Nghiên cứu Phân lập nhóm vi khuẩn Lactic Acid có tính chất đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Pangasianodon hypophthanlmus

chủng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc và tăng độc lực. Để thay thế dần dần phương pháp phịng bệnh truyền thống, phương pháp phịng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học ngày càng được ưa chuộng như vaccine, các chất tăng cường hệ miễn dịch (immunostimulants), probiotics. Nghiên cứu về vaccine ứng dụng trên cá tra vẫn đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Vaccine được cho là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng ngừa mợt sớ bệnh gây ra bởi vi khuẩn và virus, nhưng chưa được sử dụng phở biến có thể là do giá thành quá cao, thời gian nghiên cứu lâu và thường gây sớc cho cá. Những thành cơng đáng chú ý là việc sử dụng các chất tăng cường hệ miễm dịch thân thiện với mơi trường và có phở phòng ngừa bệnh rợng. Hơn thế nữa, phương pháp trị liệu sinh học bằng vi sinh vật có lợi (probiotic) được mong đợi và trở thành cơng cụ phòng ngừa, điều trị nhiều bệnh hiệu quả trong nuơi trờng thủy sản thơng qua khả năng cải thiện mơi trường nước và ức chế vi sinh gây bệnh. Đặc biệt là các vi sinh vật cĩ lợi cĩ khả năng phân hủy phân tử tín hiệu (Quorum sensing) của các vi khuẩn gây bệnh nhằm làm giảm độc và đồng thời ức chế sự phát triển của chúng. Trong khuơn khổ của đề tài chúng tơi tiến hành nghiên cứu phân lập nhĩm vi khuẩn lactic từ hệ tiêu hĩa cá tra thịt và giống, nước ao nuơi cá tra cĩ đặc tính phân hủy phân tử tín hiệu và đối kháng Edwardsiella ictaluri. Và thực phẩm lên men truyền thống. 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lâp các dịng vi khuẩn cĩ tính chất đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, gây bệnh cho cá tra nuơi ở các tỉnh đồng bằng sơng Cửu Long. 1.3 Nội dung đề tài - Thu thập mẫu cá Tra ở 3 tỉnh thuộc đồng bằng sơng Cửu Long: Tiền Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp. - Sàng lọc các mẫu cĩ khả năng phân hủy phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL). - Dùng một số phương pháp để đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập đối với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ E. ictaluri. - Khảo sát khả năng phân hủy HHL và đối kháng E. ictaluri của các vi khuẩn nhận từ ngân hàng vi sinh vật. - Bước đầu mơ tả hình thái, nhộm gram các chủng cĩ khả năng phân hủy AHL và đối kháng. 1.4 Phạm vi nghiên cứu đề tài - Phân lập từ hệ vi sinh vật từ hệ tiêu hĩa của cá tra nuơi và cá tra giống. - Phân lập từ hệ vi sinh vật nước của cá tra nuơi. - Phân lập từ hệ vi sinh vật trong thực phẩm lên men truyền thống. - Sàng lọc các chủng vi khuẩn phân lập và các chủng từ ngân hàng vi sinh khả năng phân hủy phân tử tín hiệu AHLs và đối kháng Edwardsiella ictaluri. CHƯƠNG 2. TỔNG QUÁT TÀI LIỆU 2.1 Một số đặc điểm sinh học của cá Tra 2.1.1 Phân loại   Bộ cá nheo Siluriformes Họ cá tra Pangasiidae         Giống cá tra dầu Pangasianodon             Lồi cá tra Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage 1878) 2.1.2  Phân bố     Cá tra phân bố ở lưu vực sơng Mê Kơng, cĩ  mặt ở cả 4 nước Lào, Việt Nam, Campuchia, Thái Lan. Ở Thái Lan cịn gặp chúng ở lưu vực sơng Mê Kơng và Chao phraya. Ở nước ta cá bột và cá giống vớt được chủ yếu trên sơng Tiền, cá trưởng thành chỉ thấy trong các ao nuơi, rất ít khi tìm thấy trong tự nhiên.  2.1.3  Đặc điểm hình thái và sinh thái Cá thân dài, khơng vẩy, màu sắc đen xám trên lưng, bụng hơi bạc, miệng rộng, cĩ hai đuơi râu dài. Cá sống chủ yếu trong nước ngọt, cĩ thể sống được ở vùng nước hơi lợ (10 - 14 % độ muối), cĩ thể chịu đựng được nước phèn với pH ≥ 4 (pH dưới 4 thì cá bỏ ăn, bị sốc), ít chịu đựng được nhiệt độ thấp dưới 150C, chịu nĩng tới 390C. 2.1.4  Đặc điểm dinh dưỡng Cá hết nỗn hồn thì thích ăn mồi tươi sống, vì vậy chúng ăn thịt lẫn nhau ngay trong bể ấp, thậm chí cá vớt trên sơng vẫn thấy chúng ăn nhau trong đáy vớt cá bột. Chúng ăn các loại phù động vật cĩ kích thước vừa cỡ miệng của chúng. Khi cá lớn, tính ăn tạp thiên về động vật và dễ chuyển đổi loại thức ăn. Trong ao nuơi cá Tra cĩ khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn, kể cả thức ăn bắt buộc như: mùn, bã hữu cơ, cám, rau, phân hữu cơ, động vật đáy,…. 2.1.5  Đặc điểm sinh trưởng Cá trong tự nhiên, cĩ thể sống trên 20 năm. Đã gặp cỡ cá trong tự nhiên 18 kg hoặc cĩ  mẫu dài tới 1,8m. Trong ao nuơi cá bố mẹ cho đẻ đạt tới 25 kg ở cá 10 tuổi. Nuơi trong ao 1 năm cá đạt 1 - 1,5 kg/con (năm đầu tiên), những năm về sau cá tăng trọng nhanh hơn, cĩ khi đạt 5 - 6 kg/năm. 2.1.6. Đặc điểm sinh sản Tuổi thành thục: Cá Tra đực thành thục ở tuổi thứ 2 và cá cái ở tuổi thứ 3 trở lên. Cá Tra khơng cĩ cơ quan sinh dục phụ (thứ cấp), nên nhìn hình dáng ngồi khĩ phân biệt đực - cái. Ở thời kì thành thục, tuyến sinh dục ở cá đực phát triển lớn gọi là buồng tinh, ở cá cái gọi là buồng trứng. Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 - 6 (dương lịch), cá đẻ tự nhiên trên sơng ở những khúc sơng cĩ điều kiện sinh thái phù hợp. Cá khơng đẻ ở phần sơng của Việt Nam. Ở Campuchia, bãi đẻ của cá nằm từ khu vực ngã tư giao tiếp 2 con sơng Mê Kơng và Tonlesap, từ Sombor, tỉnh Crache trở lên. Trong sinh sản nhân tạo, ta cĩ thể nuơi thành thục sớm và cho đẻ sớm hơn trong tự nhiên (tháng 3). Trong tự nhiên khơng gặp tình trạng tái phát dục. Chỉ cĩ trong điều kiện nuơi nhân tạo, cá Tra cĩ thể tái phát dục 1 - 2 lần trong năm. Số lượng trứng đếm được trong buồng trứng của cá ta gọi là sức sinh sản tuyệt đối. Sức sinh sản tuyệt đối của cá Tra cĩ thể từ 200.000 đến vài triệu trứng. 2.2 Các bệnh thường gặp ở Cá Tra Bệnh là nguyên nhân gây thất thốt cá Tra nuơi. Nếu khơng điều trị kịp thời, bệnh sẽ lây lan nhanh chĩng và dẫn đến kết quả khơng như mong muốn. Hiện nay, do quy định sử dụng kháng sinh trên cá rất khắc khe nên người nuơi sử dụng phương pháp phịng bệnh là chính, hạn chế tối đa việc sử dụng thuốc, hĩa chất trong danh mục cấm của Bộ Thủy Sản. 2.2.1 Nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Aeromonas Tác nhân gây bệnh: Nhĩm vi khuẩn gây bệnh chủ yếu thuộc giống Aeromanas: A. hyrophila, A. caviae, A. sobria. Vi khuẩn cĩ mặt trong nước cĩ nhiều chất hữu cơ. Cá con dễ mẫn cảm hơn cá trưỡng thành, cĩ thể gây chết đến 80%. Dấu hiệu bệnh lý: Cá bị bệnh sẫm màu từng vùng ở bụng, xuất hiện từng mảng đỏ trên cơ thể, hoại tử đuơi, vây, xuất hiện các vết thương trên lưng, các khối u trên bề mặt cơ thể, mắt lồi, mờ đục và sưng phù, xoang bụng chứa dịch, nội tạng hoại tử. 2.2.2 Nhiễm khuẩn do Pseudomonas (Bệnh đốm đỏ) Tác nhân gây bệnh : Pseudomonas fluorescens, P.anguillise, P.chlororaphis Dấu hiệu bệnh lý: Xuất huyết từng đốm nhỏ trên da, xung quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng, bề mặt cơ thể chảy máu, tuột nhớt nhưng khơng xuất huyết vây và hậu mơn. Pseudomonas spp gây nhiễm khuẩn huyết thường xâm nhập vào cơ thể cá qua các thương tổn ở mang, da, vẩy. 2.2.3 Nhiễm khuẩn huyết do Edwardsiella (Edwarsiellosis) a. Tác nhân gây bệnh: Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella tarda gây ra. b. Dấu hiệu bệnh lý Xuất hiện những vết thương nhỏ trên da (phía mặt lưng), đường kính khoảng 3-5m. Những vết thương này sẽ phát triển thành những khối u rỗng bên trong cơ và da bị mất sắc tố. Cá mắc bệnh sẽ mất chức năng vận động do vây đuơi bị rách, gẫy. Cĩ thể xuất hiện những vết thương bên dưới biểu bì, cơ, khi ấn vào sẽ phát ra khí cĩ mùi hơi. Các vết thương này sẽ gây hoại tử vùng cơ xung quanh. Biết xuất hiện khi chất lượng nước trong mơi trường nuơi xấu, nuơi với mật độ dày. Nhiệt độ thích hợp để phát triển khoảng 300C. c. Đặc điểm sinh hĩa The Hawke et al. (1981) Edwardsiella ictaluri là lồi thuộc Enterobacteria cea, gram âm, hình que ngắn kích thước 0.75x1.5-2.5μm. di động yếu ở 25-300C, khơng di động khi nhiệt độ cao hơn, Catalase dương tính, cytochrome oxidase âm tính và lên men glucose (Shott,1989). Khơng sinh ra H2S và Indole âm tính. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phát triển chậm trên mơi trường BHI (36-48 giờ tại 28-300C). Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cịn gây bệnh trên một số lồi cá trong điều kiện thí nghiệm như: Chinook salmon Oncarhynchus tshauytscha và Rainbow trout Oncorhynchus mykiss (Lương Trần Thục Đoan, 2006). Ở Việt Nam, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh chủ yếu trên cá tra (ở tất cả các giai đoạn phát triển). Tỷ lệ hao hụt lớn trên cá tra giống, nhưng gây thiệt hại về kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá tra thịt cỡ 300-500g (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Theo Ferguson et al (2001), bệnh này được ghi nhận xuất hiện ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 và cĩ tên là BNP (Bacilliaty Necrosis of Pangaius). Từ Thanh Dung (2005) cũng phân lập vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra nuơi bè ở Việt Nam, với dấu hiệu cĩ nhiều nốt trắng trên gan. 2.2.4 Bệnh ký sinh trùng Bệnh trùng bánh xe (Trichodinosis) + Dấu hiệu bệnh lý: Thân cá cĩ lớp nhớt màu trắng hơi đục, mang cá đầy nhớt. Cá thường nổi đầu và tập trung nơi cĩ nước chảy, đơi khi nhơ đầu lên mặt nước lắc mạnh đầu. Cá bệnh nặng thường lờ đờ, đảo lộn vài vịng, chìm xuống đáy rồi chết. Trùng bánh xe ký sinh chủ yếu trên da, mang, các gốc cây. Bệnh trùng quả dưa (Ichthyopthisiosis) + Dấu hiệu bệnh lý: Trùng quả dưa ký sinh trên da, mang và vây. Trùng bám thành các hạt lấm tấm rất nhỏ, đường kính lớn nhất bằng 0,5-1mm, cĩ thể thấy được bằng mắt thường. Da và mang cá cĩ nhiều nhớt, màu sắc nhợt nhạt. Cá nổi đầu từng đàn trên mặt nước, bơi lờ đờ do trùng bám nhiều ở mang, phá hoại biểu mơ mang làm cá ngạt thở. 2.3 Tình hình nuơi cá tra ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long 2.3.1 Tình hình nuơi cá tra Trong các năm qua, nghề nuơi thủy sản trong nước đã cĩ bước phát triển nhanh và ngày càng cĩ vị trí nổi bật. Sản lượng nuơi trồng thủy sản nước ngọt năm 2002 đã đạt 450.000 tấn, chiếm 46% sản lượng nuơi trồng và khai thác thủy sản nội địa. Trong các lồi cá nuơi nước ngọt, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là lồi cá nuơi nước ngọt truyền thống được nuơi chủ yếu trong bè, ao và đăng quần với các mức độ thâm canh, bán thâm canh và qui mơ nơng hộ ao hồ nhỏ ở hầu hết ở các tỉnh Nam bộ, trong đĩ tập trung chủ yếu ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, và Cần Thơ. Sản lượng nuơi cá tra ước tính đạt khoảng 300.000 tấn năm 2004, đạt 400.000 tấn năm 2005, đạt trên 800.000 tấn năm 2006, đạt 1.000.000 tấn năm 2007 và 1.128.000 tấn năm 2008 (Đồ thị 1) (Sáng et al., 2007) Đồ thị 1. Sản lượng nuơi cá tra từ năm 2000-2008 (Vietnam association of Seafood Exporters and Producers-VASEP, 2008 Tuy nhiên, tình hình sản xuất và tiêu thụ cá tra trong mấy năm qua đang thể hiện sự thiếu bền vững. Cĩ rất nhiều nguyên nhân chủ quan, khách quan khác nhau đang được Chính phủ, Bộ Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn, các Bộ ngành, các địa phương, các tổ chức Hiệp hội nuơi cá và chế biến xuất khẩu đang chung tay triển khai các giải pháp đồng bộ để khắc phục một cách hữu hiệu (Sáng et al., 2007). Trong đĩ, vấn đề về mơi trường bị nhiễm dẫn đến dịch bệnh bùng phát đã tác động nghiệm trọng đến người nuơi và đồng thời giảm chất lượng sản phẩm của cá tra. 2.3.2 Nghiên cứu về bệnh gan thận mủ Hình 1. Các bệnh thường xuyên xuất hiện trên cá tra qua các giai đoạn nuơi (Loan và ctv., 2007). a. Bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá tra và những nghiên cứu về phịng bệnh gan thận mủ Hiện nay cá tra đang là một trong những sản phẩm xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Năm 2008, khu vực Đồng bằng sơng Cửu Long (ĐBSCL) đã xuất khẩu hơn 640.000 tấn sản phẩm cá tra philê, đạt kim ngạch gần 1,5 tỷ USD, tăng hơn 48% so với năm 2007. Chỉ trong vịng khoảng 10 năm, từ năm 1998 đến năm 2008, từ một lồi cá bản địa, cá tra đã trở thành sản phẩm chiến lược quốc gia, với sản lượng nuơi tăng gấp 65 lần, xuất khẩu sang hơn 140 nước, chiếm hơn 50% tổng sản lượng thủy sản xuất khẩu Việt Nam, đĩng gĩp khoảng 2% GDP của cả nước (Thủy sản Việt Nam, số 13/2009). Với sự phát triển ngày càng cao của cá tra cùng thị trường to lớn cho xuất khẩu, hàng ngàn nơng dân đã chạy theo lợi nhuận từ con cá tra một cách vơ điều kiện, với năm 2008 là đỉnh điểm của phong trào nuơi cá tra ở ĐBSCL. Người nuơi đã ồ ạt mở rộng diện tích nuơi, tăng mật độ nuơi một cách tự phát, cung cấp một lượng lớn thức ăn dẫn đến mơi trường trong ao nuơi dễ dàng bị ơ nhiễm, là điều kiện để bệnh bộc phát, gây thiệt hại cho người nuơi. Nghề nuơi cá tra trong những năm gần đây cĩ tỉ lệ hao hụt khá cao (khoảng 40-50%), cao gấp đơi so với các năm trước (www.vasep.com.vn). Các bệnh thường gặp trên cá tra bao gồm bệnh do vi khuẩn (bệnh gan thận mủ, bệnh đốm đỏ do Pseudomonas, bệnh nhiễm trùng máu do Edwardsiella tarda), nấm (nấm thủy mi,...) và ký sinh trùng (trùng bánh xe, trùng quả dưa, sán lá đơn chủ, sán song chủ,...). Theo kết quả điều tra của Nguyễn Thanh Phương (2007) về các bệnh do tác nhân vi khuẩn xuất hiện trong các ao nuơi cá tra thâm canh ở tỉnh An Giang, 68,3% số hộ điều tra nhận thấy bệnh đỏ mỏ đỏ đuơi, 61% số hộ ghi nhận bệnh gan-thận-mủ, 51,2% số hộ ghi nhận bệnh phù đầu, 24,4% số hộ ghi nhận bệnh vàng da. Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan (2008), tần suất xuất hiện bệnh năm 2007 ở các tỉnh ĐBSCL bao gồm bệnh gan thận mủ: 52,80%; xuất huyết: 42,50%; phù đầu, phù mắt: 20,70%; vàng da: 21,60%. Trong đĩ bệnh gan thận mủ (hay bệnh đốm trắng nội tạng) gây thiệt hại nhiều nhất cho người nuơi. Bệnh này xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuơi ở ĐBSCL vào cuối năm 1998. Khi cá nhiễm bệnh, tỉ lệ chết tăng cao (10-90%), cĩ thể lên đến 100% tùy thuộc vào cách quản lý và kích cỡ cá nuơi, đồng thời trên gan, thận và tụy tạng xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1-3 mm bên trong chứa dịch màu trắng đục. Khi cá bệnh người nuơi thường dùng hĩa chất hoặc thuốc kháng sinh để chữa trị. Tuy nhiên người ta đã phát hiện rằng tác nhân gây bệnh, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (theo kết quả định danh của Crumlish et al., 2002), đã kháng với khá nhiều loại kháng sinh như: Bactrime (100%), Colistin (97,9%), Florphenicol (42,5%), Amoxicillin (40,4%), Tetracyclin (31,9%), Doxycyclin (27,7%) (Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan, 2007). Nguyễn Thanh Phương (2007) xác định khả năng kháng thuốc kháng sinh của 8 chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá tra bệnh mủ gan, cho thấy cả 8 chủng đều cho kết quả kháng với Colistin, Oxolinic acid, Streptomycin, Cefepime, Sulfa+trime, Ceftriaxone, Cefazolin, Gentamycin, Aztreonam, Cefixim, Cefotaxime, Oxytetracycline và Amoxicillin. Hơn thế sản phẩm cá tra sau thu hoạch thường khơng được ưa chuộng do sự tích lũy thuốc, hĩa chất trong thịt, tạo các dịng vi khuẩn kháng thuốc và gây ơ nhiễm mơi trường nước. Ngồi ra tồn dư chất kháng sinh trong thịt cá tra sẽ ảnh hưởng đến vấn đề vệ sinh an tồn thực phẩm, và làm giảm uy tín của sản phẩm cá tra xuất khẩu ra thị trường nước ngồi. Để giải quyết vấn đề trên, chúng ta phải tìm các giải pháp thay thế cho việc chữa trị bằng kháng sinh và thuốc hĩa học. Hiện nay biện pháp sử dụng vaccine để phịng bệnh đang được đánh giá là cĩ hiệu quả và kinh tế. Từ năm 2005, Viện Nghiên cứu Nuơi trồng Thủy sản II đã phối hợp với Cơng ty Thuốc thú y Trung ương