Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Newcastle ở gà và ứng dụng kỹ thuật hoá mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… i Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o tr−êng ®¹i häc n«ng nghiÖp hµ néi ------------------ NguyÔn thÞ h−¬ng giang NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA BỆNH NEWCASTLE Ở GÀ VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HOÁ MÔ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ðOÁN BỆNH LuËn v¨n th¹c sÜ n«ng nghiÖp Chuyªn ngµnh : Thó y M· sè : 60.62.50 Ng−êi h−íng dÉn khoa häc : TS. NGUYÔN THÞ LAN HÀ NỘI, 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất cứ công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 12 năm 2009 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hương Giang Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… ii Lêi c¶m ¬n Trong qu¸ tr×nh häc tËp vµ thùc hiÖn ®Ò tµi tèt nghiÖp, ngoµi sù nç lùc cña b¶n th©n, t«i cßn nhËn ®−îc rÊt nhiÒu sù gióp ®ì cña c¸c tËp thÓ c¸ nh©n trong vµ ngoµi tr−êng. Nh©n dÞp nµy, T«i xin bµy tá lßng biÕt ¬n s©u s¾c cña m×nh ®èi víi TS. NguyÔn ThÞ Lan, c« gi¸o ®· trùc tiÕp h−íng dÉn vµ chØ b¶o tËn t×nh trong suèt qu¸ tr×nh t«i häc tËp vµ hoµn thµnh luËn v¨n tèt nghiÖp nµy. T«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n c¸c ThÇy C« gi¸o trong Bé m«n BÖnh lý, Khoa Thó y vµ ViÖn ®µo t¹o sau ®¹i häc, Tr−êng §¹i häc N«ng nghiÖp Hµ Néi. §ång thêi ®−îc göi lêi c¶m ¬n ch©n thµnh ®Õn c¸c Gi¸o s− vµ b¹n bÌ cña t«i t¹i Lab nghiªn cøu cña Tr−êng §¹i häc Miyazaki NhËt B¶n ®· tËn t×nh gióp ®ì t«i trong suèt qu¸ tr×nh nghiªn cøu t¹i ®©y. §Ó hoµn thµnh luËn v¨n nµy t«i cßn nhËn ®−îc sù ®éng viªn, khÝch lÖ cña gia ®×nh, ng−êi th©n vµ b¹n bÌ ®ång nghiÖp. T«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n nh÷ng t×nh c¶m cao quý ®ã! Hµ Néi, Ngµy 15 th¸ng 12 n¨m 2009 T¸c gi¶ luËn v¨n NguyÔn ThÞ H−¬ng Giang Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… iii MỤC LỤC PHẦN I MỞ ðẦU.........................................................................................1 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ðỀ TÀI ...........................................................1 1.2 MỤC TIÊU CỦA ðỀ TÀI........................................................................2 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................3 2.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH NEWCASTLE....................................3 2.1.1. Lịch sử bệnh. ........................................................................................3 2.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Newcastle trên thế giới. .............................5 2.1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh Newcastle trong nước ................................9 2.2. MỘT SỐ ðẶC ðIỂM CỦA VIRUS NEWCASTLE VÀ BỆNH NEWCASTLE..12 2.2.1. Một số ñặc ñiểm của virus Newcastle ................................................12 2.2.2. Một số ñặc ñiểm bệnh Newcastle........................................................20 2.3. MỘT SỐ HIỂU BIẾT CƠ BẢN VỀ HOÁ MÔ MIỄN DỊCH ................28 2.3.1. Lịch sử phát triển của kỹ thuật hoá mô miễn dịch ...............................28 2.3.2. Nội dung của kỹ thuật hoá mô miễn dịch............................................29 2.3.3. Ứng dụng của hoá mô miễn dịch trong chẩn ñoán giải phẫu bệnh ..........31 PHẦN III. ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................32 3.1. ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...............................................................32 3.2. THỜI GIAN VÀ ðỊA ðIỂM NGHIÊN CỨU........................................32 3.3. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT...........................................32 3.3.1. Nguyên liệu ........................................................................................32 3.3.2. Dụng cụ, hoá chất ...............................................................................32 3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU..................................................................33 3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................................33 3.5.1. Phương pháp quan sát, thống kê sinh học ...........................................33 3.5.2. Phương pháp mổ khám .......................................................................34 3.5.3. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý ......................................................34 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… iv 3.5.4.Phương pháp ñếm hồng cầu, bạch cầu bằng buồng ñếm Newbauer: ....37 3.5.5. Phương pháp làm huyết sắc tố Shalli ..................................................38 3.5.6 Phương pháp Hematocrit .....................................................................39 3.5.7. Phương pháp chẩn ñoán huyết thanh học: HI......................................40 3.5.8. Phương pháp nhuộm hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry-IHC)......40 3.5.9 Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................42 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................43 4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TRIỆU CHỨNG, BỆNH TÍCH ðẠI THỂ CỦA BỆNH NEWCASTLE Ở GÀ ISA BROWN (20 – 22 TUẦN TUỔI) ..............43 4.1.1 Kết quả khảo sát triệu chứng lâm sàng gà mắc bệnh Newcastle. .........43 4.1.2. Kết quả khảo sát bệnh tích ñại thể ở gà mắc bệnh Newcastle..............45 4.2. MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA BỆNH NEWCASTLE Ở GÀ GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM ...............................................................49 4.2.1. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của bệnh Newcastle ở gà gây nhiễm thực nghiệm.......................................................................................52 4.2.2. Kết quả nghiên cứu bệnh tích ñại thể chủ yếu của gà thí nghiệm mắc bệnh newcastle .............................................................................................55 4.2.3. Kết quả so sánh triệu chứng, bệnh tích của bệnh Newcastle ở gà gây nhiễm và gà mắc bệnh tự nhiên. ...................................................................58 4.2.4. Kết quả nghiên cứu bệnh tích vi thể chủ yếu ở một số cơ quan của gà mắc bệnh Newcastle .....................................................................................64 4.2.5. Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh Newcastle....68 4. 3. KẾT QUẢ NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH.......................................74 4.4. MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA BIẾN ðỔI ðẠI THỂ, VI THỂ, HOÁ MÔ MIỄN DỊCH TRONG SỰ PHÂN BỐ VIRUS TRÊN MỘT SỐ CƠ QUAN CỦA GÀ MẮC BỆNH NEWCASTLE ........................................................77 4.5. SO SÁNH HIỆU QUẢ CHẨN ðOÁN BỆNH NEWCASTLE BẰNG IHC VỚI CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÁC. ....................................................80 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… v PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ ..........................................................82 5.1 KẾT LUẬN............................................................................................82 PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................84 1. Tài liệu Tiếng Việt....................................................................................84 2. Tài liệu Tiếng Anh....................................................................................87 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CPE: (Cytopathic effect): Phá huỷ tế bào. EID50: (Egg infective dose): Liều gây nhiễm 50% phôi. ELD50: (Egg lethal dose): Liều gây chết 50% phôi. F : Fusion protein. FAO: (Food and Agriculture Organization): Tổ chức lương thực và Nông nghiệp của Liên hiệp quốc. GMT: Geometic Mean Titer: Hiệu giá kháng thể trung bình HA : (Hemagglutination test): Phản ứng ngưng kết hồng cầu. Hb: Hemoglobin HE: (Haematoxylin – Eosin): HI: (Hemagglutination Inhibition test): Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu. HN: (Haemagglutinin – Neuraminidase): Cấu trúc kháng nguyên của virus Newcastle ICPI: Intracerebral pathogennicity Index: Chỉ số gây bệnh trên não gà 1 ngày tuổi IHC: Immunohistochemistry ILT: (Infectious laryngotrachetis): Bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm L: Large polymerazase protein. LD50: (50 Percent Lethal Dose) : Liều gây chết 50% ñộng vật thí nghiệm LHbBQ: Lượng huyết sắc tố (Hemoglobin) bình quân hồng cầu. M: Matric protein. MAB: (Monoclonal antibody): Kháng thể ñơn dòng NðHbBQ: Nồng ñộ huyết sắc tố bình quân hồng cầu. N: Nucleoprotein. NP: Nucleoprotein Phospho. RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction OIE : (Office International des Epizooties): Tổ chức dịch tễ thế giới Vbq: Thể tích bình quân của hồng cầu. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Hệ thống chuyển ñúc mẫu tự ñộng ...............................................36 Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của bệnh Newcastle ở gà mắc bệnh tự nhiên ........................................................................................44 Bảng 4. 2 .Kết quả nghiên cứu bệnh tích ñại thể của gà mắc bệnh Newcastle........46 Bảng 4.3. Kết quả theo dõi thời gian tiến triển của bệnh Newcastle ở gà gây nhiễm thực nghiệm.......................................................................................51 Bảng 4.4. Kết quả theo dõi các triệu chứng lâm sàng của bệnh Newcastle ở gà gây nhiễm thực nghiệm............................................................................53 Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của bệnh Newcastle ở gà gây nhiễm thực nghiệm ................................................................................54 Bảng 4.6. Kết quả mổ khám và quan sát các các biến ñổi ñại thể chủ yếu của bệnh Newcastle ở gà gây nhiễm thực nghiệm...............................................56 Bảng 4.7. Kết quả nghiên cứu bệnh tích ñại thể chủ yếu của bệnh Newcastle ở gà gây nhiễm thực nghiệm............................................................................57 Bảng 4.8. Kết quả so sánh triệu chứng lâm sàng của bệnh Newcastle ở gà gây nhiễm thực nghiệm và gà mắc bệnh tự nhiên................................................59 Bảng 4.9. Kết quả so sánh bệnh tích ñại thể của bệnh Newcastle ở gà gây nhiễm thực nghiệm và gà mắc bệnh tự nhiên................................................62 Bảng 4.10. Kết quả kiểm tra bệnh tích vi thể ở một số cơ quan của gà mắc bệnh Newcastle ............................................................................................65 Bảng 4.11. Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu hệ hồng cầu của gà mắc bệnh Newcastle.....................................................................................................69 Bảng 4.12. Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu bạch cầu của gà mắc bệnh Newcastle.....................................................................................................72 Bảng 4. 