Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của Vi khuẩn Salmonella phân lập được từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy và chế tạo thử nghiệm Vacxin phòng bệnh

Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o tr−êng ®¹i häc n«ng nghiÖp hµ néi ----------
---------- VĂN THỊ HƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN SALMONELLA PHÂN LẬP ðƯỢC TỪ LỢN SAU CAI SỮA BỊ TIÊU CHẢY VÀ CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM VACXIN PHÒNG BỆNH LuËn v¨n th¹c sÜ n«ng nghiÖp Chuyªn ngµnh : THó Y M· sè : 60.62.50 Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: PGS.TS. CÙ HỮU PHÚ Hµ Néi - 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, Ngày tháng 9 năm 2009 Tác giả Văn Thị Hường Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn này, cùng với sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi xin ñược ñặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy: PGS.TS. Cù Hữu Phú, người ñã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin ñược chân thành cảm ơn tới thầy: TS. Nguyễn Hữu Nam, các thầy cô trong bộ môn Bệnh lý cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Thú y; Viện sau ðại học – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn tới các chuyên gia: GS. Koichi Takeshi, GS. Makino Sou-ichi, Khoa Thú y ứng dụng và sức khỏe cộng ñồng- Trường ðại học Nông nghiệp và Thú y Obihiro, Nhật Bản ñã giúp tôi trong quá trình thực hiện ñề tài. Tôi xin cảm ơn Ban lãnh ñạo Viện Thú y, các anh, chị, em Bộ môn Vi trùng- Viện Thú y, Lãnh ñạo công ty giống chăn nuôi Hà Nôi, Hưng Yên, Bắc Ninh, Hải Phòng, Thái Bình và các bạn ñồng nghiệp ñặc biệt là gia ñình ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất giúp ñỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này. Hà nội, ngày tháng 09 năm 2009 Văn Thi Hường Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các từ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii 1. ðẶT VẤN ðỀ 1 1.1 Tính cấp thiết của ñề tài 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra 3 2.2 Một số ñặc ñiểm của vi khuẩn Salmonella 9 2.3 Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn 22 2.4 Biện pháp phòng trị bệnh do Salmonella gây ra ở lợn 28 2.5 Một số hiểu biết về vacxin và vacxin phòng bệnh Phó thương hàn 29 3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.1 Nội dung nghiên cứu 32 3.2 ðối tượng, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 33 3.3 Nguyên liệu dùng cho nghiên cứu 33 3.4 Phương pháp nghiên cứu 34 3.5 Phương pháp sử lý số liệu 44 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella 46 4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ các mẫu bệnh phẩm 46 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iv 4.1.2 Kết quả xác ñịnh tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella ở một số cơ quan phủ tạng của lợn bệnh 48 4.2 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính nuôi cấy và sinh hóa của các chủng Salmonella phân lập ñược 53 4.3 Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 57 4.4 Kết quả kiểm tra mức ñộ mẫn cảm của các chủng Salmonella phân lập ñược với một số loại kháng sinh 61 4.5 Kết quả xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 64 4.6 Kết quả xác ñịnh ñộc lực của một số chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược trên chuột nhắt trắng 69 4.7 Kết quả gây bệnh thực nghiệm trên lợn bằng các chủng Salmonella phân lập ñược 72 4.8 Kết quả chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh Salmonella cho lợn 76 4.8.1 Chế vacxin vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh Salmonella cho lợn 76 4.8.2 Kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực vacxin trên chuột thí nghiệm. 79 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 81 5.1 Kết luận 81 5.2 ðề nghị 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADP Adenosine DiPhosphate ATP Adenosine TriPhosphate BHI Brain Heart Infusion BPW Buffered Pepton Water CHO Chinese Hamster Ovary Cell CIRAD Centre de Cooperation Internationale en Recherche Agronomique pour le Developpement DHL Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose DNA DeoxyriboNucleic Acid DPF Delayer Permebility Factor DT104 Definitive phage Type 104 EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid ETEC EnteroToxigenic E. coli GDP Guanin DiPhosphate GTP Guanin TriPhosphate InvA Invasion A LIM Lysine Indole Motility LPS LipoPolySaccharide LT Heat- Labile Toxin mARN Messenger Acide RiboNucleotide RPF Rapid Permebility Factor ST Heat- stabile Toxin Stn Salmonella toxin TSI Triple- Sugar- Iron PCR Polymerase Chain Reaction RV Rappaports Vassiliadis Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vi DANH MỤC BẢNG STT Tªn b¶ng Trang 3.1 Bảng ñánh giá mức ñộ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh 41 3.2 Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm dùng ñể xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập ñược 42 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ các mẫu phân và phủ tạng 47 4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella ở một số cơ quan phủ tạng của lợn bệnh 49 4.3 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 53 4.4 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 55 4.5 Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 60 4.6 Kết quả kiểm tra mức ñộ mẫn cảm với một số loại kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 63 4.7 Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 66 4.8 Kết quả kiểm tra ñộc lực của một số chủng Salmonella phân lập ñược 71 4.9 Các chủng vi khuẩn Salmonella chọn gây bệnh 72 4.10 Kết quả gây bệnh thực nghiệm Salmonella trên lợn 35 ngày tuổi 73 4.11 Bệnh tích ñại thể các lợn gây bệnh thực nghiệm 75 4.12 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu các lô vacxin 78 4.13 Kết quả thử hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng 79 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Quy trình phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella từ các mẫu phân và phủ tạng 36 3.2 Quy trình sản xuất vacxin vô hoạt bổ trợ keo phèn 45 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Sallmonella từ mẫu phân và phủ tạng 47 4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella ở một số cơ quan phủ tạng của lợn bệnh 49 4.3 Ruột lợn bi viêm do vi khuẩn Salmonella gây ra. 52 4.4 Lách sưng to ở lợn mắc bệnh do Salmonella gây ra. 52 4.5 Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường CHROM 56 4.6 Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường DHL 56 4.7 Phản ứng lên men ñường của vi khuẩn Salmonella 57 4.8 Vi khuẩn Salmonella trên môi trường TSI 57 4. 9 Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 60 4.10 Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 67 4.11 Kết quả của phản ứng PCR xác ñịnh yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella 67 4.12 Gây bệnh thực nghiệm cho lợn 76 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………1 1. ðẶT VẤN ðỀ 1.1 Tính cấp thiết của ñề tài Trong những năm gần ñây, nền kinh tế nước ta ñã và ñang có những bước phát triển vượt bậc về mọi mặt, ñời sống kinh tế xã hội ngày càng ñược cải thiện. ðóng góp một phần không nhỏ cho sự thành công ñó phải kể ñến các thành tựu của ngành nông nghiệp, trong ñó có ngành chăn nuôi thú y mà ñặc biệt là ngành chăn nuôi lợn. Ngành chăn nuôi lợn ñã góp phần ñáp ứng nhu cầu thực phẩm trong nước và một phần dành cho xuất khẩu thu ngoại tệ. Theo CIRAD (2006)[43], thịt lợn chiếm 77% tổng lượng các loại thịt tiêu dùng hàng ngày trên thị trường Việt Nam. Tuy nhiên, một thách thức không nhỏ ñối với việc phát triển chăn nuôi lợn là dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra trên các ñàn lợn ở mọi lứa tuổi, làm giảm năng suất, giảm chất lượng con giống hoặc nhiễm vào sản phẩm thịt lợn gây nguy cơ mất an toàn vệ sinh thực phẩm. Một trong những bệnh thường gặp phải kể ñến là bệnh tiêu chảy do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn sau cai sữa, còn gọi là bệnh Phó thương hàn tuy không nổ ra thành dịch lớn, nhưng với ñặc ñiểm dịch tễ hết sức phức tạp, ñã và ñang gây nên những thiệt hại ñáng kể cho người chăn nuôi. Có thể nói rằng ở bất kỳ một cơ sở chăn nuôi nào dù quy mô lớn hay nhỏ ñều xuất hiện bệnh này. Khi ñời sống của nhân dân ngày càng ñược nâng cao, vấn ñề an toàn thực phẩm trong ñó có lợn và thịt lợn sạch bệnh, không bị nhiễm Salmonella là một yêu cầu cấp thiết. Có rất nhiều tác giả ñã công bố rằng sự nhiễm Salmonella vào thân thịt lợn trong quá trình giết mổ chủ yếu liên quan ñến sự nhiễm trùng Salmonella ở ruột (Borch và cs, 1996[38]; Berends và cs, 1997[35]). Do ñó, việc giảm tỷ lệ các trại bị nhiễm mầm bệnh Salmonella sẽ làm sự an toàn thịt lợn tăng lên. Mục tiêu của các nhà khoa học, nhà sản xuất Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………2 là xây dựng các ñàn gia súc sạch Salmonella. Nhìn chung vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra ở lợn ñã ñược rất nhiều các nhà vi sinh vật trên toàn thế giới quan tâm. Ở Việt Nam ñã có một số công trình nghiên cứu về Salmonella và bệnh do chúng gây ra ở lợn như: Nguyễn Thị Nội và cs (1989)[20]; Lê Văn Tạo và cs (1993)[26]; Trần Xuân Hạnh (1995)[11]; Cù Hữu Phú và cs (2000)[21]; ðỗ Trung Cứ (2004)[6]... Theo Bryan (1988)[40]; Nielsen và Wegener (1997)[62]; Berends và cs 1998[36]; Schwartz (1999)[71]: Các ñàn lợn bị nhiễm Salmonella không những gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi mà còn là nguồn tàng trữ mầm bệnh gây hại ñối với con người. Bởi vậy mà mỗi biện pháp ngăn chặn có hiệu quả ở gia súc ñều cần thiết và là ñiều kiện tiên quyết góp phần giảm thiểu dịch bệnh, tăng thu nhập cho người chăn nuôi, chống ô nhiễm môi trường và bảo vệ sức khoẻ cộng ñồng. Vì vậy mà việc phân lập vi khuẩn Salmonella, xác ñịnh serotyp và các ñặc tính gây bệnh của chúng ở lợn, nhằm mục ñích phát hiện sớm và tìm ra hướng phòng và trị bệnh có hiệu quả luôn là những việc làm cấp thiết. Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu và yêu cầu của sản xuất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: "Nghiên cứu một số ñặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella phân lập ñược từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy và chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh". 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập, xác ñịnh hình thái, tính chất nuôi cấy, ñặc tính sinh vật hóa học, serotyp và các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella phân lập ñược từ lợn sau cai sữa ở một số tỉnh phía Bắc. - Chế tạo thử nghiệm vacxin ña giá có chứa một số các serotyp thường gặp nhất từ những trường hợp nhiễm bệnh Salmonella ở lợn. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra 2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Năm 1880, Eberth lần ñầu tiên quan sát thấy vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi. Bốn năm sau (1984), Gaffky ñã nuôi cấy thành công vi khuẩn này. Loài vi khuẩn Salmonella typhi thời gian ñầu ñược gọi với các tên như: Bacillus typhous, Bacterium typhi và Eberthella typhi hay Eberthella typhi tiphosa, còn tên giống Salmonella ñược Lignires sử dụng ñặt tên cho trực khuẩn gây bệnh dịch tả “Hog-cholera bacillus” vào năm 1900 (Selbizt và cs, 1995[72]) Năm 1885, tên gọi S. choleraesuis lần ñầu tiên xuất hiện trong báo cáo năm của phòng chăn nuôi công nghiệp Mỹ. Thời gian này, Salmon, D.E. là trưởng phòng nghiên cứu, vì vậy mà tên ông ñược lấy ñặt cho vi khuẩn mới này. Song Smith, người cộng sự của Salmon mới thật sự là người phát hiện ra vi khuẩn Salmonella. Một vài năm sau ñó, lần lượt các loài Salmonella khác ñã ñược phát hiện và những loài vi khuẩn ñó vẫn có ý nghĩa trong y học cho tới ngày nay. Năm 1891 Jensen, ñã phân lập ñược S. dublin từ bệnh phẩm của bê bị tiêu chảy. Cũng vào năm ñó, S. typhimurium ñược phát hiện ở vùng Greiswald và Breslau. Hai năm sau ñó (1893), tại Breslau ñã xảy ra một vụ ngộ ñộc thịt do ăn phải thịt bò ốm, kết quả là bệnh ñã xảy ra ở người. Kaensche là người tìm thấy vi khuẩn, vì vậy vi khuẩn ñược ñặt tên là trực khuẩn Kaensche (Selbizt và cs, 1995[72]). Tất cả các bệnh do Salmonella gây ra lúc ñầu ñược ñặt tên chung là Phó thương hàn “Para-typhus”, cho ñến năm 1914, có 12 loài vi khuẩn ñược Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………4 mô tả và xếp vào giống Salmonella. Năm 1926, với những công trình nghiên cứu của White về cấu trúc kháng nguyên của Salmonella ñã bắt ñầu một thời kỳ khoa học mới về giống vi khuẩn này. Sau ñó Kauffmann cũng rất thành công trong lĩnh vực nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella (Selbizt và cs, 1995[72]). Năm 1934, Kauffmann và White ñã thiết lập ñược bảng cấu trúc kháng nguyên ñầu tiên và ñặt tên là bảng phân loại Kauffmann-White. Từ ñó ñến nay, bảng cấu trúc kháng nguyên của Salmonella luôn luôn ñược bổ sung. Năm 1993 ñã có 2375 serovar Salmonella ñược ñịnh danh (Selbizt và cs, 1995[72]). Năm 1997, số serovar ñã lên ñến 3000 (Plonait và Birkhardt, 1997[65]). Như vậy, giống Salmonella luôn luôn thu hút sự chú ý của các nhà chuyên môn trong lĩnh vực vi sinh vật. Trước năm 1983, sự tồn tại của nhiều loài Salmonella ñược chấp nhận trong phân loại. Từ ñó vì kết quả của những thí nghiệm cho thấy mức tương ñồng DNA cao, tất cả các chủng Salmonella ñược xếp thành một loài duy nhất là S. choleraesuis (Salmonella choleraesuis) (Crosa và cs, 1973[48]; Farmer, 1995[51]). Năm 1999, tại khóa phân loại học của trung tâm Kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh (CDC: Center for Diease Control and Prevention) của Hoa Kỳ Euzéby ñề nghị ñặt tên các typ huyết thanh Salmonella như sau: Giống Salmonella ñược chia thành 2 loài, ñó là S. enterica và S. bongori. Tất cả các type huyết thanh gây bệnh cho người và ñộng vật ñều thuộc S. enterica. Loài S. enterica ñược chia nhỏ thành 6 dưới loài ñó là: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houterae và indica, tương ứng với số la mã: I, II, IIIa, IIIb, IV và VI dựa trên sự tương ñồng DNA và phạm vi vật chủ. Do dưới loài I có nhiều typ huyết thanh khác nhau nên dưới loài này ñược phân loại ñến typ huyết thanh. ðể nhấn mạnh rằng typ huyết thanh không phải là loài riêng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………5 biệt nên tên của typ huyết thanh không viết nghiêng và chữ ñầu phải viết hoa. Vì vậy, S. choleraesuis có tên ñầy ñủ là S. enterica serotyp choleraesuis, hoặc viết tắt ngắn gọn hơn là S. choleraesuis. Mặc dù hệ thống phân loại mới này không ñược công nhận một cách chính thức bởi ủy ban quốc tế về vi khuẩn học hệ thống, nhưng nó ñã ñược tổ chức y tế thế giới và hiệp hội vi sinh vật học ở Mỹ chấp nhận sử dụng (Euzéby, 1999[50]). Vi khuẩn Salmonella ñược phân lập từ thịt lợn chết bởi bệnh Phó thương hàn thường gặp ở miền Tây của nước Mỹ là S. choleraesuis var kunzendorf, S. typhimurium và S. typhisuis (Barnes và Sorensen, 1975[33]). Trong một vài trường hợp, ở lợn còn tìm thấy S. dublin và S. enteritidis. Hai serotyp S. dublin và S. enteritidis cũng gặp ở lợn con ñang theo mẹ. Những báo cáo gần ñây cho thấy: Ở một số nước như Mỹ, Canada, Anh và Bắc ðài Loan ñã phân lập ñược S. choleraesuis từ người bị bệnh (Khakhria & Johnson, 1995[57]; Chiu và cs, 1996[41]; Su và cs, 2001[74]). Từ việc tìm thấy vi khuẩn Salmonella trong ñộng vật ốm, sản phẩm ñộng vật, trong nước và trong các dụng cụ chăn nuôi..., các tác giả ñã có những ñề xuất về các giải pháp tổng hợp cần thiết nhằm tránh sự lây lan vi khuẩn trong hệ sinh thái môi trường ñể bảo vệ sức khỏe. Nguồn tàng trữ Salmonella chủ yếu là ñường tiêu hoá của người và ñộng vật mắc bệnh. Một vài loài như S. typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. paratyphi C chỉ ký sinh ở người. Những loài khác hay gặp hơn như: S. choleraesuis, S. enteritidis chủ yếu ký sinh ở ñộng vật nhưng cũng có khả năng gây bệnh cho người. Do tính chất gây bệnh của vi khuẩn Salmonella không những cho gia súc, gia cầm, ñộng vật máu nóng, máu lạnh và cả ở trên người nên từ lâu trong nhân y và thú y, người ta ñã quan tâm nghiên cứu các ñặc tính sinh học, yếu tố gây bệnh và các biện pháp phòng và ñiều trị bệnh do chúng gây ra. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………6 Wilcock và Schwartz (1992)[80] thì tại nước Anh, năm 1972 tìm thấy vi khuẩn Salmonella có trong phân lợn là 9,9%, năm 1973 tìm thấy vi khuẩn Salmonella trong hạch ruột là 7,3%. Tại Nhật Bản, Asai và cs (2002)[32] cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn sau cai sữa bị tiêu chảy là 12,4%; lợn vỗ béo là 17,3%; lợn con theo mẹ 4,5%. Tác giả cũng cho biết S. typhimurium ñược phân lập thấy nhiều nhất ở lợn sau cai sữa là 72,6%; lợn gần xuất chuồng là 73,8%. Kishima và cs (2008)[58] ñã ñiều tra tỷ lệ nhiễm và phân bố của vi khuẩn Salmonella trong phân lợn khỏe mạnh bình thường trên toàn lãnh thổ Nhật Bản giữa năm 2003 và năm 2005 là 3,1%. Theo Barnes và Sorensen (1975)[33];Wilcock và Schwartz (1992)[80]: Ở lợn, cần phân biệt 2 dạng bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra, ñó là bệnh Phó thương hàn cấp tính ở lợn con do S. choleraesuis var kunzendorf và bệnh viêm ruột mãn tính do S. typhimurium. Ở trâu bò, bệnh chủ yếu do các loài S. dublin và S. entertidis gây ra. Ở cừu, do S. abortus ovis, S. montevideo, S. dublin, S. anatum gây ra. Ở ngựa do S. abortus equi gây ra, còn ở gia cầm và chim do S. pullorum, S. gallinarum, S. typhimurium và S. enteritidis gây ra. Hiện nay, có rất nhiều loại thuốc kháng sinh có thể ñược sử dụng ñể ñiều trị bệnh, nhất là với lợn con trước và sau cai sữa. Tuy nhiên, do việc sử dụng rộng rãi kháng sinh ñể phòng và ñiều trị bệnh nên ñã xuất hiện các chủng vi khuẩn Salmonella kháng thuốc (Kishima và cs, 2008[58]). Gần ñây, nhiều nghiên cứu ñã tập trung vào nghiên cứu gen kháng kháng sinh DT104 ở vi khuẩn Salmonella. Chủng ña kháng thuốc S. typhimurium DT104 ñược phát hiện lần ñầu tiên ở người mắc Salmonellosis tại Anh vào năm 1980. Sau ñó ñược quan sát thấy cả ở người cũng như vật nuôi trên khắp thế giới vào những năm 90 và hiện ñang là mối quan ngại hàng ñầu ñối với sức khỏe cộng ñồng. Gen này thường xuất hiện ở các serotyp S. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………7 typhimurium và ít thấy ở các serotyp khác. Một tổ hợp kháng thuốc ñiển hình của S. typhimurium DT104 là kháng ñồng thời với 5 loại kháng sinh, bao gồm: Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Sulfonamide và Tetracycline (ACSSuT) (Kishima và cs, 2008[58]). Tuy nhiên, không có chiều ngược lại, tức là nếu các kết quả xác ñịnh lâm sàng cho thấy một chủng vi khuẩn kháng với cả 5 loại kháng sinh này thì vẫn chưa ñủ căn cứ ñể kết luận là chủng vi khuẩn này có mang gen kháng kháng sinh DT104 (Kishima và cs, 2008[58]). Cũng theo tác giả, có 61,5% số chủng thuộc serotyp S. typhimurium có mang gen DT104. Selbitz (1995)[72] còn cho biết: “genom” của Salmonella ñược nghiên cứu tương ñối kỹ. Cho ñến nay ít nhất ñã chứng minh ñược 750 gen, trong ñó có 680 gen ñã có trong bản ñồ gen. Như vậy, vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra ñược rất nhiều các nhà vi sinh vật trên toàn thế giới quan tâm. Mục ñích của các nghiên cứu này nhằm tìm ra các biện pháp có hiệu quả ñể góp phần ngăn chặn và ñẩy lùi bệnh do Salmonella gây ra ở ñộng vật và ở người. 2.1.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước Ở Việt Nam, vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra cho người và gia súc cũng ñã ñược bắt ñầu nghiên cứu từ những năm 50. Viện Pasteur Sài Gòn trong những năm (1951-1953) ñã phân lập ñược 6 chủng Salmonella ở người (4 chủng từ máu, 2 chủng từ nước tiểu). Cũng ở Sài Gòn, trong thời gian này ñã phân lập ñược 35 chủng từ 360 lợn, trong ñó có 23 mẫu là S. cholereasuis (ðỗ ðức Diên, 1999[7]). Năm 1989, Nguyễn Thị Nội và cs[19] ñã tiến hành ñiều tra tình hình nhiễm vi khuẩn ñường ruột tại một số cơ sở chăn nuôi lợn ở miền Bắc ñã tìm thấy 37,5% lợn nhiễm Salmonella. Trước tình hình như vậy, nhóm tác giả này ñã nghiên cứu và chế tạo thành công vacxin ña giá Salsco phòng bệnh ỉa chảy Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………8 cho lợn con. Vacxin ñã ñược áp dụng ñể phòng bệnh có hiệu quả ở nhiều trại chăn nuôi lợn, tỷ lệ lợn bị tiêu chảy giảm từ 30-50%, tỷ lệ lợn chết do tiêu chảy giảm xuống còn 10-20%. Lê Văn Tạo và cs (1994)[27] ñã phân lập và xác ñịnh serotyp của vi khuẩn Salmonella gây bệnh ở lợn, kết quả cho thấy: 50% các chủng phân lập ñược thuộc S. choleraesuis; 12,5% S. enteritidis; 6,25% S. typhimurium và số còn lại thuộc các serotyp khác. Trần Xuân Hạnh (1995)[11] ñã phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella ở lợn tại Thành phố Hồ Chí Minh cho kết quả: S. typhisuis ở lợn bệnh là 16,9%; ở lợn bình thường 6-16 tuần tuổi là 4,2%; S. paratyphi ở lợn 6-16 tuần tuổi là 2,8%. ðặc biệt, vi khuẩn S. choleraesuis chiếm 38,7% ở lợn bệnh và 2,8% ở lợn bình thường. Theo Phùng Quốc Chướng (1995)[2] ở Tây Nguyên, mùa khô lợn mắc bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra là 20,03%, vụ ñông là 28,66%. Tạ Thị Vịnh và cs (1996)[31] ñã kiểm tra 75 mẫu phân lợn khoẻ và 65 mẫu phân lợn bệnh tại một số vùng thuộc Ba Vì (Hà Tây) và Gia Lâm (Hà Nội) cho thấy: Tỷ lệ nhiễm Salmonella cao 30-56% ở lợn khoẻ trong giai ñoạn 22-60 ngày tuổi. Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn mắc hội chứng tiêu chảy cao hơn lợn bình thường và tăng dần theo lứa tuổi, dao ñộng từ 70-90%. Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy tại 4 cơ sở chăn nuôi lợn thuộc miền Bắc nước ta của Cù Hữu Phú và cs (2000)[21] cho biết: Tỷ lệ tìm thấy Salmonella trung bình ở lợn tiêu chảy nuôi tại 4 cơ sở trên là 80%. ðây là ñiều ñáng lo ngại ñối với ngành chăn nuôi lợn ở nước ta. Theo Nguyễn Bá Hiên (2001)[13], tỷ lệ nhiễm Salmonella ở các ñàn lợn, ngoại thành Hà Nội cao nhất là lợn trên 60 ngày tuổi (88,23%), thấp nhất là lợn từ 1-21 ngày tuổi (73,68%). Ngoài ra ngộ ñộc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella cũng ñã và ñang Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………9 ñược rất nhiều tác giả quan tâm. Lê Minh Sơn (2003)[25] ñã xác ñịnh tỷ lệ nhiễm Salmonella trong thịt lợn giết mổ tiêu dùng nội ñịa từ 10,91-16,67% và thịt lợn xuất khẩu trung bình 1,42%. Tô Liên Thu (2005)[30] ñã xác ñịnh tỷ lệ nhiễm Salmonella của các mẫu thịt gà ở Hà Nội là rất cao: 33% các mẫu lấy tại siêu thị, 40% các mẫu lấy từ chợ. Lò mổ là một mắt xích quan trọng có nguy cơ cao ô nhiễm Salmonella vào thân thịt sau giết mổ. Trần Thị Hạnh (2009)[12] ñã công bố tỷ lệ nhiễm Salmonella tại các cơ sở giết mổ lợn công nghiệp và cho kết quả: Chất chứa manh tràng của lợn là 59,18%, ở mẫu lau thân thịt là 70%, mẫu lau hậu môn 66%, mẫu lau nền chuồng nhốt lợn chờ giết mổ là 40%, mẫu lau sàn giết mổ là 28%, còn các mẫu nước kiểm tra không phát hiện Salmonella. Tại các cơ sở giết mổ lợn theo phương thức thủ công cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chất chứa manh tràng của lợn chờ giết mổ là 87,5%, ở mẫu lau thân thịt là 75%, mẫu lau hậu môn là 55%, mẫu lau nền chuồng nhốt lợn chờ giết mổ là 70%, mẫu lau sàn giết mổ là 80%, mẫu nước là 50%. Cùng với quá trình nghiên cứu chi tiết về vi khuẩn, các biện pháp phòng bệnh ñã ñược nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, trong ñó có vacxin phòng bệnh. Nguyễn Văn Lãm (1968)[15] ñã tiến hành nghiên cứu chế vacxin Phó thương hàn lợn con từ chủng Salmonella chuẩn của Trung Quốc. Hiện nay, các loại vacxin phòng bệnh Phó thương hàn ñã ñược một số công ty, xí nghiệp thuốc thú y sản xuất như vacxin nhược ñộc chủng TS – 177, vacxin có bổ trợ như vacxin keo phèn hay vacxin nhũ hoá có bổ trợ dầu. Như vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn Salmonella một cách toàn diện ñể từ ñó ñề ra biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả, giữ gìn vệ sinh an toàn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe con người là một yêu cầu rất cần thiết. 2.2 Một số ñặc ñiểm của vi khuẩn Salmonella Trực khuẩn Salmonella thuộc bộ Eubacteriales, họ Enterobacteriaceae. Giống Salmonella gồm 2 loài: S. enterica và S. bongori ñã ñược phân chia Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………10 thành trên 2000 serotyp theo bảng phân loại Kauffmann-White trên cơ sở cấu trúc của kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và ñôi khi các kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K). Gần ñây, loài S. enterica ñã ñược phân thành 6 phân loài ñó là: S. enterica subsp. enterica, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizinae, S. enterica subsp. houtenae, S. enterica subsp. indica. Trong ñó phân loài S. enterica subsp. enterica gồm phần lớn các chủng Salmonella là những tác nhân gây bệnh cho người và ñộng vật (Quinn, 2002[68]). 2.2.1 ðặc ñiểm hình thái Theo Bergeys Manual (1994)[37], vi khuẩn Salmonella là những trực khuẩn ngắn, hai ñầu tròn, có kích thước 0,4-0,6 x 1,0-3,0 µm, bắt màu Gram âm, không hình thành nha bào và giáp mô. ða số loài Salmonella có lông (flagella) từ 7-12 chiếc xung quanh thân (trừ S. gallinarum-pullorum). Lông giúp cho vi khuẩn có khả năng di ñộng. Lông có hình tròn, dài, xuất phát từ màng cytoplasma. Do có cấu trúc từ các sợi protein hình xoắn nên có thể co giãn và di ñộng nên lông của chúng rất khó nhuộm. Nếu nhuộm bằng phương pháp Haschem (1972) thì có thể nhìn thấy chúng dưới kính hiển vi ñiện tử (Lê Văn Tạo, 1993[26]). Lông có tính kháng nguyên và do các gen mã hóa tổng hợp protein riêng quy ñịnh. Ngoài ra, trên bề mặt màng ngoài của vi khuẩn Salmonella ñều có các cấu trúc sợi nhỏ hơn, còn gọi là Fimbriae hay Pili. Chúng có kích thước chừng 0,01- 0,03 x 1,0 µm. Số lượng fimbriae trên 1 vi khuẩn có khoảng 250- 400 cái vươn thẳng ra xung quanh bề mặt tế bào. Fimbriae có cấu trúc là protein và có tính kháng nguyên ñặc trưng. Theo Jones và cs (1981)[56]: Fimbriae tạo cho vi khuẩn khả năng bám dính (adhesion) lên các tế bào biểu mô ruột và xâm nhập vào lớp niêm mạc. 2.2.2 Tính chất nuôi cấy Salmonella là vi khuẩn vừa hiếu khí, vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ nuôi cấy. Nhiệt ñộ nuôi cấy thích hợp là 37oC, nhưng có thể phát triển ñược ở Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………11 nhiệt ñộ từ 6- 42oC. Nuôi cấy ở 43oC có thể loại trừ ñược tạp khuẩn mà Salmonella vẫn phát triển ñược (Timoney và cs, 1988[76]). pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 7,6, tuy nhiên vi khuẩn vẫn phát triển ñược ở pH từ 6-9. Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường BPW (Buffered Pepton Water) và môi trường RV (Rappaports Vassiliadis) sau vài giờ nuôi cấy thấy môi trường vẩn ñục nhẹ, sau 18 ñến 24 giờ thấy canh trùng ñục ñều, trên mặt môi trường có màng mỏng, ñáy ống nghiệm có cặn. Hiện nay có rất nhiều loại môi trường chọn lọc ñược các nhà vi sinh vật thú y sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và phân lập Salmonella như môi trường thạch DHL (Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose agar), sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc tròn, lồi, bóng láng (dạng S), có màu vàng nhạt. Các chủng sinh H2S thì giữa khuẩn lạc có màu ñen. Môi trường thạch MacConkey: Vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc tròn lồi, trong không màu, nhẵn bóng. Trên môi trường thạch CHROMTM Salmonella, sau 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trơn, tròn, bóng láng (dạng S) và có màu tím hồng. Trong môi trường thạch TSI (Triple Sugar Iron), vi khuẩn Salmonella do sản sinh alkaline nên phần thạch nghiêng có màu ñỏ (pH=7,3), ñáy ống nghiệm màu vàng (pH=6,8) do vi khuẩn chỉ lên men ñường Glucose. Phần giữa ống nghiệm có màu ñen do vi khuẩn sản sinh ra khí H2S. Nếu ñể lâu (quá 24 giờ), màu ñen môi trường thường làm át phản ứng tạo axit ở phần ñáy ống nghiệm (không nhìn thấy màu vàng). Vi khuẩn sinh hơi làm nứt thạch, có khi ñẩy thạch khỏi ñáy ống nghiệm (Quinn và cs, 2002[68]). Trong môi trường LIM (Lysine Indole Motility), vi khuẩn không làm chuyển màu môi trường, môi trường có màu tím nhạt. Môi trường Malonate, vi khuẩn không phát triển nên không làm thay ñổi màu môi trường. 2.2.3 ðặc tính sinh hoá Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………12 Theo Quinn và cs (2002)[68], giống vi khuẩn Salmonella ñược chia thành 7 phân nhóm, mỗi phân nhóm có khả năng lên men một số loại ñường nhất ñịnh và không ñổi. Phần lớn phân loài S. enterica subsp. enterica gây bệnh cho ñộng vật máu nóng. Chúng lên men và sinh hơi: Glucoza, Mannit, Mantoza, Galactoza, Dulcitol, Arabonoza, Sorbitol. Cũng ở nhóm này, hầu như các chủng vi khuẩn Salmonella ñều không lên men Lactoza và Saccaroza. ða số các vi khuẩn thuộc giống Salmonella không làm tan chảy Gelatin, không phân giải Urê, không sản sinh Indol. Phản ứng MR, Catalaza dương tính (trừ S. choleraesuis, S. gallinarum-pullorum có MR âm tính). Phản ứng Oxidaza âm tính. Phản ứng sinh H2S dương tính (trừ S. paratyphi A, S. typhisuis, S. choleraesuis) (Ewing và Edwards, 1970[49]). Trong quá trình phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella thì ñặc tính sinh hóa có ý nghĩa rất quan trọng. ðây là bước không thể bỏ qua khi xét nghiệm vi khuẩn nói chung và vi khuẩn Salmonella nói riêng. 2.2.4 Sức ñề kháng của vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn Salmonella mẫn cảm với nhiệt ñộ và các chất sát trùng mạnh. Ở nhiệt ñộ 50oC trong 1 giờ, 70oC trong 20 phút, 100oC trong 15 phút hoặc ánh sáng mặt trời chiếu thẳng trong 5 giờ có thể diệt ñược vi khuẩn (Laval, 2000[16]). Các chất sát trùng thông thường dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn như: Phenol 5%, Formon 1/500 diệt vi khuẩn trong 15- 20 phút. Theo Laval, (2000)[16], vi khuẩn Salmonella sống ñược lâu trong ñiều kiện lạnh, chúng có thể sống trong b._.ột thịt 8 tháng, nhưng ở ñiều kiện môi trường có ñộ pH ≤ 5 chúng chỉ sống ñược trong thời gian ngắn. Vi khuẩn Salmonella tồn tại trong chất ñộn chuồng tới trên 30 tuần, có thể sống ở trong ñất với ñộ sâu 0,5cm trong thời gian 2 tháng. Ở sàn gỗ, tường gỗ trong ñiều kiện ít ánh sáng là 87 ngày, máng gỗ 108 ngày (ðào Trọng ðạt và cs, 1995[10]). Trong nước tù ñọng, ñồng cỏ ẩm thấp S. typhimurium có thể Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………13 tồn tại trên 7 tháng. Trong xác súc vật chết, Salmonella có thể sống trên 100 ngày, trong thịt ướp muối từ 6-8 tháng (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1970[22]). 2.2.5 ðặc ñiểm dịch tễ học của vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho người và vật nuôi, phân bố ở khắp nơi trên thế giới, vì vậy các nghiên cứu về cách truyền lây của vi khuẩn này ñược nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Một ñặc ñiểm dịch tễ quan trọng của Salmonella là trạng thái mang trùng và thải trùng của gia súc. Theo Archie Hunter (2002)[14], một nguồn bệnh ñặc biệt quan trọng là gia súc mang vi khuẩn Salmonella nhưng không biểu hiện lâm sàng. Những con này có thể thải mầm bệnh ra ngoài môi trường trong vài tháng. Tác giả cũng cho biết cách lây lan như sau: Gia súc nhiễm bệnh thải vi khuẩn Salmonella vào trong phân và bệnh xảy ra do tiếp xúc trực tiếp hay ô nhiễm phân vào thức ăn, nước uống hay chuồng trại gia súc. Theo Gray và cs (1995)[54] , các lợn nhiễm S. choleraesuis thường biểu hiện các dấu hiệu lâm sàng từ 36-48 giờ sau khi nhiễm trùng và có 103- 106 ñơn vị vi khuẩn trong 1 gram phân vào giai ñoạn bệnh cao nhất. Cũng theo tác giả thì phần lớn những lợn nhiễm tự nhiên sau khi khỏi bệnh, có thể loại thải hoàn toàn vi khuẩn vào giữa 9-12 tuần sau khi nhiễm trùng. ðiều này cho thấy rằng tình trạng mang trùng lâu dài này có thể dẫn tới sự nhiễm khuẩn môi trường và sự tái nhiễm tiếp theo của những ñộng vật mới ñưa vào trại. Nhiều nhà khoa học khi nghiên cứu về ñường nhiễm Salmonella ñều cho rằng: Vi khuẩn Salmonella theo thức ăn, nước uống vào ñường tiêu hóa và có thể do tiếp xúc. Bình thường, chúng sống trong ống tiêu hoá mà không gây bệnh. Chỉ khi nào sức ñề kháng của lợn giảm sút, vi khuẩn xâm nhập vào máu và nội tạng gây bệnh. Bệnh Phó thương hàn chỉ gây thành dịch ñịa phương, dịch bệnh phụ thuộc vào cơ cấu ñàn, tình hình vệ sinh thú y, chế ñộ chăm sóc nuôi dưỡng và ñặc ñiểm dịch tễ học của cơ sở ñó (Phan Thanh Phượng, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………14 1988[23]; Nguyễn Như Thanh, 2001[28]; Laval, 2000[16]). Theo Phan Thanh Phượng (1988)[23], tỷ lệ lợn mắc bệnh do Salmonella gây ra thường tăng lên vào thời kỳ lợn cai sữa, vì lúc ñó cơ thể lợn con thay ñổi, dễ nhiễm bệnh. Nguyễn Như Thanh và cs (2001)[28], cũng cho biết: vi khuẩn gây ra bệnh Phó thương hàn cho lợn con từ 2 – 4 tháng tuổi với tỷ lệ tử vong khoảng 25%, có khi lên ñến 95%; bệnh có thể ở lợn lớn với thể mạn tính và ít gây chết. Bệnh ít xảy ra ở lợn con trước cai sữa, bởi chúng ñược bảo hộ nhờ kháng thể có trong sữa ñầu của lợn mẹ. Song nguy cơ nổ ra bệnh tăng dần theo lứa tuổi, ñặc biệt là sau cai sữa, khi mà khả năng miễn dịch chủ ñộng chưa thể bù ñắp kịp thời ñể thay thế miễn dịch thụ ñộng (Laval, 2000[16]). 