Nghiên cứu nhân nhanh giống địa lan Hồng hoàng Sapa (cymbidium iridioides) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

hu lợi nhuận từ lan cắt cành 10 triệu USD. Kim ngạch xuất khẩu hoa lan trên thế giới hàng năm đạt 1,8 tỷ USD [13]. Việt Nam là một quốc gia có hệ thống rừng với độ che phủ lớn, khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa phù hợp nhu cầu sinh thái của các loài lan. Mặt khác nước ta nằm trong trung tâm khởi nguồn của nhiều loài lan quý, có tiềm năng to lớn nguồn cây dại và quỹ gen phong phú. Các vùng như Sapa, cao nguyên Mộc Châu, Ba Vì, Đà Lạt... thích hợp cho sự phát triển nhiều loài lan phục vụ công tác chọn tạo giống cây trồng. Tuy nhiên chúng ta còn gặp những khó khăn bởi thiên tai diễn biến bất thường, nạn khai thác rừng tràn lan, nhiều loài lan quý có nguy cơ tuyệt chủng, hệ sinh thái tài nguyên ngày càng cạn kiệt. Địa lan hồng hoàng (Cymbidium iridioides) mặc dù số lượng ít nhưng với vẻ đẹp tự nhiên là loài có hoa tự dài nhất, hoa to và bền, màu sắc nâu tím, cánh môi vàng sẫm, số lượng hoa trên chùm có thể lên tới 15,5 hoa, nó đã thực sự thu hút người tiêu dùng trong và ngoài nước. Nhưng khả năng đậu quả trong tự nhiên lại rất thấp. Việc nghiên cứu tìm ra nhân giống in - vitro cho loài địa lan này còn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Để khôi phục phát triển lan bản địa nhằm bảo tồn nguồn gen phục vụ cho lai tạo lan rừng trong tương lai, tạo ra nhiều loài đặc hữu ở Việt Nam là một vấn đề cấp thiết cần nghiên cứu giải quyết. Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, chúng tôi triển khai nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh giống địa lan Hồng hoàng Sapa (cymbidium iridioides) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”. Mục đích yêu cầu đề tài Mục đích Xác định được một số khâu kỹ thuật chính trong quy trình nhân giống địa lan bản địa, trên cơ sở đó xây dựng kỹ thuật trồng nhân giống và công nghệ nhân nhanh giống địa lan bản địa Hồng hoàng Sapa (Cymbidium iridioides) Yêu cầu của đề tài Giai đoạn nhân nhanh in - vitro Nghiên cứu của việc bổ sung khoai tây vào môi trường đến sự nảy mầm của hạt. Nghiên cứu nhân nhanh bằng phương pháp cắt lát mỏng. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến chất lượng của chồi Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh - Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến quá trình ra rễ. - Nghiên cứu ảnh hưởng của α - NAA đến quá trình ra rễ. Giai đoạn sau nuôi cấy in vitro - Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý giá thể của cây ở giai đoạn vườn ươm. - Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp che tối khi cây đưa ra vườn ươm. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây ở giai đoạn vườn ươm. Phần 2. Tổng quan tài liệu Sơ lược về cây hoa lan Nguồn gốc, vị trí trong hệ thống phân loại thực vật Cây hoa lan orchidaceae thuộc họ phong lan orchidaceae, bộ lan orchidales, lớp một lá mầm Monocotyledoneae. Cây lan được biết đến đầu tiên ở phương Đông, theo Bretchacider thì từ đời vua Thần Nông (2800) trước công nguyên, lan rừng này được dùng làm thuốc chữa bệnh. Sau đó cùng với vẻ đẹp và tác dụng chữa bệnh. Robut Bron (1773 – 1858) là người đầu tiên đã phân biệt rõ ràng giữa họ lan và các họ khác [1, 2, 3, 4, 9, 10, 23]. Joanlind (1979 – 1985) là người đặt nền tảng hiện đại cho môn học về lan. Năm 1836, ông công bố sắp xếp các tông họ lan (A tabuler view of the Tribes of orchidalr) tên của họ lan do ông đưa ra đựơc dùng cho đến ngày nay (Trần Hợp – 1990) [10]. Họ lan có mặt ở hầu hết các vùng trên trái đất, nhưng có khoảng 4/5 tập trung ở những vùng nhiệt đới [20], nó đứng thứ hai sau họ cúc, khoảng 15000-35000 loài, phân bố từ 68 độ vĩ bắc cho đến 56 vĩ độ nam. Tuy nhiên, phân