II (Navetco) thực hiện đề tài cấp Bộ “Nghiên cứu vaccine phịng bệnh nhiễm khuẩn cho cá tra, cá basa, cá mú, cá giị, cá hồng Mỹ nuơi cơng nghiệp”, trong đĩ đối tượng được quan tâm đặc biệt là cá tra. Sau ba năm thực hiện, việc nghiên cứu vaccine phịng bệnh gan thận mủ cho cá tra đã đạt được một số kết quả khả quan và cĩ triển vọng áp dụng vào thực tế. Hiện nay loại vaccine này đã nhận được lời mời hợp tác từ cơng ty cổ phần Vĩnh Hồn (Đồng Tháp), cơng ty nuơi và xuất khẩu cá tra lớn thứ ba của Việt Nam. Ngồi ra, các nghiên cứu hợp tác giữa tập đồn Bayer và cơng ty sản xuất vaccine Pharmaq của Nauy trên bệnh gan thận mủ của cá tra cũng đã bước đầu khẳng định tác nhân gây bệnh là vi khuẩn E. ictaluri, hiện đang tiếp tục nghiên cứu để chế tạo vaccine. Tuy nhiên, các loại vaccine nĩi trên là vaccine bất hoạt (sử dụng kháng nguyên là tế bào vi khuẩn giết bằng formalin 0,4%), cĩ một số nhược điểm là tỉ lệ bảo hộ chưa cao, thời gian bảo hộ khá ngắn (hai tháng, trong khi một vụ nuơi cá tra kéo dài tới 5-6 tháng), địi hỏi phải bổ sung một số chất bổ trợ để làm tăng hiệu quả của vaccine. Biện pháp phịng bệnh tổng hợp luơn luơn địi hỏi sự kết hợp của nhiều cách tiếp cận khác nhau: quản lý mơi trường nuơi, quản lý chất lượng con giống, tăng cường sức khỏe vật nuơi, sử dụng các hợp chất kích thích miễn dịch, vaccine bất hoạt, vaccine sống nhược độc, các chế phẩm sinh học cĩ nguồn gốc thảo dược, các chế phẩm vi sinh vật..... Hiện nay, một số chế phẩm vi sinh đã được ứng dụng trong sản xuất giống và nuơi thương phẩm cá tra nhằm thay thế cho việc sử dụng kháng sinh. Các chế phẩm này được bổ sung vào trong thức ăn dưới dạng men vi sinh, đồng thời được bổ sung vào nước để xử lý mơi trường. Gần đây, chế phẩm sinh học Bokashi được chiết xuất từ lá trầu của nhĩm nghiên cứu Khoa Thủy sản, trường Đại học Nơng Lâm Huế được xem là một trong những hướng nghiên cứu đột phá trong việc phịng và trị bệnh cho tơm cá. Thành phần hệ vi sinh vật trong chế phẩm này bao gồm vi khuẩn lactic (50%), vi khuẩn quang hợp (20%), nấm men (20%), xạ khuẩn (5%), nấm sợi (5%). Qua kết quả thử nghiệm của Cơng ty TNHH Hải Nơng Phát thành phố Hồ Chí Minh trên một số ao nuơi cá tra, basa từ tháng 4/2006 đến nay đã đạt được những thành cơng nhất định trong việc phịng bệnh gan thận mủ (Nguyễn Khoa Diệu Hà, 2009). b. Bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da trơn và một số nghiên cứu về biện pháp phịng bệnh Bệnh gan thận mủ trên cá tra xuất hiện lần đầu tiên vào cuối năm 1998, tác nhân gây bệnh lúc đầu được xác định bởi nhĩm nghiên cứu của trường Đại học Stirling phối hợp với trường Đại học Cần Thơ là Bacillus sp. (Ferguson et al., 2001). Đến năm 2002 nhĩm nghiên cứu này đã đính chính lại tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra là vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Crumlish et al., 2002). E. ictaluri được báo cáo đầu tiên trên cá nheo Mỹ, Ictalurus punctatus, vào năm 1979 (Hawke, 1979). E. ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá da trơn, hội chứng này được gọi tắt là ESC (Enteric Septicaemia of Catfish) và cĩ thể dẫn đến tỉ lệ chết cao ở cá nheo Mỹ (Austin & Austin, 1999). Bệnh này được tìm thấy tại bất cứ nơi nào nuơi cá nheo tại nước Mỹ. Bệnh xảy ra ở tất cả các kích cỡ cá nuơi nhưng tập trung ở giai đoạn cá hương và cá giống (USDA/APHIS, 2003). Sự thiệt hại cho nghề nuơi cơng nghiệp của cá da trơn do ESC được ước tính hàng năm khoảng 4-6 triệu USD từ năm 1990 và đã tăng nhanh sau đĩ. Khoảng 70% các hộ nuơi được khảo sát vào năm 1996 cho thấy nguyên nhân từ ESC đã gây ra thiệt hại cao nhất cho các hộ nuơi cá da trơn, với 57% số hộ nuơi bị thiệt hại nặng (USDA/APHIS, 1997). Bệnh xảy ra theo mùa, đặc biệt xảy ra thường xuyên khi nhiệt độ nước nằm trong khoảng 20 – 29oC (Tucker et al., 2004). Cá bị bệnh ESC thường giảm ăn, lờ đờ, bơi dạng xoay vịng, xuất huyết xung quanh vùng miệng và phần bụng. Nhiều vết lở loét nhỏ màu trắng cĩ thể xuất hiện trên bề mặt da. Cá nhiễm bệnh thường lồi mắt và bụng trương to (Tucker et al., 2004). Cĩ khá nhiều nghiên cứu trên thế giới trong lĩnh vực sản xuất vaccine phịng bệnh do E. ictaluri gây ra trên cá da trơn. Shoemaker và ctv. (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của ba loại vaccine sống cải tiến dưới dạng đơng khơ (Immuno X+5, Immuno2 X+5, Serial 1A) và một loại vaccine sống truyền thống (RE-33). Cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) được gây miễn dịch bằng phương pháp ngâm ở các ngày tuổi khác nhau (từ 7 ngày tuổi đến 31 ngày tuổi). Kết quả cho thấy hiệu lực của vaccine đã thể hiện được ngay từ khi cá được gây miễn dịch ở giai đoạn 7 ngày tuổi và 10 ngày tuổi. Tỉ lệ sống của cá 7 ngày tuổi được gây miễn dịch dao động trong khoảng 58,4 – 77,5%, đối với cá 10 ngày tuổi thì dao động trong khoảng 64,1 – 78,9%. Ba năm sau đĩ, nhĩm tác giả này cũng đã nghiên cứu phương pháp in ovo đối với việc sử dụng các loại vaccine sống cải tiến này, khi gây miễn dịch từ giai đoạn trứng của cá nheo Mỹ, bằng phương pháp ngâm trong thời gian 10 phút. Kết quả cho thấy phương pháp gây miễn dịch này là khá hiệu quả, với tỉ lệ bảo hộ khoảng 59,7% (Shoemaker et al., 2002). Trong những năm gần đây, một số nhĩm nghiên cứu đã quan tâm đến việc phát triển các chế phẩm vi sinh (probiotic) và một số chế phẩm sinh học khác bổ sung vào thức ăn để phịng bệnh ESC ở cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus). Shelby và ctv. (2007) bổ sung hai loại chế phẩm vi sinh cĩ chứa Pediococcus sp. và Enterococcus sp. (riêng lẻ hoặc phối hợp với nhau) vào thức ăn của cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) giống và cho ăn trong vịng 5-8 tuần. Sau đĩ tiến hành đo các chỉ tiêu: tăng trọng, hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) và các thơng số miễn dịch như protein huyết thanh, immunoglobulin, lysozyme, complement. Các số liệu về vi sinh cho thấy hai chủng vi khuẩn probiotic vẫn tồn tại được trong thức ăn sau khi bổ sung trong thời gian bảo quản trong vịng 4 tuần. Tuy nhiên các tác giả khơng tìm thấy sự khác biệt nào về tăng trọng, đáp ứng miễn dịch cũng như tính kháng bệnh của cá sau thời gian cho ăn thức ăn cĩ bổ sung probiotic. Aboagye và ctv. (2008) thử nghiệm ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh Lymnozyme đến tỉ lệ sống của cá nheo Mỹ sau khi được gây nhiễm thực nghiệm với Edwardsiella ictaluri. Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nghiệm thức cĩ bổ sung Lymnozyme vào nước hàng ngày liên tục trong hai tuần, tỉ lệ chết của cá sau khi gây nhiễm Edwardsiella ictaluri (45%) giảm một cách cĩ ý nghĩa thống kê (p = 0,002) so với nghiệm thức đối chứng (80%). Các nhà khoa học Nauy và Mỹ đã nghiên cứu hiệu quả kháng khuẩn của hai lọai peptide tổng hợp cecropin B và cecropin P1 đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên cá, trong đĩ cĩ E. ictaluri (Kjuul et al., 1999). Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cecropin B dao động từ 0,3-1,3 µM. Các dẫn xuất của cecropin B đã được biết đến cĩ họat tính kháng khuẩn đối với nhiều lịai vi khuẩn gây bệnh, và cĩ khả năng tăng cường tính đề kháng của cá nheo Mỹ gây cảm nhiễm với E. ictaluri (Kelly et al., 1993). Prebiotic là những hợp chất bổ sung vào thức ăn, cĩ tác dụng kích thích sinh trưởng và họat tính của hệ vi khuẩn cĩ lợi hịện diện trong hệ tiêu hĩa của vật chủ (Delzenne & Roberfroid, 1994). Prebiotic thường được sử dụng kết hợp với probiotic (gọi là synbiotic). Các hợp chất đường mạch ngắn đang được sử dụng phổ biến như là prebiotic bổ sung vào thức ăn thủy sản, trong số đĩ bao gồm: Inulin, fructose-oligosaccharide (FOS), transgalacto-oligosaccharide, lactulose (Mahious, 2005), isomalto-oligosaccharide (IMOS) (Li et al., 2009). Hiệu quả về dinh dưỡng và sức khỏe của một số oligosaccharide đã được chứng minh trên cá (Glencross et al., 2003; Li & Gatlin, 2005; Pryor et al., 2003). Isomalto-oligosaccharide ở nồng độ 0,2% sử dụng kết hợp với vi khuẩn probiotic Bacillus OJ (108 CFU/g thức ăn) bổ sung vào thức ăn cho tơm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) đã giúp điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường phản ứng miễn dịch và khả năng đề kháng đối với virus đốm trắng, thơng qua hiệu ứng tương hỗ của hai loại chế phẩm này (Li et al., 2009). Mannan-oligosaccharide (MOS), một loại prebiotic chiết xuất từ nấm men, đã được chứng minh là cĩ hiệu quả tăng cường đáp ứng miễn dịch và tính đối kháng đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus (Welker et al., 2007). 