13. Kết quả nhuộm hoá mô miễn dịch .............................................75 Bảng 4.14. Mối tương quan giữa biến ñổi ñại thể, vi thể, hoá mô miễn dịch trong sự phân bố virus trên một số cơ quan của gà mắc bệnh Newcastle ......78 Bảng 4.15. So sánh hiệu quả chẩn ñoán bệnh Newcastle ở các lô gà bằng các phương pháp khác nhau................................................................................80 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… viii DANH MỤC ðỒ THỊ ðồ thị 4.1. Kết quả so sánh triệu chứng lâm sàng chủ yếu của bệnh Newcastle ở gà gây nhiễm và gà mắc bệnh tự nhiên ......................................................60 ðồ thị 4.2. Kết quả so sánh bệnh tích ñại thể chủ yếu của bệnh Newcastle ở gà gây nhiễm và gà mắc bệnh tự nhiên..............................................................63 Biểu ñồ 4.3a. Công thức bạch cầu của gà ISA Brown mắc bệnh Newcastle .73 Biểu ñồ 4.3b. Công thức bạch cầu của gà ISA Brown (20 tuần tuổi) ............73 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… ix DANH MỤC HÌNH ẢNH MINH HOẠ Ảnh 4.1: Gà ISA Brown 20 tuần bị bệnh Newcastle; ủ rũ, kém ăn. Ảnh 4.2:Gà ISA Brown 20 tuần ủ rũ, ñuôi cụp. Bệnh Newcastle Ảnh 4.3: Gà co giật, mắt ngưỡng thiên. Bệnh Newcastle Ảnh 4.4: Gà ủ rũ. Bệnh Newcastle Ảnh 4.5: Triệu chứng thần kinh. Bệnh Newcastle Ảnh 4.6: Triệu chứng thần kinh. Gà mắc bệnh Newcastle Ảnh 4.7: Gà ñẻ trứng non. Bệnh Newcastle Ảnh 4.8:Trứng non, trứng dính máu. Bệnh Newcastle Ảnh 4.9: Phổi viêm , xuất huyết. Bệnh Newcastle Ảnh 4.10: Xuất huyết mỡ vành tim. Bệnh Newcastle Ảnh 4.11: Xuất huyết dạ dầy tuyến. Bệnh Newcastle Ảnh 4.12: Xuất huyết dạ dầy tuyến. Bệnh Newcastle Ảnh 4.13: Xuất huyết dạ dầy tuyến.Bệnh Newcastle Ảnh 4.14: Loét, xuất huyết ruột non. Bệnh Newcastle Ảnh 4.15: Loét, xuất huyết ruột non. Bệnh Newcastle Ảnh 4.16: Xuất huyết lỗ huyệt. Bệnh Newcastle Ảnh 4.17: Gà uống nước nhiều. Bệnh Newcastle Ảnh 4.18: Gà gây nhiễm 8 tuần: Chân khô, co quắp. Bệnh Newcastle Ảnh 4.19: Diều chứa thức ăn không tiêu. Bệnh Newcastle Ảnh 4.20: Phân nhớt, trắng xanh Bệnh Newcastle Ảnh 4.21: Gà chảy nước nhớt ở miệng. Bệnh Newcastle Ảnh 4.22: Gà có triệu chứng thần kinh. Bệnh Newcastle Ảnh 4.23: Ngoại tâm mạc xuất huyết, Phù. Bệnh Newca stle Ảnh 4.24: Khí quản có dịch nhày xuất huyết. Bệnh Newcastle Ảnh 4.25: Loét, xuất huyết ruột non. Bệnh Newcastle Ảnh 4.26: Phổi viêm, tụ máu. Bệnh Newcastle Ảnh 4.27: Xuất huyết dạ dày tuyến. Bệnh Newcastle Ảnh 4.28: Loét, xuất huyết hạch ruột. Bệnh Newcastle Ảnh 4.29: Xuất huyết dạ dày tuyến. Bệnh Newcastle Ảnh 4.30: Xuất huyết túi Fabricius. Bệnh Newcastle Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… x Ảnh 4.31: Phổi gà lành (HE x 600) Lòng phế nang trong sáng, vách phế nang mỏng Ảnh 4.32: Huyết khối trong lòng mạch quản phổi (HE x 150) Ảnh 4.33: Xung huyết các mạch quản phổi (HE x 150) Ảnh 4.34: Xuất huyết phổi hồng cầu tròn, ngập trong lòng các phế nang (HE x 600) Ảnh 4.35: Hoại tử tế bào nhu mô phổi (HE x 150) Ảnh 4.36: Thoái hoá mỡ ở tế bào gan (HE x 600) Ảnh 4.37: Xuất huyết kẽ thận (HE x 150) Ảnh 4.38: Xuất huyết túi fabricius (HE x 150) Ảnh 4.39: Dạ dày tuyến bình thường (HE x 150) Ảnh 4.40: Xuất huyết dạ dày tuyến (HE x 150) Ảnh 4.41: Hoại tử niêm mạc dạ dày tuyến ( HE x 150) Ảnh 4.42: Xuất huyết não (HE x 150) Ảnh 4.43: Tăng sinh tế bào hình thành hạt thần kinh ñệm ở não gà (HE x 150) Ảnh 4.44: Hình thành hạt Newcastle ở não gà (HE x 600) Ảnh 4.45: Hình thành hạt Newcastle ở não gà (HE x 600) Ảnh 4.46: Thoái hoá tế bào thần kinh (HE x 600) Ảnh 4.47: Virus tập trung ở tuyến tụy (HE) Ảnh 4.48: Virus tập trung ở tuyến tụy (IHC) Ảnh 4.49: Virus tập trung ở biểu mô phế quản (HE) Ảnh 4.50: Virus tập trung ở biểu mô phế quản (IHC) Ảnh 4.51: Virus tập trung ở ngoại tâm mạc (HE) Ảnh 4.52: Virus tập trung ở ngoại tâm mạc (IHC) Ảnh 4.53: Lách HE x 150 Ảnh 4.54: Lách IHC x 150 Ảnh 4.55: Não HE x 150 Ảnh 4.56: Hành Tủy IHC x 150 Ảnh 4.57: Tá tràng HE x 150 Ảnh 4.58: Tá tràng IHC x 150 Ảnh 4.59: Thực quản IHC x 150 Ảnh 4.60: Mí mắt IHC x 150 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 1 PHẦN I MỞ ðẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ðỀ TÀI Chăn nuôi gia súc, gia cầm từ lâu ñã ñóng một vị trí quan trọng trong ngành chăn nuôi của nước ta, trong những năm gần ñây ngành chăn nuôi ñã có những thay ñổi ñáng kể và góp phần không nhỏ trong quá trình phát triển của ngành Nông nghiệp Việt Nam, góp phần nâng cao mức sống cho người dân ở nông thôn cũng như thành thị. Với vai trò không nhỏ ñó, ðảng và nhà nước ta ñã tiếp tục ñầu tư và ngày càng quan tâm tới ngành chăn nuôi, nhất là chăn nuôi gia cầm. Bên cạnh những thành công ñã ñạt ñược, chúng ta cũng gặp phải những khó khăn khách quan và những trở ngại không nhỏ do bệnh tật gây ra, với những tổn thất ñáng kể về kinh tế cho ngành chăn nuôi. Một trong những bệnh thường gặp trong các cơ sở chăn nuôi gà là bệnh Newcastle. ðây là bệnh truyền nhiễm cấp tính và lây lan nhanh. Bệnh gây ra bởi virus Paramyxovirus serotype 1 thuộc nhóm Paramyxovididae, chúng gây bệnh tích trên ñường hô hấp, tiêu hóa và tác ñộng tới hệ thần kinh, bệnh thường nhiễm ghép với các bệnh khác và tỉ lệ chết rất cao. Bệnh ñược phát hiện vào những năm 20 của thế kỷ XX nhưng cho ñến nay bệnh vẫn là mối ñe dọa nguy hiểm ñối với ngành chăn nuôi gia cầm Việt nam nói riêng và của thế giới nói chung. Vì vậy, ñể hạn chế thiệt hại do bệnh này gây nên thì một trong những nhiệm vụ ñược ñặt ra cho người làm công tác thú y là cần rút ngắn thời gian, nâng cao hiệu quả của việc chẩn ñoán bệnh. Hiện nay, chúng ta ñã có nhiều phương pháp chẩn ñoán bệnh Newcastle. Tuy nhiên tại các cơ sở chăn nuôi hộ gia ñình hay chăn nuôi trang trại, khi gà có bệnh, người chăn nuôi vẫn chủ yếu dùng phương pháp lâm sàng ñể chẩn ñoán bệnh, trong khi mức ñộ chính xác của phương pháp này là chưa cao. Do ñó, vấn ñề ñược người làm công tác chuyên môn quan tâm hàng ñầu là làm sao có ñược một phương pháp chẩn ñoán bệnh Newcastle nhanh, nhạy và chính xác. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 2 Nhằm góp phần nâng cao năng lực hoạt ñộng của ngành Thú y nói chung, công tác chẩn ñoán bệnh Newcastle nói riêng, chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài: “ Nghiên cứu một số ñặc ñiểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Newcastle ở gà và ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn ñoán bệnh” 1.2 MỤC TIÊU CỦA ðỀ TÀI - Xác ñịnh ñược các ñặc ñiểm bệnh lý chủ yếu ở gà mắc bệnh Newcastle. - Thiết lập ñược quy trình chẩn ñoán bệnh Newcastle ở gà bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch bệnh lý. ðồng thời tiến hành so sánh hiệu quả chẩn ñoán của phương pháp này với các phương pháp bệnh lý vi thể nhuộm HE, RT-PCR. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 3 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH NEWCASTLE 2.1.1. Lịch sử bệnh. Newcastle là tên một thành phố của nước Anh, nơi lần ñầu tiên lưu hành dịch Newcastle ở gà với tình trạng bệnh lý cao, Doyle ñã lấy tên thành phố này ñể ñặt cho tên bệnh. Theo tài liệu ghi chép có liên quan ñến một con tàu vận chuyển thịt ñông lạnh mang theo gà nuôi, di chuyển từ Châu á ñến cảng của Newcastle (Alexander, 1988)[35]. Theo Doyle (1985)[53] sau khi khám nghiệm, các nhà khoa học ñã tiến hành giải phẫu và mô tả bệnh này, ñây là bệnh có tỷ lệ chết cao, có khi lên tới 100 %. Riêng ở California (Mỹ), bệnh xảy ra vào giữa những năm 1930 (Alexander, 1988)[36] ñược gọi là bệnh “ viêm não phổi” bệnh có tỷ lệ chết thấp, hiếm khi tới 15%, với biểu hiện hô hấp nhẹ, ñôi khi có triệu chứng thần kinh nhưng khác hẳn với bệnh ñã ñược Doyle mô tả. Sau ñó, vào các năm 1941, 1946, 1951 một số lượng lớn ổ dịch do virus Newcastle lại xuất hiện ở Mỹ và ñã thiệt hại 52 triệu ñôla. Bệnh tiếp tục bùng phát mãnh liệt năm 1977, 1979 và 1980. Năm 2002 bệnh lại quay lại California và Nevadan, ñến tháng 1 năm 2003 ñã có hơn 1,2 triệu gia cầm bị bệnh và buộc phải tiêu hủy ñể ngăn ngừa bệnh lây lan. (OIE, 2005) [84]. Một số chủng virus có ñộc lực thấp ñược phân lập ở một số nước như: Mỹ ,Anh, Ireland (Asplin, 1986)[40], Australia (Alexander, 1988)[35], những chủng này ñược dùng chế vacxin sống. Tại Venezuela, Mexico tỷ lệ chết của gà trưởng thành tới 100% (Brandly, 1965)[49]. Năm 1966, bệnh xảy ra ở Iran với thể cấp tính. Bệnh lan vào Châu Á rồi từ Tây Âu qua Trung ðông (Lancaster và Alexander, 1975)[72]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 4 Ở Australia, năm 1998 hai vụ dịch lớn ñã gây ra nhiều thiệt hại nặng nề cho ñất nước này. Trích theo Collins (2004)[35], các vụ dịch tiếp tục hành hoành cho ñến cuối năm 2000. Những năm gần ñây, các quốc gia trên thế giới liên tục phải ñối mặt với các vụ dịch lớn mà ñiển hình là các nước Hilap, Romania, Estonia. Ở Hylap, tháng 10 năm 2007 tại phía bắc của ñảo Crete ñã xảy ra vụ dịch Newcastle lớn và gây chết nhiều loại gia cầm, trong ñó tập trung vào gà Broiler (OIE,2007) [87]. Ở Romania, Từ tháng hai ñến tháng 8 năm 2007, nhiều vụ dịch do Newcatle ở Covasna (một vùng ở Romania) (OIE,2007) [86]. Vào tháng 5 năm 2007, Estonia xảy ra các vụ dịch Newcatle ở gà thương phẩm từ Harju ñến miền Bắc của ñất nước này. (OIE, 2007) [85]. Có một vài sự nghi ngờ về các một vài chủng Newcastle là một nguyên nhân nguy hiểm của dịch bệnh ñộng vật, nó là một nguyên nhân thường xuyên gây chết ñàn gia cầm ở Châu Mỹ, Châu Á và các vùng của Nam Mỹ (Spradbrow, 1988) [94]. Ở Châu Âu, cho ñến năm 1990 các vụ dịch xảy ra ở những năm ñầu của thập kỷ 70 vẫn diễn ra nhưng với quy mô nhỏ lẻ mặc dù ñã có chương trình về vacxin ñể tiêm chủng cho gà. (Alexander et al., 1998) [36]. Tuy nhiên ở miền tây của Châu Âu, trong những năm của thập kỷ 90 ñã có nhiều báo cáo về các vụ dịch bùng nổ, có tới 239 vụ xảy ra ở các nước Châu Âu vào năm 1994. Mặc dù ñã có chương trình vaccin miễn phí ñể tiêm chủng cho ñàn gà nuôi từ năm 1984, tuy nhiên các vụ dịch lớn vẫn xảy ra ở nước Anh vào năm 1996. Tiếp ñó, ñến năm 1997, nước Anh lại xảy ra 11 vụ dịch và gây thiệt hại lớn cho ñàn gà thương phẩm của nước này, trong ñó có 4 vụ dịch với gà Broiler và 7 vụ xảy ra ở gà tây (Alexander et al., 1998) [36] Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 5 2.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Newcastle trên thế giới. Bệnh Newcastle là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của gia cầm. ðể hạn chế thiệt hại của bệnh, với trình ñộ khoa học kỹ thuật ngày càng tiên tiến, ñã có nhiều công trình nghiên cứu bệnh một cách ñầy ñủ và toàn diện. * Bệnh Newcastle ở chim hoang dã Newcatle thường xuyên phân lập ñược từ các loài chim hoang dã (chim nước, chim bắt cá…). Hầu hết những virus phân lập ñược từ chim ñều có ñộc lực thấp ñối gà (Lancaster and Alexander 1975)[72]. Chim hoang dã là loài gia cầm có khả năng mẫn cảm với bệnh Newcastle và là một trong những nguồn lây lan dịch bệnh. Chính vì vậy trong thời gian dài chim hoang dã là ñối tượng ñược nghiên cứu rộng rãi ở khắp các nước trên thế giới nhằm ngăn chặn nguồn bệnh này. Qua nhiều năm nghiên cứu, Luthgen (1981)[77], ñã lập một danh sách gồm 117 loài chim, trong ñó có 17 loài bị nhiễm virus Newcastle và thấy phần lớn do chim tiếp xúc với gia cầm ñã nhiễm bệnh. Vindevolgel (1997)[99], nghiên cứu bệnh Newcastle ở chim hoang dã thấy virus nhiễm ở chim hầu hết có tính hướng hệ hô hấp, chim có thể biểu hiện bệnh hoặc không. Estudillo (1972)[54], ñã mô tả ổ dịch ở Mexico cho thấy gà lôi, nhật, công, vẹt, chim yến có khả năng mẫn cảm với bệnh và có triệu chứng thần kinh do lây nhiễm virus Newcastle. Qua nghiên cứu bệnh Newcastle ở chim hoang dã, các tác giả cho thấy những dấu hiệu của bệnh rất khác nhau, bất kỳ thể bệnh nào ở gà cũng có thể thấy ở các loài chim. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 6 • Bệnh Newcastle ở chim bồ câu (Pigeon) Vào những năm cuối của thập niên 70, một chủng Newcastle với nhiều kháng nguyên khác nhau từ giống cổ ñiển ñã xuất hiện ở chim bồ câu, có thể nó ñược lan truyền từ Trung ðông. Ở châu âu, bệnh Newcatle ở chim bồ câu ñược báo cáo lần ñầu tiên ở Italy năm 1981 (Alexander et al, 1983) [32]. Năm 1985, ở Canada (Ide P.R, 1987)[65], lần ñầu tiên phân lập virus Newcastle trong 6 ñàn bồ câu vùng Ontario, Alberta Colombia. Chủng này không biểu hiện triệu chứng khi cấy chuyển 4 lần ở gà 4 – 6 tuổi và ñược ñánh giá là chủng Lentogen. Năm 1987, Pearson J.E và cộng sự [89], báo cáo kết quả nghiên cứu chủng vi rút PMV – 1 phân lập từ chim bồ câu có triệu chứng liệt, vẹo cổ, run rẩy, mất thăng bằng và chết. Thời gian chết khoảng từ 4 – 25 ngày, virus bài xuất ñến 20 ngày, có bệnh tích viêm ruột dạ dày và hoại tử tuyến tuỵ. Nếu gây bệnh cho gà qua lỗ huyệt, mũi hoặc tiêm vào túi khí ở ñốt ngực thì gà vẫn khoẻ mạnh; tiêm vào não gà con chúng có chỉ số ICPI giống nhóm Velogen và 4 trong 6 chủng virus phân lập có khả năng gây bệnh theo hướng tác ñộng thần kinh cho gà 6 tuần tuổi. Nghiên cứu bệnh Newcastle ở chim bồ câu thấy tỷ lệ mắc chiếm từ 30% -70%, tỷ lệ chết có thể thấp, hiếm khi vượt quá 100% nhưng cũng có trường hợp lên tới 40%. Thời gian ủ bệnh từ vài ngày ñến vài tuần. Triệu chứng chủ yếu là thần kinh và ỉa chảy, ngoài ra còn thấy triệu chứng ở ñường hô hấp, viêm mũi, viêm màng kết mạc mắt, run rảy, ngoẹo cổ và thiếu sự kết hợp (Alaxander, 1986; Estudillo, 1972)[33; 54]. Alaxander D. J và cộng sự (1986)[33] ñã phân lập 51 chủng PMV -1 bồ câu từ 15 nước thấy chỉ số ICPI = 1, 44 và IVPI từ 0,00 - 2,44. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 7 ở Nhật Bản, Maeda M và cộng sự (1993)[78], ñã nghiên cứu biến ñổi về tổ chức bồ câu bị mắc bệnh Newcastle. Các tác giả thấy có hoại tử hoặc thoái hoá tổ chức lympho ở lách cũng như ở túi fabricicus, tuyến ức, ruột, thận. Ngoài ra còn thấy tăng sinh tế bào lympho ở lách, hình thành những ñám tế bào lympho ở thận và viêm não không chứa mủ. Dựa vào các thay ñổi về tổ chức có thể thấy ñược chủng virus có hướng thần kinh hay nội tạng. * Bệnh Newcastle ở gà tây Biểu hiện bệnh bình thường, ít nghiêm trọng, với triệu chứng chủ yếu là hô hấp và thần kinh. Bệnh có thể ảnh hưởng ñến sản xuất trứng, trứng có vỏ mềm, mất hình dáng và chất lượng trứng giảm. Gà có thể liệt 1-2 chân, trong ổ dịch quá cấp có tỷ lệ chết cao. * Bệnh Newcastle ở chim cút Theo Sharaway (1994)[93], chim cút ít mẫn cảm với virus Newcastle hơn gà, thời gian ủ bệnh từ 2 - 15 ngày, trung bình 5 - 6 ngày. Triệu chứng bệnh thay ñổi tuỳ theo ñộc lực của chủng gây bệnh. Nếu nhiễm virus có ñộc lực cao, chim cút có biểu hiện ủ rũ, khó thở, bệnh kéo dài vài ngày rồi chết. Quan sát thấy chim cút có thể bị sưng mắt và cổ, ỉa phân xanh ñôi khi có máu, chim cút run rẩy, liệt chân, ñôi khi liệt cánh. Tỷ lệ chết có thể tới 90% ở chim cút hậu bị và 50% ở chim cút trưởng thành. * Bệnh Newcastle ở loài thuỷ cầm Vịt, ngan, ngỗng ñều có khả năng nhiễm bệnh Newcastle (Asplin, 1947; Higgins, 1971 và Estudillo, 1972)[40; 64; 54], ở ngỗng và vịt mắc bệnh có biểu hiện liệt chân, cánh và không có triệu chứng hô hấp. Tỷ lệ nhiễm của ngỗng ngan và vịt khoảng 10% hoặc ít hơn. Tỷ lệ chết chỉ có ở vịt và ngỗng khoảng 10%. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 8 * Bệnh Newcastle ở gà Ở ðài Loan trong 16 năm (từ năm 1970 - 1985) có 396 ổ dịch Newcastle trong ñó 93% là ở gà, còn lại là ở gà lôi, bồ câu, gà tây, ngỗng và chim cút. 82% gà mắc bệnh dưới 2 tháng tuổi, virus gây bệnh thuộc nhóm Velogen hướng nội tạng và thần kinh (Lu Y. S and Tsai H.J 1986)[74]. Tại Newzealand, Tisdal D. J (1988)[97] phát hiện ñược kháng thể ngăn cản sự ngưng kết ñối với virus Newcastle ở gà, gà lôi và công. Các loài này không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng nhưng phân lập ñược virus Newcastle thuộc nhóm Lentogen. Theo báo cáo của Lukarev T. (1987)[76] năm 1985 - 1986 tại Macedonia, bệnh Newcastle xảy ra ở một trại gà 7 tuần tuổi, gà ñã ñược miễn dịch bằng phương pháp khí dung lúc 17 ngày tuổi. Bệnh ở 8 gian chuồng, mỗi gian chứa khoảng 9000 gà với tỷ lệ chết từ 75- 96%. Năm 1989, ở Nigeria (Okoye và cs, 1989)[88] xảy ra ở ổ dịch Newcastle không ñiển hình, gà không có triệu chứng thần kinh, không xuất huyết dạ dày tuyến, chỉ có các dấu hiệu ủ rũ, ỉa phân xanh, tỷ lệ chết từ 50 - 83,6%; mổ khám thấy dịch thẩm xuất ở ống khí quản, lách teo, manh tràng xuất huyết có dấu hiệu hoại tử, các tế bào lympho giảm; ñã phân lập ñược virus Newcastle từ bệnh phẩm. Biswal G, và Morrill C.C. (1954)[47], nghiên cứu ảnh hưởng bệnh Newcastle ñến khả năng sinh sản của gà bằng chủng 11914 Califonia gây nhiễm vào xoang mũi gà mái tơ, thấy sản lượng trứng bị giảm từ 2 - 3 tuần, thời gian ảnh hưởng kéo dài ñến 56 ngày, 27% gà bị nhiễm có thoái hoá những nang trứng, biểu hiện bề ngoài nang gồ ghề, nang trứng bị xung huyết, xuất huyết, trứng không bọc vỏ hoặc vỏ mềm, ñôi khi xuất hiện nòng ñỏ trong xoang bụng, ống dẫn trứng bị co lại, ñôi khi bị phù nề ở ngày thứ 5 - 7 kể từ sau khi nhiễm, thiếu dịch nhày và ñộ bóng sáng. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 9 * Bệnh Newcastle ở người Trích theo Suarez – Hernander M (Garagher và cs.1974)[57] khảo sát huyết thanh học của virus Newcastle ở những công nhân chăn nuôi gà. Kháng thể HI với virus bệnh Newcastle ñã ñược tìm ra ở 73/277 (26,3%) người làm việc trực tiếp ở trại gà và ở 110/230 (47,8%) người gián tiếp. Sự khác nhau về số mẫu dương ở 2 nhóm người là không có ý nghĩa, vì bệnh ít khi xảy ra ở người, nhưng bệnh có thể gây viêm kết mạc mắt, các hạch lâm ba ngoại biên, trong trường hợp bệnh nặng có thể gây khó thở, viêm phổi. Trẻ em có thể bị viêm não màng não. 2.1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh Newcastle trong nước Bệnh Newcastle ñược Phạm Văn Huyến ñề cập lần ñầu tiên ở Việt Nam vào năm 1933 và gọi là bệnh dịch tả gà ðông Dương. Năm 1938, một dịch vụ gà ở Nam Bộ ñược Vitor mô tả có triệu chứng giống bệnh Newcastle. Tại Nha Trang năm 1949, Jacottot và Lelouet ñã phân nhập ñược virus Newcastle, sau dùng chủng này ñể gây bệnh cho gà và tiêm truyền trên phôi trứng, bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu và ức chế ngưng kết hồng cầu tác giả ñã xác ñịnh sự có mặt của virus Newcastle tại ổ dịch. Năm 1956, ở Sài Gòn, Notter và N.B. Lương ñã phân lập ñược chủng virus Newcastle. Từ năm 1955 - 1957 qua ñiều tra tình hình dịch bệnh ở 20 tỉnh thành, kiểm tra 189 bệnh phẩm các tác giả thấy có 58 mẫu có virus Newcastle. Trong ñầu thập niên 70, chăn nuôi gà công nghiệp bắt ñầu phát triển, một số cơ sở chăn nuôi gà ñã xảy ra những dịch vụ lớn về Newcastle. Nguyễn Bá Huệ và cộng sự (1980)[13], phân lập ñược 4 chủng virus Newcastle cường ñộc từ gà của các xí nghiệp Cầu Diễn, Thành Tô, An Khánh, ðông ._.Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 10 Anh, là các chủng CD, HP, AK và ðA. Qua khảo sát trên gà và trên phôi trứng, tác giả nhận xét cả 4 chủng virus ñều có ñộc cực mạnh, với giá trị ELD50 = 8; 8,2; LD50 = 7,2 - 7,6. Nguyễn Thu Hồng (1993)[12] dùng vacxin Lasota và Hệ 1 cho gà thấy có thể chống ñược các chủng virut nói trên. Nếu uống vacxin Lasota ñể phòng bệnh Newcastle với liều 103. Từ 3 - 4 ml/con lúc gà 1 tuần tuổi thì ñến 2 tháng rưỡi còn khả năng bảo hộ là 63%, nếu cho uống lúc 2 tuần rưỡi tuổi thì ñến 2 tháng rưỡi vẫn còn bảo hộ ñược 100%. Trần ðình Tứ và cộng sự (1985)[30] ñã xác ñịnh ñộc lực của các chủng virus vacxin Newcastle ñang sử dụng ở Việt Nam bằng phương pháp ñã chuẩn ñoán hoá của FAO. ðộc lực ñược xác ñịnh dựa trên 3 chỉ số MDT, ICPI và IVPI, kết quả thấy 3 chủng virus Newcastle ñang sử dụng hiện nay có ñộc lực ổn ñịnh. Chủng hệ I thuộc nhóm Mesogen, cùng loại với chủng II nhưng có ñộc lực cao hơn và ñặc tính gây bệnh khác với chủng II, do ñó Hệ I có thể có nguồn gốc từ chủng Mukteswar. Nguyễn Tiến Dũng và cs (1991)[7], nghiên cứu cấu trúc kháng nguyên HN của virus Newcastle và ảnh hưởng của virút trong phản ứng HA và HI. Ngoài ra, còn dùng kháng thể ñơn dòng 4D6, 5A1, 8C11 và 7D4 ñể nghiên cứu một số chủng virus Newcastle. Tác giả thấy chủng Lasota, F, M ñều có phản ứng HI với 4 loại kháng thể ñơn dòng; Hệ 1 và VN91 không có phản ứng với 5A1 và 7D4; VL88 (chủng cường ñộc của Lào) chỉ phản ứng với kháng thể 4D6. Tác giả phát hiện sự khác nhau về tính kháng nguyên giữa chủng Mukteswar và Hệ I. Vũ ðạt và cộng sự (1989)[5] nghiên cứu những tác nhân gây ảnh hưởng ñến quá trình ñáp ứng miễn dịch chống bệnh Newcastle. Tác giả thấy kháng thể thụ ñộng và kháng sinh dùng trước hoặc sau vacxin ñều ảnh hưởng ñến quá trình hình thành kháng thể. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 11 Năm 1995, trong hội nghị về virus ở khu vực Châu Á Thái Bình Dương tại Australia, ðào Trọng ðạt và Phạm Văn Chức ñã thông báo bệnh Newcastle ở Việt Nam thường xảy ra từ tháng 12 ñến tháng 3 năm sau. Nguyễn Tiến Trung và Lê Thành Nguyên (1987)[28], ñã nghiên cứu về thời gian bảo quản ñộ dài miễn dịch của vacxin Newcastle do Phân viện thú y Nam Bộ sản xuất. Vài năm gần ñây, nhiều công trình nghiên cứu và thử nghiệm vacxin Newcastle có khả năng chịu nhiệt như của Nguyễn Thu Hồng và cộng sự (1993)[12], thử nghiệm vacxin chịu nhiệt V4 phòng bệnh cho gà ở Việt Nam. Kết quả cho thấy vacxin V4 có ưu ñiểm hơn Lasota về tính chịu nhiệt và thời gian bảo quản, ở nhiệt ñộ thường bảo quản ñược 1 tháng. Mặt khác, vacxin có ñặc tính gây miễn dịch qua tiếp xúc. Vacxin chịu nhiệt chủng V4 có tên HR - NDV là chủng virus vacxin có sức ñề kháng cao với nhịêt ñộ ñã ñược Australia chọn lọc và thử nghiệm ở nhiều nước thuộc khu vực ðông Nam Á như Malaysia, Indonesia, Srilanca (Spradbrow P.B, 1987)[94], vacxin này thích hợp ở khu vực nuôi gà chăn thả. Năm 1994, Phan Lục [19], nghiên cứu sự biến ñộng hàm lượng kháng thể Newcastle ở gà nuôi tập trung và ñưa ra lịch sử dụng vacxin phòng bệnh phù hợp với ñặc ñiểm riêng của mỗi cơ sở. Tác giả nhận thấy, hàm lượng kháng thể của gà ở vụ hè thu cao hơn vụ ñông xuân. Phan Lục và cộng sự (1996)[21], ñã theo dõi 6 cơ sở nuôi gà ở các tỉnh phía Bắc, từ năm 1980 - 1991. Các cơ sở ñều ñạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y, quy cách chăn nuôi, nhưng ñã xảy ra 5 vụ dịch Newcastle. Trong số các vụ dịch này, có 4 vụ ở gà nhỏ, 1 vụ ở gà trưởng thành, dịch xảy ra vào các vụ ñông xuân (từ tháng 10 ñến tháng 3 năm sau). Do ñó, tác giả ñã ñề xuất lịch sử dụng vacxin thích hợp là: 7 ngày, 21 - 28 ngày, 50 - 58 ngày và 133 - 140 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 12 ngày; Vacxin sử dụng là Lasota và Hệ 1, bằng phương pháp nhỏ mũi và tiêm dưới da tuỳ từng loại vacxin. Trong thí nghiệm so sánh hiệu quả dùng vacxin Lasota bằng phun sương, cho uống và nhỏ mũi; tác giả nhận thấy, phương pháp phung sương có hiệu quả hơn nhỏ và uống, sức miễn dịch chống virus cường ñộc Newcastle thu ñược do phương pháp phun sương và nhỏ mũi cao hơn phương pháp uống (Phan Lục và cs, 1996)[20]. Kết quả nghiên cứu bệnh Newcastle, vacxin và sử dụng vacxin của các tác giả trong nước và trên thế giới ñã góp phần to lớn ñể ngăn chặn và hạn chế thiệt hại về kinh tế của bệnh Newcastle. 