Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.COLI trong hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé tại Sơn La và thử nghiệm phác đồ điều trị

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LỪ VĂN TRƢỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ, YẾU TỐ GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN E. COLI TRONG HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÊ, NGHÉ TẠI SƠN LA VÀ THỬ NGHIỆM PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP THÁI NGUYÊN - 2008 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LỪ VĂN TRƢỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ, YẾU TỐ GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN E. COLI TRONG HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÊ, NGHÉ TẠI SƠN LA VÀ THỬ NGHIỆM PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ Chuyên ngành: THÚ Y Mã số: 60.62.50 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. CÙ HỮU PHÚ THÁI NGUYÊN - 2008 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là luận văn do tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ai công bố trong bất cứ cong trình nghiên cứu nào khác.Các tài liệu tham lhaor trích dẫn đều được ghi tên tác giả và tên tài liệu trích dẫn trong phần tài liệu tham khảo. Tác giả luận văn Lừ Văn Trường Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Nông lâm Thái nguyên, Viện Thú y, Chi cục Thú y Sơn La đã cho phép và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành bản luận văn này. Xin chân thành cảm ơn: GS.TS. Cù Hữu Phú; TS. Nguyễn Văn Sửu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa sau đại học trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, Bộ môn Vi trùng Viện Thú y, cùng toàn thể bạn bè đồng nghiệp đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo và toàn thể cán bộ công chức Chi cục Thú y tỉnh Sơn La, đặc biệt là KS. Lò Văn Tăng Chi cục trưởng Chi cục Thú y đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn trạm Thú y, cán bộ Thú y xã thuộc các huyện Thuận Châu, Mai Sơn, Yên Châu, Mộc Châu, Phù Yên và Sông Mã đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn. Để góp phần thực hiện thành công luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ đáng kể của gia đình và đồng nghiệp. Nhân dịp này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với mọi sự giúp đỡ quý báu đó. Tác giả luận văn Lừ Văn Trường Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu của đề tài 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Tình hình nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé 4 1.1.1. Nguyên nhân do vi khuẩn 4 1.1.2. Nguyên nhân do vi rút 6 1.1.3. Nguyên nhân do ký sinh trùng 6 1.1.4. Ảnh hưởng của môi trường, khí hậu 7 1.1.5. Ảnh hưởng của nuôi dưỡng không đúng kỹ thuật 8 1.2. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy ở bê, nghé 8 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 8 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước 14 1.3. Một số đặc tính của Vi khuẩn E. coli 16 1.3.1. Đặc tính về hình thái 16 1.3.2. Đặc tính nuôi cấy 16 1.3.3. Đặc tính sinh hoá 18 1.3.4. Sức đề kháng 18 1.3.5. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli 19 1.3.5.1. Kháng nguyên O (Somatic-kháng nguyên thân) 19 1.3.5.2. Kháng nguyên H (flagellar-kháng nguyên lông) 20 1.3.5.3. Kháng nguyên K (Capsular-kháng nguyên bề mặt) 21 1.3.5.4. Kháng nguyên giáp mô (kháng nguyên vỏ bọc) 21 1.3.5.5. Kháng nguyên K (Fimbriae-kháng nguyên bám dính) 22 1.4. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli 24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 1.4.1. Các yếu tố không phải là độc tố 24 1.4.1.1. Khả năng bám dính của vi khuẩn 24 1.4.1.2. Khả năng xâm nhập của vi khuẩn 26 1.4.1.3. Khả năng dung huyết 26 1.4.1.4. Khả năng kháng kháng sinh 27 1.4.1.5. Yếu tố kháng khuẩn của vi khuẩn 30 1.4.2. Độc tố-yếu tố gây bệnh của vi khuẩn 30 1.4.2.1. Ngoại độc tố (Exotoxin) 30 1.4.2.2. Nội độc tố (Endotoxin) 31 1.5. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E. coli 33 1.6. Bệnh tiêu chảy do vi khuẩn gây ra ở bê, nghé 36 1.6.1. Triệu chứng 36 1.6.2. Bệnh tích 37 1.6.3. Chẩn đoán bệnh 37 1.6.4. Phòng bệnh 38 1.6.5. Điều trị bệnh 39 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 40 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 40 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu 40 2.1.3. Thời gian nghiên cứu 40 2.2. Vật liệu dùng trong nghiên cứu 40 2.2.1. Mẫu bệnh phẩm 40 2.2.2. Môi trường, hoá chất, dụng cụ và động vật thí nghiệm 40 2.2.2.1. Các loại hoá chất môi trường 40 2.2.2.2. Động vật dùng cho thí nghiệm 41 2.2.2.3. Các loại kháng huyết thanh chuẩn để định type vi khuẩn E. coli phân lập được 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 2.2.2.4. Các loại hoá chất và môi trường dùng trong phản ứng PCR 41 2.2.2.5. Máy móc thiết bị 41 2.3. Nội dung nghiên cứu 41 2.3.1. Điều tra hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé nuôi tại Sơn La 41 2.3.2. Nuôi cấy phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy ở bê, nghé 42 2.3.3. Xác định đặc tính sinh vật, hoá học các chủmg vi khuẩn E. coli phân lập được 42 2.3.4. Xác định serotype vi khuẩn E. coli phân lập được 42 2.3.5 Xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli phân lập được 42 2.3.6. Xác định độc lực của vi khuẩn E. coli phân lập được trên động vật thí nghiệm 42 2.3.7. Xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được 42 2.3.8. Xây dựng một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy bê, nghé do vi khuẩn gây ra tại Sơn La 42 2.4. Phương pháp nghiên cứu 42 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ 42 2.4.1.1. Phương pháp chọn mẫu điều tra 42 2.4.1.2. Các phương pháp đo lường trong dịch tễ 42 2.4.2. Phương pháp lấy mẫu 43 2.4.3. Phương pháp phân lập và xác định của vi khuẩn E. coli 43 2.4.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn E. coli 43 2.4.3.2. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn E. coli 45 2.4.3.3. Giám định một số đặc tính sinh hoá chủ yếu của các chủng E. coli phân lập được 45 2.4.3.4. Xác định type của vi khuẩn E. coli phân lập được 48 2.4.3.5. Xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli phân lập được 48 2.4.4. Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn E. coli phân lập được trên động vật thí nghiệm 51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 2.4.5. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng E. coli phân lập được 51 2.4.6. Thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy bê, nghé do vi khuẩn E. coli gây ra tại Sơn La 52 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1. Một số đặc điểm dịch tễ của hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé tại Sơn La 53 3.1.1. Tỷ lệ bê, nghé bị tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại Sơn La 53 3.1.2. Tỷ lệ bê, nghé bị tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo lứa tuổi tại Sơn La 55 3.1.3. Tỷ lệ bê, nghé bị tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo mùa tại Sơn La 58 3.1.4. Bệnh tích đại thể ở bê, nghé bị chết do tiêu chảy tại Sơn La 60 3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy bê, nghé tại Sơn la 61 3.2.1. Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli từ phân bê, nghé bị tiêu chảy và bình thường 61 3.2.2. Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli từ một số loại bệnh phẩm bê, nghé bị chết do tiêu chảy 63 3.2.3. Biến động số lượng vi khuẩn E. coli ở phân bê, nghé bị tiêu chảy và bình thường 64 3.3. Kết quả giám định đặc tính sinh vật hoá học của các chủng E. coli phân lập được 65 3.4. Kết quả xác định type vi khuẩn E. coli phân lập được 66 3.5. Kết quả xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli phân lập được 69 3.5.1. Xác định khả năng dung huyết 69 3.5.2. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố chịu nhiệt và không 70 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 chịu nhiệt của một số chủng vi khuẩn E. coli phân lập được 3.5.3. Kết quả xác định yếu tố bám dính của vi khuẩn E. coli phân lập được 71 3.5.4. Tổ hợp các yếu tố gây bệnh mang trong các chủng E. coli phân lập được 72 3.6. Kết quả xác định độc lực vi khuẩn E. coli phân lập được bằng tiêm truyền chuột bạch 73 3.7. Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng E. coli phân lập được với một số loại kháng sinh 76 3.8. Kết quả một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy bê, nghé do vi khuẩn E. coli gây ra tại Sơn La 77 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 80 4.1. Kết luận 80 4. 2. Đề nghị 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 A. Tài liệu tham khảo bằng tiếng việt 83 B. Tài liệu tham khảo bằng tiếng nước ngoài 86 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU Trang Bảng 1.1. Các serotype và yếu tố gây bệnh chủ yếu của vi khuẩn E. coli ở bò, bê 13 Bảng 2.1. Chu trình của phản ứng PCR 50 Bảng 3.1. Kết quả xác định tỷ lệ bê, nghé tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại một số địa bàn Sơn La 54 Bảng 3.2. Kết quả xác định tỷ lệ bê, nghé tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo lứa tuổi tại một số địa bàn Sơn La 55 Bảng 3.3. Kết quả xác định tỷ lệ bê, nghé tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo mùa tại một số địa bàn Sơn La 59 Bảng 3.4. Bệnh tích đại thể ở bê, nghé bị chết do tiêu chảy tại Sơn La 61 Bảng 3.5. Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli từ phân bê, nghé tiêu chảy và bình thường tại Sơn La 62 Bảng 3.6. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn E. coli từ một số nội tạng bê, nghé chết do tiêu chảy tại Sơn La 64 Bảng 3.7. Kết quả xác định biến động số lượng vi khuẩn E. coli ở phân bê, nghé bị tiêu chảy và bình thường 65 Bảng 3.8. Kết quả giám định đặc tính sinh hoá các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được tại Sơn La 66 Bảng 3.9. Kết quả xác định type vi khuẩn E. coli phân lập được tại Sơn La 68 Bảng 3.10. Kết qủ xác định khả năng gây dung huyết của vi khuẩn E. coli phân lập được tại Sơn La 69 Bảng 3.11. Kết quả xác định độc tố đường ruột các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được tại Sơn La 70 Bảng 3.12. Kết quả xác định yếu tố bám dính vi khuẩn E. coli phân 71 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 lập được Bảng 3.13. Tổ hợp các yếu tố gây bệnh mang trong các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được 72 Bảng 3.14. Các yếu tố gây bệnh các chủng vi khuẩn E. coli được lựa chọn để thử độc lực 74 Bảng 3.15. Kết quả kiểm tra độc lực một số chủng vi khuẩn E. coli trên chuột bạch 75 Bảng 3.16. Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng E. coli phân lập được với một số loại kháng sinh 77 Bảng 3.17. Kết quả điều trị thực nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy bê, nghé tại Sơn la 78 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ bê, nghé tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo lứa tuổi 56 Biểu đồ 3.2. Tỷ lệ bê, nghé tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo mùa 58 Biểu đồ 3.3. So sánh kết quả xác định type vi khuẩn E. coli phân lập được 67 Biểu đồ 3.4. So sánh các yêu tô gây bệnh trong các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được 72 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deboxy nucleic AEEC : Adhereneia Enteropathogenic E. coli AMP : Adenosine Monophosphate ATP : Adenosin Triphosphate BHI : Brai-heart infusion Colv : Colicin V C. perfrigens : Clostridium perfringens E. coli : Escherichia coli EMB : Eosin Methylene Blue Agar EPEC : Enteropathogenic E. coli ETEC : Eneterotoxigenic E. coli ETEE : Enterotoxinic E. coli F : Fimbriae GTP : Guanosin 5-Triphosphate Hly : Heamolyzin LT : Heat-Labile-Toxin LTa : Heat-Labile-Toxin a LTb : Heat-Labile-Toxin b NTEC : Nectrotoxigenic E. coli PCR : Polymerase Chain Reaction TLCTLT : Tỷ lệ chết theo lứa tuổi TLTCTLT : Tỷ lệ tiêu chảy theo lứa tuổi ST : Heat-Stable-Toxin VTEC : Verotoxigenic E. coli Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Sơn La là một tỉnh miền núi, điều kiện tự nhiên rất thuận lợi cho việc phát triển chăn nuôi trâu, bò. Tỉnh đã đưa ra mục tiêu phát triển chăn nuôi là theo hướng sản xuất hàng hoá tập trung, toàn diện vững chắc, ưu tiên những loại gia súc ăn cỏ có khả năng thích ứng cao với địa hình bãi chăn thả và nguồn thức ăn đa dạng, đặc biệt là phát triển bò sữa, bò thịt chất lượng cao, phấn đấu đến năm 2010 tỷ trọng chăn nuôi đạt từ 30-35% trong cơ cấu kinh tế nông nghiệp. Do có cơ chế chính sách thích hợp và việc áp dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật trong chăn nuôi số lượng đàn trâu, bò tăng bình quân hằng năm: trâu 2,9%, bò 5,8% [22] Chăn nuôi trâu, bò ngoài cung cấp thịt, sữa, sức kéo, còn đem lại nguồn thu nhập lớn cho nhiều hộ gia đình, nhiều hộ đã thoát nghèo nhờ chăn nuôi trâu bò. Song song với việc phát triển đàn trâu bò, việc phòng và trị bệnh cũng luôn được coi trọng. Trong khi một số các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm như: lở mồm long móng, tụ huyết trùng, nhiệt thán ... đã được khống chế thì bệnh tiêu chảy ít được quan tâm cho nên đã gây thiệt hại không nhỏ cho người chăn nuôi trâu bò, nhất là bê, nghé. Theo số liệu dịch tễ của Chi cục Thú y tỉnh từ năm 2005-2007 [1] số bê, nghé bị tiêu chảy trung bình hằng năm trên 2.000 con trong đó tỷ lệ chết là 8,30%/ năm trong số con bị mắc bệnh. Hội chứng tiêu chảy ở gia súc nói chung và ở bê, nghé nói riêng là một hiện tượng bệnh lý rất phức tạp gây ra bởi sự tác động tổng hợp của nhiều nguyên nhân, bao gồm các nhân tố điều kiện ngoại cảnh bất lợi gây ra các stress cho cơ thể như: chăm sóc, quản lí kém, thời tiết... và do bản thân con vật tạo điều kiện thuận lợi cho việc cho việc xâm nhập các vi sinh vật gây bệnh vào vật chủ, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh ở đường tiêu hoá dẫn tới Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 sự nhiễm khuẩn loạn khuẩn. Theo Lê Minh Chí (1995) [2] thì ở bê, nghé 70 - 80% tổn thất trong thời kỳ nuôi dưỡng và 80 - 90% trong số đó là hậu quả của bệnh tiêu chảy gây ra. Các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ở bê, nghé như: E. coli, Salmonella, C. perfringens, Streptococcus ... Trong đó vi khuẩn E. coli đã được nhiều tác giả trên thế giới thống nhất là một trong các nguyên nhân thường gặp và quan trọng nhất gây bệnh tiêu chảy ở bê, nghé. Vì vậy nghiên cứu xác định dịch tễ của bệnh để có một cách nhìn tổng quát về nguyên nhân gây bệnh theo mùa, tuổi có liên quan đến bệnh đồng thời đề ra những biện pháp phòng, trị bệnh đạt hiệu quả cao. Mặt khác, trong những năm gần đây việc dụng sử dụng thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh tiêu chảy ở bê, nghé không được hướng dẫn và quản lý chặt chẽ, phần lớn phụ vào sự chủ quan của người bán thuốc và sử dụng tuỳ tiện của người chăn nuôi dẫn tới tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn hiệu quả điều trị không cao, thậm chí còn một số thuốc không còn tác dụng. Như vậy, đã có hiện tượng một số vi khuẩn chính gây bệnh trong đó có E. coli đã kháng lại kháng sinh dùng để điều trị. Để góp phần hạn chế thiệt hại bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E. coli gây ra ở bê, nghé và giải quyết yêu cầu cấp thiếp cho chăn nuôi trâu, bò ở địa phương chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ, yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli trong hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé tại Sơn La và thử nghiệm phác đồ điều trị". 2. Mục tiêu của đề tài - Xác định một số đặc điểm dịch tễ hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé. - Phân lập, giám định đặc tính, vai trò gây bệnh của vi khuẩn E.coli trong hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé tại Sơn La. - Xây dựng một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy bê, nghé do vi khuẩn E. coli gây ra trên địa bàn tỉnh Sơn La. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Đây là đề tài đầu tiên nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy do vi khuẩn E. coli gây ra ở bê, nghé trên địa bàn tỉnh Sơn La. Đồng thời xác định được nguyên nhân chính gây bệnh để có cơ sở khoa học để đưa ra các biện pháp phòng trị hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé. - Xây dựng và áp dụng quy trình phòng chống bệnh tiêu chảy bê, nghé phù hợp với điều kiện ở Sơn La, góp phần thúc đẩy chăn nuôi trâu bò phát triển về cả số lượng và chất lượng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy ở bê nghé Tiêu chảy là một biểu hiện lâm sàng của quá trình bệnh lý đặc thù của đường tiêu hoá. Hiện tượng lâm sàng này tuỳ theo đặc điểm, tính chất diễn biến, tuỳ theo độ tuổi mắc bệnh, tuỳ theo yếu tố được coi là nguyên nhân chính mà nó được gọi theo nhiều tên khác nhau: chứng khó tiêu, chứng rối loạn tiêu hoá, Colibacillosis… Tuy nhiên, thực chất tiêu chảy là một hội chứng bệnh lý liên quan đến rất nhiều yếu tố như: dinh dưỡng, chăm sóc, điều kiện ngoại cảnh, ký sinh trùng, vi khuẩn, vi rút trong đó có yếu tố là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát và việc phân biệt rõ ràng nguyên nhân gây tiêu chảy là rất khó khăn. Cho dù bất cứ nguyên nhân nào dẫn đến tiêu chảy thì hậu quả của nó cũng là gây viêm nhiễm, tổn thương thực thể đường tiêu hoá và cuối cùng là quá trình nhiễm khuẩn (Trịnh Văn Thịnh, 1964) [28], (Hồ Văn Nam và cộng sự, 1997) [11]. Dù nguyên nhân nào thì tiêu chảy cũng dẫn đến triệu chứng chung là: tiêu chảy, mất nước, mất chất điện giải, suy kiệt, nếu trầm trọng dễ bị trụy tim mạch và có thể chết. Bằng nhiều nghiên cứu và thực nghiệm, người ta đã tìm ra những nguyên nhân chính gây hội chứng tiêu chảy ở bê nghé, bao gồm: 1.1.1. Nguyên nhân do vi khuẩn Trong đường ruột của gia súc nói chung và của bê, nghé nói riêng có rất nhiều loài vi sinh vật sinh sống. Chúng tồn tại dưới dạng cân bằng và có lợi cho cơ thể vật chủ. Dưới tác động của sự bất lợi nào đó, trạng thái cân bằng của khu hệ vi sinh vật trong đường ruột bị phá vỡ, tất cả hoặc chỉ một loài nào đó sinh sản quá nhiều sẽ gây ra hiện tượng loạn khuẩn, hấp thu ở ruột bị rối loạn, hậu quả là bê, nghé bị ỉa chảy. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Fetisova K, (1989) [51], Contrepois M, (1990) [43] đã nghiên cứu hội chứng viêm dạ dày, ruột ở bê sơ sinh và vai trò của E. coli và Salmonella trong bệnh viêm dạ dày, ruột ở bê. Hồ Văn Nam và cộng sự, 1997) [11] khi nghiên cứu trâu bị ỉa chảy, đã cho thấy: thấy số lượng vi khuẩn thường gặp trong phân trâu như: E. coli, Salmonella, Klebsiella, Staphylococcus, Streptococcus tăng lên rất rõ so với bình thường, nhất là trâu già và nghé bị bệnh. Nguyễn Ngã và cộng sự (2000) [15] qua theo dõi 425 bê, nghé dưới 12 tháng tuổi tại 2 tỉnh Khánh Hoà và Ninh Thuận cho thấy có 115 bê, nghé bị ỉa chảy (26,71%) chủ yếu tập trung vào tháng 9-10 và tháng 4-5 và ở bê, nghé 1- 9 tháng tuổi. Xác định lượng vi khuẩn trong phân bê, nghé ỉa chảy cho thấy nhiều gấp 3 lần so với bê, nghé khoẻ mạnh. Phân lập và giám định vi khuẩn trong 189 mẫu phân ỉa chảy cho thấy có 4 loài chính: E.coli, Salmonella, Klebsienlla và Shigella, trong đó cao nhất là E. coli (72,48%) và Salmonella (51,32%). Nguyễn Văn Quang (2004) [20] khi nghiên cứu vai trò của Salmonella và E. coli trong hội chứng tiêu chảy của bò, bê đã cho biết khi bò, bê bị tiêu chảy E. coli và Salmonella bội nhiễm với số lượng cao (vi khuẩn /1g phân). E. coli gấp 3 lần, Salmonella gấp 1, 98 lần. Theo Nguyễn Văn Sửu (2005) [23] khi nghiên cứu ở 3 tỉnh miền núi phía Bắc đã kết luận: vi khuẩn E. coli, Salmonella và Cl. Perfringens thấy ở bê, nghé bị tiêu chảy cao hơn bê, nghé ở trạng thái bình thường. Trương Văn Quang và cộng sự (2006) [21] khi bê nghé bị tiêu chảy thì số lượng và tỷ lệ các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được mang các yếu gây bệnh và sản sinh độc tố tăng rất cao so với bê nghé bình thường. Điều này khẳng định vi khuẩn E. coli có vai trò đặc biệt quan trọng và thực sự là tác nhân làm cho quá trình tiêu chảy ở bê nghé càng trầm trọng hơn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Phạm Hồng Ngân (2007) [14], ở bê dưới 6 tháng tuổi khi bị tiêu chảy: 61,35% số mẫu phân phân lập được Salmonella với số lượng rất lớn: 26,00 - 43,70 x 10 6 CFU/g phân. Như vậy, các loài vi khuẩn như: E. coli, Salmonella, Clostridium perfringens là những vi khuẩn thường gặp trong các loại vi khuẩn gây tiêu chảy cho bê, nghé. 1.1.2. Nguyên nhân do vi rút Ngoài nguyên nhân gây tiêu chảy do vi khuẩn còn có vi rút. Đã có nhiều công trình nghiên cứu khẳng định vai trò của một số vi rút: nhóm Rotavirut, Adenovirut, vi rút dịch tả trâu bò, vi rút viêm ruột bò (Bovine Rhinotracheitis Infection- IBR). Các vi rút này tác động gây viêm ruột và gây rối loạn quá trình tiêu hoá, hấp thu của bê, nghé và cuối cùng dẫn đến triệu chứng tiêu chảy. 1.1.3. Nguyên nhân do ký sinh trùng Ký sinh trùng ở đường tiêu hoá là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở gia súc. Tác hại của chúng không chỉ cướp đi các chất dinh dưỡng của vật chủ mà còn tiết ra độc tố đầu độc vật chủ làm giảm sức đề kháng, gây trúng độc, tạo điều kiện cho các bệnh khác phát sinh. Theo Phạm Văn Khuê, Phan Lục (1996) [8], chính phương thức sống ký sinh ở đường tiêu hoá của các loài giun sán đã làm tổn thương niêm mạc ruột, nhờ đó các loại mầm bệnh dễ xâm nhập gây viêm ruột, gây rối loạn quá trình tiêu hoá hấp thu, kích thích nhu động ruột, gây ỉa chảy và hiện tượng nhiễm trùng. Theo tài liệu của Lương Tố Thu (1996) (theo trích dẫn của Phạm Sĩ Lăng 2002) [10] kết quả khảo sát ở một số cơ sở chăn nuôi trâu bò sữa cho thấy có 7 loài cầu trùng là một trong những nguyên nhân gây ỉa chảy ở bê, nghé non. Phạm Sĩ Lăng và cộng sự (2002) [10] cho biết giun đũa Toxocara vitulorum thường gây ỉa chảy phân trắng ở bê, nghé non 1-3 tháng tuổi. Sán lá Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 gan Fasciola gigantica, Fasciola hepatica trong quá trình ký sinh cũng tiết độc tố gây ỉa chảy cho bê, nghé non. Ký sinh trùng là nguyên nhân tiền phát cho nhiễm khuẩn và ỉa chảy ở bê, nghé. 1.1.4. Ảnh hưởng của môi trường, khí hậu Môi trường ô nhiễm là điều kiện để bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E. coli phát thành dịch, ở những nơi nuôi bê nhốt thì bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E. coli phát nhiều hơn là những nơi thả ngoài đồng. Bệnh có thể lây qua con vật mang trùng hoặc qua thức ăn như: bột thịt, bột xương của con vật ốm không