Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella phân lập được từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy và chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh

1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm gần đây, nền kinh tế nước ta đã và đang có những bước phát triển vượt bậc về mọi mặt, đời sống kinh tế xã hội ngày càng được cải thiện. Đóng góp một phần không nhỏ cho sự thành công đó phải kể đến các thành tựu của ngành nông nghiệp, trong đó có ngành chăn nuôi thú y mà đặc biệt là ngành chăn nuôi lợn. Ngành chăn nuôi lợn đã góp phần đáp ứng nhu cầu thực phẩm trong nước và một phần dành cho xuất khẩu thu ngoại tệ. Theo CIRAD (2006)[43], thịt lợn chiếm 77% tổng lượng các loại thịt tiêu dùng hàng ngày trên thị trường Việt Nam. Tuy nhiên, một thách thức không nhỏ đối với việc phát triển chăn nuôi lợn là dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra trên các đàn lợn ở mọi lứa tuổi, làm giảm năng suất, giảm chất lượng con giống hoặc nhiễm vào sản phẩm thịt lợn gây nguy cơ mất an toàn vệ sinh thực phẩm. Một trong những bệnh thường gặp phải kể đến là bệnh tiêu chảy do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn sau cai sữa, còn gọi là bệnh Phó thương hàn tuy không nổ ra thành dịch lớn, nhưng với đặc điểm dịch tễ hết sức phức tạp, đã và đang gây nên những thiệt hại đáng kể cho người chăn nuôi. Có thể nói rằng ở bất kỳ một cơ sở chăn nuôi nào dù quy mô lớn hay nhỏ đều xuất hiện bệnh này. Khi đời sống của nhân dân ngày càng được nâng cao, vấn đề an toàn thực phẩm trong đó có lợn và thịt lợn sạch bệnh, không bị nhiễm Salmonella là một yêu cầu cấp thiết. Có rất nhiều tác giả đã công bố rằng sự nhiễm Salmonella vào thân thịt lợn trong quá trình giết mổ chủ yếu liên quan đến sự nhiễm trùng Salmonella ở ruột (Borch và cs, 1996[38]; Berends và cs, 1997[35]). Do đó, việc giảm tỷ lệ các trại bị nhiễm mầm bệnh Salmonella sẽ làm sự an toàn thịt lợn tăng lên. Mục tiêu của các nhà khoa học, nhà sản xuất là xây dựng các đàn gia súc sạch Salmonella. Nhìn chung vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra ở lợn đã được rất nhiều các nhà vi sinh vật trên toàn thế giới quan tâm. Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về Salmonella và bệnh do chúng gây ra ở lợn như: Nguyễn Thị Nội và cs (1989)[20]; Lê Văn Tạo và cs (1993)[26]; Trần Xuân Hạnh (1995)[11]; Cù Hữu Phú và cs (2000)[21]; Đỗ Trung Cứ (2004)[6]... Theo Bryan (1988)[40]; Nielsen và Wegener (1997)[62]; Berends và cs 1998[36]; Schwartz (1999)[71]: Các đàn lợn bị nhiễm Salmonella không những gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi mà còn là nguồn tàng trữ mầm bệnh gây hại đối với con người. Bởi vậy mà mỗi biện pháp ngăn chặn có hiệu quả ở gia súc đều cần thiết và là điều kiện tiên quyết góp phần giảm thiểu dịch bệnh, tăng thu nhập cho người chăn nuôi, chống ô nhiễm môi trường và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng. Vì vậy mà việc phân lập vi khuẩn Salmonella, xác định serotyp và các đặc tính gây bệnh của chúng ở lợn, nhằm mục đích phát hiện sớm và tìm ra hướng phòng và trị bệnh có hiệu quả luôn là những việc làm cấp thiết. Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu và yêu cầu của sản xuất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella phân lập được từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy và chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh". 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hóa học, serotyp và các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella phân lập được từ lợn sau cai sữa ở một số tỉnh phía Bắc. - Chế tạo thử nghiệm vacxin đa giá có chứa một số các serotyp thường gặp nhất từ những trường hợp nhiễm bệnh Salmonella ở lợn. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra 2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Năm 1880, Eberth lần đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi. Bốn năm sau (1984), Gaffky đã nuôi cấy thành công vi khuẩn này. Loài vi khuẩn Salmonella typhi thời gian đầu được gọi với các tên như: Bacillus typhous, Bacterium typhi và Eberthella typhi hay Eberthella typhi tiphosa, còn tên giống Salmonella được Lignires sử dụng đặt tên cho trực khuẩn gây bệnh dịch tả “Hog-cholera bacillus” vào năm 1900 (Selbizt và cs, 1995[72]) Năm 1885, tên gọi S. choleraesuis lần đầu tiên xuất hiện trong báo cáo năm của phòng chăn nuôi công nghiệp Mỹ. Thời gian này, Salmon, D.E. là trưởng phòng nghiên cứu, vì vậy mà tên ông được lấy đặt cho vi khuẩn mới này. Song Smith, người cộng sự của Salmon mới thật sự là người phát hiện ra vi khuẩn Salmonella. Một vài năm sau đó, lần lượt các loài Salmonella khác đã được phát hiện và những loài vi khuẩn đó vẫn có ý nghĩa trong y học cho tới ngày nay. Năm 1891 Jensen, đã phân lập được S. dublin từ bệnh phẩm của bê bị tiêu chảy. Cũng vào năm đó, S. typhimurium được phát hiện ở vùng Greiswald và Breslau. Hai năm sau đó (1893), tại Breslau đã xảy ra một vụ ngộ độc thịt do ăn phải thịt bò ốm, kết quả là bệnh đã xảy ra ở người. Kaensche là người tìm thấy vi khuẩn, vì vậy vi khuẩn được đặt tên là trực khuẩn Kaensche (Selbizt và cs, 1995[72]). Tất cả các bệnh do Salmonella gây ra lúc đầu được đặt tên chung là Phó thương hàn “Para-typhus”, cho đến năm 1914, có 12 loài vi khuẩn được mô tả và xếp vào giống Salmonella. Năm 1926, với những công trình nghiên cứu của White về cấu trúc kháng nguyên của Salmonella đã bắt đầu một thời kỳ khoa học mới về giống vi khuẩn này. Sau đó Kauffmann cũng rất thành công trong lĩnh vực nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella (Selbizt và cs, 1995[72]). Năm 1934, Kauffmann và White đã thiết lập được bảng cấu trúc kháng nguyên đầu tiên và đặt tên là bảng phân loại Kauffmann-White. Từ đó đến nay, bảng cấu trúc kháng nguyên của Salmonella luôn luôn được bổ sung. Năm 1993 đã có 2375 serovar Salmonella được định danh (Selbizt và cs, 1995[72]). Năm 1997, số serovar đã lên đến 3000 (Plonait và Birkhardt, 1997[65]). Như vậy, giống Salmonella luôn luôn thu hút sự chú ý của các nhà chuyên môn trong lĩnh vực vi sinh vật. Trước năm 1983, sự tồn tại của nhiều loài Salmonella được chấp nhận trong phân loại. Từ đó vì kết quả của những thí nghiệm cho thấy mức tương đồng DNA cao, tất cả các chủng Salmonella được xếp thành một loài duy nhất là S. Choleraesuis (Salmonella choleraesuis) (Crosa và cs, 1973[48]; Farmer, 1995[51]). Năm 1999, tại khóa phân loại học của trung tâm Kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh (CDC: Center for Diease Control and Prevention) của Hoa Kỳ Euzéby đề nghị đặt tên các typ huyết thanh Salmonella như sau: Giống Salmonella được chia thành 2 loài, đó là S. enterica và S. bongori. Tất cả các type huyết thanh gây bệnh cho người và động vật đều thuộc S. enterica. Loài S. enterica được chia nhỏ thành 6 dưới loài đó là: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houterae và indica, tương ứng với số la mã: I, II, IIIa, IIIb, IV và VI dựa trên sự tương đồng DNA và phạm vi vật chủ. Do dưới loài I có nhiều typ huyết thanh khác nhau nên dưới loài này được phân loại đến typ huyết thanh. Để nhấn mạnh rằng typ huyết thanh không phải là loài riêng biệt nên tên của typ huyết thanh không viết nghiêng và chữ đầu phải viết hoa. Vì vậy, S. choleraesuis có tên đầy đủ là S. enterica serotyp choleraesuis, hoặc viết tắt ngắn gọn hơn là S. choleraesuis. Mặc dù hệ thống phân loại mới này không được công nhận một cách chính thức bởi ủy ban quốc tế về vi khuẩn học hệ thống, nhưng nó đã được tổ chức y tế thế giới và hiệp hội vi sinh vật học ở Mỹ chấp nhận sử dụng (Euzéby, 1999[50]). Vi khuẩn Salmonella được phân lập từ thịt lợn chết bởi bệnh Phó thương hàn thường gặp ở miền Tây của nước Mỹ là S. choleraesuis var kunzendorf, S. typhimurium và S. typhisuis (Barnes và Sorensen, 1975[33]). Trong một vài trường hợp, ở lợn còn tìm thấy S. dublin và S. enteritidis. Hai serotyp S. dublin và S. enteritidis cũng gặp ở lợn con đang theo mẹ. Những báo cáo gần đây cho thấy: Ở một số nước như Mỹ, Canada, Anh và Bắc Đài Loan đã phân lập được S. choleraesuis từ người bị bệnh (Khakhria & Johnson, 1995[57]; Chiu và cs, 1996[41]; Su và cs, 2001[74]). Từ việc tìm thấy vi khuẩn Salmonella trong động vật ốm, sản phẩm động vật, trong nước và trong các dụng cụ chăn nuôi..., các tác giả đã có những đề xuất về các giải pháp tổng hợp cần thiết nhằm tránh sự lây lan vi khuẩn trong hệ sinh thái môi trường để bảo vệ sức khỏe. Nguồn tàng trữ Salmonella chủ yếu là đường tiêu hoá của người và động vật mắc bệnh. Một vài loài như S. typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. paratyphi C chỉ ký sinh ở người. Những loài khác hay gặp hơn như: S. choleraesuis, S. enteritidis chủ yếu ký sinh ở động vật nhưng cũng có khả năng gây bệnh cho người. Do tính chất gây bệnh của vi khuẩn Salmonella không những cho gia súc, gia cầm, động vật máu nóng, máu lạnh và cả ở trên người nên từ lâu trong nhân y và thú y, người ta đã quan tâm nghiên cứu các đặc tính sinh học, yếu tố gây bệnh và các biện pháp phòng và điều trị bệnh do chúng gây ra. Wilcock và Schwartz (1992)[80] thì tại nước Anh, năm 1972 tìm thấy vi khuẩn Salmonella có trong phân lợn là 9,9%, năm 1973 tìm thấy vi khuẩn Salmonella trong hạch ruột là 7,3%. Tại Nhật Bản, Asai và cs (2002)[32] cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn sau cai sữa bị tiêu chảy là 12,4%; lợn vỗ béo là 17,3%; lợn con theo mẹ 4,5%. Tác giả cũng cho biết S. typhimurium được phân lập thấy nhiều nhất ở lợn sau cai sữa là 72,6%; lợn gần xuất chuồng là 73,8%. Kishima và cs (2008)[58] đã điều tra tỷ lệ nhiễm và phân bố của vi khuẩn Salmonella trong phân lợn khỏe mạnh bình thường trên toàn lãnh thổ Nhật Bản giữa năm 2003 và năm 2005 là 3,1%. Theo Barnes và Sorensen (1975)[33];Wilcock và Schwartz (1992)[80]: Ở lợn, cần phân biệt 2 dạng bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra, đó là bệnh Phó thương hàn cấp tính ở lợn con do S. choleraesuis var kunzendorf và bệnh viêm ruột mãn tính do S. typhimurium. Ở trâu bò, bệnh chủ yếu do các loài S. dublin và S. entertidis gây ra. Ở cừu, do S. abortus ovis, S. montevideo, S. dublin, S. anatum gây ra. Ở ngựa do S. abortus equi gây ra, còn ở gia cầm và chim do S. pullorum, S. gallinarum, S. typhimurium và S. enteritidis gây ra. Hiện nay, có rất nhiều loại thuốc kháng sinh có thể được sử dụng để điều trị bệnh, nhất là với lợn con trước và sau cai sữa. Tuy nhiên, do việc sử dụng rộng rãi kháng sinh để phòng và điều trị bệnh nên đã xuất hiện các chủng vi khuẩn Salmonella kháng thuốc (Kishima và cs, 2008[58]). Gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào nghiên cứu gen kháng kháng sinh DT104 ở vi khuẩn Salmonella. Chủng đa kháng thuốc S. typhimurium DT104 được phát hiện lần đầu tiên ở người mắc Salmonellosis tại Anh vào năm 1980. Sau đó được quan sát thấy cả ở người cũng như vật nuôi trên khắp thế giới vào những năm 90 và hiện đang là mối quan ngại hàng đầu đối với sức khỏe cộng đồng. Gen này thường xuất hiện ở các serotyp S. typhimurium và ít thấy ở các serotyp khác. Một tổ hợp kháng thuốc điển hình của S. typhimurium DT104 là kháng đồng thời với 5 loại kháng sinh, bao gồm: Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Sulfonamide và Tetracycline (ACSSuT) (Kishima và cs, 2008[58]). Tuy nhiên, không có chiều ngược lại, tức là nếu các kết quả xác định lâm sàng cho thấy một chủng vi khuẩn kháng với cả 5 loại kháng sinh này thì vẫn chưa đủ căn cứ để kết luận là chủng vi khuẩn này có mang gen kháng kháng sinh DT104 (Kishima và cs, 2008[58]). Cũng theo tác giả, có 61,5% số chủng thuộc serotyp S. typhimurium có mang gen DT104. Selbitz (1995)[72] còn cho biết: “genom” của Salmonella được nghiên cứu tương đối kỹ. Cho đến nay ít nhất đã chứng minh được 750 gen, trong đó có 680 gen đã có trong bản đồ gen. Như vậy, vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra được rất nhiều các nhà vi sinh vật trên toàn thế giới quan tâm. Mục đích của các nghiên cứu này nhằm tìm ra các biện pháp có hiệu quả để góp phần ngăn chặn và đẩy lùi bệnh do Salmonella gây ra ở động vật và ở người. 