Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR

n cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả Lê Thị Thu Hằng LỜI CẢM ƠN Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Phạm Xuân Hội, người đã tận tình dạy bảo, trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm việc cũng như thực hiện nghiên cứu khoa học và hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và các cán bộ trong Bộ môn Bệnh Cây đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại Bộ môn. Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô trong Khoa Nông học, Viện đào tạo Sau đại học – Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học tại Bộ môn trong thời gian vừa qua. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã nhiệt tình động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và trong cuộc sống. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 9 năm 2009 Lê Thị Thu Hằng MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A. candidus Aspergillus candidus A. glacus Aspergillus glacus A. flavus Aspergillus flavus A. paraciticus Aspergillus paraciticus A. nomius Aspergillus nomius A. fumigatus Aspergillus fumigatus A. ochraceus Aspergillus ochraceus A. oryzae Aspergillus oryzae cDNA Complementary DNA CTAB Cetyltrimethylammonium bromide CS Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxy nucleotide triphosphates ĐC Đối chứng EDTA Ethylenediaminetetra acetic acid HPLC High – performance liquid chromatography HPTLC High performance thin layer chromatography KAc Kalipotassium acetate PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp SDS Sodium lauryl sulfate TLC Thin – layer chromatography TE Tris- EDTA DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Sự có mặt của A. flavus và Aflatoxin ở các mẫu lạc (từ 1967-1983 ở Philippin) 5 2.2 Tính chất lý hóa của các Aflatoxin 16 2.3 Mối quan hệ giữa tỷ lệ ung thư gan với sự hấp thu Aflatoxin vào cơ thể 18 2.4 Những quy định tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam 20 2.5 Hàm lượng cho phép tối đa của Aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi 21 3.1 Các chủng nấm A. flavus thuần được phần lập trên các nông sản và địa phương khác nhau 29 4.1 Số lượng các chủng nấm A. flavus thuần thu được trên các nông sản tại các vùng khác nhau 42 4.2 So sánh tốc độ phát triển (cm) của các chủng nấm A. flavus tại các nông sản khác nhau ở nhiệt độ 200C, 280C và 300C 42 4.3 Tốc độ phát triển (cm) của các chủng nấm A. flavus trên các mẫu nông sản được nuôi cấy trên môi trường PDA, ở nhiệt độ 280C 45 4.4 Kết quả kiểm tra chất lượng ADN tổng số sử dụng phương pháp đo quang phổ hấp thu (OD260/280) 48 4.5 Kết quả phản ứng PCR đặc hiệu với các mẫu nấm A. flavus 51 4.6 Tần số bắt cặp của các cặp mồi trong phản ứng PCR đặc hiệu 52 4.7 Tổng hợp kết quả phản ứng Multiplex PCR với các mẫu nấm Aspergillus flavus sử dụng cả 4 cặp mồi: Ver - 1 , Omt - 1, Nor – 1 và Apa - 2 55 4.8 Tần số bắt cặp của các cặp mồi trong phản ứng Multiplex PCR 56 4.9 So sánh kết quả phương pháp Multiplex PCR và phương pháp dựa vào màu sắc chủng nấm trên môi trường CAM để phát hiện chủng nấm A. flavus sinh độc tố Aflatoxin 59 4.10 So sánh kết quả phương pháp Multiplex PCR và phương pháp sắc ký lớp mỏng để phát hiện chủng nấm A. flavus sinh độc tố Aflatoxin 63 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Chu kỳ của nấm A. flavus trên ngô vàng 9 2.2 Cấu tạo vi thể của nấm Aspergillus flavus Link – Cơ quan sinh sản gồm: bọng (vesicular); thể bình (metular); và bào tử (conidi) 11 2.3 Mối quan hệ di truyền của một số loài nấm Aspergillus spp. 12 2.4 Hình thái cuống sinh bào tử của nấm A. flavus và nấm A. oryzae 12 2.5 Màu sắc khuẩn lạc của các loài nấm Aspergillus spp. trên môi trường nuôi cấy (PDA) 12 2.6 Cấu trúc hoá học của Aflatoxin (Jones, 1977) 14 2.7 Tỷ lệ ung thư gan trên 100.000 dân, (2002) 19 2.8 Sơ đồ minh hoạ con đường sinh tổng hợp độc tố Aflatoxin B1 ở nấm A. flavus 27 4.1A Thu nhận mẫu nấm A. flavus từ các mẫu A: Lạc; B: Gạo trên môi trường PDA đặc 39 4.1B Thu nhận mẫu nấm A. flavus từ các mẫu, A: Ngô; B: Đậu tương trên môi trường PDA đặc 39 4.2 Hình ảnh thể bình và cuống sinh bào tử của nấm A. flavus quan sát dưới kính hiển vi (×1600) 39 4.3 Hình ảnh nấm A. flavus được phân lập từ các mẫu gạo tại Hà Nội phát triển trên môi trường PDA (trái) và môi trường Czapek (phải) 41 4.4 Các chủng nấm được bảo quản trong dung dịch glycerol 50%, 40C 41 4.5 Tốc độ phát triển của nấm A. flavus tại các ngưỡng nhiệt độ 200C, 280C, 300C trên các nông sản sau, A: 4 ngày; B: 6 ngày nuôi cấy 43 4.6 Hình ảnh phát triển của nấm A. flavus được phân lập từ các mẫu Ngô tại Thanh Hóa; A: sau 2 ngày ; B: sau 4 ngày nuôi cấy; C: sau 6 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA 43 4.7 Nuôi cấy nấm A. flavus trong môi trường PDA lỏng 47 4.8 Sợi nấm A. flavus đã làm khô dùng làm nguyên liệu cho quá trình tách chiết ADN tổng số 47 4.9 Hình ảnh điện di ADN tổng số trên gel Agarose 1% của các mẫu nấm A. flavus phân lập từ các mẫu nông sản A: Đậu tương; B: Gạo 47 4.10 Sản phẩm PCR được nhân lên từ ADN tổng số các chủng A. flavus được phân lập từ các mẫu Gạo, phân tích trên gel Agarose 1% với các cặp mồi: A: mồi ver-1; B: mồi omt-1; C: mồi nor-1; D: mồi apa-2 nhân các đoạn gen 50 4.11 Mật độ xuất hiện của ba, hai và một gen trong phản ứng PCR đặc hiệu với các cặp mồi riêng rẽ, sử dụng khuôn là các mẫu ADN nấm A. flavus 53 4.12 Hình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR của các mẫu nấm A. flavus phân lập từ các mẫu Đậu tương trên gel agarose 1%: M: marker; 1 – 4: A. flavus Hà Nội ; 4 – 8: A. flavus Thanh Hoá; 9: đối chứng A. niger chuẩn 54 4.13 Hình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR của các mẫu nấm A. flavus phân lập từ các mẫu Ngô trên gel agarose 1%: M: marker; 1 – 11: A. flavus Thanh Hoá ; 12 – 15: A. flavus Hà Nội ; 16: đối chứng A. niger chuẩn 54 4.14 Hình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR của các mẫu nấm A. flavus phân lập từ các mẫu Gạo trên gel agarose 1%: M: marker; 1 – 5: A. flavus Sơn La ; 6 – 11 : A. flavus Hà Nội ; 12: đối chứng A. niger chuẩn 54 4.15 Hình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR của các mẫu nấm A. flavus phân lập từ các mẫu Lạc trên gel agarose 1%: M: marker; 1 – 5: A. flavus Nghệ An ; 6 – 10: A. flavus Hà Nội ; 11 – 14: A. flavus Hải Dương; 16: đối chứng A. niger chuẩn 54 4.16 Tần số xuất hiện các tổ hợp gen được nhân lên trong phản ứng Multiplex PCR với 4 cặp mồi đặc hiệu nor-1, ver-1, omt-1 và apa-2 57 4.17 Mầu sắc biểu hiện của nấm Aspergillus flavus trên môi trường CAM (nước dừa) theo thứ tự: vàng sậm, vàng nhạt và trắng 61 4.18 Hình ảnh quan sát độc tố Aflatoxin được sinh ra bởi các chủng nấm Aspergillus flavus dưới ánh sáng đèn UV 61 4.19 Hình ảnh quan sát độc tố Aflatoxin trên bản sắc ký lớp mỏng TLC dưới đèn UV 62 1. MỞ ĐẦU Nấm bệnh là một trong những tác nhân gây bệnh chính làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm nông sản. Ngoài ra, nhiều loại nấm còn sinh ra độc tố mycotoxin làm ảnh hưởng đến sức khoẻ của con người và vật nuôi. Nhóm nấm sinh độc tố phổ biến nhất là Aspergillus (A. flavus, A. parasiticus và A. nomius) sản sinh ra Aflatoxin, là độc tố nguy hiểm nhất trong nhóm độc tố mycotoxin và là hợp chất có tiềm năng gây ung thư cao nhất [29, 52]. Nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin có phổ hoạt động rất rộng, lây nhiễm trên nhiều loại nông sản đặc biệt là ngô, lạc, bông, đậu tương,...