Nghiên cứu phân loại, khả năng phân hủy DDT và sinh Laccase của chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu

IÊN CỨU PHÂN LOẠI, KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DDT VÀ SINH LACCASE CỦA CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Ô NHIỄM HỖN HỢP THUỐC TRỪ SÂU Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60.42.30 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà Thái Nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Lời Cảm Ơn ! Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà, và các anh chị trong nhóm nghiên cứu Công nghệ sinh học xử lý khử độc các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy, phòng Công nghệ Sinh học Môi trường, đặc biệt là Ths. Nguyên Bá Hữu, KS. Đàm Thúy Hằng, KS.Nguyễn Nguyên Quang, KS. Nguyễn Quang Huy. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Khoa sau đại học, Khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiệp – Trường đại học Sư phạm – Đại Học Thái Nguyên và lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình dạy dỗ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và thực hiện luận văn này. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này. Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2009 Đào Thị Ngọc Ánh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4,- dichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxin ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) bp Base pair DDE Dichlorodiphenyldichloroethylene DDD Dichlorodiphenyldichloroethane DDT Dichloro - Trichloroethane Diphenyl DNA Deoxyribonucleic acid EC Enzyme Commission EPA U.S. Environmental Protection Agency HCH Hexacyclohexan Lac Laccase LB Luria - Bertani LiP Lignin peroxidase MnP Manganese peroxidase PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon PCB Polychlorinated biphenyl PCR Polymerase Chain Reaction POP Persistent Organic Pollutant RBBR Remazol brilliant blue R RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl- β galactosidase Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỤC LỤC MỤC LỤC 1 MỞ ĐẦU 4 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 1 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA DDT 6 1.1 Cấu trúc của DDT 6 1.2 Tính chất lý hóa của DDT 6 2 ẢNH HƢỚNG ĐẾN MÔI TRƢỜNG VÀ SỨC KHỎE CON NGƢỜI CỦA DDT 7 2.1 Ảnh hƣởng đến môi trƣờng 7 2.2 Ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời 9 3 TÌNH TRẠNG Ô NHIỄM DDT 11 3.1 Nguồn gốc phát sinh 11 3.2 Tình trạng ô nhiễm DDT trên thế giới 13 3.3 Tình trạng ô nhiễm DDT ở Việt Nam 14 4 CÁC PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ Ô NHIỄM DDT 16 4.1 Các phƣơng pháp cơ, hóa lý 16 4.1.1 Phương pháp chôn lấp, cô lập 16 4.1.2 Phương pháp đốt có xúc tác 17 4.1.3 Phương pháp phân hủy bằng kiềm nóng 17 4.2 Phƣơng pháp phân hủy sinh học 18 5 PHÂN HỦY SINH HỌC DDT 20 5.1 Khả năng phân hủy DDT bởi vi sinh vật 20 5.1.1 Loại clo bởi quá trình khử 21 5.1.2 Khoáng hoá DDT bởi nấm thủy phân lignin 22 5.1.3 Phân hủy DDT bởi vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí 23 5.2 Các điều kiện môi trƣờng ảnh hƣởng đến phân hủy sinh học DDT và các dẫn xuất của DDT 26 6 LACCASE 27 6.1 Định nghĩa 27 6.2 Cấu trúc phân tử của laccase 28 6.3 Cơ chế xúc tác của laccase 30 6.4 Tính chất hóa sinh của laccase 32 6.5 Sự phân bố và một số vi sinh vật sinh laccase 33 6.6 Gene mã hóa laccase 34 6.7 Ứng dụng của laccase 36 6.8 Lignin peroxidase và Mangan peroxidase 37 6.8.1 Lignin peroxidase 37 6.8.2. Mangan peroxidase 38 7 PHÂN LOẠI VI SINH VẬT 39 7.1 Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống 39 7.2 Phân loại bằng phƣơng pháp xác định và so sánh trình tự gene mã hóa 18S Rrna 39 Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 7.2.1 Một số phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử 39 7.2.2 Phân loại dựa vào trình tự gene mã hoá 18S rRNA 40 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 1 VẬT LIỆU 42 1.1 Nguyên liệu 42 1.2 Hóa chất 42 1.3 Thiết bị 42 1.4. Môi trƣờng nuôi cấy 43 2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.1 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm sợi 45 2.2 Sàng lọc khả năng sinh Lac, LiP, MnP 45 2.3 Nghiên cứu khả năng phân hủy DDT của chủng FNA1 45 2.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme 46 2.4.1 Xác định hoạt tính laccase 46 2.4.2 Xác định hoạt tính LiP 47 2.4.3 Xác định hoạt tính MnP 47 2.5 Khảo sát các điều kiện môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng phát triển và sinh laccase của chủng FNA1 48 2.6 Xác định một số tính chất hóa sinh của laccase thô 49 2.7 Phân loại nấm sợi dựa vào xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 18S rRNA 50 2.7.1 Tách DNA tổng số từ nấm sợi 50 2.7.2 Nhân đoạn gen bằng kỹ thuật PCR 51 2.7.3 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ và biến nạp vào E.coli 53 2.7.4 Tách chiết DNA plasmid 53 2.7.5 Kiểm tra plasmit mang sản phẩm PCR mong muốn 54 2.7.6 Điện di kiểm tra DNA tổng số 55 2.6.8 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 55 2.6.7 Xác định trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA 55 PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI KHUẨN LẠC VÀ CUỐNG SINH BÀO TỬ CỦA CÁC CHỦNG FNA1, FNA2, FNA3 56 2 SÀNG LỌC KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP Lac, LiP, MnP 57 3 KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DDT CỦA CHỦNG FNA1 59 4 CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP LACCASE CỦA CHỦNG FNA1 64 4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH môi trường nuôi cấy, nồng độ NaCl 64 4.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 64 4.1.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 65 4.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl 67 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ DDT và nồng độ glucose 68 4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ DDT 68 4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ glucose 69 Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 4.3 Ảnh hưởng của các chất cảm ứng 71 4.3.1 Guaiacol, veratyl alcohol, CuSO4 71 4.3.2 Các chất ô nhiễm khác 72 4.4 Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt 74 4.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitơ và môi trường thay thế 76 4.5.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon 76 4.5.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 78 4.5.3 Ảnh hưởng của môi trường thay thế 80 5 MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA LACCASE THÔ 81 5.1 pH tối ưu và độ bền pH 81 5.1.1 pH tối ưu 81 5.1.2 Độ bền pH 83 5.2 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của laccase và độ bền nhiệt 84 5.2.1 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của laccase 84 5.2.2 Độ bền nhiệt 85 6 PHÂN LOẠI CHỦNG NẤM SỢI FNA1 BẰNG PHƢƠNG PHÁP SO SÁNH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN MÃ HÓA 18S rRNA 86 6.1 Tách chiết DNA tổng số 86 6.2 Nhân đoạn gen 18S rRNA bằng kỹ thuật PCR 87 6.3 Tách dòng gen 18S rRNA trong vectơ pTZ57R/T 88 6.4 So sánh trình tự đoạn gen mã hóa 18S rRNA của chủng FNA1 91 KẾT LUẬN 94 KIẾN NGHỊ 95 TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 PHỤ LỤC 103 Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 MỞ ĐẦU DDT (Dichloro - Trichloroethane Diphenyl) là một trong những thuốc trừ sâu tổng hợp đƣợc biết đến nhiều nhất. DDT đƣợc tổng hợp đầu tiên vào năm 1874, nhƣng thuộc tính thuốc trừ sâu của DDT thì cho đến 1939 mới đƣợc khám phá. Vào những năm đầu của Chiến tranh Thế giới thứ II, DDT đƣợc sử dụng với lƣợng lớn để kiểm soát muỗi truyền bệnh sốt rét, bệnh sốt phát ban, và các bệnh do côn trùng khác trong cả quân đội lẫn dân cƣ. DDT trở thành loại thuốc trừ sâu phổ biến sử dụng trong nông nghiệp. Chúng có mặt ở khắp mọi nơi, trong không khí, đất, nƣớc do một lƣợng lớn đã đƣợc giải phóng ra khi phun trên các cánh đồng và rừng để diệt muỗi và côn trùng. Ngày nay DDT đã bị cấm sử dụng do tính độc của nó nhƣ có khả năng gây ung thƣ tiềm tàng, gây đột biến và gây ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng. Để bảo vệ môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời, cần phải xử lý khử độc DDT trong môi trƣờng đất cũng nhƣ trong các môi trƣờng khác. DDT ở trong đất có thể giảm đi do sự bay hơi, sự xói mòn đất, sự hấp thu của động vật, thực vật và sự phân hủy sinh học của các vi sinh vật có sẵn trong đất nhƣng với thời gian tƣơng đối lâu. Trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, đã có một số phƣơng pháp khử độc khác nhau đƣợc nghiên cứu và áp dụng. Trong đó phƣơng pháp xử lý sinh học nhờ các vi sinh vật và hệ enzyme do chúng tiết ra là một hƣớng đi mới có nhiều triển vọng. Hệ enzyme sử dụng trong xử lý sinh học chủ yếu là các enzyme ngoại bào, chúng có khả năng phá vỡ các liên kết trong các hợp chất hữu cơ hoặc xúc tác chuyển hóa chúng thành các chất ít độc hơn và các dạng dễ bị phân hủy hơn. Nhóm enzyme có vai trò lớn trong quá trình phân hủy DDT cũng nhƣ các chất thuộc POPs khác gồm có laccase (Lac), mangan Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 peroxidase (MnP) và lignin peroxidase (LiP), trong đó laccase có vai trò quan trọng và đang bắt đầu đƣợc quan tâm nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam. Tại Nhóm nghiên cứu Công nghệ sinh học xử lý khử độc các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy (Persistent Organic Pollutants – POPs), phòng Công nghệ Sinh học Môi trƣờng, Viện CNSH, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã có những nghiên cứu bƣớc đầu về khả năng phân hủy DDT, DDD, DDE và sinh enzyme ngoại bào Lac, MnP, LiP [4,5,6]. Để làm rõ bản chất sinh học và khả năng sinh enzyme của các chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm DDT phục vụ cho các nghiên cứu ứng dụng enzyme ngoại bào vào xử lý các chất ô nhiễm khó phân hủy POPs, chúng tôi đã thực hiện đề tài với tên là: “Nghiên cứu phân loại, khả năng phân hủy DDT và sinh laccase của chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu”. Nội dung bao gồm: 1. Phân loại và định tên chủng nấm sợi dựa vào đặc điểm hình thái và trình tự đoạn gene mã hoá 18S rRNA. 2. Nghiên cứu khả năng phân hủy DDT của chủng nấm sợi FNA1. 3. Nghiên cứu khả năng sinh laccase của chủng nấm sợi FNA1. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA DDT 1.1 Cấu trúc của DDT DDT là một trong các thuốc diệt côn trùng, chúng là một nhóm các hợp chất hữu cơ có hai vòng thơm và có chứa Clo, bao gồm 14 hợp chất hữu cơ, trong đó: 71% là p,p,- DDT, 14.9% là o,p,- DDT, 0.3%p,p,- DDD, 0.1% là o,p , -DDD, 4% là p,p , - DDE, 0.1% là o,p , -DDE, sản phẩm khác là 3.5% (Hình 1.1). p-p DDT p-p DDE p-p DDD o-p DDT o-p DDE o-p DDD Hình 1.1. Công thức cấu tạo của một số đồng phân DDT 1.2 Tính chất lý hóa của DDT Tất cả các đồng phân của DDT đều là dạng tinh thể màu trắng, không mùi, không vị, có công thức tổng quát là C14H9Cl5, khối lƣợng phân tử là 354.5. Nhiệt độ nóng chảy khoảng 108.5 - 1090C, áp suất bay hơi là 2.53 x10- 5 Pa (1.9 x10 -7mmHg) tại 200C. DDT tan ít trong nƣớc (1g/l) nhƣng có khả năng giữ nƣớc, tan tốt trong các hợp chất hữu cơ đặc biệt là mỡ động vật. Khả Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 năng hoà tan của DDT trong nƣớc là thấp (hệ số hấp phụ cao) nên DDT có xu hƣớng bị hấp phụ trong cặn bùn, đất đá, trầm tích. Điều này có vai trò đặc biệt trong phân hủy sinh học DDT. Một số đặc tính cơ bản của DDT và các đồng phân đƣợc trình bày ở phụ lục 1 [59]. 2 ẢNH HƢỚNG ĐẾN MÔI TRƢỜNG VÀ SỨC KHỎE CON NGƢỜI CỦA DDT 2.1 Ảnh hƣởng đến môi trƣờng DDT [ 1,1,1-trichloro-2,2-bis-(p-chlorophenyl)ethane] đã đƣợc tổng hợp vào năm 1874, nhƣng mãi đến 1930, Bác sĩ Paul Muller (Thụy Sĩ ) mới xác nhận DDT là một hóa chất hữu hiệu trong việc trừ sâu rầy và từ đó đƣợc xem nhƣ là một thần dƣợc và không biết có ảnh hƣởng nguy hại đến con ngƣời. Khám phá trên mang lại cho ông giải Nobel về y khoa năm 1948 và DDT đã đƣợc sử dụng rộng rãi khắp thế giới cho việc khử trùng và kiểm soát mầm mống gây bệnh sốt rét. Nhƣng chỉ hai thập niên sau đó, một số chuyên gia thế giới đã khám phá ra tác hại của DDT trên môi trƣờng và sức khỏe ngƣời dân. Do đó, tại Hoa Kỳ từ năm 1972 DDT đã bị cấm sử dụng hẳn. DDT bị nhiễm vào môi trƣờng không khí, nƣớc, đất trong suốt quá trình sử dụng, DDT có mặt ở nhiều vị trí ô nhiễm khác nhau, sau đó có thể tiếp tục bị lan truyền và gây ô nhiễm môi trƣờng. Đặc biệt trong đất, nó giữ nƣớc thành các phần tử rắn và trở thành dạng bền vững (EPA 1986) và đƣợc EPA Hoa Kỳ xếp vào danh sách các loại hóa chất phải kiểm soát vì có nguy cơ tạo ra ung thƣ cho ngƣời và động vật [59]. DDT, DDE (1,1-dichloro-2,2-bis(p- chlrophenyl)ethylene), DDD (1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlrophenyl)ethylene) cũng có thể đƣợc thải vào không khí khi chúng bay hơi từ đất và nƣớc nhiễm độc. Một lƣợng lớn DDT đã đƣợc thải vào môi trƣờng nhƣ đi vào không khí, Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 đất và nƣớc thông qua quá trình tƣới, phun trên các diện tích sản xuất nông nghiệp và rừng để diệt côn trùng và muỗi [59].DDT và các đồng phân bị ngấm vào mạch nƣớc ngầm khi nó đƣợc sử dụng để diệt côn trùng ở gần các cửa sông .v.v. Trong đất, DDT có thể suy giảm nhờ quá trình bốc hơi, quá trình quang phân và quá trình phân hủy sinh học (hiếu khí và kị khí) nhƣng những quá trình này xảy ra rất chậm tạo ra sản phẩm là DDD và DDE có độ bền tƣơng tự nhƣ DDT. DDD cũng đƣợc sử dụng nhƣ là một loại thuốc trừ sâu, còn DDE chỉ đƣợc tìm thấy trong môi trƣờng nhiễm bẩn do sự phân hủy sinh học của DDT. Quá trình bốc hơi, phân hủy DDT, DDD, DDE có thể đƣợc lặp lại nhiều lần và kết quả là DDT, DDD, DDE đƣợc tìm thấy ở cả những nơi rất xa. Những hợp chất hóa học này có thể đƣợc phát hiện ở đầm lầy, tuyết và động vật ở vùng Bắc Cực & Nam Cực, rất xa so với nơi chúng đƣợc sử dụng, DDT, DDD, DDE cuối cùng ở trong đất một thời gian dài, hầu hết bị phân hủy chậm thành DDD và DDE thƣờng là bởi hoạt động của các vi sinh vật. Chu kỳ bán hủy của những hợp chất này trong khí quyển khi bay hơi đƣợc ƣớc tính 1,5- 3 ngày. DDT ở trong đất phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nhiệt độ, loại đất, độ ẩm v.v. ở những vùng nhiệt đới DDT bay hơi dễ hơn và vi sinh vật cũng phân hủy nó nhanh hơn. DDT ở đất ẩm bị phân hủy nhanh hơn ở đất khô. Chúng làm giảm giá trị của đất và khi bị phân hủy DDT đƣợc chuyển thành DDE trong cả điều kiện hiếu khí và kị khí. Những hợp chất này có thể bốc hơi trong không khí hoặc lắng đọng lại ở các vị trí khác nhau và có độc tính rất cao. Chúng ở sâu trong đất, thấm qua đất và vào các mạch nƣớc ngầm. Trên bề mặt nƣớc, DDT sẽ liên kết các phần tử ở trong nƣớc, lắng xuống và có thể lắng đọng trong các trầm tích. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 Gần đây DDT là một trong 12 hoá chất đƣợc các nhà khoa học thế giới xếp vào hạng chất ô nhiễm khó phân hủy (POPs). Năm 1998, đại diện của hơn 92 quốc gia trên thế giới đã tụ họp tại Montreal đã bàn thảo về các biện pháp nhằm cấm sản xuất và sử dụng các hoá chất trên vì lý do tác hại của chúng do sự tích luỹ lâu dài trong không khí, lòng đất và nguồn nƣớc, kết tụ vào các mô động vật- nguồn thực phẩm chính của loài ngƣời [7]. DDT tích trữ một lƣợng lớn ở trong cá và các động vật biển (ví dụ: hải cẩu, cá heo). Tính độc của DDT đã đƣợc biết đến thông qua các nghiên cứu rất kỹ lƣỡng ở trên các vi sinh vật, động vật không xƣơng sống ở dƣới nƣớc, cá, lƣỡng cƣ, động vật không xƣơng sống ở trên cạn và các loài động vật có vú khác (chuột hang, thỏ v.v.). Trong các động vật này, DDT đƣợc tìm thấy một lƣợng lớn trong các mô mỡ và sẽ tiếp tục di chuyển đến những cơ quan khác. Ngƣỡng độc của DDT và các đồng phân của nó đã xác định thông qua chỉ số LC50 (LC50 là liều gây chết 50% mẫu sinh vật thí nghiệm) ở một số loài động vật thí nghiêm là: LD50 ở lợn khoảng 1.000mg DDT/kg [12], LD50 ở thỏ là 300mg DDT/kg và 4.000-5.000 mg DDD/kg [12]. DDT ở trong đất cũng có thể đƣợc hấp thụ bởi một số thực vật hoặc trong cơ thể con ngƣời khi ăn các thực vật đó [57]. 2.2 Ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời Những nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra đƣợc tác hại của DDT và các hợp chất có liên quan tới một số loài và việc sử dụng nó đã bị cấm hoặc giảm trên nhiều nƣớc do những hậu quả độc hại của nó. Nhƣng các số liệu về ảnh hƣởng trên con ngƣời vẫn chƣa đƣợc biết đến nhiều. Các nghiên cứu về sự ảnh hƣởng trên ngƣời đƣợc nghiên cứu trên các công nhân làm việc trong các nhà máy có sản xuất DDT. Các nghiên cứu khác cũng cho những kết quả có Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 giá trị nhƣng do những hạn chế của các nghiên cứu về dịch tễ học nên chƣa xác định đƣợc những nguyên nhân gây bệnh từ chúng. Con ngƣời bị nhiễm DDT thông qua nhiều cách khác nhau đó là phơi nhiễm trực tiếp và gián tiếp. Phơi nhiễm trực tiếp, có thể xảy ra qua phổi hoặc qua da. Nhiễm gián tiếp xảy ra khi ăn các thực phẩm nhƣ ngũ cốc, rau đậu đã bị nhiễm DDT, cũng nhƣ tôm cá sống trong vùng bị ô nhiễm, DDT sẽ đi vào cơ thể qua đƣờng tiêu hoa và tích tụ theo thời gian trong các mô mỡ và gan của con ngƣời. Nguồn lây nhiễm DDT chính là ở trong thịt, cá, gia cầm và các sản phẩm từ sữa. Nếu ngƣời ăn các loại lƣơng thực thực phẩm đƣợc phun DDT và ăn kéo dài thì có nhiều nguy cơ dẫn tới ngộ độc mãn tính, sinh con quái thai. Mức độ tối thiểu mà con ngƣời có thể chịu đựng và không gây hại là 285 mg/kg. DDT có tác động rõ rệt lên hệ thống thần kinh ngoại biên, gây nên sự rối loạn hệ thống thần kinh, ức chế các enzyme chức năng đòi hỏi sự dịch chuyển các ion dẫn đến tê liệt. Những ngƣời bị nhiễm một lƣợng lớn gây ngộ độc cấp tính, dễ bị kích động, bị rùng mình và gây tai biến mạch máu não. Chúng cũng gây nên sự đổ mồ hôi, đau đầu, buồn nôn, chóng mặt. Những ảnh hƣởng nhƣ trên cũng có thể xuất hiện khi hít DDT ở trong không khí hoặc hấp thụ một lƣợng lớn qua da [59]. Đối với những ngƣời bị nhiễm DDT ở mức độ thấp (20 mg/ngày) - ví dụ nhƣ những ngƣời làm việc trong các nhà máy sản xuất DDT, sẽ xuất hiện những biến đổi nồng độ enzyme có trong gan và trong máu. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng DDT, DDE, DDD có thể gây bệnh ung thƣ, mà trƣớc tiên là ung thƣ gan, cũng có thể là ung thƣ vú, ung thƣ tuỷ [59]. Những nghiên cứu của Garabrant và cộng sự 1992 ở một nhóm công nhân của các nhà máy sản xuất thuốc hóa học giữa năm 1948 đến năm 1971 đã phát hiện ra DDT có thể Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 gây ung thƣ tủy và dẫn đến tử vong vào năm 1953- 1988 [59]. Bên cạnh đó nó cũng gây nên một số bệnh ung thƣ khác nhƣng vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu kỹ nhƣ: ung thƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ tinh hoàn, ung thƣ máu, ung thƣ dạ con v.v. Trẻ con bú sữa mẹ hay sữa tƣơi bị nhiễm độc DDT trực tiếp qua sự hiện diện của DDT trong sữa tƣơi hay gián tiếp vì thức ăn của ngƣời mẹ. Tệ hại hơn nữa, nhiều bà mẹ đã bị sảy thai trong vùng ảnh hƣởng của DDT. Ở nƣớc ta, đã có một số công trình nghiên cứu và rút ra nhận xét là tất cả các bà mẹ dù có tiếp xúc hay không tiếp xúc trực tiếp với DDT đều có lƣợng DDT trong sữa mẹ rất cao. Vì DDT xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua đƣờng tiêu hóa, cao hơn rất nhiều lần so với liều lƣợng cho phép của OMS (0.05ppm), của Liên Xô (0.14ppm) và của Hungari (0.13ppm) [53]. 3 TÌNH TRẠNG Ô NHIỄM DDT 3.1 Nguồn gốc phát sinh DDT (1,1,1-trichloro-2,2-bis (p-chlorophenyl) ethane) đã đƣợc tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1873 bởi nhà khoa học ngƣời Đức Othmar Ziedler. Tuy nhiên, phải đến 1939 nhà hoá học Thuỵ Sỹ- Paul Hermann Muller mới khám phá các đặc tính để diệt trừ côn trùng của DDT, chúng có thể phá huỷ nhanh chóng hệ thần kinh của côn trùng. Năm 1948, Paul Muller đã đƣợc trao giải thƣởng Nobel về sinh - y học về khám phá này. DDT có hiệu quả chống lại rận, bọ chét, và muỗi mang các mầm bệnh sốt phát ban, dịch hạch, sốt rét, và sốt vàng .v.v. DDT đã đƣợc dùng rất rộng rãi hơn 20 năm và đƣợc xem là nhân tố chính trong việc gia tăng sản lƣợng lƣơng thực thế giới và ngăn chặn bệnh tật từ côn trùng. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 DDT đƣợc tạo thành từ phản ứng của trichloroethanol với chlorobenzen (Hình 1.2). Tên thƣơng mại hoặc các tên khác của DDT bao gồm Anofex, Cesarex, Chlorophenothane, Dadelo, p,p-DDT, dichlorodiphenyltrichloroethane, Dinocide, Didimac, Digmar, ENT 1506, Genitox, Guesapon, Guesarol, Gexarex, Gyrol, Hildit, Ixodex, Kopsol, Neocid, OMS 16, Micro DDT 75, Pentachlorin, Rukseam, R50 và Zerdane. Hình 1.2. Tổng hợp DDT từ trichloroethanol và chlorobenzen DDT là loại thuốc hóa học diệt côn trùng đƣợc sử dụng rộng rãi từ chiến tranh thế giới lần thứ II trên khắp thế giới và hàng triệu tấn đƣợc sản xuất, sử dụng trƣớc đây hiện đang còn lƣu giữ trong đất và sẽ tiếp tục phân tán trong môi trƣờng. Một lƣợng lớn DDT đã đƣợc giải phóng vào không khí, đất và nƣớc khi sử dụng để diệt côn trùng, muỗi ở các địa điểm nhạy cảm nhƣ cửa sông [59]. Đầu năm 1960, nhà hoạt động ngƣời Mỹ Rachel Carson đã xuất bản cuốn sách Silent Spring khẳng định DDT là nguyên nhân của bệnh ung thƣ và nguy hại đến sinh sản của chim do làm mỏng lớp vỏ trứng. Cuốn sách đã gây ra sự phản đối kịch liệt của công chúng và sự kiện này đã dẫn đến lệnh cấm sử dụng DDT trong nông nghiệp ở Mỹ. Tiếp theo trong những năm 1970 và 1980, DDT đã bị cấm sử dụng trong nông nghiệp ở hầu hết các nƣớc phát triển do ảnh hƣởng nguy hại của nó đối với môi trƣờng. Mặc dầu vậy, DDT vẫn đƣợc sử dụng rộng rãi trong một số quốc gia đang phát triển. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 3.2 Tình trạng ô nhiễm DDT trên thế giới Do tác hại của DDT trên môi trƣờng và sức khỏe ngƣời dân tại Hoa Kỳ từ năm 1972 DDT đã bị cấm sử dụng hẳn. Tuy nhiên, đến nay hóa chất này vẫn còn gây tác hại ở những vùng nông nghiệp đã sử dụng và những vùng quanh nơi sản xuất ra DDT trƣớc đây. Hiện tại DDT vẫn còn ngƣng tụ nơi thềm lục địa vùng Palos Verdas (ngoài khơi vùng biển Los Angeles) vì nhà máy sản xuất ra DDT Montrose Chemical.co tại Torrance đã thải DDT vào hệ thống cống rãnh thành phố vào năm 1971. Việc xử lý ô nhiễm DDT cho vùng này ƣớc tính vào khoảng 300 triệu USD [7]. Cho đến nay ở Mỹ do lợi ích về kinh tế nên vẫn sản xuất DDT để xuất cảng qua Phi châu và các nƣớc Á châu trong đó có Việt Nam. DDT là một loại thuốc sát trùng công hiệu mạnh, đặc biệt quan trọng trong việc kiểm soát bệnh sốt rét nên vẫn đƣợc sử dụng rộng rãi ở các nƣớc đang phát triển bất chấp nguy cơ gây hại tiềm tàng và lâu dài của nó. Sự tích tụ nhiều nhất của DDT và các hợp chất có liên quan ở biển phía Tây của Trung Quốc. ở các bờ biển khác, lƣợng tích tụ của DDT cũng rất lớn nhƣ: vịnh Bengal, biển Arabian, biển bắc Trung Quốc v.v.Từ năm 1980-1983, có rất nhiều phân tích về sự tích tụ DDT ở trong các trầm tích biển ở EPA [54]. Hàm lƣợng trung bình của DDT, DDE, DDD là: 0.1, 0.1, 0.2 g/kg (trọng lƣợng khô). Hàm lƣợng DDT và các sản phẩm chuyển hóa của các mẫu trầm tích đƣợc phân tích ở đáy sông ở vịnh River tại Washington: 0.1-234 g/kg. Sự tích trữ của DDT, DDE, DDD và tổng lƣợng DDT ở đáy trầm tích từ sông San Joaquen và các nhánh sông của nó ở California-1992 lần lƣợt là:1.4 - 115, 0.7 - 14, 0.4 - 39, 2.2 - 170 (ng/l) [45]. Trong đó Orestinba Creat có hàm lƣợng DDT cao hơn hẳn so với các vị trí khác. Ở Canada, tổng lƣợng DDT lắng đọng trên bề mặt trầm tích ở 8 hồ khác dọc ngang lục địa vào Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 khoảng 9.7g/kg. Iwata et al (1993) đã thu thập và phân tích 68 ví dụ về hàm lƣợng DDT ở nƣớc bề mặt từ một vài đại dƣơng (18 khu vực) đã nêu lên những ảnh hƣởng chủ yếu do sự lắng đọng khí quyển từ tháng 4/1989-8/1990. Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của DDT trong các mẫu trầm tích với nồng độ cao do DDT đƣợc vận chuyển từ khu vực bị ô nhiễm đến Bắc cực và Nam cực. Tổng lƣợng DDT ở đại dƣơng New Zealand và Ross Iland, Antarctica giữa tháng 1 và tháng 3 (1990) là: 0.40 và 0.81 pg/m3 [14, 33]. Vùng Gulf của Mexico (1977) chứa trung bình 34pg/m3 DDT với tỉ lệ 10-78pg/m3 [13]. Lƣợng DDT cao nhất đƣợc tìm thấy ở gần khu vực nơi mà DDT vẫn đƣợc sử dụng, ví dụ ở bờ biển Arabian của ấn Độ. Các khu vực mà lƣợng DDT trong không khí cao là eo biển Malacca, bờ biển phía nam Trung Quốc, vịnh Mexico. 3.3 Tình trạng ô nhiễm DDT ở Việt Nam DDT đƣợc dùng lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1949 để phòng ngừa bệnh sốt rét. Tuy nhiên, số lƣợng thuốc DDT đƣợc dùng chỉ có 315 tấn trong năm 1961 và giảm xuống còn 22 tấn trong năm 1974. Từ năm 1957 đến 1990, tổng số lƣợng thuốc DDT nhập cảng chỉ có 240.422 tấn. Mặc dù việc sử dụng thuốc DDT đã bị cộng đồng quốc tế ngăn cấm từ năm 1992, việc nhập cảng và sử dụng DDT ở Việt Nam vẫn tiếp tục cho đến năm 1994. Trong khoảng từ năm 1992 đến năm 1994, số lƣợng thuốc DDT nhập cảng từ Nga lên đến 423.358 tấn Tuy không có số liệu chính xác về số lƣợng DDT đang đƣợc sử dụng ở Việt Nam, nhƣng tin tức trong nƣớc cho biết thuốc này vẫn còn đang đƣợc sử dụng rộng rãi đặc biệt ở vùng châu thổ sông Cửu Long vì là vùng có nhiều sông rạch và nhiều muỗi mồng [8]. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 Tại một kho dã chiến chứa DDT những năm 1967 – 1968 ở Hà Tĩnh vẫn còn một lƣợng tồn dƣ lớn hóa chất này. Khối lƣợng thuốc DDT ở kho này ƣớc tính khoảng 4- 5 tấn. Hiện nay số thuốc DDT đã nằm phơi lộ trên mặt đất, một phần thuốc có thể bị phân hủy song phần lớn vẫn còn đó, chúng có thể khuếch tán vào không khí gây ô nhiễm môi trƣờng và phân rã ngấm vào đất và các mạch nƣớc ngầm gây ô nhiễm đất và nƣớc trong khu vực. Nghệ An là một trong những tỉnh còn tồn lƣu một lƣợng tƣơng đối lớn hóa chất bảo vệ thực vật, hiện tại tỉnh có 25 điểm tồn lƣu hóa chất chất bảo vệ thực, trong đó mới có 5 điểm đƣợc xử lý. Phần lớn những điểm tồn lƣu hóa chất chất bảo vệ thực đều nằm gần, hoặc nguy hiểm hơn là nằm lọt trong khu dân cƣ. Một kết quả điều tra khác ở tỉnh Nghệ An cho thấy, DDT vẫn còn trong một nhà kho từ năm 1965 đến năm 1985. Nồng độ của DDT thay đổi từ 3.38 đến 960.6 mg/kg trong các mẫu đất và từ 0.00012 đến 0.00168 mg/l trong các mẫu nƣớc. Trong nhiều năm liên tiếp, mùi thuốc DDT nồng nặc bay xa đến 600 mét. Đã có 25 ngƣời chết vì ung thƣ, và 22 trƣờng hợp dị thai đƣợc ghi nhận [8]. Do sự nguy hiểm của các chất POP nói chung và hóa chất bảo vệ thực vật nói riêng đối với sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng, các nƣớc trên thế giới cũng nhƣ Việt Nam đã và đang tích cực tiến tới loại trừ và cấm sử dụng hoàn toàn các chất POP. Cụ thể là Công ƣớc Stockholm về các chất hữu cơ ô nhiễm khó phân hủy ra đời và 172 quốc gia đã tham gia ký kết, trong đó có Việt Nam. Ở nƣớc ta công ƣớc Stockholm chính thức có hiệu lực kể từ ngày 14/5/2004. Tham gia công ƣớc này, Việt Nam sẽ xây dựng và hoàn thiện hệ thống pháp luật để quản lý an toàn hóa chất, giảm thiểu và tiến tới loại bỏ các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân huỷ. Đồng thời, phòng ngừa, kiểm soát và xử lý an toàn đối với các chất này, tiến tới kiểm soát, xử lý và tiêu hủy hoàn toàn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 các kho thuốc bảo vệ thực vật, những hóa chất rất độc hại đã bị loại bỏ, còn tồn lƣu. 4 CÁC PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ Ô NHIỄM DDT DDT là chất có tính độc hại cao, bền vững cao đối với quá trình phân hủy tự nhiên. Một khi đã phát thải vào môi trƣờng, chất này có thể tồn tại trong thời gian dài và có thể di chuyển đi xa khỏi nguồn phát thải ban đầu nhờ gió, nƣớc hay nhờ vào các loài động vật di cƣ. Ngoài ra DDT có thể đƣợc hấp thụ dễ dàng vào các mô mỡ và tích tụ trong cơ thể của các sinh vật sống, nồng độ chất này trở nên cao hơn theo chiều tăng của chuỗi thức ăn, đặc biệt là trong các loài sinh vật lớn và sống lâu. Chính vì những tính chất này mà việc loại bỏ, tiêu hủy DDT cũng nhƣ các chất bảo vệ thực vật trong danh mục cấm khác ngày càng trở nên cần thiết và cấp bách không chỉ riêng ở nƣớc ta mà còn là vấn đề quan tâm của nhiều nƣớc trên thế giới. Tùy điều kiện địa hình, tính chất, quy mô của vùng ô nhiễm; tùy điều kiện kinh phí để áp dụng các quy trình xử lý khác nhau, có thể xử dụng các phƣơng pháp nhƣ phƣơng pháp hóa lý; phƣơng pháp bao vây, cô lập nguồn ô nhiễm; hay phƣơng pháp sinh học v.v. 4.1 Các phƣơng pháp cơ, hóa lý Có rất nhiều phƣơng pháp hóa lý đƣợc sử dụng để loại bỏ các chất ô nhiễm khó phân hủy. Đối với ô nhiễm DDT thì các phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng là chôn lấp, cô lập; phân hủy bằng kiềm nóng và phƣơng pháp đốt có xúc tác. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 4.1.1 Phương pháp chôn lấp, cô lập Với cấu trúc vòng thơm, DDT rất khó phân hủy trong tự nhiên nên biện pháp chôn lấp chất thải nguy hại đƣợc áp dụng rộng rãi ở nhiều nƣớc trên thế giới. Một số nƣớc sử dụng biện pháp chôn lấp cô lập và xi măng hóa chất thải có độc tính cao ở dạng lỏng hoặc rắn. Phƣơng pháp này đòi hỏi phải chuẩn bị hố chôn lấp đảm bảo kỹ thuật, không bị rò rỉ, bền vững trong thời gian dài, địa điểm chôn lấp phải xa khu dân cƣ, không gần mạch nƣớc ngầm. 4.1.2 Phương pháp đốt có xúc tác Đây là phƣơng pháp vô cơ hoá chuyển clo hữu cơ thành CO2, H2O và Cl - . Clo hữu cơ nếu tiếp xúc với kim loại đồng nung đỏ đều bị đồng lấy mất clo (tạo thành CuCl2) và chúng bị phân huỷ tiếp theo thành CO2 và nƣớc cùng với các dẫn xuất khác không độc, hoặc ít độc hơn (Hình 1.3). DDT CO2 + H2O + CuCl2 Hình 1.3. Phƣơng pháp đốt có xúc tác Công nghệ thiêu đốt cũng đã đƣợc sử._. dụng trên thế giới, phƣơng pháp xử lý này tƣơng đối triệt để song giá thành lại cao và có khả năng gây ô nhiễm thứ cấp bởi các sản phẩm phụ tạo trong quá trình vận hành. Các phƣơng pháp vật lý khác nhƣ sử dụng tia bức xạ, tia cực tím, hay áp suất cao cũng mang lại hiệu quả nhất định trong xử lý ô nhiêm DDT. 4.1.3 Phương pháp phân hủy bằng kiềm nóng Cu / 600-700 0 C O2 (không khí) Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 Khi xử lý DDT với dung dịch NaOH 20% nóng, xảy ra phản ứng dehydroclorua hoá tạo nên một olefin. Olefin đƣợc sinh ra bị polime hoá cho sản phẩm rắn. Sản phẩm rắn này đƣợc tách ra dễ dàng và cho vào bao nilon rồi chôn vùi dƣới đất. Mặc dù làm sạch DDT có thể đƣợc tiến hành bằng nhiều biện pháp nhƣ đã nêu ở trên, nhƣng nhƣợc điểm của các công nghệ đốt và hóa học là gây ô nhiễm thứ cấp. Chính vì vậy mà xu hƣớng sử dụng các phƣơng pháp hóa lý ngày càng giảm. 4.2 Phƣơng pháp phân hủy sinh học Ngày nay do có những hiểu biết sâu sắc về tác hại của DDT nên các nhà khoa học và công nghệ Việt Nam đang nghiên cứu tìm ra các giải pháp để có thể làm giảm lƣợng DDT còn sót lại trong đó biện pháp xử lý sinh học đang đƣợc quan tâm nhiều bởi tính ƣu việt của nó là không tạo ra ô nhiễm thứ cấp cho môi trƣờng. Phân hủy sinh học đã đƣợc các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và áp dụng trong những năm gần đây và cũng đạt đƣợc khá nhiều thành tựu [63]. Quá trình làm sạch sinh học có thể thực hiện ở quy mô lớn nhỏ khác nhau, có thể sử dụng thực vật hay vi sinh vật và ở điều kiện hiếu khí hoặc kị khí. Việc tẩy độc bằng phân hủy sinh học có thể đƣợc tiến hành riêng rẽ hoặc kết hợp với các phƣơng pháp khác, sau vài tháng hoặc vài năm các chất ô nhiễm có thể đƣợc hoàn toàn loại bỏ. Phân hủy sinh học (Bioremediation) thƣờng bao gồm các phƣơng pháp sau: Kích thích sinh học (augmentation) và làm giàu sinh học (stimulation). + Kích thích sinh học (Biostimulation): là quá trình thúc đẩy sự phát triển và hoạt động trao đổi chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 sử dụng các chất độc hại thông qua việc thay đổi các yếu tố môi trƣờng nhƣ: pH, độ ẩm, nồng độ O2, chất dinh dƣỡng .v.v. + Làm giàu sinh học (Bioaugmentation): sử dụng tập đoàn các vi sinh vật bản địa đã đƣợc làm giàu hoặc vi sinh vật sử dụng các chất độc hại từ nơi khác, thậm chí vi sinh vật đã đƣợc cải biến về mặt di truyền đƣa vào các địa điểm ô nhiễm. + Sử dụng thực vật (phytoremediation): sử dụng thực vật, hệ enzyme của thực vật và các quá trình phức tạp khác nhằm hấp thu