Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp chất màu thực phẩm carotenoid của các chủng nấm sợi Blakeslea trispora

ng nghiệp thực phẩm, đang đặt ra những mối lo ngại đối với chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm không chỉ ở một quốc gia mà ở khắp hành tinh của chúng ta. Hơn một nửa dân Châu Âu cho rằng đồ ăn, thức uống ngày nay là “cực kì nguy hiểm”. Quan niệm ẩm thực hiện nay của người Châu Âu là “ăn uống đúng và an toàn” thay cho “ăn uống ngon” trước đây. Ăn uống an toàn là không gây ngộ độc, còn ăn uống đúng là phòng các bệnh ung thư, tim mạch, béo phì và đái tháo đường. Để tự bảo vệ mình và góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng đồng, mỗi quốc gia đều phải có những chính sách, chiến lược để bảo đảm chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm của mình. Vì vậy, ngày nay công nghiệp thực phẩm được xem là nhà bếp của thế giới và chưa bao giờ các tiêu chuẩn về độ tinh khiết, độ ổn định và tính vô hại của các chất phụ gia thực phẩm trong đó có các chất màu thực phẩm đối với sức khoẻ con người lại được quan tâm cao như ngày nay. ở Việt Nam, có nhiều loại phẩm màu đã được dùng tuỳ tiện không đúng với qui định của Bộ Y tế (hoặc là không được phép, hoặc là quá liều lượng qui định cho phép…) đã gây thiệt hại không nhỏ cho người tiêu dùng nói riêng và xã hội nói chung. Theo thống kê về ngộ độc thức ăn của ngành Y tế, chỉ đứng sau các vụ ngộ độc do ô nhiễm thuốc trừ sâu hoá học, nhiễm vi sinh vật gây bệnh thì điển hình là các vụ ngộ độc do sử dụng thực phẩm chứa các phẩm màu công nghiệp. Ví dụ như hiện tượng ăn xôi gấc nhuộm phẩm màu công nghiệp giả màu gấc bị ngộ độc phải đi cấp cứu đã xảy ra tại Vĩnh Phức (60 người bị ngộ độc), tại Bình Thuận (115 trong số 136 khách dự tiệc cưới phải đi cấp cứu). Đó là những vụ điển hình có thể nhìn thấy hậu quả tức thì. Trong thực tế, còn có nhiều trường hợp ngộ độc thể nhẹ không gây triệu chứng cấp tính nhưng lại ảnh hưởng tới sức khoẻ lâu dài cho con người do tích luỹ từ từ những liều lượng nhỏ khi ăn các loại thực phẩm sử dụng phẩm màu thực phẩm không cho phép trong thời gian dài và có thể gây nhiều ảnh hưởng tai biến cho sức khoẻ về sau. Phẩm màu có thể thu nhận bằng nhiều con đường: khai thác từ nguyên liệu tổng hợp tự nhiên và tổng hợp hoá học. Nhiều công trình khoa học cho thấy các chất màu tự nhiên được tổng hợp bằng con đường sinh học có rất nhiều ưu thế như không độc hại tới sức khoẻ con người, chịu được nhiệt độ, ánh sáng, có tác dụng ngăn ngừa quá trình ôxy hoá. Mặc dù trên thị trường, sản phẩm chất màu b- carotene thương phẩm được tổng hợp hoá học chiếm ưu thế, nhưng sự ưa thích lại đang có xu hướng dành cho những sản phẩm tự nhiên được chiết xuất từ nguồn vi sinh vật phong phú trong tự nhiên. Chất màu caroteneoid mà tiêu biểu là b-carotene có thể được tổng hợp từ: Tảo lam (dunaliella salina), nấm ascomycetes và zygomycetes, nấm men đỏ rhodotorula và vi khuẩn quang hợp cyanobacteria, deuteromycetes, một số nấm sợi thuộc bộ mucorales, họ choanephoraceae bao gồm blakeslea, choanophora, parasitella, phycomycetes và pilaria là những chủng được biết nhiều về khả năng tổng hợp b-carotene [1]. Nắm được vai trò quan trọng của chất màu tự nhiên được tổng hợp bằng con đường sinh học cũng như để bắt kịp với xu thế của thời đại, chúng tôi đã tham gia nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp chất màu thực phẩm carotenoid của các chủng nấm sợi Blakeslea trispora”. PHầN I TổNG QUAN TàI LIệU I - Khái quát về carotenoid 1. Cấu trúc của nhóm các carotenoid Carotenoid là một nhóm của hơn 600 loại hợp chất tự nhiên có cùng kiểu cấu trúc hoá học và đều được tổng hợp bằng con đường sinh học từ một tiền chất chung là geranylgeranyl-pyrophosphate. Carotenoid là nhóm chất