bố chính của họ này là ở trên các vĩ độ nhiệt đới, đặc biệt là châu Mỹ và Đông Nam á (Mau – RFL 1983) [23]. Cây lan biết đến đầu tiên ở Trung Hoa là kiến lan, đó là Cymbidium ensifonymum là một loài bán địa lan. ở châu Âu bắt đầu để ý đến phong lan từ thế kỷ 18 sau Trung Quốc đến hàng chục thế kỷ và cũng nhờ các thuỷ thủ thời bấy giờ mà phong lan đã đi khắp các miền của địa cầu, lúc đầu là Vanny sau đó đến Bạch cập, Hạc đính rồi kiến lan, lan chính thức gia nhập vào ngành hoa cây cảnh trên thế giới 400 năm nay. ở Việt Nam, có lẽ người đầu tiên khảo sát về lan ở Việt Nam là Gioalas Noureiro – nhà truyền giáo Bồ Đào nha, ông đã mô tả cây lan ở Việt Nam lần đầu tiên vào năm 1789 trong cuốn “ Flora cochin chinensis” gọi tên các cây lan trong cuộc hành trình đến Nam phần Việt Nam là aerides, phaius và sarcopodium mà đã được Ben tham và Hooker ghi lại trong cuốn “Genera plante rum” (1862 – 1883) (Nguyễn Hữu Huy, Phan Ngọc Cấp – 1995) [11], chỉ sau khi người Pháp đến Việt Nam thì mới có những công trình nghiên cứu được công bố đáng kể là F. Gagne Pain và A. Gui Ilaumin mô tả 70 chi gồm 101 loài cho cả 3 nước Đông Dương trong bộ “thực vật Đông Dương chí” (Flora Genera Indochine) do H. Leconte chủ biên xuất bản từ những năm 1932 – 1934. Đặc tính thực vật học của địa lan Lan cũng giống như các loại thực vật khác, có 6 bộ phận: rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt. theo tác giả Trần Hợp (1990) [10] cây lan được mô tả như sau: Rễ lan Nhìn chung, họ lan bao gồm các cây thân thảo, sống lâu năm, sống ở đất, vách đá vôi sống phụ, sống hoại. Đối với địa lan khi sống ở đất, chúng thường có củ giả, rễ mập, xum xuê phụ (bì sinh) rễ bò dài hay ngắn. Chúng phát triển thân rễ nạc dài, ngắn mập hay mảnh mai (tuỳ thuộc vào từng loài) đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày. Hệ rễ cũng nhỏ, đan thành búi, ngược lại ở các loài phong lan có kích thước lớn hay trung bình, hệ rễ khí sinh phát triển rất phong phú, mọc rất dài và mập, khoẻ, vừa giữ cho cơ thể khỏi bị gió làm lung lay và làm nhiệm vụ hấp thu dinh dưỡng. ở một số loài lan có thân, lá kém phát triển hệ rễ phát triển dày đặc và kiêm nhiệm luôn cả vai trò quang hợp. Rễ có dạng dẹt, bò rất dài, màu xanh như lá. Đặc biệt các loài phong lan sống hoại bộ rễ có hình dạng, cấu trúc khá độc đáo, có thể dài đến vài chục mét, nó có khảo năng leo bò cao. Thân cây Thân rất ngắn hay kéo dài, đôi khi phân nhánh, mang lá hay không mang lá. Theo M.E.Pfizer (1882) [10] phong lan có 2 loại thân, mà đa số thuộc loại sinh trưởng hợp trụ (nhóm không thân). Thân này gồm hệ thống của nhiều nhánh lâu năm, với bộ phận nằm ngang, bò dải trên giá thể hay ẩn sâu trong lòng đất. Ngược lại, rất ít khi gặp các loài phong lan sinh trưởng đơn trục (nhóm có thân), cơ thể khó có khả năng duy trì được tư thế thẳng đứng, nó phải nhờ đến các rễ chống đỡ để vươn cao, ở các loài phong lan sống phụ, có nhiều đoạn phình lớn, tạo thành củ giả. Đó là bộ phận dự trữ nước và chất dinh dưỡng để nuôi cây trong hoàn cảnh khô hạn khi sống bán trên cao. Đa số củ giả đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp. Lá lan Có thể phân lá lan thành 3 loại: lá đứng, lá nửa đứng, lá cong rũ. Hầu hết các loại địa lan đều là cây tự dưỡng, là “ xương” chế tạo chất dinh dưỡng bằng quang hợp, do đó nó phát triển rất đầy đủ hệ thống lá. Lá mọc đơn độc, hoặc xếp dày đặc ở gốc, hay xếp cách đề đặn trên thân, trên củ giả. Hình dáng lá thay đổi từ loại lá mọng nước, nạc, dài hình kim, hình trụ dài, tiết diện tròn hay có rãnh, đến loại lá hình phiến mỏng, dài, những lá dưới sát gốc thường tiêu giảm đi chỉ còn những bẹ không có phiến lá hay giảm hẳn thành các vảy. Các loài địa lan có số lá trên nhánh biến động rất lớn: lá trên nhánh ít phải kể đến Đông lan (2,6 lá/ nhánh). trong khi đó Bạc lan (Cerythrostylum) có số lá/ nhánh rất lớn (9,1 lá/ nhánh). Độ dày và độ rộng của lá cũng rất khác nhau, lá dài phải kể đến Bích ngọc (Cymbidium dayamum): 1cm. Thanh ngọc (Cymbidiumensifolium) 40- 80 cm. Về màu sắc, phiến lá thường có màu xanh bóng như các chi Lan kiếm (Cymbidium. SW), chi lan Bầu rượu (Calanthe R.Br), có loài có màu xanh đậm như Hạc Đính Vàng (P. flavum). Hoa lan Cấu tạo của hoa lan phong phú và đa dạng. Ta có thể gặp nhiều loài mà mỗi mùa chỉ có một đoá hoa nở hoặc có nhiều cụm hoa mà mỗi cụm chỉ đơm một bông. Mặc dù muôn hình muôn vẻ nhưng nếu ta quan sát hoa của bất kỳ cây lan nào cũng có một tổ chức đồng nhất của hoa mẫu 3 là một kiểu hoa đặc trưng của lớp một lá mầm, nhưng đã biến đổi rất nhiều để hoa có đối xứng qua một mặt phẳng. Mầm hoa của địa lan được hình thành từ đốt thứ 3, thứ 4 ở gần đáy của các giả hành, hoa đứng thẳng hay cong thường dài và mang nhiều hoa, chồi hoa thường xuất hiện bên dưới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹ già đâm ra bên ngoài. Thông thường, mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần. Chồi hoa thường xuất hiện đồng thời với chồi thân, nhưng chồi hoa no tròn hơn, còn chồi thân hơi dẹp. Các lá đầu tiên ở chồi thân mọc đâm ra hai phía hình đuôi cá, còn ở chồi hoa các lá bao hoa luôn ôm chặt quanh phát hoa. Cọng phát hoa không phân nhánh, dựng đứng hay buông thõng. Chiều dài của phát hoa từ 10 cm đến hơn 100cm. Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luân phiên nhau theo đường xoắn ốc. Búp hoa khi đã đủ lớn bắt đầu dang xa khỏi cọng hoa. Thoạt nhìn hoa Cymbidium có 5 cánh gần giống nhau, thực ra chỉ có 2 cánh hoa ở bên trong, còn lại là 3 lá đài ở bên ngoài, có cấu trúc và màu sắc giống cánh hoa. Cánh hoa thứ 3 chuyên hoá thành cánh môi, màu sắc sắc sỡ hơn xẻ thành 3 thuỳ tạo ra dạng nửa hình ống. Hai thuỳ bên ôm lấy trụ, thuỳ thứ 3 có dạng bầu hay nhọn tạo thành hình đáy thuyền, làm chỗ đậu cho côn trùng khi đến đậu hút mật và thụ phấn cho hoa. Giữa 2 cánh môi có 2 gờ dọc song song màu vàng.Tận cùng bên trong có đĩa mật và đôi khi có tuyến tiết mồ hôi. Hoa Cymbidium lưỡng tính nhị đực và nhị cái cùng gắn chung trên một trụ nhị, nhuỵ hình bán trụ hơi cong về phía trước. Nhị ở trên cùng mang 2 khối phấn màu vàng có gót dính như keo. Khối phấn được đậy bởi một nắp màu trắng ngà rễ mở dời chứa khối phấn của trục hợp nhuỵ cách với muỗm nhuỵ bởi một cái gờ nổi lên. Cấu trúc này trong tự nhiên hoa Cymbidium chỉ thụ phấn được nhờ côn trùng. Sau khi hoa thụ phấn, hoa xoay dần về vị trí cũ, bầu noãn phình to lên tạo thành quả. Quả lan Quả của cây địa lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3-6 đường nứt dọc, có dạng từ quả dài (Vanilla) đến dạng hình trụ ngắn phình ở giữa. Khi chín quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phần đỉnh và phía gốc. ở một số loài quả chín nở theo 1-2 khía dọc, thậm chí không nứt ra mà hạt chỉ ra khỏi vỏ quả khi vỏ này bị mục nát. Hạt lan Hạt lan rất nhiều nhỏ li ti kích thước hạt vô cùng nhỏ với khối lượng toàn bộ hạt trong một quả bằng 1/10-1/1000 mg trong đó không khí chiếm 76-96% thể tích của quả. Do đó hạt lan hầu như không có khối lượng. Hạt chỉ cấu tạo từ một khối chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ xốp chứa đầy không khí. Phải trải qua 2-18 tháng hạt mới chín. Phần lớn hạt thường chết vì khó gặp nấm cộng sinh cần thiết để nảy mần. Do đó hạt nhiều có thể theo gió bay rất xa, nhưng hạt nảy mần thành cây lại hiếm. Chỉ ở trong những khu rừng già ẩm ướt, vùng nhiệt đới mới đủ điều kiện cho hạt lan nảy mầm. Đặc điểm thực vật của địa lan Hồng hoàng Sapa Địa lan Hồng hoàng (Hoàng lan) tên khoa học là Cymbidium iridioides, có giả hình tròn dài, lá song đính, phiến hình