2.2. MỘT SỐ ðẶC ðIỂM CỦA VIRUS NEWCASTLE VÀ BỆNH NEWCASTLE 2.2.1. Một số ñặc ñiểm của virus Newcastle 2.2.1.1. Hình thái và cấu trúc của virus Newcastle Virus Newcastle thuộc họ Paramyxoviridae, phân nhóm PMV -1 (trích theo Tumova, 1979)[97], là vi rút ARN ña hình thái: hình tròn, hình trụ, hình sợi. Virus có vỏ bọc lipit, kích thước virion từ 150 - 400nm. Virus có cấu trúc nucleo capsit dạng xoắn ốc dài 1000mm, ñường kính 17 - 18nm. Vỏ bọc ñược phủ các gai glycoprotein (HN - F) dài 8 -12nm. Hệ gen của virus Newcastle là chuỗi ñơn ARN ñể truyền thông tin ARN và mật mã di truyền các protein của virus. Virus có trọng lượng phân tử ARN nặng 5,2 - 5,7 x 106 dalton, khoảng 15 kilobases (Kb) (Kolakofsky, 1974)[69]. Mật mã di truyền của ARN virus chứa 6 gen mã hoá các thông tin di truyền tổng hợp các protein cấu trúc: Haemagglutinin - Neuraminidase (HN); Fusion protein (F); Nucleoprotein (N) giống như Histin là một protein bảo vệ ARN; Nucleoprotein phospho (NP) chưa rõ chức năng; Matricprotein Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 13 (M): Có tác dụng gắn ARN virus với vỏ bọc; Largepolymerazase protein (L) chưa rõ chức năng. Trong số những protein này, có 2 protein tham gia vào hoạt ñộng của virus, liên quan ñến vỏ bọc lipit ñó là: Haemagglutinin protein gây ngưng kết hồng cầu, men Neuramidaza cắt ñứt thụ thể hồng cầu và Fusion protein gây liên kết các tế bào bị nhiễm virus thành tế bào ña nhân khổng lồ. Những protein này liên quan ñến hoạt ñộng của virus ñối với tế bào và trung hoà kháng thể (Spradbrow P.B và cs 1988)[94]. 2.2.1.2. ðặc tính sinh học Virus Newcastle là virus có vỏ bọc, có hoạt tính bề mặt nên nó có một số ñặc tính sinh học ñặc trưng: * Ngưng kết hồng cầu Burnet (1942)[50], là người ñầu tiên phát hiện ñặc tính của virus Newcastle: - Có khả năng làm ngưng kết hồng cầu một số loài như hồng cầu gà, người, chuột lang, chuột bạch. - Chỉ một vài chủng virus làm ngưng kết hồng cầu bò, dê, cừu, lợn và ngựa. - Hồng cầu loài lưỡng thê, bò sát và loài chim bị ngưng kết với virus Newcastle ở các mức ñộ khác nhau. Hiện tượng ngưng kết Hồng cầu là do hồng cầu liên kết với ñiểm quyết ñịnh kháng nguyên trên bề mặt của virus (Rott, 1964)[90]. Quá trình ngưng kết xảy ra qua 2 giai ñoạn (Trần Minh Châu và Hồ ðình Chúc.1988; Ackermann, 1964)[3; 31]. - Virus tìm ñiểm thụ cảm trên bề mặt của hồng cầu Haemagglutinin làm ngưng kết hồng cầu. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 14 - Virus tách khỏi bề mặt tế bào do men Neuramidaza phá huỷ thể thụ cảm trên bề mặt hồng cầu. Theo Tolba và Eskarous (1962)[98], hoạt tính ngưng kết hồng cầu tuỳ theo từng chủng virus, không nhất thiết bị vô hoạt cùng thời gian với hoạt tính gây nhiễm. Một vài chủng virus khi xử lý ở nhiệt ñộ 560C trong 5 phút, hoạt tính ngưng kết hồng cầu bị phá huỷ nhưng vẫn còn khả năng gây nhiễm phôi hoặc vật chủ khác. Ngược lại có một số chủng ñược xử lý 560C với thời gian 25 phút vẫn còn khả năng gây nhiễm và gây ngưng kết hồng cầu (Hanson R.P. Spalatin.J, 1978)[62]. ðặc tính này dùng ñể phân biệt giữa các chủng virus Newcastle với nhau và cũng là ñiểm khác nhau giữa virus Newcastle với virus cúm. * Dung giải hồng cầu Virus Newcastle có khả năng dung giải hồng cầu ngưng kếtvới dung huyết tố. ðặc tính này bị ảnh hưởng bởi nhiệt ñộ, nồng ñộ muối của dung dịch hoặc khi làm ñông tan, siêu âm, chiết rút sẽ làm hoạt tính dung huyết tăng lên (Brandly C.A, Hanson R.P 1965)[49]. * Ức chế ngưng kết hồng cầu (Haemagglutination Inhibition - HI) Virus Newcastle bị trung hoà bởi huyết thanh dương tính Newcastle, khi bị trung hoà virus không còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu; bằng phản ứng HI sẽ phát hiện kháng thể làm ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà. Dựa vào ñặc tính này ñể phát hiện gián tiếp sự nhiễm virus Newcastle của ñàn gà, xác ñịnh hiệu giá ñáp ứng miễn dịch Newcastle với vacxin và ñể phân biệt các chủng virus Newcastle. Sự khác nhau giữa các chủng virus thuộc vào nguồn gốc phát sinh bệnh. Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA) và phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu gà (HI) ñược sử dụng ñể phát hiện kháng nguyên và kháng thể Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 15 Newcastle, phản ứng có thể ñược thực hiện trong ống nghiệm hoặc ñĩa ngưng kết 96 lỗ có ñáy chữ U. * Nuôi cấy virus Newcastle - Trên phôi gà Virus có thể nhân lên trong xoang niệu nang của trứng gà có phôi 9 -11 ngày tuổi, ñặc tính này ñược ứng dụng ñể nuôi cấy và phân lập virus từ bệnh phẩm. Khi nuôi cấy trên phôi gà, những chủng virus Newcastle ñộc lực mạnh gây chết phôi từ 20 - 48 giờ kể từ khi gây nhiễm, những chủng ñộc lực trung bình và yếu thời gian gây chết phôi trên 60 giờ. Mổ khám những phôi chết, bệnh tích xuất huyết dưới da, nhất là ñầu, ngực, bụng và chân. - Trên tế bào phôi gà Các chủng virus Newcastle ñều phát triển trên môi trường tế bào và gây hiện tượng bệnh lý tế bào (CPE). Hệ thống tế bào thường dùng là tế bào phôi gà, thận gà một lớp (Beard và cs , 1984)[45]. Chandra và cs (1972)[52], ñã nhân virus Newcastle trên tế bào phôi gà thấy hiện tượng kết dính, sau 1- 2 giờ tế bào co lại, ñến 48 giờ bị thoái hoá cuối cùng tế bào một lớp hoàn toàn bị phá huỷ. Như vậy, sau khi tế bào hấp thụ virus, màng virus hoà hợp với màng tế bào, nucleocapsit và chui vào tế bào. Virus nhân lên trong tế bào chất, ñạt tối ña lúc 5 - 