy nếu không xác định được ngưỡng thời gian chịu đựng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng thí nghiệm với hoá chất khử trùng là: clorua thuỷ ngân (HgCl2) ở các nồng độ 0,07% và 0,1% trong các thời gian khác nhau. Thí nghiệm được tiến hành như sau: Mẫu hoắc hương được rửa bằng xà phòng và xả sạch dưới vòi nước chảy. Tiếp theo, tráng mẫu nhiều lần bằng nước cất, nhúng qua cồn 70% trong vài giây rồi khử trùng với clorua thuỷ ngân (HgCl2) có nồng độ và thời gian khác nhau. Sau thời gian xử lý, mẫu được tráng lại bằng nước cất vô trùng nhiều lần và đưa vào môi trường nuôi cấy. Kết quả theo dõi được trình bày ở bảng: Bảng 1: ảnh hưởng của nồng độ HgCl2 và thời gian khử trùng đối với tỷ lệ sống của cây hoắc hương. Chất khử trùng Thời gian khử trùng(phút) Số mẫu TN(mẫu) Số mẫu bị nhiễm(mẫu) Tỉ lệ nhiễm(%) Số mẫu sống(mẫu) Tỉ lệ mẫu sống (%) HgCl2 0,07% 7 50 43 86 7 14 10 50 33 66 8 16 15 50 5 10 40 80 HgCl2 0,1% 7 50 38 76 11 22 10 50 4 8 42 84 15 50 0 0 5 10 14 86 16 66 80 10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 7 10 15 Tỷ lệ sống(%) Tỷ lệ nhiễm(%) Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ (%) Biểu đồ 1: ảnh hưởng của HgCl2 (0,07%) và thời gian khử trùng đối với cây hoắc hương. Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ (%) 22 76 84 8 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 7 10 15 Tỷ lệ sống(%) Tỷ lệ nhiễm (%) Biểu đồ 2: ảnh hưởng của HgCl2 (0,1%) và thời gian khử trùng đối với cây hoắc hương. Qua bảng 1 và biểu đồ 1, 2 chúng tôi thấy rằng: - Khi khử trùng mẫu hoắc hương bằng (HgCl2) ở nồng độ 0,07% với các thời gian khử trùng khác nhau kết quả cho thấy, thời gian khử trùng 15 phút là tốt hơn cả mặc dù kết quả khử trùng chỉ đạt tỷ lệ sống là 80%. - Đối với HgCl2 nồng độ 0,1%, thời gian khử trùng là 7 phút thì tỷ lệ nhiễm còn cao (76%), ngược lại thời gian khử trùng cao (15 phút) thì gây chết mẫu. Vì vậy, chúng tôi thấy thời gian khử trùng là 10 phút là thời gian khử trùng tối ưu nhất, vì có tỷ lệ mẫu nhiễm thấp (8%) và tỷ lệ mẫu sống cao nhất (84%). Tóm lại, sử dụng HgCl2 0,07% trong thời gian 15 phút hoặc HgCl2 0,1% trong thời gian 10 phút là thời gian khử trùng tối ưu nhất. 3.2. Giai đoạn tạo cụm chồi ở giai đoạn này, mẫu tái sinh có thể phản ứng với các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau. Do vậy muốn có tốc độ nhân tối đa, phải tìm được môi trường tối ưu cho chúng. Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu vấn đề này trên các môi trường dinh dưỡng gồm khoáng, vitamin, đường, thạch theo môi trường MS có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng là BAP, kinetin. 3.2.1. ảnh hưởng của BAP tới sự tạo chồi cây hoắc hương Mẫu cấy là các chồi đơn, các thí nghiệm được tiến hành trên nền môi trường MS (đ/c) có bổ sung BAP với nồng độ từ 0,5 – 2,0 mg/l BAP. Các kết quả được trình bày ở bảng: Bảng 2: ảnh hưởng của BAP tới sự tạo chồi cây hoắc hương STT Công thức môi trường Số chồi/mẫu cấy Trạng thái chồi 20 ngày 40 ngày 1 MS (đối chứng) 3,5 ± 0,35 5,0 ± 0,42 + 2 MS + 0,5 mg/l BAP 4,2 ± 0,54 6,7 ± 0,36 + 3 MS + 1,0 mg/l BAP 11,4 ± 0,48 14,3 ± 0,47 ++ 4 MS + 1,5 mg/l BAP 17,1 ± 0,45 19,0 ± 0,46 + + mọng nước 5 MS + 2,0 mg/l BAP 17,3 ± 0,41 20,0 ± 0,39 + + mọng nước Ghi chú: +: Chồi yếu + +: Chồi khoẻ 3,5 5 4,2 6,7 11,4 14,3 17,1 19 17,3 20 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1 2 3 4 5 20 ngày 40 ngày Công thức môi trường Chỉ tiêu theo dõi Biểu đồ 3: ảnh hưởng của BAP tới sự tạo chồi cây hoắc hương ảnh 2: ảnh hưởng của BAP tới sự tạo chồi cây hoắc hương Số liệu ở bảng 2 cho ta thấy: Tuỳ thuộc vào nồng độ chất ĐTST bổ sung vào môi