2.2.6 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmoenlla hết sức phức tạp, bao gồm 3 loại chính: Kháng nguyên O (O- Antigen): Kháng nguyên thân. Kháng nguyên H (H- Antigen): Kháng nguyên lông. Kháng nguyên K (K- Antigen) hay kháng nguyên vỏ. * Kháng nguyên thân O (O- Antigen) Kháng nguyên O nằm ở thành tế bào vi khuẩn, có cấu trúc LipoPolySaccharide (LPS) là thành phần chính cấu tạo nên lớp màng ngoài của thành tế bào vi khuẩn Gram âm. Kháng nguyên O chịu nhiệt (Heat-stable) và kháng cồn, bị biến tính khi sử lý bằng formaldehyde. Kháng nguyên O gồm 2 nhóm chính: - Polysaccharide không có nhóm hydro, không mang tính ñặc trưng của kháng nguyên và chỉ tạo sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc từ dạng S (Smooth) sang dạng R (Rough) và dẫn ñến giảm ñộc lực của vi khuẩn (Selbitz, 1995[72]). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………15 - Polysaccharide nằm ở ngoài có nhóm hydro quyết ñịnh tính kháng nguyên và ñặc trưng cho từng serotyp. Kháng nguyên O ñược xem như là một nội ñộc tố (Endotoxin) mà nó ñược cấu tạo bởi nhóm hỗn hợp Glyco- polypeptide có thể tìm thấy ở màng ngoài của vỏ bọc vi khuẩn. Theo CIRAD (2006)[43], kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella có 67 loại chính, ñược chia thành hơn 50 nhóm, số còn lại ñóng vai trò phụ. * Kháng nguyên lông H (H- Antigen) - Kháng nguyên H (H-Antigen) là protein nằm trong thành phần lông của vi khuẩn, là loại kháng nguyên không chịu nhiệt (Heat labile), rất kém bền vững so với kháng nguyên O, bị phá hủy ở nhiệt ñộ 60oC sau 1 giờ, dễ phá hủy bởi cồn và axit yếu (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001[28]). - Kháng nguyên H gồm có 2 pha: Pha 1: có tính ñặc hiệu, gồm 28 loại kháng nguyên ñược biểu thị bằng chữ mẫu la tinh thường: a,b,c,d,...,z. Pha 2: Không có tính ñặc hiệu, gồm 6 loại ñược biểu thị bằng chữ số ả rập: 1,2,3,4,5,6 hay la tinh thường: e,n,x,.... Tuy nhiên, trong từng tế bào vi khuẩn riêng biệt luôn luôn chỉ xuất hiện từng pha, bởi vậy mà trong chẩn ñoán, ñể ñạt ñược một công thức kháng nguyên hoàn chỉnh cho Salmonella phải thay ñổi pha. Có các loài Salmonella như S. typhisuis, hoặc S. enteritidis... thì chỉ tạo 1 pha. Kháng nguyên H không quyết ñịnh yếu tố ñộc lực của vi khuẩn, cũng như không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, nhưng nó có ý nghĩa quan trọng trong việc xác ñịnh giống loài của vi khuẩn. * Kháng nguyên vỏ (K- Antigen)( hay Vi- Antigen) Theo Quinn và cs (2002)[68], kháng nguyên vỏ chỉ có ở một số loài như S. typhi, S. paratyphi. S. dublin cũng có thể mang kháng nguyên vỏ, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………16 kháng nguyên K có thể làm che các kháng nguyên thân O. Cũng theo tác giả, nếu ñun sôi huyễn dịch của các loài Salmonella này trong 10 ñến 12 phút sẽ phá hủy ñược kháng nguyên vỏ. Kháng nguyên vỏ là một loại kháng nguyên có khả năng ngưng kết kháng thể O khi phát triển nhiều. Kháng nguyên này chỉ gặp ở 2 serotyp là: S. typhi và S. paratyphi C, ký hiệu kháng nguyên hay Vi trong công thức ñứng sau kháng nguyên O. Theo sơ ñồ của Kauffmann – White; công thức kháng nguyên của S. paratyphi C là: 6,7, Vi: -1,5 và S. Typhi là: 9, 12, Vi: c,d. Trong 3 kháng nguyên chủ yếu trên, kháng nguyên O và kháng nguyên H là 2 loại kháng nguyên có ý nghĩa quan trọng trong công tác chẩn ñoán. 2.2.7 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella 2.2.7.1 Các yếu tố không phải là ñộc tố a) Kháng nguyên O Chất lượng thành phần hóa học, cấu trúc kháng nguyên O ñều ảnh hưởng tới ñộc lực của vi khuẩn Salmonella. Cụ thể là: S. typhimurium nếu thay ñổi thành phần kháng nguyên từ công thức 1, 4, 12 sang 1, 9, 12 thì vi khuẩn từ dạng có ñộc lực chuyển sang dạng không có ñộc lực (Valtonen, 1977[78]). Kháng nguyên O là yếu tố ñộc lực giúp vi khuẩn chống lại khả năng phòng vệ của vật chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tế bào tổ chức, chống lại sự thực bào của ñại thực bào (Morris và cs, 1976[60]). Kháng nguyên O khích thích các cơ quan ñáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể ñặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên tương ứng. Cơ chế phòng vệ này giúp cơ thể vật chủ chống lại quá trình tái xâm nhập của vi khuẩn. ðến nay, người ta ñã xác ñịnh ñược trên 3000 serotyp kháng nguyên O của Salmonella, thành phần kháng nguyên của vi khuẩn S. choleraesuis gồm: O6, O7; S. typhimurium gồm: O1, O4, O5, O12; S. enteritidis gồm: O1, O9, O12. b) Kháng nguyên H Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………17 Kháng nguyên H không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, cũng không quyết ñịnh yếu tố ñộc lực, tuy vậy nó có vai trò bảo vệ cho vi khuẩn không bị tiêu diệt bởi quá trình thực bào, giúp vi khuẩn sống và nhân lên trong các tế bào ñại thực bào, cũng như trong tế bào gan và thận (Weinstein và cs, 1984[79]). c) Kháng nguyên K Bản chất hóa học của kháng nguyên K là Polysaccharide, nhưng thực chất chúng chỉ là thành phần của kháng nguyên O. Kháng nguyên K tạo hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác ñộng ngoại cảnh và hiện tượng thực bào (Nguyễn Như Thanh, 2001[28]) d) Yếu tố bám dính Theo Jones và Richardson (1981)[56] khả năng bám dính của vi khuẩn Salmonella lên tế bào nhung mao ruột là bước khởi ñầu quan trọng trong quá trình gây bệnh. Hiện tượng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vừa mang tính chất lý hóa, vừa mang tính chất sinh học và ñược thực hiện theo 3 bước: Bước 1: Vi khuẩn liên kết từng phần với bề mặt tế bào, thực hiện quá trình này ñòi hỏi vi khuẩn phải có khả năng di ñộng. Bước 2: Là quá trình hấp phụ, phụ thuộc vào ñặc tính bề mặt của vi khuẩn và tế bào mà vi khuẩn bám dính và ñược thực hiện theo hướng thuận nghịch với sự tương hỗ của những tác ñộng khác nhau. Bước 3: Là quá trình tương tác giữa yếu tố bám dính của vi khuẩn với các ñiểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào. Yếu tố bám dính của vi khuẩn ñược sắp xếp trên các fimbriae. Theo Lê Văn Tạo (1993)[26], trên mỗi tế bào vi khuẩn Salmonella có từ 250- 400 fimbriae, chúng giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột non ñể gây bệnh. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………18 ðỗ Trung Cứ và cs (2003)[5] ñã công bố: S. typhimurium phân lập từ lợn mắc bệnh Phó thương hàn có khả năng bám dính lên bề mặt tế bào Vero với tỷ lệ cao (từ 70,76% - 93,48%). Kết quả này tương ñương với khả năng bám dính của chủng S. typhimurium chuẩn. e) Yếu tố xâm nhập Theo Finlay và cs (1988)[52], khả năng xâm nhập vào tế bào có nhân hoặc lớp niêm mạc của ñường ruột là ñặc tính của một số chủng Salmonella có ñộc lực. Các biến chủng Salmonella không có khả năng xâm nhập vào tế bào thường là các chủng không có ñộc lực. Sau khi tiếp cận tế bào vật chủ, vi khuẩn Salmonella tác ñộng làm tăng hàm lượng Ca++ nội bào, hoạt hóa Actin Depolimeriring Enzyme, làm thay ñổi cấu trúc, hình dạng các sợi actin, biến ñổi màng tế bào, dẫn ñến hình thành giả túc bao vây tế bào vi khuẩn dưới dạng các không bào chứa vi khuẩn. Sau ñó Salmonella ñược xâm nhập vào trong tế bào, tồn tại, tiếp tục nhân lên với số lượng lớn, phá vỡ tế bào vật chủ, sản sinh ñộc tố ñường ruột (Enterotoxin), làm xuất hiện quá trình tiêu chảy của vật chủ (Frost và cs, 1997[53]). f) Khả năng tổng hợp sắt Theo Benjamin (1985)[34], ñây là một yếu tố giúp vi khuẩn Salmonella tăng nhanh về số lượng làm suy yếu khả năng chống ñỡ của vật chủ do bị thiếu sắt. Cũng theo tác giả, vi khuẩn Salmonella có phản ứng với sự thay ñổi cơ chế chu chuyển sắt; khi quá trình tổng hợp sắt bị ức chế, chúng sẽ chuyển toàn bộ protein màng ñiều phối sắt lên bề mặt của tế bào vi khuẩn, làm cho khả năng hấp thu sắt tăng cường một cách rõ rệt. i) Khả năng kháng kháng sinh Khi vi khuẩn có sẵn những yếu tố gây bệnh thì khả năng kháng kháng sinh sẽ làm tăng tính gây bệnh của vi khuẩn lên gấp bội. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………19 Việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc kháng sinh ñể phòng trị bệnh, kích thích sinh trưởng của gia súc, gia cầm, ñã tạo ra nhiều giống vi khuẩn có khả năng kháng thuốc, mang plasmid kháng kháng sinh, tồn tại rất lâu trong cơ thể người, vật nuôi và môi trường. Khả năng kháng kháng sinh có thể thay ñổi, phụ thuộc vào ñịa phương, thời ñiểm làm kháng sinh ñồ và loại vật nuôi. Trên ñây là 7 yếu tố gây bệnh không phải là ñộc tố của vi khuẩn Salmonella. Các yếu tố này bằng những cơ chế tác ñộng khác nhau, phương thức tác ñộng khác nhau, ñã tạo ñiều kiện bất lợi cho cơ thể vật chủ, ñồng thời chúng lại tạo ñiều kiện thuận lợi cho vi khuẩn Salmonella gây bệnh. Chính vì thế các yếu tố không phải là ñộc tố ñóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella. Vì vậy, việc nghiên cứu các yếu tố này là hết sức cần thiết, góp phần quan trọng trong việc phòng chống bệnh do vi khuẩn Salmonella gây nên. 2.2.7.2 Các yếu tố là ñộc tố Nếu như các yếu tố gây bệnh không phải là ñộc tố là những tác nhân gián tiếp, quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella, thì các yếu tố gây bệnh là ñộc tố lại là tác nhân trực tiếp quyết ñịnh quá trình sinh bệnh. Các yếu tố gây bệnh là ñộc tố của Salmonella bao gồm: nội ñộc tố (Endotoxin), ngoại ñộc tố ñường ruột (Enterotoxin) và ñộc tố tế bào (Cytotoxin) (Finlay và Falkov, 1988[52]) a) ðộc tố ñường ruột (Enterotoxin) ðộc tố ñường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính: ðộc tố thẩm xuất nhanh RPF (Rapid Permeability Factor) và ñộc tố thẩm xuất chậm DPF (Delayed Permeability Factor) (Peterson, 1980[64]). + Theo Clarke và cs (1988)[44], ñộc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc thành phần giống với ñộc tố chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli (Heat-stabile toxin: ST). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………20 Yếu tố thẩm xuất nhanh giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột, và thực hiện khả năng thẩm xuất sau 1- 2 giờ, kéo dài 48 giờ và làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell). ST có khả năng chịu ñược nhiệt ñộ 100oC trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt ñộ thấp, có thể bảo quản ở - 20oC. Cấu trúc phân tử gồm nhiều polysaccharide và một số chuỗi polypeptide. ðộc tố RPF kích thích lên hệ thống men Guanylate Cyclase trong tế bào biểu mô ruột, chuyển GTP thành GDP. Trong tế bào, GDP tăng cao làm cho nồng ñộ ion Ca++ cũng tăng cao, dẫn ñến ngăn cản hấp thu chất ñiện giải và nước ở trong xoang ruột. Do vậy, lượng nước trong ruột tăng cao, kích thích niêm mạc ruột, tăng co bóp, làm gia súc ỉa chảy. Theo ðỗ Trung Cứ (2001)[4]: 72,7% các chủng Salmonella phân lập ñược từ lợn sau cai sữa bị ốm, chết nghi Phó thương hàn sản sinh ñộc tố chịu nhiệt. + Yếu tố thẩm xuất chậm của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống ñộc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli (Heat Labile Toxin: LT). Nó thực hiện chức năng thẩm xuất chậm từ 18- 24 giờ, có thể kéo dài 36- 48 giờ. DPF bị phá hủy ở 70oC trong vòng 30 phút và ở 56oC trong vòng 4 giờ. Cấu trúc phân tử gồm 3 chuỗi polypeptide và một số hợp chất khác, phân tử lượng 40.000- 50.000 dalton. ðộc tố thẩm xuất chậm của Salmonella làm thay ñổi quá trình trao ñổi nước và chất ñiện giải, dẫn ñến tăng cường bài xuất nước và chất ñiện giải từ mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thoái hóa lớp tế bào villi của thành ruột gây tiêu chảy. ðỗ Trung Cứ và cs (2003)[5] ñã kết luận: 81,81% số chủng S. typhimurium phân lập từ lợn mắc bệnh tiêu chảy sản sinh ñộc tố không chịu nhiệt (LT) có khả năng gây tích nước trong ruột non của lợn thí nghiệm. b) Nội ñộc tố (Endotoxin) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………21 Nội ñộc tố nằm ở lớp màng ngoài của tế bào vi khuẩn và ñược cấu tạo bởi thành phần cơ bản là Lipopolysaccharide (LPS). LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biệt với các ñặc tính và chức năng riêng biệt: Vùng ưa nước, vùng lõi và vùng lipit A. Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi Polysaccharide chứa các ñơn vị cấu trúc kháng nguyên O. Vùng lõi có bản chất là acid heterooligosaccharide, ở trung tâm, nối kháng nguyên O với vùng lipit A. Vùng lipit A ñảm nhận chức năng nội ñộc tố của vi khuẩn. Cấu trúc nội ñộc tố gần giống với cấu trúc của kháng nguyên O. Cấu trúc nội ñộc tố biến ñổi sẽ dẫn ñến sự thay ñổi ñộc lực của Salmonella. Các ñột biến gen ở vùng lõi, vùng ưa nước làm cho Salmonella không còn ñộc lực (Trần Quang Diên, 2002[8]). Lipit A có ái lực với màng tế bào, với lipit khác và với Protein. ðiều ñó chứng tỏ lipit A chính là trung tâm hoạt ñộng của nội ñộc tố. Vùng ña ñường Polysaccharide, chỉ giữ vai trò là vật mang các lipit không hòa tan (Bradley, 1979[39]). Nội ñộc tố là LPS ñược tiết ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải. Trước khi thể hiện ñộc tính, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: Tế bào lâm bao cầu B, lâm bao cầu T, tế bào ñại thực bào, tiểu cầu, tế bào gan lách. Rất nhiều các cơ quan trong cơ thể vật chủ chịu sự tác ñộng của nội ñộc tố LPS: Gan, thận, cơ, hệ tim mạch, hệ tiêu hóa và hệ thống miễn dịch với các biểu hiện bệnh lý như: Tắc mạch máu, giảm trương lực cơ, thiếu oxy mô bào, toan huyết, rối loạn tiêu hóa, mất tính thèm ăn. c) ðộc tố tế bào (Cytotoxin) ðặc tính chung của Cytotoxin là có khả năng ức chế tổng hợp Protein của tế bào có nhân và làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell) ða phần ñộc tố của chúng bị phá hủy bởi nhiệt ñộ. Theo Clarke và cs (1988)[44], làm tổn thương tế bào biểu mô là ñặc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………22 tính quan trọng của Cytotoxin. Có ít nhất là 3 dạng Cytotoxin: + Dạng 1: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với Trypsin. ðộc tố này có trọng lượng phân tử khoảng 56- 78 kDa, nó tác ñộng theo cơ chế là ức chế tổng hợp Protein của tế bào Hela và làm teo tế bào. + Dạng 2: Có nguồn gốc từ Protein màng ngoài tế bào vi khuẩn, có cấu trúc và chức năng gần giống với các dạng ñộc tố tế bào do Shigella và các chủng Enterotoxigenic E. coli (ETEC) sản sinh ra. Dạng ñộc tố này cũng có ở hầu hết các serovar Salmonella gây bệnh. + Dạng 3: Dạng này có liên quan với Hemolysin. Dạng ñộc tố này tác ñộng lên tế bào theo cơ chế dung giải các không bào nội bào. Trong phòng thí nghiệm, ñộc tố này gây chết tế bào Vero, tế bào Hela và tế bào CHO (Rahman và cs, 1992[69]). Trên ñây là 3 loại ñộc tố gây bệnh chính của vi khuẩn Salmonella, chúng là các tác nhân trực tiếp, quyết ñịnh khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Một số serotyp như: S. choleraesuis, S. typhimurium, S. enteritidis, S. dublin, S. gallinarum, S. pullorum có mang các plasmid có kích thước lớn (khoảng từ 50- 100 kb). Chính những plasmid này có mang các yếu tố di truyền quyết ñịnh khả năng sản sinh các yếu tố ñộc lực gây bệnh cho người và gia súc với tỷ lệ ốm và chết cao (Krause và Fang, 1995[59]). 2.3 Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn 2.3.1 ðặc tính sinh bệnh Theo Quinn và cs (2002)[68], sự lây truyền Salmonella thường qua con ñường phân-miệng, nhưng nhiễm trùng qua niêm mạc của kết mạc mắt và ñường hô hấp trên cũng có khả năng xảy ra. Cũng theo Quinn và cs (2002)[68], Salmonella cần xâm nhập vào ruột non và kết tràng ñể gây bệnh ñường ruột. Tuy nhiên, những axit hữu cơ bay hơi ñược sản sinh bởi hệ vi sinh vật yếm khí bình thường trong ñường ruột có khả năng ức chế sự phát triển của Salmonella. Hệ vi sinh vật hiếu khí bình Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………23 thường cũng có thể ngăn cản việc tiếp xúc với các vị trí bám gắn cần cho loài Salmonella. Sự rối loạn của hệ vi sinh vật do các yếu tố như: Dùng kháng sinh, khẩu phần ăn, mất nước làm tăng khả năng mẫn cảm của vật chủ với sự nhiễm trùng. Nhu ñộng ruột giảm, stress do vận chuyển và chật chội cũng tạo ñiều kiện cho sự xâm nhập ñường ruột của Salmonella. Mầm bệnh sau khi nhiễm vào ñường tiêu hoá, nhanh chóng ñi vào hệ lâm ba của ruột gây viêm sưng hạch, từ ñó vào hệ tuần hoàn, gây bại huyết, làm cho lá lách sưng to, lúc ñầu do tụ máu, về sau do tăng sinh, sản sinh nội ñộc tố, gây viêm hoại tử gan và hạch. Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn có 2 dạng chủ yếu: Thể nhiễm trùng huyết do S. choleraesuis var kunzendorf gây ra và thể viêm ruột do S. typhimurium. 2.3.2 Thể nhiễm trùng huyết do S. choleraesuis var kunzendorf gây ra Bệnh Phó thương hàn lợn thể nhiễm trùng máu xảy ra chủ yếu ở lợn sau cai sữa do S. choleraesuis var Kunzendorf gây nên (Laval, 2000[16]). Lợn bệnh bỏ ăn, ủ rũ, thích nằm tập trung lại với nhau ở góc chuồng tối hay chui vào ổ rơm, thân nhiệt tăng cao 40,5 – 41,6oC. Mí mắt sưng mọng có nốt tím bầm, viêm kết mạc. Khi bị biến chứng, gây viêm phổi, ho khan, có dịch ñờm. Xuất huyết lấm tấm dưới da, tụ lại thành những vết ñỏ thẫm trên da bụng và tai. Sau 3 – 4 ngày bị mắc bệnh, lợn ỉa chảy có màu vàng. Tác ñộng lâm sàng của bệnh Phó thương hàn thể nhiễm trùng máu rất nghiêm trọng và gây chết. Trong các ổ dịch, tỷ lệ lợn bệnh chết ở mức cao, tỷ lệ những con ốm không cố ñịnh, thường dưới 10% tổng ñàn (Wilcock, 1995)[81]. Ở thể á cấp tính, hiện tượng ỉa chảy xuất hiện sau 2 – 3 ngày, rồi kéo dài cho ñến khi lợn chết hoặc khỏi bệnh. Phân bài xuất nhiều lần trong ngày, sau ñó phân chảy ra liên tục, phân có màu vàng, vàng xám, vàng nâu ở lợn con, còn ở lợn trưởng thành phân nhão, phân nước có lẫn máu. Lợn gầy sút nhanh (Laval, 2000[16]). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………24 Trên da lợn trưởng thành mắc bệnh cũng xuất hiện các mảng da bị ñỏ, hoặc tím bầm ở vùng bụng, tai, bẹn,… sau ñó xuất hiện chứng viêm phổi, lợn ho, thở dốc. Những lợn như vậy thường bị chết do chứng viêm phổi thứ phát 15 ngày sau khi bị bệnh. Tỷ lệ lợn chết ở lợn bị bệnh thể á cấp tính khoảng 40 – 45%. Lợn bị bệnh thường mang trùng và ñều ñặn thải mầm bệnh ra ngoài theo phân, nhưng khó phát hiện một cách chính xác (Laval, 2000[16]). * Bệnh tích ñại thể: Khi mổ khám lợn bệnh, những bệnh tích ñại thể quan sát ñược bao gồm: Các vết tím xanh ở rìa tai, trên bề mặt da bụng, bẹn, chân và ñuôi; xuất huyết lấm tấm dưới da; hạch màng treo ruột, lách và hạch bạch huyết xưng phồng lên, các thuỳ lách cứng lại. Trên bề mặt gan có ñiểm hoại tử nhỏ màu hơi trắng. Xuất hiện những ñám hoại tử màu hồng như trứng gà tây ở thận và phổi viêm (Trương Văn Dung và Yoshihara Shinobu, 2002[9]). * Bệnh tích vi thể: Lưới nội mô và hạch bạch huyết tăng trưởng; hoại tử ñiểm trắng ở gan; xuất huyết và hoại tử ở hạch bạch huyết của màng treo ruột, màng phổi, màng bụng, màng bao tim, thận và màng não lấm tấm xuất huyết (Trương Văn Dung và Yoshihara Shinobu, 2002[9]). Theo Wilcock (1995)[81], dấu hiệu biến ñổi bệnh tích vi thể là do Salmonella gây ra là ở hạch lympho màng treo ruột: Sưng, xung huyết, xuất huyết và có ñiểm hoại tử màu xám, trên bề mặt gan thấy xuất hiện ñiểm hoại tử mô bào. Những biến ñổi bệnh tích vi thể ở lợn do Salmonella gây ra là không hề trùng lặp với bất cứ bệnh nào khác ở lợn. * Chẩn ñoán: Chẩn ñoán bệnh Phó thương hàn thể nhiễm trùng máu do S. choleraesuis var Kunzendorf gây nên không thể chỉ dựa trên các triệu chứng lâm sàng ñơn lẻ, vì các triệu chứng lâm sàng của bệnh giống như nhiều triệu chứng nhiễm trùng khác ở lợn như bệnh nhiễm trùng do Streptoccocus, bệnh ðóng dấu lợn… Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………25 2.3.3 Thể viêm ruột do S. typhimurium Bệnh Phó thương hàn thể viêm ruột thường do các serotyp S. typhimurium gây ra ở lợn con từ sau cai sữa ñến khoảng 4 – 6 tháng tuổi. Các thể bệnh hay gặp là cấp tính hoặc mãn tính (Laval, 2000[16]). * Triệu chứng: Thời kỳ nung bệnh thường từ 3 – 4 ngày. Một trong những triệu chứng ñầu tiên là ỉa chảy, phân dạng nước màu vàng, lẫn máu và chất nhầy. Lợn ốm bỏ ăn, thường uống nhiều nước. ðợt sốt ñầu tiên kéo dài chừng một tuần, tiếp theo một thời kỳ không sốt mấy ngày, rồi lại tiếp tục sốt. Ở một số lợn ốm thấy bị viêm khớp, chân bị què, ñứng không vững, ñi xiêu vẹo. Ngoài triệu chứng tiêu chảy, lợn ốm còn bị viêm phổi, lợn ho, thở gấp, nước mũi chảy nhiều. Hầu hết lợn bệnh bình phục nếu ñược ñiều trị kịp thời, nhưng chủ yếu chuyển sang thể mãn tính kéo dài vài tháng. Tỷ lệ lợn chết dao ñộng từ 40% – 50%. Số con còn sống sót chậm lớn, còi cọc. Những lợn khỏi bệnh thường mang trùng và thải mầm bệnh ra ngoài môi trường (Laval, 2000[16]). * Bệnh tích ñại thể Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2004)[17], bệnh tích thường thấy ở ruột, nhất là ruột già. Trong thể cấp tính, niêm mạc ruột thấm máu tràn lan, khi cắt ra trông giống như mỡ và có thể có màng giống như sợi huyết phủ ở trên, lách sưng to và dai như cao su. Trong thể mạn tính, bệnh tích ñặc biệt là thối loét ở niêm mạc ruột. Những mụn loét to hay nhỏ, màu vàng xanh hoặc xám, chứa ñầy một thứ bã ñậu, xung quanh có bờ ñỏ và nhẵn. Van hồi manh tràng bị loét cúc áo, có phủ một lớp màng (Trương Văn Dung và Yoshihara Shinobu, 2002[9]). * Bệnh tích vi thể: Sự hoại tử nông hay sâu trên bề mặt của lớp tế bào biểu mô ruột là những bệnh lý vi thể ñặc trưng của thể viêm ruột; có trường hợp thấy nổi gồ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………26 lên khỏi niêm mạc xung huyết của ruột những hạt tròn như hạt ñậu màu trắng vàng. Phần ñầu lông nhung trong hồi tràng bị teo ngắn lại. ða số trường hợp thấy mảng payer bị loét dưới ñáy như phủ một lớp tổ chức hoại tử màu vàng trắng, niêm mạc dạ dày có ñiểm chảy máu rải rác, có một số loét nhỏ tập trung ở bờ cong nhỏ. Gan xung huyết, trên bề mặt gan có thể thấy những nốt u nhỏ (áp xe) mang tính ñặc trưng cho thể bệnh không giống với ñiểm hoại tử trong thể nhiễm trùng huyết (Phạm Sỹ Lăng và cs, (2004)[17]). * Chẩn ñoán: + Chẩn ñoán lâm sàng: Ở thể viêm ruột của bệnh Phó thương hàn, căn cứ vào các triệu chứng ñiển hình như viêm ruột và dạ dày ở lợn con từ sau cai sữa ñến 4 tháng tuổi. ðồng thời, dựa vào kết quả nuôi cấy, phân lập vi khuẩn trên môi trường pepton và kiểm tra di ñộng trên môi trường thạch và xét nghiệm huyết thanh học. + Chẩn ñoán phân biệt với bệnh hồng lỵ; Chứng viêm ruột do Campylobacter (PHE); Viêm ruột hoại tử; bệnh viêm dạ dày ruột (Transmission Gasto Enteritis- TGE); tiêu chảy ở lợn do E. coli. Một số tác nhân gây tiêu chảy do vi rút như Rotavirus và Coronavirus gây viêm ruột, bệnh dịch tả lợn, các loại ký sinh trùng như cầu trùng Coccidia… - Ở bệnh Phó thương hàn, thân nhiệt lợn ốm vẫn giữ cao (41 – 42oC) trong suốt thời gian lợn bị ỉa chảy, ñiều ñó hoàn toàn khác với bệnh hồng lỵ. Hiện tượng tím tái nhiều khu vực trên da lợn bị bệnh Phó thương hàn cũng khác với lợn bị bệnh hồng lỵ. Ở lợn bị bệnh hồng lỵ, phân có màu xám, xám- ñen, ñen, ñen nâu, hiện tượng này không có ở lợn bị bệnh