gươm, dài 30-90 cm , rộng 2-3cm, mầu xanh đậm. Chùm dài hơn lá, hoa to rộng đến 10 cm, màu lục vàng hay vàng, môi thuỳ cạnh chóp nhọn, thuỳ giữa có đốm sậm hay vàng, bìa rất dúm có lông. Nang dài từ 8-10cm [9]. Lá dài gần 70 cm hoa nở vào tháng 4, tháng 6, số lá trung bình / nhánh là 5,1. Loại địa lan này chỉ đẻ một lần/ năm, đẻ hai đợt mầm trong năm, tháng 3- 4 và tháng 9-10, những mầm đẻ vào tháng 9-10 thường là mầm sinh trưởng phát triển kém, còi cọc, những mầm này khó có khả năng cho hoa. Tốc độ sinh trưởng về chiều cao của địa lan chậm, nhanh nhất là tháng thứ 6 mới đạt chiều cao tối đa [14]. Yêu cầu về ngoại cảnh của cây lan Để sinh trưởng và phát triển tốt chúng vẫn cần có các yếu tố ngoại cảnh như nơi xuất xứ. Muốn nuôi dưỡng tốt hoa lan trước tiên chúng ta cần tìm hiểu đặc tính sinh trưởng của nó. Nhiệt độ Yêu cầu nhiệt độ của các loài lan do nguồn gốc phát sinh và sự phân bố tự nhiên trong quá trính sinh trưởng, phát triển đã quy thành các nhóm lan. Vì vậy căn cứ vào điều kiện khí hậu những vùng xuất xứ các loài lan trên thế giới được chia thành 3 nhóm chính là nhóm lan ôn đới, nhóm lan cận nhiệt đới và nhóm lan nhiệt đới. Trong đó giống địa lan (Cymbidium) được xếp vào nhóm lan ôn đới, chúng được phân bố từ vĩ độ 280-400 [19]. Nhìn chung, nhiệt độ ảnh hưởng đến cả quá trình sinh trưởng của cây, nhưng ở giai đoạn phát dục của mầm hoa thì nhiệt độ ảnh hưởng là lớn nhất. Thời kỳ phát dục khác nhau thì chịu ảnh hưởng của nhiệt độ là khác nhau, trong tháng 7- tháng 8 ở các nước nhiệt đới có nhiệt độ cao thì mầm hoa sẽ được hình thành vào buổi tối, nhiệt độ dao động quanh 150C rất thuận lợi cho quá trình phát dục mầm hoa, nhưng nhiệt độ lớn hơn 200C thì hoa nở chậm. Những mầm hoa hình thành sau tháng 10 gặp nhiệt độ ban đêm cao thi nở hoa càng nhanh. Khi hình thành mầm hoa, cây gặp nhiệt độ lớn hơn 300C trong thời gian dài sẽ dẫn đến khô héo, rụng hoa. ẩm độ Độ ẩm cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới cây lan. Trước hết, về nguyên tắc, chúng ta cần phân biệt ba loại ẩm độ: Độ ẩm của vùng: Là độ ẩm của khu vực rộng lớn, nơi mà ta thiết lập vườn lan. ẩm độ này do điều kiện địa lý, địa hình nói chung quy định. Độ ẩm của vườn: Là ẩm độ của chính vườn lan, độ ẩm này có thể cải tạo theo ý muốn của người trồng lan. Độ ẩm trong chậu trồng lan: Gọi là ẩm độ cục bộ, do cấu tạo của giá thể, thể tích chậu, số lần tưới quyết định. ẩm độ này phụ thuộc hoàn toàn vào kỹ thuật của người trồng lan. Đối với Địa lan thì ẩm độ này trong khoảng 50 - 70% [7]. ánh sáng Như chúng ta đều biết, sự phát triển của cây tăng theo tỷ lệ với cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng đến mức độ nhất định và khi vượt mức độ đó nó sẽ ngừng tăng trưởng. Do đó cần đặc biệt chú ý tới ánh sáng cho tất cả các loại cây lan. Cần thiết phải làm giàn che nắng cho cây, tùy thuộc vào từng loài mà có chế độ che nắng cho thích hợp. Tuyệt đối không để cho ánh nắng trực tiếp chiếu vào cây, kể cả những tia nắng xiên. Khi chuyển chậu, thì phải chuyển sang chỗ có ánh nắng nhiều hơn, nhưng không quá 60% độ nắng. Tận dụng ánh nắng buổi sáng, hạn chế ánh nắng buổi chiều. Nếu cần, che hoàn toàn ánh nắng buổi trưa, từ 12 giờ đến 14-15 giờ vào những ngày quá nắng. Đặc biệt đối với những cây lan dưới 2 tháng thì việc điều chỉnh cường độ và thời gian chiếu sáng trong ngày phải thực hiện chu đáo và linh hoạt phải cho chúng làm quen dần với ánh nắng ngày càng tăng đến mức chúng có thể chịu đựng nổi [22]. Dinh dưỡng ở các nước công nghiệp trồng lan phát triển, người ta dùng nhiều loại phân bón, trong đó ngoài 3 chất chủ yếu là N (đạm), P (lân) và K (kali), người ta còn bổ sung các nguyên tố đa lượng, vi lượng thích hợp với lan. Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu vấn đề dinh dưỡng cho lan rất kỹ. Họ khuyên nên bón nhiều N khi cây phát triển và khi kết thúc thời kỳ phát triển thì nên bón nhiều P và K. Bón nhiều lần thật loãng bao giờ cũng tốt hơn bón ít lần đậm đặc. Đối với cây lan từ trong ống nghiệm tới khi ra hoa thì mỗi thời kỳ phát triển chúng cần có một chế độ dinh dưỡng khác nhau được các nhà khoa học chia ra làm các giai đoạn: Lan con từ trong ống nghiệm đến 3 tháng tuổi: Thời kỳ này được dùng chủ yếu là đạm, lân và kali có dùng nhưng rất loãng. Lan từ 4-10 tháng tuổi: Tỷ lệ phân bón (N:P:K = 3:1:1). Lan từ 10 tháng tuổi đến 24 tháng tuổi. Tỷ lệ phân bón (N:P:K = 2:2:2). Lan từ 24 tháng tuổi cho tới khi ra hoa. Tỷ lệ phân bón (N:P:K = 1:2:3). Ngoài ra, chế độ dinh dưỡng còn tùy thuộc vào các yếu tố khác. Nếu ánh sáng đầy đủ, cây được quang hợp tốt thì cần nhiều chất dinh dưỡng hơn chỗ thiếu ánh sáng. Thông thường, người ta xem màu sắc của lá và sự phát triển của bộ rễ và thân cây để quyết định nên tăng hay giảm liều lượng sử dụng N : P : K. Về phân hữu cơ, các tác giả nước ngoài giới thiệu rất nhiều các loại khác nhau, kể cả máu khô, ốc ngâm, bột xương. Có người dùng phân bò, phân chim bồ câu ngâm nước và vài ngày sau, khi chu trình lên men sắp kết thúc thì lấy ra lọc kỹ và pha loãng với nước, cho thêm P và K với tỉ lệ 1/1000 (1g cho hoà tan trong 1 lít nước) và tưới cho lan. Ngoài ra có thể dùng phân chim cút, nhưng với tỉ lệ bằng 1/3 phân bò vì tỉ lệ đạm trong phân chim cút cao hơn nhiều. Đó là những loại phân hữu cơ đối với lan đã trưởng thành. Còn đối với lan con, khi dùng phải thận trọng hơn nhiều, vì lá và rễ của lan con còn quá yếu. Rất dễ sinh bệnh. Nếu dùng phải lọc kỹ (bằng cát) và được diệt trùng bằng hóa chất. Cũng như khi dùng phân vô cơ, ta cần tưới hết sức loãng, cây dễ tiếp thu, đồng thời phòng bệnh cả cho cây [20]. Khi có bệnh, phải chữa cho cây khỏi bệnh rồi mới tiếp tục bón phân. Độ thông gió Lan rất sợ các luồng gió chướng. Nếu ở chỗ thường xuyên có những luồng gió (thí dụ gió mùa Đông Bắc ở miền Bắc, gió Lào ở Nghệ Tĩnh, Thanh Hóa), lan sẽ chết rất nhanh. Nhưng nếu ở nơi không khí tù hãm, ngột ngạt, lan cũng không lớn và không trổ bông được. ở bất cứ lứa tuổi nào, lan cũng cần được thoáng gió. Điều này cũng giải thích là ở trong rừng ít khi người ta tìm thấy lan ở dưới thấp (trừ địa lan ở xứ lạnh). Lan thường sống cheo leo trên các vách đá, hoặc bám chót vót trên các ngọn cây cao. Độ thoáng gió là một trong những đặc tính quan trọng về sinh thái của cây lan [10]. Tình hình sản xuất hoa lan trong và ngoài nước Tình hình sản xuất hoa trên thế giới Hiện nay sản xuất hoa trên thế giới đang phát triển một cách mạnh mẽ và đã trở thành một ngành thương mại có lợi nhuận cao. Sản xuất hoa đã mang lại lợi ích to lớn cho nền kinh tế các nước trồng và xuất khẩu hoa. Diện tích trồng hoa trên thế giới ngày càng được mở rộng và không ngừng tăng lên. Năm 1989 tổng giá trị về hoa, cây cảnh thế giới đạt 1,8 tỷ đô la tới năm 1996 giá trị sản lượng đạt 20 tỷ đô la trong đó Nhật 3,731 tỷ, Hà Lan 3,558 tỷ, Mỹ 3,720 tỷ (theo trung tâm xuất khẩu của Liên hợp quốc ITC) [12]. Các nước có ngành sản xuất và kinh doanh xuất khẩu hoa Lan đã và đang chiếm lĩnh thị trường là Thái Lan, Nhật Bản, Indoniaxia, Hà Lan, Hungary, Anh, Bungary, Costarica, Đan Mạch, Bỉ, Italia, Pháp. Có nhiều tạp chí về hoa lan được xuất bản, nhiều cuộc hội thảo về hoa được tổ chức. Trước đây việc nuôi trồng và xuất khẩu chủ yếu là lan rừng nên gây nguy cơ khoảng 13 loài tuyệt chủng. Ngày nay việc trồng lan đã trở thành quy mô công nghiệp, người ta xuất khẩu lan đạt tới số lượng hàng trăm ngàn giò, hàng vạn cành lan trong một năm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường. Các nước Châu á với ưu thế về tự nhiên cũng đang phát triển mạnh mẽ ngành