Nghiên cứu nuôi thành thục và thụ tinh ống nghiệm trứng bò nội tại Việt Nam

oa học: 1. GS. TSKH. Cù Xuân Dần 2. TS. Nguyễn Thị Ước Hà Nội - 2005 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả đ−ợc trình bày trong luận án này là trung thực và ch−a từng đ−ợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Nguyễn Hữu Đức Lời cảm ơn Tôi xin chân thành cảm ơn GS. TSKH. Cù Xuân Dần, nguyên Hiệu tr−ởng Tr−ờng Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, đã tận tình h−ớng dẫn, giúp đỡ và góp ý cho luận án. Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Bùi Xuân Nguyên- Tr−ởng Phòng Công nghệ Phôi-Viện Công nghệ Sinh học và TS. Nguyễn Thị Ước đã nhiệt tình chỉ dẫn, ủng hộ, tạo mọi điều kiện để tôi có thể thực hiện các thí nghiệm liên quan đến luận án này và nhất là hết lòng đào tạo, giúp cho tôi có các điều kiện thuận lợi để ngày càng tr−ởng thành trong thời gian công tác tại Phòng Công nghệ Phôi. Với tình cảm sâu sắc, tôi xin cảm ơn sự ủng hộ và hợp tác của các anh chị em cán bộ nghiên cứu đặc biệt là anh Lê Văn Ty và các kỹ thuật viên Phòng Công nghệ Phôi-Viện Công nghệ Sinh học-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong quá trình thực hiện các nghiên cứu tại đơn vị. Tôi cũng xin trân trọng chuyển lời cảm ơn đến Giáo s− Jean Paul Renard và các cộng sự tại Viện INRA (Cộng hòa Pháp), dự án BIODIVA, Giáo s− Jack Rutledge và Tiến sĩ Leibfreid Rutledge cùng các cộng sự tại Tr−ờng Đại học Wisconsin (Mỹ) đã giúp đỡ tài liệu, kinh nghiệm và vật liệu thí nghiệm có liên quan đến luận án này. Tôi xin chuyển lời cảm ơn đến gia đình bác Nguyễn Văn Tân (thị xã Hà Đông), hợp tác xã Chăn nuôi bò lai sinh sản Vân Xuân (Huyện Vĩnh T−ờng-Tỉnh Vĩnh Phúc), nhân dân các tỉnh H−ng Yên, Hải D−ơng đã nhiệt tình cung cấp mẫu vật và bò nhận phôi thụ tinh ống nghiệm. Cuối cùng, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ Sinh học, Khoa Sau Đại học, các thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú Y, Bộ môn Sinh lý, Sinh hóa, Động vật-Tr−ờng Đại học Nông nghiệp I, Vụ Đại học và Sau Đại học-Bộ Giáo dục và Đào tạo đã hết sức ủng hộ, tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành các thủ tục cần thiết để bảo vệ thành công luận án này. Nguyễn Hữu Đức Danh mục các chữ viết tắt trong luận án BSA Bovine Serum Albumin COC Cumulus Oocyte Complex DPBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline E Estradiol-17β EGF Epidermal Growth Factor FCS Foetal Calf Serum FGF Fibroblast Growth Factor FSH Follicle Stimulating Hormone HIS High Ionic Strength IVC In vitro Culture IVF In vitro Fertilization IVM In vitro Maturation IVP In vitro Production LH Luteinizing Hormone MPF Maturation Promoting Factor OMI Oocyte Maturation Inhibitor OPU Ovum Pick Up PCR Polymerase Chain Reaction SOF Synthetic Oviduct Fluid TCM 199 Tissue Culture Medium 199 Mục lục Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục các chữ viết tắt Mục lục Danh mục các bảng Danh mục các hình ảnh Mở đầu 1 Ch−ơng 1 Tổng quan vấn đề nghiên cứu 1.1 khai thác và nuôi thành thục trứng bò trong ống nghiệm 1.1.1 Các ph−ơng pháp khai thác trứng bò 4 1.1.2 Ph−ơng pháp nuôi và đánh giá sự thành thục trong ống nghiệm của trứng bò 9 1.1.3 Các yếu tố ảnh h−ởng kết quả khai thác và nuôi thành thục trứng bò trong ống nghiệm 13 1.2 thụ tinh trứng bò trong ống nghiệm 1.2.1 Nguyên lý thụ tinh ống nghiệm và các giai đoạn của quá trình thụ tinh 21 1.2.2 Ph−ơng pháp thụ tinh trứng bò trong ống nghiệm 32 1.2.3 Các yếu tố ảnh h−ởng kết quả thụ tinh trứng bò trong ống nghiệm 35 Ch−ơng 2 đối t−ợng, nội dung và ph−ơng pháp nghiên cứu 2.1 Đối t−ợng và Nội dung nghiên cứu 2.1.1 Đối t−ợng nghiên cứu 46 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 46 2.1.3 Các chỉ tiêu nghiên cứu 47 2.1.4 Bố trí thí nghiệm 47 2.2 Ph−ơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Thu và bảo quản buồng trứng 48 2.2.2 Khai thác trứng từ buồng trứng 48 2.2.3 Phân loại chất l−ợng trứng 49 2.2.4 Đánh giá các giai đoạn phát triển của trứng 49 2.2.5 Nuôi trứng thành thục trong ống nghiệm 50 2.2.6 Xử lý tinh trùng dùng trong thụ tinh ống nghiệm 50 2.2.7 Thụ tinh ống nghiệm 51 2.2.8 Đánh giá kết quả thụ tinh ống nghiệm 51 2.2.9 Nuôi phôi trong ống nghiệm 51 2.2.10 Xử lý số liệu 52 Ch−ơng 3 Kết quả và thảo luận 3.1 Khai thác trứng bò từ buồng trứng 3.1.1 ảnh h−ởng của ph−ơng pháp khai thác đến số và chất l−ợng trứng bò vàng 53 3.1.2 ảnh h−ởng của mùa đến kết quả khai thác trứng từ buồng trứng bò vàng 56 3.1.3 ảnh h−ởng của giống bò đến kết quả khai thác trứng ở bò vàng và bò lai Sind 57 3.2 Nuôi thành thục trứng bò trong ống nghiệm 3.2.1 ảnh h−ởng của môi tr−ờng nuôi đến khả năng thành thục của trứng bò vàng 61 3.2.2 ảnh h−ởng của thời gian nuôi đến khả năng thành thục của trứng bò vàng 63 3.2.3 ảnh h−ởng của chất l−ợng trứng đến tỉ lệ thành thục của trứng bò vàng 68 3.2.4 ảnh h−ởng của mùa đến khả năng thành thục của trứng bò vàng 68 3.2.5 So sánh khả năng thành thục của trứng bò vàng và bò lai Sind trong ống nghiệm 69 3.3 thụ tinh trứng bò trong ống nghiệm 3.3.1 ảnh h−ởng của tinh trùng dùng trong thụ tinh ống nghiệm trứng bò vàng 74 3.3.2 ảnh h−ởng của thời gian tiến hành thụ tinh 78 3.3.3 ảnh h−ởng của chất l−ợng trứng 79 3.3.4 ảnh h−ởng của môi tr−ờng thụ tinh 79 3.4 Sự phát triển của phôi bò thụ tinh ống nghiệm 3.4.1 ảnh h−ởng của môi tr−ờng nuôi phôi 87 3.4.2 ảnh h−ởng của chất l−ợng trứng 89 3.4.3 ảnh h−ởng của đực giống 90 3.4.4 ảnh h−ởng của mật độ nuôi phôi 92 3.4.5 ảnh h−ởng của thành phần khí nuôi 93 3.4.6 So sánh hiệu quả sản xuất phôi thụ tinh ống nghiệm ở bò vàng và bò lai Sind 94 3.5 bê thụ tinh ống nghiệm 103 Kết luận và đề nghị 108 Danh mục các công trình liên quan Luận án của tác giả 110 Tài liệu tham khảo 111 Phụ lục 136 Danh mục các bảng Trang Bảng 3.1: Số l−ợng và chất l−ợng trứng khai thác từ buồng trứng bò vàng bằng ph−ơng pháp hút và hút kết hợp cắt lớp Bảng 3.2: Số l−ợng trứng bò loại A thu từ buồng trứng bò vàng trong các mùa Bảng 3.3: Khả năng khai thác trứng bò ở giống bò vàng và bò lai Sind Bảng 3.4: ảnh h−ởng của FCS đến tỉ lệ trứng thành thục trong môi tr−ờng 199 Bảng 3.5: ảnh h−ởng của FSH đến tỉ lệ trứng thành thục trong môi tr−ờng 199+10%FCS Bảng 3.6: ảnh h−ởng của Estradiol-17β đến tỉ lệ trứng thành thục trong môi tr−ờng 199+10%FCS+FSH Bảng 3.7: ảnh h−ởng của LH đến tỉ lệ trứng thành thục trong môi tr−ờng 199+10%FCS+FSH+E Bảng 3.8: ảnh h−ởng của thời gian nuôi đến khả năng thành thục của trứng Bảng 3.9: ảnh h−ởng của chất l−ợng trứng đến khả năng thành thục Bảng 3.10: ảnh h−ởng của mùa đến khả năng thành thục của trứng Bảng 3.11: Kết quả nuôi thành thục trứng bò vàng và bò lai Sind trong ống nghiệm Bảng 3.12: Kết quả chọn lọc tinh trùng bằng ph−ơng pháp lọc qua phân lớp percoll Bảng 3.13: Kết quả chọn lọc tinh trùng bằng ph−ơng pháp bơi ng−ợc (swim-up) 53 56 58 61 62 62 63 64 68 68 69 75 75 Bảng 3.14: ảnh h−ởng của ph−ơng pháp xử lý tinh trùng đến kết quả thụ tinh ống nghiệm Bảng 3.15: ảnh h−ởng của nồng độ tinh trùng đến kết quả thụ tinh ống nghiệm Bảng 3.16: ảnh h−ởng của cá thể đực giống đến kết quả thụ tinh ống nghiệm Bảng 3.17: ảnh h−ởng của thời gian thụ tinh đến kết quả thụ tinh ống nghiệm Bảng 3.18: ảnh h−ởng của chất l−ợng trứng đến kết quả thụ tinh ống nghiệm Bảng 3.19: ảnh h−ởng của heparin trong môi tr−ờng thụ tinh INRA đến kết quả thụ tinh ống nghiệm Bảng 3.20: ảnh h−ởng của heparin trong môi tr−ờng thụ tinh IVF-1 đến kết quả thụ tinh ống nghiệm Bảng 3.21: ảnh h−ởng của heparin trong môi tr−ờng thụ tinh IVF-2 đến kết quả thụ tinh ống nghiệm Bảng 3.22: Khả năng phát triển của phôi IVF trong môi tr−ờng 199 có và không có bổ sung tế bào cumulus Bảng 3.23: Khả năng phát triển của phôi IVF trong môi tr−ờng SOF có và không có bổ sung tế bào ống dẫn trứng Bảng 3.24: Khả năng phát triển của phôi IVF trong môi tr−ờng KSOM có và không có bổ sung tế bào ống dẫn trứng Bảng 3.25: Khả năng phát triển của phôi IVF trong môi tr−ờng B2 có và không có bổ sung tế bào Vero Bảng 3.26: ảnh h−ởng của chất l−ợng trứng đến khả năng phát triển của phôi thụ tinh ống nghiệm 76 77 77 78 79 80 80 81 87 88 88 89 90 Bảng 3.27: ảnh h−ởng của cá thể đực giống đến khả năng phát triển của phôi thụ tinh ống nghiệm Bảng 3.28: ảnh h−ởng của mật độ nuôi phôi đến khả năng phát triển của phôi thụ tinh ống nghiệm Bảng 3.29: ảnh h−ởng của thành phần khí nuôi đến khả năng phát triển của phôi thụ tinh ống nghiệm Bảng 3.30: So sánh hiệu quả sản xuất phôi ống nghiệm từ trứng bò vàng và bò lai Sind 91 92 93 94 Danh mục các hình ảnh Trang Hình 3.1: Trứng bò loại A Hình 3.2: Trứng bò loại B Hình 3.3: Trứng bò loại C Hình 3.4: So sánh tỉ lệ trứng loại A thu đ−ợc/ tổng số trứng thu trong các mùa khác nhau Hình 3.5: Buồng trứng bò vàng và bò lai Sind Hình 3.6: So sánh kết quả khai thác trứng tổng số và trứng loại A từ buồng trứng bò vàng và bò lai Sind Hình 3.7: Nhân trứng và màng nhân bắt đầu tan Hình 3.8: Nhiễm sắc thể ở trạng thái Metaphase I Hình 3.9: Nhiễm sắc thể tập trung trên mặt phẳng xích đạo Hình 3.10: Nhiễm sắc thể tập trung trên mặt phẳng xích đạo và hình thành các thoi vô sắc Hình 3.11: Nhiễm sắc thể bắt đầu dịch chuyển trên các thoi đi về 2 cực Hình 3.12: Kết thúc sự dịch chuyển của nhiễm sắc thể về 2 cực Hình 3.13: Nhiễm sắc thể ở trạng thái Metaphase II Hình 3.14: Trứng bò thành thục với sự hình thành thể cực thứ nhất (first polar body) Hình 3.15: Trứng bò loại A thành thục với sự tơi bông của lớp tế bào cumulus bao quanh Hình 3.16: So sánh tỉ lệ thành thục của trứng bò trong các môi tr−ờng nuôi khác nhau Hình 3.17: Sự phụ thuộc của tỉ lệ trứng thành thục vào thời gian nuôi Hình 3.18: Sự phụ thuộc của tỉ lệ phôi phân chia vào nồng độ tinh trùng dùng trong thụ tinh ống nghiệm Hình 3.19: Sự phụ thuộc của tỉ lệ phôi phân chia vào thời gian tiến hành thụ tinh ống nghiệm 55 55 55 57 58 60 65 65 65 66 66 66 67 67 67 70 72 83 85 Hình 3.20: ảnh h−ởng nồng độ heparin bổ sung đến tỉ lệ phôi phân chia Hình 3.21: So sánh tỉ lệ phôi phân chia trong môi tr−ờng INRA, IVF-1 và IVF-2 ở nồng độ heparin 10àg/ml Hình 3.22: Thụ tinh ống nghiệm giữa trứng bò nuôi thành thục in vitro và tinh trùng đông lạnh-giải đông Hình 3.23: Phôi bò thụ tinh ống nghiệm ở giai đoạn 2 tế bào Hình 3.24: Phôi bò thụ tinh ống nghiệm ở giai đoạn 4 tế bào Hình 3.25: Phôi bò thụ tinh ống nghiệm ở giai đoạn 8 tế bào Hình 3.26: Phôi bò thụ tinh ống nghiệm ở giai đoạn phôi dâu Hình 3.27: Phôi bò thụ tinh ống nghiệm ở giai đoạn phôi nang có xoang Hình 3.28: Phôi bò thụ tinh ống nghiệm ở giai đoạn phôi nang căng phồng Hình 3.29: Phôi bò thụ tinh ống nghiệm ở giai đoạn phôi nang bắt đầu thoát khỏi màng sáng Hình 3.30: Phôi bò thụ tinh ống nghiệm ở giai đoạn phôi nang đã thoát 1/2 khỏi màng sáng Hình 3.31: Phôi bò thụ tinh ống nghiệm ở giai đoạn phôi nang đã hoàn toàn thoát khỏi màng sáng Hình 3.32: So sánh tỉ lệ phôi nang trong các môi tr−ờng nuôi phôi Hình 3.33: So sánh khả năng sản xuất phôi ống nghiệm ở bò vàng và bò lai Sind Hình 3.34: Đôi bê Thụ tinh ống nghiệm đầu tiên của Việt Nam đ−ợc