ở hầu hết các nước trên thế giới đặc biệt là các nước có khí hậu nhiệt đới [52]. Phương pháp truyền thống phát hiện nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin chủ yếu dựa vào đặc điểm sinh học, hình thái sợi nấm và vết loang để lại trên môi trường đã được công bố từ thập kỷ 80 [26]. Tuy vậy, phương pháp này có nhược điểm là tốn công sức độ chính xác và độ nhạy không cao. Tiếp theo, phương pháp sắc ký được sử dụng để phát hiện mức độ nhiễm Aflatoxin như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng cao áp (HPLC) [43]. Ưu điểm của phương pháp này là có thể định lượng chính xác hàm lượng Aflatoxin nhiễm trong mẫu thí nghiệm. Tuy nhiên, phương pháp này lại có nhược điểm là cần phòng thí nghiệm được trang bị các máy chuyên dụng đắt tiền. Gần đây, các phương pháp dựa vào kỹ thuật PCR và kỹ thuật kháng thể đơn dòng đang được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi do có ưu điểm là phát hiện nhanh, nhậy, chính xác nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin. Ngoài ra, phương pháp PCR còn có thể phát hiện được chủng nấm Aspergillus lây nhiễm [40]. Phương pháp chẩn đoán sử dụng kỹ thuật PCR được dựa trên kết quả nghiên cứu hệ gen nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin và con đường sinh tổng hợp Aflatoxin. Các nghiên cứu cho thấy, ít nhất có 20 gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp Aflatoxin, bốn gen quan trọng là ver-1, omt-1, nor-1 và apa-2 đã được công bố trình tự nucleotide và chức năng gen. Trình tự nucleotide của các gen này là cơ sở để sinh tổng hợp các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR sử dụng sợi khuôn là ADN tổng số tách chiết từ sợi nấm hoặc các mẫu xét nghiệm. Điều kiện thời tiết Việt nam được xem là môi trường lý tưởng cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Aspergillus. Điều này dẫn đến hàm lượng và tỷ lệ nhiễm Aflatoxin trên nông sản Việt Nam là ở mức cao trong khu vực và đây là một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn đến giá trị nông sản xuất khẩu của Việt nam rất thấp. Thực tế thì đã có nhiều lô hàng nông sản xuất khẩu của nước ta như: lạc, đậu tương... đã bị trả lại do phát hiện độ nhiễm Aflatoxin cao quá mức cho phép. Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong việc hạn chế lây lan và giảm thiểu tác hại của nấm. Phương pháp phát hiện mầm bệnh nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR chưa được nghiên cứu ở Việt nam. Với mục tiêu xây dựng phương pháp chẩn đoán sớm, nhanh và nhạy góp phần làm giảm thiểu tác hại của nấm Aspergillus trong sản xuất nông nghiệp và tăng giá trị nông sản xuất khẩu của Việt nam trên thị trường thế giới, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR" với các mục tiêu chính như sau: Thu thập và phân lập các chủng nấm A. flavus trên một số nông sản (lạc, ngô, đậu tương, gạo). Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh A. flavus sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR để phát hiện tình trạng nhiễm Aflatoxin trên nông sản. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tính nguy hại của việc nhiễm nấm Aspergillus spp. và độc tố Aflatoxin trên lương thực, thực phẩm Trong lịch sử đã từng xảy ra nhiều vụ ngộ độc thức ăn gây tử vong cho hàng loạt người và gia súc mà nguyên nhân chính là do độc tố của một số chủng vi nấm mà chúng ta gọi là nấm mốc. Năm 1924 Shofield và cộng tác đã phát hiện một loại độc tố được sản sinh từ nấm mốc gây dịch bệnh cho gia súc. Cũng trong thời gian này, Liên Xô tìm ra bệnh không tăng bạch cầu (Aleusemic) ở một số người ăn phải ngũ cốc bị mốc [61]. Đến năm 1960 có một vụ dịch làm chết hàng ngàn con gà tây tại một quần đảo nước Anh do ăn phải lạc thối mốc, các nhà khoa học phương Tây tiến hành nghiên cứu và phát hiện ra nguyên nhân gà chết là do sưng to gan, sau xét nghiệm và phân tích đã xác định tác nhân gây chết là độc tố Aflatoxin do nấm A. flavus tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển trên thức ăn [61, 62]. Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết người khoảng 10mg), độc tố Aflatoxin còn được xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư. Người ta đã biết Aflatoxin là một trong những chất gây ung thư gan mạnh nhất tác động qua đường miệng – nếu hấp thu một tổng lượng 2,5mg Aflatoxin trong thời gian 89 ngày có thể dẫn đến ung thư gan hơn 1 năm sau. Năm 1961, ở Anh người ta đã tiến hành thực nghiệm trên chuột cống, cho ăn thức ăn đã nhiễm mốc trong đó 20% là bột lạc thối, sau 6 tháng thấy xuất hiện ung thư gan. Robinson nghiên cứu trên trẻ em Ấn Độ bị xơ gan, bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, ông đã tìm thấy Aflatoxin trong nước tiểu của những trẻ bị xơ gan và trong sữa của những bà mẹ có con bị xơ gan. Như vậy, theo ông giữa xơ gan và Aflatoxin có một mối quan hệ khá chặt chẽ với nhau [3]. Ở Thái lan, năm 1967 nhóm nghiên cứu của Shank cho thấy các mẫu lương thực thực phẩm bị mốc thì 50 – 60% số mẫu đó có Aflatoxin. Đồng thời nhóm tác giả này tiến hành trên thức ăn gia đình (lấy mẫu lương thực thực phẩm tại các gia đình) cũng thấy có 30 – 50% số mẫu có độc tố Aflatoxin. Payet và cs (1966) cho biết ở Xênêgan nhiều trẻ em dưới 1 năm tuổi được ăn 70-140 g lạc/ngày trong 10 tháng liền để điều trị bệnh Kwashuovkov. Những mẫu lạc này sau đó phát hiện có chứa 500 – 1000 ppb Aflatoxin B1. Như vậy trung bình một ngày một trẻ em đã phải ăn từ 35 – 140 ppb. Hai đứa trẻ trong số này mắc bệnh gan sau 4 – 6 năm. Những người công nhân làm việc trong dây chuyền chế biến lạc có thể nhiễm Aflatoxin qua hô hấp. Một kỹ sư hóa chất phụ trách khâu hấp tiệt trùng bột lạc bị chết và đã phát hiện được Aflatoxin B1 trong tế bào phổi [22]. Ở Hà Lan, những công nhân làm việc ở nhà máy ép dầu lạc có thể tiếp nhận từ 0,039 ppb tới 2,5 ppb Aflatoxin trong một tuần lễ làm việc (Van Nieweenhuize, 1973). Theo Baxter và cs (1981) có sự nguy hiểm khi tiếp xúc với bụi lạc hay các sản phẩm nông nghiệp khác có chứa Aflatoxin, tuy mức độ nguy hiểm chưa được xác nhận [1]. Theo thống báo của tổ chức nông lương thế giới (FAO), tổn thất hàng năm ước tính khoảng 12 – 15 % trên toàn thế giới, trong đó 25% nông sản của toàn thế giới bị nhiễm các độc tố nấm mốc. Vì vậy, phòng chống độc tố nấm mốc là vấn đề hết sức quan trọng trong sản xuất nông nghiệp và được các nước trên thế giới đặc biệt quan tâm [3, 4]. Ở Philippin các sản phẩm công nghiệp dùng làm thức ăn như lạc, gạo, đậu tương và cà phê cũng được xác định là nhiễm A. flavus và độc tố Aflatoxin ở các mức độ khác nhau và được thể hiện ở Bảng 2.1 [1]. Bảng 2.1 Sự có mặt của A. flavus và Aflatoxin ở các mẫu lạc (từ 1967-1983 ở Philippin) Loại mẫu lạc Tỷ lệ nhiễm A. flavus (%) Hàm lượng Aflatoxin B1 (ppb) Lạc còn tươi mới đào 5 14 Lạc ở trại, bảo quản trong các chum, kho 1 257 Lạc đã bóc vỏ từ các kho nông trại 45 964 Lạc còn trong vỏ 25 0 Nhân lạc bóc vỏ lụa 90 114 Có nhiều chủng nấm mốc tiết ra độc tố này (nấm A. flavus, A. parasiticus, A. nomius), nhưng A. flavus là loài nấm mốc cung cấp những lượng Aflatoxin lớn nhất, nguy hiểm nhất. Ở khắp các vùng Nam Phi, nơi người ta ăn nhiều lạc có mốc A. flavus, tỷ lệ bệnh nhân bị ung thư gan rất cao. A. flavus gặp nhiều ở các lương thực, thực phẩm khác nhau, nhưng các loại hạt có dầu (đặc biệt là lạc) thích hợp nhất cho sự phát triển [29, 51]. Tác giả (Hiscocks) đã nghiên cứu hơn 1000 mẫu lạc thí nghiệm thì thấy lạc hạt có 3,3% số củ là rất độc – 1kg chứa trên 0,25mg Aflatoxin B1 (độc tố chủ yếu của A. flavus) và 21,7% số củ độc vừa, 75% số củ không độc. Còn trên lạc khô: 42% số mẫu là rất độc; 49,3% độc vừa và chỉ có 8,7% là không độc [3, 4]. Loài nấm sản