trồng hoa mà trong đó trồng hoa lan là một ngành được chú ý phát triển. Có 15 nước xuất khẩu hoa lan, đáng chú ý là: Hồng Kông, ấn Độ, Indonesia, Thái Lan với sản lượng hoa cắt xuất khẩu đạt 68,2 triệu đô la, chủ yếu tiêu thụ trong nước có khoảng 50% dùng xuất khẩu. Các nước ở Châu Phi, Châu Đại Dương cũng đang chú ý phát triển ngành kinh tế có nhiều lợi nhuận này [13]. Tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam Việt Nam với điều kiện khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho việc phát triển nghề trồng hoa, cây cảnh trở thành một ngành công nghiệp. Tuy nhiên do chưa được đầu tư thích đáng nên ngành trồng hoa nói chung và ngành trồng lan nói riêng vẫn chưa phát triển đúng với tiềm năng của nó. Từ năm 1980 Việt Nam đã xuất khẩu lan sang Liên Xô, Tiệp Khắc. Năm 1987 ở thành phố Hồ Chí Minh có các vườn lan quốc doanh và tư nhân cùng với sự ra đời của nhiều hội hoa lan, cây cảnh. Nhiều cơ sở nghiên cứu cũng ra đời. Theo số liệu điều tra bước đầu tính đến năm 1986 trong thành phố có khoảng 15 gia đình có vườn lan với số lượng từ 1000-7000 chậu. Đến năm 1987 ở thành phố Hồ Chí Minh đã có vườn Quốc doanh và tư nhân: Vườn lan T78, vườn lan Hàng không dân dụng. Kể từ năm 1980 năm nào thành phố cũng tổ chức hội hoa xuân... Mới đây thành phố Hồ Chí Minh dự kiến giai đoạn 2005-2006 thực hiện đầu tư 20 ha nuôi trồng hoa lan và 20 ha trồng cây kiểng( dự án đầu tư và phát triển hoa, cây kiểng tại thành phố Hồ Chí Minh tháng 7 năm 2005) [6]. Tại Viện Sinh học Nông nghiệp thuộc Đại học Nông nghiệp I Hà nội đã cho ra hàng vạn cấy giống hoa lan có giá trị kinh tế như: Hồ điệp (Phalaenopsis), cát lan(Cattleya), lan thái(Dendrobium)... Ngoài ra viện còn làm cố vấn kỹ thuật, chuyển giao quy trình nuôi trồng một số giống lan có hiệu quả kinh tế ở các tỉnh như Hải Phòng, Bắc Giang, Lạng Sơn... Hiện nay sở công nghệ và môi trường của tất cả các tỉnh thành phố phía Bắc đều có phòng nuôi cấy mô tế bào, chức năng chính là để phục vụ cho nghiên cứu khoa học, một phần sản xuất giống cung cấp cho thị trường trong đó có hoa lan. Ví dụ, Hải Phòng xây dựng khu nông nghiệp công nghệ cao (xã Mỹ Đức, huyện An Lão) với mục tiêu cụ thể: Sản xuất 300.000 cây giống hoa lan bằng công nghệ của Viện Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiêp 1 và của Hiệp hội hoa lan Thái Lan (xây dựng khu nông- lâm nghiệp công nghệ cao tại trung tâm phát triển lâm nghiệp Hải Phòng năm 2003[7]. Một số nơi ở Việt Nam như thành phố Hồ Chí Minh, Hà nội (có nhiệt độ trung bình 23,50C tổng lượng mưa 1674 mm nhiệt độ tối cao 42,80C. Tháng trung bình lạnh nhất 13,70C, biên độ nhiệt độ ngày 6,10C) thích hợp phát triển các loài lan nhiệt đới, Sapa (nằm ở độ cao 1570 m nhiệt độ trung bình 15,20C lượng mưa 2833mm rải đều trong năm. Nhiệt độ thấp nhất 5,90C, cao nhất 29,80C. Biên độ nhiệt độ ngày đêm trung bình 6,20C), Đà Lạt (nằm ở độ cao 1513 m, nhiệt độ trung bình 18,20C lượng mưa1865 mm. Nhiệt độ cao nhất 31,50C, nhiệt độ trung bình tháng thấp nhất 24,60C, biên độ ngày trung bình trong năm 8,90C) [21] rất hấp dẫn cho phát triển các loài lan ôn đới. Nước ta có các vùng tiểu khí hậu rất thuận lợi cho phát triển cả 3 loại lan: nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới. Đây là một điều kiện rất tốt cho phát triển nghề trồng lan. Các nghiên cứu về nhân giống địa lan bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào Cơ sở khoa học của biện pháp nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào Tế bào là đơn vị sinh lý của sinh vật. Vì vậy ở các sinh vật đơn bào sống độc lập, tất cả các chức năng đều tập trung ở trong tế bào duy nhất ấy. Tế bào ấy có tính toàn năng, nghĩa là có khả năng sống và phát triển. Đối với một cây nguyên vẹn (một sinh vật đa bào) thì nguồn gốc