sinh ra ngày 28-11-2002 tại Vĩnh T−ờng-Vĩnh Phúc Hình 3.35: Bê cái Thụ tinh ống nghiệm tại Hải D−ơng Hình 3.36: Bê cái Thụ tinh ống nghiệm tại H−ng Yên Hình 3.37: Bê cái Thụ tinh ống nghiệm tại Vĩnh Phúc Hình 3.38: Bê đực Thụ tinh ống nghiệm tại H−ng Yên Hình 3.39: Bê cái Thụ tinh ống nghiệm tại Vĩnh Phúc (8 tháng tuổi) Hình 3.40: Bê cái Thụ tinh ống nghiệm tại H−ng Yên (8 tháng tuổi) 85 86 95 95 95 96 96 96 97 97 97 98 100 103 104 105 105 106 106 107 107 Mở đầu Công nghệ phôi (embryo biotechnology) ngày nay đ−ợc hiểu nh− một tổ hợp các kỹ thuật sinh sản, di truyền, sinh học tế bào và phân tử nhằm sử dụng hợp lý các nguồn nguyên liệu mang thông tin di truyền (tinh trùng, trứng, tế bào sinh d−ỡng). Sự kết hợp và ứng dụng các kỹ thuật trên giúp chúng ta có thể chủ động nâng cao năng suất sinh học vật nuôi, tạo ra các động vật có tiềm năng di truyền cao hoặc đặc biệt với mục đích phục vụ lợi ích của con ng−ời; công nghệ phôi đồng thời góp phần bảo tồn sự đa dạng của các nguồn gen thông qua việc thành lập các ngân hàng tế bào sống. Các nội dung cơ bản của công nghệ phôi bao gồm: khai thác trứng bằng ph−ơng pháp in vivo và in vitro, sản xuất phôi có chất l−ợng cao với số l−ợng lớn bằng ph−ơng pháp nuôi trứng thành thục, thụ tinh ống nghiệm, nuôi phôi, vi phẫu thuật phôi, tạo phôi từ tế bào đơn, gây động dục đồng pha và cấy phôi, bảo quản phôi ngoài cơ thể bằng các kỹ thuật nuôi in vitro và đông lạnh bảo quản trong ngân hàng nitơ lỏng (-196°C), tách tinh trùng đực/cái kết hợp thụ tinh ống nghiệm, tạo các cá thể hoặc giống mới mang những phẩm chất đặc biệt bằng các kỹ thuật lai ghép phôi, chuyển gen hoặc cấy nhân cũng nh− sản xuất các phôi đã đ−ợc xác định giới tính bằng kỹ thuật PCR... Công nghệ phôi bò đã có những b−ớc tiến đáng kể từ khi con bê thụ tinh ống nghiệm đầu tiên của thế giới ra đời tại Mỹ vào năm 1981 (Brackett và cs, 1982)[36]. Bê đực này là kết quả của qúa trình thụ tinh trong ống nghiệm giữa các tinh trùng t−ơi (đã xuất ra) với trứng đã thành thục in vivo. Sau đó, hợp tử đ−ợc cấy ngay vào vòi trứng bò nhận. Những năm tiếp theo, tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới, các kỹ thuật liên quan công nghệ trên tiếp tục đ−ợc nghiên cứu theo h−ớng cải tiến các điều kiện nuôi trứng thành thục trong ống nghiệm (in vitro maturation=IVM), kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng (capacitation), thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization=IVF), nuôi phôi (in vitro culture=IVC), xác định giới tính phôi bằng kỹ thuật PCR, khai thác trứng để thụ tinh ống nghiệm (TTON) ở con vật sống với sự trợ giúp của máy siêu âm (Ovum Pick Up-IVF) (Fukui và cs, 1983[69]; Iritani và cs, 1984[94]; Criser và cs, 1984[50]; Fukushima và cs, 1985[73]; Fukuda và cs, 1990[68]; Fukui và cs, 1991[71]; Bols và cs, 1995[34]; Galli và cs, 2001[75]; Beker và cs, 2002[31]; Ali và cs, 2003[20]; Oyamada và cs, 2004[142]; Oikawa và cs, 2005[138]). Tại Việt Nam, công nghệ phôi đ−ợc nghiên cứu tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam từ năm 1978 với những thành công trên các đối t−ợng vật nuôi nh− sự ra đời của thỏ cấy phôi (1978), bê sữa do cấy phôi t−ơi (1986), bê Charolaise thuần chủng sinh ra do cấy phôi đông lạnh vào bò Hà-ấn (1987), dê Sannen thuần chủng ra đời từ cấy phôi đông lạnh vào dê cỏ Việt Nam (1997), bê sữa Holstein thuần ra đời từ cấy phôi đông lạnh vào bò lai Sind (1999)... Trong khuôn khổ các ch−ơng trình cấp nhà n−ớc, cấp bộ về công nghệ sinh học, các ch−ơng trình nghiên cứu cơ bản và hợp tác quốc tế, Phòng Công nghệ Phôi - Viện Công nghệ Sinh học đã có những nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ phôi ở mức in vitro và sinh học phân tử: tạo phôi trâu và bò bằng ph−ơng pháp thụ tinh ống nghiệm (Bùi Xuân Nguyên và cs, 1994[9][10]; 1996[133][134]; 1997[11][131]; 1998[132]; 1999[13]; Nguyễn Thị Ước và cs, 1999[17]; Lê Văn Ty và cs, 1998[15]; Nguyễn Hữu Đức và cs, 1996[3], 1998[4]), đặc biệt là các nghiên cứu xác định giới tính phôi bò bằng kỹ thuật PCR (Nguyễn Thị Ước và cs, 1999[18]; Bùi Linh Chi và cs, 1999[1]), lập ngân hàng phôi động vật (Bùi Xuân Nguyên và cs, 1999)[12]; nghiên cứu tạo phôi bò bằng ph−ơng pháp cấy nhân tế bào sinh d−ỡng (Bùi Xuân Nguyên và cs, 2000[13][40]; Lê Văn Ty và cs, 2003[16]), sản xuất phôi bò vàng và bò lai Sind bằng ph−ơng pháp thụ tinh ống nghiệm (Nguyễn Hữu Đức và cs, 2003)[54], sản xuất bò sữa giống th−ơng phẩm bằng cấy phôi thụ tinh ống nghiệm và xác định giới tính (Nguyễn Thị Ước và cs, 2003)[19]. Tại Viện Chăn nuôi (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn), Bộ môn Cấy truyền phôi cũng có những nghiên cứu trong việc gây rụng trứng nhiều ở bò (Đỗ Kim Tuyên và cs, 1994)[14], cấy phôi bò (Hoàng Kim Giao và cs, 1994)[6], thụ tinh ống nghiệm bò (Nguyễn Văn Lý và cs, 2003)[8], đông lạnh phôi bò (L−u Công Khánh và cs, 2003)[7]. Nhằm mục đích tiếp tục đóng góp vào sự phát triển của chuyên ngành công nghệ phôi động vật ở n−ớc ta, chúng tôi tiến hành thực hiện luận án “Nghiên cứu nuôi thành thục và thụ tinh ống nghiệm trứng bò nội tại Việt Nam” với mục tiêu góp phần xây dựng ph−ơng pháp nuôi trứng bò nội thành thục trong ống nghiệm, thụ tinh ống nghiệm và nuôi phôi phục vụ công nghệ phôi bò. Luận án mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn đối với việc đẩy nhanh các nghiên cứu cơ bản cũng nh− ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ phôi bò tại Việt Nam (xác định giới tính phôi bằng ph−ơng pháp PCR, đông lạnh phôi ống nghiệm, sản xuất bò thịt và sữa bằng ph−ơng pháp OPU-IVF...). Kết quả của luận án có giá trị trong các nghiên cứu cải tiến và hoàn thiện các kỹ thuật tiên tiến trong công nghệ phôi động vật, trong đó việc sử dụng các trứng bò nội đ−ợc quan tâm (cấy nhân tế bào phôi và tế bào sinh d−ỡng, công nghệ tế bào mầm, chuyển gen). Đồng thời, luận án cũng đóng góp cho sự phát triển công nghệ sinh sản ở các n−ớc nhiệt đới, có nền chăn nuôi lạc hậu, không tiêu chuẩn nh−ng lại có tiềm năng lớn về nguồn gen mang đặc tính chống chịu tốt với bệnh tật và điều kiện sống kham khổ nh− các giống gia súc tại n−ớc ta. Ch−ơng 1 Tổng quan vấn đề nghiên cứu 1.1 Khai thác và nuôi thành thục trứng bò trong ống nghiệm 1.1.1 Các ph−ơng pháp khai thác trứng bò 1.1.1.1 Khai thác trứng bò in vitro Ph−ơng pháp khai thác in vitro (khai thác trứng trực tiếp từ các buồng trứng) là ph−ơng pháp chủ yếu khi tiến hành thu trứng bò phục vụ công nghệ phôi động vật ở góc độ nghiên cứu cơ bản cũng nh− ứng dụng tại hầu hết các phòng thí nghiệm trên thế giới (Fukushima và cs, 1985[73]; Fukuda và cs, 1990[68]; Keskintepe và cs, 1995[99]; Mizushima và cs, 2000[124]; Paloma Duque và cs, 2003[143]). Ph−ơng pháp này cho phép cung cấp một số l−ợng trứng lớn với chất l−ợng ổn định. Ph−ơng pháp khai thác trứng bò in vitro gồm các b−ớc sau: Thu buồng trứng Buồng trứng bò đ−ợc thu ngay khi con vật bị chết. Dùng panh cố định buồng trứng và sử dụng kéo để cắt lấy buồng trứng. Bảo quản và vận chuyển buồng trứng Buồng trứng đ−ợc rửa 3-4 lần trong dung dịch n−ớc muối sinh lý có bổ sung kháng sinh (Penicillin 100.000 đơn vị và Streptomycin 50mg/lít) và bảo quản trong môi tr−ờng Phosphate Buffered Saline (PBS) ở nhiệt độ khống chế 30-35oC. Các buồng trứng đ−ợc chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 2-4 giờ. Hút trứng từ các nang trứng Buồng trứng về đến phòng thí nghiệm đ−ợc rửa lại 3-4 lần bằng môi tr−ờng PBS và dùng bơm tiêm hoặc máy hút chuyên dụng có kích th−ớc lỗ kim là 18G để chọc hút các nang trứng. Kể từ giai đoạn này, các b−ớc tiếp theo đều đ−ợc tiến hành trong tủ vô trùng. Thông th−ờng, ng−ời ta tiến hành chọc hút các nang trứng có đ−ờng kính từ 2-6mm. Rửa và chọn lọc trứng Dịch nang trứng hút ra có lẫn trứng và các tế bào nang trứng đ−ợc bơm vào các đĩa petri của hãng NUNC (CHLB Đức). Tiến hành soi tìm trứng trên kính hiển vi soi nổi có độ phóng đại 40-100 lần. Trứng đ−ợc gắp ra bằng pipet thủy tinh và rửa vài lần trong môi tr−ờng DPBS hoặc các môi tr−ờng thích hợp khác. 1.1.1.2 Khai thác trứng bò in vivo Ngoài ph−ơng pháp khai thác trứng in vitro đã trình bày ở trên, ng−ời ta nghiên cứu áp dụng một ph−ơng pháp mới gọi là ph−ơng pháp Ovum Pick Up (OPU). Ph−ơng pháp này đ−ợc xây dựng trên cơ sở ph−ơng pháp hút trứng với sự trợ giúp của máy siêu âm dùng trong các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản ở ng−ời. Ph−ơng pháp OPU đ−ợc sử dụng để khai thác trứng từ các cá thể có tiềm năng di truyền cao (sữa, thịt), kết hợp với công nghệ thụ tinh ống nghiệm cho phép tạo ra các phôi có chất l−ợng tốt bằng việc chủ động dùng các nguồn tinh đực giống. Các phôi này đ−ợc cấy vào các bò nhận đồng pha để sinh ra các bê con có tiềm năng năng suất cao. Các thí nghiệm về thu trứng bò bằng ph−ơng pháp dùng siêu âm đ−ợc tiến hành đầu tiên bởi Callesen và cs, (1987)[41]; sau đó, Pieterse và cs, (1988)[150] là những ng−ời đầu tiên sử dụng ph−ơng pháp OPU nh− là một ph−ơng pháp khai thác trứng một cách hiệu quả và đều đặn trên đối t−ợng bò. Ph−ơng pháp OPU đòi hỏi phải có các thiết bị và dụng cụ chuyên dùng nh− máy siêu âm, đầu dò, kim chọc hút cũng nh− tay nghề cao của ng−ời thao tác. Hình 1.1: Các dụng cụ chuyên dùng trong kỹ thuật OPU a (Bols và cs, 1995)[34] - Hệ kim hút có nối dây để thu trứng từ nang vào tube đựng bên ngoài b - Bộ đầu dò siêu âm và dây chuyền tín hiệu - Phần nhựa cố định đầu dò - ống kim loại bao ngoài toàn bộ hệ thống kim, dây hút, đầu dò, dây truyền tín hiệu. Ph−ơng pháp OPU cho phép hút các trứng trong nang của buồng trứng từ con vật đang sống. Con vật đ−a vào khai thác trứng đ−ợc giữ đứng yên trong giá cố định và ng−ời thao tác một tay đ−a vào trực tràng kiểm soát buồng trứng, áp buồng trứng vào đầu dò, tay kia điều khiển kim hút. Khi quan sát thấy nang trứng xuất hiện trên màn hình của máy siêu âm, một tay (thông qua trực tràng) cố định buồng trứng áp vào đầu dò và tay kia ấn nhẹ kim chọc hút vào lòng nang trứng. Thao tác này diễn ra nhẹ nhàng và hình ảnh kim hút chọc vào nang hiện rõ trên màn hình máy siêu âm giúp ng−ời thao tác điều chỉnh chính xác và nhịp nhàng kim hút. Những hình ảnh lần l−ợt hiện ra trên màn hình máy siêu âm, giúp chúng ta biết đ−ợc h−ớng đi của kim, vị trí nang trứng và vị trí đầu kim chọc vào nang (hình 2a, 2b, 2c) (Bols và cs, 1995)[34]. Hình 1.2a Hình 1.2b Hình 1.2c H−ớng kim hút sẽ đi vào Nang trứng Đầu kim bắt đầu vào nang Khi thao tác, máy siêu âm th−ờng đ−ợc đặt ở tần số 5-7,5Mhz; kim dùng chọc hút khá dài, khoảng 30-50cm với góc vát của đầu kim dao động 25o-45o. Thông th−ờng ng−ời ta chọc hút các nang có kích th−ớc 2-6 mm (Pieterse và cs, 1988)[150]. Toàn bộ dịch hút ra sẽ chảy vào các tube (50ml) để trong máy ổn nhiệt bên ngoài (35-37oC), các tube này có chứa sẵn môi tr−ờng PBS (15- 25ml). Để tránh hiện t−ợng kết đông, có thể bổ sung thêm heparin vào môi tr−ờng PBS nói trên với nồng độ 2-5UI/ml. Tuy nhiên sự có mặt của heparin có ảnh h−ởng không tốt cho trứng khi thời gian thao tác kéo dài. Sau đó, các tube chứa dịch nang nói trên đ−ợc chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành tìm và chọn lọc trứng. Các trứng này sẽ đ−ợc đ−a vào nuôi thành thục và thụ tinh ống nghiệm để sản xuất phôi (De Roover cs, 2005)[52]. Ph−ơng pháp khai thác trứng bò từ buồng trứng (ph−ơng pháp in vitro và ph−ơng pháp OPU) phục vụ công nghệ phôi cho phép cung cấp một số l−ợng lớn trứng với chất l−ợng tốt. Ph−ơng pháp thu trứng in vitro đ−ợc sử dụng cho các nghiên cứu cơ bản tại hầu hết các phòng thí nghiệm trên thế giới. Ph−ơng pháp OPU kết hợp thụ tinh ống nghiệm và cấy phôi đặc biệt có giá trị trong việc nhân nhanh các cá thể có tiềm năng năng suất cao. Trứng bò sau khi đ−ợc khai thác từ buồng trứng bằng một trong các ph−ơng pháp đã trình bày trong phần trên, chúng đ−ợc phân loại và lập tức đ−a vào các môi tr−ờng nuôi giàu dinh d−ỡng. 1.1.1.3 Phân loại chất l−ợng trứng bò Sau khi thu đ−ợc trứng bò bằng ph−ơng pháp khai thác in vitro hoặc in vivo, cần tiến hành phân loại chất l−ợng trứng và việc phân loại này là rất quan trọng, nó là một trong các nhân tố có ảnh h−ởng trực tiếp đến kết quả nuôi trứng thành thục, thụ tinh ống nghiệm cũng nh− khả năng phát triển của phôi về sau. Trứng th−ờng đ−ợc phân loại theo 3 cấp A, B, và C dựa theo hình thái bên ngoài của chúng. Trong bảng 1.1, chúng tôi trình bày một trong những ph−ơng pháp đánh giá và phân loại trứng phổ biến theo Leibfried và cs, (1979)[106] và đ−ợc nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới áp dụng. Bảng 1.1: Phân loại chất l−ợng trứng bò (Leibfried và cs, 1979)[106]. Chất l−ợng trứng Hình thái A Có trên 4 lớp tế bào cumulus bao quanh trứng, các lớp tế bào này dày, đều đặn và có sự liên kết chặt chẽ giữa các tế bào đó với nhau Nguyên sinh chất đồng đều Toàn bộ trứng nhìn trong và đầy đặn B Có ít hơn 4 lớp tế bào cumulus bao quanh trứng, các lớp tế bào này không liên kết chặt chẽ, có nơi bị mất một phần các tế bào này Nguyên sinh chất đồng đều nh−ng có màu hơi tối ở vùng ngoại vi của trứng Toàn bộ trứng nhìn ít trong và ít đầy đặn C Có ít tế bào cumulus bao quanh, nguyên sinh chất không đồng đều hoặc có màu tối, bị tan rã hoặc tr−ơng to Việc đánh giá trực tiếp chất l−ợng của trứng bò đòi hỏi một khả năng tinh tế để không làm hỏng chúng. Để đánh giá trạng thái của nhân trứng đòi hỏi phải tiến hành ph−ơng pháp nhuộm nhân vì nguyên sinh chất của trứng bò vốn giàu các hạt nhỏ lipid, chúng sẽ cản trở sự quan sát trực tiếp nhân trứng trên kính hiển vi. Vì thế, ng−ời ta không tiến hành đánh giá chất l−ợng trứng thông qua việc đánh giá trực tiếp tình trạng của nhân trứng. Tuy nhiên, nhiều quan sát cho thấy có mối liên quan chặt chẽ giữa hình thái bên ngoài (cấu trúc lớp tế bào nang bao quanh trứng, độ đồng đều và màu sắc của nguyên sinh chất) với chất l−ợng của trứng. Do vậy, ng−ời ta tiến hành phân loại chất l−ợng trứng bò trên cơ sở quan sát và đánh giá hình thái bên ngoài của trứng (Leibfried và cs, 1979)[106]; De Loos và cs, 1989[51]; Hazeleger và cs, 1995[88]). 1.1.2 Ph−ơng pháp nuôi và đánh giá sự thành thục trong ống nghiệm của trứng bò 1.1.2.1 Sự thành thục của trứng Các trứng khai thác từ buồng trứng đều ở trạng thái ch−a thành thục, để có thể đ−ợc thụ tinh, trứng cần có khả năng phát triển và đạt đến trạng thái thành thục. Sự phát triển của trứng nh− vậy có kèm theo những biến đổi về mặt hình thái, sinh lý và sinh hóa liên quan đến nhân trứng, nguyên sinh chất và màng trứng. Sự thành thục của nhân trứng Ph−ơng diện hình thái Sự thành thục của nhân trứng bắt đầu bằng việc tan biến màng nhân (germinal vesicle break down), các nhiễm sắc thể đặc lại, điển hình nhất là sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (first polar body) và nhiễm sắc thể ở trạng thái Metaphase II. Trạng thái này sẽ đ−ợc duy trì cho đến khi tinh trùng xâm nhập. Hoạt hóa sự thành thục của trứng Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng tồn tại một yếu tố thúc đẩy sự thành thục (maturation promoting factor=MPF). Ng−ời ta nhận thấy, progesterone có vai trò kích thích sự sản sinh ra MPF, một yếu tố thúc đẩy sự phân bào, sự có mặt của yếu tố này dẫn đến sự đặc lại của các nhiễm sắc thể, nó tác động đến sự phát triển của nhân và góp phần làm xuất hiện các thoi phân bào. Yếu tố thúc đẩy sự thành thục của trứng nói trên không có tác dụng đặc hiệu của loài đối với tất cả các tế bào sinh d−ỡng, từ loài l- −ỡng c− đến loài có vú. Về bản chất, MPF là một phức hợp protein bao gồm sự liên hợp của một số cycline và một protein kinase p34 (trọng l−ợng phân tử là 34 Kdal); đây là histone kinase H1 t−ơng tự một yếu tố men đ−ợc sản xuất bởi gen cdc2, gen này tham gia vào việc kiểm soát quá trình phân bào. Để đ−ợc hoạt hóa, protein kinase p34 phải đ−ợc khử gốc phospho bởi các cycline. Khả năng trứng phục hồi sự phân bào của chúng là kết quả của sự phiên mã và sự định vị trong mối điều khiển đồng pha đã đ−ợc ch−ơng trình hóa của những sản phẩm của các gen. Sự lớn lên của nguyên sinh chất, sự biệt hóa của ty thể, sự tổng hợp, sự tích lũy noãn hoàng và các ARN thông tin, cuối cùng là sự biến mất của các hạt trung tâm, đó là những sự kiện phải đ−ợc hoàn tất tr−ớc khi xảy ra sự phục hồi phân bào ở nhân trứng. Thực tế cho thấy, mức AMP vòng trong trứng có ảnh h−ởng lớn đến việc phục hồi sự phân bào của trứng, cụ thể là khi mức AMP vòng trong trứng tăng lên thì nó ức chế sự phục hồi phân bào trong ống nghiệm của trứng. Sự ổn định trứng ở trạng thái Metaphase II Sự tạm dừng của trứng ở trạng thái Metaphase II cho đến khi đ−ợc thụ tinh là do một sản phẩm có trong bào t−ơng có nguồn gốc từ một tiền gen ung th− (proto-oncogene) c-mos, đ−ợc gọi là nhân tố ổn định sự phân bào MSF (meiosis stabilizing factor). Sự hoạt hóa trứng phụ thuộc đồng thời vào các quá trình phosphoryl-dephosphoryl hóa; mà quá trình này lại bị ức chế bởi 6-DMAP (6-dimethyl-aminopurine) và các quá trình tổng hợp protein; chúng lại bị ức chế bởi puromicine. Hai chất này có thể làm dừng một cách độc lập với nhau sự đặc lại của nhiễm sắc thể hay cũng chính là làm cản trở sự phục hồi khả năng phân bào của trứng. Sự thành thục của nguyên sinh chất Sự thành thục nguyên sinh chất của trứng đ−ợc đặc tr−ng bằng sự dịch chuyển của các hạt vỏ (cortical granule) theo h−ớng từ bộ máy Golgi đến màng bào t−ơng của trứng. Những hạt này có chứa ovoperoxidase góp phần vào việc giảm thiểu hiện t−ợng thụ tinh đa tinh trùng. Có mặt trong trứng của tất cả các loài động vật có vú, các hạt này cố định trên bề mặt màng bào t−ơng bởi một protein gọi là calpactine. Sự thành thục của màng trứng Đó là một đặc tính, một điều kiện cần thiết để màng trong suốt có thể nhận biết một cách đặc hiệu những tinh trùng đã kiện toàn năng lực thụ tinh của loài đó. Đặc biệt phải kể đến sự có mặt của glycoprotein ZP3 trên màng trong suốt, nó chính là nhân tố chịu trách nhiệm nhận biết tr−ớc tiên các giao tử đực. Vùng trong suốt gồm 95% của 3 glycoprotein đ−ợc tổ chức thành các sợi dài hợp nhất gọi là ZP1, ZP2 và ZP3 (Cù Xuân Dần, 1996[2]). Phần ZP3 và ZP2 hợp thành các sợi, còn ZP1 làm nhiệm vụ bắc cầu, liên kết các sợi với nhau. Chỉ có glycoprotein ZP3 là đ−ợc tinh trùng nhận biết và phát ra phản ứng thể đỉnh; ZP2 có vai trò can thiệp khi xảy ra sự thụ tinh bằng cách cố định tạm thời đầu tinh trùng trong khi tinh trùng đi qua vùng trong suốt. 1.1.2.2 Ph−ơng pháp nuôi thành thục trứng bò trong ống nghiệm Cơ sở của các ph−ơng pháp nuôi thành thục trứng các loài động vật trong ống nghiệm dựa trên những hiểu biết về quá trình thành thục trong tự n._.hiên của chúng. Các trứng thu đ−ợc bằng ph−ơng pháp in vivo hay in vitro đã trình bày ở trên đ−ợc đ−a vào nuôi thành thục. Do có sự liên quan chặt chẽ giữa chất l−ợng trứng và hình thái bên ngoài, ng−ời ta chọn những trứng có chất l−ợng tốt đ−a vào nuôi trong môi tr−ờng giàu chất dinh d−ỡng với sự có mặt của những tế bào granulose (ở nồng độ 1-5 triệu tế bào/ml). Nhiệt độ tủ nuôi đ−ợc đặt ở 39oC, đồng thời nồng độ khí CO2 điều chỉnh ở mức 5% (Donnay và cs, 1997[53], Galli và cs, 2001[75]). Môi tr−ờng nuôi đ−ợc bổ sung bằng huyết thanh bò đang động dục (giàu LH, FSH, Estradiol) hoặc bằng huyết thanh bào thai (giàu yếu tố IGF-1) và song song cũng bổ sung thêm Estradiol-17β. Tuy nhiên, để hoàn thiện quá trình thành thục trong ống nghiệm, vẫn cần bổ sung thêm LH, FSH vào môi tr−ờng nuôi trứng (Pieterse và cs, 1988 [150]; Mizushima và cs, 2000[124]; Paloma Duque và cs, 2003[143]). Hiện nay, hầu hết các phòng thí nghiệm dùng môi tr−ờng 199 làm môi tr−ờng cơ bản để nuôi trứng thành thục và việc bổ sung các chất nh− LH, FSH, Estradiol, huyết thanh bò, pyruvate Na... là hết sức cần thiết nhằm đảm bảo sự phát triển bình th−ờng và đầy đủ của trứng đến giai đoạn thành thục đồng thời cả nhân trứng, bào t−ơng và lớp màng trong suốt nh− trong phần trên đã đề cập. 1.1.2.3 Đánh giá sự thành thục của trứng bò Để có thể đánh giá sự thành thục của trứng bò đ−ợc nuôi trong ống nghiệm, cần phải nhuộm nhân hoặc nhiễm sắc thể của trứng. Điều đáng tiếc là biện pháp này sẽ không cho phép chúng ta tiếp tục sử dụng trứng cho những mục đích tiếp theo nh− thụ tinh ống nghiệm, cấy chuyển nhân (nuclear transfer). Tuy nhiên, có những dấu hiệu bên ngoài có thể quan sát thấy, giúp chúng ta đánh giá đ−ợc sự thành thục của trứng sau thời gian nuôi trong ống nghiệm. Đó là các căn cứ dựa trên sự tơi bông của các tế bào cumulus bao quanh trứng, hoặc sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (Leibfried và cs, 1979[106]). Thông th−ờng, để đánh giá sự thành thục của nhân trứng, ng−ời ta tiến hành nhuộm nhân của lô trứng đối chứng bằng thuốc nhuộm Orcein 1%. Kết quả thu đ−ợc đ−ợc dùng nh− một thông số tham khảo cho các lô trứng cùng nguồn gốc, chất l−ợng ban đầu hoặc cùng ph−ơng pháp và điều kiện nuôi thành thục. Việc đánh giá sự thành thục của nguyên sinh chất là rất khó. Hiện nay, khi các kỹ thuật nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm, thụ tinh ống nghiệm và nuôi phôi trong ống nghiệm đã trở thành một tổ hợp công nghệ sinh học hoàn chỉnh thì việc đánh giá kết quả của giai đoạn nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm th−ờng đ−ợc phản ảnh qua kết quả thụ tinh ống nghiệm (số hợp tử phân chia ở giai đoạn 2 tế bào) và kết quả nuôi phôi trong ống nghiệm (số phôi dâu, phôi nang) thu đ−ợc về sau (Paloma Duque và cs, 2003[143]). 