sinh Aflatoxin là A. flavus được phân lập từ 13-21% trong các mẫu gạo. Những nghiên cứu ở Thái Lan cũng cho thấy A. flavus có mặt trong nhiều loại thực phẩm bán trên thị trường. Các chủng sinh Aflatoxin cũng có trong đất trồng trọt. A. flavus được phân lập từ 15 trong 50 mẫu đất ở Malaysia và 29 trong 106 mẫu đất ở Thái lan, 16 chủng trong số 44 chủng phân lập sản sinh Aflatoxin [1, 60]. Các trường hợp nhiễm độc ở người do ăn phải Aflatoxin có trong thực phẩm, đặc biệt là ngô nhiễm hàm lượng cao đáng được quan tâm hơn lạc. Mặc dù lạc nhiễm Aflatoxin nhiều hơn ngô, nhưng người ta chỉ ăn lạc với lượng nhỏ, trừ một số nước ăn lạc khá phổ biến như Môdambic, Xênêgan, Xuđăng [1, 3] Những nghiên cứu của Ablas K. và cộng sự (2004) cho thấy sự nhiễm Aflatoxin trên ngô do nấm A. flavus gây nên là một vấn đề quan trọng ở các vùng trồng ngô của đồng bằng Missisipi của Mỹ. Trong 3 năm nghiên cứu từ 2000 đến 2002, các tác giả đã nghiên cứu mức nhiễm A. flavus trong đất và đã xác định rằng mức nhiễm A. flavus trong đất trồng ngô bị ảnh hưởng bởi các vụ canh tác trước. Mật độ A. flavus cao nhất là 794 CFU/g, trong đất trồng ngô vụ 2001 so với 251 CFU/g trong đất trồng bông gối vụ năm 2000 và 457 CFU/g đất trồng lúa mì gối vụ năm 2002. Sự nhiễm A. flavus trên ngô hạt năm 2000 dao động từ 0% đến 100% (trung bình là 15% hạt ngô bị nhiễm), hàm lượng Aflatoxin trong ngô dao động từ 0 đến 1590 ppb (trung bình là 57ppb). Mức nhiễm Aflatoxin phân bố ngẫu nhiên trong ngô ở ngoài đồng không tương quan tới sự nhiễm A. flavus: 43 đến 59% có khả năng tạo các chủng A. flavus phân lập trong đất Aflatoxin. Với sự nhiễm cao nhất ở quần thể đất của ngô gối vụ năm 2001. Kết quả cũng cho thấy 84% A. flavus phân lập từ các hạt ngô có khả năng tạo Aflatoxin [24]. Ở Thái Lan, 35% mẫu ngô nhiễm Aflatoxin B1 (mức trung bình 400µg/kg), trong khi 40% nhiễm Aflatoxin B1 (mức trung bình 133µg/kg) đã được tìm thấy ở Uganda và 97% ở đảo Cebu, Philippin trung bình là 213 µg/kg. Hàm lượng Aflatoxin ở các mẫu ngô ở gia đình đã liên quan tới sự bùng nổ của bệnh gan độc tố cấp tính ở tây bắc Ấn Độ. Theo Goto và cộng sự 80 – 85% số mẫu ngô thu thập từ các kho bảo quản trong mùa mưa 1984 – 1985 ở Thái lan đã nhiễm Aflatoxin B1 với lượng 6,30 – 1310 ppb và 0,6 – 767 ppb theo thứ tự. Trong năm 1973, nghiên cứu về lạc bóc vỏ ở Mỹ cho thấy 15% của 361 mẫu có Aflatoxin giới hạn từ vết đến 50 µg/kg. Stoloff, Krof và Hald đã tìm thấy Aflatoxin ở 86,5% của 52 mẫu của các sản phẩm lạc nhập vào Đan Mạch làm thức ăn gia súc, một mẫu có 3,465 µg/kg. Các Aflatoxin đã tìm thấy ở 41% của 173 số mẫu lạc ở Sudan, 16 mẫu có trên 250 µg/kg và 9% số mẫu có trên 1000 µg/kg. Ở Philippin, tất cả các mẫu lạc được kiểm tra năm 1967 – 1969, có Aflatoxin với giá trị 155 µg/kg và giá trị trung bình 500 µg/kg [3, 4]. Điều kiện thời tiết ở Việt Nam được xem là môi trường lý tưởng cho sinh trưởng và phát triển của nấm mốc nói chung và nấm Aspergillus spp. nói riêng. Nấm mốc có mặt khắp mọi nơi và thường phát sinh, phát triển trên các sản phẩm lương thực, thực phẩm…và cả trên hoa quả. Bên cạnh việc nấm mốc gây hư hỏng, thối rữa, làm hỏng, giảm chất lượng và giá trị sử dụng còn có rất nhiều loài nấm mốc tiết ra độc tố gây bệnh cho con người. Chính vì tác hại của độc tố này gây nên với con người nên nhiều nước phát triển trên thế giới như: Mỹ, Nhật Bản, các nước EU,…khi nhập lương thực, thực phẩm như: ngô, lạc, cà phê, chè,…đã đưa ra khung giới hạn về hàm lượng về Aflatoxin phải ở dưới mức cho phép. Thực tế thì đã có nhiều lô hàng nông sản xuất khẩu của nước ta như: lạc, đậu tương... đã bị trả lại do phát hiện độ nhiễm Aflatoxin cao quá mức cho phép. Vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện sớm và nhanh nấm Aspergillus spp. sinh độc tố Aflatoxin đang được đặc biệt quan tâm nghiên cứu. Mức độ nhiễm Aflatoxin trên ngô và một số tỉnh miền Nam và Bắc Việt nam cho thấy tần xuất nhiễm Aflatoxin giao động từ 73,3% đến 95,8% trong đó hàm lượng Aflatoxin trung bình cao nhất là 63,8 ppb và hàm lượng Aflatoxin trung bình thấp nhất là 16,25 ppb đối với các tỉnh khác nhau [3, 4 ]. Ở Việt Nam, Đậu Ngọc Hào và các cộng sự đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và Aflatoxin trên ngô của các tỉnh Sơn La và Thanh Hóa. Kết quả phân tích của 24 mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột cho thấy các mẫu này đã bị nhiễm A. flavus với tần số cao, từ 50 - 80 %. Các loài khác như A. glacus, A. fumigatus và A. candidus cũng nhiễm với tỷ lệ khá cao. Loài A. ochraceus đã được phát hiện thấy ở tỷ lệ thấp. Các loài thuộc chi Fusarium đã nhiễm với tần suất 15%. Kết quả nghiên cứu mức nhiễm Aflatoxin những mẫu ngô trên đã cho thấy 33% số mẫu ngô hạt đã bị nhiễm Aflatoxin B1 từ 10 - 40 ppb, 83 % số mẫu bị nhiễm Aflatoxin B2 từ 10 - 20 ppb, 72% mẫu ngô bột đã bị nhiễm Aflatoxin B1 từ 25 - 250 ppb ; 9,5% số mẫu ngô bị nhiễm Aflatoxin B2 từ 10 - 20 ppb [1, 3]. 2.2 Sơ lược về các loài nấm Aspergillus spp. A. flavus, A.parasiticus, A. nomius là ba loài nấm trong quá trình xâm nhiễm, sinh trưởng phát triển tiết ra độc tố Aflatoxin cả trên môi trường tự nhiên và môi trường nuôi cấy nhân tạo, ba loài nấm này thuộc họ nấm cúc. Đây là các loài nấm khá phổ biến, có thể tìm thấy trên khắp địa cầu, đặc biệt là các nước nhiệt đới. Bào tử của nấm A. flavus có khả năng phát tán trong không khí, trong nước, trong đất. Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển trên lương thực, thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số loài cây trồng. Vì phạm vi ký chủ rộng, khả năng phát tán rất lớn nên phòng trừ nấm hại này thường rất khó khăn. Nấm A. flavus có thể ký sinh, gây hại các loại lương thực như: lúa, ngô, sắn. Trên một số loại hạt làm thực phẩm như: lạc, đậu, vừng, vv…. Trên thực phẩm như: các sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, lạc, vừng, đậu đỗ,…và thậm chí cả trên hoa quả tươi bị bầm dập như: thanh long, nhãn, xoài, vải,….[12, 57]. Hình 2.1 cho thấy chu kỳ của nấm A. flavus trên ngô vàng. Các loài nấm sống qua mùa đông thường hoặc là hệ sợi nấm hoặc là có cấu trúc kháng như hạch nấm (sclerotia). Hạch nấm hoặc là sinh thêm các bào tử sợi nấm (hyphae) hoặc sinh ra bào tử đính (conidia) hay bào tử thể vô tính, chính điều này sẽ phát tán ra ngoài môi trường, ra đất và không khí. Các bào tử mang đến các cây ngô nhờ côn trùng hoặc nhờ gió, rồi từ đó nhiễm nấm trên ngô và gây hại [63]. 2.2.1 Hình thái học nấm A. flavus và nấm A. paraciticus. Trong tự nhiên, có thể dễ dàng phân biệt được loài nấm này do chúng có màu sắc dễ nhận. Màu vàng lục hay màu xanh lục của đám bào tử khi chín bám trên các mầm của hạt hoặc phát triển trên các kẽ giữa hai phiến của hạt, khi tách ra có thể nhìn thấy rất rõ. Ở các khe giữa hạt lạc hay lớp mầm của hạt ngô bị mốc có thể quan sát thấy bào tử. Trên môi trường nuôi cấy nhân tạo, trên thạch Sabouraud hay Czapek Doc hình thành khuẩn lạc sau 24 giờ, khu vực trung tâm có màu vàng nhạt, rìa mép màu trắng mịn. Sau 48 giờ hình thành nhiều bào tử miền trung tâm, xuất hiện các khối bào tử chin, màu vàng nhạt đã chuyển sang màu vàng lục. Từ 72 – 96 giờ, khuẩn lạc phát triển mạnh và đạt cực đại ở ngày thứ 6 – 7 khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Khuẩn lạc có kích thước tới 4 – 5 cm, hình thành nhiều vòng tròn đồng tâm đều đặn, thường có 5 – 6 vòng tròn màu xanh lục trên bề mặt khuẩn lạc, rất dễ phân biệt với nhiều loại nấm mốc khác. Quan sát đặc điểm vi thể dưới kính hiển vi ở bội số thấp (X16) cũng có thể phân biệt được do cơ quan sinh sản của loại nấm này rất phong phú. Cơ quan sinh sản có hình hoa cúc. Bọng tròn có kích thước từ 25 – 45 µm, giá conidi (conidiophores) (cuống sinh bào tử) mọc thẳng từ sợi xù xì có kích thước từ 400 – 1000 µm; rộng 5 – 15 µm. Bào tử trần (conidi) hình tròn hoặc hình ovan, có đường kính từ 2 – 4 µm. Thể bình có hai lớp, kích thước từ 10 – 15 µm và 3 – 5 µm, đôi khi chỉ có 1 lớp [1, 12]. 