của nó cũng khởi đầu từ một tế bào duy nhất, đó là hợp tử hay trứng. Mặc dù phát triển từ một hợp tử, nhưng khi nó phân chia và chuyên hoá thành mô, các cơ quan thì các tế bào ấy lại trở lên khác nhau về hình dạng và chức vụ. Trong trường hợp này các tế bào đó không biểu hiện được tính toàn năng vì chúng chịu ảnh hưởng từ các tế bào khác. Nếu ảnh hưởng ấy bị vô hiệu hoá thì mỗi tế bào lại hoạt động như một tế bào non trẻ, nghĩa là phân chia, tăng trưởng tạo ra cơ quan và phát triển thành cây hoàn chỉnh. Như vậy, khi tách tế bào ra khỏi cơ thể một sinh vật đa bào thì tế bào ấy có khả năng sinh sống và sinh sản hay không? Để trả lời câu hỏi này, nhiều nhà khoa học đã tách tế bào ra khỏi cơ thể đa bào và nuôi trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào bắt đầu từ phương pháp nuôi cấy tế bào này. Hiện nay phương pháp nhân giống này đã được áp dụng nhiều trên loại cây trồng trong đó có hoa lan. Đây là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống lan trên quy mô công nghiệp, các cây con được sản xuất hoàn toàn giống nhau từ một cây bố, mẹ ban đầu [24, 25, 26, 27, 28]. Một số nghiên cứu tiêu biểu Geroges Morel(1956) đã nghiên cứu thành công phương pháp nuôi cấy mô tế bào của cây lan. Phương pháp này để công bố trên tạp chí A. O. S (American Orchid Society, 1960) và giống lan đầu tiên Morel áp dụng là Cymbidium. Năm 1963 Donol E. Vimbex cũng nghiên cứu thành công trên giống Cymbidium nhưng lại nuôi cấy mô phân sinh đỉnh trên môi trường lỏng. Năm 1996, Yonco Sagaw và T .Shoji nuôi cấy mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh bên của Cymbidium trên cùng một lúc hai môi trường lỏng và đặc. Như vậy, giống địa lan (Cymbidium) là nền tảng cho việc nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật. Khả năng ứng dụng rễ thấy nhất của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là nhân nhanh giống và phục tráng giống trong cây trồng. Morel (1960) đã nhận thấy Meristem của một loài địa lan có rất ít hoặc không có virus. Đồng thời ông cũng thành công trong kỹ thuật tạo protocorm, khi nuôi cấy Meristem, các protocorm được cắt và nuôi cấy tiếp tục sẽ thu được các protocorm mới. Nếu trong điều kiện nhất định, nó sẽ hình thành các cây địa lan con mới và là những cây sạch virus. ở nước ta, năm 1999 có Nguyễn Xuân Linh, Phạm Thị Liên, Phùng Thị Thanh Thuỷ, Lê Đức Thảo nghiên cứu về loài Hạc Đĩnh Nâu. Năm 2001 Phạm Thị Liên đã nghiên cứu đánh giá và phát triển một số giống địa lan miền Bắc. Hiện nay đã có nhiều Viện nghiên cứu, Sở Khoa học Công nghệ của nhiều tỉnh như: Lạng Sơn, Nghệ An, Nam Định đã xây dựng các phòng nuôi cấy mô. Tại các Viện nghiên cứu hình thành những quy trinh nhân giống hoàn chỉnh với những cây trồng cụ thể để chuyển giao cho các đơn vị, địa phương, đồng thời tham gia sản xuất lượng cây giống nhất định phục vụ kịp thời cho sản xuất. Tại Viện Sinh học Nông nghiệp - Đại học Nông nghiệp1 Hà Nội là nơi nghiên cứu đầu tiên về hoa lan. Năm 2005, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga “ Xây dựng quy trình nhân nhanh một số giống địa lan bản địa bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào’’, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh và cộng sự, Thuyết minh dự án Hoàn thiện công nghệ và sản xuất một số giống hoa có giá trị kinh tế, chất lượng cao( Hoa đồng tiền, địa lan ) bằng công nghệ nuôi cấy mô Phương pháp cắt lớp mỏng tế bào (Thin cell layers - TCL) Khái niệm: Hệ thống lớp mỏng tế bào được hình thành từ một hoặc một số lớp tế bào là hệ thống thực nghiệm được giản hoá, trong đó sự tương tác chèn ép giữa các cơ quan cũng như sự tương tác qua lại giữa các mô, tế bào được duy trì ở mức tối thiểu. Một số nghiên cứu về phương pháp cắt lớp mỏng tế bào Phương pháp lớp mỏng tế bào lần