2.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng probioic trong nuơi trồng thủy sản trên thới giới và tại Việt nam 2.4.1 Tình hình nghiên cứu probiotic trên thế giới Sản lượng nuơi trồng thủy sản hiện nay chiếm đến 40% tổng sản lượng thủy sản, với tổng giá trị vào khỏang 78 tỉ USD (FAO, 2008). Vai trị quan trọng của nuơi trồng thủy sản ngày càng gia tăng đáng kể, do sản lượng khai thác thủy sản đã trở nên bão hịa và nhu cầu tiêu thụ hải sản ngày càng tăng. Tuy nhiên, vấn đề dịch bệnh đang gây tổn thất rất lớn cho nghề nuơi thủy sản. Những bệnh gây ra bởi Vibrio spp., Aeromonas spp., Pseudomonas spp., Streptococcus spp., xảy ra rất phổ biến và dẫn đến tỉ lệ chết cao của tơm cá nuơi (Watson et al., 2008). Khi người nuơi gặp phải vấn đề dịch bệnh, thơng thường biện pháp đối phĩ đầu tiên là sử dụng các hĩa chất diệt khuẩn hoặc kháng sinh. Việc sử dụng những hĩa chất này đã đem lại hiệu quả trong việc phịng và trị bệnh trên vật nuơi (Schwarz et al., 2001; Phillips et al., 2004). Tuy nhiên, việc lạm dụng hĩa chất diệt khuẩn và kháng sinh trong nơng nghiệp cũng như trong nuơi trồng thủy sản đã dẫn đến sự xuất hiện các dịng vi khuẩn kháng thuốc (Schwarz et al., 2001; Akinbowale et al., 2006). Những thiệt hại lớn nhất đã xảy ra cho nghề nuơi tơm trên thế giới, khi việc nuơi tơm thiếu quy họach cộng với việc lạm dụng kháng sinh đã đưa đến hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và suy giảm về năng suất nuơi ở nhiều nước châu Á (Karunasagar et al., 1994; Moriarty, 1999). Nghiêm trọng hơn, những dịng vi khuẩn kháng thuốc cĩ thể truyền những gen kháng thuốc cho vi khuẩn gây bệnh ở người, đe dọa đến sức khỏe con người (Witte, 2000; Schwarz et al., 2001). Nhận thức được về những mối nguy do việc sử dụng kháng sinh khơng kiểm sĩat, Hoa Kỳ, nhiều nước châu Âu và một số nước châu Á đã ban hành những đạo luật về kiểm sĩat việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuơi và nuơi trồng thủy sản, tiến đến việc ngưng sử dụng kháng sinh (Delson et al., 2005; Martin, 2005). Thức tỉnh trước những mối đe dọa do việc sử dụng kháng sinh cũng như do vi khuẩn gây bệnh mang đến cho người nuơi, những biện pháp thay thế đang được tìm kiếm. Trong đĩ cĩ việc sử dụng vaccine, các chất kích thích miễn dịch, các peptide kháng khuẩn, prebiotic (hợp chất tiền sinh học), probiotic (chế phẩm vi sinh). Trong đĩ, việc sử dụng chế phẩm vi sinh đang ngày càng được quan tâm và ứng dụng rộng rãi. Probiotic ban đầu được định nghĩa là “chế phẩm vi sinh vật sống bổ sung vào thức ăn, cĩ ảnh hưởng cĩ lợi đối với vật chủ thơng qua việc cải thiện cân bằng hệ đường ruột (Fuller, 1989). Tuy nhiên trong nuơi trồng thủy sản, probiotic khơng chỉ được bổ sung vào thức ăn mà cịn được bổ sung vào mơi trường nước (Moriarty, 1998). Trong những năm gần đây, cĩ rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng vi khuẩn probiotic cĩ thể làm tăng cường khả năng kháng bệnh của tơm/cá thơng qua việc ức chế vi khuẩn gây bệnh, nâng cao hiệu quả của hệ miễn dịch hoặc cải thiện chất lượng nước (Verschuere et al., 2000). Năm 2002, Irianto và Austin đề nghị một định nghĩa ngắn gọn nhưng đầy đủ “probiotic là cả tế bào hoặc một thành phần của vi sinh vật sống cĩ ảnh hưởng cĩ lợi đối với sức khỏe của vật chủ”. Trong một số trường hợp, những vi khuẩn ứng cử viên sau khi sàng lọc in vitro sẽ được kiểm tra in vivo ở qui mơ nhỏ về đặc tính an tồn đối với vật chủ (Chythanya et al., 2002; Hjelm et al., 2004) và khả năng bảo vệ vật chủ khi gây cảm nhiễm ngược với tác nhân gây bệnh (Irianto & Austin, 2002; Lategan et al., 2004). Trong một số nghiên cứu khác, các ứng cử viên sau khi sàng lọc sẽ tiếp tục được kiểm tra những đặc tính khác như khả năng chịu đựng muối mật (Chabrillon et al., 2006), khả năng kích thích hệ miễn dịch (Irianto & Austin, 2003), cạnh tranh vị trí bám (Chabrillon et al., 2006), cạnh tranh chất dinh dưỡng (Gram et al., 1999). Trong thực tế, những nghiên cứu này là cần thiết để kiểm tra các vi khuẩn probiotic ứng cử viên cĩ thể hiện những cơ chế tác động nào khác hay khơng. Ngồi ra, những thử nghiệm in vivo là rất cần thiết, bởi vì một chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn khác ở điều kiện in vitro, khơng nhất thiết là sẽ thể hiện đặc tính đối kháng đĩ khi cĩ sự hiện diện của vật chủ. 2.4.2 Tình hình sử dụng các chế phẩm probiotics trong hoạt động nuơi trồng thuỷ sản ở Việt Nam Những năm gần đây, để giảm thiểu những bất lợi do sử dụng hĩa chất trong nuơi trồng thủy sản, việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm sinh học để phịng bệnh và cải thiện mơi trường trong quá trình nuơi tơm ở nước ta đang phát triển mạnh (FICen, 2007). Hiện nay cĩ hàng trăm loại chế phẩm sinh học được sử dụng trong lĩnh vực nuơi trồng thủy sản, bao gồm chế phẩm trộn vào thức ăn và chế phẩm xử lý nước. Đa số các chế phẩm cĩ nguồn gốc ngoại nhập hay sử dụng cơng nghệ từ nước ngồi để sản xuất phân phối tại Việt Nam. Tuy nhiên, yếu tố lợi nhuận được đặt lên hàng đầu, chưa thật sự quan tâm đúng mức đến quyền lợi của người sử dụng. Chưa kể đến tác dụng của chế phẩm ra sao bởi vì những chế phẩm ngoại nhập hay chủng vi sinh vật từ nước ngồi đưa vào Việt Nam cĩ phù hợp với điều kiện của Việt Nam hay khơng thì việc đưa một lượng đáng kể chủng vi sinh vật vào Việt Nam cũng là một mối nguy hiểm tiềm tàng, xét về khía cạnh an tồn sinh học (Lương Đức Phẩm, 2007). Giá bán của các loại chế phẩm này khá cao, nên đã gây khĩ khăn cho người nuơi trồng thủy sản trong việc lựa chọn một sản phẩm vừa đạt chất lượng vừa cĩ giá thành rẻ. Với lý do đĩ,việc đẩy mạnh nghiên cứu để sản xuất probiotic dùng trong chăn nuơi và nuơi trồng thủy sản là một yêu cầu tất yếu. Tuy nhiên sản phẩm tinh chế thì giá thành cịn cao nên ở nước ta hiện nay vẫn sử dụng nguồn nguyên liệu chủ yếu là các loại phụ phẩm của ngành nơng nghiệp. Do đĩ giá thành của probiotic giảm xuống nhiều và cũng giúp cho vật nuơi tiêu hĩa tốt hơn, giảm tỉ lệ bệnh và gĩp phần cải thiện mơi trường. Viện Sinh học Nhiệt đới đã thành cơng trong việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm probiotic BioII gồm hỗn hợp các vi sinh vật sống và enzyme tiêu hĩa dùng trong nuơi trồng thủy sản Chế phẩm này đã được khảo nghiệm trên ao nuơi tơm sú ở các tỉnh cho kết quả khả quan và được Cơng ty thuốc thú y và nuơi trồng thủy sản đưa ra thị trường (Võ Thị Hạnh và ctv, 2004). Các nhà khoa học tại Viện hĩa học các hợp chất thiên nhiên đã nghiên cứu và sản xuất thành cơng chế phẩm EBS2 để bổ sung vào thức ăn trong nuơi trồng thủy sản. EBS2 cĩ vai trị quan trọng như những vitamin kích thích trong quá trình sinh trưởng của các đối tượng nuơi trồng thủy sản. Kết quả thử nghiệm với cua biển cho thấy trong 22 ngày đầu lơ cua dùng thức ăn tổng hợp cĩ bổ sung EBS2 đạt tốc độ tăng trưởng 3,5%. Trong khi đĩ lơ khơng bổ sung EBS2 cĩ tốc độ tăng trưởng là 0,9% và lơ dùng thức ăn tự nhiên cĩ tốc độ tăng trưởng là 0,5% (Phịng hĩa sinh