béo không tan trong nước, tan trong chất béo, có màu từ vàng, da cam đến đỏ, bao gồm 65 - 70 sắc tố tự nhiên. Những sắc tố chủ yếu ở nấm là các carotene, carotenoid acid, torularhodin torutene, keto-carotenoid, licopene, capxanthin và citrocapxanthin. Cấu trúc cơ bản của các carotenoid là một mạch thẳng, gồm 40 cacbon được cấu thành từ 8 đơn vị 5-cacbon isoprenoid liên kết nhau, đối xứng qua trung tâm. Điểm nổi bật và đặc biệt trong cấu trúc là hệ thống nối đôi liên hợp, xen kẽ nối đơn, nối đôi tạo chuỗi polyen. Chính cấu trúc này đã tạo nên các đặc tính quan trọng như: dễ bị oxy hoá, đồng phân hoá, hấp thụ ánh sáng (đặc biệt là ánh sáng tử ngoại) và thể hiện màu của hợp chất (màu càng đậm khi hệ thống dây nối càng dài). Từ cấu trúc cơ bản này có thể biến đổi theo các cách: cộng hợp H2 hoặc dehydro hoá, hydroxyl hoá, cacboxyl hoá, di chuyển nối đôi, đóng vòng, cắt thành nhiều chuỗi nhỏ…Tạo nên một lượng lớn các cấu trúc khác nhau. Kết quả là có khoảng 600 hợp chất khác nhau, đã được tách chiết và xác định đặc tính. Một số cấu trúc chính được trình bày dưới đây: 1.1. phytofluen Phytofluen 1.2. licopene licopene có trong quả cà chua và một số quả khác. Mầu đỏ của cà chua chín chủ yếu là do có mặt của licopene mặc dầu trong cà chua còn một loạt trong các carotenoid khác nữa. Trong quá trình chín, hàm lượng licopene trong cà chua tăng lên 10 lần.Tuy nhiên chất mầu này không có hoạt tính vitamin. licopene có cấu tạo như sau: Lycopene Bằng cách tạo vòng ở một đầu hoặc cả hai đầu của phân tử licopene thì sẽ được các đồng phân a, b, g-carotene. 1.3. Carotene Màu da cam của cà rốt, quả mơ chủ yếu là do nhóm các carotene. Trong nhóm carotene thì b-carotene có vai trò quan trọng nhất. b-carotene có công thức hoá học: C40H56 và khối lượng phân tử 536.88. b-carotene hấp thụ cực đại ở bước sóng 450. Dưới đây là cấu tạo của carotene: g- Carotene b- Carotene a- Carotene 1.4. crypthoxanthin crypthoxanthin có công thức nguyên là C40H56O (3 hoặc 4- hydroxyl-b-carotene). Màu da cam rất đẹp của quýt, của cam chủ yếu là do crypthoxanthin. b- Crypthoxanthin a- Crypthoxanthin 1.5. Xanthophyll. Xanthophyll có công thức là C40H56O2, có được bằng cách gắn thêm hai nhóm hydroxyl vào phân tử a-carotene, do đó có tên 3,3’-hydroxyl-a-carotene. xanthophyll là chất mầu vàng nhưng sáng hơn carotene vì có chứa ít nối đôi hơn. Trong lòng đỏ trứng gà có hai xanthophyll là hydroxyl-a-carotene và hydroxyl-b-carotene với tỉ lệ là (2:1). xanthophyll cùng với carotene có chứa trong rau xanh, cùng với carotene và licopene có trong cà chua. Công thức cấu tạo: Xanthophyll Trong nhóm này a, g, b-carotene và crypthoxanthin là những tiền chất vitamin A quan trọng, cung cấp vitamin A cho cơ thể người và động vật. Một phân tử g, a-carotene và crypthoxathin vào cơ thể động vật, sau khi thuỷ phân cho một phân tử vitamin A, nhưng một phân tử b-carotene sau khi thuỷ phân cho hai phân tử vitamin A. Vì vậy b-carotene được đánh giá là chất có hoạt tính sinh học mạnh và quan trọng nhất của nhóm các carotenoid. 2. Tính chất lý học của b-carotene và carotenoid - Trong thực vật, động vật carotenoid có thể ở dạng tinh thể chất rắn vô định hình. - Carotenoid không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ và dầu béo thành dung dịch, phân tán keo hoặc tạo phức với protein trong môi trường nước. - Rất dễ bị oxy hoá dưới tác dụng của oxy không khí, ánh sáng, nhiệt độ và enzyme. - Rất nhậy cảm với axit và chất oxy hoá, bền với kiềm. - b-carotene là tinh thể hình kim, màu nâu đỏ tan trong dầu và các dung môi hữu cơ như axeton, alcohol, ethyl-ether, tetrahydrofuran,…đặc biệt tan tốt trong dầu, ether và hexan, không tan trong nước. Nhờ có hệ thống dây nối đôi liên hợp dài mà b-carotene có ái lực mạnh với oxy đơn bội (1O2), dễ bị oxy hoá, đồng phân hoá trong điều kiện tiếp xúc với không khí, ánh sáng, nhiệt độ. Toàn bộ tính chất của carotenoid được khái quát trong sơ đồ sau: ái lực cao với oxy đơn bội Hấp thụ ánh sáng Oxy hoá, đồng phân hoá Tan trong dầu, không tan trong nước Chống gốc tự do Carotenoid 3. Tác dụng sinh học Trong tự nhiên, cơ thể sinh vật có thể tự tổng hợp carotenoid nhằm mục đích bảo vệ, chống lại các tác động bất lợi của môi trường (các gốc tự do, tia tử ngoại, ánh sáng mặt trời.v.v..) Một số carotene là tiền vitamin A. Đối với động vật có vú, nó giữ chức năng sinh học quan trọng trong quá trình phát triển cá thể như: phát triển thị giác, vị giác, tăng đáp ứng miễn dịch, tăng sự sinh sản và tạo tinh trùng. Tác động chủ yếu của carotenoid không chỉ là chống oxy hoá mà còn trao đổi thông tin từ tế bào này đến tế bào khác, tác động tới cấu trúc và chức năng của màng tế bào, tăng cường sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Chính vì vậy mà carotenoid được xác định là chất điều hoà dinh dưỡng. Đặc biệt b-carotene không độc với cơ thể khi sử dụng liều cao và kéo dài. Dùng vitamin A kéo dài và liều cao sẽ gây rối loạn thị giác, rối loạn chức năng gan. Nguyên nhân là do cơ thể chuyển hoá b-carotene chuyển thành vitamin A khi có nhu cầu. Chỉ 1/6 lượng b-carotene chuyển thành vitamin A. [2]. Có hàng trăm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, trong đó tế bào được cho tiếp xúc với những chất gây ung thư, virus và các tia phóng xạ. vitamin A và b-carotene cho thấy chúng có khả năng ngăn cản các tế bào chuyển thành các tế bào gây ung thư. b-carotene cũng có những tác dụng chống ung thư riêng cho nó, không phụ thuộc vào vitamin A. Các nghiên cứu invitro đã cho thấy rằng b-carotene và capthaxanthin, một carotenoid không phải tiền chất của vitamin A, có tác dụng ức chế sự chuyển sang dạng tân sản của các tế bào invitro dưới tác dụng của các tác nhân vật lí và hoá học. Điều này có nghĩa là tác dụng chống oxy hoá là một tính chất quan trọng của các carotenoid. Trong các nghiên cứu trên động vật, vitamin A cũng cho thấy sự ngăn cản sự thành lập khối u trên động vật thử nghiệm khi tiếp xúc với các chất gây ung thư và làm chậm lại sự phát triển của khối u đã bị biến đổi. Ngoài bệnh ung thư phổi, rất nhiều nghiên cứu trên những tập thể người sống ở khắp nơi trên thế giới từ Mỹ, Anh, Nhật, Phần Lan…đã cho thấy mối liên hệ giữa nguồn thực phẩm giàu vitamin A và b-carotene với tỉ lệ thấp mắc các bệnh ung thư khác như: ung thư khí quản, màng trong dạ con, bàng quang, cổ tử cung, vú, tuyến tiền liệt, trực tràng, manh tràng và dạ dày, kể cả melanoma (một loại ung thư da nguy hiểm). Các kết quả thay đổi từ giảm 8 lần trong ung thư phổi đến giảm 80% trong ung thư cổ tử cung. Theo bendich và cộng sự khi thử nghiệm trên cơ thể người và động vật tại Mỹ, đã nhận thấy b-carotene và carotenoid đều có khả năng làm tăng đáp ứng miễn dịch. Khi sử dụng liều cao b-carotene trên bệnh nhân nhiễm hiv đã làm tăng tỷ lệ tế bào CD4: CD*, tác động kìm hãm sự phát triển virus.[3] 4. Cơ chế chống oxy hoá Trong cơ thể, carotenoid nói chung và b-carotene nói riêng có khả năng chống lại các gốc tự do, dập tắt chuỗi phản ứng dây chuyền. Nhờ có hệ thống dây nối liên hợp, nó vô hiệu hóa đặc biệt với phân tử oxy bị kích hoạt (1O2). Một phân tử b-carotene có thể hấp thụ năng lượng của hàng ngàn phân tử (1O2) rất nguy hiểm rồi giải phóng năng lượng ấy dưới dạng nhiệt vô hại. Người ta gọi đó là cơ chế toả năng lượng. 