1.1.3 Các yếu tố ảnh h−ởng kết quả khai thác và nuôi thành thục trứng bò trong ống nghiệm Bê thụ tinh ống nghiệm đầu tiên của thế giới ra đời tại Mỹ vào năm 1981 (Brackett và cs, 1982)[36]. Con bê đực này là kết quả cấy phôi thụ tinh ống nghiệm có nguồn gốc từ một trứng đã thành thục in vivo tr−ớc đó. Trong những năm đầu thực hiện kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm, ng−ời ta tiến hành thu trứng đã thành thục in vivo bằng kỹ thuật gây rụng trứng nhiều trên bò cho trứng. Có thể thu trứng từ trong những nang sắp rụng hoặc thu trứng từ vòi trứng ngay sau khi xác định thời điểm chắc chắn trứng đã rụng. Các trứng thành thục in vivo cho kết quả thụ tinh ống nghiệm và phôi phát triển sau đó là bình th−ờng (Brackett và cs, 1982[36]; Leibfried- Rutledge và cs, 1986a[107]). Kết quả của Leibfried-Rutledge và cs cho thấy với cả hai loại trứng thành thục in vivo (hoặc là hút từ nang trứng sắp rụng, hoặc là thu từ vòi trứng) đều cho tỉ lệ phôi phân chia và phôi nang sau thụ tinh ống nghiệm là rất đáng khích lệ. Kết quả trong lô trứng thành thục in vivo và hút từ các nang sắp rụng, tỉ lệ phôi phân chia đạt 82%, tỉ lệ phôi nang đạt 45%; kết quả này ở lô trứng thành thục in vivo thu từ vòi trứng lần l−ợt là 68% và 25%. Bằng việc sử dụng các dụng cụ nội soi, ng−ời ta có thể tiến hành lặp đi lặp lại khả năng hút trứng từ các nang trên bề mặt buồng trứng nhiều lần ở cùng một con vật cho trứng. Ph−ơng pháp này đ−ợc thực hiện thành công bởi các nhóm nghiên cứu của Sirard và cs, (1985)[163]; Lambert và cs, (1986)[103]. Tuy nhiên, một giới hạn lớn trong việc thu trứng in vivo là số l−ợng trứng thu đ−ợc không nhiều, ngay cả khi tiêm cho bò hocmon FSH, số trứng thu đ−ợc cũng chỉ từ 5-10 trứng / bò (Lambert và cs, 1986[103]; Leibfried-Rutledge và cs, 1986a[107]). Một nguồn trứng lớn, ổn định và rẻ có thể giải quyết mâu thuẫn trên là nguồn trứng từ các lò mổ. Dựa trên một nền chăn nuôi tiên tiến và cơ sở hạ tầng tốt, việc thu trứng từ các bò ở lò mổ hoàn toàn có thể đáp ứng nhu cầu lớn về buồng trứng phục vụ thí nghiệm. Các trứng này có chất l−ợng tốt và ổn định đồng thời lại rẻ hơn rất nhiều. Việc bảo quản buồng trứng trong quá trình vận chuyển từ nơi thu mẫu về đến phòng thí nghiệm cũng là một yếu tố ảnh h−ởng đến chất l−ợng trứng khai thác từ buồng trứng. Wang và cs, (1995)[174] đã đánh giá khả năng phát triển của trứng bò in vitro sau khi bảo quản ở các nhiệt độ và thời gian khác nhau. Thí nghiệm đ−ợc chia ra 5 lô. Lô 1: buồng trứng đ−ợc bảo quản ở nhiệt độ 25oC trong 24 giờ, lô 2: buồng trứng đ−ợc bảo quản ở 4oC trong 24 giờ, lô 3: buồng trứng đ−ợc bảo quản ở 4oC trong 36 giờ, lô 4: buồng trứng đ−ợc bảo quản ở 4oC trong 48 giờ, lô 5 (đối chứng): trứng đ−ợc hút ra khỏi buồng trứng ngay khi về đến phòng thí nghiệm. Trứng của lô 1 đến 4 đ−ợc hút ra khỏi buồng trứng sau thời gian bảo quản đã nói. Sau khi nuôi thành thục trong ống nghiệm, tỉ lệ trứng không thành thục là cao ở lô 1 (30,3%), lô 2 (46,3%), lô 3 (39,2%), lô 4 (49,2%), trong khi lô 5 chỉ là 10,4%. Sau khi thụ tinh ống nghiệm các trứng của các lô nói trên, tỉ lệ phôi phân chia ở lô 1 là 21,75; lô 2 là 8,9%; lô 3 là 7,7%; lô 4 là 3,7% trong khi lô 5 là 83,0%. Tỉ lệ phôi dâu và phôi nang của các lô trên nh− sau: lô 1 là 4,8%; lô 2 là 2,4%; lô 3 là 1,7%; lô 4 là 1,0% trong khi ở lô 5 là 58,7%. Kết quả này chứng tỏ quá trình bảo quản buồng trứng có ảnh h−ởng lớn đến chất l−ợng trứng. Thông th−ờng, việc bảo quản buồng trứng đ−ợc thực hiện ở 30-37oC và vận chuyển buồng trứng từ nơi thu mẫu về phòng thí nghiệm chỉ kéo dài 2-6 giờ. Ph−ơng pháp khai thác in vivo th−ờng áp dụng để khai thác trứng từ các cá thể cái có tiềm năng di truyền cao, trong giai đoạn hiện nay, kỹ thuật OPU trên bò cũng đ−ợc hoàn thiện dần. Mục đích của ph−ơng pháp OPU là tăng tần số chọn lọc dòng của con mẹ, kết hợp với ph−ơng pháp thụ tinh ống nghiệm (OPU-IVF) cũng nh− kỹ thuật cấy phôi để đạt đến khả năng khai thác tiềm năng sinh học cao nhất một cách chủ động. Ph−ơng pháp OPU ít gây tổn th−ơng và th−ờng cũng không cần thiết phải xử lý hocmon ở bò thu trứng. Ưu điểm nổi bật của ph−ơng pháp này là ng−ời ta có thể tiến hành thu trứng nhiều lần lặp lại trên cũng một bò cái. Tần số cao có thể đến 2 lần thu trứng /con/ tuần và đ−ợc lặp đi lặp lại trong vòng 5 tháng liên tục. Trung bình có thể thu đ−ợc 5 trứng/1 lần OPU và khoảng 20-30% trong số chúng có thể phát triển thành phôi nang sau khi thụ tinh ống nghiệm. Các phôi này đạt tiêu chuẩn để cấy ngay hoặc đông lạnh bảo quản lâu dài (Bols và cs, 1995[34]; Galli và cs, 2001[75]). Đối với những bò bình th−ờng về sinh sản, có thể tiêm hocmon để thúc đẩy sự phát triển số l−ợng nhiều nang trên buồng trứng và sau đó tiến hành OPU, tr−ờng hợp này tiến hành thu 1 lần/tuần (Galli và cs, 2001[75]). Ưu thế của ph−ơng pháp OPU thể hiện rõ khi tiến hành thu trứng nhiều lần trên một cá thể. Nghiên cứu của Kruip và cs (1994)[102] cho thấy, mỗi tuần có thể thu đ−ợc khoảng 13 trứng trên một bò cho và số phôi nang đạt tiêu chuẩn để cấy t−ơng ứng là 2,1 phôi (16%). Do vậy, có thể thu đ−ợc khoảng 50 phôi trên một bò cho trong vòng 6 tháng nếu tiến hành khai thác trứng bằng ph−ơng pháp OPU kết hợp IVF. Điều này đ−ợc đánh giá là −u thế lớn của ph−ơng pháp OPU so với ph−ơng pháp thu phôi bằng kỹ thuật cổ điển (kết hợp gây rụng trứng nhiều, thụ tinh nhân tạo và thu phôi). Hiệu suất của ph−ơng pháp OPU −ớc chừng 4 lần lớn hơn ph−ơng pháp cổ điển trong cùng một chu kỳ thời gian khai thác (Colleau và cs, 1998[181]). Hiệu suất hút trứng từ nang trứng trong ph−ơng pháp OPU cũng có nhiều biến động. Nghĩa là khi quan sát thấy một số l−ợng nang trứng có thể hút đ−ợc hiện rõ trên màn hình, sau đó, ng−ời thao tác tiến hành chọc hút các nang đó thông qua hệ thống OPU đã trình bày trong phần ph−ơng pháp, thực tế cho thấy số trứng hút đ−ợc là ít hơn so với số nang quan sát thấy trên màn hình. Kết quả trình bày ở bảng 1.2 chứng minh cho điều này : Bảng 1.2: Tỉ lệ trứng thu đ−ợc so với số nang (Bols và cs, 1995)[34]. STT ca OPU Số bò sử dụng Số nang quan sát thấy và đ−ợc chọc hút Số trứng thu đ−ợc Tỉ lệ trứng thu đ−ợc so với số nang quan sát (%) 1 1 5 3 60 2 1 2 2 100 3 4 10 6 60 4 4 12 5 42 5 1 5 1 20 6 1 2 0 0 7 8 69 16 23 8 4 29 6 21 9 2 8 5 63 10 4 18 7 39 11 7 22 7 32 12 1 4 1 25 13 7 28 18 64 14 6 21 8 38 15 4 12 4 33 16 5 21 14 67 17 6 23 19 83 Trung bình 291 122 42 Trong thực tế, số l−ợng trứng thu đ−ợc trong mỗi ca OPU là rất biến động, một nghiên cứu của Hasler và cs (1995)[87] khi tiến hành triển khai kết hợp kỹ thuật OPU và IVF (in vitro fertilization) cho thấy: số l−ợng trứng thu đ−ợc trong mỗi ca OPU có thể dao động từ không đến 40 trứng (chiếm 7,2% số ca). Số l−ợng trứng thu bằng ph−ơng pháp OPU khi tiến hành lặp lại trên bản thân con đã cho trứng cũng có những dao động lớn, cũng nh− thế đối với tỉ lệ phôi nang thu đ−ợc khi tiến hành IVF, con số này dao động từ 4-33%. Kết quả dao động này cũng đ−ợc quan sát thấy trên đối t−ợng bò sữa, tỉ lệ này là 6-26%, riêng với giống bò Belgian Blue thì tỉ lệ này nằm trong khoảng 4-38%. Dựa trên nền các nghiên cứu của Sato và cs (1977a[155], 1977b[156]), ph−ơng pháp nuôi thành thục trứng in vitro đầu tiên đ−ợc phát triển với việc sử dụng môi tr−ờng 199 nh− là môi tr−ờng cơ bản để nuôi thành thục trứng. Để giúp trứng có thể đạt đ−ợc trạng thái thành thục hoàn toàn, việc bổ sung các nguồn protein khác cũng nh− các hocmon (FSH, LH, E) là cần thiết. Năm 1987, Lu và cs [118] công bố việc bổ sung huyết thanh bò động dục và tế bào granulose vào môi tr−ờng nuôi trứng đã dẫn đến hiệu quả thụ tinh ống nghiệm tăng rõ rệt tới 73% các trứng đ−ợc thụ tinh phát triển tiếp đến giai đoạn phôi nang sau khi thụ tinh ống nghiệm và phôi đ−ợc nuôi in vivo trong ống dẫn trứng của cừu. Đã có nhiều nghiên cứu đ−ợc thực hiện nhằm xác định mối quan hệ giữa kích th−ớc nang và khả năng phát triển của trứng in vitro (Leibfried và First, 1979[106]; Fukui và cs, 1980[72]; Fuhrer và cs, 1989[67]; Fair và cs, 1995[62]; Otoi và cs, 1997[141]; Avery và cs, 2003[26]). Khi kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm và nuôi phôi đã ổn định và cho kết quả tốt thì việc đánh giá hiệu quả sản xuất phôi nang sau thụ tinh ống nghiệm đ−ợc dùng để đánh giá ng−ợc lại khả năng phát triển của trứng trong các nang đ−ợc xếp loại theo kích th−ớc (Madison và cs, 1992[119]; Pavlok và cs, 1992[149]; Lonergan và cs, 1994[112]; Blondin và cs, 1997[33]) hoặc một số tác giả đã nghiên cứu mối liên quan giữa tiềm năng phát triển của trứng (tạo phôi dâu và phôi nang) đến giai đoạn động dục của bò cho trứng (Arlotto, 1996)[22], hoặc kích th−ớc của trứng (Otoi và cs, 1997)[141], vị trí thu trứng trên buồng trứng (Takagi và cs, 1992[168]; Hamano và cs, 1993[83]; Arlotto, 1996[22]) cũng nh− sự kết hợp của nhiều yếu tố này (Gordon, 1994[78]; Lonergan và cs, 2003[115]). Hình thái của trứng là một đặc điểm ban đầu đáng l−u ý giúp chúng ta có thể nhanh chóng sơ bộ đánh giá tiềm năng phát triển của trứng về sau, nghĩa là có mối liên hệ chặt chẽ giữa chất l−ợng trứng với khả năng tạo phôi dâu và phôi nang sau thụ tinh ống nghiệm (Leibfried-Rutledge, 1986a)[107]. Trứng thu từ các nang ở các giai đoạn tạo nang khác nhau có khả năng phát triển và thành thục trong ống nghiệm là không khác nhau (Chian và cs, 2002)[47]. Thí nghiệm đ−ợc tiến hành trên 78 buồng trứng bò (Canada), mỗi nhóm thí nghiệm gồm 26 buồng trứng. Các buồng trứng đ−ợc phân lô tùy theo kích th−ớc nang định thu trứng cũng nh− sự hiện diện hay không của thể vàng. Nhóm 1 là nhóm có các nang đang ở pha sớm: tất cả các nang đều có đ−ờng kính nhỏ hơn hay bằng 8mm; nhóm 2 là nhóm có các nang đang ở pha muộn: tồn tại trên buồng trứng nang lớn nhất có đ−ờng kính bằng hoặc lớn hơn 15mm; nhóm 3 là nhóm đang ở pha thể vàng: tất cả các nang đều có đ−ờng kính nhỏ hơn hoặc bằng 8mm và có sự hiện diện của thể vàng trên buồng trứng. ở các nhóm thí nghiệm nói trên, tiến hành hút tất cả các nang và các trứng có chất l−ợng tốt đ−ợc nuôi trong 1 ml môi tr−ờng 199 có bổ sung 10% huyết thanh bò, 0,2mM pyruvate, 75mIU/ml FSH và LH (Humegon). Quá trình nuôi thành thục diễn ra trong tủ nuôi ở 38,50C; 5%CO2 trong 24 giờ. Sau khi thành thục, trứng đ−ợc thụ tinh ống nghiệm với tinh trùng đông lạnh, giải đông và sau đó tiếp tục nuôi phôi để đánh giá tỉ lệ phân chia, phôi dâu và phôi nang. Kết quả chỉ ra rằng, số trứng thu từ buồng trứng có nang đang ở giai đoạn sớm trong nhóm 1 là cao hơn đáng kể so với các nhóm khác (P<0,05). Nhóm 1 thu đ−ợc trung bình 32 + 8,1 trứng/buồng trứng và nhóm 2, 3 lần l−ợt là 20,1 + 5,4 và 22,7 + 6,9 trứng/buồng trứng. Tỉ lệ trứng thành thục, phân chia và phát triển đến giai đoạn phôi nang là không khác nhau. Cụ thể ở nhóm 1, các tỉ lệ nói trên lần l−ợt là 84,4%; 53,5% và 27,4%. Đối với nhóm 2 thì các tỉ lệ trên lần l−ợt là 89,2%; 53,3% và 33%. Kết quả trên nhóm 3 là 83,6%; 51,3% và 30,4%. Các kết quả trên chỉ ra rằng khả năng phát triển và thành thục của trứng thu từ các nang ở các giai đoạn phát triển khác nhau là không khác nhau. Trứng sau khi đ−ợc hút ra khỏi nang đ−ợc phân loại và nuôi thành thục trong ống nghiệm, ở bò, thời gian nuôi để trứng có thể phát triển đến giai đoạn Metaphase II là dao động xung quanh 24 giờ. Một công trình nghiên cứu của Nakagawa và cs (1995)[129] đã trình bày các giai đoạn thành thục nhân trứng và sự phát triển của hợp tử trong ống nghiệm. Các tác giả bố trí 4 lô thí nghiệm tùy thuộc vào thời gian nuôi thành thục trứng (14, 20, 24 và 28 giờ). Kết quả thu nhận nh− sau: tỉ lệ thành thục xác định bằng đánh giá trạng thái nhiễm sắc thể ở trạng thái Metaphase II lần l−ợt ở các lô là 0; 69,5; 76,1 và 81,7%; tỉ lệ phôi nang lần l−ợt là 21,2%; 36,6%; 46,8% và 32,5%. Việc bổ sung Estradiol-17β vào môi tr−ờng nuôi thành thục trứng có tác dụng cải thiện hiệu quả nuôi thành thục trong ống nghiệm các trứng bò thu từ các nang có đ−ờng kính 1-6mm (Fukui và cs, 1982[70]; Younis và cs, 1989[180]; Beker và cs, 2002[31]). Tuy nhiên, nồng độ Estradiol-17β cao lại có ảnh h−ởng âm tính đến việc hình thành các thoi vô sắc cũng nh− sự xuất hiện thể cực đầu tiên (Kruip và cs, 1988)[101]. Tóm lại, các trứng có chất l−ợng tốt thu từ buồng trứng đều ở trạng thái ch−a thành thục và hoàn toàn có thể nuôi thành thục trong các môi tr−ờng tổng hợp. Sự thành thục nhân, nguyên sinh chất, màng sáng có kèm theo những biến đổi và chuyển hóa cần thiết để trứng sẵn sàng tham gia vào quá trình thụ tinh tiếp theo. Chất l−ợng trứng, môi tr−ờng nuôi, điều kiện nuôi ... là các yếu tố có ảnh h−ởng trực tiếp đến kết quả nuôi thành thục ống nghiệm cũng nh− sự phát triển về sau của phôi ống nghiệm. 