Phó thương hàn. Lách ở lợn bị bệnh hồng lỵ không bị sưng và không có những biến ñổi ñặc trưng. Màng niêm mạc ruột ở lợn bị bệnh hồng lỵ thường phủ một lớp biểu bì hoại tử, hiện tượng này không có ở lợn bị bệnh Phó thương hàn. ðể có thể phân biệt rõ các loại bệnh này thường phải tiến hành các xét Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………27 nghiệm kiểm tra vi khuẩn trong phòng thí nghiệm. - Ở bệnh viêm ruột do Campylobacter (PHE) thể cấp tính có thể thấy xuất huyết ruột hay tiêu chảy cấp tính hoặc mãn tính, tổn thương thường lan tràn, làm mất ñi những bệnh tích nhỏ, lớp niêm mạc nằm dưới các ổ hoại tử có dấu hiệu tăng sinh rất rõ. ðể tránh nhầm lẫn, cần xét nghiệm, phân lập vi khuẩn. - ðối với bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn C. perfringens, bệnh xuất hiện trong vòng một vài ngày ñầu của lợn sơ sinh, lợn bệnh không sốt. Hiện tượng tiêu chảy làm cho niêm mạc hậu môn bị tổn thương, có màu ñỏ. Lợn bệnh chết nhanh. Giải phẫu ruột thấy có phủ một lớp hoại tử màu vàng hoặc những khối hơi sáng, dễ nát, dính chặt vào niêm mạc ruột. Nhung mao của không tràng và tiểu nang là nơi xét nghiệm thấy trực khuẩn Gram (+) (Trương Văn Dung và Yoshihara Shinobu, 2002[9]). - Bệnh viêm dạ dày ruột (TGE) thường mắc và tỷ lệ chết cao ở lợn dưới 2 tuần tuổi. Khi mổ khám, thấy dạ dày sưng to với các cục sữa vón, ruột non sưng to với bọt khí màu vàng và hình thành các cục sữa do không tiêu hoá ñược, thành ruột mỏng, gần như trong suốt. Các lông nhung của không tràng và hồi tràng bị teo ñi. - Chẩn ñoán phân biệt bệnh do Salmonella gây ra ở lợn với các bệnh do E. coli và bệnh dịch tả lợn có ý nghĩa rất quan trọng trong thực tiễn. - Lợn bị tiêu chảy do vi khuẩn E. coli gây ra ở lứa tuổi sau cai sữa (4- 9 tuần tuổi) cũng khá phổ biến, lợn có biểu hiện phù mắt, phù ñầu nên còn gọi là bệnh phù ñầu lợn con. Mổ khám bệnh tích thấy tụ máu trong ruột non, có thể nhìn thấy chất chứa trong ruột non vì thành ruột mỏng và lông nhung không bị phá huỷ. Ở bệnh do Salmonella, lợn tím vành tai, da bụng và vùng bẹn. Các biến ñổi bệnh lý ở ruột có tính ñặc trưng như mô tả về phần bệnh tích ñại thể và vi thể của bệnh do Salmonella. - Bệnh dịch tả lợn xảy ra và lây lan nhanh ở tất cả các lứa tuổi lợn. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………28 Hiện tượng ỉa chảy ở lợn bị bệnh dịch tả lợn xuất hiện khi nhiệt ñộ cơ thể giảm, khi sốt cao lợn lại táo bón; còn ở bệnh Phó thương hàn lợn bị ỉa chảy khi thân nhiệt sốt cao 2 – 3 ngày. Mổ khám bệnh tích lợn bị bệnh dịch tả thấy xuất huyết ở khắp các hệ thống cơ quan như hạch lympho, thận, bàng quang và da, nhồi huyết ở lách, hạch lympho có màu ñá hoa cương, viêm loét hình cúc áo trên niêm mạc bị viêm. ðiều trị bằng kháng sinh, lợn không khỏi bệnh, trong khi dùng kháng sinh ñiều trị bệnh Phó thương hàn có tỷ lệ khỏi cao. 2.4 Biện pháp phòng trị bệnh do Salmonella gây ra ở lợn 2.4.1 Phòng bệnh Phòng bệnh Phó thương hàn cho lợn, nhất là ở những nơi chăn nuôi lợn tập trung quy mô lớn và chăn nuôi lợn nái có nhiều lợn con là một việc quan trọng, vì ñặc ñiểm dịch tễ của căn bệnh là vi khuẩn Samonella không dễ dàng khống chế và yêu cầu của quá trình phòng bệnh là phải thực hiện ñược triệt ñể các nội dung như tiêm phòng vacxin, vệ sinh khử trùng tiêu ñộc, quản lý chăn nuôi, sử dụng chế phẩm sinh hoá học… 2.4.2 ðiều trị bệnh Hiệu quả chữa bệnh phụ thuộc rất nhiều vào các biện pháp phòng bệnh tổng hợp._.A DT104 1 HP-S7 Gan Hải Phòng 16 + + - 2 HN-S8 Lách Hà Nội <8 + + - 3 HN-S1 Lách Hà Nội 8-16 + + - 4 HN-S2 Gan Hà Nội <8 + + - 5 HP-S17 Hạch ruột Hải Phòng <8 + + - 6 TB-S18 Gan Thái Bình 16 + + - Thí nghiệm ñược bố trí như sau: Chọn 14 lợn với tiêu chuẩn: Lợn 35 ngày tuổi, khỏe mạnh, có trọng lượng tương ñương nhau, chưa tiêm vacxin phòng bệnh do Salmonella gây ra và âm tính với kháng thể kháng Salmonella. Tiến hành chia làm 2 lô: Lô thí nghiệm có 12 con và lô ñối chứng 2 con. Ở lô thí nghiệm, lợn ñược tiêm ñồng thời vào phúc xoang 6 ml và cho uống 10 ml canh trùng các chủng Salmonella tương ứng ñã nuôi cấy ở 37oC trong 24 giờ (1 ml canh trùng ≈ 1x 109 vi khuẩn) . Mỗi chủng vi khuẩn gây bệnh cho 2 lợn. Lợn ở lô ñối chứng ñược tiêm và cho uống môi trường nước thịt vô trùng với các liều tương tự. Theo dõi lợn hàng ngày sau khi gây bệnh. Kết quả thu ñược trình bày ở bảng 4.10. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………73 Bảng 4.10 Kết quả gây bệnh thực nghiệm Salmonella trên lợn 35 ngày tuổi Chủng vi khuẩn Kí hiệu chủng Số lợn gây bệnh (con) ðường gây bệnh Liều canh trùng (ml) Số lợn chết (con) Thời gian chết (giờ) Triệu chứng sau gây bệnh Kết quả phân lập lạiVK Uống 10 HP-S7 2 Xoang PM 6 2 28-32 Chết có vết bầm ñỏ tím ở rìa tai, chân, bụng, ñuôi. S. choleraesuis Uống 10 S. choleraesuis HN-S8 2 Xoang PM 6 2 48 Chết có vết bầm ñỏ tím ở rìa tai, chân, bụng, ñuôi. S. choleraesuis Uống 10 HN-S1 2 Xoang PM 6 2 48-72 Tiêu chảy nặng, chết. S. typhimurium Uống 10 S. typhimurium HN-S2 2 Xoang PM 6 2 68-72 Tiêu chảy nặng, chết S. typhimurium Uống 10 HP-S17 2 Xoang PM 6 2 60-72 Tiêu chảy nặng, chết S. enteritidis Uống 10 S. enteritidis TB-S18 2 Xoang PM 6 2 72-96 Tiêu chảy nặng, chết S. enteritidis Uống 0 ð/C 2 Xoang PM 0 0 - Bình thường - (Ghi chú: 1ml canh trùng ≈ 109 vi khuẩn) 74 Kết quả bảng 3.10 cho thấy: Sau khi gây bệnh, tất cả lợn ở lô thí nghiệm (12/12 con) ñều bị chết trong khoảng thời gian từ 28 - 96 giờ. Trong ñó, cả 2 chủng vi khuẩn S. choleraesuis ñều gây chết 100% lợn thí nghiệm trong vòng 28 - 48 giờ. ðiều này chứng tỏ các chủng S. choleraesuis này có ñộc lực rất cao, gây bệnh cho lợn ở thể cấp tính. Các triệu chứng lâm sàng trước khi lợn chết bao gồm: Cả 4 lợn ñều sốt rất cao 42oC, toàn thân nổi mẩn ñỏ, nhất là ở những vùng da mỏng như: Rìa tai, mõm, vùng bụng, lợn ỉa chảy, phân dạng nước màu vàng, lẫn máu và chất nhầy. Lợn ốm bỏ ăn, thường uống nhiều nước..... Cả 4 lợn gây bệnh bằng các chủng S. typhimurium ñều chết trong vòng 48-72 giờ. Tương tự, 4 lợn gây bệnh bằng các chủng S. enteritidis ñều chết trong thời gian 60 - 96 giờ. Tất cả những lợn này ñều bị tiêu chảy nặng sau 24 giờ gây bệnh. Tất cả lợn chết ñều ñược mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy chất chứa ruột non, hạch ruột, gan, lách, máu tim nuôi cấy trên các môi trường và ñều phân lập lại ñược ñúng loại vi khuẩn ñã gây bệnh. Bệnh tích của các lợn chết ñược mổ khám mà chúng tôi tổng hợp ñược cũng tương tự những mô tả về bệnh tích của tác giả Phan Thanh Phượng (1988)[23], Phạm Sỹ Lăng và cs (2004)[17]. Theo chúng tôi, trong cơ thể lợn bị tiêu chảy có rất nhiều vi khuẩn Salmonella. Vi khuẩn này tiết ra ñộc tố, tác ñộng gây rối loạn trung khu ñiều hòa thân nhiệt và làm cho con vật sốt, tiếp ñó Enterotoxin (gồm yếu tố thẩm xuất nhanh, yếu tố thẩm xuất chậm) kích thích niêm mạc ruột, làm quá trình tiêu chảy thêm trầm trọng. Quá trình tiết dịch tiêu hóa bị rối loạn, lợn mất tính thèm ăn hoặc bỏ ăn, kèm theo quá trình mất nước và chất ñiện giải qua phân, lợn bị tiêu chảy và gầy sút nhanh chóng. Kết quả mổ khám các lợn chết ñược trình bày ở bảng 4.11 75 Bảng 4.11 Bệnh tích ñại thể các lợn gây bệnh thực nghiệm Cơ quan Bệnh tích Số lợn mổ khám Số lợn có bệnh tích Tỷ lệ (%) Da Tụ máu ở vùng thấp, vùng xa tim, xuất huyết ở ngực, bụng. 12 12 100,0 Phổi Viêm, ñỏ lấm tấm, phù, tích nước 12 8 66,66 Dạ dày Niêm mạc viêm ñỏ, xuất huyết 12 12 100,0 Ruột non Căng, xuất huyết, niêm mạc sưng. 12 12 100,0 Ruột già Van hồi manh tràng có nốt loét, niêm mạc sưng, xuất huyết. 12 4 33,33 Hạch lâm ba Sưng to, ñỏ xuất huyết 12 12 100,0 Gan Sưng, tím sẫm có hoại tử màu trắng 12 8 66,66 Mật Túi mật căng 12 12 100,0 Lách Sưng to, sẫm màu. 12 12 100,0 Thận Sưng, xuất huyết lấm tấm 12 10 83,33 Qua bảng 4.11 chúng tôi thấy: 12/12 lợn mổ khám ñều có lá lách sưng to, phần giữa sưng to hơn, dai như cao su, màu xanh thẫm, cắt ra có màu tím, thấy rõ nang lâm ba sưng to. Hạch lâm ba sưng, mềm, ñỏ, thường ñỏ thẫm từ chu vi lan vào giữa. Thận có ñiểm xuất huyết ñỏ ở vỏ. Gan tụ máu, có nốt hoại tử bằng hạt kê. Niêm mạc dạ dầy và ruột viêm ñỏ, có ñiểm xuât huyết, có khi có nốt loét ñỏ bằng hạt ñậu. Phổi tụ máu, có các ổ viêm mới. 76 Những bệnh tích trên ñược quan sát ở tất cả các lợn gây bệnh, tuy mức ñộ có khác nhau ở từng cá thể và những bệnh tích này cũng gần như trùng hợp với những mô tả của các tác giả trong và ngoài nước như: Nguyễn Vĩnh Phước và cs (1970)[22], Wilcock và Schwartz (1992)[80]. Từ kết quả gây bệnh ở trên cho thấy: Tất cả 6 chủng vi khuẩn S. choleraesuis, S. typhimurium, S. enteritidis ñược chọn ñể gây bệnh ñều có ñộc lực rất cao và ñều có khả năng gây bệnh ñối với lợn. Hình 4.12 Gây bệnh thực nghiệm cho lợn 4.8 Kết quả chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh Salmonella cho lợn 4.8.1 Chế vacxin vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh Salmonella cho lợn Vacxin là một chế phẩm sinh học có chứa tác nhân gây bệnh hoặc sản phẩm của nó nhưng ñã ñược vô hoạt bằng formol, cũng có thể giảm ñộc lực bằng các phương pháp lý, hoá, sinh học nên không còn khả năng gây bệnh, 77 nhưng vẫn giữ ñược tính kháng nguyên. Khi ñưa vacxin vào cơ thể thì có khả năng kích thích cơ thể thực hiện ñáp ứng miễn dịch, hình thành kháng thể chủ ñộng, giúp cho cơ thể con vật chống lại các tác nhân gây bệnh hay sản phẩm ñộc của chúng khi xâm nhập vào lần sau. Ngày nay, biện pháp phòng bệnh bằng vacxin có thể coi là biện pháp khả thi nhất ñể khống chế các bệnh, trong ñó có bệnh do Salmonella gây ra. Tuy nhiên, trong quá trình sử dụng vacxin Phó thương hàn của các công ty, xí nghiệp thuốc Thú y sản xuất, chúng tôi thấy, hầu hết các vacxin Phó thương hàn hiện nay chỉ sử dụng duy nhất 1 loại kháng nguyên S. choleraesuis, do ñó có khả năng chỉ phòng ñược bệnh Phó thương hàn thể do serotyp này gây ra ở lợn. Mục tiêu của chúng tôi trong nghiên cứu này là chế tạo 1 loại vacxin ña giá có chứa một số các serotyp thường gặp nhất từ những trường hợp nhiễm bệnh Salmonella ở lợn ở một số tỉnh phía Bắc. Căn cứ vào kết quả phân lập, kết quả giám ñịnh các ñặc tính sinh vật hóa học, kết quả xác ñịnh các yếu tố gây bệnh và gây bệnh thực nghiệm trên bản ñộng vật, chúng tôi ñã chọn 3 chủng Salmonella, gồm 1 chủng S. choleraesuis, 1 chủng S. typhimurium và 1 chủng S. enteritidis phân lập từ lợn mắc bệnh có ñộc lực cao, có cấu trúc kháng nguyên ổn ñịnh và mang một số yếu tố gây bệnh ñể sản xuất thử nghiệm vacxin phòng bệnh Salmonella cho lợn. Theo Laval (2000)[16] tiêu chí ñể chọn một vacxin tốt phòng bệnh cho ñộng vật cần phải ñạt các yêu cầu sau ñây: - Không ñược gây phản ứng toàn thân; Có thể gây phản ứng cục bộ, nhưng những biểu hiện của phản ứng cục bộ phải biến mất trong vòng 24 giờ sau khi tiêm phòng. - Ngăn cản hoặc làm giảm sự nhân lên của bệnh nguyên khi sơ nhiễm. - Ngăn không cho xảy ra bệnh hoặc làm giảm cường ñộ của nó sau khi nhiễm. - Hiệu lực phòng bệnh cao và kéo dài. - Sử dụng và bảo quản dễ dàng, giá thành rẻ. 78 Chúng tôi ñã chế tạo vacxin dạng vô hoạt có bổ trợ keo phèn theo quy trình thường quy của Bộ môn Vi trùng - Viện thú y. Các chủng vi khuẩn S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis ñược nuôi cấy riêng rẽ theo 3 lô khác nhau bằng phương pháp lên men, sục khí. Sau 8 - 10 giờ lên men, sục khí, lấy mẫu kiểm tra thuần khiết bằng nhuộm Gram và kiểm tra ñậm ñộ vi khuẩn trong 1 ml canh trùng bằng phương pháp ñếm số khuẩn lạc mọc trên ñĩa thạch, sau ñó tiến hành vô hoạt vi khuẩn bằng Formol với nồng ñộ 0,5%. Kết quả ñược trình bày ở bảng 4.12 Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu các lô vacxin Chỉ tiêu kiểm tra Lô vacxin ðậm ñộ (109 vk/ml) Thuần khiết Vô trùng S. choleraesuis 19 ðạt ðạt S. typhimurium 22 ðạt ðạt S. enteritidis 16 ðạt ðạt Kết quả cho thấy: - ðậm ñộ vi khuẩn của lô S. choleraesuis ñạt khoảng 19x109 vi khuẩn/ml canh trùng, lô S. typhimurium là 22x109 vi khuẩn/ml canh trùng, còn lô canh trùng S. enteritidis là 16x109 vi khuẩn/ml. Với số lượng vi khuẩn yêu cầu trong 1 ml canh trùng ñể chế tạo vacxin phải ñạt tối thiểu 1,5x109 vi khuẩn thì các lô canh trùng nuôi cấy ñều ñủ tiêu chuẩn chế vacxin. - Cả 3 lô canh trùng ñều ñạt chỉ tiêu thuần khiết và canh trùng sau khi diệt Formol 0,5% ñều ñạt chỉ tiêu vô trùng khi kiểm tra trên các loại môi trường: Thạch máu, thạch nấm, nước thịt thường, nước thịt yếm khí,… Từ kết quả kiểm tra này cho thấy, cả 3 lô canh trùng ñều ñạt các chỉ tiêu cần thiết ñể có thể sử dụng làm vacxin. 