2.1.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước Ở Việt Nam, vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra cho người và gia súc cũng đã được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 50. Viện Pasteur Sài Gòn trong những năm (1951-1953) đã phân lập được 6 chủng Salmonella ở người (4 chủng từ máu, 2 chủng từ nước tiểu). Cũng ở Sài Gòn, trong thời gian này đã phân lập được 35 chủng từ 360 lợn, trong đó có 23 mẫu là S. cholereasuis (Đỗ Đức Diên, 1999[7]). Năm 1989, Nguyễn Thị Nội và cs[19] đã tiến hành điều tra tình hình nhiễm vi khuẩn đường ruột tại một số cơ sở chăn nuôi lợn ở miền Bắc đã tìm thấy 37,5% lợn nhiễm Salmonella. Trước tình hình như vậy, nhóm tác giả này đã nghiên cứu và chế tạo thành công vacxin đa giá Salsco phòng bệnh ỉa chảy cho lợn con. Vacxin đã được áp dụng để phòng bệnh có hiệu quả ở nhiều trại chăn nuôi lợn, tỷ lệ lợn bị tiêu chảy giảm từ 30-50%, tỷ lệ lợn chết do tiêu chảy giảm xuống còn 10-20%. Lê Văn Tạo và cs (1994)[27] đã phân lập và xác định serotyp của vi khuẩn Salmonella gây bệnh ở lợn, kết quả cho thấy: 50% các chủng phân lập được thuộc S. choleraesuis; 12,5% S. enteritidis; 6,25% S. typhimurium và số còn lại thuộc các serotyp khác. Trần Xuân Hạnh (1995)[11] đã phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella ở lợn tại Thành phố Hồ Chí Minh cho kết quả: S. typhisuis ở lợn bệnh là 16,9%; ở lợn bình thường 6-16 tuần tuổi là 4,2%; S. paratyphi ở lợn 6-16 tuần tuổi là 2,8%. Đặc biệt, vi khuẩn S. choleraesuis chiếm 38,7% ở lợn bệnh và 2,8% ở lợn bình thường. Theo Phùng Quốc Chướng (1995)[2] ở Tây Nguyên, mùa khô lợn mắc bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra là 20,03%, vụ đông là 28,66%. Tạ Thị Vịnh và cs (1996)[31] đã kiểm tra 75 mẫu phân lợn khoẻ và 65 mẫu phân lợn bệnh tại một số vùng thuộc Ba Vì (Hà Tây) và Gia Lâm (Hà Nội) cho thấy: Tỷ lệ nhiễm Salmonella cao 30-56% ở lợn khoẻ trong giai đoạn 22-60 ngày tuổi. Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn mắc hội chứng tiêu chảy cao hơn lợn bình thường và tăng dần theo lứa tuổi, dao động từ 70-90%. Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy tại 4 cơ sở chăn nuôi lợn thuộc miền Bắc nước ta của Cù Hữu Phú và cs (2000)[21] cho biết: Tỷ lệ tìm thấy Salmonella trung bình ở lợn tiêu chảy nuôi tại 4 cơ sở trên là 80%. Đây là điều đáng lo ngại đối với ngành chăn nuôi lợn ở nước ta. Theo Nguyễn Bá Hiên (2001)[13], tỷ lệ nhiễm Salmonella ở các đàn lợn, ngoại thành Hà Nội cao nhất là lợn trên 60 ngày tuổi (88,23%), thấp nhất là lợn từ 1-21 ngày tuổi (73,68%). Ngoài ra ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella cũng đã và đang được rất nhiều tác giả quan tâm. Lê Minh Sơn (2003)[25] đã xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella trong thịt lợn giết mổ tiêu dùng nội địa từ 10,91-16,67% và thịt lợn xuất khẩu trung bình 1,42%. Tô Liên Thu (2005)[30] đã xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella của các mẫu thịt gà ở Hà Nội là rất cao: 33% các mẫu lấy tại siêu thị, 40% các mẫu lấy từ chợ. Lò mổ là một mắt xích quan trọng có nguy cơ cao ô nhiễm Salmonella vào thân thịt sau giết mổ. Trần Thị Hạnh và cs (2009)[12] đã công bố tỷ lệ nhiễm Salmonella tại các cơ sở giết mổ lợn công nghiệp và cho kết quả: Chất chứa manh tràng của lợn là 59,18%, ở mẫu lau thân thịt là 70%, mẫu lau hậu môn 66%, mẫu lau nền chuồng nhốt lợn chờ giết mổ là 40%, mẫu lau sàn giết mổ là 28%, còn các mẫu nước kiểm tra không phát hiện Salmonella. Tại các cơ sở giết mổ lợn theo phương thức thủ công cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chất chứa manh tràng của lợn chờ giết mổ là 87,5%, ở mẫu lau thân thịt là 75%, mẫu lau hậu môn là 55%, mẫu lau nền chuồng nhốt lợn chờ giết mổ là 70%, mẫu lau sàn giết mổ là 80%, mẫu nước là 50%. Cùng với quá trình nghiên cứu chi tiết về vi khuẩn, các biện pháp phòng bệnh đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, trong đó có vacxin phòng bệnh. Nguyễn Văn Lãm (1968)[15] đã tiến hành nghiên cứu chế vacxin Phó thương hàn lợn con từ chủng Salmonella chuẩn của Trung Quốc. Hiện nay, các loại vacxin phòng bệnh Phó thương hàn đã được một số công ty, xí nghiệp thuốc thú y sản xuất như vacxin nhược độc chủng TS – 177, vacxin có bổ trợ như vacxin keo phèn hay vacxin nhũ hoá có bổ trợ dầu. Như vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn Salmonella một cách toàn diện để từ đó đề ra biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả, giữ gìn vệ sinh an toàn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe con người là một yêu cầu rất cần thiết. 2.2 Một số đặc điểm của vi khuẩn Salmonella Trực khuẩn Salmonella thuộc bộ Eubacteriales, họ Enterobacteriaceae. Giống Salmonella gồm 2 loài: S. enterica và S. bongori đã được phân chia thành trên 2000 serotyp theo bảng phân loại Kauffmann-White trên cơ sở cấu trúc của kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và đôi khi các kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K). Gần đây, loài S. enterica đã được phân thành 6 phân loài đó là: S. enterica subsp. enterica, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizinae, S. enterica subsp. houtenae, S. enterica subsp. indica. Trong đó phân loài S. enterica subsp. enterica gồm phần lớn các chủng Salmonella là những tác nhân gây bệnh cho người và động vật (Quinn, 2002[68]). 2.2.1 Đặc điểm hình thái Theo Bergeys Manual (1994)[37], vi khuẩn Salmonella là những trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, có kích thước 0,4-0,6 x 1,0-3,0 mm, bắt màu Gram âm, không hình thành nha bào và giáp mô. Đa số loài Salmonella có lông (flagella) từ 7-12 chiếc xung quanh thân (trừ S. gallinarum-pullorum). Lông giúp cho vi khuẩn có khả năng di động. Lông có hình tròn, dài, xuất phát từ màng cytoplasma. Do có cấu trúc từ các sợi protein hình xoắn nên có thể co giãn và di động nên lông của chúng rất khó nhuộm. Nếu nhuộm bằng phương pháp Haschem (1972) thì có thể nhìn thấy chúng dưới kính hiển vi điện tử (Lê Văn Tạo, 1993[26]). Lông có tính kháng nguyên và do các gen mã hóa tổng hợp protein riêng quy định. Ngoài ra, trên bề mặt màng ngoài của vi khuẩn Salmonella đều có các cấu trúc sợi nhỏ hơn, còn gọi là Fimbriae hay Pili. Chúng có kích thước chừng 0,01- 0,03 x 1,0 mm. Số lượng fimbriae trên 1 vi khuẩn có khoảng 250- 400 cái vươn thẳng ra xung quanh bề mặt tế bào. Fimbriae có cấu trúc là protein và có tính kháng nguyên đặc trưng. Theo Jones và cs (1981)[56]: Fimbriae tạo cho vi khuẩn khả năng bám dính (adhesion) lên các tế bào biểu mô ruột và xâm nhập vào lớp niêm mạc. 2.2.2 Tính chất nuôi cấy Salmonella là vi khuẩn vừa hiếu khí, vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 37oC, nhưng có thể phát triển được ở nhiệt độ từ 6- 42oC. Nuôi cấy ở 43oC có thể loại trừ được tạp khuẩn mà Salmonella vẫn phát triển được (Timoney và cs, 1988[76]). pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 7,6, tuy nhiên vi khuẩn vẫn phát triển được ở pH từ 6-9. Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường BPW (Buffered Pepton Water) và môi trường RV (Rappaports Vassiliadis) sau vài giờ nuôi cấy thấy môi trường vẩn đục nhẹ, sau 18 đến 24 giờ thấy canh trùng đục đều, trên mặt môi trường có màng mỏng, đáy ống nghiệm có cặn. Hiện nay có rất nhiều loại môi trường chọn lọc được các nhà vi sinh vật thú y sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và phân lập Salmonella như môi trường thạch DHL (Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose agar), sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc tròn, lồi, bóng láng (dạng S), có màu vàng nhạt. Các chủng sinh H2S thì giữa khuẩn lạc có màu đen. Môi trường thạch MacConkey: Vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc tròn lồi, trong không màu, nhẵn bóng. Trên môi trường thạch CHROMTM Salmonella, sau 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trơn, tròn, bóng láng (dạng S) và có màu tím hồng. Trong môi trường thạch TSI (Triple Sugar Iron), vi khuẩn Salmonella do sản sinh alkaline nên phần thạch nghiêng có màu đỏ (pH=7,3), đáy ống nghiệm màu vàng (pH=6,8) do vi khuẩn chỉ lên men đường Glucose. Phần giữa ống nghiệm có màu đen do vi khuẩn sản sinh ra khí H2S. Nếu để lâu (quá 24 giờ), màu đen môi trường thường làm át phản ứng tạo axit ở phần đáy ống nghiệm (không nhìn thấy màu vàng). Vi khuẩn sinh hơi làm nứt thạch, có khi đẩy thạch khỏi đáy ống nghiệm (Quinn và cs, 2002[68]). Trong môi trường LIM (Lysine Indole Motility), vi khuẩn không làm chuyển màu môi trường, môi trường có màu tím nhạt. Môi trường Malonate, vi khuẩn không phát triển nên không làm thay đổi màu môi trường. 2.2.3 Đặc tính sinh hoá Theo Quinn và cs (2002)[68], giống vi khuẩn Salmonella được chia thành 7 phân nhóm, mỗi phân nhóm có khả năng lên men một số loại đường nhất định và không đổi. Phần lớn phân loài S. enterica subsp. enterica gây bệnh cho động vật máu nóng. Chúng lên men và sinh hơi: Glucoza, Mannit, Mantoza, Galactoza, Dulcitol, Arabonoza, Sorbitol. Cũng ở nhóm này, hầu như các chủng vi khuẩn Salmonella đều không lên men Lactoza và Saccaroza. Đa số các vi khuẩn thuộc giống Salmonella không làm tan chảy Gelatin, không phân giải Urê, không sản sinh Indol. Phản ứng MR, Catalaza dương tính (trừ S. choleraesuis, S. gallinarum-pullorum có MR âm tính). Phản ứng Oxidaza âm tính. Phản ứng sinh H2S dương tính (trừ S. paratyphi A, S. typhisuis, S. choleraesuis) (Ewing và Edwards, 1970[49]). Trong quá trình phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella thì đặc tính sinh hóa có ý nghĩa rất quan trọng. Đây là bước không thể bỏ qua khi xét nghiệm vi khuẩn nói chung và vi khuẩn Salmonella nói riêng. 2.2.4 Sức đề kháng của vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn Salmonella mẫn cảm với nhiệt độ và các chất sát trùng mạnh. Ở nhiệt độ 50oC trong 1 giờ, 70oC trong 20 phút, 100oC trong 15 phút hoặc ánh sáng mặt trời chiếu thẳng trong 5 giờ có thể diệt được vi khuẩn (Laval, 2000[16]). Các chất sát trùng thông thường dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn như: Phenol 5%, Formon 1/500 diệt vi khuẩn trong 15- 20 phút. Theo Laval, (2000)[16], vi khuẩn Salmonella sống được lâu trong điều kiện lạnh, chúng có thể sống trong bột thịt 8 tháng, nhưng ở điều kiện môi trường có độ pH ≤ 5 chúng chỉ sống được trong thời gian ngắn. Vi khuẩn Salmonella tồn tại trong chất độn chuồng tới trên 30 tuần, có thể sống ở trong đất với độ sâu 0,5cm trong thời gian 2 tháng. Ở sàn gỗ, tường gỗ trong điều kiện ít ánh sáng là 87 ngày, máng gỗ 108 ngày (Đào Trọng Đạt và cs, 1995[10]). Trong nước tù đọng, đồng cỏ ẩm thấp S. typhimurium có thể tồn tại trên 7 tháng. Trong xác súc vật chết, Salmonella có thể sống trên 100 ngày, trong thịt ướp muối từ 6-8 tháng (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1970[22]). 