1.2 thụ tinh trứng bò trong ống nghiệm 1.2.1 Nguyên lý thụ tinh ống nghiệm và các giai đoạn của quá trình thụ tinh Thụ tinh in vitro lần đầu cho noãn bào của loài có vú, đã đợc tiến hành năm 1954 cho thỏ (Dauzer và cs, 1954)[182] từ những tinh trùng đã kiện toàn năng lực thụ tinh (trong tử cung) với những noãn bào mới rụng trứng. Năm năm sau (1959), sự ra đời của những thỏ con đã khẳng định tính chất bình thờng sinh học của kỹ thuật thụ tinh in vitro. Thụ tinh in vitro các noãn bào thành thục đã đợc thực hiện thành công trên nhiều loài và đợc tóm tắt qua bảng 1.3: Bảng 1.3: Lịch sử thụ tinh in vitro ở các loài có vú. Năm xác nhận qua đánh giá mô bào học hoặc sự phân chia của trứng Sinh con 1954: Thỏ 1963: Chuột đồng 1968: Chuột nhắt 1969: Ngời 1980: Bò 1989: Ngựa 1959 : Thỏ 1978 : Ngời 1981 : Bò 1985 : Dê 1986 : Cừu và lợn 1990 : Ngựa Các giai đoạn chính của quá trình thụ tinh in vitro và in vivo có những điểm tơng đồng nh phần trình bày dới đây. 1.2.1.1 Các giai đoạn của quá trình thụ tinh Tinh trùng xuyên qua lớp tế bào vành phóng xạ ở phần lớn các loài động vật có vú, có nhau thai; trứng rụng (thành thục in vivo) hoặc trứng chín (thành thục in vitro) đợc bao bọc xung quanh bởi nhiều lớp tế bào cumulus tơi bông. Chúng tạo nên một đám “ma trận” giàu axít hyaluronic. Đối với một số loài (bò, cừu, dê), đám tế bào cumulus này nhanh chóng tan rã sau khi trứng đã rụng (in vivo) và đi vào vòi trứng. Tinh trùng có thể tiếp xúc trực tiếp với vùng trong suốt của trứng. Tuy nhiên, trong in vitro, khi trứng đã đợc nuôi thành thục thì đám tế bào này vẫn còn bao quanh trứng. Chỉ những tinh trùng đã kiện toàn năng lực thụ tinh mới có thể đi qua đợc lớp tế bào cumulus nói trên. Tất cả tinh trùng khi tiếp cận với vùng trong suốt (sau khi đi qua đợc đám tế bào cumulus) đều còn acrosom nguyên vẹn (Cherr và cs, 1986[46]). Hyaluronidaza với một lợng ít ỏi, liên kết với màng ngoài của tinh trùng, có thể tạo cho chúng xuyên qua lớp tế bào cumulus một cách thuận lợi. Tơng tác của tinh trùng với màng trong suốt Trớc khi xuyên qua màng trong suốt của trứng, tinh trùng sẽ bám vào bề mặt màng trong suốt và thực hiện phản ứng acrosom. Vùng trong suốt đợc cấu tạo chủ yếu bởi các glycoprotein, mà trong họ có nhiều dạng đồng phân, chúng đã đợc xác định ở nhiều loài khác nhau. Ba glycoprotein chủ yếu có tên là ZP1, ZP2 và ZP3. ZP3 có kết cấu của một polypeptite, trên đó có ghép những chuỗi oligosaccharit đặc biệt có chứa fucose và N-acetyl glusamin. ZP2 và ZP3 liên kết với nhau để tạo nên những sợi có cầu nối với nhau bởi ZP1; nó tạo nên cấu trúc ba chiều của vùng trong suốt. Tinh trùng gắn vào vùng trong suốt Vùng trong suốt nhận biết và cố định đặc hiệu các tinh trùng cùng loài một khi chúng đã đợc kiện toàn năng lực thụ tinh. Sự kết dính này đợc xảy ra bởi tơng tác qua lại giữa các phân tử trên một phần bề mặt của tinh trùng và vùng trong suốt của trứng. Tinh trùng, khi đợc gắn vào vùng trong suốt, sẽ thực hiện phản ứng thể đỉnh của nó. Điều này nhằm bộc lộ màng trong của acrosom. Thân Phần d N-acetyl glucosamine Màng sáng Trứng Hình 1.3: Gắn kết ban đầu của tinh trùng vào vùng trong suốt (Shur và Hall, 1982)[162]. Một galactosyltransferaza màng tinh trùng đảm bảo cho cầu nối với gốc N-acetylglucosamin của ZP3. Sự gắn kết của tinh trùng mà acrosom còn nguyên đợc đảm bảo bằng những chuỗi glucide của ZP3 (ZP3 glu.), mặc dù phản ứng thể đỉnh đợc tiến hành bằng bộ phận protein của ZP3 (ZP3 pr.). Sự gắn kết của tinh trùng khi phản ứng thể đỉnh nhờ đến ZP2 và acrosin hãy còn liên kết tại màng trong acrosom của tinh trùng. Phản ứng thể đỉnh Theo quan điểm hình thái học, phản ứng thể đỉnh đợc đặc trng bằng sự dung giải dần dần màng sinh chất và màng ngoài acrosom của tinh trùng. Do đó, một mặt hình thành những bọng của màng và mặt khác tạo nên những lỗ trống để cho các chất chứa trong acrosom giải phóng ra ngoài. Phản ứng thể đỉnh xảy ra rất nhanh. Phản ứng này phụ thuộc vào nồng độ Ca+2. Phản ứng này luôn kèm theo việc tăng nồng độ Ca+2 nội bào và không thể đ c trong môi trờng thiếu Ca+2. Trong những điều kiện thông thờng, ngời ta còn bằng cơ chế nào xảy ra luồn ia một trong những giai đoạn đầu của phản ứng. cha rõ g Ca+2 vào để tham gạt đợ Màng sinh chất Màng trong acrosom Đai xích đạo Màng sinh chất Nhân Màng trong acrosom Màng ngoài accrosom Hình 1.4: Sơ đồ phản ứng thể đỉnh (Yanagimachi, 1988)[179] a. Trớc khi phản ứng: tinh trùng với acrosom còn nguyên vẹn b. Khi xảy ra phản ứng: màng sinh chất và màng ngoài acrosom bị dung giải làm hình thành những bọng của màng và những lỗ thủng, qua đó, chất chứa trong acrosom (bị thủy phân bởi các enzym của acrosom) phóng thích ra c. Khi phản ứng thể đỉnh đã xảy ra hoàn chỉnh: Tinh trùng bỏ mặc những bọng của màng. Màng trong acrosom của nó bộc lộ ra, đai xích đạo vẫn còn nguyên Cảm ứng phản ứng thể đỉnh bởi màng trong suốt của trứng: ở nhiều loài gia súc, vùng trong suốt bị hòa tan có cảm ứng in vitro với phản ứng thể đỉnh các tinh trùng cùng loài (Ehrenwald và cs, 1988[58]). Nh vậy ZP3 có tính 2 mặt chức năng: một mặt nó đảm bảo cho sự gắn kết tinh trùng và mặt khác nó phát động phản ứng thể đỉnh của nó. Sự gắn kết của phối tử ZP3 vào thể tiếp nhận của tinh trùng đã phát động những phân tử và những tế bào dẫn đến phản ứng thể đỉnh và nhất là luồng Ca+2 vào là một trong những chặng đầu của đợt phản ứng. Tinh trùng xuyên qua vùng trong suốt Khi thực hiện phản ứng thể đỉnh, tinh trùng thải những bọng màng (sản phẩm của phản ứng) lên bề mặt vùng trong suốt, sau đó chui qua lớp vỏ bọc này theo một đờng chéo góc. Dấu vết lu lại trong vùng trong suốt (do tinh trùng xuyên qua) có những bờ mép rõ nét, chứng tỏ sự xuyên nhập của tinh trùng đã sử dụng quá trình cơ giới hơn là quá trình enzym. Nhng hình nh chỉ riêng sức hoạt động của tinh trùng không đủ đảm bảo cho nó xuyên qua đợc vùng trong suốt. Ngời ta biết rằng hyaluronidaza thủy phân axit hyaluronic có chứa trong những mắt lới của vùng trong suốt. Acrosin không thể làm tan rã vùng trong suốt ở in vitro, nhng có thể thủy phân từng phần một số những glycoprotein (Dunbar và cs, 1985[55]; Chandler và cs, 1999[44]) và làm biến đổi kết cấu vùng trong suốt. Cả hai enzym này (và có thể những enzym khác), đợc phóng thích khi xảy ra phản ứng thể đỉnh, còn sót lại rải rác trên màng trong acrosom của tinh trùng, sẽ tiếp xúc trực tiếp với vùng trong suốt khi xuyên nhập. Sự dung hợp của giao tử đực và cái Sau khi vợt khỏi vùng trong suốt, tinh trùng đi vào khoảng trống quanh noãn hoàng và đi vào tiếp xúc với màng trong suốt noãn bào. Bấy giờ nó ngừng chuyển động và 2 giao tử dung hợp. Sự dung hợp xảy ra giữa màng sinh chất bao quanh đai xích đạo của tinh trùng với màng sinh chất của noãn bào. Màng sinh chất của tinh trùng hòa trộn với màng sinh chất noãn bào khi dung hợp. Còn màng trong acrosom thì hòa trộn trong bào tơng noãn bào cùng với nhân tinh trùng. ở các loài có vú, đoạn chính của đuôi đợc hòa trộn toàn bộ vào trong trứng. Sự hoạt hóa tế bào trứng Noãn bào đợc tinh trùng hoạt hóa kèm theo những biến đổi về trao đổi chất cũng nh những thay đổi quan trọng của tế bào. Mặc dù những cơ chế ở mức độ phân tử xảy ra trong hoạt hóa còn cha biết đợc cặn kẽ ở các loài có vú, nhng ngời ta cũng biết rằng thế năng truyền qua màng và sự huy động hàng loạt Ca+2 nội bào tạo nên những bớc ban đầu của hiện tợng này. Các biểu hiện ở mức tế bào đi theo sự hoạt hóa: sự xuất bào của những hạt lớp vỏ, hoàn thành phân chia giảm nhiễm lần thứ hai và những biểu hiện đặc điểm lớp vỏ của trứng, đều đợc xác định khá rõ. 1.2.1.2 Kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng in vitro Đây là một điều kiện bắt buộc đối với các tinh trùng tham gia vào quá trình thụ tinh in vitro. Hiện tợng kiện toàn năng lực thụ tinh (capacitation) của tinh trùng đ- ợc phát hiện bởi Austin (1951)[23] trên chuột và Chang (1951)[45] trên thỏ khi tiến hành thụ tinh bằng các tinh trùng trong ống dẫn trứng. Cả hai ông đều chỉ ra rằng, các tinh trùng trong tinh dịch khi phóng tinh đều không có khả năng thụ tinh trực tiếp với trứng mà chúng phải trải qua một thời gian nhất định trong đờng sinh dục con cái để đạt tới khả năng thụ tinh. Các biến đổi sinh lý, sinh hóa ở tinh trùng dẫn đến khả năng tơng tác một cách hiệu quả giữa tinh trùng và trứng đợc gọi là sự kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng (Austin, 1960[24], 1967[25]; Bedford, 1970[30]; Yanagimachi, 1981[178]). Một trong những vấn đề quan trọng nhất của sự kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng là sự diễn ra các biến đổi sinh lý, sinh hóa của màng sinh chất của tinh trùng. Sự loại bỏ từng bớc hoặc sự thay thế các lipoprotein ngoại vi, sự sắp xếp lại các lipoprotein nội màng, sự khử cholesterol màng và các thay đổi trong việc phân bố cũng nh thành phần của một số phospholipit màng, tất cả chúng đều đóng góp vào sự biến đổi màng nói trên (Yanagimachi, 1981[178]; Cooper, 1986[49]; Yanagimachi, 1988[179]; Eddy, 1988[57], Parrish và cs, 1989[146]). Để có thực tiễn cũng nh để tìm hiểu những cơ chế của sự kiện toàn năng lực thụ tinh, ngời ta đã thăm dò việc thụ tinh bằng những tinh trùng đ- ợc kiện toàn năng lực thụ tinh in vitro. Những lần thụ tinh in vitro đầu tiên trong những điều kiện nh vậy đã đạt kết quả đối với loài gậm nhấm (chuột đồng, 1963; chuột nhắt, 1968), sau đó là đối với ngời (1969), còn với đại gia súc thì muộn hơn nhiều (1981-1990). Thời gian kiện toàn năng lực thụ tinh in vitro của tinh trùng bò, cừu, dê, lợn và ngựa cũng lâu hơn nhiều (4-6 giờ) so với ngời và các loài gậm nhấm bé và vấn đề đặt ra là phải duy trì sức hoạt động in vitro trong nhiều giờ. Trong công nghệ thụ tinh ống nghiệm, xử lý nhằm kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng là một khâu quan trọng, ảnh hởng trực tiếp đến kết quả thụ tinh ống nghiệm sau này. Phơng pháp kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng in vitro Cơ sở của các phơng pháp kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng in vitro là dựa trên những hiểu biết về quá trình này đã xảy ra trong tự nhiên (in vivo). Các quan tâm liên quan qúa trình này bao gồm: - Loại bỏ tinh thanh và pha loãng tinh trùng trong các môi trờng cho