1O2 + b - carotene đ b - carotene*+ b - carotene* đ b - carotene + nhiệt (vụ hại) Tác dụng sinh học của b-carotene được tóm tắt theo sơ đồ: ức chế ung thư Provitamin A hoạt động b-carotene Giảm khả năng đục thuỷ tinh thể Chống lão hoá Tăng cường miễn dịch Ngăn ngừa các bệnh tim mạch II - Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của b-carotene 1. Tình hình nghiên cứu 1.1. Những nghiên cứu thu nhận hợp chất carotenoid trên thế giới b-carotene sản xuất theo con đường hoá học hiện nay chiếm khoảng 70%- 80% sản lượng trên thế giới, tập trung chủ yếu ở: Thuỵ sỹ, Mỹ (Công ty hofmanroche) và ở Đức (Công ty basf). Sản lượng của các nhà máy này được xây dựng vào những năm đầu của thập kỷ 90 đạt khoảng 400- 500 tấn b-carotene tinh khiết chiếm khoảng 98% năm. Các nghiên cứu trích ly b-carotene từ nguyên liệu thực vật đã được nghiên cứu và sản xuất với quy mô nhỏ tại Mỹ, Nhật, Phần Lan, Anh từ các loại cà rốt chuyển gene chứa khoảng 5,2 - 12,2 mg/100 gam cà rốt tươi, dầu cọ chứa hàm lượng carotenoid khoảng 5 mg/100 gam dầu cọ thô với khoảng 1/2 là b-carotene và a-carotene. Trên thế giới ở một số nước: Đức, Hàn Quốc, ý, Nhật, Anh, Nga, úc, Bồ Đào Nha, Hy lạp, Trung Quốc…đã có những nghiên cứu sản xuất carotenoid đặc biệt là b- carotene từ vi sinh vật. Một số vi tảo như tảo lam Dunaliella salina, Heamatococcuss pluvialis, Mantoniella squamata đã được nghiên cứu nuôi cấy, tách chiết các hợp chất carotenoid có chứa b-carotene và các dẫn xuất như: asthaxanthin, zeaxanthin, violaxanthin (Công ty Nutralite Ltd, Microalgae International Company, Cyanotech Inc- Mỹ; Betatene Ltd, western biotechnology- úc). Tuy nhiên nuôi cấy tảo cần điều kiện chiếu sáng, khí CO2, thể tích nuôi cấy lớn và đặc biệt là hiệu xuất tổng hợp b-carotene không cao. Các chủng nấm nem tự nhiên hoặc là gây đột biến có sắc tố đỏ như: rhodotorula glutinis, R. mucilaginosa, R. rubra cũng được nghiên cứu nhiều ở các nước như : ấn Độ, canada, Pháp, Nga song còn gặp nhiều hạn chế. Trong các nguồn vi sinh vật có thể sử dụng để sản xuất b-carotene, chủng nấm sợi blakeslea trispora được chú ý nhất vì khả năng tổng hợp carotenoid với hàm lượng b-carotene cao chiếm (85%-95%) và có thể sản xuất ở qui mô công nghiệp sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền. ở Hy Lạp, Tây Ban Nha, Mỹ, Trung Quốc hiệu suất tổng hợp, thu nhận b-carotene từ Blakeslea trispora ở phòng thí nghiệm trên qui mô máy lắc với các môi trường tổng hợp đạt 1300-2880 mg b-carotene/lit. Tại Hàn Quốc và Nga người ta sử dụng các phụ phẩm của nông nghiệp và công nghiệp chế biến thực phẩm làm môi trường lên men nấm sợi Blakeslea trispora. Kết quả thu được carotenoid với 92-95% là b-carotene (485-1500 mg/lit) và 5-7% là g-carotene, cypthoxanthin và b-zeacarot. 1.2. Những nghiên cứu thu nhận hợp chất carotenoid ở nước ta Để có được các sản phẩm có chứa hợp chất carotenoid thiên nhiên, các nhà khoa học ở nước ta cũng đã nghiên cứu khai thác từ nhiều nguồn khác nhau. Từ nguồn động vật: Từ đầu thập kỷ 70 nước ta đã tận dụng nguồn khai thác cá biển để tạo ra dược phẩm vitamin A từ dầu gan cá biển.[4] Từ nguồn thực vật: Khoảng những năm 60-70 nghành Quân Y đã sản xuất thuốc Gacavit sử dụng dầu màng gấc để phòng và điều trị một số bệnh ung thư ở Việt Nam. Công ty Dược Biopha tại Tp.HCM phối hợp với trung tâm phát triển Hoá sinh (QEDEB) Hà Nội chế biến mứt gấc Viga và thuốc viên nén có bổ sung dầu màng gấc. Công ty TNHH chế biến dầu thực vật và thực phẩm Việt Nam (VNPOFOOD). Đại diện tại Tp.HCM: Công ty Dược phẩm Quận 10 đã sản xuất dầu gấc viên nang VINAGA chiết xuất từ gấc có chứa b-carotene 1,5 mg/g và lycopene 0,12 mg/g. Gần đây Viện Lúa ĐBSCL đã thông báo chọn lựa được nhiều dòng lúa mà trong phôi nhũ có hàm lượng carotene cao. Những dòng lúa này đang được khảo nghiệm trên diện rộng, hy vọng những năm tới sẽ có những giống lúa vừa cho năng suất cao vừa giàu vitamin A. [5] Từ nguồn tảo: Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Trung tâm Dinh dưỡng Trẻ em Tp.HCM đã nghiên cứu nuôi cấy tảo Spirulina có hàm lượng b-carotene 1,7 mg/g sinh khối khô và Viện Công nghệ Sinh học nuôi cấy tảo Dunaliella salina 5,4mg/g b-carotene. 