hoặc chuyển hóa các chất ô nhiễm. Kích thích sinh học hiện là khuynh hƣớng đƣợc sử dụng rộng rãi trong xử lý ô nhiễm theo phƣơng pháp phân hủy sinh học. Đôi khi ngƣời ta cũng kết hợp hai biện pháp để có thể tăng cƣờng sự phân hủy sinh học. Song song với việc bổ sung các chủng vi sinh vật nuôi cấy có khả năng phân hủy chất ô nhiễm, ngƣời ta cũng tạo điều kiện tối ƣu cho tập đoàn vi sinh vật hoạt động. Nhƣ vậy, cùng với hoạt động của tập đoàn vi sinh vật bản địa và hoạt động của vi sinh vật ngoại lai sẽ tăng cƣờng hiệu quả của quá trình xử lý. Hiện nay, tại Viện Công nghệ Sinh học đã tiến hành một số nghiên cứu về khả năng phân hủy dầu, các chất độc hại khác nhƣ dioxin, 2,4-D, hydrocacbon thơm đa nhân (PAH) v.v. bằng công nghệ phân hủy sinh học và đã mang lại những hiệu quả khả quan [2]. Đối với DDT, những nghiên cứu bƣớc đầu về khả năng phân hủy bằng vi sinh vật cũng đang bắt đầu đƣợc nghiên cứu để góp phần khử độc DDT ở một số địa phƣơng bị ô nhiễm [5]. Ngoài ra trên thế giới việc ứng dụng hệ enzyme ngoại bào của vi sinh vật vào xử lý ô nhiêm đã có nhiều nghiên cứu, đây cũng là hƣớng có nhiều triển vọng do rút ngắn đƣợc thời gian xử lý và hiệu quả xử lý cao hơn so với khử độc bằng phân hủy sinh học thông thƣờng. Những nghiên cứu bƣớc đầu Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 về hệ enzyme ngoại bào ứng dụng vào xử lý khử độc đã đƣợc tiến hành tạo cơ sở cho việc thiết kế công nghệ xử lý các chất ô nhiễm hóa học trong tƣơng lai [4,5,6]. Hệ enzyme ngoại bào đƣợc quan tâm là hệ enzyme xúc tác với các đại diện là laccase (oxidoreductase), mangan peroxidase và lignin peroxidase (peroxidase). Đây là những enzyme có khả năng phân hủy nhiều loại chất ô nhiễm hữu cơ có cấu trúc đa vòng thơm khác nhau do tính đặc hiệu cơ chất không cao. Trong đó laccase đƣợc tập trung nghiên cứu, enzyme này xúc tác quá trình oxy hóa các hợp chất phenolic mạnh nhất trong nhóm enzyme phân hủy lignocellucose, laccase đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghệ tẩy độc các hợp chất phenol, các dẫn xuất clo biphenyl, các loại thuốc nhuộm và các loại nƣớc thải v.v. 5 PHÂN HỦY SINH HỌC DDT 5.1 Khả năng phân hủy DDT bởi vi sinh vật Các nhà khoa học cũng đã phân lập và nghiên cứu nhiều chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy DDT và các sản phẩm chuyển hóa của nó. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng số lƣợng các vi sinh vật có khả năng phân hủy DDT tại các vùng ô nhiễm nhiều hơn so với các vùng không ô nhiễm. Các loài vi sinh vật trong vùng ô nhiễm có xu hƣớng thích nghi, sau đó thay đổi cấu trúc về di truyền để hƣớng đến việc phân hủy DDT. Các vi sinh vật tiềm năng tham gia vào quá trình phân huỷ sinh học DDT chủ yếu là vi khuẩn, vi nấm. Các vi sinh vật này chuyển hoá DDT thông qua quá trình khử loại clo, vi nấm thủy phân và vi khuẩn phân huỷ chlorobiphenyl thực hiện cắt vòng DDT trong điều kiện hiếu khí. Ngoài ra vi sinh vật phân huỷ DDT có thể đƣợc thiết kế chuyển gene dựa trên các kỹ thuật di truyền phân tử và đƣa vào vùng đất nhiễm. Hiện nay, có tới hơn 300 loài vi sinh vật có khả năng phân hủy DDT Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 đã đƣợc nghiên cứu, danh sách dƣới đây đƣa ra một vài đại diện của vi khuẩn, một số loài nấm và xạ khuẩn ( Phụ lục 2) [20, 29, 48]. Cơ chế của quá trình phân hủy sinh học DDT và đồng phân của nó có thể là nhờ quá trình cắt vòng hoặc loại khử clo. Các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa DDT và các đồng phân của nó (o,p,-DDT, p,p,-DDT) thành dạng bớt độc hơn, không độc hoặc chuyển hóa hoàn toàn thành CO2. Các cơ chế tấn công DDT bởi vi sinh vật đã đƣợc công bố cho thấy DDT đƣợc loại clo bởi quá trình khử dẫn đến DDD. Vi khuẩn và nấm sợi phân huỷ DDT chủ yếu theo cơ chế này. Một con đƣờng khác phân huỷ sinh học ở điều kiện hiếu khí đã đƣợc mô tả có sự tham gia của vi khuẩn phân huỷ chlorobiphenyl [15, 42]. 5.1.1 Loại clo bởi quá trình khử Dƣới các điều kiện khử, quá trình loại clo bởi quá trình khử là cơ chế chủ yếu của quá trình chuyển hoá sinh học các đồng phân o,p´-DDT và p,p´- DDT của DDT thành DDD (Fries 1969). Phản ứng diễn ra bởi sự thay thế chlorin mạch thẳng bằng nguyên tử hydro. Một số vi sinh vật chuyển hoá DDT thành DDD đã đƣợc công bố bao gồm Escheria coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Bacillus sp., “Hydrogenomonas” và một số nấm nhƣ Saccharomyces cerevisiae, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma [29,48]. Rochkind-Dubinsky và cộng sự đã phát triển các điều kiện khử loại trong các bình nuôi cấy. Các cơ chế khử loại clo với sự chuyển tiếp các kim loại và phức kim loại đóng vai trò chất khử (Hollinger & Schraa 1994). Trong hầu hết các trƣờng hợp các quá trình có sự tham gia của vận chuyển điện tử đơn, loại ion clo, và tạo gốc alkyl. Sự chuyển tiếp phức hệ kim loại trong vi sinh vật có kết hợp với các trung tâm hoạt động của các phân tử Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 vận chuyển điện tử. Ở E. coli, khử loại clo của DDT cần FAD và các điều kiện kỵ khí, trong khi đó ở E. aerogenes là cytochrom oxidaza [29].  Con đường chuyển hoá DDT bởi vi khuẩn theo cơ chế loại khử clo Trƣớc tiên DDT bị phân hủy tạo DDMS, quá trình phân hủy tiếp theo sẽ là quá trình loại Cl tạo DDNU,sau đó sẽ là quá trình oxy hoá tạo DDOH, DDOH bị oxy hoá tiếp thành DDA và loại carbon thành DDM, DDM có thể đƣợc chuyển hoá tạo DBP hoặc tách một vòng thơm tạo p-chlorophenylaxetic acid (PCPA). Trong điều kiện kị khí DBP không thể chuyển hóa xa hơn nữa (Hình 1.4) [29]. Hình 1.4. Con đƣờng chuyển hoá DDT bởi vi khuẩn trong điều kiện kị khí theo cơ chế loại khử clo 5.1.2 Khoáng hoá DDT bởi nấm thủy phân lignin Nấm thủy phân lignin có khả năng phân huỷ nhiều loại chất hữu cơ bền vững trong môi trƣờng tự nhiên trong đó có DDT. Aust 1990 chỉ ra rằng Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 khoáng hoá DDT xảy ra đồng thời với quá trình sinh ligninaza. Khi DDT đƣợc bổ sung vào giống nấm thủy phân lignin quá trình khoáng hoá bắt đầu ngay lập tức nhƣng nếu thí nghiệm bắt đầu từ giống là bào tử thì sự phân huỷ và hoạt tính thủy phân lignin xảy ra đồng thời sau 4 ngày.  Con đường phân hủy DDT bởi loài nấm trắng Phanerochaete chrysosporium Sự phân hủy DDT bởi nấm đảm trắng P. chrysosporium đƣợc biết đến trong công trình nghiên cứu của Aust và cộng sự [15]. Bumpus và Aust đã miêu tả sự phân hủy của DDT sau 30 ngày nuôi cấy (trong điều kiện thiếu N), có khoảng 50% DDT đã đựơc chuyển hoá, trong đó 10% đƣợc khoáng hoá, phần còn lại đƣợc chuyển hoá thành dicofol, FW-152 và bị phân hủy tạo DBP. Tiếp đó là phản ứng phá vòng tạo CO2. Quá trình này đƣợc điều khiển bởi hệ enzyme ligninase. Dicofol đƣợc tạo thành sau pha lag, DDD đƣợc tạo thành sau pha suy tàn trên đó sẽ bị phân hủy bởi hệ enzyme ligninase khác. Trong trƣờng hợp này DDE không đƣợc phát hiện. Trong quá trình khoáng hoá DDT thì tinh bột và cenlulose là nguồn C tốt hơn so với nguồn C khác (muối cacbornate) kể cả đƣờng (Hình 1.5) 5.1.3 Phân hủy DDT bởi vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí Kỹ thuật làm giàu vi sinh vật đã đƣợc sử dụng trong đó một hợp chất có cấu trúc tƣơng tự đã đƣợc dùng thay thế DDT. Một số chủng vi khuẩn đã thể hiện khả năng phân huỷ DDT theo các cơ chế mới. Chủng B-206 sinh ra các chất trung gian phenol từ DDT, DDD, và DDE, tuy nhiên không có sản phẩm cắt vòng nào đƣợc tạo ra [42]. Nadeau 1994 thông báo về chủng Alcaligenes eutrophus A5 chuyển hoá các đồng phân o,p´-và p,p´-DDT. Aiskable 1997 đã phân lập đƣợc vi khuẩn Gram dƣơng từ đất nhiễm DDT ở New Zealand theo Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 phƣơng pháp làm giàu trên môi trƣờng khoáng chứa biphenyl, DDT, DDD và DDE nhƣ là nguồn cacbon [42]. Hình 1.5. Con đƣờng phân hủy DDT bởi loài nấm trắng P. chrysosporium Một trong các con đƣờng phân hủy DDT đƣợc nghiên cứu khá kỹ trên đối tƣợng vi khuẩn Alcaligenes eutrophus A5, dƣới đây là cơ chế phân hủy thực hiện bởi vi khuẩn này. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25  Con đường phân hủy DDT bởi vi khuẩn Alcaligenes eutrophus A5 Chủng Alcaligenes eutrophus A5 có khả năng chuyển hoá cả o,p , - và p,p , -DDT. DDT bị oxy hoá bởi enzym dioxygenase tạo ra một dẫn xuất dihydrodiol- DDT và trải qua qúa trình phá vỡ vòng ở vị trí meta. Tiếp đó là một loạt các phản ứng trung gian tạo sản phẩm cuối cùng là 4- chlorobenzoic acid (Hình 1.6). Hình 1.6. Con đƣờng phân hủy DDT bởi Alcaligenes eutrophus A5 Sản phẩm cắt vòng màu vàng Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 5.2 Các điều kiện môi trƣờng ảnh hƣởng đến phân hủy sinh học DDT và các dẫn xuất của DDT Các yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng lớn đến sự phát triển của vi sinh vật. Đặc biệt các yếu tố môi trƣờng tại vùng phân lập có tác động lớn đến sự phát triển của vi sinh vật tại đó. Ở những vùng nhiệt đới, DDT bay hơi dễ hơn và vi sinh vật cũng phân hủy các chất ô nhiễm này nhanh hơn, DDT ở đất ẩm bị phân hủy nhanh hơn ở đất khô. Trong quá trình xử lý môi trƣờng thì vấn đề này càng đóng vai trò quan trọng và quyết định hiệu suất xử lý. Các yếu tố nhƣ nhiệt độ, độ pH môi trƣờng, nồng độ muối, nồng độ chất độc, các chất hoạt động bề mặt v.v. đóng vai trò quyết định trong quá trình phân hủy, chuyển hóa và khoáng hóa DDT. Trong tự nhiên không chỉ tồn tại một loại chất ô nhiễm thuộc hydrocacbon thơm đa nhân mà thƣờng chúng tồn tại dƣới dạng hỗn hợp. Do đó việc nghiên cứu khả năng phân hủy hỗn hợp DDT là điều cần thiết để xem ảnh hƣởng qua lại của chúng trong hỗn hợp cũng nhƣ nồng độ hỗn hợp của các chất ô nhiễm. Sự tồn tại của DDT có thể thúc đẩy hoặc ức chế quá trình phân hủy sinh học hoặc gây độc cho vi sinh vật. Các yếu tố quan trọng khác là nguồn dinh dƣỡng bao gồm C, N, P có sẵn trong môi trƣờng hay bổ sung thêm. Việc bổ sung các chất thêm nhƣ nguồn cacbon cũng tạo điều kiện tăng khả năng phân hủy sinh học của các chủng vi sinh vật phân hủy chất độc theo cơ chế đồng trao đổi chất, một số Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 chất thƣờng đƣợc bổ sung nhằm kích thích thêm quá trình phân hủy chất độc có thể kể đến glucose, acetate, pyruvate. Các muối N đóng một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình xử lý bằng phƣơng pháp phân hủy sinh học, việc bổ sung nguồn muối này đã làm tăng tốc độ phân hủy DDT. Nguồn N có thể thêm vào cả dạng vô cơ và hữu cơ [23]. Phốtpho cũng là một nguồn dinh dƣỡng cần thiết để tăng cƣờng quá trình phân hủy sinh học các chất ô nhiễm. Nó đƣợc sử dụng để tăng sinh khối tế bào, thƣờng bổ sung muối gốc PO4 3- . Nitơ và Phốtpho thƣờng bổ sung dƣới dạng muối (NH4)2HPO4. Hơn nữa, phốtpho nhƣ là một chất đệm pH để tạo pH thích hợp cho hoạt động của vi sinh vật nhằm tăng hoạt tính sinh học của chúng, do vậy làm tăng khả năng sống sót của vi sinh vật trong các môi trƣờng có điều kiện khác nhau. Ngoài ra tốc độ phân hủy các hợp chất hydrocacbon thơm đa nhân còn bị ảnh hƣởng mạnh bởi các chất hoạt động bề mặt. Chất hoạt động là một sản phẩm rất có giá trị đối với công nghệ sinh học và nó đã đƣợc ứng dụng rất rộng rãi đối với nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Đối với đất bị nhiễm độc, các chất hoạt động bề mặt có thể làm tăng khả năng phân hủy, nó phụ thuộc vào thời gian phân hủy và số lần các chất hoạt động bề mặt bám vào bề mặt chất độc [36]. Bên cạnh đó quá trình phân hủy sinh học của vi sinh vật còn phụ thuộc vào bản thân các vi sinh vật, phƣơng thức mà các vi sinh vật chuyển cơ chất qua màng tế bào. Ngoài cơ chế phân hủy DDT và dẫn xuất của DDT bởi các enzyme nội bào tức là phải chuyển các chất độc qua màng tế bào thì cơ chế xúc tác phân hủy DDT bằng các enzyme ngoại bào cũng đã đƣợc quan tâm. Trong đó ba enzyme ngoại bào LiP, MnP thuộc nhóm peroxidase và Lac thuộc nhóm oxidoreductase hiện nay đƣợc quan tấm nhiều nhất. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 6 LACCASE 6.1 Định nghĩa Laccase (p- benzenediol:oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) thuộc nhóm enzyme oxidase, cụ thể là polyphenol oxidase. Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử. Khác với phần lớn các enzyme khác, laccase có phổ cơ chất rất đa dạng, bao gồm diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, PCB, dioxin và cả các hợp chất vô cơ nhƣ iot. Các loại enzyme laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau rất khác nhau về mức độ glycosyl hóa, khối lƣợng phân tử và tính chất động học [35]. 6.2 Cấu trúc phân tử của laccase Một loài sinh vật có thể có nhiều dạng isozyme của laccase, các dạng isozyme này khác nhau về trình tự acid amine và một số tính chất về động học xúc tác. Nấm có thể tạo ra nhiều dạng isozyme laccase khác nhau cả về mức độ glycosyl hóa và cả thành phần các gốc carbonhydrate. Trametes versicolor có 5 dạng isozyme chỉ khác nhau về thành phần carbonhydrate, thành phần carbonhydrate của chúng thay đổi từ 10 – 45% so với khối lƣợng của thành phần protein. Phân tử laccase thƣờng là monomeric protein, chỉ một số là oligomeric protein, có khối lƣợng phân tử dao động trong khoảng 60 – 90 kD. Phần lớn laccase của nấm có bản chất là glycoprotein với hàm lƣợng carbonhydrate chiếm khoảng 10 – 25% [34]. Tuy vậy, tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng. Những nguyên tử đồng này đƣợc chia thành 3 nhóm: loại 1 (T1), loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp phụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 không tạo phổ hấp thụ điện tử, và có thể đƣợc hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh. Phân tử laccase thông thƣờng bao gồm 3 tiểu phần chính (vùng) A, B, C có khối lƣợng tƣơng đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá trình xúc tác của laccase. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và C. Trung tâm đồng một nguyên tử chỉ chứa 1 nguyên tử đồng T1, liên kết với một đoạn peptide có 2 gốc histidine và 1 gốc cystein. Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh nƣớc biển đặc trƣng. Trung tâm đồng 3 nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp nguyên tử đồng T3. Nguyên tử đồng T2 liên kết với 2 gốc histidine bảo thủ trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidine bảo thủ (Hình 1.7, 1.8) [35]. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 Hình 1.7. Hình ảnh không gian ba chiều của laccase từ M. albomyces Tiểu phần A, B, C đƣợc kí hiệu đỏ, xanh lục và xanh lá cây Hình 1.8. Trung tâm hoạt động của laccase Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 6.3 Cơ chế xúc tác của laccase Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử. Khác với phần lớn các loại enzyme khác, laccase có phổ đặc hiệu cơ chất khá rộng. Sự phù hợp của các cơ chất đối với laccase quyết định bởi hai nhân tố chính. Thứ nhất là sự phù hợp giữa cơ chất và nguyên tử đồng T1, thứ hai là sự phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa thế oxy-hóa khử giữa cơ chất và enzyme. Các đại lƣợng này phụ thuộc cấu trúc hóa học của cơ chất. Thế oxy hóa khử của laccase dao động trong khoảng 0,4 đến 0,8 V [9]. Cơ chất khử bị mất một điện tử nhờ xúc tác laccase thƣờng tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không bền này tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính laccase đó hoặc tiếp tục các phản ứng không cần xúc tác enzyme nhƣ hydrate hóa, phân ly hoặc polymer hóa. Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hóa cơ chất. Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+). Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời 4 electron từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptide bảo thủ His-Cys-His. Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nƣớc (Hình 1.9). Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Hình 1.9. Cơ chế xúc tác của laccase Ngoài ra cơ chế xúc tác có thể xảy ra theo một trong các cơ chế sau. Cơ chế đơn giản nhất có thể diễn ra khi các cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm. Tuy nhiên, các phần tử cơ chất thƣờng có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế khử quá lớn, vì vậy chúng không thể tiếp cận đƣợc trung tâm phản ứng của phân tử laccase. Trong trƣờng hợp này cần một hợp chất hóa học trung gian (mediator). Hợp chất hóa học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase và bị laccase oxy hóa thành dạng gốc tự do [52]. Sau đó mediator ở dạng oxy hoá nhận một điện tƣ̉ của cơ chất và trở thành khƣ̉, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xác tác. Ngƣợc lại, laccase sau khi cho mediator một điện tƣ̉ thì trở thành dạng khƣ̉, và sau đó bị oxy hoá thành dạng oxy hoá và tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác tiếp theo (Hình 1.10). Các mediator thƣờng phù hợp cho laccase là 3-Hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), N- hydroxybenzo-trialzone (HBT), N-hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid ( VLA) v.v [52]. Sƣ̣ tham gia của mediator đã làm tăng phổ cơ chất xúc tác và tính không đặc hiệu cơ chất của laccase. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Hình 1.10. Các kiểu xúc tác của laccase A. Chu kỳ xúc tác không có sự tham gia của các mediator B. Chu kỳ xúc tác với sự tham gia của các mediator Các chất ức chế của laccase thƣờng là các ion nhỏ nhƣ azide, cyanide, fluoride. Các ion này sẽ liên kết vào trung tâm đồng 3 nguyên và cản trở các dòng điện tử đi đến các nguyên tử này. Các chất ức chế laccase khác là ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), acid béo, tropolone, acid kojic và acid coumaric, nhƣng chúng chỉ có tác dụng ức chế ở nồng độ cao hơn. Các hợp chất chứa sulfhydryl nhƣ L-cystein, dithiothreitol và thioglycolic acid cũng đƣợc coi là các chất ức chế laccase. 6.4 Tính chất hóa sinh của laccase Hoạt tính xúc tác của enzyme đƣợc đặc trƣng bởi hằng số Michaelis - Menten (Km). Hằng số này của laccase dao động trong một giới hạn khá rộng, trong khoảng 2 – 500µM phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme và cơ chất. Giá trị Km thấp nhất đối với cơ chất là syringaldazine (một dạng dimer của hai phân tử 2,6-dimethoxyphenol liên kết với nhau bằng cầu nối azide). Ái lực đối với oxy thì ít phụ thuộc vào enzyme hơn và chỉ dao động trong khoảng 20 - 50µM. A B Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4 – 6 đối với cơ chất phenolic. Khi tăng pH sang vùng trung tính hoặc vùng kiềm thì hoạt tính của laccase bị giảm, nguyên nhân do anion nhỏ là ion hydroxide đã ức chế laccase. Mặt khác, tăng pH còn làm giảm thế oxy hóa khử của các cơ chất phenolic do đó cơ chất phenolic dễ bị oxy hóa bởi laccase hơn. Do vậy, hoạt tính laccase ở các pH khác nhau là kết quả của hai tác dụng đối lập của pH là sự tăng chênh lệch thế oxy hóa khử laccase – cơ chất và tác dụng ức chế trung tâm đồng ba nguyên tử của ion hydroxide. Đối với các cơ chất không phải phenolic nhƣ ABTS thì phản ứng oxy hóa không liên quan đến sự vận chuyển ion và do đó pH tối thích nằm trong khoảng 2 – 3. Ngƣợc lại, tính bền của laccase cao nhất trong khoảng pH kiềm nằm trong khoảng 8 – 9. Nhiệt độ bền của laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc của vi sinh vật. Nhìn chung, laccase bền ở 30 – 50oC và nhanh chóng mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 60oC. Laccase bền nhiệt nhất đƣợc phân lập chủ yếu từ các loài thuộc prokaryote ví dụ, thời gian bán hủy của laccase của Streptomyces lavendulae là 100 phút ở 70oC và của protein cotA từ loài Bacillus subtilis là 112 phút ở 80oC. Thời gian bán hủy của laccase có nguồn gốc nấm thƣờng là nhỏ hơn 1 giờ ở 70oC và dƣới 10 phút ở 80oC [9,35,43,55]. 6.5 Sự phân bố và một số vi sinh vật sinh laccase Laccase là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, chúng đƣợc tìm thấy ở thực vật, nấm, một số vi khuẩn và côn trùng. Laccase lần đầu tiên đƣợc phát hiện đầu tiên ở cây Rhus vernicifera. Việc nghiên cứu laccase trên đối tƣợng thực vật và nấm đảm rất phổ biến. Laccase từ nấm đƣợc nghiên cứu và khảo sát rất kỹ đặc biệt là laccase từ nấm đảm Basidomyces. Ngoài ra các các loài nấm nhƣ Ascomyces, Deuteromyces, basidomyces và các loài nấm có khả Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 năng phân hủy ligincellulose nhƣ Agaricus bisporus, Botrytis cinerea, Chaetomium themophilum, Coprius cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiate, Pleurotus ostrotus ostreatus, Pycnoporus cinnabarius, Trametes versicolor [35]. Tuy nhiên, các nghiên cứu này trên các đối tƣợng nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn lại không nhiều. Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase đƣợc miêu tả ở phụ lục 3 [21,25,38,44,56,60]. 6.6 Gene mã hóa laccase Trong vài thập kỷ gần đây, gene sinh tổng hợp laccase đã bắt đầu đƣợc nghiên cứu. Cho đến nay đã có hơn 100 gene sinh tổng hợp laccase đƣợc đánh giá và so sánh. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung trên đối tƣợng vi sinh vật. Năm 1998 gene laccase đầu tiên đƣợc phân lập và giải trình tự từ nấm đảm Neurospora crassa và nấm sợi Aspergillus nidulans. Tuy nhiên các gene tƣơng ứng với các protein laccase hoàn chỉnh mới chỉ có khoảng 20 gene, phần lớn trong số đó là từ nấm đảm [9,32,35,44,60] ( Phụ lục 4). Đối với nấm đảm và thực vật bậc cao, các gene laccase thƣờng có nhiều intron. Số lƣợng intron trong mỗi gene thƣờng từ 8 – 13 đoạn, mỗi đoạn có kích thƣớc khoảng 50 – 90 nucleotit. Ngoài ra cũng có những gene laccase chỉ có một intron nhƣ Neurospora crassai, ngƣợc lại Pleurotus ostreatus lại có đến 19 đoạn intron. Các gene điển hình mã hóa protein laccase thƣờng có kích thƣớc khoảng 500 – 600 axit amin. Ở nhiều chủng nấm trong bộ gene chứa nhiều gene mã hóa sinh tổng hợp laccase. Trametes villosa chứa ít nhất 5 gene mã hóa cho laccase, Coprinus cinereus chứa ít nhất 8 gene và Rhizoctonia solani, Pleurotuss sajor-caju chứa ít nhất là 4 gene mã hóa laccase. Tuy nhiên các gene này nằm Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 ở các allen khác nhau trên nhiễm sắc thể và các trình tự bảo thủ liên quan đến vị trí liên kết với các nguyên tử đồng lại đồng thời cũng có mặt trong các gene mã hóa các enzyme oxidase chứa nhiều nguyên tử đồng khác, chính những điều này đã gây khó khăn trong việc phân lập và xác định chính xác số gene mã hóa cho laccase. Sự biểu hiện của gene sinh tổng hợp laccase phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trƣờng. Với mỗi chủng khác nhau thì đòi hỏi điều kiện môi trƣờng thích hợp cho sinh tổng hợp laccase khác nhau. Nhƣ môi trƣờng giàu nitơ làm tăng quá trình sinh tổng hợp laccase ở chủng Pleurotus sajor-caju, nhƣng chủng Lentinula edodes lại có khả năng sinh tổng hợp laccase t ốt hơn trên môi trƣờn g có hàm lƣợng nitơ thấp . Đồng và các ion kim loại khác nhƣ Hg 2+ , Mg 2+ , Cd 2+ và một số hợp chất vòng thơm đƣợc xem là những nhân tố hoạt hóa mạnh quá trình sinh tổng hợp laccase. Quá trình hoạt hóa gene sinh tổng hợp laccase bởi các ion kim loại hoặc các hợp chất phenol chƣ́ng minh là đƣợc điều khiển bởi một trình tự điều hòa của vùng promoter của gene [32,35]. Gene mã hóa sinh tổng hợp laccase đã đƣợc chuyển vào nhiều đối tƣợng khác nhau nhƣ Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, A. nodulan, A. oryzae, cây thuốc lá v.v. Trong nghiên cứu mới nhất (2009) Xiaoshu Shao và cộng sự đã chỉ ra rằng, hoạt tính của laccase từ Shigella dysenteriae đƣợc biểu hiện trong Escherichia coli (Wlac) tăng từ 24,4 UI/mg lên 52,9 UI/mg sau khi thay thế hai axit amin Glu 106 bằng Phe 106 trong chuỗi xoắn anpha (WlacS). Với kỹ thuật đột biến xóa đoạn trong chuỗi xoắn anpha t ừ Leu 351 đến Gly 378 (WlacD), hoạt tính enzyme tăng 3,5 lần so với laccaseWlac). Đồng thời cả hai WlacS và WlacD đều bền nhiệt hơn Wlac [60]. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Trình tự gene mã hóa laccase có thể chia thành 3 nhóm chính là Ascomycete, Basidomycete và thực vật bậc cao. Tuy nhiên các nghiên cứu về gene mã hóa laccase ở prokaryote hiện nay không nhiều. 6.7 Ứng dụng của laccase Phƣơng pháp oxy hóa sinh học nhờ enzyme đƣợc xem là phƣơng pháp khả quan có thể thay thế các phƣơng pháp oxy hóa hóa học do chúng rất thân thiện với môi trƣờng và đặc biệt là do phản ứng bởi enzyme thƣờng rất đặc hiệu và có hiệu suất cao. Laccase là một trong các loại enzyme oxy hóa đƣợc ứng dụng khá phổ biến trong các ngành công nghiệp do chúng có phổ cơ chất rộng và sử dụng chất nhận điện tử cuối cùng là oxy phân tử chứ không phải cần các chất nhận điện tử đắt tiền khác nhƣ NAD(P)+. Laccase đƣợc sử dụng trong một số ngành nhƣ công nghiệp dệt nhuộm, công nghiệp hóa mỹ phẩm, hóa thực phẩm, dƣợc phẩm v.v. Laccase có tiềm năng cao trong công nghệ nano sinh học để tạo các biosensor có độ nhạy cao. Ngoài ra còn đƣợc sử dụng trong phân hủy các hợp chất lignincellulose và xử lý các chất ô nhiễm khó phân hủy [11,17,35,52,58]. Laccase rất hữu hiệu trong việc tham gia xúc tác phân hủy các chất độc thông qua quá trình oxy hóa đặc biệt là các chất phức tạp, không tan. Laccase có thể tham gia phân hủy các hợp chất phenol là chất thải của các quá trình sản xuất khác nhau nhƣ hóa dầu, sản xuất các hợp chất hữu cơ v.v. Laccase đƣợc cố định trên các vật liệu mang và hệ thống xúc tác laccase - mediator tỏ ra hiệu quả trong việc chuyển hóa các chất ô nhiễm chứa phenol và các hợp chất dẫn xuất clo phenol khác nhƣ các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân (polycyclic aromatic hydrocarbon – PAH), polychlorinated biphenyl (PCB) từ ngành công nghiệp dầu mỏ, thuốc nổ._.màu xanh) Kênh 1, 2, 3: DNA plasmit của các dòng khuẩn lạc màu trắng Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 91 M 1 2 Hình 3.32 Sản phẩm PCR từ DNA plasmit với cặp mồi EF4f và fung5r Kênh M: Marker 1kb Kênh 1, 2: Sản phẩm PCR kiểm tra dòng 1 và 3 1 2 C Hình 3.33 DNA plasmit mang gen 18S rRNA của chủng FNA1 Kênh 1, 2: DNA plasmit sau khi làm sạch Kênh C: Đối chứng Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 92 6.4 So sánh trình tự đoạn gen mã hóa 18S rRNA của chủng FNA1 Trình tự đoạn gen 18S rRNA (534 nucleotid) của chủng FNA1 đã đƣợc xác định, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.34. Trình tự đoạn gen mã hoá 18S rRNA của chủng FNA1 đƣợc đăng ký trên Genbank với mã số GQ906535. So sánh với các trình tự gen 18S rRNA của các chủng vi nấm đã công bố trên các ngân hàng dữ liệu Genbank, EMBL cho thấy chủng FNA1 có mức tƣơng đồng cao với các chủng vi nấm thuộc ngành nấm nang Ascomycetes, ngành phụ Pezizomycotina, chi Aspergillus. Dựa trên cơ sở so sánh mức độ tƣơng đồng một phần trình tự gen mã hóa 18S rRNA chủng FNA1 với một số chủng vi nấm đại diện, sử dụng phần mềm Clustal X để xây dựng cây phát sinh chủng loại để thấy rõ đƣợc mối quan hệ phát sinh chủng loại của chủng nấm sợi FNA1(Hình 3.35). Nhƣ vậy, dựa trên các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và so sánh một phần trình tự gen mã hóa 18S rRNA của chủng FNA1 thì ch ủng này thuộc chi Aspergillus và đƣợc đặt tên là Aspergillus sp. FNA1. GGAAGGGGTGTATTTATTAGATAATCTGTGCTCCTTCTTCGAGCTCCTTGGTGATTCATAA TAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTC GATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGA GAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCC CGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTAATTGGAAT GAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGG TAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGG TCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAACCT CATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGGACTTTTACA Hình 3.34 Trình tự đoạn gen mã hóa 18S rRNA của chủng FNA1 Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 93 Hình 3.35 Cây phát sinh chủng loại của chủng Aspergillus sp. FNA1 Nấm thuộc chi Aspergillus có nhiều chủng có khả năng phân hủy DDT hay các chất có cấu trúc tƣơng tự. Aspergillus conicus làm biến đổi 55,1% bis(4-chlorophenyl)acetic acid (DDA) thành các sản phẩm hòa tan trong nƣớc chƣa xác định và chƣa chiết tách đƣợc. Aspergillus niger và Penicillium brefeldianum chuyển hóa lần lƣợt 12,4 và 24,6% DDT thành các sản phẩm không xác định và hòa tan trong nƣớc. Aspergillus niger Aspergillus sp. FNA1 Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 94 phân hủy 4, 4’-dichlorobenzophenone (DBP) thành 4-chlorobenzophenone và methylated 4-chlorobenzophenone [47]. Các minh chứng trên cho thấy vai trò rất qua n trọng của nấm sợi , đặc biệt là các đại diện của chi Aspergillus trong phân hủy sinh học DDT và các sản phẩm trong chu trình khoáng hóa DDT . Trên cây phát sinh chủng loại cho thấy chủng Aspergillus sp. FNA1 có quan hệ gần gũi với một số chủng nhƣ Aspergillus sp. FNA4, Aspergillus sp. FNA33, Aspergillus sp. FBH11, đây đều là các chủng có khả năng phân hủy các chất thuộc POPs. Đặc biệt 2 chủng Aspergillus sp. FNA4, Aspergillus sp. FNA33 là 2 chủng đƣợc phân lập cùng địa điểm ô nhiễm với chủng FNA1, các chủng này có khả năng phân hủy lần lƣợt 94,48 % hỗn hợp DDT trong 14 ngày và 88 % HCH, trong khi chủng FNA1 phân hủy 97,23 % DDT; 97,19 DDD; và 92,69 % DDE trong 7 ngày nuôi cấy. Cả 3 chủng FNA4, FNA33 và FBH11 đều đƣợc mô tả là có khả năng sinh laccase, chủng FNA4 sinh laccase với hoạt tính 15,4 U/l, chủng FNA33 là 4,3 U/l [3,4,5], chủng FBH11 có độ tƣơng đồng 98 % đƣợc phân lập từ đất ô nhiễm thuốc diệt cỏ/dioxin sinh laccase với hoạt tính cao. Một số chủng nấm sợi thu ộc chi Aspergillus đƣợc công bố là có khả năng sinh enzyme ngoại bào là Aspergillus terreus LD-1 và Aspergillus nidulans. Chủng Aspergillus tereus sinh ra hai loại enzyme ngo ại bào là MnP và Laccase trong điều kiện kiềm (pH từ 11 đến 12.5), hoạt tính enzyme trung bình của hai loại enzyme này là 0,384 U/mg [40]. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 95 KẾT LUẬN 1. Dựa trên các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và so sánh một phần trình tự gen mã hóa 18S rRNA, chủng nấm sợi FNA1 đƣợc xác định thuộc chi Aspergillus và đƣợc đặt tên là Aspergillus sp. FNA1. Trình tự đoạn gen mã hóa 18S rRNA của chủng Aspergillus sp. FNA1 đƣợc đăng ký trên Genbank với mã số GQ906535. 2. Cả 3 chủng FNA1, FNA2 và FNA3 đều có khả năng sinh laccase và MnP, chủng FNA1 không sinh LiP. Trên môi trƣờng sàng lọc, hoạt tính laccase lần lƣợt là 5,4; 2,9; 3,3 (U/l), hoạt tính MnP lần lƣợt là 26,9; 6,05; 13,4 (U/l), hoạt tính LiP của FNA2 và FNA3 là 4,15 và 2,07 (U/l). 3. Aspergillus sp. FNA1 phân hủy DDT theo cơ chế đồng trao đổi chất, sau 7 ngày nuôi cấy chủng này loại bỏ DDE, DDD và DDT lần lƣợt là 92,69 %, 97,19 % và 97,23 % so với mẫu đối chứng. 4. Aspergillus sp. FNA1 phát triển tốt nhất ở 37oC, pH 5, nồng độ NaCl 0,1 %, nồng độ DDT 200 ppm, ngoài ra còn phát triển tốt trên môi trƣờng chứa 2,4-D, 2,4,5-T, pyren, phenanthren, anthracene và dịch chiết. Chủng FNA1 không phát triển trên nguồn carbon là lactose và cellulose, phát triển yếu trên nguồn nitơ là urê. 5. Aspergillus sp. FNA1 sinh tổng hợp laccase trong điều kiện 30oC, pH 5, nồng độ NaCl 0,1 %, glucose 0,1 %, CuSO4 1 mM và nguồn chất ô nhiễm là DDT, nguồn carbon là saccharose, nguồn nitơ là NaNO3 và KNO3. 6. Môi trƣờng thích hợp nhất để Aspergillus sp. FNA1 sinh tổng hợp laccase là môi trƣờng Czapek nghèo có bổ sung Tween 80 0,2 %, hoạt tính laccase đạt 2608,3 U/l sau 1 ngày nuôi cấy. 7. Laccase từ chủng FNA1 có pH tối ƣu 1,5, nhiệt độ tối ƣu 50oC, bền trong khoảng pH 4 – 5 và nhiệt độ dƣới 50 oC. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 96 KIẾN NGHỊ 1. Nghiên cứu các gen chức năng tham gia quá trình phân hủy DDT và gen mã hóa laccase. 2. Nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học các loại thuốc trừ sâu khác của chủng FNA1, đồng thời nghiên cứu khả năng sử dụng enzyme ngoại bào trong việc loại bỏ thuốc nhuộm màu và phân hủy các chất ô nhiễm. 3. Tối ƣu các điều kiện lên men để sản xuất laccase với lƣợng lớn. 4. Tiếp tục nghiên cứu các đặc tính hóa sinh của laccase từ chủng FNA1. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 97 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trƣơng Nam Hải, Lê Quang Huấn, 2003. áp dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam. Nxb KH&KT Hà Nội: 325- 329 2. Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Đƣơng Nhã, Đặng Thị Cẩm Hà, 2004. Nấm sợi phân hủy hydrocarbon thơm đa nhân phân lập từ cặn dầu thô của giếng khai thác dầu, Vũng Tàu. Tạp chí Công nghệ Sinh học, số I(tập 2): 255- 264. 3. Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Thanh Thủy, Ngô Xuân Quý, Nghiêm Xuân Trƣờng, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2004) Khả năng phân hủy 2,4-D và dibenzofuran của chủng nấm sợi FDN20. Tạp chí công nghệ sinh học 2 (4): 517-528 4. Trần Thị Nhƣ Hòa, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2008), “Phân loại hai chủng vi sinh vật từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin khử độc trong bioreactor hiếu khí”, Tạp chí công nghệ sinh học, tập(số), trang. 5. Nghiêm Ngọc Minh, Vũ Mạnh Chiến, Đặng Thị Cẩm Hà (2006), “Nghiên cứu phân loại và khả năng sử dụng DDT của chủng XKNA21 đƣợc phân lập từ đất ô nhiễm DDT”, Tạp chí công nghệ sinh học, 4(2), 257-264 6. Nguyễn Nguyên Quang, Đặng Thị Cẩm Hà (2009), “Phân lập, phân loại và khả năng phân hủy DDT, DDD, DDE của một số chủng vi sinh vật”, Tạp chí công nghệ sinh học, đang in. 7. Mai Thanh Truyết. Ô nhiễm thuốc sát trùng: DDT. 8. Mai Thanh Truyết, Nguyễn Minh Quang. Phát triển và môi trường bền vững ở Việt Nam. Tài liệu Tiếng Anh 9. Adinarayana Kunamneni et al (2008), “Engineering and Application of fungal laccase for organic synthesis”, Microbial Cell Factories. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 98 10. Aislabie J, Davison A D, Boul H L, Franzmann P D, Jardine D R, and Karuso P (1999), “Isolation of Terrabacter sp. Strain DDE-1, Which metabolizes 1,1-dichloro-2,2-bis (4-chlorophenyl) ethylene when induced with biphenyl”, Appl and Environ Microbiol, 65, pp. 5607-561. 11. Andrea Zille (2005), Laccase reactions for textile applications, Doctor thesis, University of Minho, Italia 12. Ben- Dyke R., Sanderson D., Noakes D., (1970), ”Acute toxicity data for pesticides”, World Rev Pestic Cont, 9, pp.119- 127. 13. Bidleman T., Christensen E., Billings W. et al., (1981). Atmospheric transport of organochlorines in the North Atlantic gyre, J. Mar Res 39, pp.443- 464. 14. Bononi, V. L. R., Machado, K. M. G., Matheu, D. R. (2005), “Ligninolytic enzymes production and Remazol Brilliant Blue R decolorization by tropical Brazilian Basidiomycetes fungi”, Brazilian journal of microbiology 36, pp.246-252. 15. Bumpus and Aust (1987), “Biodegradation of DDT [1,1,1- trichloro - 2,2- bis (4-chlorophenyl) ethane] by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium”, Appl Environ Microbiol, 53(9), pp.2001–2008. 16. Christiane Galhaup, Harald Wagner Barbara, Hinterstoisser and Dietmar Haltrich (2002), “Increased production of laccase by the wood-degrading basidiomycete Trametes pubescens”, Enzyme and Microbial Technology, 30(4), pp.529-536. 17. Crawford, D.L. and Crawford, R.L. (1978), “Microbial degradation of lignocellulose the lignin component”, Appl. Env. Microbiol, 31(5), pp.714-717. 18. D. A. Wood (1980), “Production, Purification and Properties of Extracellular Laccase of Agaricus bisporus”, Journal of General Microbiology 117, pp.327-338. 19. Gerd J. Mander, Huaming Wang, Elizabeth Bodie, Jens Wagner, Kay Vienken, Claudia Vinuesa, Caroline Foster, Abigail C. Leeder, Gethin Allen, Valerie Hamill, Giselle G. Janssen, Nigel Dunn-Coleman, Marvin Karos, Hans Georg Lemaire, Thomas Subkowski, Claus Bollschweiler, Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 99 Geoffrey Turner, Bernhard Nüsslein, and Reinhard Fischer (2006), “Use of Laccase as a Novel, Versatile Reporter System in Filamentous Fungi”, Applied and Environmental Microbiology, 72(7), pp.5020-5026. 20. Giraud, Guiraud P., Kadri M., Blake G., Steiman S., (2001), “Biodegradation of phenanthrene and fluoranthene by fungi isolated from an experimental constructed wetland for wastewater treatment”, Wat. Res., 35(17), pp.4126-4136. 21. Gladys Alexandr, Igor B. Zhulin (2000), “Laccases are widespread in bacteria”, Trend in Biotechnology, 18(2), pp.41-42. 22. Gochev, V. K., A. I. Krastanov (2007), “Isolation of Laccase Producing Trichoderma Spp”, Bulg. J. Agric. Sci., 13, pp.171-176 23. Guarro Josep, Josepa Gene, và Alberto M. Stchigel. Developments in Fungal Taxonomy. Unitat de Microbiologia Spain. 24. Hans E. Schoemaker, Klaus Piontek (1996), “On the interaction of lignin peroxidase with lignin”, Pure & Appl. Chem, 68(11), pp.2089-2096. 25. Harald Claus (2003), “Laccase and their occurrence in prokaryotes”, Arch Microbiol, 179, pp.145-150. 26. Hestbjerg Helle, Willumsen Pia Arentsen, Christensen Mette, Andersen Ole and Jacobsen Carsten Suhr (2003), “Bioaugmentation of tar- contaminated soils under field conditions using Pleurotus ostreatus refuse from commercial mushroom production”. Environmental Toxicology and Chemistry 22(4), pp.692-98. 27. Hirofumi Hirai , Sawako Nakanishi, Tomoaki Nishida (2004), “Oxidative dechlorination of methoxychlor by ligninolytic enzymes from white-rot fungi”, Chemosphere, 55(4), pp.641-645 28. Hongman Hou, Jiti Zhou, Jing Wang, Cuihong Du, Bin Yan (2004), “Enhancement of laccase production by Pleurotus ostreatus and its use for the decolorization of anthraquinone dye”, Process Biochemistry, 39(11), pp.1415-1419 Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 100 29. J.M. Aislabie, N.K.Richards, H.L.Boul (1997), “Microbial degradation of DDT and its residues- a review”, New Zealand Journal of Agricultural Research, pp.271- 275. 30. Jan D. V. E., Gabriela F. D., Anneke K. – W., Eric S (2000), “Analysis of the dynamics of fungal communities in soil via fungal – specific PCR of soil DNA followed by denaturing gradient gel electrophoresis”, Journal of Microbiological Methods, 43, pp.133 – 151. 31. Johnson B. Thomas and Jack O. Kennedy (1973), “Biomagnification of p, p'-DDT and Methoxychlor by Bacteria”, Appl Environ Microbiol, 26(1), pp.66-71. 32. José Renato P . Cavallazzi, Catarina M. Kasuya, Marcos A. Soares, (2005), “Screening of inducers for laccase production by Lentinula edodes in liquid medium”, Brazillan Journal of Microbiology 36, pp.383-387. 33. Kizhekkedathu Narayanan Niladevi, Parukuttyama Prema (2005), “Mangrove Actinomyces as the source of Ligninolytic Enzymes” Actinomycestologica, 19, pp.40 –47. 34. Klaus Piontek, Matteo Antorini, Thomas Choinowski Crystal (2002), “Structure of a Laccase from the FungusTrametes versicolor at 1.90-Å Resolution Containing a Full Complement of Coppers”, The Journal of Biological Chemistry, 277,pp.37663-37669. 35. Laura-Leena Kiiskinen (2005), “Characteration and heterologuos production of novel laccase from Melanocarpus albomyces”, Doctor Thesis, Helneski University of Technology. 36. Lucier G.W., Trischer A. M., Van den Heuvel J.P., et al., (1992), “Organohalogen compounds: Extended abstracts of 12th Intern. Symp. On dioxins and related compounds”, Tampere: Finish Institute of occupational heath, 10, pp.3-6. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 101 37. M. Enriqueta Arias, María Arenas, Juana Rodríguez, Juan Soliveri, Andrew S. Ball, and Manuel Hernández (2003), “Kraft Pulp Biobleaching and Mediated Oxidation of a Nonphenolic Substrate by Laccase from Streptomyces cyaneus CECT 3335”, Applied and Environmental Microbiology, 69(4), pp.1953-1958. 38. Marie-Francois Hullo, Ivan Moszer, Antoine Danchin and Isabelle Martin-verstraete (2001), “Cot A of Bacillus subtilis is a copper-depedent laccase”. Journal of Bacteriology, pp.5426-5430. 39. Marièlle Bar (2001), “Kinetics and physico-chemical properties ò white- rot fungal laccases”, doctor thesis. 40. Mario Scherer, Reinhard Fischer (2001), “Molecular characterization of a blue-copper laccase, TILA, of Aspergillus nidulans”, FEMS Microbiology Letters, 199, pp.207-213. 41. Nadeau Lloyd J, Sayler Gary S and Spain J C (1998), “Oxidation of 1,1,1-trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)ethane (DDT) by Alcaligenes eutrophus A5”, Archives of Microbiology, 171(1), pp.44-49. 42. Nadeau, L. J.; Menn, F- M.; Breen, A.; Sayler, G.S., (1994). “Aerobic degradation of DDT by Alcaligenes eutrophus A5”, Applied and environmental microbiology 60: 51- 55. 43. O. V. Morozova, G. P. Shumakovich, M. A. Gorbacheva, S. V. Shleev, and A. I. Yaropolov (2007), ““Blue” Laccases”, Biochemistry (Moscow), 72(10), pp.1136-1150. 44. P. Sharma, R. Goel, N. Capalash (2007), “Bacterial laccase”, World J Microbiol Biotechnol, 23, pp.823-832. 45. Pereira W., Domagalski J., Hostettler F., et al., (1996), “Occurrence and accumulation of pesticides and organic contaminants in river sediment, water and clam tissues from the San Joaquin River and tributaries, California”, Environ Toxicol Chem, 15(2), pp.172- 180. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 102 46. PJ Collins, MJJ Kotterman, JA Field and ADW Dobson (1996), “Oxidation of Anthracene and Benzo[a]pyrene by Laccases from Trametes versicolor”, Appl. Environ. Microbiol.,62(12), pp.4563-4567. 47. R V Subba-Rao and M Alexander (1985) “Bacterial and fungal cometabolism of 1,1,1-trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)ethane (DDT) and its breakdown products”, Applied and Environmental Microbiology 49(3), pp.509-516. 48. Rochkind- Dubinsky, M.L.; Sayler, G.S.; Blackburn, J.W., 1987. Microbiological decomposition of chlorinated aromatic compounds. Microbiology series, vol. 18, New York, Marcel Dekker: pp. 153- 162. 49. S. Sadhasivam, S. Savitha, K. Swaminathan, Feng-Huei Lin (2008), “Production, purification and characterization of mid-redox potential laccase from a newly isolated Trichoderma harzianum WL1”, Process Biochemistry 43, pp.736–742. 50. S. Tagger, C. Périssol, G. Gil, G. Vogt and J. Le Petit (1998) “Phenoloxidases of the white-rot fungus Marasmius quercophilus isolated from an evergreen oak litter (Quercus ilex L.)”, Enzyme and Microbial Technology, 23(6), pp.372-379. 51. Sambrook J., Russell D.W. (2001), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 52. Sergio Riva (2006), “Laccases: Blue enzymes for green chemistry”, Trends in Biotechnology, 24(5), pp.219-226. 53. Shah, M. M.; Barr, D. P.; Chung, N.; Aust S.D., (1992),“ Use of white rot fungi for the degradation of environmental cheicals”, Toxicology letters, 64/65, pp.493- 501. 54. Staples C., Werner A., Hoogheem T., (1985) “Assessment of priority pollutant concentrations in the United States using STORET database”, Environ Toxicol Chem 4, pp.131- 142. 55. Susana Rodríguez Couto and José Luis Toca-Herrera (2009), “Lacasses in the textile industry”, Biotechnology and Molecular Biology Reviews, 1(4), pp.115-120. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 103 56. Tereza Skálová et al, (2009), “The structure of small laccase from streptomyces coelicolor reveals a link between laccase and nitrite reductases”, Journal of Molecular Biotechnology, 385, pp.1165-1178. 57. The Use and Effectiveness of Phytoremediation to Treat Persistent Organic Pollutants (2005), Kristi Russell Environmental Careers Organization. 58. Timothy P.Ruggaber, Jeffrey W. Talley (2006), “Enhancing Bioremediation with enzymatic Processes”, Practice periodical of hazardous, toxic, and radioactive waste management. 59. Toxicology profile for DDT, DDE, DDD, pp. 1- 231. 60. Xiaohu Shao et al (2009), “Deletion and site-directed mutagnesis of laccase from Shigella dysenteriae results in enhanced enzymatic activity and thermostability”, Enzyme and Microbial Technology, 44, pp.274-280. 61. Y. Z. Xiao, Q. Chen, J. Hang, Y. Y. Shi1, Y. Z. Xiao, J. Wu, Y. Z. Hong, Y. P. Wang (2004), “Selective induction, purification and characterization of a laccase isozyme genes from Trametes sp. AH28-2 and analyses of their differential expression”, Applied Microbiology and Biotechnology 71, pp.493-501. 62. Yi Huang, Xi Zhao and Shengji Luan (2007), “Uptake and biodegradation of DDT by 4 ectomycorrhizal fungi”, Sicence of the total enviroment 358, pp.235-241. 63. Zaidi R., Baquar. And Imam H. S., (1999), “Factors affecting microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocacbon phenanthrene in the Caribbean coastal water”, Marine Pollution Bulletin, 38, pp.737- 742. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 104 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Đặc tính lý - hóa một số đồng phân của DDT Đặc tính p,p,-DDT p,p,-DDE p,p,-DDD o,p,- DDT o,p,-DDE o,p-DDD Khối lƣợng phân tử 354.5 318.03 320.05 354.49 318.03 320.05 Màu Tinh thể bé,bột trắng Tinh thể bé, bột trắng Tinh thể bé, bột trắng Tinh thể bé, bột trắng ND ND Trạng thái vật lý Rắn Rắn Rắn Rắn Rắn ND Nhiệt độ sôi Phân hủy 336 0C 3500C ND ND ND Khối lƣợng riêng d(g/cm 3 ) 0.98-0.99 ND 1.385 0.98-0.99 ND ND Mùi Nhẹ ND ND ND ND ND Độ tan trong nƣớc 0.025mg/l (25 0 C) ND ND 0.085mg/l (25 0 C) 0.14mg/l (25 0 C) 0.1mg/l (25 0 C) Độ tan trong dung môi hữu cơ Ít tan trong etanol, tan tốt trong etylete và acetone Tan tốt trong chất béo và các dung môi hữu cơ khác ND ND ND Tan trong etanol, iso octan, cacbon- tetraclorit Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 105 Áp suất bay hơi 1.6x10 -7 20 0 C,torr 6x10 -6 25 0 C,torr 1.35x10 6 25 0 C,torr 1.1x10 -7 20 0 C,torr 6.2x10 -6 25 0 C,torr 1.94x10 6 30 0 C,torr Phụ lục 2. Các vi sinh vật sử dụng DDT Phụ lục 3. Vi sinh vật sinh laccase Nấm đảm Nấm sợi Xạ khuẩn Vi khuẩn Phanerochaete chrysosporium Melanocarpus albomyces Streptomyces lavendulae Bacillus licheniformis Pycnoporus cinnabarinus Fusarium oxysporum Streptomyces psammoticus Bacillus halodurans Rhizotonia solani Aspergillus nidulans Streptomyces Thermus Vi khuẩn Nấm Xạ khuẩn Alcaligenes eutrophus A5 Nocardia .sp Streptomyces aureofaciens Arthrobacter. Sp Phanerochaete chrysosporium Streptomyces viridochromogenes Bacillus. Sp Trichoderma viridae Streptomyces annamoneus Cylindrotheca closterium Sacharomyces cerevisiae Streptomyces chromofuscus Enterobacter aerogenes Fusarium solami Enterobacter cloacae Aspergillus conicus Eschrichia coli Aspergillus niger Klebsiella pneumoneae Leccinum scabrum Klebsiella pneumoniae Gloeophyllum trabeum Pseudomonas putida Penicillium brefeldianum Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 106 viridosporus thermophilus Trametes villosa Trichoderma harzianum Streptomyces coelicolor Escherichia coli Trametes versicolor Aspergillus niger Bacillus subtilis Pleurotus ostreatus Aspergillus terreus Lentinula edodes Pholiota spp. Agaricus bisporus Peniophora spp. Botrytis cinerea Mauginiella sp. Phụ lục 4. Gene mã hóa laccase Tên chủng Tên gene laccase Tên chủng Tên gene laccase Bacillus subtilis cotA Basidiomycete PM1 lac1 Ceriporiopsis subvermispora Ics-1 Podospora anserina lac2 Coprinus cinereus lcc1 Populus euramericana lac90 Cryptococcus neoformans CNLAC1 Rhizoctonia solani lcc4 Gaeumannomyces graminis var. tritici LAC2 Trametes pubescens lap2 Marasmius quercophilus lac1 Trametes trogii lcc1 Myceliophthora thermophila lcc1 Trametes versicolor lccI Neurospora crassa SalI Trametes versicolor lcc2 Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 107 Phlebia radiata lac1 Trametes villosa lcc1 Pleurotus ostreatus poxa1b Trametes villosa lcc2 Pleurotus ostreatus Poxc Streptomyces lavendulae Poxb Phụ lục 5. Một số kỹ thuật phân loại hiện đại Thành phần tế bào Phƣơng pháp phân tích Phạm vi phân loại DNA nhiễm sắc thể Thành phần Bazơ (%G+C) Chi Biến tính DNA : DNA Loài Các phần DNA đƣợc cắt bằng enzym giới hạn Loài và dƣới loài Đa hình chiều dài các đoạn giới hạn của RNA riboxom RNA riboxom Trình tự nucleotit Loài, chi và trên chi Lai DNA : rRNA Protein Trình tự axit amin Loài, chi và trên chi So sánh bằng phản ứng huyết thanh Loài và chi Các kiểu điện di Điện di enzym đa vị trí Các dòng trong loài Thành tế bào Cấu trúc peptidoglucan Loài và chi Polysaccharid Axít teichoic Màng Axít béo Loài và chi Lipid phân cực Axít mycolic Isoprenoid quinones Các sản phẩm trao đổi chất Axít béo Loài và chi Toàn bộ tế bào Sắc kí lỏng pyrolysis Pyrolsis khối phổ Loài và dƣới loài Phụ lục 6. Xác định hoạt tính LiP, MnP Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 108 Xác định hoạt tính enzyme LiP Thành phần phản ứng: Thành phần phản ứng Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm Đệm kali phosphate PPB (50 mM, pH = 7) 500 µl 500 µl 4-aminoantipyrine, 0,164 mM 50 µl 50 µl 2,4-DCP 3 mM 200 µl 200 µl Dịch enzyme 200 µl 200µl H2O2 4 mM 0 µl 50 µl Nƣớc khử ion 50 µl 0 µl Phản ứng diễn ra khi cho H2O2 vào hỗn hợp, giá trị OD đo sau 1 phút. Công thức tính:    E fpuCM V DVODOD U 610)( Trong đó: U: Hoạt độ enzym (U/l) ε: hệ số hấp thụ, ε510 = 21647 M -1 cm -1 Vpu: Tổng thể tích phản ứng (1 ml) VE: Thể tích enzyme (0,2 ml) ODM: Giá trị OD đo đƣợc của mẫu thí nghiệm ODC: Giá trị OD đo đƣợc của mẫu đối chứng Df: Độ pha loãng Xác định hoạt tính MnP Thành phần phản ứng: Thành phần phản ứng Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm Đệm kali phosphate PPB (100 mM, pH = 7) 3 ml 3 ml MnSO4 0,1 mM 200 µl 200 µl Phenol đỏ 0,1 mM 300 µl 300 µl Dịch enzyme 1 ml 1 ml H2O2 50 mM 0 µl 500 µl Nƣớc khử ion 500 µl 0 µl Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 109 Phản ứng diễn ra khi cho H2O2 vào hỗn hợp, sau 1 phút 30 giây dừng phản ứng bằng cách cho 40 µl NaOH 5M vào 1 ml mẫu, xác định giá trị OD ở bƣớc sóng 610 nm. Công thức tính:    5,1 10)( 6 E fpuCM V DVODOD U Trong đó: U: Hoạt độ enzyme (U/l) ε: hệ số hấp thụ, ε610 = 4460 M -1 cm -1 Vpu: Tổng thể tích phản ứng (5 ml) VE: Thể tích enzyme (1 ml) ODM: Giá trị OD đo đƣợc của mẫu thí nghiệm ODC: Giá trị OD đo đƣợc của mẫu đối chứng Df: Độ pha loãng Phụ lục 7. Phƣơng pháp chiết dịch chiết từ đất ô nhiễm Cân khoảng 10g đất nhiễm chất độc hóa học (1,5DN5) thu nhận từ sân bay Đà Nẵng đã đƣợc làm khô vào bình tam giác, bổ sung 15g Na2SO4 để tiếp tục làm khô mẫu. Sau khi mẫu khô hoàn toàn bổ sung 45ml dung môi Methanol : Toluen = 1 : 4 để chất độc khuếch tán ra ngoài, siêu âm mẫu đất 30 phút, đậy nắp và lắc 2 giờ hoặc hơn, sau đó để lắng, ly tâm tách dịch, bổ sung H2SO4 với tỉ lệ 1 : 1 về thể tích so với tổng thể tích dung dịch trên để oxy hóa. Khi dung dịch tách làm hai pha thì dùng phễu chiết để lấy pha trên và bảo quản trong lọ tối màu. Phụ lục 8. Quy trình biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào E. coli Các bƣớc thực hiện theo quy trình và hóa chất của “PCR cloning kit” hãng Fermentas. Chuẩn bị tế bào khả biến và môi trường nuôi cấy: Ngày trước biến nạp: Nuôi 1 khuẩn lạc vi khuẩn E.coli (bất kì chủng nào) trong môi trƣờng C, lắc 37oC qua đêm. Ngày biến nạp: Làm ấm môi trƣờng C trong tube ở 37oC ít nhất 20 phút và làm ấm đĩa thạch LB có bổ sung kháng sinh ampicilin (100 µl/ml) ở 37oC ít nhất 20 phút trƣớc khi gạt. Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 110 Quy trình biến nạp: Bƣớc 1: Bổ sung 150 µl dịch nuôi qua đêm vào 1,5 ml môi trƣờng C đã làm ấm. Lắc ở 37 oC trong 20 phút. Bƣớc 2: Ly tâm 6000 vòng trong 4 phút ở 4 oC, loại dịch nổi Bƣớc 3: Trộn đều tế bào trong 300 µl dung dịch T. Ủ 5 phút trong đá. Bƣớc 4: Ly tâm 6000 vòng trong 4 phút ở 4 oC, loại dịch nổi Bƣớc 5: Trộn đều tế bào trong 120 µl dung dịch T. Ủ 5 phút trong đá. Bƣớc 6: Lấy 2,5 µl sản phẩm ligation vào ống mới làm lạnh trong đá 2 phút. Bƣớc 7: Bổ sung 50 µl tế bào đã chuẩn bị vào ống chứa sản phẩm ligation trên, ủ trong đá 5 phút Bƣớc 8: Gạt ngay ra đĩa LB-ampicillin, có bổ sung thêm X-gal và IPTG. Ủ 37 oC qua đêm. Phụ lục 9. Hoạt tính laccase Ảnh hƣởng của nhiệt độ Nhiệt độ (oC) 28 30 37 42 Hoạt tính (U/l) 7 12.2 10.7 1.3 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy pH 2 3 4 5 6 7 8 9 Hoạt tính (U/l) 0 2.6 3.2 111.1 100 3.4 1.4 3.5 Ảnh hƣởngnồng độ NaCl NaCl % 0 0.1 1 5 10 Hoạt tính 5.8 10.4 2.6 1.4 0.04 Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 111 (U/l) Ảnh hƣởng của nồng độ DDT DDT ppm 50 100 200 300 Hoạt tính (U/l) 7 6,6 7,1 6,8 Ảnh hƣởng của nồng độ glucose Glucose % 0 0,1 0,5 1 2 3 Hoạt tính (U/l) 0 7,5 6,5 6 0,2 0 Ảnh hƣởng của các chất cảm ứng Chất cảm ứng guiaiacol veratyl alcohol CuSO4 Hoạt tính (U/l) 7,6 2,9 11 Ảnh hƣởng của chất hoạt động bề mặt Chất hoạt động bề mặt Tween 80 Nƣớc bồ kết Hoạt tính (U/l) 1 ngày 2608,3 0,4 2 ngày 0,4 0,5 4 ngày 6,5 3,8 6 ngày 4,8 3,1 Động thái sinh tổng hợp laccase Ngày 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hoạt tính (U/l) 0 2608,3 0,4 2,5 6,5 194,4 4,8 2,6 7,5 6,3 2,25 Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 112 Ảnh hƣởng của nguồn carbon Carbon Glucose Saccharose lactose Tinh bột Khoai tây Cao malt Cellulose Hoạt tính (U/l) 8,6 22,2 1,8 4,3 3,7 1,1 3,3 Ảnh hƣởng của nguồn nitơ Nitơ NaNO₃+KNO₃ Cao men Cao thịt Đậu tƣơng Urê NH₄NO₃ Hoạt tính (U/l) 22,2 1,5 1,1 1,7 0,6 0,9 Môi trƣờng thay thế Môi trƣờng MEG YS SG PG Hoạt tính (U/l) 11,3 6,2 21,3 5,8 pH tối ƣu pH 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 Hoạt tính (U/l) 0,02 3,2 7,5 28,2 503,1 1552,8 2355,6 2802,8 1969,4 Nhiệt độ tối ƣu Nhiệt độ (oC) 32 40 50 60 70 80 90 Hoạt tính (U/l) 1354,2 1877,3 2532,4 2307,9 1289,3 914,4 905,1 Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 113 Độ bền pH pH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hoạt tính (U/l) 650 1075 1472 2100 1825 1416,7 1386 1425 1472 1425 Độ bền nhiệt Nhiệt độ (oC) 50 60 80 90 Hoạt tính (U/l) 10 phút 2508 2370.37 1333.333 1370.37 20 phút 2394 1958.333 1120.37 1212.963 40 phút 2453 1287.037 1263.889 1018.519 60 phút 2409 1259.259 1185.185 1074.074 ._.