phép xảy ra sự kiện toàn năng lực thụ tinh, đồng thời chú ý giữ cho đợc sự vận động tự nhiên của chúng. Thành phần và tính chất của các môi trờng sử dụng vào mục đích này đợc pha chế trên cơ sở những hiểu biết về các chất tiết trong ống dẫn trứng (môi trờng B2), hoặc huyết thanh (môi trờng 199, Hank’s), hoặc đơn giản chỉ là những biến thể của môi trờng nớc muối (môi trờng Tyrode, Krebs-Ringer), hoặc phổ biến hơn nữa là sử dụng môi trờng Phosphate Buffered Saline (PBS). - Cần có sự hiện diện của chất mang cholesterol là huyết thanh hay albumin huyết thanh, chúng đảm bảo cho việc bảo vệ màng tế bào. Huyết thanh là có hiệu quả hơn albumin huyết thanh nhờ những lipotrotein (HDL, LDL, VLDL) có khả năng thu giữ cholesterol tốt hơn (11%, 40% và 44% so với 7%). Dịch nang trứng cũng là một chất mang có hiệu quả vì nó có chứa HDL. - Sự có mặt của heparin trong môi trờng kiện toàn năng lực thụ tinh cải thiện đáng kể hiệu quả thụ tinh ống nghiệm ở bò. Giống nh glycosaminoglycan, chất heparin luôn có mặt trong chất tiết của tử cung và ống dẫn trứng của bò và cừu. Điều này, trớc đây đã đợc ngời ta lu ý nhiều. Vai trò đáng kể của heparin trong môi trờng kiện toàn năng lực thụ tinh là rõ ràng, tuy nhiên, kiểu tác động của nó nh thế nào thì đến nay vẫn còn cha sáng rõ. Ngời ta chỉ biết rằng, heparin làm thuận lợi cho việc đi vào màng tinh trùng của ion Ca+2 (Handrow và cs, 1989)[85]. Tuy nhiên, những điều kiện không thể thiếu trong in vivo để đảm bảo cho những thay đổi của protein màng (ví dụ nh pH thấp, hoạt tính của các enzym khác nhau...) lại là không có trong in vitro. Nhng vì quá trình kiện toàn năng lực thụ tinh vẫn xảy ra trong in vitro, nên ngời ta phải công nhận rằng tự bản thân các tinh trùng đã đóng góp vào việc tạo nên các điều kiện cần thiết để có thể tự kiện toàn năng lực thụ tinh của chúng. Từ đó, ngời ta đa ra một giả thuyết là cần thiết phải ủ tinh trùng với một nồng độ cao (Nagai và cs, 1984)[128]. Khi ủ ở nồng độ cao, khoảng 10% hay hơn thế, các tinh trùng tự chúng giải phóng chất chứa trong acrosom, và nhờ nồng độ các enzym giải phóng ra đó, khi chúng đạt tới một mức đủ, chúng sẽ làm thay đổi thành phần màng của những tinh trùng khác. Trong in vitro, không có những protein bao phủ có nguồn gốc từ tử cung hay vòi trứng, điều này giải thích vì sao trong in vitro không thể giữ đợc tinh trùng tồn tại lâu 24-36 giờ nh trong in vivo. Dới đây là một số phơng pháp xử lý tinh trùng bò dùng trong thụ tinh ống nghiệm đợc sử dụng ở các phòng thí nghiệm: - Phơng pháp bơi ngợc (swim-up): Tinh trùng đông lạnh trong cọng rạ đợc giải đông ở 35oC trong vòng 1 phút. Toàn bộ tinh trùng đợc cho vào môi trờng TALP trong 1 giờ ở 39oC. Thu lấy phần tinh trùng bên trên và ly tâm 200g trong 10 phút. Những tinh trùng này đạt tiêu chuẩn đa vào môi trờng thụ tinh (Parrish, 1986b)[148]. - Phơng pháp ly tâm : Tinh trùng đông lạnh dạng cọng rạ (0,25ml) đợc giải đông trong nớc ấm (37oC) và rửa 3 lần trong môi trờng BO (thành phần nh bảng dới). Môi trờng này đợc bổ sung 5mM caffein, ly tâm thu tinh trùng ở 700g trong 5 phút. Tiếp đó, tinh trùng đợc ủ trong tủ nuôi (incubator) trong vòng 2-3 giờ, tủ nuôi có chế độ 5%CO2. Tinh trùng thu đợc lúc này đã sẵn sàng để đa vào môi trờng thụ tinh (Goto và cs, 1988)[80]. - Phơng pháp lọc qua phân lớp percoll: Tinh trùng đông lạnh dạng cọng rạ đợc giải đông trong nớc ấm 35- 37oC. Chúng đợc cho lên lớp percoll với các nồng độ khác nhau (90%/45%), ly tâm 20-30 phút ở 700g. Phần lắng xuống đáy là những tinh trùng khỏe, đạt tiêu chuẩn đa vào môi trờng thụ tinh (Gutierrez-Adan và cs, 2001)[81]. Đánh giá sự kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng Một số tác giả đã có ý định chứng minh hoặc làm rõ hiện tợng kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng bằng cách sử dụng chỉ thị huỳnh quang trên màng sinh chất của tinh trùng (lectine, c._.ided aspiration of bovine follicular oocytes”, Theriogenology, 27, 217. 42. Camous S., Heyman Y., Meiziou W. and Menezo Y (1984), “Cleavage beyond the block stage and survival after transfer of early bovine embryos co-cultured with trophoblastic vesicles”, J. Reprod. Fert., 72, 479-485. 43. Carolan C., Lonergan P., Van Lanendockt A., Mermillod P. (1995), “Factors affecting bovine embryo development in synthetic oviduct fluid following oocyte maturation and fertilization in vitro”, Theriogenology , 43, 1115-1118. 44. Chandler J.E., Degelos S.D., Canal A.M. and Paul J.B. (1999), “A technique for the evaluation of sperm penetrating ability and quality of bovine semen processed in an extender made with Brackett- Oliphant medium and egg yolk”, Theriogenology, 51, 1467-1476. 45. Chang M.C. (1951), “Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the Fallopian tubes”, Nature. Lond., 168, 697-698. 46. Cherr G.N., Lambert H., Meizel S., Katz D.F. (1986), “In vitro studies of the golden hamster sperm acrosome reaction: completion on the zona pellucida and induction by homologous solubilized zona pellucida”, Dev. Biol., 114, 119-131. 47. Chian R.C., Chung J.T., Downey B.R., Tan S.L. (2002), “Maturational and developmental competence of immature oocytes derived from bovine ovaries at different phases of folliculogenesis”. Reprod Biomed Online, 4(2), 127-132. 48. Chung J.T., Keefer C.L. and Downey B.R. (2000), “Activation of bovine oocytes following intracytoplasmic sperm injection (ICSI)”, Theriogenology, 53, 1273-1284 49. Cooper T.G. (1986). The Epididymis, Sperm Maturation and Fertilization. Springer-Verlag, Berlin. 50. Criser E.S., Leibfried M.L., First N.L. (1984), “The effect of semen extension, cAMP and caffein on in vitro fertilization of bovine oocytes”, Theriogenology, 21, 625-631. 51. De Loos F., Van Vliet C., Van Maurik P., Kruip T.A.M. (1989), “Morphology of immature bovine oocytes”. Gamete Research, 24, 197-204. 52. De Roover R., Genicot G., Leonard S., Bols P., Dessy F. (2005), “Ovum pick up and in vitro embryo production in cows superstimulated with an individually adapted superstimulation protocol”, Anim. Reprod. Sci., 86 (1-2), 13-25. 53. Donnay I., Van Langendonckt A., Anquier P., Grisart B., Vansteenbrugge A, Massip A., Dessy F. (1997), “Effects of co- culture and embryo number on the in vitro development of bovine embryos”, Theriogenology, 47, 1549-1561. 54. Duc N.H., Uoc N.T., Ty L.V., Hanh N.V., Thanh N.T., Bui L.C., Anh N.T., Huu Q.X., Nguyen B.X. (2003), “Potential for in vitro production of embryo from follicular oocyte of Yellow and Yellow- RedSindhi crossbred cattle”, Theriogenology, 59 (1), 442. 55. Dunbar B.S., Budkiewicz A.B., Bundman D.S. (1985), “Proteolysis of specific porcine zona pellucida glycoproteins by boar acrosine”, Biol. Reprod., 32, 619-630. 56. Eckert J., Neimann H. (1995), “In vitro maturation, fertilization and culture to blastocysts of bovine oocytes in protein-free media”, Theriogenology, 43, 1211. 57. Eddy E.M. (1988), Theriogenology spermatozoa. In the Physiology of Reproduction, Eds E. Knobil & J.D. Neill. Raven Press. New York. Vol. 1, 27-68. 58. Ehrenwald E., Parks J.E., Foot R.H. (1988), “Cholesterol efflux from bovine sperm. In Induction of the acrosome reaction with lysophosphatidylcholine after reducing sperm cholesterol”, Gam. Res., 20, 145-157. 59. Eyestone W.H. and First N.L. (1986), “A study of the 8-16 cells developmental block in bovine embryos cultured in vitro”, Theriogenology, 25, 152. 60. Eyestone W.H., First N.L. (1989), “Co-culture of early cattle embryos to the blastocyst stage with oviductal tissue or in conditionned medium”. J. Reprod. Fert., 85, 715-720. 61. Eyestone W.H., Northey D.L. and Leibfried-Rutledge M.L. (1985), “Culture of 1-cell bovine embryos in the sheep oviduct”, Biol. Reprod., 32, 125. 62. Fair T., Hyttel P., Greve T. (1995), “Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity”, Mol. Reprod. Dev., 42, 437-442. 63. Farin C.E., Hasler J.F., Martus N.S. (1995), “Comparison of Menezo B2 and TCM-199 media for in vitro production of bovine blastocysts, Theriogenology, Vol. 43, No. 1, 210. 64. Ferry L., Mermillod P., Massip A., Dessy F. (1994), “Bovine embryos cultured in serum-poor oviduct-conditionned medium need cooperation to reach the blastocyst stage”, Theriogenology, 42, 445- 453. 65. Fischer-Brown A., Crooks A., Leonard S., Monson R., Northey D., Rutledge J.J. (2005), “Parturitionfollowing transfer of embryos produced in two media under two oxygen concentrations”, Anim. Reprod. Sci., 87 (3-4), 215-218. 66. Fraser L.R. (1984), “Mechanisms controlling mammalian fertilization”. Oxford Rev. Reprod. Biol., 6, 174. 67. Fuhrer F., Nayr B, Schellander K., Kalat M., Schleger W. (1989), “Maturation competence and chromatin behavior in growing and fully grown cattle oocytes”, J. Vet. Med., 36, 285-291. 68. Fukuda Y., Ichikawa M., Naito K. and Toyoda Y. (1990), “Birth of normal calves sedulting from bovine oocytes matured, fertilized and cultured with cumulus cells in vitro up to the blastocyt stage”, Biology of reproduction, 42, 114-119. 69. Fukui Y., Fukushima M. and Ono H. (1983), “Fertilization in vitro of bovine oocytes after various sperm procedures”. Theriogenology, 20, 651-660. 70. Fukui Y., Fukushima Y., Terawaki Y., Ono H. (1982), “Effect of gonadotropins, steroids and culture media on bovine oocyte maturation in vitro, Theriogenology, 18, 161-175. 71. Fukui Y., McGowan L.T., James R.W., Pugh P.A. and Tervit H.R. (1991), “Factors affecting the in vitro development to blastocysts of bovine oocytes matured and fertilized in vitro”, Journal of Reproduction & Fertility, 92, 125-131. 72. Fukui Y., Sakuma Y. (1980), “Maturation of bovine oocytes cultured in vitro in relation to ovary activity, follicular size and the presence or absence of cumulus cells”, Biol. Reprod., 20, 313-319. 73. Fukushima M. and Fukui Y. (1985), “Effects of gonadotropin and steroids on the subsequent fertilizability of extrafollicular bovine oocytes cultured in vitro”, Animal Reproduction Science, 9, 323- 332. 74. Funahashi H., Aoyagi Y., Takeda T., Onihara T. (1991), “Developmental capacity of bovine oocytes collected from ovaries of individual heifer and fertilized in vitro”. Theriogenology, Vol. 36, No. 3, 427-434. 75. Galli C., Crotti G., Notari C., Turini P., Duchi R. and Lazzari G. (2001), “Embryo production by ovum pick up from live donors”, Theriogenology, 55, 1341-1357. 76. Geshi m., Yonai M., Sakaguchi M. and Nagai T. (1999), “Improvement of in vitro co-culture systems for bovine embryos using a low concentration of carbon dioxide and medium supplemented with β-mercaptoethanol”, Theriogenology, 51, 551- 558. 77. Gomez E., Diez C. (2000), “Effects of glucose and protein sources on bovine embryo development in vitro”, Anim. Reprod. Sci., 58, 23- 37. 78. Gordon I. (1994), Laboratoty production of cattle embryos. Wallingford UK: CAB International. 79. Goto K. and Iritani A. (1992), “Oocyte maturation and fertilization”, Animal Reproduction Science, 28, 407-413. 