2.2.2 Phân biệt A. flavus trong nhóm A. flavus oryzae. Trong nhóm A. flavus oryzae có 5 loài gồm A. oryzae Cohn, A. flavus Link, A. parasiticus Speare, A. micro virido citrinus Constantin Lucet, và A. effuses Tiraboschi. Cả 5 loài này rất dễ nhầm lẫn với nhau về hình thái học, về màu sắc điển hình trên môi trường nuôi cấy: loài A. oryzae Cohn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men đậu tương, trong công nghiệp sản xuất các men (enzym) phục vụ cho công nghiệp lên men rượu bia, sản xuất thức ăn chăn nuôi, do vậy cần phải được phân biệt để tránh nhầm lẫn với hai loài A. flavus và A. parasiticus sản sinh độc tố Aflatoxin. Cả 5 loài này rất phổ biến trên phạm vi toàn thế giới và chiếm phần đông trong họ Aspergillus. Chúng được biết đến do sự có mặt ở nhiều loại cơ chất khác nhau. Trong công nghiệp lên men của các nước phương Đông: ngũ cốc, sản phẩm chế biến từ lương thực như bánh mì, mì sợi, hàng hoá làm bằng da, thịt, sản phẩm từ trứng, sữa, đậu tương, nước hoa quả, rau quả, hàng dệt, giấy, từ côn trùng, phân rác, từ phổi của chim, từ ruột của bệnh nhân… Chúng còn có thể tìm thấy trong đất, đặc biệt vùng đất ẩm, nóng ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Các loài này rất khác nhau về hình thái, màu sắc, trên môi trường nuôi cấy và quan sát trên kính hiển vi về cơ quan sinh bào tử. Sự khác nhau liên quan tới nguồn gốc thu thập mẫu phân lập chúng. Mẫu phân lập từ đất cho thấy các bọng bào tử có màu xanh vàng và có cuống bào tử ngắn. Các chủng phân lập từ gạo ở vùng phương Đông thấy bọng có màu vàng nhạt, giá bào tử dài (cuống sinh bào tử), vách mỏng [1, 12]. Tuy nhiên, nhóm này cũng có những đặc điểm chung là: Màu sắc khuẩn lạc khác nhau từ màu xanh lục tới màu xanh vàng đậm. Cuống bào tử thô ráp không màu sắc. Đầu hình bán cầu, hình cột hay gần hình cầu. Thể bình một lớp hay hai lớp, thường khác nhau ngay trên một bọng. Bọng khác nhau về hình dạng từ bán cầu tới hình vòm trên các đầu nhỏ và hình cầu trên các đầu lớn. Bào tử thô khác nhau về màu sắc. Hạch nấm có trong nhiều chủng, màu nâu xám tới màu đen. Hình 2.2 Cấu tạo vi thể của nấm Aspergillus flavus Link – Cơ quan sinh sản gồm: bọng (vesicular); thể bình (metular); và bào tử (conidi). Nấm A. flavus, A. parasiticus thường nhầm lẫn với loài A. oryzae trong sử dụng (chúng có hình thái, cấu tạo và mối quan hệ di truyền rất gần nhau), như có mầu khuẩn lạc xanh nhạt, cuống sinh bào tử không mầu, lớn như nhau, đầu thể bình lưỡng tính hoặc đơn tính, bào tử hình cầu nhỏ... Vì vậy, chúng ta cần phải kết hợp cả việc quan sát mầu sắc khuẩn lạc trong quá trình phân lập, nuôi cấy và hình ảnh cuống sinh bào tử khi soi kính hiển vi để tránh nhầm lẫn khi phát hiện các loại nấm này (A. flavus có kích thước cuống sinh bào tử (0,4 – 1mm) trong khi đó A. oryzae là (1 – 2 mm)). 2.3 Những đặc tính của độc tố Aflatoxin 2.3.1 Tính chất vật lý, hoá học của Aflatoxin Aflatoxin là độc tố chính được tiết ra chủ yếu bởi một số loài nấm Aspergillus spp. Các Aflatoxin được cấu tạo gồm bốn hợp chất của nhóm bis-furanocouramin, là sản phẩm trao đổi chất tạo bởi nấm A. flavus và A. parasiticus. Hiện có khoảng trên 16 loại độc tố Aflatoxin đã được tìm thấy, có kí hiệu B1, B2, G1, G2, M1, M2, P1, Q1,... được phân biệt trên đặc tính lý hóa và độc tính của chúng [1]. Các Aflatoxin B1, B2 và G1, G2 đã được nhiều phòng nghiên cứu xác định cấu trúc hoá học. Thoạt đầu các nhà hoá học đã xác định có hai Aflatoxin có công thức C17H12O6 và C17H12O7 với trọng lượng phân tử tương ứng là 312 và 328. Hiện nay hai độc tố được biết là Aflatoxin B1 và G1. Trong cấu trúc phân tử có các nhóm lacton và metoxyl, không có nhóm hydroxyl tự do. Các hợp chất trên được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng. B là viết tắt của chữ Blue (xanh lam) và G là viết tắt của chữ Green (xanh lá cây). Aflatoxin G1 có chứa 2 vòng lacton, Aflatoxin B1 – 1 vòng lacton. Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử Aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thủy phân trong môi trường kiềm, đặc tính này giữ vai trò quan trọng trong mọi quá trình chế biến thực phẩm vì quá trình xử lý kiềm làm giảm hàm lượng Aflatoxin của các sản phẩm, mặc dầu sự có mặt của protein, pH, và thời gian xử lý có thể làm thay đổi các kết quả. Tuy nhiên, nếu chỉ xử lý kiềm nhẹ thì việc axit hóa sẽ làm phản ứng diễn ra theo chiều ngược lại để tạo Aflatoxin ban đầu [1, 2]. Aflatoxin M1 Aflatoxin M2 Hình 2.6 Cấu trúc hoá học của Aflatoxin (Jones, 1977). Sau đó, hai Aflatoxin B2 và G2 cũng được phát hiện. Chúng có công thức hoá học hoàn toàn giống với Aflatoxin B1 và G1, chỉ khác là nối đôi trong vòng hydrofuran đã bị khử. Sự khác biệt về cấu trúc hóa học giữa các độc tố này là không lớn nhưng độc tính của chúng thì khác nhau rất lớn. Ví dụ như độc tố B1 và G1 có độc tính cao nhất và cao hơn nhiều lần so với B2 và G2. Trong các loại Aflatoxin thì Aflatoxin B1 thường được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, tiếp theo là G1, trong khi đó B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn. Năm 1966 Dutton và Heathcote đã phát hiện thấy trong môi trường nuôi cấy hai dẫn xuất hydroxi – 2 của Aflatoxin B2 và Aflatoxin G2 là Aflatoxin B2a và Aflatoxin G2a. Allcroft và Carnaghan đã nhận thấy trong sữa và thịt bò cũng có các dẫn chất của Aflatoxin B1 và B2 được đặt tên là Aflatoxin M1 và M2 (Milk). Cả hai chất này đều bắt màu huỳnh quang màu xanh tím. Ở gan, thận và nước tiểu của cừu cũng tìm được hợp chất như vậy. Theo Dalezios và Wogan, trong nước tiểu của khỉ có Aflatoxin P1, dẫn chất của Aflatoxin B1. Các độc tố Aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím, sóng dài. Điều này cho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực kỳ thấp (0,5 ng hay thấp hơn trên một vết ở sắc ký bản mỏng). Nó cung cấp cơ sở quan trọng về mặt thực hành cho tất cả các phương pháp hóa lý về phát hiện và định lượng độc tố này [17]. Các Aflatoxin hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như chloroform và metanol và đặc biệt ở dimetyl sulfoit (dung môi thường được sử dụng như phương tiện trong việc áp dụng các Aflatoxin vào động vật thực nghiệm). Tính tan của Aflatoxin trong nước giao động từ 10 - 20 mg/l. Mặt khác, Aflatoxin tinh khiết rất bền vững ở nhiệt độ cao, khi được làm nóng trong không khí. Với mẫu lạc nhiễm nấm bệnh, khi rang đến 1500C tuy các bào tử nấm đã bị tiêu diệt nhưng không hoàn toàn loại bỏ được độc tố. Các Aflatoxin trong các dung môi chloroform và benzen bền vững trong nhiều năm nếu được giữ trong chỗ tối và lạnh. Các Aflatoxin ít hoặc không bị phá hủy dưới điều kiện nấu bình thường và làm nóng khí thanh trùng. Bảng 2.2. Tính chất lý hóa của các Aflatoxin Aflatoxin Công thức Điểm nóng chảy Huỳnh quang Hấp thụ tia UV trong EtOH Độ quay cực quang học Aflatoxin B1 C17H12O6 268 – 269 Xanh lam 223,265 và 362 -5580C Aflatoxin B2 C17H14O6 286 – 289 Xanh lam 222,265 và 362 -4920C Aflatoxin G1 C17H32O7 244 – 246 Xanh lục 243,264 và 362 -5560C Aflatoxin G2 ._. C17H34O7 229 – 231 Xanh lục 221,265 và 357 -4730C Aflatoxin M1 C17H12O7 299 Xanh tím 226,265 và 357 -2800C Aflatoxin M2 C17H14O7 293 Xanh tím 221,264 và 357 - 2.3.2 Tính gây độc của Aflatoxin Thông