tiệt trùng hoặc qua đệm lót chuồng, các loài gặm nhấm, chim nuôi, chim trời đều có thể là nguồn truyền bệnh. Edward Aliame (1990) [46]. Phạm Sĩ Lăng, Phan Địch Lân (1997) [9] mùa xuân mùa có mưa phùn ẩm ướt và mùa hè nóng ẩm, bệnh ỉa chảy bê, nghé xảy ra nhiều có khi chiếm 40-50% tổng số trâu, bò ở cơ sở giống như một ổ dịch. Các cơ sở chăn nuôi bò sữa, thường thấy bê non phát bệnh nhiều vào mùa hè thời tiết nóng ẩm, sau các trận mưa rào làm chuồng trại bãi chăn ẩm ướt và ô nhiễm. Tác nhân stress: là yếu tố nguy hại lớn, dù không phải là tác nhân đặc biệt. Bê, nghé thường sinh ra trong vụ đông xuân, phải đương đầu với tác nhân lạnh ẩm. Để chống lại tác nhân stress lạnh ẩm, các catecolamin sản sinh nhiều hơn, hoạt động hệ trục H-H-H (hypothalamus, hypophyis, hyponephra) thay đổi để tự điều chỉnh, nếu tác nhân stress tiếp tục kéo dài hoạt động hệ trục H-H-H đi vào rối loạn. Các hormon kích thích viêm ở vỏ thượng thận tiết nhiều. Các receptor thụ cẩm với hormon này có ở dạ dày, ruột và khớp. Kết quả là dẫn tới viêm niêm mạc dạ dày, ruột, đây là cơ hội tốt nhất để các vi khuẩn độc hại (E. coli, Salmonella ...) tấn công, lúc này gia súc non bị ỉa chảy là không thể tránh khỏi (Phạm Khắc Hiếu, 1997) [6]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 1.1.5. Ảnh hưởng của nuôi dưỡng không đúng kỹ thuật Trong chăn nuôi bê, nghé phải thực hiện đúng quy trình chăm sóc nuôi dưỡng: bê, nghé phải phải bú đầy đủ sữa đầu, đảm bảo vệ sinh chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi. Khi thay đổi thức ăn đột ngột, đặc biệt là tăng lượng đạm và chất béo làm cho bê, nghé rối loạn tiêu hoá, dẫn đến viêm ruột. Thức ăn bị ôi thiu, nấm mốc đặc biệt là nấm Candia albicans xâm nhập vào ruột cũng gây tác hại tương tự như các vi khuẩn. Ngoài tác hại phá hoại tổ chức dạ dày, ruột gây ỉa chảy, nấm còn tiết độc tố gây nhiễm độc toàn thân. * Như vậy, có thể nói hội chứng tiêu chảy của bê, nghé là một hội chứng bệnh lý rất phức tạp ở đường tiêu hoá, do nhiều nguyên nhân, nhiều yếu tố tác động. Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, chúng tôi xin trình bày vai trò của vi khuẩn E. coli ở bê, nghé. 1.2. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E.coli gây tiêu chảy ở bê, nghé 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Từ lâu, trên thế giới đã có rất nhiều nhà khoa học đi sâu nghiên cứu về vi khuẩn E. coli, đặc biệt là trong thập kỷ 60, 70 của thế kỷ 20 và những năm gần đây. Vi khuẩn E. coli được bác sĩ nhi khoa người Đức Theodor Escherich (1857-1911) mô tả lần đầu tiên vào năm 1885, vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriace. Escherichia coli thường xuất hiện sớm ở ruột người và động vật sơ sinh (sau khi đẻ 2 giờ) chúng thường cư trú ở phần sau của ruột, ít khi thấy ở dạ dày hay ruột non. vô hoạt sống trong ruột già của người và động vật. Smith (1963) [77] đã cho thấy có hai loại độc tố là thành phần chính của Enterotoxin được phát hiện ở các vi khuẩn E. coli gây bệnh. Hai loại đó có sự khác biệt ở khả năng chịu nhiệt. Độc tố chịu nhiệt ST (Heat-stabletoxin) chịu nhiệt ở nhiệt độ 100oC trong 15 phút. Độc tố không chịu nhiệt LT (Heat- labile toxin) bị vô hoạt ở nhiệt độ 60oC trong 15 phút. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 Theo Smith và cộng sự (1968) [78] cho biết: trong nước bị ô nhiễm các loại vi khuẩn gây bệnh mang Plasmid kháng thuốc kháng sinh có thể sống rất lâu. Nước nhiễm E. coli, Salmonella chủ yếu là do động vật thải trực tiếp hoặc gián tiếp vào nước. Minhew và cộng sự (1978) [70] đã phát hiện có 48% số chủng vi khuẩn E. coli phân lập ở ngoài đường ruột có khả năng gây dung huyết, trong khi đó vi khuẩn E. coli phân lập từ phân chỉ có từ 8-10% các chủng gây dung huyết. Evan và cộng sự (1981) [48] đã xác định được 48,0% chủng E. coli phân lập ngoài đường ruột, 8-10,0% E. coli phân lập từ phân, 42,0% E. coli phân lập từ bàng quang và 29,0% phân lập từ máu và có khả năng dung huyết. Theo Sokol (1981) [80] vi khuẩn E. coli từ cộng sinh thường trực trong đường ruột trở thành vi khuẩn gây bệnh vì trong quá trình sống vi khuẩn có thể tiếp nhận các yếu tố gây bệnh, bao gồm các yếu tố dung huyết (Hly), yếu tố cạnh tranh (Colv) và yếu tố bám dính. Có 5 yếu tố bám dính gồm F4 hay còn gọi là K88 (K88ac, K88ab, K88ad); F5 hay còn gọi là K99; F6 hay còn gọi là 987P. Loại kháng nguyên F4 cho phép vi khuẩn có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô của toàn bộ ruột non. Kháng nguyên F5, F6 chỉ kết dính ở tế bào biểu mô phần giữa và phần sau của ruột non. Các kháng nguyên F4 và F6 chỉ có ở vi khuẩn E. coli gây bệnh trên lợn, F5 tìm thấy chủ yếu ở vi khuẩn E. coli gây bệnh trên bê. Các yếu tố gây bệnh này không được di truyền bằng ADN của nhiễm sắc thể mà di truyền bằng ADN nằm ngoài nhiễm sắc thể được gọi là Plasmid. Qua hiện tượng di truyền bằng tiếp hợp, chính yếu tố gây bệnh này đã giúp cho vi khuẩn bám dính vào được tế bào nhung mao của ruột non, xâm nhập vào thành ruột. Từ đây, vi khuẩn thực hiện quá trình gây bệnh và sản sinh độc tố, gây phá huỷ tế bào niêm mạc ruột, gây dung huyết, nhiễm độc huyết. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Felix B, (1983) [50] cho rằng Plasmid mang mã thông tin ngoài nhiễm sắc thể của tế bào vi khuẩn. Mã di truyền này có cấu trúc AND hình tròn hai nhánh xoẵn, có khả năng tái sinh. Thông qua Plasmid, vi khuẩn có khả năng kháng kháng sinh, kháng tia tử ngoại và có khả năng tạo colicin. Tại Iraq, Abdul-rudha và cộng sự (1984) [34] cho biết khi nghiên cứu 103 bê bị tiêu chảy đã thấy 41 chủng E. coli gây bệnh phân lập được thuộc 12 nhóm huyết thanh khác nhau, trong đó chủ yếu là O9 và O20 và kháng nguyên K99. Acres (1985) [35] nghiên cứu nhiễm khuẩn E. coli ở bê sơ sinh đã khẳng định: tiêu chảy do Enterotoxigenic E. coli (ETEC) là bệnh nhiễm khuẩn của bê xảy ra từ ngày đầu sau sinh. ETEC gây bệnh có độc lực giúp chúng phát triển ở ruột và tạo ra Enterotoxin. Gunther và cộng sự (1985) [57] đã nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi gia súc đối với tiêu chảy của bê do vi khuẩn E. coli gây ra, đã khẳng định sức đề kháng của bê đối với E. coli tăng nhanh theo lứa tuổi. Al-Dabbas và Willinger (1986) [36] qua nghiên cứu tính chất của các chủng E. coli ở bê bị tiêu chảy từ năm 1970-1983 cho biết: trong 274 chủng E. coli phân lập được thì type O101 chiếm 59,1%; O9 chiếm 25,9%; O8 chiếm 6,6% và O35 chiếm 2,6%. Có 12% số chủng phân lập được không xác định được type và 25,8% số chủng có độc tố. Theo Janke và cộng sự (1989) [65] tuổi của bê, nghé cảm nhiễm Adherencia Enteropathogenic E. coli (AEEC) từ 2 ngày đến 4 tháng tuổi, sự cảm nhiễm với AEEC dường như là nguyên nhân duy nhất của bệnh tiêu chảy và nguyên nhân tử vong của một số gia súc. Hiện tượng xuất huyết đường ruột kèm theo các tổn thương biến đổi từ các đám nhỏ lác đác trên các vết thương lớn lan rộmg khắp màng nhày ruột là do quá trình bám dính của vi khuẩn gây ra. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Trong năm 1986-1987, Fialova (1989) [51] đã phân lập được 400 chủng E. coli từ bê mắc bệnh và hầu hết các bê này tiêu chảy trầm trọng, viêm tĩnh mạch rốn, viêm khớp hoặc một số trường hợp bị nhiễm trùng máu. Từ năm 1986-1987, Tominaga (1989) [83] đã xác định được các đặc điểm sinh hoá và khả năng gây bệnh của E. coli phân lập được từ bê bị bệnh tiêu chảy. Các đặc điểm sinh hoá đặc biệt của vi khuẩn này là kỵ khí, di động và sản sinh enzym, phân huỷ urea. Các serotype huyết thanh của chúng là O5: K. Các chủng E. coli không điển hình phân lập từ 2 bê, có sản sinh Verotoxin, nhưng không sản sinh ST và LT (Eterotoxin). Otoi (1990) [73] đã nghiên cứu sự cảm nhiễm E. coli có cấu trúc kháng nguyên K99 ở bê và kết quả điều tra huyết thanh học cho thấy có 11 chủng E. coli mang K99. Các chủng E. coli phân lập được từ phân của 50 bê bị tiêu chảy đã xác định được khả năng sản sinh độc tố chịu nhiệt ST và không sản sinh độc tố không chịu nhiệt LT và có 9 chủng mang k._.háng nguyên O9, 2 chủng có kháng nguyên O8 . Kết quả nghiên cứu huyết thanh học của 100 gia súc từ 92 trang trại cho thấy có 34 gia súc được kiểm tra sau 6-9 tháng có hiệu giá kháng thể với kháng nguyên K99 cao gấp 4 lần. Baljer và cộng sự (1990) [38], Janke và cộng sự (1990) [66] khi nghiên cứu các chủng E. coli tại Mỹ, Anh từ năm 1985-1988 đều đi đến kết luận: E. coli gây bệnh tiêu chảy ở bê chủ yếu đều cư trú ở đoạn xoắn ốc của kết tràng, chúng gây ra các tổn thương đặc biệt ở đây như viêm kết tràng, xuất huyết ở đại tràng. Kết quả quan sát cho thấy có trên 40% bê và gần 90% gia súc cảm nhiễm là sơ sinh, tuổi trung bình là 11,8 ngày, xuất hiện hiện tượng viêm này. Baljer (1990) [38] bằng phương pháp kiểm tra tế bào nuôi cấy và xác định ADN của E. coli phân lập được ở bê bị tiêu chảy để xác định độc tố Verotoxin do E. coli này sản sinh ra. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 Fairbrother (1992) [49] căn cứ vào kết quả nghiên cứu các yếu tố gâybệnh của từng chủng vi khuẩn E. coli phân lập được từ các bệnh khác nhau, các chủng vi khuẩn E. coli đã được phân loại theo những yếu tố gây bệnh mà chúng có khả năng sản sinh như: Enterotoxigenic E. coli được ký hiệu là ETEC, Enterotoxinic E.coli được ký hiệu ETEEC, Enterotopathogenic E. coli được ký hiệu EPEC, Verotoxigenic E.coli được ký hiệu VTEC, Adherence Enterotopathogenic E. coli được ký hiệu AEEC. Từ đó xác định các serotype mang các yếu tố gây bệnh đặc trưng cho từng loại vi khuẩn E. coli trên từng nhóm gia súc khác nhau. Blanco (1993) [41] đánh giá vai trò của Enterotoxigenic (ETEC), Verotoxigenic (VTEC) và Necrotoxigenic (NTEC) của vi khuẩn E. coli trên bò bị tiêu chảy, đã đi đến kết luận: bò đang là nguồn chứa đựng VTEC và đó là tác nhân gây bệnh cho con người. Còn với ETEC đang là nguyên nhân không bình thường của bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E. coli gây ra ở bò nuôi tại tây bắc Tây Ban Nha. Ngoài ra các kết luận của nghiên cứu cũng chỉ ra rằng VTEC và NTEC mà E. coli sản sinh ra CNF2 (nhân tố hoại độc tế bào) có thể là một phần của hệ vi sinh vật đường ruột bình thường của bò. Cray (1995) [45] nghiên cứu sự thải hồi của độc tố E. coli O157: H7 theo phân và có sự biến động rất lớn trong số các gia súc trong cùng một nhóm tuổi. Maria de Fatima Martins và cộng sự (2000) (dẫn theo Đỗ Ngọc Thuý, 2002) [31] khẳng định: Đã phát hiện các chủng vi khuẩn E. coli kháng thuốc với tỷ lệ và mức độ khá cao, có đến 50,5% số chủng đã kháng lại ít nhất 1 loại kháng sinh và 20,87% số chủng kháng lại 2 hay nhiều hơn các loại kháng sinh khác nhau. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 Bảng 1.1: Các serotype và yếu gây bệnh của vi khuẩnE. coli ở bò, bê KN bám dính Serotype mang KN Thể bệnh Loại VK E.coli Sản sinh độc tố Tác giả năm công bố S T L T C S 3 2 A C o lv C N F 2 K99 O9; O8 Gây tiêu chảy ở bê ETEC + Otoi (1990) [73] KH7 O157 Gây xuất huyết đai tràng, gây tán huyết, ure huyết ở bê VTEC + Gonzalez (1989) [55] K O2; O103; O104; O128; O123 nt VTEC + nt K87 O8 Tiêu chảy ở bê NTEC nt K14 O15 nt NTEC nt K80 O18 nt NTEC nt K O15;O54;O76O88 ; O123 O139 nt NTEC nt K99 O20, O9 nt Abdul- rudha [1984)(34 ) K88 hoặc K99 O15;O2;O10O8;O 9;O149 Tiêu chảy trầm trọng, viêm tĩnh mạch rốn, viêm khớp, nhiễm trùng máu ở bê VTEC Jain (1989) [67] H11 hoặc H16 O26;O111 O118 Tiêu chảy ở bò VTEC Pohl (1997) [75] O26; O103 O113; O157 Tiêu chảy ở bò VTEC + Blanco (1993) [41] O1; O3; O15 O55;O88;O123 + Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước Ở nước ta, bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E. coli gây ra ở bê, nghé xuất hiện rất lâu, bệnh đã được báo cáo có ở hầu hết các tỉnh, thành phố trong toàn quốc, bệnh đã và đang gây thiệt hại nghiêm trọng cho chăn nuôi trâu bò ở tất cả các hình thức và quy mô chăn nuôi. Vì vậy, nghiên cứu bệnh tiêu chảy ở bê, nghé do vi khuẩn E. coli gây ra đã có nhiều nhà khoa học thú y trong nước quan tâm. Nguyễn Như Thanh và cộng sự (1997) [27], Cù Hữu Phú và cộng sự (1996-2000) [17] nghiên cứu phân lập vi khuẩn từ những gia súc mắc hội chứng tiêu chảy cho thấy tỷ lệ cũng như số lượng của vi khuẩn E. coli cao trên 85-100% số mẫu dương tính, tiếp theo là vi khuẩn Salmonella và Streptococcus. Theo Phạm Quang Phúc (2003) [18] khi nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học, vai trò của vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy ở bê, nghé tại tỉnh Thái Nguyên đã cho thấy: - Bê, nghé dưới một năm tuổi bị tiêu chảy và chết giảm dần theo tháng tuổi, tháng tuổi càng cao tỷ lệ bị tiêu chảy và chết càng thấp. - Bê, nghé bị tiêu chảy và chết vụ đông xuân cao hơn vụ hè thu. Nguy cơ bị tiêu chảy và chết của bê, nghé thay đổi theo lứa tuổi và theo vùng. - Trong 213 chủng E. Coli xác định được type có 25,82% là O101, 16,43% là O9, 15,96% là O20 và O8 chiếm 15,02%. Nguyễn Văn Quang (2004) [20] khi nghiên cứu vai trò của vi khuẩn Salmonella và E. coli trong hội chứng tiêu chảy của bò, bê ở các tỉnh Nam Trung bộ, cho biết: khi bò, bê bị tiêu chảy E. coli bội nhiễm với số lượng cao (số vi khuẩn /1gam phân) E. coli gấp 3 lần. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 - Các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được từ bò, bê bị tiêu chảy sản sinh ra độc tố ST là 83,3%, LT là 41,6% cả ST và LT là 41,6%. 30% có khả năng dung huyết, 50% sản sinh F4 (K88) và 55% sản sinh F5 (K99). Nguyễn Văn Sửu (2005) [23] khi nghiên cứu tình hình tiêu chảy của bê, nghé dưới 6 tháng tuổi tại 3 tỉnh miền núi phía Bắc và xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli, Salmonella và Clostridium perfringens phân lập được kết luận: - Tiêu chảy ở bê, nghé cao nhất là mùa Xuân: bê 23,61% nghé 21,38% tiếp đó là mùa Hè và mùa Đông, thấp nhất là mùa Thu: bê 15,48% nghé 17,19%. Tỷ lệ chết cao nhất vào mùa Đông: 9,00%, mùa Xuân: 7,32%, mùa Hè: 5,90% và thấp nhất là mùa Thu: 5,65%. - Bê, nghé bị tiêu chảy và chết giảm dần theo lứa tuổi. - Bê, nghé bị tiêu chảy số lượng vi khuẩn E. coli gây bệnh tăng cao hơn với trạng thái bình thường không tiêu chảy: trung bình tăng 81,04% ở bê và 184,62% ở nghé. Trương Văn Quang và cộng sự (2006) [21] khi nghiên cứu vai trò gây bệnh của vi khuẩn E. coli trong bệnh tiêu chảy của bê, nghé cho biết: khi bê, nghé bị tiêu chảy thì số lượng và tỷ lệ các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được mang các yếu tố gây bệnh và sản sinh độc tố tăng rất cao so với bê, nghé bình thường: - Số lượng vi khuẩn /1g phân: bê gấp 2,99 lần, nghé gấp 2,79 lần. - Tỷ lệ các chủng mang kháng nguyên bám dính: bê gấp 3,4 lần, nghé gấp 2,9 lần. - Tỷ lệ các chủng có khả năng dung huyết: bê gấp 2,1 lần, nghé gấp 2,77 lần. - Tỷ lệ các chủng sản sinh độc tố đường ruột: đối với độc tố chịu nhiệt (ST) ở bê gấp gấp 4,33 lần, nghé gấp 3,5 lần; đối với độc tố không chịu nhiệt (LT) ở bê gấp gấp 5,48 lần, ở nghé gấp 2,7 lần; cả 2 thành phần độc tố ở bê là 6,93 lần, nghé là 3,69 lần. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 1.3. Một số đặc tính của vi khuẩn E.coli Trực khuẩn ruột già E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, tộc Escherichae, giống Escherichia, loài Escherichia coli. Trong các vi khuẩn đường ruột, E. coli phổ biến nhất còn có tên là Bacterium coli commune, Bacillus coli communis do Theodor Escherich phân lập được đầu tiên vào năm 1885 từ phân trẻ em. Về mặt huyết thanh học, người ta chia các chủng vi khuẩn E. coli thành nhiều serotype khác nhau. Cho đến nay đã phát hiện được 279 serotype, trong đó có 250 serotype có độc lực và có vai trò quan trọng trong một số bệnh của gia súc. Ở điều kiện bình thường, các chủng vi khuẩn E. coli không gây bệnh, khi điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng, vệ sinh thú y kém, điều kiện ngoại cảnh bất lợi, dẫn đến sức đề kháng của con vật giảm thì vi khuẩn E. coli trở nên cường độc và có khả năng gây bệnh. 1.3.1. Đặc tính về hình thái Theo Bergey's (1957) [39], Nguyễn Vĩnh Phước (1970) [19], Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1976) [4], Nguyễn Như Thanh và cộng sự (1997) [27] vi khuẩn E. coli là một trực khuẩn ngắn, kích thước 2-3 x 0,6 µm. Có trong môi trường nuôi cấy hai đầu tròn, có lông nên đa số là di động được, một số không di động được. Vi khuẩn E. coli không hình thành nha bào, có thể có giáp mô, bắt màu gram âm. Trong cơ thể gia súc, vi khuẩn có hình cầu riêng rẽ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Dưới kính hiển vi điện tử người ta quan sát thấy những Pili - yếu tố mang kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E. coli. 1.3.2. Đặc tính nuôi cấy E. coli trực khuẩn hiếu khí tuỳ tiện, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5- 40 0C, nhiệt độ thích hợp là 370C trong 24 giờ, pH thích hợp là 7,2-7,4 nhưng có thể phát triển ở pH từ 5,5-8. Vi khuẩn E. coli phát triển dễ dàng trên các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản: - Trên môi trường nước thịt: sau thời gian nuôi cấy ở 370C trong 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn E. coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đôi khi hình thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trường, môi trường có mùi phân thối. - Trên môi trường thạch thường: bồi dưỡng ở 37oC trong 24 giờ vi khuẩn phát triển hình thành những khuẩn lạc tròn ướt, bóng láng, không trong suốt, màu tro nhạt, hơi lồi đường kính 2-3 mm. Nếu nuôi lâu hơn, khuẩn lạc chuyển màu gần như màu nâu nhạt và mọc rộng ra. Có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng M (Mucoid) và dạng R (Rough). - Trên môi trường thạch máu: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sáng, kích thước từ 1-2 mm, có thể có hoặc không có dung huyết tuỳ thuộc vào chủng. - Trên môi trường thạch peptone: sau 18-24 giờ bồi dưỡng trong tủ ấm 37 oC, vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc tròn ướt, màu xám, kích thước trung bình, mặt khuẩn lạc hơi lồi lên, có nếp nhăn và bề mặt láng bóng. - Trên môi trường thạch MacConkey: sau khi nuôi cấy 24 giờ ở tủ ấm 37 oC, hình thành khuẩn lạc màu hồng, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường. - Trên môi trường Endo: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ mận chín, có hoặc không có màu ánh kim. - Trên môi trường EMB (Eosin Methyl Blue): sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 0C, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu tím đen có ánh kim. - Trên môi trường thạch SS (Salmonella Shigella): sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc màu đỏ. - Trên môi trường thạch Brilliant Green Agar: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 oC hình thành khuẩn lạc dạng S (Smooth), màu vàng chanh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 Vi khuẩn không mọc lên ở các môi trường Malasit và Mulerkauffmann, bị kiềm chế khi nuôi trong môi trường Wilson Blair. 1.3.3. Đặc tính sinh hoá - Đặc tính lên men các loại đường. Nhóm Escherichia coli gồm những trực khuẩn di động hoặc không di động, có khả năng lên mên sinh hơi các loại đường Glucoza, Fructoza, Galactoza, Lactoza, Maniton, Mannit, Levuloza, Xyloza. Lên men không chắc chắn với các loại đường Dulciton, Sacaroza, Lactose trong khi đó vi khuẩn Salmonella thì không có đặc tính này, đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt vi khuẩn E. coli và Salmonella (Nguyễn Như Thanh và cộng sự, (1997) [27]. - Một số phản ứng khác bao gồm: Indon: + Di động: + MR: + Catalase: + VP: - H2S: - Citrate: - ureaza: - (+): phản ứng dương tính; (-): phản ứng âm tính + Làm đông sữa sau khi ủ ở 37oC trong vòng 24-72 giờ. + Không làm tan chảy gelatin. + Vi khuẩn E. coli có khả năng khử Nitrat thành Nitrit, khử Cacboxyl trong môi trường Lysine decacboxylase. 1.3.4. Sức đề kháng Vi khuẩn E. coli không hình thành nha bào nên có sức đề kháng yếu, bị diệt ở nhiệt độ 55oC trong một giờ hoặc 60oC trong vòng 30 phút, đun sôi 100 oC thì chết ngay. Những chủng vi khuẩn E. coli trong phân có xu hướng đề kháng cao hơn những chủng phân lập được ở môi trường bên ngoài. ở môi trường bên ngoài, các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh có thể tồn tại đến 4 tháng (Nguyễn Như Thanh và cộng sự, 1997) [27]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 1.3.5. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli Dựa vào cấu trúc bề mặt và cấu trúc bên trong tế bào vi khuẩn E. coli, các nhà khoa học đã xác định được cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli gồm kháng nguyên thân O (Somatic), kháng nguyên lông H (flagellar), kháng nguyên vỏ K (Capsular) và kháng nguyên F (Fimbriae). Hiện nay người ta xác định được 170 nhóm kháng nguyên O, 70 type kháng nguyên K, 56 type kháng nguyên H và một số nhóm kháng nguyên F Bertschinger H.U và cộng sự (1992) [40]. Bằng phản ứng ngưng kết, các nhà khoa học đã phát hiện được các tính chất phức tạp các yếu tố kháng nguyên của vi khuẩn E. coli, bao gồm các loại kháng nguyên sau: 1.3.5.1. Kháng nguyên O (Somatic - kháng nguyên thân) Theo Zinner và Perter (1983) [86] đây là thành phần chính của vi khuẩn và cũng được coi là yếu tố độc lực của vi khuẩn. Kháng nguyên O được coi như một ngoại độc tố, có thể tìm thấy ở màng ngoài vỏ của vi khuẩn và thường xuyên được giải phóng vào môi trường nuôi cấy. Trong trạng thái chiết xuất tinh khiết, nó có bản chất là lypopolysaccharide, bao gồm 2 nhóm sau: - Polysaccharide có nhóm hydro ở thành ngoài vi khuẩn, mang tính chất đặc trưng cho kháng nguyên từng giống. - Polysaccharide không có nhóm hydro nằm ở phía trong, không mang tính đặc trưng mà chỉ tạo sự khác biệt về khuẩn lạc (từ dạng S sang dạng R). Kháng nguyên O có những đặc tính sau: chịu nhiệt (không bị phá huỷ khi đun nóng ở 100oC trong 2 giờ); các chất cồn, axit HCL nồng độ 1N chịu được 20 giờ. Kháng nguyên O rất độc chỉ cần 1/20mg đã đủ giết chết chuột nhắt trắng sau 24 giờ, nhưng bị phá huỷ bởi Formol 0,5%. Kháng nguyên O được cấu trúc bởi các phân tử lớn với thành phần các phân tử gồm: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 + Protein: làm cho phức hợp mang tính kháng nguyên. + Polyosit: tạo ra tính đặc hiệu của kháng nguyên. + Lypit: kết hợp với Polyosit và là cơ sở của độc tính. Theo Medearis, 1968 (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Nội, 1986) [16], khi làm mất dần từng phân tử đường của chuỗi polysaccharide hay thay đổi vị trí của các phân tử này sẽ dẫn đến thay đổi độc lực của vi khuẩn. Tất cả kháng nguyên O đều cư trú ở bề mặt, do vậy có thể liên kết trực tiếp với hệ thống miễn dịch. Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết gọi là “Hiện tượng ngưng kết O”. Thân vi khuẩn ngưng kết với nhau dưới dạng những hạt khô, rất khó tan khi lắc. 1.3.5.2. Kháng nguyên H (flagellar - kháng nguyên lông) Kháng nguyên H được cấu tạo bởi thành phần lông vi khuẩn, có bản chất là protein giống như chất myosin của cơ và mang các đặc tính sau: + Bị phá huỷ ở 60oC trong 1 giờ. + Dễ bị cồn, acid yếu và các enzym phân giải protein phá huỷ. + Kháng nguyên H vẫn tồn tại khi sử dụng formol 0,5% xử lý. Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết, trong đó các vi khuẩn được ngưng kết lại với nhau nhờ lông dính lông. Các kháng thể kháng H cố định trên lông và là cầu nối với các lông bên cạnh. Kết quả tạo nên các hạt ngưng kết giống như cục bông nhỏ. Các hạt ngưng kết rất dễ tan khi lắc vì lông rất nhỏ và dài, dễ đứt. Các vi khuẩn di động khi tiếp xúc với kháng thể tương ứng và sẽ trở thành không di động. Kháng nguyên H của vi khuẩn E. coli không có vai trò về bám dính, đồng thời không có vai trò đáp ứng miễn dịch nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa lớn trong việc xác định giống, loài của vi khuẩn và bảo vệ vi khuẩn khỏi bị tiêu diệt trong tế bào đại thực bào, giúp vi khuẩn sống lâu và tồn tại trong đại thực bào (Weinstein, 1984) [85]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 1.3.5.3. Kháng nguyên K (Capsular - kháng nguyên bề mặt) Kháng nguyên K còn gọi là kháng nguyên bề mặt, chúng bao quanh tế bào vi khuẩn và có bản chất hoá học là polysaccharide. Vai trò của kháng nguyên K chưa được thống nhất lắm, có tác giả cho rằng nó không có ý nghĩa về độc lực, vì vậy chủng E. coli có kháng nguyên K cũng giống như chủng không có kháng nguyên K (Orskov, 1980) [72], cũng có ý kiến cho rằng kháng nguyên K có ý nghĩa về độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước các yếu tố phòng vệ của cơ thể (Evan và cộng sự, 1981) [48]. Phần lớn các ý kiến cho rằng kháng nguyên K có 2 nhiệm vụ chính: + Hỗ trợ phản ứng ngưng kết với kháng nguyên O. + Tạo ra hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại điều kiện ngoại lai và hiện tượng thực bào. Theo Nguyễn Như Thanh (1997) [27] kháng nguyên K gồm 3 loại kháng nguyên: L, A, B. + Kháng nguyên L: ngăn không cho hiện tượng ngưng kết O của vi khuẩn sống xảy ra, khi đun 100oC trong 1 giờ kháng nguyên L bị phá huỷ. + Kháng nguyên A: ngăn hiện tượng ngưng kết O, kháng huyết thanh A trộn với E. coli có kháng nguyên A gây hiện tượng phình vỏ. Với nhiệt độ 120 oC trong 2 giờ kháng nguyên A mới bị phân huỷ. + Kháng nguyên B: gồm nhiều thành phần: B1, B2, B3, B4, B5. Kháng nguyên B của vi khuẩn sống xảy ra. Đun 100oC trong 1 giờ kháng nguyên này bị phá huỷ một phần. Dựa vào cấu tạo kháng nguyên O, vi khuẩn E. coli được chia làm nhiều nhóm, căn cứ vào cấu tạo kháng nguyên O, K, H E. coli được chia làm nhiều type, mỗi type đều được ghi thứ tự các yếu tố kháng nguyên O, K, H. 1.3.5.4. Kháng nguyên giáp mô (kháng nguyên vỏ bọc) Chất nhầy giáp mô phần lớn không có tính định hình vì khuyếch tán, thường được cấu trúc bởi hợp chất polysaccharide nhưng cấu trúc của Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 polysaccharide lại phụ thuộc vào từng họ vi khuẩn khác nhau thì cấu trúc khác nhau, do đó mà tính kháng nguyên của từng loại vi khuẩn khác nhau. Tuy nhiên ở vi khuẩn E. coli nói riêng kháng nguyên giáp mô không đóng vai trò quan trọng, vì vậy chủ yếu đi sâu tìm hiểu kháng nguyên K88, K99 (kháng nguyên Fimbriae) (Nguyễn Thị Nội, 1986) [16]. Một số vi khuẩn trong quá trình phát triển tiết ra một chất nhầy có khả năng tan vào nước ở một mức độ nhất định, chất nhầy này bao bọc xung quanh bên ngoài vách vi khuẩn giúp vi khuẩn chống lại sự tác động của môi trường ngoại cảnh, có thể quan sát thấy ở trạng thái ướt, dễ bị mất đi khi thay đổi điều kiện phát triển gọi là giáp mô (Capsul) (Nguyễn Như Thanh và cộng sự, 1997) [27]. 1.3.5.5. Kháng nguyên F (Fimbriae - Kháng nguyên bám dính) Ngoài lông ra, ở nhiều vi khuẩn gram âm nói chung và vi khuẩn E. coli nói riêng còn có những bộ phận khác hình sợi gọi là pili. Pili hay Fimbriae có bản chất là protein bao phủ trên toàn bộ bề mặt vi khuẩn. Dưới kính hiển vi điện tử, chúng có hình ảnh giống như một chiếc áo lông bao bọc xung quanh vi khuẩn, pili vi khuẩn đường ruột khác lông ở chỗ nó cứng hơn, không lượn sóng và không liên quan đến chuyển động. Trước đây, kháng nguyên bám dính được ký hiệu là K (K88; K99), nay đổi là F (K88 =F4; K99 = F5; 987P = F6). Một số kháng nguyên bám dính thường gặp ở các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được từ gia súc ỉa chảy bao gồm F4, F5, F6, F18 và F41. Riêng đối với giống E. coli phân lập từ lợn thì kháng nguyên Fimbriae F4 (K88) còn ở bê, nghé là F5 (K99) đóng vai trò quan trọng nhất trong việc bám dính (Parry và Porter,1978) [74]. * Kháng nguyên F4 (K88) Kháng nguyên F4 có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, đặc tính này không bị cản trở bởi manose (đề kháng với manose). Kháng nguyên này chỉ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 có mặt ở các chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ phân lợn con bị ỉa chảy, đây là một yếu tố độc lực đối với lợn và không có khả năng gây bệnh đối với loài gia súc khác. Điều đó phụ thuộc vào receptor đặc hiệu, có trên bề mặt tế bào biểu mô ruột non của các loài gia súc khác nhau chỉ cho phép một số serotype E. coli nhất định nào đó gắn với kháng nguyên pili mà thôi. Kháng nguyên F4 được sản sinh ở nhiệt độ 37oC, trong khi ở nhiệt độ phòng (20oC), vi khuẩn không có khả năng tạo kháng nguyên này. Thông tin mã hoá cho tổng hợp cho kháng nguyên nằm ngoài nhiễm sắc thể, trên plasmid (Gyles, 1992) [58]. * Kháng nguyên F5 (K99) F5 trước kia được cho là kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E. coli bê, nghé và cừu. Sự sản sinh của F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố của vi khuẩn như: tốc độ sinh trưởng, pha sinh trưởng, nhiệt độ và alanine trong môi trường, các gen mã hoá cho sự tổng hợp F5 nằm trên ADN của plasmid (Isaacson, 1983) [62]. Tuy nhiên hiện nay chúng cũng được tìm thấy với tỷ lệ thấp ở các chủng ETEC phân lập từ lợn tiêu chảy (Lindhl và cộng sự, 1990) [69]. * Kháng nguyên F6 (987P) Giống như F4, F5, kháng nguyên F6 thường có mặt trong ở các nhóm có kháng nguyên O9, O20, O101, O149. Vật liệu di truyền má hoá quá trình tổng hợp kháng nguyên pili F6 cũng nằm ngoài nhiễm sắc thể, trên plasmid của tế bào vi khuẩn (Orskov, 1980) [72]. * Kháng nguyên F41 Những nghiên cứu đầu tiên về kháng nguyên F5 cho rằng, đây chỉ là kháng nguyên gồm 1 đơn vị, nhưng gần đây điện phân thấy rằng F5 có 2 đơn vị nhỏ, 1 đi về cực dương và 1 đi về cực âm. Đơn vị đi về cực dương được cho là 1 Fimbriae riêng biệt đặt tên là F41. Khối lượng phân tử của F41 là 30,5 KDa (Jacobs và cộng sự, 1985) [63], (Raybould và cộng sự, 1987) [76]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Cox và cộng sự (1993) [44] đã nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về khả năng mẫn cảm và sức đề kháng của lợn đối với vi khuẩn E. coli có F41. Kết quả cho thấy các chủng có F41 bám vào lông nhung (với số lượng thấp) của 23 lợn trong số 30 lợn 4 đến 5 tuần tuổi được kiểm tra. Tại đó tác giả cho thấy rằng, chỉ có lợn lớn tuổi hơn có sức đề kháng với sự bám dính của các chủng E. coli có F41 do các receptor tương ứng với F41 bị giảm đi. * Kháng nguyên F18 Kháng nguyên F18 đã được Rippinger và cộng sự (1995) (dẫn theo Đỗ Ngọc Thuý, 2002) [31] mô tả là có mỗi quan hệ với các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được từ bệnh tiêu chảy ở lợn trước cai sữa và bệnh phù đầu. Dựa vào đặc điểm hình thái, huyết thanh học và đặc điểm kháng nguyên, người ta chia F18 thành 2 loại là: F18ab và F18ac. F18ab thường thấy trong bệnh phù đầu, trong khi đó F18ac phân lập được từ lợn con tiêu chảy trước cai sữa. 1.4. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli Vi khuẩn đường ruột nói chung hay vi khuẩn E. coli nói riêng đều bao gồm các yếu gây bệnh quan trọng sau: 1.4.1. Các yếu tố không phải là độc tố 1.4.1.1. Khả năng bám dính của vi khuẩn Khả năng bám dính của vi khuẩn là yếu gây bệnh vô cùng quan trọng để thực hiện bước đầu tiên của quá trình gây bệnh của vi khuẩn E. coli nói riêng và vi khuẩn đường ruột nói chung. Đó là quá trình liên kết vững chắc giữa bề mặt vi khuẩn với bề mặt tế bào vật chủ (Jones G, 1976) [67]. Ngày nay, bằng phương pháp chụp vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử và các phản ứng sinh hoá, PCR đã xác định cấu trúc vi thể thực hiện chức năng bám dính, giúp vi khuẩn cố định lên niêm mạc ruột, đó là các pili (fimbriae). Fimbriae bao gồm các đơn vị cấu trúc nhỏ, gọi là sợi bám dính có kháng nguyên gọi là kháng nguyên bám dính (kháng nguyên F) (Elsinghorst. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 E. A and Weit. J. A, 1994) [47]. Mỗi loại kháng nguyên bám dính có các quyết định kháng nguyên tương xứng, phù hợp với cấu trúc điểm tiếp nhận trên bề mặt biểu mô nhung mao ruột non. Lê Văn Tạo và cộng sự (1996) [25] đã nghiên cứu về cấu trúc Fimbriae và vai trò K88 trong quá trình gây bệnh, về tổ hợp các yếu gây bệnh có trong một chủng E. coli phân lập, trong đó nêu rõ vai trò của kháng nguyên K88. Đã có nhiều công trình nghiên cứu xác định các kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E. coli như: F4 có ở E. coli gây bệnh tiêu chảy ở lợn con, F18 gây bệnh phù đầu ở lợn con sau cai sữa, F5 có ở E. coli gây bệnh cho bê nghé, F41 có ở E. coli gây bệnh cho trẻ em (Nagy, 1999) [71]. Hiện tượng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vừa mang tính chất hoá học, vừa mang tính chất sinh học và thực hiện theo 3 bước sau: Bước1: vi khuẩn liên kết từng phần với bề mặt tế bào, thực hiện quá trình này đòi hỏi vi khuẩn phải có khả năng di động (Jones, 1983) [68]. Sự liên kết này tăng lên khi bề mặt của vi khuẩn có các ion hoá học hoạt động mạnh, nhờ có ion hoá học này vi khuẩn mới được giữ lại trong lớp dịch nhầy của niêm mạc ruột. Bước 2: đây là quá trình hấp phụ, nó phụ thuộc vào đặc tính bề mặt của vi khuẩn và tế bào mà vi khuẩn bám dính và thực hiện theo hướng thuận nghịch, dưới sự tác động của những lực tương hỗ khác nhau (Freter, 1981) [53]. Việc chuyển động thẳng tiến của vi khuẩn cũng có thể giúp vi khuẩn cố định và bám chắc trên bề mặt tế bào tham gia vào sự hấp thụ của quá trình bám dính (theo Uhllman, 1982) (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Nội, 1986) [16]. Bước 3: quá trình tác động tương tác giữa các yếu tố bám dính của vi khuẩn với các điểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào như màng glucoprotein của tế bào ruột non (nhung mao, tế bào biểu mô, các vi tế bào trên tế bào nhung mao), nó là hợp chất protein mạch thẳng, được tạo bởi những đơn vị tiểu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 phần, số lượng tiểu phần quyết định trọng lượng, độ dài của yếu tố bám dính. Lực lượng để giữ và liên kết giữa các tiểu phần trong yếu tố bám dính đến nay chưa rõ ( Isaacson, 1980) [61]. 