80. Goto K., Kajahara Y., Kosaka S., Koba M., Nakanishi Y., Ogawa K. (1988), “Pregnancies after co-culture of cumulus cells with bovine embryos derived from in vitro fertilization of in vitro matured follicular oocytes”, J. Reprod. Fert., 83, 753-758. 81. Gutierrez-Adan A., Lonergan P., Rizos D., Ward F.A., Boland M.P., Pintado B. and J. de la Fluent (2001), “Effect of the in vitro culture system on the kenetics of blastocyst development and sex ratio of bovine embryos”, Theriogenology, 55, 1117-1126. 82. Guyader-Joly C., Ponchon S., Durand M., Menck C., Heyman Y. (1996), “Quality assessment of bovine IVF embryos cultured on vero cells”, 12th European Embryo Transfer meeting, Lyon, 13-15 Sept. 1996, 153. 83. Hamano K., Kuwayama M. (1993), “In vitro fertilization and development of bovine oocytes recovered from the ovaries of individual donors: a comparison between the cutting and aspiration method”, Theriogenology, 3, 1421-1423. 84. Hanada A.. Sakamoto T., Shiyoa Y. and Kobayashi J. (1986), “In vitro fertilization of bovine oocytes matured in vitro”, Pro. 77th Ann. Meet. Jpn. Soci. Zootech. Sci., 79. 85. Handrow R.R., First N.L., Parrish J.J. (1989), “Calcium requirement and increased association with bovine sperm during capacitation by heparin”, J. Exp. Zool., 252, 174-182. 86. Handrow R.R., LenR.W. and Ax R.L. (1982), “Structural comparisons among glycosaminoglycans to promote an acrosome reaction in bovine spermatozoa”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 107, 1326-1332. 87. Hasler J.F., Henderson W.B., Hurtgen P.J., Jin Z.Q., McCauly A.D., Mower S.A., Neely B., Shuey L.S., Stokes J.E., Trimmer S.A. (1995), “Production, freezing and transfer of bovine IVF embryos and subsequent calving results”, Theriogenology, 43, 141-152. 88. Hazeleger N.L., Hill D.J., Stubbings R.B., Walton J.S. (1995), “Relationship of morphology and follicular fluid environment of bovine oocytes to their developmental potential in vitro”, Theriogenology, 43, 509-522. 89. Hensleigh H.C. and Hunter A.G. (1985), “In vitro maturation of bovine cumulus enclosed primary oocytes and their subsequent in vitro fertilization and cleavage”, J. Dairy Sci., 68, 1456-1562. 90. Heyman Y., Menezo Y., Chesne P., Camous S. and Garnier V. (1987), “In vitro cleavage of bovine and ovine early embryos improved development using co-culture with trophoblastic vesicles”, Theriogenology, 27, 59-68. 91. Holm P., Booth P.J., Schmidt M.H., Greve T., Callesen H. (1999), “High bovine blastocyst development in a static in vitro production system using SOFaa medium supplemented with sodium citrate and myo-inositol with or without serum-proteins”, Theriogenology, 52, 683-700. 92. Hunter R.H.F. and Wilmut I. (1984), “Sperm transport in the cow. Periovulatory redistribution of viable cells within the oviduct”, Reprod. Nutrr. Develop., 24, 597-608. 93. Iritani A. and Niwa K. (1977), “Capacitation of bull spermatozoa and fertilization in vitro of cattle follicular oocytes matured in culture”, J. Reprod. Fert., 50, 119-121. 94. Iritani A., Kasai M., Niwa K. and Song H.B. (1984), “Fertilization in vitro of cattle follicular oocytes with ejaculated spermatozoa capacitated in a chemically defined medium”, J. Reprod. Fert., 70, 487-492. 95. Jacobsen H., Schimdt M., Holm P., Sangild P.T., Vajta G., Greve T. and Callesen H. (2000), “Body dimensions and birth and organ weights of calves derived from in vitro produced embryos cultured with or without serum and oviduct epithelium cells”, Theriogenology, 53, 1761-1769. 96. Kajihara Y., Roses G., Lago I., Calvo J., Fila D. and Crispo M. (1999), “Influence of culture medium on the development of bovine blastocysts”, Theriogenology, Vol. 51, No. 1, 239. 97. Katska L. and Smorag Z. (1985), “The influence of culture temperature on in vitro maturation of bovine oocytes”, Anim. Reprod. Sci., 9, 205-212. 98. Keefer C.L. and Paprocki A.M. (1995), “Effect of percoll following sperm separation on in vitro fertilization of bovine oocytes”, Theriogenology, Vol. 43, No. 1, 244. 99. Keskintepe L., Burnley C.A., Brackett B.G. (1995), “Production of viable bovine blastocysts in defined in vitro conditions”, Biol. Reprod., 52, 1410-1417. 100. Krisher R.L., Lane M., Bavister B.D. (1998), “Influence of semi- defined culture media on the development, cell number and metabolism of bovine embryos”, Theriogenology, 49, 207. 101. Kruip TAM., Van Beneden T.H., Dieleman S.J., Bevers M.M. (1988), “The effect of Estradiol-17β on nuclear maturation of bovine oocytes”, Proceedings of the 11th international Congress on Animal Reproduction, Vol. 3, 336. 102. Kruip Th.A.M., Boni R., Wurth Y.A., Roelofsen M.W.M., Pieterse M.C. (1994), “Potential use of ovum pick up for embryo production and breeding in cattle”, Theriogenology, 42, 675-684. 103. Lambert R.D., Sirard M.A., Bernard C., Beland R., Rioux Leclerc J.E., Menard P. and Bedyoa M. (1986), “In vitro fertilization of bovine oocytes matured in vivo and collected at laparoscopy”, Theriogenology, 25, 117-133. 104. Langlais J., Kan F.W.K., Granger L., Raymond L., Bleau G., Roberts K.D. (1988), “Identification of sterol acceptors that stimulate cholesterol efflux from human spermatozoa during in vitro capacitation”, Gamete Res., 20, 188. 105. Lee C.N. and Ax R.L. (1984), “Concentrations and composition of glycosaminoglycans in the female bovine reproductive tract”. J. Dairy Sci., 67, 2006-2009. 106. Leibfried L., First N.L. (1979), “Characterization of bovine follicular oocytes and their ability to mature in vitro”. J. Anim. Sci., 48, 76- 86. 107. Leibfried-Rutledge M.L., Critser E.S., Eyestone W.H., Northey D.L. and First (1986a), “Developmental potential of bovine oocytes matured in vitro or in vivo”, Theriogenology, 25, 164. 108. Lenz R.W., Ball G.D., Leibfreid M.L., Ax R.L. and First N.L. (1983a), “In vitro maturation and fertilization of bovine oocytes are temperature-dependent processes”, Biol. Reprod., 29, 173-179. 109. Lim J.M., Okitsu O., Okuda K., Niwa K. (1994), “Effect of fetal calf serum in medium on development of bovine oocytes matured and fertilized in vitro”, Theriogenology, 41, 1091-1098. 110. Lima P.F., Oliveira M.A., Goncalves P.B., Montagner M.M., Reichenbach H.D., Weppert M., Neto C.C., Pina V.M., Santos M.H. (2004), “Effects of retinol on the in vitro development of Bos indicus embryos to blastocysts in two different culture systems”, Reprod. Domest. Anim., 39 (5), 356-360. 111. Liu Z. and Foote R.H. (1995), “Effects of CO2 concentrations and superoxide dimustase on the development of IVM/IVF bovine embryos in KSOM with 2,5mM Hepes”, Theriogenology, Vol. 43, No. 1, 268. 112. Lonergan P. Monaghan P., Rizos D., Boland M.P., Gordon I. (1994), “Effect of follicle size on bovine oocyte quality and developmental competence following maturation, fertilization and culture in vitro”, Mol. Reprod. Dev., 37, 48-53. 113. Lonergan P., Carolan C., Van Langendonckt A., Donnay I., Khatir H., Mermillod P. (1996), “Role of Epidermal Growth Factor in bovine oocyte maturation and preimplantation embryo development”, Biol. Reprod., 54, 1412-1421. 114. Lonergan P., O’Kearney-Flynn M., Boland M.P. (1999), “Effect of protein supplementation and presence of an antioxidant on the development of bovine zygotes in synthetic oviduct fluid medium under high or low oxygen tension”, Theriogenology, 51, 1565- 1576. 115. Lonergan P., Rizos D., Gutierrez-Adan A., Fair T., Boland M.P. (2003), “Oocyte and embryo quality: effect of origin, culture conditions and gene expression patterns”, Reprod. Domest. Anim., 38(4), 259-267. 116. Lu K.H., Cran D.G. and G.E. Seidel Jr. (1999), “In vitro fertilization with flow-cytometrically-sorted bovine sperm”, Theriogenology, 52, 1393-1405. 117. Lu K.H., Gordon I., Chen H.B., Gallagher M., McGovern H. (1988), “Birth of twins after transfer of cattle embryos produced by in vitro techniques”, Vet. Res., 122, 539-40. 118. Lu K.H., Gordon I., Gallagher M., McGovern H. (1987), “Pregnancy established in cattle by transfer of embryos derived from in vitro fertilization of oocytes matured in vitro”, Vet. Rec., 121, 259-260. 119. Madison V., Avery B., Greve T. (1992), “Selection of immature bovine oocytes for developmental potential in vitro”, Anim. Reprod. Sci., 27, 1-11. 120. Mastromonaco G.F., Semple E., Robert C., Rho G.J, Betts D.H., King W.A. (2005), “Different culture media requirements for IVF and nuclear transfer bovine embryos”, Reprod. Domest. Anim., 39 (6), 462-467. 121. Mermillod P., Wils C., Massip A. and Dessy F. (1992), “Collection of oocytes and production of blastocysts in vitro from individual, slaughtered cows”, Journal of Reproduction & Fertility, 92, 717- 723. 122. Merton J.S. and Mullart E. (1999), “Comparison of the effect of two bovine in vitro culture system, TC199/FCS/BRL-co-culture and SOFaaBSA, on embryo production and pregnancy rate”, Theriogenology, Vol. 51, No. 1, 248. 123. Merton J.S., J.A.W. van Dillen, Hasler J.F. and J.H.G. den Das (1995), “Effect of co-culture media and CO2 concentration on embryo development in a bovine embryo in vitro production system”, Theriogenology, Vol. 43, No. 1, 280. 124. Mizushima S. and Fukai Y. (2000), “Fertilizability and developmental capacity of bovine oocytes cultured individually in a chemically defined maturation medium”, Theriogenology, 55, 1431-1445. 125. Moor R.M. and Trouson A.O. (1977), “Hormonal and follicular factors affecting maturation of sheep oocytes in vitro and their subsequent developmental capacity”, J. Reprod. Fert. 49, 101-109. 126. Mtango N.R., Varisanga M.D., Dong Y.J., Rajamahendran R., Suzuki T. (2003), “Growth factors anh growth hormone enhance in vitro embryo production and post-thaw survival of vitrified bovine blastocytes”, Theriogenology, 59(5-6), 1393-1402. 127. Myers M.W., Broussard J.R., Menezo Y., Prough S.G., Blackwell J., Godke R.A., Thibodeaux J.K. (1994), “Established cell lines and their conditioned media support bovine embryo development during in vitro culture”, Human Reprod., 9, 1927-1931. 128. Nagai T., Niwa K., Iritani A. (1984), “Effect of sperm concentration during preincubation in a defined medium on fertilization in vitro of pig follicular oocytes”, J. Reprod. Fert., 70, 271-275. 129. Nakagawa A., Martino A., Pollard J.W., Leibo S.P. (1995), “Stage of nuclear maturation of bovine oocytes at insemination influences sperm penetration and zygote development”, Theriogenology, 43, 286. 130. Newton C.R., Hansen P.J. and Low B.G. (1988), “Characterization of a high molecular weight Glycoprotein secreted the pre-implantation bovine conceptus”, Biology of Reproduction, 39, 553-560. 131. Nguyen B.X., Ty L.V., Duc N.H., Uoc N.T. (1997), “Vietnam: The degradation of bioresources and the attempts to apply biotechnology for their sustainable conservation and utilization”, Proceedings of the IUPAC Conference, Phuket, Thailand, 23-27 November 1997, 83. 