2. ứng dụng của b-carotene Hầu hết những màu sắc hấp dẫn mà ta thấy trong cuộc sống đặc biệt là dải màu từ vàng tới đỏ thì đó là màu do nhóm các carotenoid tạo nên. Chính điều này đã giúp con người chúng ta đưa ra ý tưởng ứng dụng carotenoid làm chất màu cho thực phẩm và mỹ phẩm. b-carotene có hai đồng phân: trans b-carotene và cis b-carotene, trong đó trans b-carotene có thể chuyển thành dạng cis b-carotene. Trong hai đồng phân trên thì trans b-carotene có vai trò quan trọng, còn cis b-carotene hầu như không có tác dụng nên không được ứng dụng nhiều. Nấm sợi Blakeslea trispora, b-carotene tồn tại chủ yếu ở dạng trans b-carotene. C C R2 H H R1 C C R2 M0 H R1 R2 C C H H R1 C C H Mo R2 R1 Trans Cis  2.1. ứng dụng của b-carotene trong công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi gia súc. Bột b-carotene theo phương pháp vi sinh đã được sử dụng làm chất tạo màu, chất chống oxy hoá, chất phụ gia trong sản xuất các loại mì, mì ăn liền, bánh kẹo, kem, nước ngọt, mỹ phẩm, thuốc viên nang, viên nén. Ngoài ra sản phẩm bột b-carotene tinh khiết, sinh khối khô nấm sợi B.trispora chứa b-carotene còn được sử dụng để bổ sung vào thức ăn cho người và thức ăn gia cầm. Hội đồng khoa học Châu Âu về thực phẩm, sức khoẻ đã cho phép sử dụng b-carotene được chiết tách từ sinh khối nấm sợi B.trispora nuôi cấy theo phương pháp lên men chìm có sục khí như là một vi chất dinh dưỡng thực phẩm có hoạt tính sinh học cao với liều lượng không hạn chế (trên 5% trong thực đơn thức ăn) như đối với các chất màu tổng hợp. 2.2. ứng dụng trong y học Như chúng ta đã biết Carotenoid là chất tiền Vitamin A và được đưa vào cơ thể theo con đường ăn uống. Trong cơ thể nó chuyển hoá thành Vitamin A là chất có vai trò xúc tác cho nhiều phản ứng diễn ra bên trong tế bào, đặc biệt nó như là đồng enzyme, như là thành phần cấu thành nên hệ hoocmôn và dễ cố định các gốc tự do. Carotenoid và Vitamin A cần thiết cho sinh sản và phát triển của tế bào, tham gia vào việc tạo thành các tổ chức mô, khung xương, làm chức năng màng bảo vệ của các niêm mạc. Vitamin A còn tham gia vào các quá trình trao đổi protein, gluxit, lipit và muối khoáng, nó rất cần thiết cho sự hoạt động bình thường của mắt. Vì vậy, carotenoid cũng như vitamin A trước hết dùng để đề phòng và điều trị bệnh không có hay thiếu vitamin A. Khi thiếu Vitamin A xuất hiện bệnh quáng gà, rối loạn nhìn màu sắc, khô và sừng hoá giác mạc của mắt và da làm thay đổi biểu mô trên các niêm mạc, do vậy làm giảm sức đề kháng của các cơ quan tương ứng đối với bệnh nhiễm khuẩn (gây viêm phế quản, viêm niêm mạc, đường tiểu tiện…). Riêng đối với trẻ em, nếu thiếu Vitamin A gây chậm lớn do có sự ảnh hưởng đến sự hình thành khung xương của trẻ, gây quáng gà thậm chí có thể dẫn tới mù loà. Vì vậy, các nhà sản xuất đã bổ sung b-carotene vào sữa bột cho trẻ ăn. Đối với b-carotene khi ở dạng tiền Vitamin A, nó bảo vệ nhiễm sắc tố da để chống lại hiệu ứng có hại của các tia tử ngoại. Người ta khuyên nên dùng bổ sung b-carotene trước khi làm việc lâu dài dưới ánh nắng mặt trời. Nó có thể giúp da phòng chống không những các tia tử ngoại gây hại mà còn phòng chống lại bệnh ung thư da khi dùng trong thời gian dài. Dựa trên các nghiên cứu những gốc tự do người ta thấy rằng, gốc tự do là một phân tử nguy hiểm, bởi vì nó không bền và rất hoạt động, Thật vậy, nó có khả năng kết hợp rất nhanh đối với các phân tử khác đặc biệt là lipit và có thể gây nên một phản ứng dây chuyền cực kì nguy hiểm đối với tế bào. Chính các gốc tự do này là nguyên nhân gây nên phản ứng dị ứng, ung thư, các bệnh tim mạch, tai mũi họng, da, niệu bộ, các trạng thái suy nhược, mệt mỏi, giảm trí nhớ, giảm khả năng tư duy, quá trình lão hoá. Cùng với Vitamin C, E, ngoài ra cùng với đồng, mangan, thì Vitamin A và b-carotene có vai trò quyết định đến sự ngăn ngừa, chống lại các gốc tự do này.  