2.2.5 Đặc điểm dịch tễ học của vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho người và vật nuôi, phân bố ở khắp nơi trên thế giới, vì vậy các nghiên cứu về cách truyền lây của vi khuẩn này được nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Một đặc điểm dịch tễ quan trọng của Salmonella là trạng thái mang trùng và thải trùng của gia súc. Theo Archie Hunter (2002)[14], một nguồn bệnh đặc biệt quan trọng là gia súc mang vi khuẩn Salmonella nhưng không biểu hiện lâm sàng. Những con này có thể thải mầm bệnh ra ngoài môi trường trong vài tháng. Tác giả cũng cho biết cách lây lan như sau: Gia súc nhiễm bệnh thải vi khuẩn Salmonella vào trong phân và bệnh xảy ra do tiếp xúc trực tiếp hay ô nhiễm phân vào thức ăn, nước uống hay chuồng trại gia súc. Theo Gray và cs (1995)[54] , các lợn nhiễm S. choleraesuis thường biểu hiện các dấu hiệu lâm sàng từ 36-48 giờ sau khi nhiễm trùng và có 103- 106 đơn vị vi khuẩn trong 1 gram phân vào giai đoạn bệnh cao nhất. Cũng theo tác giả thì phần lớn những lợn nhiễm tự nhiên sau khi khỏi bệnh, có thể loại thải hoàn toàn vi khuẩn vào giữa 9-12 tuần sau khi nhiễm trùng. Điều này cho thấy rằng tình trạng mang trùng lâu dài này có thể dẫn tới sự nhiễm khuẩn môi trường và sự tái nhiễm tiếp theo của những động vật mới đưa vào trại. Nhiều nhà khoa học khi nghiên cứu về đường nhiễm Salmonella đều cho rằng: Vi khuẩn Salmonella theo thức ăn, nước uống vào đường tiêu hóa và có thể do tiếp xúc. Bình thường, chúng sống trong ống tiêu hoá mà không gây bệnh. Chỉ khi nào sức đề kháng của lợn giảm sút, vi khuẩn xâm nhập vào máu và nội tạng gây bệnh. Bệnh Phó thương hàn chỉ gây thành dịch địa phương, dịch bệnh phụ thuộc vào cơ cấu đàn, tình hình vệ sinh thú y, chế độ chăm sóc nuôi dưỡng và đặc điểm dịch tễ học của cơ sở đó (Phan Thanh Phượng, 1988[23]; Nguyễn Như Thanh, 2001[28]; Laval, 2000[16]). Theo Phan Thanh Phượng (1988)[23], tỷ lệ lợn mắc bệnh do Salmonella gây ra thường tăng lên vào thời kỳ lợn cai sữa, vì lúc đó cơ thể lợn con thay đổi, dễ nhiễm bệnh. Nguyễn Như Thanh (2001)[28], cũng cho biết: vi khuẩn gây ra bệnh Phó thương hàn cho lợn con từ 2 – 4 tháng tuổi với tỷ lệ tử vong khoảng 25%, có khi lên đến 95%; bệnh có thể ở lợn lớn với thể mãn tính và ít gây chết. Bệnh ít xảy ra ở lợn con trước cai sữa, bởi chúng được bảo hộ nhờ kháng thể có trong sữa đầu của lợn mẹ. Song nguy cơ nổ ra bệnh tăng dần theo lứa tuổi, đặc biệt là sau cai sữa, khi mà khả năng miễn dịch chủ động chưa thể bù đắp kịp thời để thay thế miễn dịch thụ động (Laval, 2000[16]). 2.2.6 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmoenlla hết sức phức tạp, bao gồm 3 loại chính: Kháng nguyên O (O- Antigen): Kháng nguyên thân. Kháng nguyên H (H- Antigen): Kháng nguyên lông. Kháng nguyên K (K- Antigen) hay kháng nguyên vỏ. * Kháng nguyên thân O (O- Antigen) Kháng nguyên O nằm ở thành tế bào vi khuẩn, có cấu trúc Lipopolysaccharide (LPS) là thành phần chính cấu tạo nên lớp màng ngoài của thành tế bào vi khuẩn Gram âm. Kháng nguyên O chịu nhiệt (Heat-stable) và kháng cồn, bị biến tính khi sử lý bằng formaldehyde. Kháng nguyên O gồm 2 nhóm chính: - Polysaccharide không có nhóm hydro, không mang tính đặc trưng của kháng nguyên và chỉ tạo sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc từ dạng S (Smooth) sang dạng R (Rough) và dẫn đến giảm độc lực của vi khuẩn (Selbitz, 1995[72]). - Polysaccharide nằm ở ngoài có nhóm hydro quyết định tính kháng nguyên và đặc trưng cho từng serotyp. Kháng nguyên O được xem như là một nội độc tố (Endotoxin) mà nó được cấu tạo bởi nhóm hỗn hợp Glyco- polypeptide có thể tìm thấy ở màng ngoài của vỏ bọc vi khuẩn. Theo CIRAD (2006)[43], kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella có 67 loại chính, được chia thành hơn 50 nhóm, số còn lại đóng vai trò phụ. * Kháng nguyên lông H (H- Antigen) - Kháng nguyên H (H-Antigen) là protein nằm trong thành phần lông của vi khuẩn, là loại kháng nguyên không chịu nhiệt (Heat labile), rất kém bền vững so với kháng nguyên O, bị phá hủy ở nhiệt độ 60oC sau 1 giờ, dễ phá hủy bởi cồn và axit yếu (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001[28]). - Kháng nguyên H gồm có 2 pha: Pha 1: có tính đặc hiệu, gồm 28 loại kháng nguyên được biểu thị bằng chữ mẫu la tinh thường: a,b,c,d,...,z. Pha 2: Không có tính đặc hiệu, gồm 6 loại được biểu thị bằng chữ số ả rập: 1,2,3,4,5,6 hay la tinh thường: e,n,x,.... Tuy nhiên, trong từng tế bào vi khuẩn riêng biệt luôn luôn chỉ xuất hiện từng pha, bởi vậy mà trong chẩn đoán, để đạt được một công thức kháng nguyên hoàn chỉnh cho Salmonella phải thay đổi pha. Có các loài Salmonella như S. typhisuis, hoặc S. enteritidis... thì chỉ tạo 1 pha. Kháng nguyên H không quyết định yếu tố độc lực của vi khuẩn, cũng như không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, nhưng nó có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định giống loài của vi khuẩn. * Kháng nguyên vỏ (K- Antigen)( hay Vi- Antigen) Theo Quinn và cs (2002)[68], kháng nguyên vỏ chỉ có ở một số loài như S. typhi, S. paratyphi. S. dublin cũng có thể mang kháng nguyên vỏ, kháng nguyên K có thể làm che các kháng nguyên thân O. Cũng theo tác giả, nếu đun sôi huyễn dịch của các loài Salmonella này trong 10 đến 12 phút sẽ phá hủy được kháng nguyên vỏ. Kháng nguyên vỏ là một loại kháng nguyên có khả năng ngưng kết kháng thể O khi phát triển nhiều. Kháng nguyên này chỉ gặp ở 2 serotyp là: S. typhi và S. paratyphi C, ký hiệu kháng nguyên hay Vi trong công thức đứng sau kháng nguyên O. Theo sơ đồ của Kauffmann – White; công thức kháng nguyên của S. paratyphi C là: 6,7, Vi: -1,5 và S. Typhi là: 9, 12, Vi: c,d. Trong 3 kháng nguyên chủ yếu trên, kháng nguyên O và kháng nguyên H là 2 loại kháng nguyên có ý nghĩa quan trọng trong công tác chẩn đoán. 2.2.7 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella 2.2.7.1 Các yếu tố không phải là độc tố a) Kháng nguyên O Chất lượng thành phần hóa học, cấu trúc kháng nguyên O đều ảnh hưởng tới độc lực của vi khuẩn Salmonella. Cụ thể là: S. typhimurium nếu thay đổi thành phần kháng nguyên từ công thức 1, 4, 12 sang 1, 9, 12 thì vi khuẩn từ dạng có độc lực chuyển sang dạng không có độc lực (Valtonen, 1977[78]). Kháng nguyên O là yếu tố độc lực giúp vi khuẩn chống lại khả năng phòng vệ của vật chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tế bào tổ chức, chống lại sự thực bào của đại thực bào (Morris và cs, 1976[60]). Kháng nguyên O khích thích các cơ quan đáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể đặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên tương ứng. Cơ chế phòng vệ này giúp cơ thể vật chủ chống lại quá trình tái xâm nhập của vi khuẩn. Đến nay, người ta đã xác định được trên 3000 serotyp kháng nguyên O của Salmonella, thành phần kháng nguyên của vi khuẩn S. choleraesuis gồm: O6, O7; S. typhimurium gồm: O1, O4, O5, O12; S. enteritidis gồm: O1, O9, O12. b) Kháng nguyên H Kháng nguyên H không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, cũng không quyết định yếu tố độc lực, tuy vậy nó có vai trò bảo vệ cho vi khuẩn không bị tiêu diệt bởi quá trình thực bào, giúp vi khuẩn sống và nhân lên trong các tế bào đại thực bào, cũng như trong tế bào gan và thận (Weinstein và cs, 1984[79]). c) Kháng nguyên K Bản chất hóa học của kháng nguyên K là Polysaccharide, nhưng thực chất chúng chỉ là thành phần của kháng nguyên O. Kháng nguyên K tạo hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác động ngoại cảnh và hiện tượng thực bào (Nguyễn Như Thanh, 2001[28]) d) Yếu tố bám dính Theo Jones và Richardson (1981)[56] khả năng bám dính của vi khuẩn Salmonella lên tế bào nhung mao ruột là bước khởi đầu quan trọng trong quá trình gây bệnh. Hiện tượng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vừa mang tính chất lý hóa, vừa mang tính chất sinh học và được thực hiện theo 3 bước: Bước 1: Vi khuẩn liên kết từng phần với bề mặt tế bào, thực hiện quá trình này đòi hỏi vi khuẩn phải có khả năng di động. Bước 2: Là quá trình hấp phụ, phụ thuộc vào đặc tính bề mặt của vi khuẩn và tế bào mà vi khuẩn bám dính và được thực hiện theo hướng thuận nghịch với sự tương hỗ của những tác động khác nhau. Bước 3: Là quá trình tương tác giữa yếu tố bám dính của vi khuẩn với các điểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào. Yếu tố bám dính của vi khuẩn được sắp xếp trên các fimbriae. Theo Lê Văn Tạo (1993)[26], trên mỗi tế bào vi khuẩn Salmonella có từ 250- 400 fimbriae, chúng giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột non để gây bệnh. Đỗ Trung Cứ và cs (2003)[5] đã công bố: S. typhimurium phân lập từ lợn mắc bệnh Phó thương hàn có khả năng bám dính lên bề mặt tế bào Vero với tỷ lệ cao (từ 70,76% - 93,48%). Kết quả này tương đương với khả năng bám dính của chủng S. typhimurium chuẩn. e) Yếu tố xâm nhậ._.p Theo Finlay và cs (1988)[52], khả năng xâm nhập vào tế bào có nhân hoặc lớp niêm mạc của đường ruột là đặc tính của một số chủng Salmonella có độc lực. Các biến chủng Salmonella không có khả năng xâm nhập vào tế bào thường là các chủng không có độc lực. Sau khi tiếp cận tế bào vật chủ, vi khuẩn Salmonella tác động làm tăng hàm lượng Ca++ nội bào, hoạt hóa Actin Depolimeriring Enzyme, làm thay đổi cấu trúc, hình dạng các sợi actin, biến đổi màng tế bào, dẫn đến hình thành giả túc bao vây tế bào vi khuẩn dưới dạng các không bào chứa vi khuẩn. Sau đó Salmonella được xâm nhập vào trong tế bào, tồn tại, tiếp tục nhân lên với số lượng lớn, phá vỡ tế bào vật chủ, sản sinh độc tố đường ruột (Enterotoxin), làm xuất hiện quá trình tiêu chảy của vật chủ (Frost và cs, 1997[53]). f) Khả năng tổng hợp sắt Theo Benjamin (1985)[34], đây là một yếu tố giúp vi khuẩn Salmonella tăng nhanh về số lượng làm suy yếu khả năng chống đỡ của vật chủ do bị thiếu sắt. Cũng theo tác giả, vi khuẩn Salmonella có phản ứng với sự thay đổi cơ chế chu chuyển sắt; khi quá trình tổng hợp sắt bị ức chế, chúng sẽ chuyển toàn bộ protein màng điều phối sắt lên bề mặt của tế bào vi khuẩn, làm cho khả năng hấp thu sắt tăng cường một cách rõ rệt. i) Khả năng kháng kháng sinh Khi vi khuẩn có sẵn những yếu tố gây bệnh thì khả năng kháng kháng sinh sẽ làm tăng tính gây bệnh của vi khuẩn lên gấp bội. Việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc kháng sinh để phòng trị bệnh, kích thích sinh trưởng của gia súc, gia cầm, đã tạo ra nhiều giống vi khuẩn có khả năng kháng thuốc, mang plasmid kháng kháng sinh, tồn tại rất lâu trong cơ thể người, vật nuôi và môi trường. Khả năng kháng kháng sinh có thể thay đổi, phụ thuộc vào địa phương, thời điểm làm kháng sinh đồ và loại vật nuôi. Trên đây là 7 yếu tố gây bệnh không phải là độc tố của vi khuẩn Salmonella. Các yếu tố này bằng những cơ chế tác động khác nhau, phương thức tác động khác nhau, đã tạo điều kiện bất lợi cho cơ thể vật chủ, đồng thời chúng lại tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn Salmonella gây bệnh. Chính vì thế các yếu tố không phải là độc tố đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella. Vì vậy, việc nghiên cứu các yếu tố này là hết sức cần thiết, góp phần quan trọng trong việc phòng chống bệnh do vi khuẩn Salmonella gây nên. 2.2.7.2 Các yếu tố là độc tố Nếu như các yếu tố gây bệnh không phải là độc tố là những tác nhân gián tiếp, quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella, thì các yếu tố gây bệnh là độc tố lại là tác nhân trực tiếp quyết định quá trình sinh bệnh. Các yếu tố gây bệnh là độc tố của Salmonella bao gồm: nội độc tố (Endotoxin), ngoại độc tố đường ruột (Enterotoxin) và độc tố tế bào (Cytotoxin) (Finlay và Falkov, 1988[52]) Độc tố đường ruột (Enterotoxin) Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính: Độc tố thẩm xuất nhanh RPF (Rapid Permeability Factor) và độc tố thẩm xuất chậm DPF (Delayed Permeability Factor) (Peterson, 1980[64]). + Theo Clarke và cs (1988)[44], độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc thành phần giống với độc tố chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli (Heat-stabile toxin: ST). Yếu tố thẩm xuất nhanh giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột, và thực hiện khả năng thẩm xuất sau 1- 2 giờ, kéo dài 48 giờ và làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell). ST có khả năng chịu được nhiệt độ 100oC trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt độ thấp, có thể bảo quản ở -20oC. Cấu trúc phân tử gồm nhiều polysaccharide và một số chuỗi polypeptide. Độc tố RPF kích thích lên hệ thống men Guanylate Cyclase trong tế bào biểu mô ruột, chuyển GTP thành GDP. Trong tế bào, GDP tăng cao làm cho nồng độ ion Ca++ cũng tăng cao, dẫn đến ngăn cản hấp thu chất điện giải và nước ở trong xoang ruột. Do vậy, lượng nước trong ruột tăng cao, kích thích niêm mạc ruột, tăng co bóp, làm gia súc ỉa chảy. Theo Đỗ Trung Cứ (2001)[4]: 72,7% các chủng Salmonella phân lập được từ lợn sau cai sữa bị ốm, chết nghi Phó thương hàn sản sinh độc tố chịu nhiệt. + Yếu tố thẩm xuất chậm của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli (Heat Labile Toxin: LT). Nó thực hiện chức năng thẩm xuất chậm từ 18- 24 giờ, có thể kéo dài 36- 48 giờ. DPF bị phá hủy ở 70oC trong vòng 30 phút và ở 56oC trong vòng 4 giờ. Cấu trúc phân tử gồm 3 chuỗi polypeptide và một số hợp chất khác, phân tử lượng 40.000- 50.000 dalton. Độc tố thẩm xuất chậm của Salmonella làm thay đổi quá trình trao đổi nước và chất điện giải, dẫn đến tăng cường bài xuất nước và chất điện giải từ mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thoái hóa lớp tế bào villi của thành ruột gây tiêu chảy. Đỗ Trung Cứ và cs (2003)[5] đã kết luận: 81,81% số chủng S. typhimurium phân lập từ lợn mắc bệnh tiêu chảy sản sinh độc tố không chịu nhiệt (LT) có khả năng gây tích nước trong ruột non của lợn thí nghiệm. Nội độc tố (Endotoxin) Nội độc tố nằm ở lớp màng ngoài của tế bào vi khuẩn và được cấu tạo bởi thành phần cơ bản là Lipopolysaccharide (LPS). LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biệt với các đặc tính và chức năng riêng biệt: Vùng ưa nước, vùng lõi và vùng lipit A. Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi Polysaccharide chứa các đơn vị cấu trúc kháng nguyên O. Vùng lõi có bản chất là acid heterooligosaccharide, ở trung tâm, nối kháng nguyên O với vùng lipit A. Vùng lipit A đảm nhận chức năng nội độc tố của vi khuẩn. Cấu trúc nội độc tố gần giống với cấu trúc của kháng nguyên O. Cấu trúc nội độc tố biến đổi sẽ dẫn đến sự thay đổi độc lực của Salmonella. Các đột biến gen ở vùng lõi, vùng ưa nước làm cho Salmonella không còn độc lực (Trần Quang Diên, 2002[8]). Lipit A có ái lực với màng tế bào, với lipit khác và với Protein. Điều đó chứng tỏ lipit A chính là trung tâm hoạt động của nội độc tố. Vùng đa đường Polysaccharide, chỉ giữ vai trò là vật mang các lipit không hòa tan (Bradley, 1979[39]). Nội độc tố là LPS được tiết ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải. Trước khi thể hiện độc tính, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: Tế bào lâm bao cầu B, lâm bao cầu T, tế bào đại thực bào, tiểu cầu, tế bào gan lách. Rất nhiều các cơ quan trong cơ thể vật chủ chịu sự tác động của nội độc tố LPS: Gan, thận, cơ, hệ tim mạch, hệ tiêu hóa và hệ thống miễn dịch với các biểu hiện bệnh lý như: Tắc mạch máu, giảm trương lực cơ, thiếu oxy mô bào, toan huyết, rối loạn tiêu hóa, mất tính thèm ăn. Độc tố tế bào (Cytotoxin) Đặc tính chung của Cytotoxin là có khả năng ức chế tổng hợp Protein của tế bào có nhân và làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell) Đa phần độc tố của chúng bị phá hủy bởi nhiệt độ. Theo Clarke và cs (1988)[44], làm tổn thương tế bào biểu mô là đặc tính quan trọng của Cytotoxin. Có ít nhất là 3 dạng Cytotoxin: + Dạng 1: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với Trypsin. Độc tố này có trọng lượng phân tử khoảng 56- 78 kDa, nó tác động theo cơ chế là ức chế tổng hợp Protein của tế bào Hela và làm teo tế bào. + Dạng 2: Có nguồn gốc từ Protein màng ngoài tế bào vi khuẩn, có cấu trúc và chức năng gần giống với các dạng độc tố tế bào do Shigella và các chủng Enterotoxigenic E. coli (ETEC) sản sinh ra. Dạng độc tố này cũng có ở hầu hết các serovar Salmonella gây bệnh. + Dạng 3: Dạng này có liên quan với Hemolysin. Dạng độc tố này tác động lên tế bào theo cơ chế dung giải các không bào nội bào. Trong phòng thí nghiệm, độc tố này gây chết tế bào Vero, tế bào Hela và tế bào CHO (Rahman và cs, 1992[69]). Trên đây là 3 loại độc tố gây bệnh chính của vi khuẩn Salmonella, chúng là các tác nhân trực tiếp, quyết định khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Một số serotyp như: S. choleraesuis, S. typhimurium, S. enteritidis, S. dublin, S. gallinarum, S. pullorum có mang các plasmid có kích thước lớn (khoảng từ 50- 100 kb). Chính những plasmid này có mang các yếu tố di truyền quyết định khả năng sản sinh các yếu tố độc lực gây bệnh cho người và gia súc với tỷ lệ ốm và chết cao (Krause và Fang, 1995[59]). 2.3 Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn 2.3.1 Đặc tính sinh bệnh Theo Quinn và cs (2002)[68], sự lây truyền Salmonella thường qua con đường phân-miệng, nhưng nhiễm trùng qua niêm mạc của kết mạc mắt và đường hô hấp trên cũng có khả năng xảy ra. Cũng theo Quinn và cs (2002)[68], Salmonella cần xâm nhập vào ruột non và kết tràng để gây bệnh đường ruột. Tuy nhiên, những axit hữu cơ bay hơi được sản sinh bởi hệ vi sinh vật yếm khí bình thường trong đường ruột có khả năng ức chế sự phát triển của Salmonella. Hệ vi sinh vật hiếu khí bình thường cũng có thể ngăn cản việc tiếp xúc với các vị trí bám gắn cần cho loài Salmonella. Sự rối loạn của hệ vi sinh vật do các yếu tố như: Dùng kháng sinh, khẩu phần ăn, mất nước làm tăng khả năng mẫn cảm của vật chủ với sự nhiễm trùng. Nhu động ruột giảm, stress do vận chuyển và chật chội cũng tạo điều kiện cho sự xâm nhập đường ruột của Salmonella. Mầm bệnh sau khi nhiễm vào đường tiêu hoá, nhanh chóng đi vào hệ lâm ba của ruột gây viêm sưng hạch, từ đó vào hệ tuần hoàn, gây bại huyết, làm cho lá lách sưng to, lúc đầu do tụ máu, về sau do tăng sinh, sản sinh nội độc tố, gây viêm hoại tử gan và hạch. Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn có 2 dạng chủ yếu: Thể nhiễm trùng huyết do S. choleraesuis var kunzendorf gây ra và thể viêm ruột do S. typhimurium. 2.3.2 Thể nhiễm trùng huyết do S. choleraesuis var kunzendorf gây ra Bệnh Phó thương hàn lợn thể nhiễm trùng máu xảy ra chủ yếu ở lợn sau cai sữa do S. choleraesuis var Kunzendorf gây nên (Laval, 2000[16]). Lợn bệnh bỏ ăn, ủ rũ, thích nằm tập trung lại với nhau ở góc chuồng tối hay chui vào ổ rơm, thân nhiệt tăng cao 40,5 – 41,6oC. Mí mắt sưng mọng có nốt tím bầm, viêm kết mạc. Khi bị biến chứng, gây viêm phổi, ho khan, có dịch đờm. Xuất huyết lấm tấm dưới da, tụ lại thành những vết đỏ thẫm trên da bụng và tai. Sau 3 – 4 ngày bị mắc bệnh, lợn ỉa chảy có màu vàng. Tác động lâm sàng của bệnh Phó thương hàn thể nhiễm trùng máu rất nghiêm trọng và gây chết. Trong các ổ dịch, tỷ lệ lợn bệnh chết ở mức cao, tỷ lệ những con ốm không cố định, thường dưới 10% tổng đàn (Wilcock, 1995)[81]. Ở thể á cấp tính, hiện tượng ỉa chảy xuất hiện sau 2 – 3 ngày, rồi kéo dài cho đến khi lợn chết hoặc khỏi bệnh. Phân bài xuất nhiều lần trong ngày, sau đó phân chảy ra liên tục, phân có màu vàng, vàng xám, vàng nâu ở lợn con, còn ở lợn trưởng thành phân nhão, phân nước có lẫn máu. Lợn gầy sút nhanh (Laval, 2000[16]). Trên da lợn trưởng thành mắc bệnh cũng xuất hiện các mảng da bị đỏ, hoặc tím bầm ở vùng bụng, tai, bẹn,… sau đó xuất hiện chứng viêm phổi, lợn ho, thở dốc. Những lợn như vậy thường bị chết do chứng viêm phổi thứ phát 15 ngày sau khi bị bệnh. Tỷ lệ lợn chết ở lợn bị bệnh thể á cấp tính khoảng 40 – 45%. Lợn bị bệnh thường mang trùng và đều đặn thải mầm bệnh ra ngoài theo phân, nhưng khó phát hiện một cách chính xác (Laval, 2000[16]). * Bệnh tích đại thể: Khi mổ khám lợn bệnh, những bệnh tích đại thể quan sát được bao gồm: Các vết tím xanh ở rìa tai, trên bề mặt da bụng, bẹn, chân và đuôi; xuất huyết lấm tấm dưới da; hạch màng treo ruột, lách và hạch bạch huyết xưng phồng lên, các thuỳ lách cứng lại. Trên bề mặt gan có điểm hoại tử nhỏ màu hơi trắng. Xuất hiện những đám hoại tử màu hồng như trứng gà tây ở thận và phổi viêm (Trương Văn Dung và Yoshihara Shinobu, 2002[9]). * Bệnh tích vi thể: Lưới nội mô và hạch bạch huyết tăng trưởng; hoại tử điểm trắng ở gan; xuất huyết và hoại tử ở hạch bạch huyết của màng treo ruột, màng phổi, màng bụng, màng bao tim, thận và màng não lấm tấm xuất huyết (Trương Văn Dung và Yoshihara Shinobu, 2002[9]). Theo Wilcock (1995)[81], dấu hiệu biến đổi bệnh tích vi thể là do Salmonella gây ra là ở hạch lympho màng treo ruột: Sưng, xung huyết, xuất huyết và có điểm hoại tử màu xám, trên bề mặt gan thấy xuất hiện điểm hoại tử mô bào. Những biến đổi bệnh tích vi thể ở lợn do Salmonella gây ra là không hề trùng lặp với bất cứ bệnh nào khác ở lợn. * Chẩn đoán: Chẩn đoán bệnh Phó thương hàn thể nhiễm trùng máu do S. choleraesuis var Kunzendorf gây nên không thể chỉ dựa trên các triệu chứng lâm sàng đơn lẻ, vì các triệu chứng lâm sàng của bệnh giống như nhiều triệu chứng nhiễm trùng khác ở lợn như bệnh nhiễm trùng do Streptoccocus, bệnh Đóng dấu lợn… 2.3.3 Thể viêm ruột do S. typhimurium Bệnh Phó thương hàn thể viêm ruột thường do các serotyp S. typhimurium gây ra ở lợn con từ sau cai sữa đến khoảng 4 – 6 tháng tuổi. Các thể bệnh hay gặp là cấp tính hoặc mãn tính (Laval, 2000[16]). * Triệu chứng: Thời kỳ nung bệnh thường từ 3 – 4 ngày. Một trong những triệu chứng đầu tiên là ỉa chảy, phân dạng nước màu vàng, lẫn máu và chất nhầy. Lợn ốm bỏ ăn, thường uống nhiều nước. Đợt sốt đầu tiên kéo dài chừng một tuần, tiếp theo một thời kỳ không sốt mấy ngày, rồi lại tiếp tục sốt. Ở một số lợn ốm thấy bị viêm khớp, chân bị què, đứng không vững, đi xiêu vẹo. Ngoài triệu chứng tiêu chảy, lợn ốm còn bị viêm phổi, lợn ho, thở gấp, nước mũi chảy nhiều. Hầu hết lợn bệnh bình phục nếu được điều trị kịp thời, nhưng chủ yếu chuyển sang thể mãn tính kéo dài vài tháng. Tỷ lệ lợn chết dao động từ 40% – 50%. Số con còn sống sót chậm lớn, còi cọc. Những lợn khỏi bệnh thường mang trùng và thải mầm bệnh ra ngoài môi trường (Laval, 2000[16]). * Bệnh tích đại thể Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2004)[17], bệnh tích thường thấy ở ruột, nhất là ruột già. Trong thể cấp tính, niêm mạc ruột thấm máu tràn lan, khi cắt ra trông giống như mỡ và có thể có màng giống như sợi huyết phủ ở trên, lách sưng to và dai như cao su. Trong thể mãn tính, bệnh tích đặc biệt là thối loét ở niêm mạc ruột. Những mụn loét to hay nhỏ, màu vàng xanh hoặc xám, chứa đầy một thứ bã đậu, xung quanh có bờ đỏ và nhẵn. Van hồi manh tràng bị loét cúc áo, có phủ một lớp màng (Trương Văn Dung và Yoshihara Shinobu, 2002[9]). * Bệnh tích vi thể: Sự hoại tử nông hay sâu trên bề mặt của lớp tế bào biểu mô ruột là những bệnh lý vi thể đặc trưng của thể viêm ruột; có trường hợp thấy nổi gồ lên khỏi niêm mạc xung huyết của ruột những hạt tròn như hạt đậu màu trắng vàng. Phần đầu lông nhung trong hồi tràng bị teo ngắn lại. Đa số trường hợp thấy mảng payer bị loét dưới đáy như phủ một lớp tổ chức hoại tử màu vàng trắng, niêm mạc dạ dày có điểm chảy máu rải rác, có một số loét nhỏ tập trung ở bờ cong nhỏ. Gan xung huyết, trên bề mặt gan có thể thấy những nốt u nhỏ (áp xe) mang tính đặc trưng cho thể bệnh không giống với điểm hoại tử trong thể nhiễm trùng huyết (Phạm Sỹ Lăng và