đầu tiên được mô tả trên cây thuốc lá [nicotina tabacum] của tác giả Trần Thanh Vân (1973,1981), nghiên cứu về sự phát sinh hình thái của chương trình biệt hoá tế bào như: chồi, rễ, hoa, mô sẹo dựa vào các lớp tế bào cắt mỏng (3 – 6 lớp tế bào biểu bì) và sự thay đổi nồng độ đường cũng như tỉ lệ auxin/xytokinin, phương pháp này đã cho thấy hiệu quả đối với khả năng phát sinh phôi vô tính của cây Brassi canapus và khả năng phát sinh chồi của cây Begoniarex, Petrolium (Bùi Văn Lê, 1999). Phương pháp cắt lớp mỏng tế bào ngang được sử dụng ở những cây một lá mầm để tạo phôi vô tính. Đối với cây Saivit pauliacae lát mỏng ngang kể từ cuống lá đều có khả năng hình thành chồi. ở Việt Nam, những nghiên cứu về nuôi cấy lát mỏng tế bào hiện còn là vấn đề khá mới. Tới nay chỉ có một số kết quả nghiên cứu của một số tác giả như: Trần Thanh Vân, Bùi Thị ánh Tuyết, Trần Duy Quý, Lê Thị ánh Hồng đã sử dụng lớp mỏng ngang của cuống lá và cụm hoa của cây Saivitpaulia Vononvhawindhl. ở viện Sinh học Nông nghiệp 1 Hà Nội cũng có một số nghiên cứu lát mỏng tế bào trên cây phong lan, trên cây dứa Kĩ thuật cắt lớp mỏng tế bào (tcl) Phương pháp TCL kinh điển Theo Trần Thanh Vân (1973, 1974, 1983, 1986) thì lớp mỏng tế bào được cắt theo chiều dọc hoặc chiều ngang từ những cơ quan khác nhau với kích cỡ rất nhỏ (từ vài micro đến 1 mm x 5mm) và số tế bào giảm đi cho phép TCL bộc lộ tính đồng nhất với các phân tử DNA ngoại lai từ quá trình cài lồng gen. Cắt lớp mỏng tế bào theo chiều dọc (itcl được sử dụng khi phân loại tế bào ( tế bào mô rộng, biểu bì, tế bào tượng tầng, tế bào nhu mô) ITCL có thể cắt từ thân, gân lá, cuống lá, lá mầm cắt lớp mỏng tế bào theo chiều ngang (tTCL) cũng có thể sử dụng cơ quan khác như phiến lá, rễ, cơ quan của hoa thân, mô sinh đỉnh. Với mục đích là để hình thành mô phân sinh đỉnh. Hình thành mô sẹo hoặc tái sinh chồi. Cơ chất của môi trường cấy thường làm đặc hoặc lỏng. Một số loài thử nghiệm thành công khi sử dụng TCL là cây thuốc lá, cà chua, lan hồ điệp. Dụng cụ chứa là ống nghiệm hoặc đĩa peptri có kích thước sao cho phù hợp với thể tích môi trường nuôi cấy và thể tích không khí để cung cấp dinh dưỡng cho mẫu cấy. Phương pháp TCL cải tiến Sử dụng tổ hợp tiền chất trên chất ức chế để nghiên cứu động lực của các con đường sinh tổng hợp khác nhau và để làm giảm mức tối thiểu sự biến đổi nội tạng của nhân tố môi trường cũng như tính gắn kết của vật liệu sinh học. Phương pháp cải tiến được Richard (1987) thực hiện bằng việc sử dụng các đĩa giếng gồm 24 đĩa với kích thước 1,6 cm để làm vật liệu chứa. Mỗi đĩa đựng một thể tích môi trường xác định sao cho tỉ lệ thể tích không khí trên thể tích môi trường thích hợp. Một màng nhựa mỏng có kích thước đàn hồi đã cách li mỗi cá thể theo trật tự để ngăn ngừa sự thay đổi giữa các đĩa riêng biệt và sự nhiễm vi sinh vật. Đĩa được bịt kín với hai lớp màng (urgo) phương pháp này có ưu điểm là sự phân bố ngẫu nhiên các mẫu cấy TCL trong mỗi đĩa. Nhờ đó giảm được kích cỡ của của các đĩa giếng và lát mỏng tiếp xúc được với các điều kiện đồng nhất của môi trường (ánh sáng, nhiệt độ, CO2, O2 ) dẫn đến giảm sự biến động. Quy trình kỹ thuật về nuôi cấy mô tế bào Theo Georger (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bước: Bước 0: chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in - vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu in - vitro. Bước 1: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in - vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn , đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá, chồi ngọn, chồi nách được sử dụng để nhân nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc .. Bước 2: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua con đường: hoạt hoá chồi ._.