III - Nguồn thu nhận carotenoid và tổng hợp carotenoid ở nấm sợi 1. Nguồn thu nhận carotenoid Hợp chất carotenoid được thu nhận từ hai nguồn: * Tổng hợp hoá học chiếm 70%-80%. * Nguồn tự nhiên được thu nhận từ nhiều nguồn: - Thực vật, hàm lượng b-carotene có trong nhiều loại rau, trái cây như ở bí đỏ có 0,018 mg/g, cà rốt 0,098 mg/g, trái gấc 0,46 mg/g. [6]. - Động vật, carotenoid đặc biệt carotene có nhiều trong gan cá, nhất là ở gan cá Thu và ở gan của các động vật như: gà, vịt, heo… - Vi sinh vật có một số tảo, vi khuẩn, vi nấm và nấm men chứa hợp chất carotenoid trong các hạt sắc tố nằm trong tế bào chất như: Tảo lam (Dunaliella salina), nấm Ascomycetes và Zygomycetes, nấm men đỏ Rhodotorula và vi khuẩn quang hợp Cyanobacteria, Deuteromycetes, một số nấm sợi thuộc bộ Mucorales họ Choanephoraceae bao gồm Blakeslea, Choanophora, Parasitella, Phycomycetes và Pilaria. 2. Tổng hợp carotenoid ở nấm sợi 2.1. Đặc tính của nấm sợi Blakeslea trispora 2.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu tạo Nấm sợi là loại tế bào Eukaryote có cấu tạo tương đối phức tạp, có cấu tạo từ các bộ phận chính như: vỏ tế bào, nhân, ty lạp thể, nguyên sinh chất và không bào là những thành phần có thể nhìn thấy dưới kính hiển vi quang học, còn các phần khác như: màng nguyên sinh chất, lưới nội chất…chỉ nhìn thấy được dưới kính hiển vi điện tử. Tế bào của nấm là một tế bào thực sự (eucyte) bao gồm màng tế bào, chất nguyên sinh, tế bào chất, thể hạt nhỏ, ribôxôm, nhân, không bào, các hạt dự trữ. Thành tế bào là một cấu trúc hai lớp với thành phần hoá học chủ yếu là kitin, kitoxan.Trên thành tế bào có nhiều lỗ nhỏ, các chất dinh dưỡng đi vào trong tế bào và các sản phẩm trao đổi chất đi từ tế bào ra môi trường xung quanh qua những lỗ nhỏ này. Bên ngoài thành tế bào không có lớp nhầy vì thế mà các tế bào không bị dính lại với nhau. Nguyên sinh chất của tế bào bao gồm màng nguyên sinh chất, tế bào chất và nhân: + Màng nguyên sinh chất nằm sát bên trong thành tế bào và làm nhiệm vụ hấp thụ các chất dinh dưỡng. + Tế bào chất là hệ thống keo phức tạp được tạo thành từ protein, gluxit, lipit, các chất khoáng phân tán trong môi trường nước. Trong tế bào chất có các ty thể, riboxom, thể golgi, mạng lưới nội chất, thể màng biên (thể màng biên là một kết cấu màng đặc biệt nằm giữa thành tế bào và màng tế bào chất, được bao bọc bởi một lớp màng đơn có hình dạng biến hoá rất đặc biệt như hình ống, hình túi, hình cầu, hình trứng hay hình nhiều lớp...). + Nhân của tế bào là hình cầu có màng bao bọc, trong nhân có nhân con (nucleolus) bao gồm có protein, ADN, ARN và enzyme. Chức năng của nhân là quyết định tính di truyền và tham gia điều kiện hoạt động sống. + Ty thể của tế bào nấm nhiều và đa dạng. Không bào chứa dịch tế bào. Mầu sắc của nấm do các chất mầu có thành phần và tính chất khác nhau tạo ra. Chất mầu thường tan trong không bào, trong tế bào chất và màng tế bào. Chất mầu không bao giờ là diệp lục, phycobilin mà thường là các chất mầu loại quinon, (anthraqiunon, naptaquinon), dẫn xuất của phenonxaron (xinnabarin), carotenoit và melanin. 