cs, (2004)[17]). * Chẩn đoán: + Chẩn đoán lâm sàng: Ở thể viêm ruột của bệnh Phó thương hàn, căn cứ vào các triệu chứng điển hình như viêm ruột và dạ dày ở lợn con từ sau cai sữa đến 4 tháng tuổi. Đồng thời, dựa vào kết quả nuôi cấy, phân lập vi khuẩn trên môi trường pepton và kiểm tra di động trên môi trường thạch và xét nghiệm huyết thanh học. + Chẩn đoán phân biệt với bệnh hồng lỵ; Chứng viêm ruột do Campylobacter (PHE); Viêm ruột hoại tử; bệnh viêm dạ dày ruột (Transmission Gasto Enteritis- TGE); tiêu chảy ở lợn do E. coli. Một số tác nhân gây tiêu chảy do vi rút như Rotavirus và Coronavirus gây viêm ruột, bệnh dịch tả lợn, các loại ký sinh trùng như cầu trùng Coccidia… - Ở bệnh Phó thương hàn, thân nhiệt lợn ốm vẫn giữ cao (41 – 42oC) trong suốt thời gian lợn bị ỉa chảy, điều đó hoàn toàn khác với bệnh hồng lỵ. Hiện tượng tím tái nhiều khu vực trên da lợn bị bệnh Phó thương hàn cũng khác với lợn bị bệnh hồng lỵ. Ở lợn bị bệnh hồng lỵ, phân có màu xám, xám-đen, đen, đen nâu, hiện tượng này không có ở lợn bị bệnh Phó thương hàn. Lách ở lợn bị bệnh hồng lỵ không bị sưng và không có những biến đổi đặc trưng. Màng niêm mạc ruột ở lợn bị bệnh hồng lỵ thường phủ một lớp biểu bì hoại tử, hiện tượng này không có ở lợn bị bệnh Phó thương hàn. Để có thể phân biệt rõ các loại bệnh này thường phải tiến hành các xét nghiệm kiểm tra vi khuẩn trong phòng thí nghiệm. - Ở bệnh viêm ruột do Campylobacter (PHE) thể cấp tính có thể thấy xuất huyết ruột hay tiêu chảy cấp tính hoặc mãn tính, tổn thương thường lan tràn, làm mất đi những bệnh tích nhỏ, lớp niêm mạc nằm dưới các ổ hoại tử có dấu hiệu tăng sinh rất rõ. Để tránh nhầm lẫn, cần xét nghiệm, phân lập vi khuẩn. - Đối với bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn C. perfringens, bệnh xuất hiện trong vòng một vài ngày đầu của lợn sơ sinh, lợn bệnh không sốt. Hiện tượng tiêu chảy làm cho niêm mạc hậu môn bị tổn thương, có màu đỏ. Lợn bệnh chết nhanh. Giải phẫu ruột thấy có phủ một lớp hoại tử màu vàng hoặc những khối hơi sáng, dễ nát, dính chặt vào niêm mạc ruột. Nhung mao của không tràng và tiểu nang là nơi xét nghiệm thấy trực khuẩn Gram (+) (Trương Văn Dung và Yoshihara Shinobu, 2002[9]). - Bệnh viêm dạ dày ruột (TGE) thường mắc và tỷ lệ chết cao ở lợn dưới 2 tuần tuổi. Khi mổ khám, thấy dạ dày sưng to với các cục sữa vón, ruột non sưng to với bọt khí màu vàng và hình thành các cục sữa do không tiêu hoá được, thành ruột mỏng, gần như trong suốt. Các lông nhung của không tràng và hồi tràng bị teo đi. - Chẩn đoán phân biệt bệnh do Salmonella gây ra ở lợn với các bệnh do E. coli và bệnh dịch tả lợn có ý nghĩa rất quan trọng trong thực tiễn. - Lợn bị tiêu chảy do vi khuẩn E. coli gây ra ở lứa tuổi sau cai sữa (4- 9 tuần tuổi) cũng khá phổ biến, lợn có biểu hiện phù mắt, phù đầu nên còn gọi là bệnh phù đầu lợn con. Mổ khám bệnh tích thấy tụ máu trong ruột non, có thể nhìn thấy chất chứa trong ruột non vì thành ruột mỏng và lông nhung không bị phá huỷ. Ở bệnh do Salmonella, lợn tím vành tai, da bụng và vùng bẹn. Các biến đổi bệnh lý ở ruột có tính đặc trưng như mô tả về phần bệnh tích đại thể và vi thể của bệnh do Salmonella. - Bệnh dịch tả lợn xảy ra và lây lan nhanh ở tất cả các lứa tuổi lợn. Hiện tượng ỉa chảy ở lợn bị bệnh dịch tả lợn xuất hiện khi nhiệt độ cơ thể giảm, khi sốt cao lợn lại táo bón; còn ở bệnh Phó thương hàn lợn bị ỉa chảy khi thân nhiệt sốt cao 2 – 3 ngày. Mổ khám bệnh tích lợn bị bệnh dịch tả thấy xuất huyết ở khắp các hệ thống cơ quan như hạch lympho, thận, bàng quang và da, nhồi huyết ở lách, hạch lympho có màu đá hoa cương, viêm loét hình cúc áo trên niêm mạc bị viêm. Điều trị bằng kháng sinh, lợn không khỏi bệnh, trong khi dùng kháng sinh điều trị bệnh Phó thương hàn có tỷ lệ khỏi cao. 2.4 Biện pháp phòng trị bệnh do Salmonella gây ra ở lợn 2.4.1 Phòng bệnh Phòng bệnh Phó thương hàn cho lợn, nhất là ở những nơi chăn nuôi lợn tập trung quy mô lớn và chăn nuôi lợn nái có nhiều lợn con là một việc quan trọng, vì đặc điểm dịch tễ của căn bệnh là vi khuẩn Samonella không dễ dàng khống chế và yêu cầu của quá trình phòng bệnh là phải thực hiện được triệt để các nội dung như tiêm phòng vacxin, vệ sinh khử trùng tiêu độc, quản lý chăn nuôi, sử dụng chế phẩm sinh hoá học… 2.4.2 Điều trị bệnh Hiệu quả chữa bệnh phụ thuộc rất nhiều vào các biện pháp phòng bệnh tổng hợp như vệ sinh thú y, chăm sóc, nuôi dưỡng, đồng thời phải chẩn đoán bệnh kịp thời thì mới nâng cao hiệu quả chữa bệnh. - Sử dụng kháng huyết thanh Phó thương hàn Kháng huyết thanh phó thương hàn được chế bằng cách: Gây tối miễn dịch cho bò đực thiến bằng canh trùng vi khuẩn S. choleraesuis chứa độc tố được vô hoạt bằng formol. Tiêm bắp 30 – 60ml cho lợn dưới 45 ngày tuổi; 50 - 80ml cho lợn 45 ngày tuổi trở lên. - Điều trị bằng kháng sinh Cho đến nay, việc dùng kháng sinh chữa bệnh Phó thương hàn cần chú ý loại trừ các loại kháng sinh đã bị vi khuẩn kháng được nhiều tác giả thông báo như Streptomycin, Ampicillin,… Cũng phải loại trừ các kháng sinh vi khuẩn mẫn cảm nhưng đã bị cấm sử dụng như Chloramphenicol, Furazolidon,… Có nhiều loại kháng sinh mà các công ty, xí nghiệp thuốc thú y trong và ngoài nước sản xuất dùng cho điều trị bệnh Phó thương hàn. Khi sử dụng theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Tốt nhất là làm kháng sinh đồ trên môi trường thạch đĩa để đánh giá và chọn loại kháng sinh điều trị có hiệu quả nhất. 2.5 Một số hiểu biết về vacxin và vacxin phòng bệnh Phó thương hàn Vacxin cổ điển hay vacxin thế hệ mới đều là một chế phẩm sinh học của vi sinh vật hay tế bào, chứa chính tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng (kể cả vật liệu di truyền như ADN hay ARN của chúng), nếu được làm giảm độc lực hay vô độc bằng các phương pháp lý, hóa hay sinh học (đối với vacxin cổ điển) hoặc các phương pháp sinh học phân tử (đối với vacxin thế hệ mới), lúc đó chúng không còn khả năng gây bệnh đối với đối tượng được hưởng vacxin (là người và động vật), nhưng khi đưa vào cơ thể bằng các phương pháp khác nhau, đều có khả năng kích thích cơ thể sinh miễn dịch thuộc các loại hình như miễn dịch dịch thể (humoral immunity) hay miễn dịch qua trung gian tế bào (cellular- mediated immunity). Khi cơ thể đã tiếp nhận vacxin, miễn dịch được tạo ra chính là sự huy động toàn bộ hệ thống miễn dịch tham gia, bao gồm hệ thống miễn dịch trung ương và hệ thống miễn dịch ngoại biên cũng như sự tham gia của nhiều loại tế bào có thẩm quyền miễn dịch khác. Cơ thể chịu sự kích thích của kháng nguyên (do vacxin đưa đến) đã sản xuất một loại protein mới có chức năng bảo vệ và là thành phẩm tham gia tạo nên miễn dịch cho cơ thể gọi là kháng thể (antibody). Với một cơ thể đã được miễn dịch, khi vi sinh vật gây bệnh xâm nhập vào, chúng sẽ không thực hiện được quá trình gây bệnh và nhanh chóng bị loại trừ ra khỏi cơ thể. Điều kiện cần của một vacxin: một vacxin phải có đủ 3 điều kiện chính: An toàn, vô trùng và có hiệu lực. An toàn là tiêu chuẩn đánh giá khi sử dụng vacxin trên chính đối tượng được hưởng, tức là vacxin không được gây bệnh và không hay ít gây phản ứng có hại. Vô trùng tức là vacxin chỉ chứa duy nhất một hay một vài loại được chọn làm vacxin mà không bị nhiễm tạp các loại khác. Hiệu lực điều quan trọng nhất là vacxin phải có hiệu lực, tức là vacxin phải kích thích sinh miện dịch cho cơ thể. Tính hiệu lực thực chất là mức độ biểu hiện gây miễn dịch của kháng nguyên. Vacxin có hiệu lực cao hay thấp tức là mức độ gây miễn dịch của vacxin đó. Vacxin Phó thương hàn lợn cũng nằm trong cơ chế này. Bệnh Phó thương hàn do vi khuẩn Samonella gây ra ở lợn đã được biết đến từ những năm đầu của thế kỷ XX. Do đó, cùng với quá trình nghiên cứu chi tiết về vi khuẩn, các biện pháp phòng bệnh đã được nhiều nhà khoa học ở nhiều nước trên thế giới quan tâm nghiên cứu, trong đó có vacxin phòng bệnh. Hiện nay đã có nhiều loại vacxin để phòng bệnh Phó thương hàn như vacxin nhược độc chủng TS – 177 và vacxin nhược độc có bổ trợ như vacxin keo phèn hay vacxin nhũ hoá có bổ trợ dầu. Vacxin chống một số chủng phổ biến là S. typhimurium, S. dublin, S. choleraesuis,… Ưu điểm của vacxin nhược độc: Vacxin có hiệu quả cao có khả năng kích thích sinh miễn dịch cục bộ trong ruột nên có khuynh hướng làm giảm sự xâm nhiễm của Salmonella qua ruột. Vacxin tạo đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào nên bảo hộ được vật nuôi chống lại Salmonella xâm nhiễm đại thực bào. Nhưng cũng có những hạn chế của vacxin nhược độc: Không ổn định về mặt di truyền; khó kiểm soát được ảnh hưởng của chủng vacxin nhược độc với môi trường và các động vật khác. Ưu điểm của vacxin vô hoạt: là an toàn với môi trường, động vật và con người, nhưng cũng có hạn chế là vacxin không có khả năng tăng sinh tế bào T gây độc và không bảo hộ gia súc hiệu quả từ sự xâm nhiễm Salmonella ở niêm mạc ruột như vacxin nhược độc. Xu hướng nghiên cứu vacxin phòng Salmonella trên thế giới và ở Việt Nam là sản xuất vacxin theo con đường tái tổ hợp gen. Ưu điểm của vacxin này là: Thành phần protein tinh khiết; an toàn vì thành phần vacxin chỉ là protein kháng nguyên tinh chế; có thể phối hợp các kháng nguyên để tạo thành vacxin đa giá, nhưng cũng có những nhược điểm như: Chủng sản xuất vacxin bị lọt ra ngoài và chuyển tính trạng kháng kháng sinh cho vi khuẩn ngoài môi trường; không có khả năng kích hoạt tế bào T gây độc nên đáp ứng miễn dịch kém; ít có hiệu quả khi có biến chủng xảy ra. Ở nước ta, để phòng bệnh Phó thương hàn, các loại vacxin đã được một số công ty, xí nghiệp thuốc thú y sản xuất và sử dụng phổ biến hiện nay như sau: + Vacxin Phó thương hàn heo do công ty (NAVETCO) sản xuất, là vacxin vô hoạt chế từ vi khuẩn S. choleraesuis chủng Kunzendorf. 1 ml vacxin chứa 1010 tế bào vi khuẩn, chất bổ trợ là keo phèn. Tiêm dưới da hoặc bắp thịt cho heo con 2 lần: lần 1 (heo từ 20 – 30 ngày tuổi) liều 1 ml/con; lần 2 cách lần một sau 3 tuần, liều tiêm như lần 1. + Vacxin Phó thương hàn lợn do Xí nghiệp thuốc thú y TW sản xuất, dạng nước, chế tạo từ toàn bộ canh trùng (giải độc tố và tế bào) của S. choleraesuis kháng nguyên typ O: 6,7; H: 1,5 vô hoạt bằng formalin, bổ trợ keo phèn. Tiêm dưới da cho lợn con từ 20 ngày tuổi 2 lần, cách nhau 7 – 15 ngày; lợn sau cai sữa 5 ml/con/lần. Có thể tiêm vacxin 2 – 3 lần cho lợn mẹ ở thời kỳ tháng đầu có chửa để phòng bệnh cho lợn con ngay sau khi đẻ qua sữa mẹ. - Vacxin Phó thương hàn nhược độc đông khô, được chế tạo từ vi khuẩn nhược độc S. choleraesuis typ O: 6,7; H: 1,5 qua tổ chức FAO, vacxin được chế ở dạng đông khô. Mỗi liều vacxin có chứa 2 – 2,5 tỷ vi khuẩn. Vacxin gây miễn dịch nhanh và mạnh. Sau khi tiêm 9 – 10 ngày bắt đầu có miễn dịch vững chắc. Vacxin được pha với nước sinh lý hoặc nước cất vô trùng, mỗi liều pha ra 1 ml, tiêm dưới da hay bắp thịt cho lợn con từ 25 ngày tuổi trở lên, kể cả lợn mẹ có thai ở nửa thời kỳ đầu. Liều miễn dịch là 1 ml đồng đều cho các loại lợn. + Vacxin tam liên do phân viện Thú y Miền Trung sản xuất: Phòng 3 bệnh: Phó thương hàn, dịch tả, tụ huyết trùng lợn; vacxin dạng đông khô, tiêm dưới da cho lợn từ 20 ngày tuổi trở lên; liều 2 ml/con/lần, nhắc lại liều trên sau một tuần. Đây là loại vacxin có ý nghĩa sử dụng trong thực tiễn cao. Trên đây là các lọai vacxin để phòng bệnh Phó thương hàn đã và đang được sử dụng trong cả nước. Mục đích của chúng tôi trong nghiên cứu này là đưa ra một loại vacxin có chứa những serotyp thường gặp nhất từ những trường hợp nhiễm bệnh Salmonella lâm sàng ở lợn. 3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu 3.1.1 Phân lập vi khuẩn Salmonella từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy nuôi tại một số tỉnh phía Bắc và xác định tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella ở các cơ quan phủ tạng của lợn bệnh. 3.1.2 Xác định một số đặc tính sinh vật hóa học, serotyp và xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được. 3.1.3 Xác định một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập được bằng phản ứng PCR: khả năng sản sinh độc tố, khả năng xâm nhập và khả năng kháng kháng sinh 3.1.4 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập được trên chuột bạch và gây bệnh thực nghiệm trên lợn 3.1.5 Xác định hiệu lực phòng bệnh của vacxin được chế tạo từ vi khuẩn Salmonella phân lập được trên động vật thí nghiệm. 