thường, ngộ độc Aflatoxin cấp tính ít khi gây chết người. Song trường hợp ăn phải Aflatoxin trực tiếp từ lạc, ngô hay gián tiếp qua thực phẩm rất đáng được quan tâm, vì nhiễm Aflatoxin có thể gây bệnh ung thư gan ở người. Báo cáo của Saito (1976) về sự có mặt của độc tố nấm mốc trong thực phẩm có liên quan đến bệnh ung thư gan ở Malaysia và Thái Lan cho biết, các trường hợp ung thư gan ở Thái Lan cao hơn ở Nhật. Khả năng gây ung thư của Aflatoxin đã được Wogan nghiên cứu và được IARC đánh giá. Ở mức độ tế bào, việc cho uống Aflatoxin với liều khác nhau đã nhanh chóng ức chế rõ ràng enzym ADN polymeraza và ARN polymeraza ở gan, các đáp ứng tương tự đã được quan sát ở việc nuôi cấy tế bào người và động vật. Khi cho các Aflatoxin uống qua đường miệng, chủ yếu là B1 đã gây ung thư ở tất cả các loài động vật nghiên cứu [3, 24]. Tính gây quái thai: Elis và Dipaolo đã chứng minh rằng việc tiêm Aflatoxin B1 vào chuột theo đường vào bụng với liều 4µg/kg thể trọng, đã gây cho thai chuột bị tật hoặc chết. Tính gây đột biến: Aflatoxin B1 gây ra sự khác thường ở nhiễm sắc thể như các đoạn nhiễm sắc thể có cầu nối ở đôi chỗ, các cầu nhiễm sắc tử, sự đứt đoạn ADN ở các tế bào động vật và thực vật. Aflatoxin cũng gây đột biến gen ở các vi khuẩn nghiên cứu, khi hoạt hoá các chế phẩm microsom từ gan chuột và gan người. Các tác dụng ở người: Aflatoxin đã được tìm thấy trên các loại nông sản như ngô, lạc, cà phê, lúa mì, đại mạch, gạo, chè, ca cao, các loại thức ăn gia súc ở hầu hết các nước Châu Á như Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Nepan, Philipin, Indonesia, Ấn Độ, một số nước ở châu Mỹ như Hoa Kỳ, Braxin và các nước châu Phi [3, 4]. Các số liệu nghiên cứu về các vùng dân cư khác nhau ở các nước khác nhau trên thế giới cho thấy nồng độ Aflatoxin thực tế ở thức ăn đã liên quan tới tai biến ung thư gan ở vùng đó. Tỷ lệ này dao động từ 3,5 – 22,1 µg/kg trọng lượng cơ thể trong 1 ngày và gây tai biến gây ung thư dao động từ 1,2 – 13 triệu trên 105 dân trong 1 năm. Bệnh Aflatoxin cấp tính ít được thông báo, có lẽ không được thường xuyên theo dõi có thể kể đến trường hợp 3 trẻ em ở Đài Loan và một trẻ em ở Uganda bị hoại tử gan cấp tính liên quan tới việc ăn phải gạo và sắn nhiễm Aflatoxin ở liều 200 µg/kg và 1700 µg/kg là bằng chứng có tính thuyết phục nhất về sự liên quan giữa Aflatoxin với bệnh gan cấp tính. Ở vùng Tây Bắc Ấn Độ năm 1994, trong 1 vụ dịch, vài trăm dân làng đã ăn ngô bị nhiễm Aflatoxin ở mức 15 µg/kg có dấu hiệu bị ngộ độc và trên 100 người bị chết. Nhóm nghiên cứu về các vùng dân cư ở các nước khác nhau trên thế giới cho thấy các nồng độ Aflatoxin gặp trong thức ăn có liên quan đến hiện tượng tai biến ung thư gan (Bảng 2.3) Bảng 2.3 Mối quan hệ giữa tỷ lệ ung thư gan với sự hấp thu Aflatoxin vào cơ thể Vùng Tỷ lệ ung thư gan (tỷ lệ người chết / 105 người) Aflatoxin nhận vào (mg/kg/người/ngày) Kenya - vùng cao 0,7 3,5 Kenya - vùng thấp 4,2 10,0 Songkhla - Thái Lan 2,0 5,0 Thụy Sỹ 2,2 5,1 Ratbur - Thái Lan 6,0 45,0 Mozambic 13,0 232,4 Ba trẻ em ở Đài Loan và một trẻ em ở Uganđa đã bị hoại tử gan cấp tính liên quan đến việc ăn phải gạo và sắn nhiễm Aflatoxin ở liều 200 μg/kg và 1700 μg/kg là những bằng chứng thuyết phục nhất về sự liên quan giữa Aflatoxin với bệnh gan cấp tính. Ở vùng Tây Bắc Ấn Độ, vào năm 1974, trong một vụ dịch, vài trăm dân làng đã ăn ngô bị nhiễm Aflatoxin ở mức 15 μg/kg có dấu hiệu ngộ độc và trên 100 người đã bị chết. Nói chung, các chất này tác động lên gan theo trình tự như sau: đầu tiên là hoại tử nhu mô gan, tăng sinh biểu mô, sau đó là xâm nhiễm tế bào lympho nhằm chống đỡ tạm thời, rồi tiến đến xơ gan, nếu thời gian kéo dài sẽ dẫn đến ung thư gan. Nhưng thực chất Aflatoxin không gây ung thư mà do nó gắn vào một enzym dẫn đến ung thư, khả năng này phụ thuộc vào sự tồn tại của nhân dihydrouran và phần 5’-lacton chứa nó, do đó nó đổi phần tận cùng difuran quan trọng trong tính độc và tính gây độc. Chính vì vậy mà Aflatoxin B1 bao giờ cũng gây ung thư mạnh hơn B2 và G2 (do B2 không có nối đôi giữa vị trí C13 và C14 nên kém độc hơn). Mặt khác, độc tố Aflatoxin còn được coi là nguyên nhân gây dị ứng (một trong những vấn đề được chú ý rất nhiều trong lĩnh vực xã hội học và y tế ngày nay), gây dị tật thai đối với người phụ nữ đang mang thai [1,2]. 2.3.3 Giới hạn hàm lượng Aflatoxin cho phép sử dụng trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Các tổ chức quốc tế như: Tổ chức Nông nghiệp và thực phẩm Thế giới (FAO), Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO), khối thị trường chung Châu Âu (EU), các nước trên phạm vi thế giới đều đưa ra những giới hạn cho phép sự có mặt của Aflatoxin trong lương thực, thực phẩm dùng cho người và gia súc. Người ta quan tâm đến nhiễm độc Aflatoxin trong chăn nuôi không chỉ vì Aflatoxin làm thiệt hại vì kinh tế cho người chăn nuôi đơn thuần mà còn do sự tồn dư của chất độc này trong sản phẩm vật nuôi, đặc biệt được chú ý đối với bò sữa. Nếu trong sữa có Aflatoxin thì rất nguy hại cho trẻ em vì cơ thể chưa trưởng thành, kể cả gia súc non và trẻ em đều rất mẫn cảm với Aflatoxin. Để đảm bảo được an toàn cho vật nuôi và sức khỏe người tiêu dùng, các nhà khoa học đã tìm cách xác định giới hạn an toàn hay an toàn tối thiểu [1, 2]. Bảng 2.4 Những quy định tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam Nguyên liệu Lượng Aflatoxin B1 tối đa (ppb) Tổng số Aflatoxin B1 + B2 + G1 + G2 (ppb) Khô dầu và lạc nhân 250 500 Khô dầu và lạc cả vỏ 100 250 Ngô hạt 100 150 Sắn khô 50 100 Khô đậu tương 100 200 Đậu tương 50 100 Cám gạo 50 100 Bột cá, bột xương 10 20 Bảng 2.5 Hàm lượng cho phép tối đa của Aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Tên nước Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Hàm lượng Aflatoxin (ppb) Úc Lạc và các sản phẩm từ lạc 15 Áo Tất cả các loại thức ăn chăn nuôi 50 Bỉ Tất cả các loại thực phẩm 5a Braxin Bột lạc dùng cho xuất khẩu 50a Canada Lạc và các sản phẩm từ lạc 15b Colombia Lạc 10 Cuba Lạc 0 Tiệp Khắc Lạc 5 Đan Mạch Lạc và các sản phẩm bằng lạc 10 Ý Lạc và các sản phẩm từ lạc 50 Pháp Tất cả các thực phẩm 10 Thực phẩm cho trẻ em 5 Mỹ Tất cả các loại thực phẩm và thức ăn chăn nuôi 20b Các sản phẩm lạc cho người tiêu dùng 15b Lạc cả vỏ 25b Thụy Sĩ Lạc và các sản phẩm từ lạc 1a hay 5b Philippin Lạc và các sản phẩm từ lạc 20 Singgapo Lạc và các sản phẩm từ lạc, dầu ăn 10 – 15 Trung Quốc Lạc 50a Ấn Độ Lạc cho thực phẩm 60 Lạc cho thức ăn chăn nuôi 1000 Chú thích: a- Aflatoxin B1 ; b- Tổng số 4 loại Aflatoxin. 2.4 Các biện pháp chẩn đoán nấm A. flavus sinh độc tố Aflatoxin Việc phát hiện Aflatoxin trong nhiều loại nông sản cả trên đồng ruộng lẫn trong bảo quản đã thúc đẩy các nỗ lực trên toàn Thế giới nhằm phát triển các phương pháp phát hiện hợp chất này. 2.4.1 Phương pháp truyền thống Để phát hiện nấm Aspergillus spp. sinh độc tố Aflatoxin dựa vào đặc điểm sinh học, hình thái sợi nấm và vết loang để lại trên môi trường đã được công bố từ thập kỷ 80 của thế kỷ trước [26]. Phương pháp này có nhược điểm là tốn nhiều thời gian, công sức và độ nhạy không cao, thậm chí nhiều khi sự nhầm lẫn có thể rất nguy hiểm. Arseculeratne và cs (1969) sử dụng môi trường CAM (Coconut agar media) – là môi trường rất tốt cho việc sản xuất Aflatoxin của nấm A. flavus. Chủng nấm A. flavus sau khi được cấy lên môi trường CAM, để ở nhiệt độ 280 C, khoảng 30 – 40 ngày, kết hợp cả xem xét màu sắc chủng nấm lên môi trường và dưới đèn UV để phát hiện chủng nấm sinh độc tố. Tuy nhiên, phương pháp này rất mất thời gian [20, 45]. 