79 4.8.2 Kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực vacxin trên chuột thí nghiệm. Sau khi ñã kiểm tra canh trùng của các chủng vi khuẩn S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis ñều ñạt các tiêu chuẩn dùng làm vacxin, tiến hành trộn lẫn các lô canh trùng với nhau theo tỷ lệ 1:1:1 ñể ñạt ñược một loại canh trùng ñồng nhất, ñiều chỉnh nồng ñộ của canh trùng, rôi bổ sung keo phèn với tỷ lệ 1/5 ñể ñảm bảo 1ml vacxin có chứa 4 – 5x109 vi khuẩn. Vacxin ñược ra chai (20 ml/chai), ñóng nút, gắn paraffin, dán nhãn, sau ñó tiến hành lấy mẫu ñể kiểm tra an toàn và hiệu lực trên ñộng vật thí nghiệm. - Kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng: Chọn 10 chuột khỏe mạnh, tiêm vacxin với liều 0,5 ml/con vào phúc xoang và 5 chuột ñược tiêm 0,2 ml/con nước trong ở phía trên lọ vacxin vào tĩnh mạch ñuôi. Theo dõi sau 7 ngày cho thấy tất cả chuột ñược tiêm vacxin ñều sống khỏe mạnh, không con nào có biểu hiện phản ứng sau khi tiêm. ðiều này khẳng ñịnh rằng vacxin ñã ñạt yêu cầu về ñộ an toàn trên ñộng vật thí nghiệm và có thể tiến hành kiểm tra hiệu lực của vacxin trên ñộng vật thí nghiệm. - Kiểm tra hiệu lực bảo hộ của vacxin trên chuột nhắt trắng: Chọn 10 chuột khỏe mạnh, mỗi chuột tiêm 0,2 ml vacxin vào dưới da và 5 chuột ñối chứng không tiêm vacxin. Sau 21 ngày, tiến hành thử thách với hỗn hợp canh trùng S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis với liều 10LD50 tương ứng với liều 0,5ml/con cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột ñối chứng. Kết quả thu ñược trình bày ở bảng 4.13. Bảng 4.13 Kết quả thử hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng Lô vacxin Số chuột tiêm (con) Liều tiêm vacxin (ml) Liều công (ml) Thời gian theo dõi Số chuột chết (con) Số chuột sống Tỷ lệ bảo hộ (%) TN 10 0,2 0,5 7 ngày 0 10 100 ð/C 5 0 0,5 24-48 giờ 5 0 0 80 Kết quả cho thấy: Ở lô thí nghiệm, chuột ñược tiêm vacxin với liều 0,2 ml/con, sau 21 ngày, chuột có miễn dịch nên ñều sống khỏe mạnh khi thử thách cường ñộc với hỗn hợp canh trùng S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis tương ứng với chủng sản xuất vacxin và ñược ñánh giá là 100% số chuột ñược bảo hộ. Trong khi ñó, cả 5 chuột ở lô ñối chứng không ñược tiêm vacxin, sau khi công cường ñộc với liều tương tự ñều bị chết trong vòng 24 giờ (tỷ lệ chết 100%) và ñều phân lập lại ñược vi khuẩn Salmonella từ máu tim. Tổng hợp các kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực bảo hộ của vacxin trên chuột bạch của lô vacxin chế thử, so sánh với tiêu chuẩn của Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y Trung Ương I về kiểm nghiệm vacxin chết có bổ trợ keo phèn, cho phép ñánh giá: Lô vacxin ñạt chỉ tiêu an toàn 100% và có hiệu lực bảo hộ cao trên chuột bạch (100%), ñủ tiêu chuẩn ñể tiến hành kiểm tra các bước tiếp theo ñể ñánh giá hiệu quả sử dụng của vacxin trên bản ñộng vật. 81 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 1. Tỷ lệ trung bình phân lập ñược vi khuẩn Salmonella từ các mẫu phân và phủ tạng thu thập từ 5 ñịa phương khác nhau là 54,73%. 2. Tỷ lệ phân lập ñược Salmonella cao nhất ở hạch màng treo ruột (52,94%), chất chứa ruột non (50,00%) sau ñó là lách (41,18%), gan (32,35%), và thấp nhất là máu tim (23,53%). 3. Các chủng Salmonella phân lập ñược mang ñầy ñủ các ñặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella như các tài liệu trong và ngoài nước ñã mô tả. 4. Kết quả xác ñịnh serotyp cho thấy: 12,31% là S. choleraesuis, 38,46% là S. typhimurium, 24,62% là S. enteritidis, 9,23% là S. derby, 6,15% là S. rissen, 1,54% là S. anatum, 7,69% là S. stanley. 5. Các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược mẫn cảm với Ofloxacin và Norfloxacin (100%), tiếp ñến là Ciprofloxacin (90%) và Neomycin (80%). Kháng hoàn toàn với Trimethoprim + Sulfamethoxazole (100%) và kháng cao với một số kháng sinh như: Cefazolin (80%) và Spectinomycin (75%). 6. 100% các chủng S. choleraesuis ñược kiểm tra có mang gen Stn và InvA; 100% các chủng S. typhimurium có mang gen Stn và 96,0% các chủng có mang gen InvA; 93,7% các chủng S. enteritidis có mang gen Stn và 87,50% các chủng gen InvA. Không có chủng vi khuẩn nào mang gen DT104. 7. Tất cả các chủng vi khuẩn ñem thử ñều có ñộc lực cao, gây chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 8 - 36 giờ sau khi tiêm. 8. Cả 6 chủng vi khuẩn Salmonella chọn gây bệnh cho lợn ñều có ñộc lực cao, giết chết hết lợn thí nghiệm trong vòng 28 - 96 giờ. 9. Cả 3 lô canh trùng S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis dùng chế tạo vacxin ñều ñạt các chỉ tiêu về: ðậm ñộ, thuần khiết, vô trùng, ñủ tiêu chuẩn dùng làm vacxin. 82 10. Lô vacxin ñược chế từ 3 chủng S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis ñạt chỉ tiêu an toàn 100% và có hiệu lực bảo hộ 100% trên chuột nhắt trắng. 5.2 ðề nghị Tiếp tục xác ñịnh hiệu lực và ñộ dài miễn dịch của vacxin, nhằm ñánh giá ñược hiệu quả phòng bệnh của vacxin trên lợn và nghiên cứu thử nghiệm trên diện rộng ñể áp dụng vào sản xuất. 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Võ Thị Trà An, Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Hữu Ngọc (2006), “Tình hình nhiễm Salmonella trong phân và thân thịt (bò, heo, gà) tại một số tỉnh phía Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr. 37-42. 2. Phùng Quốc Chướng (1995), Tình hình nhiễm Salmonella ở lợn tại vùng Tây Nguyên và khả năng phòng trị. Luận án PTS khoa học nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I Hà Nội. 3. Phùng Quốc Chướng (2005), “Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của một số thuốc kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập từ vật nuôi tại ðăkLăk”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr. 53. 4. ðỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh, Nguyễn Quang Tuyên (2001), “Kết quả phân lập và xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella spp gây bệnh Phó thương hàn lợn ở một số tỉnh miền núi phía Bắc”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 3, tr. 10-17. 5. ðỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh, Nguyễn Quang Tuyên, ðỗ Thị Lan Phương (2003), “Xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của Salmonella Typhimurium phân lập từ lợn bị tiêu chảy ở một số tỉnh miền núi phía Bắc”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 4, tr. 33-37. 6. ðỗ Trung Cứ (2004), Phân lập và xác ñịnh yếu tố gây bệnh của Salmonella ở lợn tại một số tỉnh miền núi phía Bắc và biện pháp phòng trị. Luận án Tiến sỹ nông nghiệp, Viện Thú y Quốc gia. 7. ðỗ ðức Diên (1999), Vai trò của E. coli và Salmonella trong hội chứng tiêu chảy lợn con ở Kim Bảng (Hà Nam) và thử nghiệm một số giải pháp phòng trị. Luận án Thạc sỹ Nông nghiệp. 8. Trần Quang Diên (2002), Nghiên cứu tình hình nhiễm, ñặc tính gây bệnh của Salmonella gallinarum pullorum trên gà công nghiệp và chế kháng 84 nguyên chẩn ñoán. Luận án Tiến sỹ nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội. 9. Trương Văn Dung, Yoshihara shinobu (2002), Cẩm nang chẩn ñoán tiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam. Viện Thú y Quốc gia và Tổ chức hợp tác quốc tế Nhật Bản. 10. ðào Trọng ðạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ (1995), Bệnh ñường tiêu hóa ở lợn. NXB Nông nghiệp, tr. 63- 96. 11. Trần Xuân Hạnh (1995), “Phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella trên lợn ở tuổi giết thịt”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 3, tr. 89-93. 12. Trần Thị Hạnh (2009), “Tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. tại cơ sở giết mổ lợn công nghiêp và thủ công nghiệp”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr. 51-56. 13. Nguyễn Bá Hiên (2001), Một số vi khuẩn ñường ruột thường gặp và biến ñộng của chúng ở gia súc khỏe mạnh và bị tiêu chảy nuôi tại vùng ngoại thành Hà Nội. Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội. 14. Archie Hunter (2002), Sổ tay dịch bệnh ñộng vật. Công ty in Thống nhất, Hà Nội. 15. Nguyễn Văn Lãm (1968), “Chế vacxin Phó thương hàn lợn con”. Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật thú y 1968- 1978, NXB Nông nghiệp, tr. 250- 289 16. Laval A (2000), “Dịch tễ Salmonellosis”. Báo cáo tại hội thảo về bệnh lợn tại Viện Thú y – Hà Nội tháng 6/2000, Tài liệu dịch của Trần Thị Hạnh – Viện Thú y. 17. Phạm Sỹ Lăng, Phan ðịch Lân, Trương Văn Dung (2004), Bệnh phổ biến ở lợn và biện pháp phòng trị. NXB Nông nghiệp. 18. Hồ Văn Nam, Nguyễn Thị ðào Nguyên, Trương Quang, Phùng Quốc Chướng, Chu ðức Thắng, Phạm Ngọc Thạch (1997), “Tình hình nhiễm 85 Salmonella và vai trò của Salmonella trong bệnh viêm ruột ỉa chảy ở lợn”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr. 39-45. 19. Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú, Nguyễn Thị Sở (1989), “Kết quả ñiều tra tình hình nhiễm vi khuẩn ñường ruột tại một số cơ sở chăn nuôi lợn”. Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật Thú y (1985- 1989). Viện Thú y, NXB nông nghiệp, Hà nội 1989, tr. 50-53. 20. Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú (1989), “Enterobacteria in diarrhoea pig”. Kết quả 20 năm nghiên cứu của Viện Thú y (1969 – 1989), Hà Nội, tr. 43. 21. Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh, ðỗ Ngọc Thuý (2000), “Phân lập vi khuẩn E.coli và Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác ñịnh một số ñặc tính sinh vật hoá học của các chủng vi khuẩn phân lập ñược và biện pháp phòng trị”. Kết quả nghiên cứu Khoa học kỹ thuật thú y (1996-2000), NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 171-176. 22. Nguyễn Vĩnh Phước (1970), Vi sinh vật học thú y. NXB ðại học và trung học chuyên nghiệp Hà Nội. 23. Phan Thanh Phượng (1988), Phòng và chống bệnh Phó thương hàn lợn. NXB Nông thôn, Hà Nội. 24. Hoàng Thị Phi Phượng, Trần Thị Hạnh (2004), “Ảnh hưởng của thức ăn gây nhiễm E.coli và Salmonella ñến biến ñổi bệnh lý và một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu ở lợn sau cai sữa”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 4, tr. 36-41. 