1.4.1.2. Khả năng xâm nhập của vi khuẩn Sau khi bám dính, vi khuẩn sẽ xâm nhập vào bên trong lớp tế bào. Tại đây vi khuẩn E. coli phát triển nhân lên với tốc độ lớn, sản sinh độc tố đường ruột, gây phản ứng niêm mạc và đầu độc cơ thể. Khả năng xâm nhập của vi khuẩn đường ruột là một khái niệm để chỉ quá trình chưa được xác định rõ mà nhờ đó vi khuẩn đường ruột qua được hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy trên bề mặt niêm mạc để xâm nhập vào tế bào biểu mô, đồng thời sản sinh và phát triển trong lớp tế bào này. Trong khi đó các vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua được hàng rào bảo vệ lớp màng nhầy hoặc đi qua được lớp hàng rào này sẽ bị vây bắt bởi tế bào đại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc (Giannella, 1976) [54]. 1.4.1.3. Khả năng dung huyết (Hly) Vi khuẩn E. coli phát triển trong tổ chức cơ quan vật chủ, F3+ được cung cấp cho sự dinh dưỡng phụ thuộc vào chất Siderofor do vi khuẩn sinh ra. Chất này có khả năng phân huỷ sắt liên kết trong tổ chức của vật chủ thông qua sự phá vỡ hồng cầu để vi khuẩn sử dụng dạng hợp chất HEM. Vì vậy, việc sản sinh ra chất dung huyết (haemolyzin) của vi khuẩn có thể coi là một yếu tố độc lực của vi khuẩn. Có 4 kiểu dung huyết của vi khuẩn E. coli nhưng quan trọng nhất là kiểu  và . Trong đó kiểu  gắn với tế bào vi khuẩn do vậy mà không có tác dụng độc lực (Smith, 1963) [77]. Kiểu α hình thành là do một protein thẩm thấu qua lọc, không được gắn với tế bào vi khuẩn, được giải phóng vào môi trường nuôi cấy ở pha logarit của chu trình phát triển vi khuẩn và được coi là yếu tố độc lực của vi khuẩn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 Các nhà khoa học đã chứng minh được mức độ gây chết của Haemolyzin trên chuột, trên thai trứng, gây hoại tử trên da thỏ, trên tế bào xơ thai gà, tế bào thận chuột... Trọng lượng phân tử của Haemolyzin khoảng 300.000 Dalton, được cấu tạo chủ yếu là protein còn có cả hydrocacbon (Cavalieri, 1982) [42]. Theo Smith (1967) [79] thì gen này nằm ở Plasmid được đặt tên là Hlyplasmid chỉ sản sinh Haemolyzin có trọng lượng phân tử 41 Md. Gen trong ADN sản sinh Haemolyzin có trọng lượng phân tử 3,2 Md. Những gen di truyền này không cố định ở plasmid hay ADN và không giống nhau ở các loại vi khuẩn. 1.4.1.4. Khả năng kháng kháng sinh Trong thực tế, để điều trị bệnh đường ruột người ta sử dụng nhiều loại kháng sinh, ngoài ra còn trộn chúng vào thức ăn với tỷ lệ thấp để phòng bệnh và kích thích tăng trọng gia súc, gia cầm đã gây nên hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn. Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn đường ruột nói riêng đang ngày càng gia tăng làm hiệu quả điều trị thấp, thậm chí nhiều liệu pháp kháng sinh còn vô hiệu hoá hoàn toàn. Hosoda và cộng sự (1990) [59] nghiên cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn E. coli về các plasmid - R của vi khuẩn này phân lập được từ bê tiêu chảy. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kháng mỗi loại kháng sinh là: Tetracycline 59,7%, Chloramfenicol 21,0%, Streptomycin 52,9%, Sulfadimethoxine 37,8%, Kanamycin 45,4%, Aminobenzyn penicillin 43,7% và Nalidixic axit 28,6%. Trong các chủng kháng thuốc có tới 53,7% số chủng mang các plasmid - R. Theo Lê Văn Tạo và cộng sự (1993) [24] đã xác định được khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh phân trắng và tác giả đi đến kết luận: khả năng kháng sinh được di truyền ngang và dọc bởi các loại plasmid. Bùi Thị Tho (1995) [30], cần có một chiến lược sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi và thú y hợp lý để ngăn chặn kịp thời hiện tượng kháng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 thuốc vì nó ảnh hưởng đến đời sống gia súc và con người, đến môi sinh. đặc biệt sử dụng thuốc kháng sinh như một chất kích thích tăng trọng cần phải được kiểm tra nghiêm ngặt trong sản xuất và đời sống vì nó góp phần không nhỏ vào sự hình thành kháng thuốc và truyền kháng của vi khuẩn E. Coli. Phạm Khắc Hiếu (1996) [5] kiểm tra tính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con bị bệnh phân trắng ở những cơ sở chăn nuôi ở các tỉnh phía Bắc từ._. 6 NSM O20 + + - - + Ghi chú BTC chủng phân lập từ bê ở huyện Thuận Châu BMS chủng phân lập từ bê ở huyện Mai Sơn BMC chủng phân lập từ bê ở huyện Mộc Châu NMS chủng phân lập từ nghé ở huyện Mai Sơn NPY chủng phân lập từ nghé ở huyện Phù Yên NSM chủng phân lập từ nghé ở huyện Sông Mã - Chủng NSM: mang kháng nguyên O20, có tổ hợp các yếu tố gây bệnh STa + STb + F5. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 75 Các chủng vi khuẩn E. coli được trình bày ở bảng 3.15 được tiến hành thử độc lực trên chuột bạch theo phương pháp thường quy bằng cách tiêm cho chuột bạch mỗi con 0,2 ml canh trùng nguyên (ở 370C/24 giờ) của từng chủng riêng rẽ vào xoang phúc mạc. Mỗi chủng được thử trên 2 chuột theo dõi thời gian chuột chết trong vòng 7 ngày, mổ khám kiểm tra bệnh tích... Kết quả được trình bày ở bảng 3.15. Bảng 3.15: Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng vi khuẩn E. coli trên chuột bạch S TT Ký hiệu (Chủng) Số chuột tiêm (con) Số chuột chết (con) Tỷ lệ chết (%) Thời gian chuột chết trung bình (giờ) Kết quả gây bệnh 1 BTC 2 2 100 18- 24 Tiêu chảy, ruột đầy hơi và xuất huyết; lách, gan sưng tụ huyết 2 BMS 2 1 50 24- 36 3 BMC 2 2 100 18- 24 4 NMS 2 2 100 18- 24 5 NPY 2 1 50 36- 48 6 NSM 2 2 100 18- 24 Tổng cộng 12 10 83,33 30,0 Qua bảng 3.15 cho thấy: Có 4 chủng gây chết 100% số chuột trong vòng 18-24 giờ, gồm các chủng: BTC, BMC, NMS và NSM. Có 2 chủng giết chết 50% số chuột trong vòng 24- 48 giờ. Vi khuẩn E. coli gây chết chuột trung bình 83,33%. Các chuột chết đều bị tiêu chảy ruột đầy hơi và xuất huyết; lách gan sưng và tụ huyết. Lấy máu tim phân lập lại đều thu được vi khuẩn E. coli thuần. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 76 Kết quả của chúng tôi đều cao hơn kết quả của Phạm Quang Phúc (2003) [18] và Nguyễn Văn Sửu (2005) [23] khi xác định độc lực của vi khuẩn E. coli phân lập từ bê, nghé bị tiêu chảy là 74,00% và 75,79%. Các chủng giết chết 100% chuột (BTC, BMC, NMS và NSM), ngoài các độc tố, đặc biÖt là chúng đều mang kháng nguyên bám dính F5. Theo Parry và Porter (1978) [74] kháng nguyên bám dính F5 đóng vai trò quan trọng trong việc bám dính gây bệnh tiêu chảy ở bê, còn ở lợn là kháng nguyên bám dính F4. Do đó theo chúng tôi có thể vì không mang kháng nguyên F5 mà mang kháng nguyên bám dính F4 nên các chủng (BMS, NPY) chỉ giết chết 50% số chuột thí nghiệm trong vòng 38 - 48 giờ. Vì vậy qua khi xác định độc lực vi khuẩn E. coli càng khẳng định kháng nguyên bám dính F5 có vai trò quan trọng trong bệnh tiêu chảy ở bê, nghé tại Sơn La. 3.7. Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng vi khuẩn E.coli phân lập đƣợc với một số loại kháng sinh Trong những năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng hiện tượng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn đường ruột ngày càng tăng. Ở tại các địa phương đang sử dụng rất nhiều loại kháng sinh để điều trị bệnh tiêu chảy cho gia súc, với liều lượng khác nhau, dẫn đến hiện tượng nhờn thuốc và thực tế đã có một số loại kháng sinh điều trị không có hiệu quả. Xác định mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được, với mục đích chọn những loại kháng sinh có tác dụng điều trị bệnh đạt hiệu quả cao. Chúng tôi đã chọn 57 chủng vi khuẩn E.coli phân lập được để thử kháng sinh đồ. Kết quả xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh được trình bày ở bảng 3.16. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 77 Bảng 3.16: Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng vi khuẩn E.coli phân lập được với một số loại kháng sinh S TT Tên kháng sinh Số chủng kiểm tra Rất mẫn cảm Mẫn cảm trung bình Kháng thuốc Số chủng % Số chủng % Số chủng % 1 Kanamycin 57 0 0,00 10 17,50 47 82,46 2 Gentamycin 57 35 61,40 9 15,79 13 22,81 3 Neomycin 57 32 56,14 9 15,79 16 28,07 4 Erythromycin 57 0 0,00 12 21,05 45 78,95 5 Streptomycin 57 3 5,26 6 10,53 48 84,21 6 Ampicillin 57 0 0,00 7 12,28 50 87,72 7 Penicillin 57 0 0,00 0 0,00 57 100 8 Ofloxacin 57 52 91,22 4 7,02 1 1,75 9 Norfloxacin 57 51 89,47 5 8,77 1 1,75 10 Amox/clavu 57 50 87,72 6 10,53 1 1,75 Qua bảng 3.16 cho thấy: Các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được từ bê, nghé bị tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại một số huyện ở Sơn La. Mẫn cảm mạnh với các kháng sinh: Ofloxacin 91,22%, Norfloxacin 89,47%, Amox/clavu 87,72%, Gentamycin 61,40%, Neomycin 56,14%. Kháng mạnh với các loại kháng sinh thông thường như Penicillin 100%, Ampicillin 87,72%, Strepyomycin 84,21%, Kanamycin 82,46%, Ethromycin 78,95%. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cúu của Phạm Quang Phúc (2003) [18] đã khẳng định vi khuẩn E. coli phân lập từ bê, nghé bị tiêu chảy và chết do tiêu chảy rất mẫn cảm với Ofloxacin và Norfloxacin. Qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi kết luận để điều trị bệnh tiêu chảy bê, nghé do vi khuẩn E. coli gây ra, có thể sử dụng các loại kháng sinh Ofloxaci, Norfloxacin, Amox /clavu, Gentamycin và Neomycin. 3.8. Kết quả của một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở bê, nghé Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 78 Bảng 3.17: Kết quả điều trị thực nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở bê nghế Phác đồ điều trị Loại thuốc Liều lƣợng và cách dùng Số đƣợc điều trị (con) Thời gian điều trị (ngày) Kết quả điều trị Số khỏi bệnh (con) Tỷ lệ khỏi (%) I Norfloxacin 1ml/10 kg TT; tiêm bắp, 2 lần/ngày 93 3 75 80,6 điện giải Pha nước uống, 10g/con/ngày ADE B-complex 1-2 ml/con; tiêm bắp, 2 ngày/1 lần Glucose 30% Plus vitamin C 1ml/6-8 kgTT; phúc xoang hoặc uống, 2 lần /ngày II Gentamycin 80mg 4-6 mg/kg TT; tiêm bắp, 2 lần/ngày 52 3 33 63,4 điện giải Pha nước uống, 10g/con/ngày ADE B-complex 1-2 ml/con; tiêm bắp, 2 ngày/1 lần Glucose 30% Plus vitamin C 1ml/6-8 kgTT; tiêm phúc xoang hoặc uống, 2 lần /ngày III Neomycin 10 – 15 mg/kgTT, tiêm bắp, 2 lần/ngày 37 3 19 51,3 Điện giải Pha nước uống, 10 g/con/ngày ADE B-complex 1-2 ml/con; tiêm bắp, 2 ngày/1 lần Glucose 30% Plus vitamin C 1ml/6-8 kgTT; tiêm phúc xoang hoặc uống, 2 lần/ngày 7 8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 79 Qua kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh ở bảng 3.17 cho thấy: Khi bê nghé bị mắc bệnh tiêu chảy, nên sử dụng kháng sinh như Ofloxaci, Norfloxacin, Amox /clavu, Gentamycin và Neomycin để điều trị sẽ đạt hiệu quả cao nhất cho người chăn nuôi trâu bò. Tuy nhiên, do điều kiện thực tế hiện nay, trên thị trường hiện chưa có các loại kháng sinh mới như: Ofloxacin, Amox /clavu dùng cho gia súc, nên không thể sử dụng các loại kháng sinh đã nêu trên để điều trị thực nghiệm. Nhưng để đáp ứng yêu cầu thực tế sản xuất là phải chọn được loại kháng có tính chất phổ thông, giá thành hợp lý và có hiệu quả, chúng tôi đã chọn và thử nghiệm 3 loại kháng sinh dùng cho 3 phác đồ là: Norfloxacin, Gentamicin và Neomycin, các loại thuốc tăng cường sức đề kháng, thuốc bổ, các chất điện giải với liều lượng và cách dùng giống nhau ở cả 3 phác đồ là: Bột điện giải, ADE B-Complex, Glucose 30% Plus vitamin C. Kết quả điều trị được trình bày ở bảng 3.17. Bảng 3.17 cho thấy: - Với 3 phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy cho bê, nghé bị tiêu chảy, tỷ lệ khỏi bệnh giữa các phác đồ có sự chênh lệch khá lớn, biến động từ 51,3-80,6%. - Phác đồ I có tỷ lệ điều trị khỏi bệnh cao nhất (80,6%), tiếp theo là phác đồ II (63,4%) và phác đồ III (51,3%). Như vậy, để điều trị bệnh tiêu chảy cho bê nghé, có thể dùng phác đồ I, tức là dùng kháng sinh : Norfloxacin để điều trị tiêu chảy do vi khuẩn E. coli gây ra. Đồng thời, kết hợp với sử dụng các loại thuốc bột như: bột điện giải cho uống để bù nước và lượng ion Cl-, Na+, HCO3 - bị mất do tiêu chảy; ADE-Complex tức là thuốc tổng hợp các loại vitamin: A, D, E và vitamin nhóm B để tăng cường sức đề kháng của cơ thể và tăng quá trình tiêu hoá thức ăn. Glucose (30%) ưu trương làm tăng cường hoạt động của lưới nội mô, kích thích đông máu, điều hoà nước trong cơ thể, tăng cường chức năng gan, khích thích quá trình trao đổi chất, hấp thụ các vitamin, các chất khoáng... (Nguyễn Hữu Vũ và cs, 2000) [32], chống nhiễm độc, tự nhiễm độc (Nguyễn Phước Tương, 1994) [33]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 80 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận Dựa trên các kết quả nghiên cứu đã đạt được, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1.1. Bê nghé nuôi tại Sơn La bị tiêu chảy và chết khá cao. Trong giai đoạn từ sơ sinh đến 12 tháng tuổi tỷ lệ tiêu chảy ở bê là 18,29%, nghé là 16,37%; tỷ lệ chết ở bê là 15,63%, ở nghé là 13,51%. 