biển, 2001). Ngồi ra, chế phẩm sinh học Biochie bao gồm một số chủng thuộc chi Bacillus (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis) và Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus). Chúng cĩ chức năng phân hủy hợp chất hữu cơ bằng cách tiết ra các enzyme như protease, amylase. Chúng cịn cĩ khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giả._.m số lượng vi sinh vật gây bệnh phát triển quá mức như Vibrio, Aeromonas…. Sử dụng chế phẩm sinh học Biochie để xử lý nước nuơi tơm cá cĩ tác dụng làm giảm lượng bùn hữu cơ, giảm chu kỳ thay nước và cải thiện mơi trường (tăng oxi hịa tan, giảm COD, BOD). Bên cạnh đĩ, cịn cĩ tác dụng giảm đáng kể tỷ lệ chết, tỷ lệ cịi cọc, tăng sản lượng và giảm mùi hơi của ngư trường (Vũ Thị Thứ và ctv, 2004a). Ngồi những chế phẩm probiotic trên, chế phẩm sinh học BioF cĩ chứa chủng Lactobacillus acidophillus được sử dụng trong nuơi trồng thủy sản cĩ tác dụng tăng khả năng hấp thụ thức ăn và hạn chế bệnh do Aeromonas, Vibrio… gây ra. Những nghiên cứu gần đây đã cho thấy khi bổ sung BioF vào thức ăn tơm làm tăng tỷ lệ sống và đặc biệt tăng đáng kể sản lượng tơm trong ao. Kết quả bước đầu cho thấy sử dụng BioF để nuơi tơm giống rất hiệu quả, tơm tăng trưởng nhanh, khoẻ, đồng đều (Vũ Thị Thứ và ctv, 2004b). Chế phẩm EM được giáo sư Teruo Higa-Nhật Bản phát minh năm 1980, được ứng dụng trong các lĩnh vực nơng - ngư nghiệp trên thế giới. Tuy nhiên, chế phẩm EM ở dạng lỏng được nhân giống từ EM gốc của Nhật Bản với mật độ tế bào vi sinh vật cĩ lợi cho nuơi trồng thủy sản thấp (< 107 CFU/ml) nên hiệu quả sử dụng khơng cao. Để gĩp phần hồn thiện và nâng cao hiệu quả chế phẩm EM, phịng Vi sinh ứng dụng - Viện Sinh học Nhiệt đới đã nghiên cứu sản xuất ra chế phẩm VEM sử dụng bổ sung với chế phẩm BioII. Chế phẩm VEM (Vietnamese effective microorganisms) gồm tập hợp các vi sinh vật hữu ích cĩ trong chế phẩm EM. Ngồi ra, cịn cĩ thêm một số lịai vi khuẩn Bacillus spp. được chọn lọc và vi khuẩn quang dưỡng, khơng chỉ cĩ tác dụng cải thiện mơi trường nước nuơi trồng thủy sản mà cịn cạnh tranh và đối kháng với các lồi vi khuẩn gây bệnh tơm, cá (Võ Thị Hạnh và ctv, 2004). Tại Bạc Liêu, nhiều hộ nuơi tơm đã áp dụng phương pháp nuơi cĩ bổ sung chế phẩm vi sinh. Mơ hình này bước đầu mang lại hiệu quả khá cao. Ưu điểm của mơ hình nuơi tơm sử dụng chế phẩm vi sinh là tạo nên mơi trường sạch, chi phí thấp, tơm phát triển nhanh và hạn chế dịch bệnh, nhất là bệnh đốm trắng, đầu vàng, phân trắng (FICen, 2007). Tại xã Tân Hưng Đơng - huyện Cái Nước – Tỉnh Cà Mau, việc áp dụng mơ hình nuơi tơm bằng chế phẩm EM.ZEO bước đầu mang lại hiệu quả khả quan, giữ cho mơi trường của ao luơn sạch, tơm khoẻ mạnh mà hồn tồn khơng sử dụng các hố chất độc hại, kháng sinh. Trong suốt quá trình nuơi, tơm phát triển tốt và khơng bị nhiễm bệnh. Đây là mơ hình nuơi tơm cơng nghiệp mang tính bền vững vì quy trình của dự án sử dụng chủ yếu vi sinh EM.ZEO (FICen, 2007). Việc sử dụng các chế phẩm vi sinh đã mang lại nhiều lợi ích cho người nuơi như: Sẽ giảm được vất vã, tăng lợi nhuận và ý thức hơn về việc bảo vê mơi trường xung quanh; đối với vật nuơi thì mang lại sự khỏe mạnh, sức đề kháng tốt hơn với bệnh tật, tốc độ tăng trưởng nhanh hơn,…và cải thiện được mơi trường nuơi. Tuy nhiên, người nuơi cần chú ý đến những thơng tin về sản phẩm cĩ thể hỏi ý kiến của các chuyên gia, tránh lạm dụng quá mức hay sử dụng các chế phẩm vi sinh khơng phù tại Việt Nam. 2.5 Ứng dụng probiotic trong nuơi trồng thủy sản 2.5.1 Định nghĩa probiotic Đã cĩ khá nhiều định nghĩa cho thuật từ này của các tác giả khác nhau như: Probiotic là những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm men mà cĩ thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột của sinh vật chủ (Parker, 1974). Van De Kerkove (1979) Barows và Deam (1985), Lestradet (1995) cũng cho rằng probiotic được sử dụng như một liệu pháp trong việc chũa tri bệnh tiêu chảy hay như là cách phịng bệnh ở người và động vật để giảm đến mức tối thiểu sự phát triển tán của vi sinh vật đường ruột, sự kháng lại liệu pháp sinh học và sự di căn của chứng viêm dạ dày và ruột. Havenaar (1992) đã mở rộng định nghĩa về probiotic : “ Probiotic được định nghĩa như là các chủng riêng lẻ hay hổn hợp các vi sinh vật sống cĩ ảnh hưởng cĩ lợi cho sinh vật chủ bằng cách cải thiện những đặc tính của vi sinh vật bản địa”. Riêng đối với động vật thủy sản vốn cĩ mối quan hệ gần gủi với mơi trường xung quanh. Mầm bệnh nguy hiểm cĩ thể tồn tại tự do trong mơi trường nước và tăng trưởng độc lập với vật chủ (Hansen và Olafsen;Verschuere et al., 2000) được động vật thủy sản ăn vào liên tục thơng qua quá trình điều tiết thẩm thấu và bắt mồi. Dựa trên mối quan hệ phức tạp mà một loại vi sinh vật nước cĩ với mơi trường xung quanh, định nghĩa probiotic trong nuơi trồng thủy sản cũng cần thay đổi. Verschuere và ctv (2000) đưa ra định nghĩa mới nhất “ Probiotic là chất bổ trợ vi khuẩn của mơi trường xung quanh hoặc hệ vi khuẩn cĩ liên quan đến vật chủ, đảm bảo việc cải thiện chất lượng thức ăn hoặc làm tẳng giá trị dinh dưởng của nĩ, nâng cao đáp ứng của vật chủ đối với mầm bệnh hoặc cải thiện chất lượng nước” Cĩ nhiều cơ chế phức tạp tồn tại bên trong probiotic bao gồm : khả năng bám dính trên biểu mơ ruột, sản xuất hợp chất ức chế, cạnh trnh hợp chất hoặc năng lượng cĩ sẵn, cạnh tranh vị trí bám, tăng cường đáp ứng miễn dịch, cải thiện chất lượng nước, tương tác với tảo, nguồn dinh dưỡng đa_ vi lượng và đĩng gĩp hệ enzyme cho quá trình tiêu hĩa (Ohene et al., 2007). 2.5.2 Các thành phần của probiotic Các chủng loại vi sinh vật sử dụng trong probiotcs được xác định cĩ sự hiện diện của cả vi khuẩn gram âm, vi khuẩn gram dương, bacteriophages, nấm men và cả nấm đơn bào (Irianto va Austin, 2002). a. Vi khuẩn gram âm Pseudomonas fluorescens được chứng minh là cĩ khả năng ức chế Saprolenia và A. salmocinida trên các lồi cá cĩ vây và ngăn chặn các mầm bệnh trên tơm từ Vibrio spp, đồng thời cĩ tác dụng làm giảm tỷ lệ chết trên cá hồi (Irianto và Austin, 2002). Một vi khuẩn gram âm khác cũng cĩ tác dụng cải thiện chất lượng của ấu trùng cua, hàu và cá bơn, đĩ là V. proteolyticus. Chủng này cải thiện quá trình tiêu hĩa protein ở cá bơn khi được cung cấp qua con đường cho ăn, Alteromonas làm tăng tỷ lệ sống của ấu trùng pacific oyster (Irianto và Austin, 2002). b. Vi khuẩn gram dương Cá vi sinh vật gram dương, hiếu khí và sinh bào tử như chủng Bacillus spp được sử dụng như probiotics nhằm mục đích nâng cao chất lượng nước ao nuơi do ức chế hệ vi sinh vật gây hại trong nước và làm giảm số lượng mầm bệnh. Một lợi ích trực tiếp trong việc sử dụng trực khuẩn này là làm giảm việc sử dụng kháng sinh, hĩa chất trong việc nuơi trồng thủy sản (Irianto và Austin, 2002). Ngồi các chủng Bacillus, vi khuẩn lactic trong các chế phẩm probiotics được ứng dụng khá nhiều trong nuơi trồng thủy sản như sử dụng chế phẩm chứa Lactobacillus bulgaricus, L. acidophillus, L. sporogenes, L. casei, L. plantarum, Streptococcus thermophillus (Venkat et al., 2004). Lợi ích của việc sử dụng vi khuẩn lactic trong chế phẩm probiotics là làm giảm tỷ lệ chết cảu ấu trùng cá (Irianto và Austin, 2002) đồng thời tăng hiệu quả hấp thu thức ăn (Venkat et al., 2004). c. Bacteriophages Hiện nay cĩ rất nhiều tranh cãi về vai trị của bacteriophages trong chế phẩm probiotics. Tuy nhiên, trong một số nghiên cứu, các nhà khoa học đã nuơi cấy được bacteriophages từ cá thơm, Plecoglssus altivelis và thơng qua con đường cho ăn, người ta đã nhận thấy rằng bacteriophages chống lại sự nhiễm P. plecoglossicida trên cá thơm và từ đĩ họ đi đến kết luận rằng bacteriophages làm giảm nhanh chống số lượng tế bào vi khuẩn P. plecoglossicida trong thận của ca thơm và trong mơi trường nước (Irianto và Austin, 2002). d. Nấm men Nấm men được ứng dụng trong probiotic phổ biến nhất là chủng Saccharomyces cerevisiae. Với sự hiện diện của nấm men, nĩ sẽ bám dính vào ruột, làm nâng cao sự tiết enzyme amylase và kích thích các enzyme màng ở ấu trùng sau 27 ngày tuổi (Irianto và Austin, 2002). e. Vi tảo Vi tảo Tetraselmis suecica, được sử dụng làm thức ăn cho các lồi tơm thuộc họ tơm he và các lồi cá thuộc họ cá hồi đã phát hiện ra rằng lồi nấm này làm giảm mật độ bệnh do vi khuẩn. Trên cơ sở đĩ, một số tác giả cũng đã đưa ra phương thức hoạt động của vi nấm này chống lại các tác nhân gây bệnh dựa vào sự hiện diện của các hợp chất kháng khuẩn khơng chuyên biệt trên tế bào vi tảo (Irianto và Austin, 2002). 