2.1.2. Phân loại nấm sợi Blakeslea trispora Giới (Kingdom) Fungi Ngành (Phylum) Zygomycota Lớp (Class) Zygomycetes Bộ (Order ) Mucorales Họ (Family) Choanephoraceae Chi (Genus) Blakeslea Loài (Species) Trispora 2.1.3. Đặc điểm sinh sản Nấm sợi Blakeslea trispora có cả hai hình thức sinh sản: sinh sản vô tính và hữu tính. * Trong sinh sản vô tính, bào tử được hình thành ở phía trong hoặc phía ngoài, phù hợp với đặc điểm đó mà có cấu tạo túi bào tử hay túi bào tử đính. Túi bào tử có cấu trúc điển hình hơn cả chúng có dạng hình cầu nhỏ đường kính khoảng 80-120 mm chứa từ một đến hàng nghìn bào tử. Những bào tử chứa đầy ở bên trong khoang của túi. * Sinh sản hữu tính (theo lối tiếp hợp): Sinh sản hữu tính ở đây theo lối tiếp hợp bằng sự kết hợp nội chất của hai tế bào đặc biệt ở trên một hoặc hai tản khác nhau và hình thành hợp tử hay bào tử tiếp hợp. Quá trình này phụ thuộc vào nhiều điều kiện. Khi hai sợi nấm có giới tính đối lập tiếp xúc với nhau, chúng có thể mọc ra hai mấu lồi. Hai mấu lồi này tiến dần lại gặp nhau, dần dần mỗi mấu lồi sẽ xuất hiện một vách ngăn, phân cách phần đầu ra thành một tế bào nhiều nhân. Hai tế bào sau đó sẽ tiếp hợp với nhau thành một hợp tử nhiều nhân thường có màng dày và có mầu tối. Phần mấu lồi còn lại về sau phát triển thành hai cái cuống treo giữ hợp tử hay bào tử tiếp hợp và được gọi là cuống bào tử tiếp hợp. Quá trình kếp hợp nhân của hợp tử chia thành hai trường hợp : - Có hiện tượng kết hợp nhân ngay từ khi hình thành hợp tử. - Hợp tử sau khi hình thành chưa có sự kết hợp nhân mà xếp thành đôi được gọi là hiện tượng song nhân, sau đó mới phát triển thành hợp tử tiếp hợp 2n. Sau thời gian nghỉ, bào tử tiếp hợp nảy mầm, phá vỡ màng và mọc ra một ống mầm. Đầu ống mầm về sau phát triển thành một cái túi vô tính chứa rất nhiều bào tử kín. Khi đã hình thành túi, ống mầm trở thành cuống túi. Phần cuống túi đâm sâu vào trong túi được gọi là trụ túi. Các nhân của bào tử tiếp hợp đều có sự phân chia giảm nhiễm để hình thành các bào tử kín.  2.2. Quá trình tổng hợp carotenoid ở nấm sợi Blakeslea trispora Các terpenoids đều bắt nguồn từ tiền chất chung là isopentenyl pyrophosphate. Chất này có thể được tổng hợp theo chu trình Mevalonate hoặc là chu trình Rohmer. 3-Hydroxymethylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) và mevalonate là các chất trung gian của chu trình thứ nhất (chu trình mevalonate) và D-1-deoxyxylulose 1-phosphate là chất trung gian của chu trình thứ hai. Chu trình Rohmer không có ở ngành nấm. Gene mã hoá cho hai enzyme đầu tiên của chu trình mevalonate là HMG-CoA synthase và HMG-CoA reductase đã được tách dòng ở Phycomycetes và nó đã được giải trình tự từ bốn chủng thuộc bộ Mucorales. Sinh tổng hợp Terpenoid được hình thành thông qua quá trình trùng ngưng mạch 5 cacbon tạo thành các phân tử lớn hơn như geranyl pyrophosphate, farnesyl pyrophosphate, geranylgeranyl pyrophosphate. Qúa trình tổng hợp carotenoid cần 2 phân tử geranylgeranyl-PP giống như quá trình tạo squalene được liên kết bởi phản ứng trùng ngưng. Sau khi giải phóng nhóm pyrophosphate đầu tiên sẽ tạo ra tiền phytoene pyrophosphate và giải phóng nhóm pyropohossphate thứ hai tạo nên phytoene. ở đây ta có hai gốc prenyl liên kết với nhau bởi cầu nối kép C-C, phytoene sau đó chuyển hoá thành lycopene, quá trình này được xúc tác bởi hai enzyme desaturase khác nhau. Theo các tài liệu nghiên cứu công bố gần đây, quá trình bão hoà được tạo nên thông qua các phản ứng dehydrogen trong đó hydrogen chuyển đến phân tử NADP hoặc FAD. Sự vòng hoá lycopene sau đó gây nên sự hình thành b-carotene. Một enzyme khác là cyclase tạo a-carotene. Sự hydroxy hoá b-carotene dẫn đến sự hình thành Xanthophyll zeaxanthin và sự tạo thành chất này từ zeaxanthin. 