25. Lê Minh Sơn (2003), Nghiên cứu một số vi khuẩn gây ô nhiễm thịt lợn vùng hữu ngạn sông Hồng. Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp. 26. Lê Văn Tạo (1993), “Phân lập, ñịnh danh vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho lợn”. Báo cáo khoa học mã số KN 02 – 15, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 27. Lê Văn Tạo, Nguyễn Thị Vui (1994), “Phân lập và ñịnh typ vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho lợn”. Tạp chí Nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, 86 số 11, tr. 430- 431 28. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương 2001. Vi sinh vật Thú y. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 29. Tô liên Thu (2004), “Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella và E.coli phân lập ñược từ thịt lợn và thịt gà tại vùng ñồng bằng Bắc bộ”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 4, tr. 29 – 35. 30. Tô Liên Thu (2005), Nghiên cứu tình trạng ô nhiễm một số vi khuẩn vào thịt lợn, thịt gà sau giết mổ ở Hà Nội và một số phương pháp làm giảm sự nhiễm khuẩn trên thịt. Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Thú y Quốc gia Hà Nội. 31. Tạ Thị Vịnh, ðặng Khánh Vân (1996), “Bước ñầu thăm dò và xác ñịnh E.coli và Salmonella trên lợn bình thường và lợn mắc hội chứng tiêu chảy tại Hà Tây và Hà Nội”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr. 41- 44. II. TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 32. Asai T, Otagiri Y, Osumi T, Namimatsu T, Hirai H and Sato S (2002), “Isolation of Salmonella from Diarrheic Feces of Pig”. J. Vet. Med. Sci. 64, 2, p. 159- 160. 33. Barners D.M, Sorensen K.D (1975), ”Salmonellosis”. Diseases of Swine, 4th Edition. Iowa State University press, p. 12-18. 34. Benjamin W.H, Turnbough C.N, Posey B.S and Briles D.E (1985), “The ability of Salmonella typhimurium to produce siderophore enterobactin, avirulence factors”. Infect. Immun, 50, p. 392-397. 35. Berends B.R, Van Kanpen F, Snijders J.M.A and Mossel D.A.A (1997), “Identification and quantification of risk factors regarding Salmonella spp. on fork carcasses”. Int. J. Food Microbiol, 36, p. 199-206. 36. Berends B.R, Van Knapen F, Mossel D.A.A, Burt S.A and Snij J.M.A (1998), “Impact on human health of Salmonella spp. on pork in the 87 Netherlands and the anticipated effects of some currently proposed control strategies”. Int. J. Food Mcrobiol, 44, p. 219-229. 37. Bergey’s (1994), Manual of determinative Bacteriology, 9th Edition, by the Williams and Wilkings Company. 38. Borch E, Nesbakken T and Christensen H (1996), “Hazard identification in swine slaughter with respect to foodborne”. Bacteria Int. J. Food Microbiol, 30, p. 9-25. 39. Bradley S.G (1979), “Cellular and molecular mechanisms of action of bacterial endotoxins”. Ann. Rev. Microbiol, 33, p. 67-94. 40. Bryan F (1988), “Risks associated with vehicles of foodborne pathogens and toxins”. J. Food Prot, 51, p. 498-508. 41. Chiu C.H and Ou J.T (1996), “Rapid identification of Salmonella serovars in feces by specific detection of the virulence genes, invA and spvC, by an enrichment broth culture – multiplex PCR combination assay”. J. Clin. Microbiol, 34, p. 2619-2622. 42. Chiu C.H, Su L.H and Chu C (2004), “Samonella enterica serotype Choleraesuis: Epidemiology, Pathogenesis, Clinical Disease and Treatment”. Clinical Microbiology Reviews 2, p. 311-322. 43. CIRAD “Training Course Salmonella”, 23 – 37 October 2006. 44. Clarke G.J, Wallis T.S, Starkey W.J, Collins J, Spencer A.J, Daddon G.J, Osborne M.P, Candy D.C and Stephen I (1988), “Expression of an antigen in strains of Salmonella typhimurium with antibodies tocholeratoxin”. Med. Microbiol, 25, p. 139-146. 45. Cleckner N, Roth J.R, Bostein D (1977), “Genetic engineering invivo using translocatable drug – resistance elements new methods in bacterial genetics”. Hol. Sen. Gonet , 116, p. 125 – 159. 46. Cloeckaert A, Praud K, Doublet B, Demartin M and Weill F.X (2006), “Variant Salmonella genomic island J – L antibiotic resistance gene 88 cluster in Salmonella enterica serovar Newport”. Antimicrob. Agents Chemother, 50, p. 3944-3946. 47. Cortez A.L.L, Carvalho A.C.F.B, Ikuno A.A, Bürger K.P and Vidal – Martins A.M.C (2006), “Identification of Salmonella spp. isolates from chicken abattoirs by multiplex – PCR”. Res. Vet. Sci, 81, p. 340-344. 48. Crosa J.H, Brenner D.J, Ewing W.H and Falkow S (1973), “Molecular relationship among Salmonella”. J. Bacteriol, 115, p. 307-315. 49. Ewing, Edward (1970), Indentification of Enterobacteriaceae. Edicion Revolucionnalria, Instituto Cubano Del libro 19 No 1002, Vedado Habana. 50. Euzéby J.P (1999), “Revised Salmonella nomenclature”: designation of Salmonella enterica. (ex. Kauffmann and Edwards 1952) Le Minor and Propoff 1987 sp. nov., nom. rev. as the neotype species of the genus Salmonella Lignieres 1900 (Approved Lists 1980), rejection of the name Salmonella choleraesuis (Smith 1894) Weldin 1927 (Approved Lists 1980), and conservation of the name Salmonella typhi (Schroeter 1886) Warren and Scott 1930 (Approvied Lists 1980), Request for an opinion. Int. J. Sist. Bacteriol, 49, p. 927-930. 51. Farmer J.J (1995), “Enterobacteriaceae: Introduction and identification”. p. 438-449. In Murray P.R, Baron E.J and Pfaller M.A (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 6th Edition, American Society for Microbiology, Washington D.C. 52. Finlay B.B and Falkow (1988), “Virulence factors associated with Salmonella species”. Microbiological Sciences Vol. 5, No.11. 53. Frost A.J, Bland A.P, Wallis T.S (1997), “The early dynamic respose of the calf ileal ephithelium to Salmonella typhimurium”. Vet – Pathol, 34, p. 369-386. 54. Gray J.T, Fedorka-Gray P.J and Stabel T.S (1995), “Influence of 89 inoculation route on the carrier state of Salmonella choleraesuis in swine”. Vet. Microbiol, 47, p. 43 – 49. 55. Griggs D.J, Hall M.C, Jin Y.F, and Piddock I.J.V (1994), “Quinolon resistantce in Veterinary Isolates of Salmonella”. J. Antimicrobiological Chemotherapy, p. 1173-1189. 56. Jones J.W, Richardson A.L (1981), “The attachment to invasion of helacells by Salmonella typhimurium the contribution of manose sensitive and manose – sensitive haemaglutinate activities”. J. Gen. Microbiol, V127, p. 361-370. 57. Khakhria R and Johnson W (1995), “Prevalence of Salmonella serotypes and phage types in Canada”. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 26 (Suppl. 2) p. 42-44. 58. Kishima M, Uchida i, Namimatsu T, Osumi T, Takahashi S, Tanaka K, Aoki H, Matsuura K and Yamamoto K (2008), “Nationwide Surveillance of Salmonella in the Faeces of Pigs in Japan”. 59. Krause M, Fang F.C, Gedaily A.E, Libby S and Guiney D.G (1995), “Mutational Ananysis of SpvR Binding to DNA in the Regulation of the Salmonella Plasmid Virulence Operon”. Academic Press. Inc. Plasmid, 34, p. 37-47. 60. Morris I.A, Wray C, Sojka W.J (1976), “The effect of T and B lymphocyte depletion on the protection of mice vaccinated with a get E mutant of Salmonella typhymurium”. Bristh J. of Exp, Path 57. 61. NCCLS (2000), Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. Approved standard, seventh edition edn. Pennsylvania, USA: The National Committe for Clinical Laboratory Standards, p. 5-10. 62. Nielsen B and Wegener H.C (1997), “Public health and pork and fork products: regional perspectives of Denmark”. Rev. Sci. Tech, 16, p. 90 513-524. 63. Nusera D.M, Maddox C.W, Hoien-Dalen P and Weigel R.M (2006), “Comparison of API 20E and invA PCR for identification of Salmonella enterica isolates from swine production units”. J. Clin. Microbiol, 44, p. 3388-3390. 64. Peteron J.W (1980), “Salmonella toxin”. Pharm Ather, VII, p. 719-724. 65. Plonait H, Bickhardt (1997), Salmonella infectionand Salmonella lehrbuchder Schweine Krankheiten. Parey Buchverlag, Berlin, p. 334 – 338. 66. Popoff M.Y (2001), Antigenic formulas of the Salmonella serovas. , 8th edition. WHO Collaborating Centre for reference and Research on Salmonella Institus Pasteur, Paris, France, p. 156. 67. Pritchett L.C, Konkel M.E, Gay J.M and Besser T.E (2000), “Identification of DT 104 and U 302 phage types among Salmonella enterica serotype Typhimurium isolates by PCR”. J. Clin. Microbiol, 38, p. 3484-3488. 68. Quinn P.J, Carter M.E, Makey B, Carter G.R (2002), Clinical veterinary microbiology. Wolfe Pulishing, London WC1 H9LB, England, p. 209- 236. 69. Rahman K, De Grandis S.A, Clarke R.C, McEwen S.A, Galán J.E, Ginocchio C, Curtiss III R and Gyles C.L (1992), “Amplification of a invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of Salmonella”. Mol. Cell. Probes, 6, p. 271-279. 70. Saitoh M, Tanaka K, Nishimori K, Makino S, Kanno T, Ishihara R, Hatama S, Kitano R, Kishima M, Sameshima T, Akiba M, Nakazawa M, Yokomizo Y and Uchida I (2005), “The artAB genes encode a putative ADP- ribosyltransferase toxin homologue associated with Salmonella enterica serova Typhimurium DT104”. Microbiology , 151, p. 3089-3096. 91 71. Schwartz K.J (1999), “Salmonellosis”. In: Straw, B. E., S. D Allaire, W. L. Mengeling, and D. J. Taylo (eds), Disease of Swine, p. 535-551. Iowa State University Press, Ames. 72. Selbitz H.J (1995), Grundsaetzliche Sicherheisanfornderungen bein Einsatz von lebendimpfstoffen bei lebensmittelliefernden Tieren. Berl Much. Tieruzl. Wschr, 144, p. 428-423. 73. Skyberg J.A, Logue C.M and Nolan L.K (2006),“Virulence genotyping of Salmonella spp. with multiplex PCR“. Avian Dis, 50, p. 77-81. 74. Su L.H, Chiu C.H, Kuo A.J, Chia J.H, Sun C.F, Leu H.S and Wu T.L (2001), “Secular trends in incidence and antimicrobial resistance among clinical isolates of Salmonella at a university hospital in Taiwan, 1983- 1999”. Epidemiol Infect, 127, p. 207-213. 75. Suzuki S, Komase K, Matsui H, Abe A, Kawahara K, Tamura Y, Kijima M, Danbara H, Nakamura M and Sato S (1994), “Virulence region of plasmid pNL2001 of Salmonella enteritidis”. Microbiology, 140, p. 1307-1318. 76. Timoney J.F, Gillespie J.H, Baelough J.E, Hagan and Bruner’s (1988), “Microbiology and infection disease of domentic animals”, Inthca and London Comstock Publising Associates, A Division of cornell University press, p. 209-230. 77. Tsolis R.M, Adams L.G, Fitcht T.A and Baumler A.J (1999), “Contribution of Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence factors to diarrheal disease in calves. Infect”. Immun, 67, p. 1879-1885. 78. Valtonen M.V (1977), “Role of phagocytosis in mouse virulence of Salmonella typhimurium recombinmant with O- antigen 6, 7 or 4, 12.” Infect. Immun, 18, p. 574. 79. Weinstein D.L, Carsiotis M, Lissner CH.R, Osrien A.D (1984), “Flagella help Samonella typhimurium survive within murine macrophages”. Infection 92 and Immuniti, 46. p. 819-825. 80. Wilcock B.P, Schwartz K.J (1992), “Salmonella”. Disease of Swine, 7th Edition, p. 570-583. 81. Wilcock B.P (1995), “Salmonellosis”. Disease of Swine, Sixth Edition, Iowa state University Press, U.S.A, p. 508-518. ._.