3.2 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Lợn con sau cai sữa nuôi tại các trại chăn nuôi ở Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh, Hải Phòng và Thái Bình. - Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Vi trùng Viện Thú y. - Thời gian thực hiện: Từ tháng 12 năm 2008 đến tháng 8 năm 2009 3.3 Nguyên liệu dùng cho nghiên cứu 3.3.1 Mẫu thí nghiệm Mẫu thí nghiệm là phân và phủ tạng (gan, lách, hạch màng treo ruột, chất chứa ruột và máu tim) của lợn (4-9 tuần tuổi) ốm và chết bị tiêu chảy có các triệu chứng của bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra được nuôi tại các trại chăn nuôi tại Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh, Hải Phòng và Thái Bình. 3.3.2 Động vật thí nghiệm - Chuột nhắt trắng khỏe mạnh, có trọng lượng trung bình 18-20 g/con - Lợn sau cai sữa 35 ngày tuổi khỏe mạnh, chưa được tiêm vacxin Phó thương hàn. 3.3.3 Các loại môi trường, hóa chất * Các loại môi trường Môi trường sử dụng trong nghiên cứu là những loại môi trường (của các hãng: Eiken, Oxoid, Biorad,...) ở dạng tổng hợp, khi dùng pha theo công thức có sẵn bao gồm: - Môi trường BPW, RV, Mac Conkey, Môi trường thạch CHROMTM Salmonella và thạch DHL dùng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella - Môi trường TSI, LIM và môi trường Malonate dùng để giám định vi khuẩn Salmonella - Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) dùng để định typ và giữ giống vi khuẩn * Các loại hóa chất - Các loại đường: Glucoza, Mantol, Lactoza, Sorbitol, Dextroze, Sucroze, Galactoze, Manitol, Arabinoze - Thuốc nhuộm Gram, dung dịch Kovac’s, dung dịch Andrader - Giấy tẩm kháng sinh (do hãng Oxoid của Anh sản xuất) 3.3.4 Các loại kháng huyết thanh chuẩn để định typ vi khuẩn Salmonella Kháng huyết thanh chuẩn (do hãng Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Nhật Bản sản xuất) dùng để định type kháng nguyên O và H của vi khuẩn Salmonella 3.3.5 Các loại hóa chất, Primer và chủng vi khuẩn dùng cho phản ứng PCR - Gồm Primer, Taq-DNA polymerase, dNTPs, đệm phản ứng, đệm điện di TAE (Tris-Acetic-EDTA), nhuộm điện di (Gel loading buffer), nhuộm DNA (Ethidium Bromide). - Các chủng vi khuẩn dùng làm đối chứng dương gồm: S. choleraesuis, S. typhimurium, S. enteritidis do Viện Thú y Nhật Bản cung cấp. 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Phương pháp lấy mẫu - Đối với mẫu phân: Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng của các lợn từ 4- 9 tuần tuổi có triệu chứng tiêu chảy, phân có màu vàng, lẫn chất nhầy, có mùi thối đặc biệt, rồi cho vào các typ vô trùng, bảo quản lạnh 4oC và vận chuyển về phòng thí nghiệm. - Đối với những lợn sau cai sữa bị ốm hoặc chết có các triệu chứng: ỉa chảy phân có mùi thối đặc biệt, vùng da bụng, quanh tai và bẹn có những đốm đỏ hoặc tím bầm, tiến hành mổ khám tại chỗ, rồi lấy các bệnh phẩm như: gan, lách, hạch ruột, chất chứa ruột non vào các túi nilon riêng rẽ, máu tim được hút vào sơranh, bảo quản ở 4oC và vận chuyển về phòng thí nghiệm. 3.4.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella spp Được tiến hành dựa trên cơ sở quy trình phân lập và giám định vi khuẩn của Khoa Thú y ứng dụng và Thú y cộng đồng, trường Đại học Nông Nghiệp và Thú y Obihiro, Nhật Bản, với một số cải tiến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam. Sơ đồ 3.1 trình bày tóm tắt quy trình phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella từ các mẫu bệnh phẩm. Bệnh phẩm (Phân, máu tim, gan, lách, hạch ruột, dịch ruột) BPW (370C/ 18- 24 h) LIM (370C/ 20- 24 h) Malonate (370._.Phổi Viêm, đỏ lấm tấm, phù, tích nước 12 8 66,66 Dạ dày Niêm mạc viêm đỏ, xuất huyết 12 12 100,0 Ruột non Căng, xuất huyết, niêm mạc sưng. 12 12 100,0 Ruột già Van hồi manh tràng có nốt loét, niêm mạc sưng, xuất huyết. 12 4 33,33 Hạch lâm ba Sưng to, đỏ xuất huyết 12 12 100,0 Gan Sưng, tím sẫm có hoại tử màu trắng 12 8 66,66 Mật Túi mật căng 12 12 100,0 Lách Sưng to, sẫm màu, dai. 12 12 100,0 Thận Sưng, xuất huyết lấm tấm 12 10 83,33 Qua bảng 4.11 chúng tôi thấy: 12/12 lợn mổ khám đều có lá lách sưng to, phần giữa sưng to hơn, dai như cao su, màu xanh thẫm, cắt ra có màu tím, thấy rõ nang lâm ba sưng to. Hạch lâm ba sưng, mềm, đỏ, thường đỏ thẫm từ chu vi lan vào giữa. Thận có điểm xuất huyết đỏ ở vỏ. Gan tụ máu, có nốt hoại tử bằng hạt kê. Niêm mạc dạ dầy và ruột viêm đỏ, có điểm xuât huyết, có khi có nốt loét đỏ bằng hạt đậu. Phổi tụ máu, có các ổ viêm mới. Những bệnh tích trên được quan sát ở tất cả các lợn gây bệnh, tuy mức độ có khác nhau ở từng cá thể và những bệnh tích này cũng gần như trùng hợp với những mô tả của các tác giả trong và ngoài nước như: Nguyễn Vĩnh Phước và cs (1970)[22], Wilcock và Schwartz (1992)[80]. Từ kết quả gây bệnh ở trên cho thấy: Tất cả 6 chủng vi khuẩn S. choleraesuis, S. typhimurium, S. enteritidis được chọn để gây bệnh đều có độc lực rất cao và đều có khả năng gây bệnh đối với lợn. Vacxin là một chế phẩm sinh học có chứa tác nhân gây bệnh hoặc sản phẩm của nó nhưng đã được vô hoạt bằng formol, cũng có thể giảm độc lực bằng các phương pháp lý, hoá, sinh học nên không còn khả năng gây bệnh, nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên. Khi đưa vacxin vào cơ thể thì có khả năng kích thích cơ thể thực hiện đáp ứng miễn dịch, hình thành kháng thể chủ động, giúp cho cơ thể con vật chống lại các tác nhân gây bệnh hay sản phẩm độc của chúng khi xâm nhập vào lần sau. Ngày nay, biện pháp phòng bệnh bằng vacxin có thể coi là biện pháp khả thi nhất để khống chế các bệnh, trong đó có bệnh do Salmonella gây ra. Tuy nhiên, trong quá trình sử dụng vacxin Phó thương hàn của các công ty, xí nghiệp thuốc Thú y sản xuất, chúng tôi thấy, hầu hết các vacxin Phó thương hàn hiện nay chỉ sử dụng duy nhất 1 loại kháng nguyên S. choleraesuis, do đó có khả năng chỉ phòng được bệnh Phó thương hàn thể do serotyp này gây ra ở lợn. Mục tiêu của chúng tôi trong nghiên cứu này là chế tạo 1 loại vacxin đa giá có chứa một số các serotyp thường gặp nhất từ những trường hợp nhiễm bệnh Salmonella ở lợn ở một số tỉnh phía Bắc. Căn cứ vào kết quả phân lập, kết quả giám định các đặc tính sinh vật hóa học, kết quả xác định các yếu tố gây bệnh và gây bệnh thực nghiệm trên bản động vật, chúng tôi đã chọn 3 chủng Salmonella, gồm 1 chủng S. choleraesuis, 1 chủng S. typhimurium và 1 chủng S. enteritidis phân lập từ lợn mắc bệnh có độc lực cao, có cấu trúc kháng nguyên ổn định và mang một số yếu tố gây bệnh để sản xuất thử nghiệm vacxin phòng bệnh Salmonella cho lợn. Theo Laval (2000)[16] tiêu chí để chọn một vacxin tốt phòng bệnh cho động vật cần phải đạt các yêu cầu sau đây: - Không được gây phản ứng toàn thân; Có thể gây phản ứng cục bộ, nhưng những biểu hiện của phản ứng cục bộ phải biến mất trong vòng 24 giờ sau khi tiêm phòng. - Ngăn cản hoặc làm giảm sự nhân lên của bệnh nguyên khi sơ nhiễm. - Ngăn không cho xảy ra bệnh hoặc làm giảm cường độ của nó sau khi nhiễm. - Hiệu lực phòng bệnh cao và kéo dài. - Sử dụng và bảo quản dễ dàng, giá thành rẻ. Chúng tôi đã chế tạo vacxin dạng vô hoạt có bổ trợ keo phèn theo quy trình thường quy của Bộ môn Vi trùng - Viện thú y. Các chủng vi khuẩn S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis được nuôi cấy riêng rẽ theo 3 lô khác nhau bằng phương pháp lên men, sục khí. Sau 8 - 10 giờ lên men, sục khí, lấy mẫu kiểm tra thuần khiết bằng nhuộm Gram và kiểm tra đậm độ vi khuẩn trong 1 ml canh trùng bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, sau đó tiến hành vô hoạt vi khuẩn bằng Formol với nồng độ 0,5%. Kết quả được trình bày ở bảng 4.12 Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu các lô vacxin Lô vacxin Chỉ tiêu kiểm tra Đậm độ (109 vk/ml) Thuần khiết Vô trùng S. choleraesuis 19 Đạt Đạt S. typhimurium 22 Đạt Đạt S. enteritidis 16 Đạt Đạt Kết quả cho thấy: - Đậm độ vi khuẩn của lô S. choleraesuis đạt khoảng 19x109 vi khuẩn/ml canh trùng, lô S. typhimurium là 22x109 vi khuẩn/ml canh trùng, còn lô canh trùng S. enteritidis là 16x109 vi khuẩn/ml. Với số lượng vi khuẩn yêu cầu trong 1 ml canh trùng để chế tạo vacxin phải đạt tối thiểu 1,5x109 vi khuẩn thì các lô canh trùng nuôi cấy đều đủ tiêu chuẩn chế vacxin. - Cả 3 lô canh trùng đều đạt chỉ tiêu thuần khiết và canh trùng sau khi diệt Formol 0,5% đều đạt chỉ tiêu vô trùng khi kiểm tra trên các loại môi trường: Thạch máu, thạch nấm, nước thịt thường, nước thịt yếm khí,… Từ kết quả kiểm tra này cho thấy, cả 3 lô canh trùng đều đạt các chỉ tiêu cần thiết để có thể sử dụng làm vacxin. 4.8.2 Kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực vacxin trên chuột thí nghiệm. Sau khi đã kiểm tra canh trùng của các chủng vi khuẩn S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis đều đạt các tiêu chuẩn dùng làm vacxin, tiến hành trộn lẫn các lô canh trùng với nhau theo tỷ lệ 1:1:1 để đạt được một loại canh trùng đồng nhất, điều chỉnh nồng độ của canh trùng, rôi bổ sung keo phèn với tỷ lệ 1/5 để đảm bảo 1ml vacxin có chứa 4 – 5x109 vi khuẩn. Vacxin được ra chai (20 ml/chai), đóng nút, gắn paraffin, dán nhãn, sau đó tiến hành lấy mẫu để kiểm tra an toàn và hiệu lực trên động vật thí nghiệm. - Kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng: Chọn 10 chuột khỏe mạnh, tiêm vacxin với liều 0,5 ml/con vào phúc xoang và 5 chuột được tiêm 0,2 ml/con nước trong ở phía trên lọ vacxin vào tĩnh mạch đuôi. Theo dõi sau 7 ngày cho thấy tất cả chuột được tiêm vacxin đều sống khỏe mạnh, không con nào có biểu hiện phản ứng sau khi tiêm. Điều này đã khẳng định rằng vacxin đã đạt yêu cầu về độ an toàn trên động vật thí nghiệm và có thể tiến hành kiểm tra hiệu lực của vacxin trên động vật thí nghiệm. - Kiểm tra hiệu lực bảo hộ của vacxin trên chuột nhắt trắng: Chọn 10 chuột khỏe mạnh, mỗi chuột tiêm 0,2 ml vacxin vào dưới da và 5 chuột đối chứng không tiêm vacxin. Sau 21 ngày, tiến hành thử thách với hỗn hợp canh trùng S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis với liều 10LD50 tương ứng với liều 0,5ml/con cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột đối chứng. Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.13. Bảng 4.13 Kết quả thử hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng Lô vacxin Số chuột tiêm (con) Liều tiêm vacxin (ml) Liều công (ml) Thời gian theo dõi Số chuột chết (con) Số chuột sống Tỷ lệ bảo hộ (%) TN 10 0,2 0,5 7 ngày 0 10 100 Đ/C 5 0 0,5 24-48 giờ 5 0 0 Kết quả cho thấy: Ở lô thí nghiệm, chuột được tiêm vacxin với liều 0,2 ml/con, sau 21 ngày, chuột có miễn dịch nên đều sống khỏe mạnh khi thử thách cường độc với hỗn hợp canh trùng S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis tương ứng với chủng sản xuất vacxin và được đánh giá là 100% số chuột được bảo hộ. Trong khi đó, cả 5 chuột ở lô đối chứng không được tiêm vacxin, sau khi công cường độc với liều tương tự đều bị chết trong vòng 24 giờ (tỷ lệ chết 100%) và đều phân lập lại được vi khuẩn Salmonella từ máu tim. Tổng hợp các kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực bảo hộ của vacxin trên chuột bạch của lô vacxin chế thử, so sánh với tiêu chuẩn của Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc và vacxin Quốc gia về kiểm nghiệm vacxin chết có bổ trợ keo phèn, cho phép đánh giá: Lô vacxin đạt chỉ tiêu an toàn 100% và có hiệu lực bảo hộ cao trên chuột bạch (100%), đủ tiêu chuẩn để tiến hành kiểm tra các bước tiếp theo để đánh giá hiệu quả sử dụng của vacxin trên bản động vật. 