1.2. Bê, nghé bị tiêu chảy và chết giảm dần theo tháng tuổi, tháng tuổi càng cao thì tỷ lệ tiêu chảy và chết càng thấp. - Bê từ sơ sinh đến 3 tháng tuổi tỷ lệ tiêu chảy là 29,41%, ở 4-6 tháng tuổi là 18,40% và 7-12 tháng tuổi là 8,00%. Tỷ lệ chết tương ứng là 20,64%, 13,21% và 0%. - Nghé từ sơ sinh đến 3 tháng tuổi tỷ lệ tiêu chảy là 27,21%, ở 4-6 tháng tuổi là 13,04% và 7-12 tháng tuổi là 7,14%. Tỷ lệ chết tương ứng là 17,50%, 11,11% và 0%. 1.3. Mùa vụ và thời tiết ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc tiêu chảy và chết của bê nghé. - Tiêu chảy ở bê, nghé cao nhất là mùa Xuân ở bê là 22,60%, ở nghé là 23,85%; tiếp đó là mùa Hè ở bê là 17,60%, nghé là 15,74%; mùa Đông ở bê là 17,39%, ở nghé là 14,18%; thấp nhất là mùa Thu ở bê là 16,52%, ở nghé là 11,88%. - Bê, nghé chết cao nhất vào mùa Đông: ở bê là 27,50%, ở nghé là 15,79%; tiếp đó là mùa Xuân ở bê là 16,50%, ở nghé là 15,38%; mùa Hè ở bê là 11,9%, ở nghé là 11,76%; thấp nhất là mùa Thu ở bê là 6,41%, ở nghé là 8,33%. 1.4. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn E. coli ở mẫu phân bê nghé bị tiêu chảy: ở bê là 94,05%, ở nghé là78,12% cao hơn ở mẫu phân bình thường: ở bê là 78,78%, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 81 ở nghé là 65,33%. Đồng thời số lượng vi khuẩn cũng tăng cao, bê, nghé bị tiêu chảy số lượng vi khuẩn bình quân tăng so với bình thường ở bê là 3,12 lần, ở nghé là 3,03 lần. 1.5. Vi khuẩn vi khuẩn E.coli phân lập được mang đầy đủ các đặc tính sinh hoá như các tài liệu đã mô tả. 1.6. Số chủng vi khuẩn E. coli thuộc về 4 serotype kháng nguyên O chính đó là: O101, O8, O9, O20. Trong đó số chủng thuộc nhóm kháng nguyên O101 chiếm tỷ lệ cao nhất là 25,35%, O8 là 15,49%, O9 là 14,08%, O20 là 11,27% 1.7. Vi khuẩn E. coli phân lập từ bê, nghé tại Sơn La mang đặc tính gây bệnh tiêu chảy: - Có 11/71 chủng gây dung huyết kiểu  (15,49%), 16/71 chủng dung huyết kiểu  (22,53%). - Có 26/57 chủng sản sinh ra STa (45,61%), 22/57 chủng sản sinh STb (38,60%), 3/57 chủng sản sinh LT (5,26%), 19/57 chủng mang cả 3 độc tố STa+STb+LT (33,33%). - Trong 57 chủng kiểm tra, có 6 chủng mang yếu tố bám dính F4 (K88) chiếm 10,53%, có 18 chủng mang yếu tố bám dính F5 (K99) chiếm 31,58%. 1.8. Các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh ở bê, nghé ở Sơn La mang các yếu tố gây bệnh thuộc các tổ hợp chính: - Tổ hợp STa + STb + LT + F5 (8,77%) - Tổ hợp STa + STb + LT + F4 (7,02%) - Tổ hợp STa + STb + F5 (52,63%) - Tổ hợp STa + STb + F4 (14,03%) - Tổ hợp STa+STb (12,28%) 1.9. Vi khuẩn E. coli phân lập được có độc lực mạnh có 4/6 chủng vi khuẩn gây chết chuột 100% trong vòng 18-24 giờ, có 2/6 chủng vi khuẩn gây chết 50% số chuột trong vòng 24-48 giờ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 82 1.10. Vi khuẩn E.coli phân lập được tại Sơn La rất mẫn cảm với 5 loại kháng sinh là Ofloxacin 91,22%, Norfloxacin 89,47%, Amox/clavu 87,72%, Gentamycin 61,40%, Neomycin 56,14% . Có thể sử dụng Norfloxacin để điều trị cho bê nghé bị tiêu chảy nuôi tại Sơn La. 2. Đề nghị Triển khai áp dụng các kết quả nghiên cứu của đề tài vào thực tế sản xuất chăn nuôi của các hộ, trang trại trên địa bàn tỉnh cũng như cũng như trong công tác quản lý của cơ quan thú y. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TÀI LIỆU THAM KHẢO BẰNG TIẾNG VIỆT 1. Chi cục Thú y tỉnh Sơn La (2007), Báo cáo tình hình dịch bệnh gia súc, gia cầm hàng tháng, năm từ năm 2006-2007, Sơn La. 2. Lê Minh Chí (1995),"Bệnh tiêu chảy ở gia súc", Báo cáo hội thảo khoa học, Bộ nông nhgiệp và Công nghiệp thực phẩm, tr 20-22. 3. Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ (1995), Bệnh đường tiêu hoá lợn con, Nxb Nông nghiệp. 4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên và cs (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập II, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà nội. 5. Phạm Khắc Hiếu, Bùi Thị Tho (1996), "Kết quả kiểm tra tính kháng kháng sinh của E. coli phân lập từ lợn con bị bệnh phân trắng tại các tỉnh phía bắc trong 20 năm qua (1975-1995)", Tạp chí KHKT Thú y, 3 (4), tr 57-63. 6. Phạm Khắc Hiếu (1997), "Một số vấn đề dược lý học đối với gia súc non", Tạp chí KHTY, số 1 tr 72. 7. Phạm Khắc Hiếu, Bùi Thị Tho (1999), "Một số kết quả tính kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trong thú y", Kết quả nghiên cứu KHKT khoa Chăn nuôi Thú y, Nxb Nông nghiệp, tr 134-138. 8. Phạm Văn Khuê, Phan Văn Lục (1996), Giáo trình ký sinh trùng thú y, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 9. Phạm Sĩ Lăng, Phan Địch Lân (1997), Bệnh trâu bò ở việt nam và biện pháp phòng trị, Nxb Nông nghiệp, tr 217. 10. Phạm Sĩ Lăng, Lê Văn Tạo, Bạch Đằng Phong (2002), Bệnh phổ biến ở bò sữa, Nxb Nông nghiệp, tr 227 và 276. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 84 11. Hồ Văn Nam, Nguyễn Huy Thông, Nguyễn Thị Đào Nguyên, Trương Quang, Phạm Văn Khẩn, Nguyễn Hiệp, Phùng Quốc Chướng, Chu Đức Thắng, Phạm Ngọc Thạch (1997), "Bệnh viêm ruột ỉa chảy ở lợn", Tạp chí KHKT thú y, số 2, tr 39-45. 12. Hồ Văn Nam, Nguyễn Huy Thông Nguyễn Thị Đào Nguyên, Trương Quang, Phạm Văn Khẩn, Phạm Ngọc Thạch, Nguyễn Bá Hiên, Đặng Như Phả (1997), "Bệnh viêm ruột ở trâu" .Tạp chí KHKT thú y, số 2, tr 6. 13. Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú, Đỗ Ngọc Thuý, Âu Xuân Tuấn, Nguyễn Xuân Huyên, Văn Thị Hường và Vũ Ngọc Quý (2003), "Kết quả điều tra tiêu chảy của lợn con theo mẹ tại một số trại lợn miền bắc Việt Nam, xác định tỷ lệ kháng kháng sinh và các yếu tố gây bệnh của các chủng E. coli phân lập được", Báo cáo khoa học Viện Thú y Quốc gia, tr 6-7, 11-12. 14. Phạm Hồng Ngân (2007), "Phân lập, xác định serotype và một số yếu tố gây bệnh của Salmonella từ bê dưới 6 tháng tuổi", Tạp chí KHKT thú y 4 (2), tr 44. 15. Nguyễn Ngã, Nguyễn Thiên Thu, Lê Lập, Lê Thị Thi, Vũ Khắc Hùng (2000)," Điều tra nghiên cứu hệ vi khuẩn trong hội chứng tiêu chảy của bê, nghé khu vực miền Trung", Tạp chí KHKT Thú y, 7(2), tr 36-40. 16. Nguyễn Thị Nội (1986), Tìm hiểu vai trò Escherichia coli trong bệnh phân trắng của lợn con và vắc xin dự phòng, Luận án Phó tiến sĩ nông nghiệp, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam. 17. Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh, Đỗ Ngọc Thuý (2000), "Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli và Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác định một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn phân lập được và biện pháp phòng trị", Kết quả nghiên cứu KHKT Thú y năm 1996 - 2000, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 85 18. Phạm Quang Phúc (2003), Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học, vai trò của E.coli gây tiêu chảy ở bê, nghé tại tỉnh Thái Nguyên và biện pháp phòng trị, Luận án Tiến sĩ nông nghiệp, Hà Nội. 19. Nguyễn Vĩnh Phước (1970), Vi sinh vật học thú y, Tập II, Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. 20. Nguyễn Văn Quang (2004), Vai trò của Salmonella và E.coli trong hội chứng tiêu chảy của bò, bê ở các tỉnh Nam trung bộ và bước đầu chế tạo thử kháng thể phòng trị bệnh, Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp, Hà Nội. 21. Trương Văn Quang, Phạm Hồng Ngân, Trương Hà Thái (2006), "Kết quả nghiên cứu vai trò gây bệnh của E.coli trong bệnh tiêu chảy bê, nghé", Tạp chí KHKT thú y, 4 (8). 22. Sở Nông nghiệp và PTNT Sơn La (2006), Báo cáo tình hình phát triển chăn nuôi năm 2006 và định hướng phát triển chăn nuôi đến năm 2010, Sơn La. 23. Nguyễn Văn Sửu (2005), Nghiên cứu tình hình tiêu chảy của bê, nghé dưới 6 tháng tuổi tại 3 tỉnh miền núi phía Bắc và xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli, Salmonella và Clostridium perfringens phân lập được, Luận án tiến sĩ Nông nghiệp, Hà Nội. 24. Lê Văn Tạo, Khương Bích ngọc, Nguyễn Thị Vui, Đoàn Băng Tâm (1993), "Xác định các yếu tố di truyền bằng Plasmid của vi khuẩn E. coli để chọn giống sản xuất vắc xin phòng bệnh phân trắng lợn con", Công trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật (1990-1991), Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr 77-81. 25. Lê Văn Tạo (1996), "Cấu trúc Fimbriae, kháng nguyên bám dính K88 của vi khuẩn E. coli và vai trò của nó trong quá trình gây bệnh phân trắng lợn con", Tạp chí Nông nghiệp, Công nghiệp thực phẩm, số 2 năm 1996, Hà Nội. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 86 26. Lê Văn Tạo, Nguyễn Ngã và cộng sự (2003)," Độc lực và một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli phân lập từ bê tiêu chảy tại các tỉnh Nam Trung Bộ", Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 3 (8). 27. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (1997), Vi sinh vật học Thú y, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr 81-85. 28. Trịnh Văn Thịnh (1964), Giáo trình bệnh nội khoa và bệnh ký sinh trùng thú y, Nxb Nông thôn, Hà Nội. 29. Trung tâm dự báo khí tượng thuỷ văn tỉnh Sơn La (2008), Thông báo khí tượng thuỷ văn từ tháng 6 năm 2007 đến tháng 6 năm 2008, Sơn La. 30. Bùi Thị Tho, Phạm Khắc Hiếu (1995), "Tình hình kháng thuốc của E. coli phân lập từ lợn con phân trắng trong thời gian qua", Tạp chí KHKT Thú y, 2 (1), tr 92-93. 31. Đỗ Ngọc Thuý, Drraen Trot, Alan Forst, Kirsty Townsend, Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Nguyễn Xuân Huyên, Âu Xuân Tuấn, Văn Thị Hường và Vũ Ngọc Quý, "Tính kháng kháng sinh của các chủng Escherichia coli phân lập từ lợn tiêu chảy của một số tỉnh miền Bắc Việt Nam (2002)", Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập IX, (số 2- 2005), tr 21-27. 32. Nguyễn Phước Tương (1994), Thuốc và biệt dược Thú y, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr 363-354. 33. Nguyễn Hữu Vũ, Nguyễn Đức Loan (2000), Thuốc Thú y và cách sử dụng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr 326-328. B. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG NƢỚC NGOÀI 34. Abdul-rudha G.S., Hassan F.K., Sharma V.K. (1984), "Charaterisation of Escherichia coil from diarrhoeic calves", Veterinary Record. 