3. Hướng nghiên cứu nhằm nâng cao khả năng tổng hợp chất màu carotenoid từ nấm sợị Blakeslea trispora. Chủng Blakeslea trispora có khả năng tổng hợp carotenoid trong đó quan trọng là b-carotene với hàm lượng cao. Để nâng cao khả năng tổng hợp chất màu carotenoid của chủng Blakeslea trispora chúng tôi đưa ra các giải pháp công nghệ sau: - Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp. - Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp. - Lựa chọn pH thích hợp. - Tỉ lệ phối giống thích hợp. - Lựa chọn thể tích môi trường lên men: - Bổ sung các tiền chất và chất hoạt động bề mặt với nồng độ thích hợp. * Xử lí đột biến chủng Blakeslea trispora. PHầN II NGUYÊN VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU I - Nguyên liệu 1. Chủng vi sinh vật Sử dụng chủng giống Blakeslea trispora WH1(+) và WH2(-) và 5989 (+) được bộ môn Công Nghệ Enzyme và Protein thuộc Viện Công nghiệp Thực phẩm cung cấp. (+) là kí hiệu của chủng giống có giới tính đực. (-) là kí hiệu của chủng giống có giới tính cái. 2. Hoá chất và thiết bị 2.1. Hoá chất: + Cao ngô (Nhật ) + Glucose (Việt Nam) + Saccharose (Việt Nam) + Cao nấm men (Việt Nam) + L-asparagin (Trung Quốc) + Cazein hydrolysis ( Đức) + Agar (Việt Nam) + KH2PO4 (Trung Quốc) + MgSO4 (Trung Quốc) + VTM B1 (Nhật Bản) +Dầu đậu nành (Việt Nam) + Dầu ô liu (Pháp) + b-ionone (Nhật Bản) + iso niazid (Nhật Bản) + Span20 (Nhật Bản) + BHT (Nhật Bản) + n-Hecxan (Trung Quốc) + Ethanol (Trung Quốc) +Nystatin (Sigma) +lovastatin (Sigma) +Sodiume deoxycholate (Đức) +EMS (Nhật) +Sodium thiosunfat (Nhật) 2.2. Thiết bị và dụng cụ + Box cấy Bioblockscientific (Phỏp) + Nồi hấp ỏp lực Himayamatoko (Nhật) + Mỏy lắc tròn có điều nhiệt. Lab-Line (Mỹ) + Mỏy li tâm Universal 16 (Hettich) + Lũ vi súng. LG (Hàn Quốc) + Kớnh hiển vi quang học Eclipse E600-Nikon (Nhật) + Mỏy so mầu Jenway 6300 Spectrophotometer +Máy chỉnh pH +Tủ ấm , tủ sấy. + Ly tâm siêu tốc + Đĩa peptri, pipetman cỏc loại, ống eppendorff, ống falcon, đầu cụn cỏc loại, que cấy, đèn cồn. 3. Một số môi trường sử dụng cho nghiên cứu 3.1. Môi trường nhân giống: Môi trường 1: Môi trường thạch nghiêng (PDA) cho nhân giống hai chủng WH1 và WH2. Agar 2.2% Đường glucose 2% Khoai tây 20% Môi trường 2: Môi trường thạch nghiêng (PSA) cho nhân giống chủng 5989. Agar 2.2% Đường saccharose 2% Khoai tây 20% pH=5,6 3.2. Môi trường lên men Sử dụng môi trường cơ bản, môi trường chọn lọc và ba loại môi trường bổ sung thêm các thành phần khác.  Môi trường lên men cơ bản. Glucose 50g/l L-asparagin 2g/l KH2PO4 1,5g/l MgSO4 0,5g/l VTM-B1 5mg/l BHT 0,05% Dầu 2,5% Môi trường chọn lọc của WH1 Glucose 50g/l Cao ngô 60g/l KH2PO4 1,5g/l MgSO4 0,5g/l VTM-B1 5mg/l BHT 0,05%  Dầu 2,5% Môi trường chọn lọc của WH2 Glucose 60g/l Cao ngô 50g/l KH2PO4 1,5g/l MgSO4 0,5g/l VTM-B1 5mg/l BHT 0,05% Dầu 2,5% Môi trường chọn lọc của 5989 Glucose 60g/l L-asparagin 6g/l KH2PO4 1,5g/l MgSO4 0,5g/l VTM-B1 5mg/l BHT 0,05% Dầu 2,5% Môi trường lên men cho các chủng Tên chủng Môi trường lên men MT cơ bản (MT1) MT chọn lọc (MT2) MT3 MT4 MT5 WH1 MT1 MT2 MT2+Lactose MT1 + Cao nấm men MT4+ Cao ngô + Cazein hidrolysis WH2 MT1 MT2 MT2+Lactose MT1 + Cao nấm men MT4+ Cao ngô + Cazein hidrolysis 5989 MT1 MT2 MT1+Lactose MT1 + Cao nấm men MT4+ Cao ngô + Cazein hidrolysis WH1:WH2 MT2 MT2+Lactose MT1 + Cao nấm men 5989:WH2 MT1+Cao ngô MT1+ Cao ngô +Lactose MT1 + Cao nấm men 3.3. Môi trường hoạt hoá chủng đột biến Blakeslea trispora - Môi trường CM 17-1. Glucose 3 g/l L-asparagin 200 mg/l KH2PO4 1,5 g/l MgSO4 0,5 g/l Cao nấm men 100 mg/l Sodium deoxycholate 100 mg/l VTM B1 25 mg/l Agar 22 g/l pH = 5,3 đ 5,5 Sau đó bổ sung chất kháng sinh vào môi trường CM17-1: Hoặc * Nystatin: 0.7 đ 0.8 mg/ml. Hoặc * Lovastatin: 30 mg/ml 4. Phương pháp nghiên cứu 4.1. Phương pháp vi sinh Môi trường giữ giống và môi trường nhân giống +Môi trường giữ giống Nguyên tắc: Giống được bảo quản trong cát vô trùng (cát vàng sàng qua rây) đã xử lý bằng hoá chất. Mục đích là để rửa sạch và loại bỏ tạp chất kim loại bằng nam châm, sau khi cát được làm sạch cho cát vào trong ống nghiệm có nút xoáy thanh trùng, sấy ở nhiệt độ 60 0 C cuối cùng cấy giống cần bảo quản vào trong ống cát ở trong điều kiện vô trùng. Sấy ống giống ở nhiệt độ 370C trong ._.