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 1. Tỷ lệ trung bình phân lập được vi khuẩn Salmonella từ các mẫu phân và bệnh phẩm thu thập từ 5 địa phương khác nhau là 54,73%. 2. Tỷ lệ phân lập được Salmonella cao nhất ở hạch màng treo ruột (52,94%), chất chứa ruột non (50,00%) sau đó là lách (41,18%), gan (32,35%), và thấp nhất là máu tim (23,53%). 3. Các chủng Salmonella phân lập được mang đầy đủ các đặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella như các tài liệu trong và ngoài nước đã mô tả. 4. Kết quả xác định serotyp cho thấy: 12,31% là S. choleraesuis, 38,46% là S. typhimurium, 24,62% là S. enteritidis, 9,23% là S. derby, 6,15% là S. rissen, 1,54% là S. anatum, 7,69% là S. stanley. 5. Các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được mẫn cảm với Ofloxacin và Nofloxacin (100%), tiếp đến là Ciprofloxacin (90%) và Neomycin (80%). Kháng hoàn toàn với Trimethoprim + Sulfamethoxazole (100%) và kháng cao với một số kháng sinh như: Cefazolin (80%) và Spectinomycin (75%). 6. 100% các chủng S. choleraesuis được kiểm tra có mang gen Stn và InvA; 100% các chủng S. typhimurium có mang gen Stn và 96,0% các chủng có mang gen InvA; 93,7% các chủng S. enteritidis có mang gen Stn và 87,50% các chủng gen InvA. Không có chủng vi khuẩn nào mang gen DT104. 7. Tất cả các chủng vi khuẩn đem thử đều có độc lực cao, gây chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 8 - 36 giờ sau khi tiêm. 8. Cả 6 chủng vi khuẩn Salmonella chọn gây bệnh cho lợn đều có độc lực cao, giết chết hết lợn thí nghiệm trong vòng 28 - 96 giờ. 9. Cả 3 lô canh trùng S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis dùng chế tạo vacxin đều đạt các chỉ tiêu về: Đậm độ, thuần khiết, vô trùng, đủ tiêu chuẩn dùng làm vacxin. 10. Lô vacxin được chế từ 3 chủng S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis đạt chỉ tiêu an toàn 100% và có hiệu lực bảo hộ 100% trên chuột nhắt trắng. 5.2 Đề nghị Tiếp tục xác định hiệu lực và độ dài miễn dịch của vacxin trên lợn, nhằm đánh giá được hiệu quả phòng bệnh của vacxin trên lợn và nghiên cứu thử nghiệm trên diện rộng để áp dụng vào sản xuất.  TÀI LIỆU THAM KHẢO I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Võ Thị Trà An, Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Hữu Ngọc (2006), “Tình hình nhiễm Salmonella trong phân và thân thịt (bò, heo, gà) tại một số tỉnh phía Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr. 37-42. 2. Phùng Quốc Chướng (1995), Tình hình nhiễm Salmonella ở lợn tại vùng Tây Nguyên và khả năng phòng trị. Luận án PTS khoa học nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội. 3. Phùng Quốc Chướng (2005), “Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của một số thuốc kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập từ vật nuôi tại ĐăkLăk”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr. 53. 4. Đỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh, Nguyễn Quang Tuyên (2001), “Kết quả phân lập và xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella spp gây bệnh Phó thương hàn lợn ở một số tỉnh miền núi phía Bắc”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 3, tr. 10-17. 5. Đỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh, Nguyễn Quang Tuyên, Đỗ Thị Lan Phương (2003), “Xác định một số yếu tố gây bệnh của Salmonella Typhimurium phân lập từ lợn bị tiêu chảy ở một số tỉnh miền núi phía Bắc”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 4, tr. 33-37. 6. Đỗ Trung Cứ (2004), Phân lập và xác định yếu tố gây bệnh của Salmonella ở lợn tại một số tỉnh miền núi phía Bắc và biện pháp phòng trị. Luận án Tiến sỹ nông nghiệp, Viện Thú y Quốc gia. 7. Đỗ Đức Diên (1999), Vai trò của E. coli và Salmonella trong hội chứng tiêu chảy lợn con ở Kim Bảng (Hà Nam) và thử nghiệm một số giải pháp phòng trị. Luận án Thạc sỹ Nông nghiệp. 8. Trần Quang Diên (2002), Nghiên cứu tình hình nhiễm, đặc tính gây bệnh của Salmonella gallinarum pullorum trên gà công nghiệp và chế kháng nguyên chẩn đoán. Luận án Tiến sỹ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội. 9. Trương Văn Dung, Yoshihara shinobu (2002), Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam. Viện Thú y Quốc gia và Tổ chức hợp tác quốc tế Nhật Bản. 10. Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ (1995), Bệnh đường tiêu hóa ở lợn. NXB Nông nghiệp, tr. 63- 96. 11. Trần Xuân Hạnh (1995), “Phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella trên lợn ở tuổi giết thịt”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 3, tr. 89-93. 12. Trần Thị Hạnh và cộng sự (2009), “Tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. tại cơ sở giết mổ lợn công nghiêp và thủ công nghiệp”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr. 51-56. 13. Nguyễn Bá Hiên (2001), Một số vi khuẩn đường ruột thường gặp và biến động của chúng ở gia súc khỏe mạnh và bị tiêu chảy nuôi tại vùng ngoại thành Hà Nội. Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội. 14. Archie Hunter (2002), Sổ tay dịch bệnh động vật. Công ty in Thống nhất, Hà Nội. 15. Nguyễn Văn Lãm (1968), “Chế vacxin Phó thương hàn lợn con”. Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật thú y 1968- 1978, NXB Nông nghiệp, tr. 250- 289 16. Laval A (2000), “Dịch tễ Salmonellosis”. Báo cáo tại hội thảo về bệnh lợn tại Viện Thú y – Hà Nội tháng 6/2000, Tài liệu dịch của Trần Thị Hạnh – Viện Thú y. 17. Phạm Sỹ Lăng, Phan Địch Lân, Trương Văn Dung (2004), Bệnh phổ biến ở lợn và biện pháp phòng trị. NXB Nông nghiệp. 18. Hồ Văn Nam, Nguyễn Thị Đào Nguyên, Trương Quang, Phùng Quốc Chướng, Chu Đức Thắng, Phạm Ngọc Thạch (1997), “Tình hình nhiễm Salmonella và vai trò của Salmonella trong bệnh viêm ruột ỉa chảy ở lợn”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr. 39-45. 19. Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú, Nguyễn Thị Sở (1989), “Kết quả điều tra tình hình nhiễm vi khuẩn đường ruột tại một số cơ sở chăn nuôi lợn”. Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật Thú y (1985-1989). Viện Thú y, NXB nông nghiệp, Hà nội 1989, tr. 50-53. 20. Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú (1989), “Enterobacteria in diarrhoea pig”. Kết quả 20 năm nghiên cứu của Viện Thú y (1969 – 1989), Hà Nội, tr. 43. 21. Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh, Đỗ Ngọc Thuý (2000), “Phân lập vi khuẩn E.coli và Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác định một số đặc tính sinh vật hoá học của các chủng vi khuẩn phân lập được và biện pháp phòng trị”. Kết quả nghiên cứu Khoa học kỹ thuật thú y (1996-2000), NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 171-176. 22. Nguyễn Vĩnh Phước (1970), Vi sinh vật học thú y. NXB Đại học và trung học chuyên nghiệp Hà Nội. 23. Phan Thanh Phượng (1988), Phòng và chống bệnh Phó thương hàn lợn. NXB Nông thôn, Hà Nội. 24. Hoàng Thị Phi Phượng, Trần Thị Hạnh (2004), “Ảnh hưởng của thức ăn gây nhiễm E.coli và Salmonella đến biến đổi bệnh lý và một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu ở lợn sau cai sữa”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 4, tr. 36-41. 25. Lê Minh Sơn (2003), Nghiên cứu một số vi khuẩn gây ô nhiễm thịt lợn vùng hữu ngạn sông Hồng. Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp. 26. Lê Văn Tạo (1993), “Phân lập, định danh vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho lợn”. Báo cáo khoa học mã số KN 02 – 15, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 27. Lê Văn Tạo, Nguyễn Thị Vui (1994), “Phân lập và định typ vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho lợn”. Tạp chí Nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, số 11, tr. 430- 431 28. Nguyễn Như Thanh. 2001. Vi sinh vật Thú y. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 29. Tô liên Thu (2004), “Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella và E.coli phân lập được từ thịt lợn và thịt gà tại vùng đồng bằng Bắc bộ”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 4, tr. 29 – 35. 30. Tô Liên Thu (2005), Nghiên cứu tình trạng ô nhiễm một số vi khuẩn vào thịt lợn, thịt gà sau giết mổ ở Hà Nội và một số phương pháp làm giảm sự nhiễm khuẩn trên thịt. Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Thú y Quốc gia Hà Nội. 31. Tạ Thị Vịnh, Đặng Khánh Vân (1996), “Bước đầu thăm dò và xác định E.coli và Salmonella trên lợn bình thường và lợn mắc hội chứng tiêu chảy tại Hà Tây và Hà Nội”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr. 41- 44. II. TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 32. Asai T, Otagiri Y, Osumi T, Namimatsu T, Hirai H and Sato S (2002), “Isolation of Salmonella from Diarrheic Feces of Pig”. J. Vet. Med. Sci. 64, 2, p. 159- 160. 33. Barners D.M, Sorensen K.D (1975), ”Salmonellosis”. Diseases of Swine, 4th Edition. Iowa State University press, p. 12-18. 34. Benjamin W.H, Turnbough C.N, Posey B.S and Briles D.E (1985), “The ability of Salmonella typhimurium to produce siderophore enterobactin, avirulence factors”. Infect. Immun, 50, p. 392-397. 35. Berends B.R, Van Kanpen F, Snijders J.M.A and Mossel D.A.A (1997), “Identification and quantification of risk factors regarding Salmonella spp. on fork carcasses”. Int. J. Food Microbiol, 36, p. 199-206. 36. Berends B.R, Van Knapen F, Mossel D.A.A, Burt S.A and Snij J.M.A (1998), “Impact on human health of Salmonella spp. on pork in the Netherlands and the anticipated effects of some currently proposed control strategies”. Int. J. Food Mcrobiol, 44, p. 219-229. 37. Bergey’s (1994), Manual of determinative Bacteriology, 9th Edition, by the Williams and Wilkings Company. 38. Borch E, Nesbakken T and Christensen H (1996), “Hazard identification in swine slaughter with respect to foodborne”. Bacteria Int. J. Food Microbiol, 30, p. 9-25. 39. Bradley S.G (1979), “Cellular and molecular mechanisms of action of bacterial endotoxins”. Ann. Rev. Microbiol, 33, p. 67-94. 40. Bryan F (1988), “Risks associated with vehicles of foodborne pathogens and toxins”. J. Food Prot, 51, p. 498-508. 41. Chiu C.H and Ou J.T (1996), “Rapid identification of Salmonella serovars in feces by specific detection of the virulence genes, invA and spvC, by an enrichment broth culture – multiplex PCR combination assay”. J. Clin. Microbiol, 34, p. 2619-2622. 42. Chiu C.H, Su L.H and Chu C (2004), “Samonella enterica serotype Choleraesuis: Epidemiology, Pathogenesis, Clinical Disease and Treatment”. Clinical Microbiology Reviews 2, p. 311-322. 43. CIRAD “Training Course Salmonella”, 23 – 37 October 2006. 44. Clarke G.J, Wallis T.S, Starkey W.J, Collins J, Spencer A.J, Daddon G.J, Osborne M.P, Candy D.C and Stephen I (1988), “Expression of an antigen in strains of Salmonella typhimurium with antibodies tocholeratoxin”. Med. Microbiol, 25, p. 139-146. 45. Cleckner N, Roth J.R, Bostein D (1977), “Genetic engineering invivo using translocatable drug – resistance elements new methods in bacterial genetics”. Hol. Sen. Gonet , 116, p. 125 – 159. 46. Cloeckaert A, Praud K, Doublet B, Demartin M and Weill F.X (2006), “Variant Salmonella genomic island J – L antibiotic resistance gene cluster in Salmonella enterica serovar Newport”. Antimicrob. Agents Chemother, 50, p. 3944-3946. 