2.4.2 Phương pháp vật lý hóa học Hiện nay, các phòng thí nghiệm đang sử dụng các phương pháp sắc ký để phát hiện nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng cao áp (HPLC) [43]. Ưu điểm của phương pháp này là có thể định lượng chính xác hàm lượng Aflatoxin nhiễm trong mẫu thí nghiệm. Tuy nhiên, phương pháp này lại có nhược điểm là cần phòng thí nghiệm được trang bị các máy chuyên dụng đắt tiền. * Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography-TLC) Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định, định lượng Aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960 (Coomes et al, 1964, 1965). Thủ tục phân tích sử dụng các bản được tráng bởi Silica gel. Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là Chloroform: methanol và Chloroform: axeton. Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan Aflatoxin. Hệ dung môi gồm: nước: axeton: chloroform (1,5: 12: 88) được đánh giá là có khả năng hòa tan Aflatoxin tốt nhất. Các bản mỏng đã được chảy qua các dung môi chạy, được đưa vào chiếu bởi đèn tử ngoại (UV) 365nm. Các vết mẫu phân tích có màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây và có độ dài Rt được so sánh với các vết của Aflatoxin tiêu chuẩn. Nhược điểm của phương pháp này là phụ thuộc vào người phân tích. Khi so sánh giữa mẫu và các vết của độc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả tới 20 – 30% [1, 43]. * Phương pháp đo mật độ huỳnh quang trên máy fluorodensitometer Fluorodensitometer có nhiều tiến bộ hơn, chính xác hơn so với nhìn bằng mắt thường (Dons, 1968). Tuy nhiên, ở nhiều phòng thí nghiệm hiện đại vẫn sử dụng phương pháp nhìn để so sánh trực tiếp các vết trên bản mỏng vì dễ hơn nhiều khi phải qua máy densitometer [1]. Khẳng định sự có mặt của Aflatoxin của phương pháp này: một số chất được tách ra từ mẫu đôi khi dễ nhẫm lẫn với Aflatoxin, dẫn đến sự khẳng định sai lệch. Phương pháp khẳng định sự có mặt của Aflatoxin trực tiếp thực hiện trên các bản sắc ký. Dựa vào sự biến đổi của Aflatoxin thành các đồng phân có mầu huỳnh quang khác so với huỳnh quang ban đầu, cả Aflatoxin chuẩn và Aflatoxin có trong mẫu phân tích đều chuyển sang có cùng một đồng phân. Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của Aflatoxin trong mẫu phân tích được phát hiện bởi Przybylski (1975) và Verhulsdonk (1977) và được hội phân tích hóa học Hoa Kỳ (A.O.A.C) công nhận. Aflatoxin B1 được axit hóa để trở thành đồng phân Aflatoxin B2. Đồng phân này có màu huỳnh quang màu xanh và có độ dài Rf thấp hơn so với độ dài của Rf của Aflatoxin B1. Theo phương pháp của Przybylski, Aflatoxin B1 được chuyển thành Aflatoxin B2a nhờ axit trifloaxetic (TFA) phun trực tiếp lên các bản mỏng. Axit sulfuric 50% cũng được sử dụng để phun trực tiếp lên các bản mỏng trước khi chạy trong các dung môi chạy. Axit sulfuric làm thay đổi màu huỳnh quang xanh da trời của Aflatoxin B1 thành màu vàng. Thử nghiệm này nhằm khẳng định sự không có mặt của Aflatoxin nếu vết nghi ngờ không chuyển thành màu vàng [1]. * Sắc ký lớp mỏng hiệu suât cao (High performance thin layer chromatography – HPTLC) Do những khiếm khuyết trong phương pháp sắc ký lớp mỏng đơn thuần ở các khâu như chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi, phương pháp HPTLC có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: Đưa mẫu lên bản mỏng một cách tự động; cải thiện sự đồng nhất cả lớp hấp thụ; chạy bản mỏng trong dung môi có kiểm soát. Sử dụng kỹ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phương pháp TLC như một phương pháp định lượng Aflatoxin có hiệu quả nhất. * Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High performance liquid chromatography – HPLC) Hệ thống phân tích Aflatoxin tự động HPLC là hệ thống phân tích đắt tiền, chọn lọc, dùng xác định định lượng Aflatoxin. Phương pháp HPLC sử dụng cả hai pha: pha bình thường và pha phản. Hệ thống này dựa trên sự hấp thu tia tím (UV) và xác định cường độ huỳnh quang. Trong pha bình thường, pha tĩnh là rắn, phân cực hơn pha động. Trong pha phản, pha bình thường là pha phản pha, pha tĩnh là lỏng và ít phân cực hơn pha động. Trong HPLC, pha phản được sử dụng để tách Aflatoxin nhiều hơn pha bình thường. 2.4.3 Phương pháp hóa sinh học (Immunochemical methods) Phương pháp hoá sinh miễn dịch mang tính đặc hiệu cao, dựa trên nguyên lý kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu. Hai phương pháp hiện dùng là: Aflatoxin đánh dấu phóng xạ và Aflatoxin gắn men (Pestka, 1980, 1981). Do sự tiến bộ của kỹ thuật miễn dịch trong những năm qua, đã phát triển nhiều hệ thống ELISA khác nhau để xác định Aflatoxin và kháng thể đơn và đa dòng [1]. * Phương pháp ELISA (enzyme – linked immunoabsorbant assay) Phương pháp ELISA gồm ELISA trực tiếp và ELISA gián tiếp, ELISA trực tiếp sử dụng Aflatoxin có gắn men, ELISA gián tiếp – Aflatoxin có gắn prôtêin và một kháng thể thứ hai. Cả hai phương pháp này đều sử dụng men peroxidaza và men photphataza kiềm để gắn. Phương pháp ELISA trực tiếp: dựa trên nguyên lý kháng thể đặc hiệu được phủ trên các đĩa chuẩn độ (microtites). Dung dịch tách từ mẫu hay Aflatoxin mẫu được ủ cùng nhau hay tách thành hai bước, sau đó được rửa bằng dung dịch thích hợp. Lượng men gắn vào đĩa được xác định bằng dung dịch đặc biệt. Phản ứng màu được đo bằng quang phổ hoặc so sánh trực tiếp bằng mắt thường với các đĩa chuẩn. Phương pháp này chiếm nhiều thời gian và sai số lớn trong cùng mẫu phân tích do sự xâm nhập của các chất ngoại lai có trong mẫu tách [1]. Phương pháp ELISA gián tiếp: Aflatoxin gắn vào protein được phủ các đĩa chuẩn độ (microtiter). Mẫu tách hay Aflatoxin chuẩn được đưa vào đĩa, tiếp theo là kháng thể thứ cấp (anti Aflatoxin antibody). Lượng kháng thể gắn vào đĩa được xác định do thêm kháng thể IgG (anti rabit IgG) gắn với photphataza kiềm (ALP) và phản ứng màu xảy ra với P-nitrophenyl photphat. Lượng độc tố được xác định bằng cách so sánh với đường độc chuẩn Standard Curve. Phương pháp này trải qua nhiều bước và cần một kháng thể thứ cấp nên sai số cao và chiếm nhiều thời gian [1]. 2.4.4 Phương pháp PCR dùng chẩn đoán nấm sinh độc tố Aflatoxin. Để tiện lợi hoá việc phát hiện nấm Aspergillus spp. sinh độc tố Aflatoxin, gần đây phương pháp dựa vào kỹ thuật PCR đang được nghiên cứu áp dụng rộng rãi [40]. Ngoài tính tiện lợi và dễ sử dụng, phương pháp này còn có ưu điểm là phát hiện nhanh, nhạy, chính xác nấm Aspergillus spp. sinh độc tố Aflatoxin. Phương pháp chẩn đoán sử dụng kỹ thuật PCR được dựa trên kết quả nghiên cứu hệ gen nấm Aspergillus ssp. sinh độc tố Aflatoxin và con đường sinh tổng hợp Aflatoxin [15, 28]. Các nghiên cứu cho thấy, ít nhất có 20 gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp Aflatoxin, trong đó có 4 gen quan trọng là ver-1, omt-1, nor-1 và apa-2 đã được công bố trình tự nucleotide và chức năng gen. Trình tự nucleotide của các gen này là cơ sở để sinh tổng hợp các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR sử dụng sợi khuôn là ADN tổng số tách chiết từ sợi nấm hoặc các mẫu xét nghiệm. Chất đầu tiên tham gia vào con đường sinh tổng hợp Aflatoxin có nguồn gốc từ một polyketide, ngưng tụ các chất acetate để tạo thành axit norsoloric, tiếp đó là sự biến đổi norsolorinic axit (NOR)→ averantin (AVN)→ averufanin → averufin (AVF) → hydroxyversicolorone → versiconal hemiacetal acetate → versicolorin B → versicolorin A (VA)→ sterigmatocystin (ST) → O – methylsterigmatocystin (OMST) → Aflatoxin B1. Trong mắt xích cuối của con đường sinh tổng hợp enzym O – methyltransferase xúc tác cho quá trình chuyển hoá (ST) → (OMST) có liên quan tới sự sản