trường nuôi cấy, cây hoắc hương in vitro cho hệ số nhân giống khá cao. Trên môi trường không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng số chồi/mẫu đạt 5,0 chồi ( ở giai đoạn 40 ngày sau cấy). Đối với các công thức thí nghiệm, ở giai đoạn 20 ngày sau cấy số chồi/mẫu cấy dao động từ 4,2 - 17,3 chồi. Đến giai đoạn 40 ngày sau cấy số chồi/mẫu đạt cao nhất là 20,0 chồi ( ở công thức 5), nhưng ở công thức này cây hoắc hương rất mọng nước. Như vậy, để có được hiệu quả nhân giống tốt nhất sử dụng môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l BAP làm môi trường nhân nhanh cây hoắc hương và để khắc phục hiện tượng mọng nước cần tiếp tục tiến hành thí nghiệm có bổ xung thêm a- NAA. 3.2.2. ảnh hưởng của kinetin tới sự tạo chồi của cây hoắc hương Kinetin là một Cytokinin thông dụng, có nguồn gốc tự nhiên, tác dụng kích thích mạnh đến sự sinh trưởng của cây trồng nên thường được dùng trong nuôi cấy mô. Chúng tôi đã nghiên cứu sự tác động của kinetin với nồng độ từ 0,5 đến 2,0 mg/l đến sự sinh trưởng, phát sinh chồi. Thí nghiệm gồm 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần và mỗi lần nhắc lại theo dõi 10 mẫu. Kết quả thí nghiệm được trình bày như sau: Bảng 3: ảnh hưởng của kinetin tới sự tạo chồi cây hoắc hương. STT Công thức môi trường Số chồi/mẫu cấy Trạng thái chồi 20 ngày 40 ngày 1 MS (đối chứng) 3,5 ± 0,56 5,0 ± 0,45 + 2 MS + 0,5 mg/l kinetin 3,7 ± 0,45 4,6 ± 0,56 + 3 MS + 1,0 mg/lkinetin 9,1 ± 0,46 11,5 ± 0,43 ++ 4 MS + 1,5 mg/l kinetin 15,5 ± 0,56 16,8 ± 0,42 + + mọng nước 5 MS + 2,0 mg/l kinetin 16,0 ± 0,49 17,5 ± 0,45 + + mọng nước Ghi chú: + : Chồi yếu ++: Chồi khoẻ 3.5 5 3.7 4.6 9.1 11.5 15.5 16.8 16 17.5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1 2 3 4 5 20 ngày 40 ngày Công thức môi trường Chỉ tiêu theo dõi Biểu đồ 4: ảnh hưởng của kinetin tới sự tạo chồi cây hoắc hương. Tương tự như BAP, kinetin cũng có tác dụng theo chiều tăng dần nhưng tác dụng của kinetin yếu hơn của BAP. Tối ưu hơn cả là môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l kinetin, ở công thức 5( MS + 2mg/l ) số chồi/ mẫu đạt 17,5 chồi (giai đoạn 40 ngày sau cấy) vẫn gây hiện tượng mọng nước. Tóm lại: Qua 2 thí nghiệm bố trí ảnh hưởng của cytokinin đến nhân chồi hoắc hương trên các dải nồng độ BAP và kinetin khác nhau, chúng tôi sơ bộ kết luận rằng: dùng môi trường MS có bổ xung 1 mg/l BAP làm môi trường nhân nhanh cây hoắc hương là tốt nhất. Tuy nhiên, tác dụng của BAP mạnh hơn kinetin nên chúng tôi đã sử dụng BAP trong quá trình nhân nhanh in vitro. Và để khắc phục hiện tượng mọng nước, chúng tôi bố trí thí nghiệm tổ hợp BAP và a- NAA. 3.3. Giai đoạn nhân nhanh ảnh 3: ảnh chồi hoắc hương ở giai đoạn tạo cụm chồi ở giai đoạn tạo cụm chồi, chồi hoắc hương bị mọng nước. Vì vậy cần bổ sung thêm Auxin để cân bằng dinh dưỡng được thiết lập 3.3.1. ảnh hưởng của BAP và a- NAA tới sự tạo chồi cây hoắc hương Thông thường, chúng ta không biết rõ nồng độ Cytokenin và Auxin nội sinh trong cây. Khi tăng nồng độ BAP, số chồi mẫu tăng nhưng sức sống của chồi yếu hơn. Bổ xung a- NAA vào môi trường làm cho cán cân điều tiết sinh trưởng cân bằng trở lại, giúp cây sinh trưởng tốt hơn. Các kết quả được trình bày ở bảng sau: Bảng 4: ảnh hưởng của BAP và a- NAA tới sự tạo chồi cây hoắc hương. STT Công thức môi trường Số chồi/mẫu cấy Trạng thái chồi 20 ngày 40 ngày 1 MS (đối chứng) 3,5 ± 0,47 5,0 ± 0,51 + 2 MS + 0,5mg/l BAP+0,2mg/l a- NAA 4,0 ± 0,52 5,7 ± 0,46 + + 3 MS+1,0 mg/l BAP + 0,2mg/l a-NAA 10,1 ± 0,35 13,3 ± 0,34 + + 4 MS+1,5 mg/l BAP + 0,2mg/l a-NAA 13,4 ± 0,045 14,5 ± 0,56 + + + 5 MS+2,0 mg/lBAP+ 0,2mg/l a-NAA 16,1 ± 0,45 20,2 ± 0._.