47. Cortez A.L.L, Carvalho A.C.F.B, Ikuno A.A, Bürger K.P and Vidal – Martins A.M.C (2006), “Identification of Salmonella spp. isolates from chicken abattoirs by multiplex – PCR”. Res. Vet. Sci, 81, p. 340-344. 48. Crosa J.H, Brenner D.J, Ewing W.H and Falkow S (1973), “Molecular relationship among Salmonella”. J. Bacteriol, 115, p. 307-315. 49. Ewing, Edward (1970), Indentification of Enterobacteriaceae. Edicion Revolucionnalria, Instituto Cubano Del libro 19 No 1002, Vedado Habana. 50. Euzéby J.P (1999), “Revised Salmonella nomenclature”: designation of Salmonella enterica. (ex. Kauffmann and Edwards 1952) Le Minor and Propoff 1987 sp. nov., nom. rev. as the neotype species of the genus Salmonella Lignieres 1900 (Approved Lists 1980), rejection of the name Salmonella choleraesuis (Smith 1894) Weldin 1927 (Approved Lists 1980), and conservation of the name Salmonella typhi (Schroeter 1886) Warren and Scott 1930 (Approvied Lists 1980), Request for an opinion. Int. J. Sist. Bacteriol, 49, p. 927-930. 51. Farmer J.J (1995), “Enterobacteriaceae: Introduction and identification”. p. 438-449. In Murray P.R, Baron E.J and Pfaller M.A (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 6th Edition, American Society for Microbiology, Washington D.C. 52. Finlay B.B and Falkow (1988), “Virulence factors associated with Salmonella species”. Microbiological Sciences Vol. 5, No.11. 53. Frost A.J, Bland A.P, Wallis T.S (1997), “The early dynamic respose of the calf ileal ephithelium to Salmonella typhimurium”. Vet – Pathol, 34, p. 369-386. 54. Gray J.T, Fedorka-Gray P.J and Stabel T.S (1995), “Influence of inoculation route on the carrier state of Salmonella choleraesuis in swine”. Vet. Microbiol, 47, p. 43 – 49. 55. Griggs D.J, Hall M.C, Jin Y.F, and Piddock I.J.V (1994), “Quinolon resistantce in Veterinary Isolates of Salmonella”. J. Antimicrobiological Chemotherapy, p. 1173-1189. 56. Jones J.W, Richardson A.L (1981), “The attachment to invasion of helacells by Salmonella typhimurium the contribution of manose sensitive and manose – sensitive haemaglutinate activities”. J. Gen. Microbiol, V127, p. 361-370. 57. Khakhria R and Johnson W (1995), “Prevalence of Salmonella serotypes and phage types in Canada”. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 26 (Suppl. 2) p. 42-44. 58. Kishima M, Uchida i, Namimatsu T, Osumi T, Takahashi S, Tanaka K, Aoki H, Matsuura K and Yamamoto K (2008), “Nationwide Surveillance of Salmonella in the Faeces of Pigs in Japan”. 59. Krause M, Fang F.C, Gedaily A.E, Libby S and Guiney D.G (1995), “Mutational Ananysis of SpvR Binding to DNA in the Regulation of the Salmonella Plasmid Virulence Operon”. Academic Press. Inc. Plasmid, 34, p. 37-47. 60. Morris I.A, Wray C, Sojka W.J (1976), “The effect of T and B lymphocyte depletion on the protection of mice vaccinated with a get E mutant of Salmonella typhymurium”. Bristh J. of Exp, Path 57. 61. NCCLS (2000), Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. Approved standard, seventh edition edn. Pennsylvania, USA: The National Committe for Clinical Laboratory Standards, p. 5-10. 62. Nielsen B and Wegener H.C (1997), “Public health and pork and fork products: regional perspectives of Denmark”. Rev. Sci. Tech, 16, p. 513-524. 63. Nusera D.M, Maddox C.W, Hoien-Dalen P and Weigel R.M (2006), “Comparison of API 20E and invA PCR for identification of Salmonella enterica isolates from swine production units”. J. Clin. Microbiol, 44, p. 3388-3390. 64. Peteron J.W (1980), “Salmonella toxin”. Pharm Ather, VII, p. 719-724. 65. Plonait H, Bickhardt (1997), Salmonella infectionand Salmonella lehrbuchder Schweine Krankheiten. Parey Buchverlag, Berlin, p. 334 – 338. 66. Popoff M.Y (2001), Antigenic formulas of the Salmonella serovas. , 8th edition. WHO Collaborating Centre for reference and Research on Salmonella Institus Pasteur, Paris, France, p. 156. 67. Pritchett L.C, Konkel M.E, Gay J.M and Besser T.E (2000), “Identification of DT 104 and U 302 phage types among Salmonella enterica serotype Typhimurium isolates by PCR”. J. Clin. Microbiol, 38, p. 3484-3488. 68. Quinn P.J, Carter M.E, Makey B, Carter G.R (2002), Clinical veterinary microbiology. Wolfe Pulishing, London WC1 H9LB, England, p. 209-236. 69. Rahman K, De Grandis S.A, Clarke R.C, McEwen S.A, Galán J.E, Ginocchio C, Curtiss III R and Gyles C.L (1992), “Amplification of a invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of Salmonella”. Mol. Cell. Probes, 6, p. 271-279. 70. Saitoh M, Tanaka K, Nishimori K, Makino S, Kanno T, Ishihara R, Hatama S, Kitano R, Kishima M, Sameshima T, Akiba M, Nakazawa M, Yokomizo Y and Uchida I (2005), “The artAB genes encode a putative ADP- ribosyltransferase toxin homologue associated with Salmonella enterica serova Typhimurium DT104”. Microbiology , 151, p. 3089-3096. 71. Schwartz K.J (1999), “Salmonellosis”. In: Straw, B. E., S. D Allaire, W. L. Mengeling, and D. J. Taylo (eds), Disease of Swine, p. 535-551. Iowa State University Press, Ames. 72. Selbitz H.J (1995), Grundsaetzliche Sicherheisanfornderungen bein Einsatz von lebendimpfstoffen bei lebensmittelliefernden Tieren. Berl Much. Tieruzl. Wschr, 144, p. 428-423. 73. Skyberg J.A, Logue C.M and Nolan L.K (2006),“Virulence genotyping of Salmonella spp. with multiplex PCR“. Avian Dis, 50, p. 77-81. 74. Su L.H, Chiu C.H, Kuo A.J, Chia J.H, Sun C.F, Leu H.S and Wu T.L (2001), “Secular trends in incidence and antimicrobial resistance among clinical isolates of Salmonella at a university hospital in Taiwan, 1983-1999”. Epidemiol Infect, 127, p. 207-213. 75. Suzuki S, Komase K, Matsui H, Abe A, Kawahara K, Tamura Y, Kijima M, Danbara H, Nakamura M and Sato S (1994), “Virulence region of plasmid pNL2001 of Salmonella enteritidis”. Microbiology, 140, p. 1307-1318. 76. Timoney J.F, Gillespie J.H, Baelough J.E, Hagan and Bruner’s (1988), “Microbiology and infection disease of domentic animals”, Inthca and London Comstock Publising Associates, A Division of cornell University press, p. 209-230. 77. Tsolis R.M, Adams L.G, Fitcht T.A and Baumler A.J (1999), “Contribution of Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence factors to diarrheal disease in calves. Infect”. Immun, 67, p. 1879-1885. 78. Valtonen M.V (1977), “Role of phagocytosis in mouse virulence of Salmonella typhimurium recombinmant with O- antigen 6, 7 or 4, 12.” Infect. Immun, 18, p. 574. 79. Weinstein D.L, Carsiotis M, Lissner CH.R, Osrien A.D (1984), “Flagella help Samonella typhimurium survive within murine macrophages”. Infection and Immuniti, 46. p. 819-825. 80. Wilcock B.P, Schwartz K.J (1992), “Salmonella”. Disease of Swine, 7th Edition, p. 570-583. 81. Wilcock B.P (1995), “Salmonellosis”. Disease of Swine, Sixth Edition, Iowa state University Press, U.S.A, p. 508-518. Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o tr­êng ®¹i häc n«ng nghiÖp hµ néi ----------eêf---------- VĂN THỊ HƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Salmonella PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ LỢN SAU CAI SỮA BỊ TIÊU CHẢY VÀ CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM VACXIN PHÒNG BỆNH LuËn v¨n th¹c sÜ n«ng nghiÖp Chuyªn ngµnh : THó Y M· sè : 60.62.50 Ng­êi h­íng dÉn khoa häc: PGS.TS. CÙ HỮU PHÚ Hµ Néi - 2009 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, Ngày tháng 9 năm 2009 Tác giả Văn Thị Hường LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cùng với sự lỗ lực cố gắng của bản thân, tôi xin được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy: PGS.TS. Cù Hữu Phú, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin được chân thành cảm ơn tới thầy: TS. Nguyễn Hữu Nam, các thầy cô trong bộ môn Bệnh lý cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Thú y; Viện sau Đại học – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các chuyên gia: GS. Koichi Takeshi, GS. Makino Sou-ichi, Khoa Thú y ứng dụng và Thú y cộng đồng- Trường Đại học Nông nghiệp và Thú y Obihiro, Nhật Bản đã giúp tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Thú y, các anh, chị, em Bộ môn Vi trùng- Viện Thú y, Lãnh đạo công ty giống chăn nuôi Hà Nôi, Hưng Yên, Bắc Ninh, Hải Phòng, Thái Bình và các bạn đồng nghiệp đặc biệt là gia đình đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này. Hà nội, ngày tháng 09 năm 2009 Văn Thi Hường MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các từ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate BHI Brain Heart Infusion BPW Buffered Pepton Water CHO Chinese Hamster Ovary Cell CIRAD Centre de Cooperation Internationale en Recherche Agronomique pour le Developpement DHL Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose DNA Deoxyribonucleic Acid DPF Delayer Permebility Factor DT104 Definitive phage type 104 EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid ETEC Enterotoxigenic E. coli GDP Guanin diphosphate GTP Guanin triphosphate InvA Invasion A LIM Lysine Indole Motility LPS Lipopolysaccharide LT Heat- Labile Toxin mARN Messenger Acide RiboNucleotide RPF Rapid Permebility Factor ST Heat- stabile Toxin Stn Salmonella toxin TSI Triple- Sugar- Iron PCR Polymerase Chain Reaction RV Rappaports Vassiliadis DANH MỤC BẢNG STT Tªn b¶ng Trang 3.1 Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh 39 3.2 Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm dùng để xác định một số yếu tố gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập được 40 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ các mẫu phân và bệnh phẩm 45 4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella ở một số cơ quan phủ tạng của lợn bệnh 47 4.3 Kết quả kiểm tra một số đặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 51 4.4 Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 53 4.5 Kết quả xác định serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 57 4.6 Kết quả kiểm tra mức độ mẫn cảm với một số loại kháng của các chủngvi khuẩn Salmonella phân lập được 60 4.7 Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 63 4.8 Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng Salmonella phân lập được 67 4.9 Các chủng vi khuẩn Salmonella chọn gây bệnh 68 4.10 Kết quả gây bệnh thực nghiệm Salmonella trên lợn 35 ngày tuổi 69 4.11 Bệnh tích đại thể các lợn gây bệnh thực nghiệm 71 4.12 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu các lô vacxin 74 4.13 Kết quả thử hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng 75 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella từ các mẫu bệnh phẩm và phân 35 3.2 Quy trình sản xuất vacxin vô hoạt bổ trợ keo phèn 43 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Sallmonella từ mẫu phân và bệnh phẩm 45 4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella ở một số cơ quan phủ tạng của lợn bệnh 47 4.1 Ruột lợn bi viêm do vi khuẩn Salmonella gây ra. 50 4.2 Lách sưng to ở lợn mắc bệnh do Salmonella gây ra 50 4.3 Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường CHROM 53 4.4 Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường DHL 54 4.5 Phản ứng lên men đường của vi khuẩn Salmonella 54 4.6 Vi khuẩn Salmonella trên môi trường TSI 55 4.3. Kết quả xác định serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 57 4.4 Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 63 4.7 Kết quả của phản ứng PCR xác định yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella 64 4.8 Gây bệnh thực nghiệm cho lợn 72 ._.