2.5.3 Cơ chế tác động của pobiotic a. Tạo các hợp chất cĩ khả năng ức chế Những lồi vi khuẩn khác nhau cĩ thể giải phĩng ra một số hợp chất hĩa học cĩ khả năng tiêu diệt hoặc kiềm hãm các cộng đồng vi khuẩn khác để đấu tranh giành lấy năng lượng hay các chất hĩa học (Fredrickson và Stephanopoulos, 1981).Cĩ rất nhiều nghiên cứu in vitro đã chứng minh khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh của một số chủng vi khuẩn được chọn lựa bổ sung vào mơi trường ương nuơi ấu trùng. Nhưng cần phải nhấn mạnh những hợp chất ức chế hay đối kháng với các vi khuẩn khác trong các nghiên cứu in vitro khơng đảm bảo rằng những chủng probiotic cĩ tiềm năng này vẫn cịn cĩ hiệu quả trong các nghiên cứu in vivo trong cùng một điều kiện ứng dụng (Gram et al., 2001). Vì vậy, chỉ cĩ một số nghiên cứu, hầu hết là trên ấu trùng của giáp xác và nhuyễn thể đã cơng nhận hiệu quả ức chế vi khuẩn gây bệnh của một số chủng vi khuẩn probiotic khi ứng dụng trong thực nghiệm. Maeda và Liao (1992) đã thử nghiệm hiệu quả một số chủng vi khuẩn được tách chiết từ mơi trường nuơi tơm sú lên sự phát triểu của ấu trùng tơm. Trong số bảy chủng được thử nghiệm, chủng PM-4, được bổ sung cùng với tảo khuê đã cho tỉ lệ sống và tỉ lệ lột xác của ấu trùng cao so với những lơ thí nghiệm khác chỉ được bổ sung tảo khuê. Trong một thí nghiệm kiểm sốt sinh học, Maeda (1994) sau đĩ đã chứng minh rằng chủng PM-4 cĩ khả năng kiềm chế sự phát triển của Vibrio spp. bằng cách tạo ra các hợp chất cĩ đặc tính kháng khuẩn. Riquelme et al (1997) cũng đã lựa chọn các chủng vi khuẩn cĩ lợi xuất hiện ở điều kiện tự nhiên cĩ khả năng làm tăng tỉ lệ tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng điệp Chi Lê Argopecten purpuratus. Mười một trong số 506 chủng vi khuẩn đã sản xuất ra hợp chất cĩ khả năng ức chế Vibrio anguillarum cĩ liên quan đến mầm bệnh của ấu trùng (VAR: Vibrio anguillarum-related). Một trong số những chủng này (thuộc nhĩm Vibrio sp.) cĩ thể bảo vệ ấu trùng của con điệp Chi Lê chống lại mầm bệnh từ VAR trong một sự gây nhiễm sau đĩ. Tương tự, chủng Roseobacter sp. (BS107) cũng tiết ra hợp chất kháng khuẩn chống lại Vibrio anguillarum. Hoạt tính kháng khuẩn hoạt động cao nhất sau khi nuơi cấy chủng V.anguillarum 48 giờ trong dịch nổi của BS107. Trong thực nghiệm, dịch nổi khơng tế bào của chủng BS107 thúc đẩy một cách đặc hiệu tỉ lệ sống của ấu trùng điệp Chi Lê (Ruiz-Ponte et al,1999). Chủng Aeromonas media A199 đã bảo vệ ấu trùng con hầu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas) khi chúng được cảm nhiễm với Vibrio tubiashii. Hơn nữa, A199 cịn thể hiện hoạt tính đối kháng chống lại một dãy rộng các vi khuẩn gây bệnh trên cá, nhĩm giáp xác và nhuyễn thể trong nghiên cứu in vitro (Gibson et al., 1998). Sau đĩ, trong một nghiên cứu in vitro, Lategan et al (2006) đã tìm thấy sự sản xuất ra một hợp chất ngoại bào cĩ khả năng ức chế cĩ đặc tính hoạt động như chất được tiết ra từ chủng A199. Hợp chất ức chế này được xác định là indole 2,3-benzopyrrole, hợp chất này cĩ hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm rộng. Lactobacillus brevis (108 CFU/ml) được sử dụng để kiểm sốt sự phát triển của Vibrio alginolyticus trong mơi trường nuơi Artemia. Trong một nghiên cứu in vitro khác, các sản phẩm ngoại bào được tiết ra từ L.breví cũng cĩ thể ức chết sự phát triển của V.alginolyticus (Villamil et al., 2003). Trong tất cả các nghiên cứu trên, hiệu quả của probiotic được đo bằng sự cải thiện tỉ lệ tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng thơng qua các khảo sát trong phịng thí nghiệm. Tuy nhiên, khơng cĩ một nghiên cứu nào tập trung vào việc xác định nồng độ các hợp chất kháng khuẩn trong các nghiên cứu in vivo nhằm thiết lập mối quan hệ nồng độ phản ứng. Một số nghiên cứu cĩ kiểm sốt với các chủng probiotic đột biến bị làm mất khả năng sản xuất ra các hợp chất cĩ khả năng ức chế nên được thực hiện nhằm giải thích cơ chế tác động in vivo. b. Đấu tranh giành lấy các chất hĩa học và năng lượng cĩ sẵn Đấu tranh giành lấy các chất dinh dưỡng hay năng lượng cĩ sẵn cĩ thể đĩng một vai trị quan trọng trong việc hình thành hệ vi sinh vật đường ruột hay trong mơi trường nuơi thủy sản. Đã cĩ ba nghiên cứu thực nghiệm về lĩnh vực này được ghi nhận, các nghiên cứu này được thực hiện trong các hệ thống nuơi thức ăn tự nhiên nghèo chất hữu cơ và trong ương cá bơn bột. Rico-Mora et al. (1998) đã chọn một chủng vi khuẩn (SK-05) cĩ khả năng phát triển trên cơ chất nghèo hữu cơ, và khi cấy vào dung dịch nuơi tảo khuê (Skeletonema costatum) chúng cĩ thể ngăn cản sự phát triển của Vibrio alginolyticus khi vi khuẩn này được cấy vào. Hiệu quả ức chế V.alginolyticus của SK-05 đã được chứng minh trong điều kiện in vitro, các tác giả đã cơng bố rằng chủng này cĩ thể lấn át hồn tồn V.alginolyticus bởi khả năng cạnh tranh hấp thu các chất tiết của tảo khuê với vi khuẩn. Verschuere và cộng sự (1999) đã chọn chín chủng vi khuẩn cĩ khả năng ảnh hưởng lên tỉ lệ sống và tỉ lệ sinh trưởng của Artemia nauppli. Khi bổ sung các chủng vi khuẩn này vào mơi trường nuơi cấy Artemia đã giúp cho Artemia cĩ thể chống lại sự tấn cơng của vi khuẩn gây bệnh Vibrio proteolyticus CW8T2 (Verschuere et al, 2000a). Dựa vào việc khơng tìm thấy hợp chất ngoại bào nào cĩ liên quan trong các kết quả nghiên cứu dịch nổi của những chủng vi khuẩn được chọn này, các nhà nghiên cứu đã mặc nhiên cơng nhận hiệu quả bảo vệ của chủng vi khuẩn được chọn là do sự tranh giành các hợp chất hĩa học hoặc năng lượng cĩ sẵn mà khơng phải là do việc sản xuất ra các hợp chất ức chế. Tuy nhiên, các tác giả lại khơng đề cập đến những thí nghiệm sử dụng vi khuẩn đã chết để xác định cĩ phải ảnh hưởng của dinh dưỡng cĩ liên quan đến khả năng bảo vệ này hay khơng. Siderophore là những tác nhân với trọng lượng phân tử nhỏ cĩ khả năng gắn kết phân tử sắt cĩ thể hịa tan được sắt bị kết tủa hoặc tách nĩ ra khỏi hỗn hợp chất này, do đĩ cĩ lợi cho sự phát triển của vi khuẩn (Neilands, 1981). Các chủng vi khuẩn khơng gây hại cĩ khả năng sản xuất ra siderophore cĩ thể được sử dụng như probiotic để cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh khi tính sinh bệnh cĩ liên quan đến việc sản xuất siderophore và đấu tranh giành lấy các phân tử sắt trong mơi trường thiếu sắt trong giai đoạn cần thiết (Verschuere et al., 2000b). Chủng vibrio E cĩ thể cải thiện khả năng đề kháng đối với vi khuẩn gây bệnh vibrio P, Vibrio splendidus của cá bơn bột. Sự mơ tả in vitro cho thấy rằng, vibrio E cĩ thể phát triển trong mơi trường đã bị tách hết sắt trong khi vẫn sản xuất ra siderophore bởi phương pháp nhuộm chrome azurol S trong khi vibrio P thì khơng. Hơn nữa, cá bơn bột được cho ăn rotifer được làm giàu chất siderophore deferoxamine của vibrio E đã đạt được tỉ lệ sống cao hơn sau khi gây nhiễm với vibrio P, so với lơ đối chứng (Gatesoupe, 1997). Từ những kết quả cĩ liên quan trong các thí nghiệm in vitro và in vivo, các nhà khoa học đã kết luận rằng hiệu quả probiotic