132. Nguyen B.X., Uoc N.T., Ty L.V., Duc N.H. (1998), “Potential of genetic diversity and embryo biotechnology for improvement of meat-milk production under tropical conditions”, Proceedings of the 4th Asia-Pacific Conference on Agricultural Biotechnology, 13- 16 July 1998, Darwin, Australia, 292-294. 133. Nguyen B.X., Uoc N.T., Ty L.V., Long D.D., Duc N.H. (1996), “Embryo technology in Vietnam, contemporary results obtained in a national project”, Proceedings of the 2nd Asian Symposium on Animal Biotechnology. November 11-14/1996, Nanjing, China, 21- 28. 134. Nguyen B.X., Uoc N.T., Ty L.V., Long D.D., Duc N.H. (1996), “Embryo transfer in cattle under tropical and nonstandardized breeding conditions of Viet Nam”, Proceedings of the Third Asia Pacific Conference on Agricultural Biotechnology: Issues and Choices. 10-15 November 1996, Thailand, 22-26. 135. Niwa K., Ohgoda O. (1988), “Synergistic effect of caffeine and heparin on in vitro fertilization of cattle oocytes matured in culture”, Theriogenology, Vol. 30, No. 4, 733-741. 136. Numabe T., Oikawa T., Kikuchi T., Horiuchi T. (2000), “Birth weight and birth rate of heavy calves conceived by transfer in vitro or in vivo produced bovine embryos”, Anim. Reprod. Sci., 64, 13-20. 137. Ohgoda O., Niwa K., Yuhara M., Takahashi S. and Kanoya K. (1988), “Variations in penetration rates in vitro of bovine follicular oocytes do not reflect conception rates after artificial insemination using frozen semen from different bulls”, Theriogenology, Vol. 29, No. 6, 1375-1381. 138. Oikawa T., Tanada N., Kikuchi T., Numabe T., Takenaka M., Horiuchi T. (2005), “Evaluation of activation treatments for blastocyst production and birth of viable calves following bovine intracytoplasmic sperm injection”, Anim., Preprod. Sci., 86 (3-4), 187-194. 139. Oliphant G., Brackett B.G. (1973), “Immunological assessment of surface changes of rabbit sperm undergoing capacitation”, Biol. Reprod., 9, 404. 140. Olson S.E. and Seidel G.E. (1995), “Vitamine E improves development of bovine embryos produced in vitro”, Theriogenology, Vol. 43, No. 1, 289. 141. Otoi T., Yamamoto K., Koyama N., Tachikawa S., Suzuki T. (1997), “Bovine oocyte diameter in relation to developmental competence”, Theriogenology, 48, 769-774. 142. Oyamada T., Iwayama H., Fukui Y. (2004), “Additional effect of epidermal growth factor during in vitro maturation for individual bovine oocytes using a chemically defined medium”, Zygote, 12 (2), 143-150. 143. Paloma Duque, Enrique Gomez, Elena Diaz, Nieves Facal, Carlos Hidalgo, Carmen Diez (2003), “Use of two replacements of serum during bovine embryo culture in vitro”, Theriogenology, 59, 889- 899. 144. Papis K., Avery B., Holm P, Callesen H. and Greve T. (1995), “The effect of vitrification solution, equilibration time, and direct dilution method on survivabilitty of equilibrated or vitrified bovine in vitro matured oocytes”, Theriogenology, Vol. 43, No. 1, 293. 145. Parrish J..J., Susko-Parrish J.L. and First N.L. (1985a), “Effect of heparine and chondroitin sulfate on the acrosome reaction and fertility of bovine sperm in vitro”. Theriogenology, 24, 537-549. 146. Parrish J.J., Susko-Parrish J., First N.L. (1989), “Capacitation of bovine sperm by heparin: inhibitory effect of glucose and role of intracellular pH”, Biol. Reprod., 41, 683. 147. Parrish J.J., Susko-Parrish J., Winer M.A., First N.L. (1989), “Capacitation of bovine sperm by heparin”, Biol. Reprod., 38, 1171- 1180. 148. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., Leibfried-Rutledge M.L. (1986b), “Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen”, Theriogenology, 25, 591-600. 149. Pavlok A.A., Lucas-Hahn, Niemann H. (1992), “Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles”, Mol. Reprod. Dev., 31, 63- 67. 150. Pieterse MC., Kappen KA., Kruip ThAM., Taverne MAM. (1988), “Aspiration of bovine oocytes during transvaginal ultrasound scanning of the ovaries”, Theriogenology, 30, 751-761. 151. Pinyopummintr T., Bavister B.D. (1991), “In vitro matured/in vitro fertilized bovine oocytes can develop into morulae/blastocyst in chemically defined, protein-free media”, Biol. Reprod., 45, 736- 746. 152. Puglisi R., Balduzzi D., Galli A. (2004), “In vitro sperm penetration speed and its relationship with in vivo bull fertility”, Reprod. Domest. Anim., 39 (6), 424-428. 153. Renard J.P., Buisson F.M., Wintenberger-Torres S. and Menezo Y. (1976), In-vitro culture of cow embryos from Day 6 and Day 7, Eggs transfer in cattle, 159-164. 154. Richard F., Sirard M.A. (1993), “The effect of co-culture of follicular components with bovine oocytes on meiotic resumption”, Biol. Reprod., 48, 123. 155. Sato E., Iritani A. and Nishkawa Y. (1977a), “Effects of energy sources on oocyte maturation in pig and cattle”, Jap. J. Zool. Sci., 48, 333-335. 156. Sato E., Iritani A. and Nishkawa Y. (1977b), “Factors involved in maturation of pig and cattle follicular oocytes cultured in vitro”, Jap. J. Anim. Reprod., 23, 12-18. 157. Schwartz M.A., Koehler J.K. (1979), “Alteration in lectin binding to guinea pig spermatozoa accompanying in vitro capacitation and the acrosome reaction”, Biol., Reprod., 21, 1295. 158. Screenan J. (1968), “In vivo and in vitro culture of cattle eggs”, Proc. 6th. Int. Congr. Anim. Reprod. & A.I., Paris, 577-580. 159. Seidel G.E., Larson L.L., Spilman C.H., Haln J. and Foote R.H. (1971), “Culture and transfer of calf ova”, J. Dairy Sci., 54, 923- 926. 160. Seidel G.E., Leipold S.D. and Shawki H. (1995), “Preparation of sperm for in vitro fertilization by swim-up or centrifugation through Percoll or BSA”, Theriogenology, Vol. 43, No.1, 319. 161. Shioya Y., Kuwayama M., Fukushima M., Iwasaki S. and Hanada A. (1988), “In vitro fertilization and cleavage capability of bovine follicular oocytes classified by cumulus cells and matured in vitro”, Theriogenology, Vol. 13, No. 3, 489-496. 162. Shur B.D., Hall N.G. (1982), “A role of mouse sperm surface galactosyltransferase in sperm binding to the egg zona pellucida”, J. Cell Biol., 95, 574-579. 163. Sirard M.A., Lambert R.D., Menard D.P. and Bedoya M. (1985), “Pregnancies after in vitro fertilization of cow follicular oocytes, their incubation in rabbit oviduct and their transfer to the cow uterus”, J. Reprod. Fert., 75, 551-556. 164. Sirard M.A., Parrish J.J., Ware C.B., Liebfried-Rutledge M.L., First N.L. (1988), “The culture of bovine oocytes to obtain developmentally competent embryos”, Biology of Reproduction, 39, 546-552. 165. Sirisathien S., Hernandez-Foncesca H.J., Brackett B.G. (2003), “Influences of epidermal growth factor and insulin-like growth factor-1 on bovine blastocyte development in vitro”, Anim. Reprod. Sci., 77(1-2), 21-32. 166. Springfellow D.A., Wrathall A.E. (1995), “Epidemiological implications of the production and transfer of IVF embryos”, Theriogenology, 43, 89-96. 167. Staigmiller R.B. and Moor R.M. (1984), “Effect of follicle cells on the maturation and developmental competence of ovine oocytes matured outside the follicle”, Gamete Res., 9, 221-229. 168. Takagi Y., Mori k., Takahashi T., Sugawara S., Masaki J. (1992), “Differences in development of bovine oocytes recovered by aspiration or by mincing”. J. Anim. Sci., 70, 1923-1927. 169. Tervit H.R., Whittingham D.G., Rowson LEA. (1972), “Successful culture in vitro of sheep and cattle ova”, J. Reprod. Fertil., 30, 493- 497. 170. Thibault C., Levaseur M.C., Hunter R.H.F. (1993), Reproduction in mammals and man. Ed. Ellipses, Paris. 171. Thopsmon J.G.E., Simpson A.C., Pugh P.A., Donne P.E., Tervit H.R. (1990), “Effect of oxygen concentration on in vitro development of preimplantation sheep and cattle embryos”, J. Reprod. Fertil., 573- 578. 172. Trouson A.O., Willadsen S.M., Owson LEA. (1977), “Fertilization and development capability of bovine follicular oocytes matured in vitro and in vivo and transferred to the oviducts of rabbit and cows”, J. Reprod. Fert., 51, 321-327. 173. Van Soom A., Boerjan M., Ysebaert M.T., De Kruif A. (1996), “Cell allocation to the inner cell mass and the trophectoderm in bovine embryos cultured in two different media”, Mol. Reprod. Dev., 45, 171-182. 174. Wang Z.K., Wei P.H., Lei C., Wang D.Q., Yu D.Q. and Kong M.Q. (1995), “Developmental capacity and nuclear changes of bovine oocytes from ovaries stored for varied times and temperatures”, Theriogenology, 43, 347. 175. Ward C.R., Storey B.T. (1984), “Determination of the time course of capacitation in mouse spermatozoa using a chlortetracyclin fluorescence assay”, Dev. Biol., 104, 287. 176. Willadsen S.M. and Polge C. (1981), “Attempts to produce monozygotic quadruplets in cattle by blastomere seperation”, Vet. Rec., 108, 211-213. 177. Xu K.P., Greve T., Callesen H. and Hyttel P. (1987), “Pregnancy resulting from cattle oocytes matured and fertilized in vitro”. Journal of Reproduction & Fertility, 81, 501-504. 178. Yanagimachi R. (1981), Mechanisms of fertilization in mammals. In Fertilization and Embryonic Development in-vitro, Eds. L. Mastroianni & J.D. Biggers. Plenum Press, New York, 81-182. 179. Yanagimachi R. (1988), Mammalian fertilization. In Physiology of Reproduction, Eds. E. Knobil & J.D. Neill. Raven Press. New York. Vol.1, 135-185. 180. Younis A.I., Brackett B.G., Frayer-Hosken R.A. (1989), “Influence of serum and hormones on bovine maturation and fertilization in vitro”, Gamete Res., 23, 189-201. Tài liệu tham khảo tiếng pháp 181.Colleau J.J., Heyman Y., Renard J.P. (1998), “Les biotechnologies de la reproduction chez les bovines et leurs applications réelles ou potentielles en sélection”, Prod. Anim. INRA. 210-226. 182.Dauzer L., Thibault C., Wintenberger S. (1954). La fécondation in vitro de l’oeuf de lapine. C.R. Acad. Sci., Paris, 38, 1063-1064. 183.Le Guienne B., Thibault C., Chupin D., Gerard M., Thibier M. (1988), Fécondation in vitro chez les mammifères domestiques. Etat actuel et perspectives. El. & Ins., 225, 13. 184.Palmer E., Magistrini m., Bezard J., Duchamp G. (1990), “Gestation après fécondation in vitro dans l’espèce équine”, C. R. Acad. Sci., 310, 71. 185.Renault J. (1992), Formulaire de probabilités et de statistique. Dunod Universite, Paris, 176p. 186.Thibault C. (1966), “La culture in vitro des oeuf de vache”. Annls Biol. Anim. Biochim. Biophys., 6, 159-164. 187.Thibault C. et Levasseur M.C. (1991), La reproduction chez les mammifères et l’homme. Ed. Ellipses. Paris. Sơ đồ sản xuất ống nghiệm Bò đực Bò cái Thu trứng trong PBS Tinh trùng đông lạnh Trứng chất l−ợng A, B Đánh giá chất l−ợng trên kính hiển vi soi nổi (x120) Chọn lọc, rửa trứn trong DPBS FSH, LH, E, 5%CO2, 39 oC iải đông tinh trùng 37oC-1 phút Xử lý, chọn lọc tinh trùng (lọc percoll hoặc swim-up) Trứng thành thục Tinh trùng chọn lọc ụ tinh ống nghiệ 5%CO2, 39 oC Nuôi phôi TCM199, SOF, KSOM, B2... 5%CO2, 5%O2, 90%N o Phôi 2, 4, 8 tế bào, phôi dâu Cấy phôi t−ơi Đông lạnh bảo quả (-1960C) Nhân dòng2, 39 C , phôi nang n g GThNuôi thành thục TCM199, m phôi bò trongXác định giới tính CNP ._.