114 (20), pp. 39. 35. Acres S.D. (1985), "Enterotoxingenic Escherichia coli infections in newborn calves", A review, Journal of dairy science. 68 (1), pp 229- 256. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 87 36. Al-Dabbas A.H.M., Willinger H (1986)," Properties of Escherichia coli Strains from calves with diarrhoea before weaning", Wiener Tiararztliche Monatsschrif, pp. 217-222. 37. Arkhangelxky I.I., Akmedov A.M. (1969), "Guide diagnosis of infection animal diseases", Press “ Kolos” Moskva, pp. 147- 156. 38. Baljer G, Wieler L, Buaerfeind. R, Ludwig. S.W., Mayr A (1990), "Demonstration of verotoxin production by Escherichia coli by a cell culture test and DNA hybridization applied to faeces from calves with diarrhoea", Tierartliche-Umschau, 45(2), pp. 71-78. 39. Bergeys (1957), Manual of Determinative bacteriology-9, London, Bailiere, Tindll and cox, Itd, pp. 179-180. 40. Bertschinger H.U., Fairbrather. J.M., Nielsen. N.O., Pohlenz. J. F, Escherichia coli infection. Diseases of swine, IOWA state University press/AMES, IOWA U.S.A. 7 th Edition, 1992, pp. 487- 488. 41. Blanco M, Blanco J, Blanco J.E. Ramos J (1993), "Enterotoxingenic, verotoxigenic, and necrotoxigenic Escherichia coli isolated from cattle in Spain", American Journal of veterinary reseach (USA), 54(9), pp. 1446-1451. 42. Cavalieri S.J, Snyder I (1982), Cytotoxin activity of a partially purifield Escherichia coli alpha-haemoltsin, J. Med. Microbiology 15, 1982, pp. 11-12. 43. Contrepois M, Baroux D, Nevetat H, Espinasse J, Chevalier A, Hamm C.A., Chauveau J.F. (1990), " Study of a new syndrome of newborn charolais calves: Paralytic gastroenteritis .II. study of the virulence markers CS31A and col V of Escherichia coli isolated from faeces", Bulletin de I , Academie Veterinaire de France, 63 (3), pp. 289-294. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 88 44. Cox E, Houvenagel A (1993), Comparison of the invitro adhension of K88, K99, F41 and 987P positive Escherichia coli to intestinal villi of 4 to 5 week old pigs.Vet. Microbiol, pp. 7-18. 45. Cray W.C., Moon H.W. (1995), "Experimental infection of calves and adult cattle with Escherichia coli O157:H7", Applied and Environmental Microbiology (USA), 61(4), pp. 1586-1590. 46. Edward Aliam J (1990), Foodborne and waterborne bacterial diseases of Huma, pp. 538-544. 47. Elsingshorst E.A and Weit J.A. (1994), Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic E. coli tib locus is assocated with a 104 kilodalton outer membrance protein, Infect. Immun, 62, pp. 3463- 3471. 48. Evan D.G., Evans D.J., Gorbach S.L. (1981), "Production of vascular permeability factor by enterotoxigenic Escherichie coli isolated from man", Infect.Immun, V8, pp. 725- 730. 49. Fairbrother J. M., Alleman B.E., Straw W. L., Mengelign S, Dallare E.T., Taylor D.J. (1992), Entric colibacillosis, Diseases of swin. iowa state University press, Ames, pp. 489. 50. Felix B, Margadant A, Peduzzi Y, Piffaceti J.C. (1983), "The plasmid pattern as an epidemiologic tool for Salmonella typhymurium epidemic comparison with the lysotype", The Journal of Infections, 148 (1), pp. 243-244. 51. Fetisova K (1989), "Role of Escherichia coli and Salmonella ingastroenteritisn of newborn calves", Veterinarna Sbirka, 87(70), pp. 29-32. 52. Fialova J (1989), "Survey of the results of serotyping Escherichia coli strains isolated from intestinal infections of piglets and calves in 1986 and 1987", Veterinarstvi, 39 (1), pp. 23-26. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 89 53. Freter R, Alweiss B, O,brien P. C. M. (1981), "Roce of chemotoxin in the association of motile bacteria with intestinal mucose, in vitro studies", Infect Immun, (34), pp.241-249. 54. Gianella R.A., Rout W.R., Formal S.P., Colling H (1976), "Role of plasma filtration in the intestinal fluid secretion medicated by infection with Salmonella typhymurium", pp. 470- 474. 55. Gonzalez E. A., Blanco J (1989), "Serotypes and antibiotic resistance of verotoxigenic (VTEC) and necrotizing (NTEC) Escherichia coli strains isolated from calves with diarrhoea", FEMS Microbiology Letters, 60(1), pp. 31-36. 56. Guerrant R.L. (1985), "Microbial toxins and diarrhoeal diseases: introduction and overview", Ciba Found Symp, (112), pp. 1-13. 57. Gunther H, Schulze F (1985), "Influence of age on ther resistance of calves to Echerichia coli diarrhoea", Monatsshefte fur Veterina medzin, 40(12), pp. 419-422. 58. Gyles G.L (1992), Escherichia coli cytotoxins and enterotoxin Can. J. Microbiol. 38- 2 p. 734-746. 59. Hosoda N, Ito H, Sameshima T, Hamaoka Y, Terakado N (1990), "Drug resistance and R plasmids of Escherichia coli isolated from diseases calves and pigs", Jour of the Japan Veterinary Medical- Association, 43 (1), pp. 25-28. 60. Hutyra M, Manninger M (1978), Patologia y terapeutica especiales de los animals domesticos- Educion Revolucionaria. Cuba, pp. 103-128. 61. Issacson R.E., Dean E.A., Morgan R.I., Moon H.W. (1980), "Immunization of suckling pigs against enterotoxigenic Escherichia coli-induced diarrhoea disease by vacinating dams with purifued H99 or 987P pili Antileody production in response to vaccination", Infect Immun, 29, pp. 824-826. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 90 62. Issacson R.E. (1983), Regulation of expression of Escherichia coli pilus K99, infec,. Immun (40), pp. 633-639. 63. Jacob A.A.C and de Graaf F. K. (1985), Production of K88, K99 and F41 fimbriae in relation to growth phage and rapid procedure for adhesion Purinfication, FEMS. Micribiol, lett, (26), pp 15-19. 64. Jain N.C., Vegad J.L., Shivastava A.B., Jain N.K., Garg U.K., Kolte G.N. (1989), "Heamatological changes in buffalo calves inoculated with Escherichia coli endotoxin and corticosteroids", Research in Veterinary Science, 47(3), pp. 305-308. 65. Janke B.H., Francis D.H., Collins J.E., Libal M.C., Zeman D.H., Johson D.D. (1989), "Attaching and effacing Escherichia coli infections in calves, pigs, lambs, and dogs", Journal of Veterinary Diagnostic- nvestigation, 1919, pp 6-11. 66. Janke B.H., Francis D.H., Collins J. E., Libal M.C., Zeman D.H., Johnson D.D., Neiger R.D. (1990), "Attaching and effacing Escherichia coli infections as a cause of diarrhoea in young calvesa", Journal of the Americal Veterinary Medical Association, 196(6), pp. 897-901. 67. Jones G, Freter R (1976), "Adhesive properties of Vibrio cholerae nature of the interaction with isolated rabbit brush border membranes and human erythrocytes", Infect. Immun, (13), pp. 240-245. 68. Jones G.W., Issacson R.E. (1983), Proteinaceous bacterial adhesins and receptor, Crit Rev Microbiol, 10(3), pp. 229-60. 69. Lindhl M and Carlstedt I (1990), Binding of K99 fimbriae of enterotoxigenic E. coli to pig small intestinal mucin glycopeptide, J. Gene. Microbiol, pp. 1609-1614. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 91 70. Minhew (1978), Development of a Universal Intimin Antiserum and PCR Primers. American Society for Microbiology, pp. 3822. 71. Nagy B, Fekete P.Z. (1999), "Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in farm animal", Vet. Res, 30, pp. 259-284. 72. Orskov I, Birich F, Andersen A (1980), Comparison of Escherichia coli fimbriae antigen f7 with type I. Fimbriae Infect, Immun. 27. pp.657-66. 73. Otoi T, Toujou H, Hasimoto M (1990), "Outbreak of K99 + Escherichia coli infection in calves and a serogolical survey", Journal of the Japan Veterinary Medical Associaction, 43(3), pp. 193-196. 74. Parry S.H., Porter P (1978), "Immunological aspects of cell membrance adhesion demonstrated by porcince enteropathogenic Escherichia coli", Immunogogy, Jan 34(1), pp. 9-41. 75. Pohl P, Cleenweerck I, Imberechts H, Marin M, Jacquemin E, China B, Mainil J (1997), "Differences betwween pathotypes and serogroups of verotoxin producing Escherichia coli strains (VTEC) isolated from diarrhoeic or health calves", Annales de Medecine Veterinaire (Belgium), 141(2), pp. 155-159. 76. Raybould T.J.G., Grouch C.F., Acres S.D. (1987), Monoclonal antibody response, hemagglutination and capure enxyme linked in immuno sorbet assays for direct detection and quantitation of F41 and K99 fimbrial antigen in enterotoxigenic Escherichia coli J. Clin, Microbiol, pp. 278-284. 77. Smith H.W.(1963), "The haemolysins of Escherichia coli". J. Pathol. Bacterial, 85), pp. 197-212. 78. Smith H.W., Halls S (1967), The transmissible nature of the gentic factor in E. coli that controls hemolysin production, J. Gren. Micrpbiol, 47 1967, pp. 153-161. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 92 79. Smith H.W, Halls (1968), "The transmissible nature of the gentic factor in E. coli that controls enterotoxin production", J. Gren. Micrpbiol, V52, pp.319-388. 80. Sokol A, Mikula I, Sova C (1981), Neonatal Coli Infencie, ich Laboratorina doanostina aprevencia UOLV-Kosice.pp.40-45. 81. Sojka W.J., Erskine R.G., Lioyd M.K. (1957), “Haemolytic Escherichia coli and oedema disease of pigs”. Vet. Rec (4), pp. 293. 82. Sydney M, Finegold, Elen jo Baron (1986), "Bailey and Scotts, Diagnostic Microbiology". Seventh edition, pp. 398-421. 83. Tominaga K, Nakazawa M, Haritani H (1989), "Biochemical characteristics and pathogenicity of attaching and effacing Escherichia coli (AEEC) isolated from calves with diarrhoea". Journal of the Japan Veterinary Medical Association, 42 (11), pp. 775-779. 84. Virginal L, Waterst and Jorge H.C. (1991), Colicin virulence Plasmids. Microbiologycal, Review, Sep, pp. 473-450. 85. Weistien D.L., Carsiotis M, Lissner C.R., Osrien A.D. (1984), "Flagella help Salmonella typhimurium survive within murine macrophages", Infectionnand Immunity, (46), pp 819-825. 86. Ziner S.H., Peter G (1983), "The potential role of cell wall core glycolipids in the immunoprophylaxis and immunotheropy of Gram- negative rod bacteraomia" Medical Microbiology London and New York, pp. 7185. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 93 MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HOẠ Thể trạng Bê bị tiêu chảy Phân Bê đang bị tiêu chảy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 94 Ruột Bê chết do bị tiêu chảy căng đầy hơi Khuẩn lạc vi khuẩn E.coli trên môi trường thạch Mac Conkey Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 95 Phản ứng lên men đường xác định vi khuẩn E.coli Hình thái vi khuẩn E.coli chụp dưới kính hiển vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 96 Khả năng mẫn cảm kháng sinh của một số chủng E.coli phân lập được Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 97 2: Negative control; 8: F4 positive control; 15: F18: field isolate; 3: STa positive control; 9: F41 positive control; 16: F4 field isolate; 4: STb positive control; 10: F18 positive control; 17:F4+F6 filed isolate; 5: LT positive control; 12:STa field isolate; 18: F4+F5 field isolate; 6: F6 positive control; 13: STb field isolate; 19: F18 field isolate 7:F5 positive control; 14: STb+LT field isolate; Lane 1, 11, 20: 100 bp DNA marker Phản ứng PCR xác định cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn E.coli 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 ._.