của vibrio E cĩ thể một phần là do sự đấu tranh giành lấy phân tử sắt với tác nhân gây bệnh. c. Sự đĩng gĩp về mặt dinh dưỡng Một số tài liệu đã chứng minh rằng đối với một số lồi động vật thì hệ thống vi khuẩn đường ruột đĩng một vai trị quan trọng trong dinh dưỡng của vật chủ. Vì vậy, nhiều cách khác nhau trong việc thay đổi hệ thống vi khuẩn đường ruột để đạt được những hiệu quả cĩ lợi như tăng sự tăng trưởng và khả năng tiêu hĩa của vật chủ, đã được khảo sát trên gia súc và trên người (Burr et al, 2005). Một vài nghiên cứu đã chứng minh ảnh hưởng về mặt dinh dưỡng của vi khuẩn probiotic lên sự phát triển và tỉ lệ sống của ca, nhĩm giáp xác và nhuyễn thể. Ấu trùng của con hầu vơ trùng (Crassostrea gigas) được cho ăn tảo giáp vơ trùng (Isochrysis galbana) cĩ bổ sung thêm dịng vi khuẩn CA2, đã làm tăng tỉ lệ sống (từ 21% đến 22%) và tốc độ tăng trưởng (từ 16% đến 21%) so với lơ đối chứng (Douillet và Langdon, 1993). Việc sử dụng thực phẩm vơ trùng cho ấu trùng hào vơ trùng cĩ thể ngăn chặn sự xâm nhập của các vi khuẩn đường ruột khác, do đĩ những hiệu quả được ghi nhận cĩ thể qui cho chủng CA2. Tuy nhiên, tác giả khơng kiểm tra trường hợp cho ấu trùng hàu ăn tảo được bổ sung vi khuẩn chết để cĩ thể khẳng định hiệu quả cải thiện tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ sống là do probiotic hay do dinh dưỡng. Nấm men được biết đến trong dinh dưỡng động vật bởi vì chúng đĩng vai trị như một nguồn sản xuất polyamin, cĩ thể nâng cao khả năng hoạt động của hệ thống ruột trưởng thành (Peulen et al., 2000). Gần đây, một số chủng nấm men rất cĩ hiệu quả khi bổ sung vào khẩu phần ăn của cá đang biến thái. Tovar-Ramirez et al. (2002, 2004) đã nghiên cứu về enzym đường ruột được tiết ra từ cá vượt chẽm bột châu Âu (Dicentrarchus labrax) khi cho ăn khẩu phần gồm hỗn hợp nhiều dịng nấm men khác nhau của Saccharomyces cerevisiae và Debaryomyces hansenii. Sự tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng ăn khẩu phần ăn hỗn hợp này cao hơn so với lơ đối chứng. Các tác giả này cịn cho là hiệu quả phụ thuộc vào liều lượng của nấm men đối với hành vi ấu trùng, cĩ thể được giải thích là do số lượng polyamine được tiết ra bởi nấm men trong khoang ruột của ấu trùng. Tuy nhiên, họ khơng chứng minh được hiệu quả probiotic của nấm men là do sự kích thích của enzym tiêu hĩa của vật chủ hay hiệu quả kích thích miễn dịch. Tương tự, Wache et al. (2006) đã kiểm tra hiệu quả của hai chủng nấm men S.cerevisiae và một chủng D.hansenii như là nguồn thực phẩm bổ sung cho cá bột hồi cầu vịng (Onchorynchus mykiss). Các chủng S.cerevisiae var.boulardii và D.hansenii dường như kích thích sự trưởng thành của hệ thống tiêu hĩa của cá bột hồi cầu vịng thơng qua việc gia tăng hàm lượng enzym tiêu hĩa theo một cơ chế mà đến nay vẫn chưa được biết đến. Ấu trùng của Artemia vơ trùng được nuơi trong dung dịch cĩ chứa mười chủng vi khuẩn (chết hoặc sống) kết hợp với bốn loại thức ăn tự nhiên vơ trùng khác nhau (hai dịng nấm men bánh mì S.cerevisiae và hai dịng vi tảo Dunaliella tertiolecta), khác nhau về giá trị dinh dưỡng của chúng (Marques et al, 2005). Khi kết hợp loại thức ăn tự nhiên cĩ chất lượng trung bình hay kém (như nấm men..) và vi khuẩn đã chết, chỉ cĩ 5.9% tổng khối lượng sinh khối được sử dụng gây ảnh hưởng mạnh mẽ lên tỉ lệ sống của Artemia. Những ảnh hưởng này bị giảm thậm chí mất đi khi nguồn thức ăn cĩ chất lượng cao được sử dụng, cĩ thể là nhờ việc cải thiện tình trạng dinh dưỡng và sức khỏe nĩi chung của Artermia. Thêm vào đĩ, một vài nghiên cứu trên vi khuẩn probiotic (ví dụ như GR8, dịng vi khuẩn Cytophaga sp.) được bổ sung vào khi cịn sống đã cải thiện một cách hiệu quả sự phát triển của Artermia, cao hơn nhiều so với bổ sung khi chết, khơng phụ thuộc vào loại thức ăn chính. Điều này cho thấy sự tương tác dương tính giữa vật chủ và vi sinh vật khơng liên quan đến giá trị dinh dưỡng của vi khuẩn hay của các lồi ăn lọc như Artemia. Những thí nghiệm đã được miêu tả, đặc biệt là với các động vật vơ trùng, cho thấy rằng sự chăm sĩc tốt nhất cần phải được thực hiện trong điều kiện thí nghiệm được bố trí để cĩ thể làm phân biệt hiệu quả dinh dưỡng thuần túy của sinh khối vi khuẩn khi được bổ sung so với mối tương tác dương tính giữa vật chủ và vi sinh vật d. Chức năng kích thích miễn dịch Cĩ rất nhiều báo cáo về ảnh hưởng của probiotic lên hệ miễn dịch của cá. Tuy nhiên, số liệu về ảnh hưởng của probiotic lên hệ miễn dịch của ấu trùng cá thì khơng đáng kể. Gần đây cĩ hai nghiên cứu về việc dùng men bánh mì (S. cerevisiae) và β-glucan để kích thích hệ miễn dịch của ấu trùng Artemia chống lại Vibrio campbellii (Marques et al, 2006a,c). Hai dịng nấm men thuần chủng đột biến đẳng gen, mnn9, được dùng làm thức ăn cho Artemia vơ trùng. Dịng mnn9 mang thể đột biến vơ hại đã làm giảm nồng độ mannoprotein gắn trên màng tế bào và làm nâng cao nồng độ của chitin và glucan (Magnelli et al., 2002). Dịng nấm men này cĩ thể giúp Artemia chống lại dịng vi khuẩn cơ hội (Vibrio proteolyticus) và dịng vi khuẩn gây bệnh bắt buộc (V. campbellii). Các nhà khoa học này cho rằng sự thay đổi thành phần màng tế bào (mật độ β-glucan cao) đã giúp Artemia chống lại cả hai chủng Vibrio chứ khơng phải nhờ giá trị dinh dưỡng tốt hơn của dịng mnn9. Các nghiên cứu theo hướng này cĩ thể bổ sung dữ liệu về miễn dịch để bắt đầu làm rõ các cơ chế cĩ liên quan. e. Cải thiện chất lượng nước ao nuơi Các chế phẩm probiotic cũng cĩ tác dụng cải thiện mơi trường nước ao nuơi trồng thủy sản (Verchuere et al., 2000). Trong nhiều nghiên cứu, chất lượng mơi trường nước ao nuơi được cải thiện khi bổ sung probiotic, đặc biệt là khi bổ sung chế phẩm cĩ chứa các chủng Bacillus sp. vì Bacillus là vi khuẩn gram dương rất hiệu quả trong việc biến đổi các chất hữu cơ thành CO2 so với vi khuẩn gram âm (Verchuere et al., 2000). Hơn nữa, các chế phẩm probiotic cũng cĩ khả năng tạo nên sự cân bằng giữa NH3/NO2/NO3 trong nước với sự hiện diện của các vi khuẩn nitrate hĩa như Nitrosomonas sp. và Nitrobacter sp.. Trong điều kiện mơi trường nước ao nuơi cĩ nồng độ NH3 cao, Nitrosomonas sp. sẽ chuyển đổi NH3 thành NO2 , sau đĩ Nitrobacter sp. sẽ chuyển đổi NO2 thành NO3 , là hợp chất khơng gây độc cho vật nuơi (Sahu et al., 2008). Các chủng vi khuẩn nitrate hĩa sẽ tiết ra polymer cho phép chúng gắn kết trên bề mặt và hình thành nên biofilm. Và chính biofilm này đã làm giảm đến 50% tỷ lệ ammonia và nitrite trong mơi trường ao nuơi (Sahu et a.l, 2008). Ngồi các vi khuẩn nitrate hĩa, các chủng vi khuẩn phân hủy sulfur, methane cũng xĩ tác dụng cải thiện mơi trường nước ao nuơi trồng thủy sản (Sahu et al., 2008). f. Can thiệp vào hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh Trong thập kỷ gần đây, cụm từ “quorum sensing”được nhắc đến như một quá trình thơng tin giữa tế bào với tế bào vi khuẩn. Các phân tử dấu hiệu quorum sensing như AHL (N-acyl homoserin lactone) cĩ liên quan đến quá trình điều hịa các nhân tố gây độc ở nhiều vi khuẩn gây bệnh. Sự phá vỡ hệ thống quorum sensing được xem là một liệu pháp chống lại sự xâm nhiễm mới trong nuơi trồng thủy sản. Furanone bị halogen hĩa được tạo ra bởi tảo biển đỏ Delisea pulchra được xem là một chất ức chế quorum sensing đầy hứa hẹn. Khi bổ sung hợp chất này với nồng độ đầy đủ bảo vệ Branchionus, Artemia khơng bị ảnh hưởng bởi Vibrio (Tinh et al, 2007). 