sinh Aflatoxin. Gần đây, chỉ mới một vài enzym trong con đường sinh tổng hợp này được phân lập [33, 53]. Cụ thể, ba gen cấu trúc trong con đường sinh tổng hợp Aflatoxin của nấm A. paraciticus có liên quan đến sự biến đổi của NOR và VA (nor-1 và ver-1), enzym O – methyltransferase xúc tác cho quá trình chuyển hoá (ST) → (OMST) (omt -1) ; và một gen điều hoà của nấm A. flavus (afl-2) đã được nhân dòng. Các gen này được chọn làm gen đích cho phản ứng PCR. Gen afl -2 được biết đến như một như một enzym bảo tồn hoạt động của các enzym khác trong con đường sinh tổng hợp Aflatoxin. Trong một số nghiên cứu cũng đưa ra, gen apa-2 của chủng nấm A. parasiticus trong quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin, có mức độ tương đồng về ADN rất lớn với gen afl-2 của nấm A. flavus [33, 34]. Điều kiện thời tiết Việt nam được xem là môi trường lý tưởng cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Aspergillus. Điều này dẫn đến hàm lượng và tỷ lệ nhiễm Aflatoxin trên nông sản Việt Nam là ở mức cao trong khu vực và đây là một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn đến giá trị nông sản xuất khẩu của Việt nam rất thấp. Thực tế thì đã có nhiều lô hàng nông sản xuất khẩu của nước ta như: lạc, đậu tương... đã bị trả lại do phát hiện độ nhiễm Aflatoxin cao quá mức cho phép. Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong việc hạn chế lây lan và giảm thiểu tác hại của nấm. Hiện tại, ở Việt nam chúng ta vẫn đang sử dụng phương pháp truyền thống để chẩn đoán nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin nên mới chỉ phát hiện được chủng nấm A. flavus. Hình 2.8. Sơ đồ minh hoạ con đường sinh tổng hợp độc tố Aflatoxin B1 ở nấm A. flavus Việc phát hiện mầm bệnh nấm A. flavus sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR chưa được nghiên cứu ở Việt nam. Từ năm 2007, Bộ môn Bệnh học Phân tử thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp đã tiến hành thu thập và phân lập chủng nấm bệnh A. flavus trên một số nông sản (ngô, lạc, đậu tương, gạo), nuôi cấy thu sinh khối và tối ưu hóa quy trình tách chiết ADN tổng số của nấm A. flavus. Đã xác định được các điều kiện cho phản ứng PCR đặc hiệu sử dụng các cặp mồi riêng rẽ nor-1, omt-1, ver -1, apa -2 (do gen afl – 2 của nấm A. flavus có mức độ tương đồng rất lớn với gen apa - 2 của nấm A. parasiticus), và phản ứng Multiplex PCR (dùng cả 4 cặp mồi), có thể nhận ra được chủng nấm có mang gen mã hóa trong quá trình tổng hợp độc tố Aflatoxin B1 [1]. 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu Hạt của các loại nông sản: ngô, lạc, đậu tương, gạo được thu thập tại nhà dân, trên đồng ruộng và trong kho bảo quản ở một số tỉnh: Thanh Hoá, Nghệ An, Hải Dương, Sơn La, Hà Nội được sử dụng để phân lập nguồn nấm bệnh. Các mẫu nông sản thu về được bảo quản trong phòng lạnh ở điều kiện 4 - 80C tại Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp. Từ các mẫu nông sản ở các địa phương khác nhau chúng tôi đã phân lập và làm thuần được 50 chủng nấm A. flavus làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo. Bảng 3.1 Các chủng nấm A. flavus thuần được phần lập trên các nông sản và địa phương khác nhau Địa điểm Nông sản Diễn Châu- Nghệ An Gia Lâm Hà Nội Chí Linh Hải Dương Hoằng Hóa Thanh Hoá (Thị xã) Sơn La Lạc L1 → L5 L6 → L10 L11 → L14 __ __ Ngô __ N12 → N16 __ N1 → N11 __ Đậu tương __ D5 → D8 __ D1 → D4 __ Gạo __ G6 → G12 __ __ G1 → G6 - Các hoá chất sử dụng trong sinh học phân tử phục vụ việc tách chiết ADN tổng số từ sợi nấm và các nguyên liệu cho phản ứng PCR được mua ở hãng Sigma Fermentas. 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp thu nhận và phân lập nấm A. flavus từ một số nông sản Sử dụng phương pháp thu nhận nấm: đặt 5 – 6 hạt/đĩa lên môi trường PDA hoặc môi trường Czapek (có bổ sung 100µg/ml kháng sinh tetracycline). Sau 3 – 5 ngày đặt mẫu, chúng tôi bắt đầu quan sát được nấm A. flavus mọc trên hạt và vỏ hạt. Dựa vào các đặc điểm nhận dạng sợi nấm, vết loang để lại trên môi trường quan sát trên đĩa petri và kết hợp quan sát hình dạng bào tử, cuống sinh bào tử, thể bình... trên kính hiển vi ở độ phóng đại 1600 lần, chúng tôi chọn lọc và cấy chuyển các mẫu nấm sang môi trường PDA/Czapek đặc (có bổ sung 100µg/ml kháng sinh tetracycline), sau đó tiến hành làm thuần sợi nấm. Một số môi trường sử dụng trong nuôi cấy và phân lập nấm: - Môi trường PDA (potato dextro agar) đặc: thành phần cho 1 lít môi trường: 200g khoai tây, 30g đường, 10g agar, pH 5.8 – 6.0. - Môi trường PDA lỏng: thành phần như trên, không có agar. - Môi trường Czapek đặc : thành phần cho 1 lít môi trường : NaNO3: 3,0g ; K2HPO4: 1,0g ; MgSO4.7H20: 0,5g ; KCl: 0,5g ; FeSO4.7H20: 0,01g ; Đường: 30g ; Agar: 10g ; pH 5.8 – 6.0. 3.2.2 Phương pháp làm thuần sợi nấm A. flavus Chúng tôi sử dụng phương pháp đơn giản để phân lập đơn bào tử nấm trong nuôi cấy nấm thuần (phương pháp Single Spore) [48]. Cách thực hiện như sau: sau khi cấy nấm lên môi trường khoảng 2 – 4 ngày, dùng pipet lấy 1 μl dung dịch bào tử, pha trong nước muối sinh lý hoặc nước cất khử trùng (bào tử được pha loãng đến nồng độ 10 bào tử/1μl), nhỏ lên đĩa Petri có môi trường PDA /Czapek đặc. Đĩa Petri đó được đánh dấu bằng các đường tròn ở mặt sau có đường kính 0,5 cm, trung bình từ 50 – 100 đường tròn/1 đĩa, mỗi 1 μl dung dịch bào tử nhỏ vào một đường tròn. Sau khi ủ 12 – 24 giờ trong tủ ổn nhiệt (nhiệt độ 280C) thì số lượng bào tử trong mỗi đường tròn được đếm (quan sát qua kính hiển vi). Từng bào tử trong mỗi đường tròn khi nảy mầm được cấy truyền sang môi trường mới và sẽ thu được nấm thuần. Đây là một trong những phương pháp dễ thực hiện để phân tách từng bào tử nấm riêng biệt trong việc nuôi cấy nấm thuần. Hơn nữa phương pháp này đòi hỏi thời gian thực hiện cũng như thời gian ủ ngắn hơn các phương pháp khác. Quá trình phân lập và phát triển được tiến hành cho đến khi đạt tới độ đồng đều về màu sắc và tốc độ phát triển của khuẩn lạc. 3.2.3 Phương pháp đo tốc độ phát triển khuẩn lạc nấm A. flavus. Chúng tôi tiến hành đặt các chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường ở các tủ nhiệt độ khác nhau: 200C, 280C, 300C để tìm ra nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chủng nấm A. flavus. Tiến hành đo tốc độ phát triển của khuẩn lạc trên đĩa petri thuỷ tinh bằng cách: chủng nấm được cấy vào vị trí trung tâm của đĩa, sau đó kẻ hai đường vuông góc tính từ điểm trung tâm đó, sau đó đo đường kính phát triển của khuẩn lạc theo từng ngày (thường sau 6 – 7 ngày đường kính khuẩn lạc đạt cực đại). 3.2.4 Phương pháp tách chiết ADN tổng số. Các mẫu nấm sau khi phân lập và làm thuần, tiếp tục nuôi cấy trong môi trường PDA lỏng từ 5 -7 ngày, ở 280C để thu sinh khối. Dùng giấy lọc khử trùng và máy hút để làm khô sợi nấm. Rửa sợi nấm 2 – 3 lần bằng nước sạch khử trùng để loại bỏ môi trường tồn dư. Các mẫu nấm được giữ trong tủ lạnh sâu -800C làm nguyên liệu tách chiết ADN tổng số. Sau khi khảo sát một số quy trình tách chiết ADN tổng số ở nấm men, nấm sợi cũng như các loại nấm Aspergillus được công bố [59], chúng tôi chọn phương pháp tách chiết dựa theo quy trình của Aga et al (2003). Quy trình tách chiết của Aga et al. (2003) gồm các bước sau: - Bước 1: Lấy khoảng 300mg mẫu nấm (đã nghiền với nitơ lỏng thành dạng bột mịn) cho vào ống eppendorf 2ml. - Bước 2: Thêm 750µl extraction buffer (0,1M Tris-Cl, pH=8; 50mM EDTA; 500mM NaCl; chuẩn pH tới 7,5) và 100µl 10% SDS. - Bước 3: Ủ 20 phút ở 65oC, thỉnh thoảng lắc nhẹ cho đều. - Bước 4: Thêm 250 µl 5M KAC, lắc đều lên. Sau đó ủ trong đá ít nhất 30 phút. Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 15 phút. - Bước 5: Thu lấy phần dịch nổi phía trên cho vào ống eppendorf mới thêm vào đó một thể tích isopropanol bằng thể tích dịch phía trên, lắc nhẹ. - Bước 6: Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 10 phút. - Bước 7: Bỏ pha lỏng phía trên, thêm vào 250 µl TE để hoà tan kết tủa ADN. - Bước 8: Thêm vào 250 µl dung dịch đệm CTAB (0,2M Tris , pH=7,5; 0,05M EDTA; 2M NaCl; 2% CTAB). - Bước 9: Ủ ở 65oC trong 15 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ. - Bước 10: Thêm một lượng chloroform/isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) bằng lượng dịch có trong eppendorf. - Bước 11: Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 5 phút. Hút phần dịch trên sang ống mới. Sau đó lại lập lại thêm một lượng chloroform/isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) bằng lượng dịch có trong eppendorf, ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 5 phút, hút phần dịch trên sang ống mới. - Bước 12: Thêm một lượng isopropanol bằng thể tích dịch hút ra. - Bước 13: Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 15 phút. - Bước 14: Thu tủa và để khô tủa ADN. - Bước 15: Hoà tan ADN trong 100 µl nước hoặc TE, thêm 2,5 µl RNAse 1mg/ml 30 phút trong tủ 370 để khử ARN. Các mẫu ADN tổng số sau đó sẽ được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% và đo quang phổ hấp thụ (OD260/280nm) để kiểm tra hàm lượng và chất lượng ADN tổng số thu được. Các mẫu ADN tổng số sau đó được chúng tôi pha loãng về nồng độ 50 ng/µl để làm khuôn cho các phản ứng PCR đặc hiệu. 3.2.5 Định lượng ADN bằng phương pháp đo độ hấp thu ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260/280 nm. Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hấp thu ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm (A260) của các phân tử ADN. Từ giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu, với hệ số A260 = 1 tương đương với 50 µg/ml. Sử dụng công thức C = A260 x 50 x n (trong đó n là số lần pha loãng) để định lượng ADN có trong mẫu tách chiết. 3.2.6 Điện di ADN trên gel agarose 1%. Nguyên lý điện di: các phân tử ADN là các polyanion nên trong môi trường trung tính va kiềm, dưới tác dụng của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương. Mức độ di chuyển của các phân tử ADN trong điện trường phụ thuộc chủ yếu vào kích thước (hay khối lượng phân tử) của chúng. Phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh, còn phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm. Sử dụng thang chuẩn ADN với kích thước đã biết có thể dễ dàng xác định được kích thước tương đối của ADN mẫu. Tiến hành: Sau khi gel agarose 1% được chuẩn bị, tiến hành tra mẫu gồm 5 µl mẫu ADN được trộn với 1 µl đệm mẫu có chứa glyceron 20%, chất chỉ thị màu bromophenol xanh, xelene cyanol và ethidium bromide (EtBr) ở nồng độ 50µg/µl và tra vào các giếng trên gel. Chạy điện di với hiệu điện thế ổn định là 10 volt/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2 cm thì dừng lại. Sau đó, gel được lấy ra và soi dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp gel IQ5 (Bio-Rad), các băng gắn với EtBr xuất hiện dưới dạng các băng màu sáng trên gel màu đen. 3.2.7 Dùng phương pháp PCR để chẩn đoán những chủng A. flavus sinh độc tố Aflatoxin. 3.2.7.1. Primer đặc hiệu Con đường sinh tổng hợp Aflatoxin ở nấm bệnh A. flavus đã được nghiên cứu khá chi tiết ở mức độ phân tử. Ít nhất có 20 gen mã hóa cho các enzym tham gia vào con đường này và một số gen quan trọng đã được giải trình tự và nghiên cứu chức năng đầy đủ. Trong các gen quan trọng tham gia vào quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin: Ver-1, Omt-1, Nor-1, và Apa-2 đang được quan tâm và sử dụng làm gen đích trong các nghiên cứu xác định nấm A. flavus sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR. Tên mồi Trình tự mồi Sản phẩm khuyếch đại dự kiến Fw Ver-1 Rv Ver-1 5’-ATGTCGGATAATCACCGTTTAGATGGC-3’ 5’-CGAAAAGCGCCACCATCCACCCCAATG-3’ ~896 bp Fw Omt-1 Rv Omt-1 5’-GGCCCGGTTCCTTGGCTCCTAAGC-3 5’-CGCCCCAGTGAGACCCTTCCTCG-3 ~1000 bp Fw Nor-1 Rv Nor-1 5'-ACC GCT ACG CCG GCA CTC TCG GCA C-3' 5'-GTT GGC CGC CAG CTT CGA CAC TCCG -3' ~400 bp Fw Apa-2 Rv Apa-2 5'-TAT CTC CCC CCG GGC ATC TCC CGG-3' 5'-CCG TCA GAC AGC CAC TGG ACA CGG-3' ~1400 bp Tên và trình tự của các cặp mồi sử dụng 3.2.7.2 Phản ứng PCR đặc hiệu Nguyên tắc của PCR là sử dụng ADN polymerase chịu nhiệt (Taq DNA polymerase) để tổng hợp các đoạn ADN mới từ mạch khuôn trong môi trường có dNTPs và cặp mồi đặc hiệu. Các đoạn ADN mới được tạo thành lại được sử dụng làm khuôn. Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn ADN khuôn lại tăng lên hàng nhiều triệu bản. Từ các mẫu ADN tổng số, thu được từ loài A. flavus chúng tôi tiến hành tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR với từng cặp mồi riêng rẽ (Ver-1, Omt-1, Nor-1, và Apa-2). Phản ứng PCR đặc hiệu bằng máy nhân gen Applied Biosystems 9700 trong 35 chu kỳ với chương trình nhiệt được thiết lập: - Mồi Ver – 1  và Nor – 1: 94oC – 1 phút 94oC – 5 phút 55oC – 1 phút x 35 chu kỳ 72oC – 7 phút 4oC – ∞ 72oC – 1 phút - Mồi Omt – 1: 94oC – 1 phút 94oC – 5 phút 56oC – 1 phút x 35 chu kỳ 72oC – 7 phút 4oC – ∞ 72oC – 1 phút - Mồi Apa – 2: 94oC – 1 phút 94oC – 5 phút 58oC – 1 phút x 35 chu kỳ 72oC – 7 phút 4oC – ∞ 72oC – 1 phút Phản ứng PCR đặc hiệu được thực hiện với tổng thể tích 20μl bao gồm các thành phần tỷ lệ như sau: Thành phần phản ứng Thể tích (µl) ddH2O 8,5 50ng/ µl ADN khuôn 1 10x Taq buffer 2 5u/ µl Taq polymerase 1 2mM dNTPs 1,5 MgCl2 2 Primer F (10pmol) 2 Primer R(10pmol) 2 Tổng thể tích 20 μl Các phân đoạn sản phẩm PCR được điện di kiểm tra gel agarose 1% và ghi nhận hình ảnh bằng máy ảnh Canon EOS 40D. 3.2.7.3 Phản ứng Multiplex PCR Nguyên tắc phản ứng: Phản ứng Multiplex PCR là một dạng thay đổi của phản ứng PCR thông thường, ở đó hai hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một phản ứng. Việc kết hợp nhiều mồi trong các hỗn hợp phản ứng khác nhau và nhân lên đồng thời nhiều locus đòi hỏi sự thay đổi, tối ưu các thông số của phản ứng. Phản ứng Multiplex PCR bằng máy nhân gen Applied Biosystems 9700 trong 35 chu kỳ với chương trình nhiệt được thiết lập: 94oC – 1 phút 94oC – 5 phút 60oC – 2 phút x 35 chu kỳ 72oC – 7 phút 4oC – ∞ 72oC – 2 phút Phản ứng Multiplex PCR được thực hiện với tổng thể tích 20μl bao gồm các thành phần tỷ lệ như sau: Thành phần phản ứng Thể tích (µl) ddH2O 8 50ng/ µl ADN khuôn 2 10x Taq buffer 2 5u/ µl Taq polymerase 2 2mM dNTPs 4 Primer (10pmol) 2 Tổng thể tích 20 μl 3.2.8 Sử dụng môi trường CAM (Coconut agar medium) - Thành phần môi trường CAM: Thành phần môi trường cho 1 lít môi trường bao gồm: 100 ml nước dừa + 100 g cùi dừa xay nhỏ (ngâm kĩ vào 300 ml nước cất sau đó chắt lấy nước) + 10 g agar – thêm nước cất vào cho đủ thể tích là 1 lít. - Nấm A. flavus thuần được cấy chuyển lên môi trường nước dừa (CAM), sau khoảng 40 ngày nuôi cấy, ở nhiệt độ 280C, trong bóng tối – quan sát sự biểu hiện màu sắc của nấm A. flavus ra môi trường. 3.2.9 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Các mẫu nấm A. flavus sau đó được tiến hành tách chiết độc tố Aflatoxin theo phương pháp sau: bổ sung 1 lần thể tích chloroform vào đĩa nấm (hoặc bình môi trường lỏng nuôi nấm) sau đó hút chuyển sang ống falcol 50ml. Lắc ở nhiệt độ phòng trong 8 giờ. Ly tâm, hút phần chloroform sang ống mới, sau đó để khô (chú ý để trong box sử dụng cho các chất độc hại, có thể dùng phương pháp hút chân không cho kết quả nhanh hơn). Phần tủa thu được sau đó được hòa tan trong ._.