2.6 Bẻ gãy quá trình quorum sensing – cách tiếp cận mới trong việc kiểm sĩat hệ vi sinh trong nuơi trồng thủy sản 2.6.1 Định nghĩa quá trình quorum sensing Vi khuẩn cĩ thể giao tiếp với nhau sử dụng các phân tử tín hiệu hĩa học. Chúng tiết ra, tiếp nhận và phản ứng đối với sự tích lũy của những phân tử tín hiệu này. Việc phát hiện các phân tử tín hiệu trong mơi trường cho phép vi khuẩn phân biệt giữa các quần thể vi khuẩn mật độ thấp và mật độ cao, và kiểm sĩat việc biểu thị gen đối với sự thay đổi về mật độ tế bào. Quá trình này gọi là “quorum sensing”, cho phép một quần thể vi khuẩn kiểm sĩat cĩ phối hợp sự biểu thị gen của cả quần xã. Nhiều kiểu hình ở vi khuẩn được điều khiển bởi quorum sensing, bao gồm sự cộng sinh, độc lực, sự sản xuất kháng sinh, sự tạo thành màng sinh học v.v… (Schauder & Bassler, 2001). Trong thế giới vi khuẩn tồn tại cả hai lọai ngơn ngữ quorum sensing, ngơn ngữ phổ biến và ngơn ngữ đặc hiệu, cho phép vi khuẩn giao tiếp trong cùng một lịai và giữa các lịai. Quá trình quorum sensing ở vi khuẩn Gram âm được điều khiển bởi phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL) (Fuqua et al., 2001). Ở vi khuẩn Gram dương, quá trình quorum sensing được điều khiển bởi các phân tử oligopeptide cĩ chiều dài 5 đến 17 amino acid (Meritt et al., 2003). Phân tử AHL đựợc chứng minh cĩ liên quan đến các quá trình quorum sensing ở các vi khuẩn gây bệnh Gram âm ở người và thực vật, ví dụ như Pseudomonas aeruginosa (Rumbaugh et al., 2000), Erwinia carotovora, Agrobacterium tumefaciens (Whitehead et al., 2001), cũng như ở Vibrio harveyi (Manefield et al., 2000) và những vi khuẩn gây bệnh khác trên cá (Bruhn et al., 2005). 2.6.2 Sự phân hủy sinh học quá trình quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh Khả năng phân hủy phân tử AHL dường như phân bố rộng rãi trong vương quốc vi khuẩn. Những enzyme cĩ thể ức chế phân tử AHL đã được khám phá ở các lịai vi khuẩn thuộc nhĩm ß-Proteobacteria (Zhang et al., 2002), α-Proteobacteria (Uroz et al., 2003) và γ-Proteobacteria (Uroz et al., 2003) cũng như ở một số lịai thuộc nhĩm vi khuẩn Gram dương (Dong et al., 2002). Những lịai vi khuẩn này cĩ thể khĩa hệ thống quorum sensing của những lịai vi khuẩn cạnh tranh để đạt được ưu thế chọn lọc. Ví dụ như, đĩ là trường hợp của những vi khuẩn sinh sống ở gần các vi khuẩn điều khiển quá trình tiết ra chất kháng sinh thơng qua quorum sensing (Pierson et al., 1998). Quá trình ức chế thật sự các hợp chất tín hiệu cĩ thể được xúc tác bởi hai lọai enzyme: AHL lactonase và AHL acylase. Bên cạnh đĩ, enzyme acylase của các sinh vật bậc cao cũng cĩ thể ức chế các phân tử AHL (Xu et al., 2003)(Xu et al., 2003). a. Enzyme AHL lactonase Dong và cộng sự (2000) sàng lọc hơn 500 chủng vi khuẩn thu từ thực địa và phịng thí nghiệm về họat tính ức chế phân tử AHL. Trong số này, 24 chủng cho các họat độ enzyme khác nhau trong việc lọai bỏ phân tử AHL. Enzyme chịu trách nhiệm cho việc ức chế AHL (AiiA) được phân lập từ chủng vi khuẩn cĩ họat tính cao nhất, chủng Bacillus 240B1. Enzyme ở dạng tinh khiết ở nồng độ 50 mg/l, làm giảm nồng độ của N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone từ 20 µM xuống khỏang 5 µM sau 10 phút. Khi chạy quang phổ ion hĩa phun điện tử của sản phẩm thủy phân cho thấy enzyme AiiA làm mở vịng lactone để tạo thành N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine (Dong et al., 2001). Những nghiên cứu tiếp theo cho thấy các gen mã hĩa enzyme lactonase phân bố rộng rãi ở nhiều lịai Bacillus (Dong et al., 2004). Những enzyme đồng dạng này cho thấy 90% tương đồng về trình tự ở mức độ acid amin. Bằng chứng đầu tiên cho thấy sự ức chế bằng enzyme đối với phân tử AHL cĩ thể được sử dụng như một biện pháp kiểm sĩat sinh học được báo cáo trong nghiên cứu của Dong và cộng sự (2000). Trong nghiên cứu này, sự thể hiện của enzyme AiiA ở vi khuẩn Erwinia carotovora làm giảm việc tiết ra enzyme phân hủy thành tế bào bởi vi khuẩn gây bệnh xuống chỉ cịn 10% và hầu như ức chế được các triệu chứng bệnh thối củ ở những thực vật mẫn cảm. Trong một nghiên cứu in vivo tiếp theo, Molina và cộng sự (2003) thử nghiệm hiệu quả của việc sử dụng một chủng Bacillus phân hủy AHL trong việc kiểm sĩat sinh học đối với bệnh ở thực vật. Chủng Bacillus này cĩ thể làm giảm bệnh thối củ gây ra bởi E. carotovora xuống cịn 15% và bệnh mụn cây ở cà chua gây ra bởi Agrobacterium tumefaciens xuống cịn 10%. Việc phân hủy phân tử AHL bởi chủng Bacillus mang lại một sự bảo vệ hiệu quả tương đương hoặc tốt hơn so với việc sản xuất kháng sinh bởi một chủng kiểm sĩat sinh học Pseudomonas chlororaphis. Hơn nữa, việc phân hủy các phân tử AHL khơng chỉ cĩ tác dụng phịng bệnh mà cịn cĩ tác dụng trị bệnh. Gần đây, những kết quả tương tự đã đạt được với chủng Bacillus thuringiensis (Dong et al., 2004). b. Enzyme AHL acylase Cùng một thời điểm khi Dong và cộng sự (2000) phát hiện chủng Bacillus cĩ khả năng phân hủy AHL, Leadbetter và Greenberg (2000) phân lập được một chủng vi khuẩn cĩ thể sử dụng phân tử AHL như là nguồn cacbon và nitơ. Chủng vi khuẩn này cĩ tên là V. paradoxus VAI-C, được nuơi cấy làm giàu trong một mơi trường cĩ chứa 500 mg/l N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone như là nguồn cacbon và nitơ duy nhất. Trong các thí nghiệm sử dụng AHL được dán nhãn phĩng xạ, các nhà nghiên cứu đã suy ra rằng V. paradoxus cắt đứt phân tử AHL bằng một enzyme AHL acylase, giải phĩng ra homoserine lactone và một acid béo. Sau đĩ, acid béo được sử dụng như nguồn cacbon thơng qua đường dẫn ß-oxidation. Cần cĩ thêm nhiều nghiên cứu trong tương lai để làm sáng tỏ bằng cách nào vi khuẩn đã lấy được nitrogen từ homoserine lactone. Gần đây, Flagan et al. (2003) phân lập một chủng vi khuẩn Arthrobacter sp. VAI-A, cĩ khả năng phân hủy và sử dụng các sản phẩm phân hủy chứa nitrogen của phân tử tín hiệu AHL. Điều đáng quan tâm, là tốc độ tăng trưởng phụ thuộc nồng độ AHL và năng suất của hỗn hợp hai chủng Arthrobacter sp. và V. paradoxus VAI-C thì cao hơn so với các chủng này nuơi riêng lẻ. Điều này cho thấy rằng một cộng đồng nhiều lịai vi khuẩn cĩ thể cĩ một ảnh hưởng hiệp trợ trong quá trình chuyển đổi và khĩang hĩa tín hiệu quorum sensing. Gần đây, Lin và cộng sự (2003) phân lập một chủng vi khuẩn ức chế AHL, Ralstonia sp. XJI2B từ một màng sinh học đa lịai. Enzyme chịu trách nhiệm trong việc ức chế AHL (AiiD) được tinh chế và sau đĩ được ủ với phân tử N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone. Việc chạy quang phổ ion hĩa phun điện tử đối với sản phẩm thủy phân cho thấy rằng enzyme AiiD thủy phân liên kết amid của phân tử AHL. Sự thể hiện của enzyme AiiD ở vi khuẩn P. aeruginosa tái tổ hợp PAO1 ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh và làm giảm tỉ lệ chết của giun trịn Caenorhabditis elegans xuống cịn 15%, so với chủng vi khuẩn khơng tái tổ hợp. 2.6.3 Những triển vọng của việc bẻ gãy quá trình quorum sensing Những kết quả đạt được bằng cách sử dụng những kỹ thuật bẻ gãy hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh cho thấy rằng đây là một biện pháp đầy hứa hẹn thay thế cho việc sử dụng kháng sinh trong việc chống lại sự nhiễm khuẩn. Cách tiếp cận mới này cũng cĩ thể cĩ giá trị trong nuơi trồng thủy sản, khi mà mối liên hệ giữa quorum sensing và sự thể hiện yếu tố độc lực ở một số vi khuẩn gây bệnh ở động vật thủy sản đã được chứng minh. Tuy nhiên, vẫn cịn thiếu những số liệu về ảnh hưởng của quorum sensing đến độc lực của các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản. Nghiên cứu cơ bản trong lĩnh vực quorum sensing chắc chắn sẽ cung cấp những sự hiểu biết chính xác hơn về cơ chế mà sự biểu hiện của các gen điều khiển bởi quorum sensing được kích họat hay bị ức chế. Cho đến hiện nay, đa số các nghiên cứu đã được tiến hành đối với hệ thống quorum sensing do AHL làm trung gian của các vi khuẩn gây bệnh gram âm trên người và thực vật. Tuy vậy, cĩ thể mong đợi những kỹ thuật bẻ gãy hệ thống quorum sensing của những vi khuẩn gây bệnh khác sẽ được phát triển trong tương lai. CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu - Thời gian ._.