6 giờ. Sự hình thành ñầu tiên là kháng nguyên NP (Phospho Nueleoprotein) ở trong tế bào chất gần nhân tế bào (Rott, 1964)[90], sau ñến kháng nguyên ngưng kết hồng cầu và Neuramidaza ở khắp tế bào chất, 4 giờ sau ở bên trong màng tế bào xuất hiện những cấu trúc giống như virion thành thục. ðôi khi các hạt virion còn ôm lấy các nucrovichi tróc ra khỏi màng tế bào, giải phóng virion (Bankowski, 1964)[42], virion còn tiếp tục nhân lên và Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 16 giải phóng trong 4 giờ nữa mà không làm cho quá trình sống của tế bào bị phá huỷ. * Hấp phụ hồng cầu lên tế bào (Hemadsorption) Hiện tượng những tế bào bị nhiễm virus Newcastle có thể hấp thụ hồng cầu gà trên bề mặt tế bào gọi là Haemadsorption. Khả năng hấp phụ hồng cầu ñược ñánh giá bằng số lượng hồng cầu hấp thụ trên tế bào, thời gian xuất hiện khoảng 4 giờ sau khi virus nhiễm vào tế bào. Bankowsko (1964)[42], ñã chứng minh ở những chủng virus ñộng lực cao, việc hấp phụ hồng cầu sẽ xuất hiện sớm hơn tế bào. * Hiện tượng cản nhiễm (Interference) Virus Newcastle có khả năng cản trở sự nhân lên của virus khác hoặc ngược lại bị một số virus khác cản trở sự nhân lên của chúng trong cơ thể vật chủ, như virus viêm phế quản truyền nhiễm (Infection Bronchitis Virus). Cho nên, khi gà bị nhiễm virus Newcastle kết hợp với các loại virus khác, bệnh không biểu hiện rõ rệt, ñồng thời làm giảm phản ứng miễn dịch (Hanson R.P, 1972)[60]. 2.2.1.3. Sức ñề kháng của virus Newcastle Sức ñề kháng của virus ñược xác ñịnhbằng khả năng gây nhiễm của virus, tính ngưng kết hồng cầu, tính gây miễn dịch. Các khả năng này bị phá huỷ khi tiếp xúc trực tiếp với các yếu tố như nhiệt ñộ, ánh sáng, tia tử ngoại, quá trình oxy hoá, ñộ pH của môi trường. Ở nhiệt ñộ 1000C virus bị diệt trong 1 phút. Ở 560C tính gây nhiễm và ngưng kết hồng cầu của virus bị phá huỷ trong 5-6 phút. Ở 370C virus vẫn tồn tại hàng giờ ñến hàng ngày. Ở 80C ñến 200C virus sống hàng tháng. Ở 00C sống hàng năm. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 17 Tuỳ thuộc vào sức ñề kháng mà khả năng của virus bị phá huỷ nhanh hay chậm. Chandra và cs (1972)[52], nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ tới khả năng ngưng kết, nhưng chủng Mukteswar và B1 chỉ chịu ñược thời gian là 15 - 30 phút. Ánh sáng mặt trời chiếu thẳng diệt virus trong 48 giờ nhưng ánh sáng của tháng 5 - 6 làm virus mất hoạt tính hoàn toàn trong 1 giờ. Với hoá chất như dung dịch xút 0,5% phá huỷ sau 30 phút, formol 1 - 2% phá huỷ trong 30 phút, lizon sau 20 phút, phenol làm mất tính gây nhiễm nhưng không ảnh hưởng ñến tính miễn dịch của virus, phenol ñược dùng ñể chế vacxin vô hoạt. Virus Newcastle có thể tồn tại trong phân, vỏ trứng, lông, tường chuồng, một số dụng cụ chăn nuôi, nước. Virus ñược bao bọc bởi protein nên có sức ñề kháng cao với các chất vô hoạt như Formalin,... Virus không hoạt ñộng ñược ở nước sạch trong vòng 1 - 2 ngày, nhưng có thể sống sót trong nhiều ngày ở ao hồ có nhiều chất hữu cơ. 2.2.1.4. ðường truyền lây Theo Alexander (1988)[35], virus có trong thức ăn, nước uống, phân theo ñường tiêu hoá (miệng, hầu, thực quản) hoặc qua không khí theo ñường hô hấp khi gia cầm hít thở sẽ xâm nhập vào cơ thể gây bệnh. Mức ñộ truyền lây phụ thuộc vào ñộc lực của virus ñường xâm nhập, liều lượng lây nhiễm và sức ñề kháng của gia cầm. Việc truyền lây còn qua ñường vận chuyển các sản phẩm của gia cầm như thịt, xác chết, phân thải, thức ăn thừa hoặc qua tiếp xúc giữa các gia cầm nuôi với chim hoang dã. Ở gà công nghiệp, ñường truyền lây chủ yếu là ñường hô hấp (mũi, miệng) và niêm mạc mắt (Beard và Hanson, 1984)[45]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 18 Thời gian lây qua ñường tiêu hoá chậm hơn ñường hô hấp. Gà nhiễm bệnh sẽ thải virus qua phân và bệnh xuất hiện khi gà ăn phải mầm bệnh. (Alexander, 1988)[35]. Khả năng truyền dọc từ trứng nhiễm bệnh ở ñường sinh dục mẹ chưa rõ ràng (Beard và Hanson, 1984)[45]. Gà mái nhiễm virus Newcastle chủng Velogen có thể ngừng ñẻ nhưng gà mái nhiễm chủng Lentogen và có miễn dịch vẫn tiếp tục ñẻ. Phôi nhiễm bệnh trước khi nở thường bị chết, nhưng vẫn có thể nở khi virus không có ñộc lực (French và cộng sự, 1967)[56]. Trên bề mặt trứng nhiễm virus Newcastle từ phân. Sau khi nở, gà có thể mắc bệnh. Phôi trứng chết do nhiễm bệnh là môi trường tốt cho virus tồn tại. Virus Newcastle có thể tồn tại trong nước trứng ở nhiệt ñộ 370C trên 3 tháng (Lancaster, 1966)[71]. Ngoại ký sinh trùng có thể làm lây lan virus Newcastle nhưng không quan trọng (Lancaster, 1966)[71]. Muỗi cũng có thể truyền virus Newcastle (Beard và Hanson, 1984)[45]. 2.2.1.5. Bài xuất virus Trong cơ thể gà bệnh, hầu hết các cơ quan phủ tạng ñều chứa virus. Thường 44 giờ sau khi nhiễm có thể tìm thấy virus ở thận, lách, túi Fabricicus ñường hô hấp, tụy và não. Máu chứa virus nhưng không thường xuyên. Virus ñược bài xuất qua phân, nước mắt, nước mũi. Cơ thể bài xuất virus bắt ñầu từ 20 - 24 giờ trước khi xuất hiện triệu chứng lâm sàng và kéo dài suốt thời kỳ bệnh cho ñến khi khỏi hoặc chết. Gà lành bệnh trở thành vật mang trùng và bài xuất virus ra môi trường xung quanh trong khoảng 2 tuần, có khi kéo dài ñến 5 tuần (Lancaster, 1966)[71]. 2.2.1.6. ðộc lực của virus Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 19 Virus Newcastle ñược phân lập ở nhiều nước trên thế giới, chúng có mức ñộ ñộc lực và tính gây bệnh khác nhau. ðể thống nhất cách ñánh giá các chủng virus phân lập, tổ chức FAO (Allan. H Lancaster. JE và Toth B, 1978)[39], ñã chuẩn hoá cách ñánh giá theo mức ñộ ñộc lực và phân virus thành 3 nhóm: - Nhóm Velogen: ðộc lực mạnh - Nhóm Mesogen: ðộc lực trung bình - Nhóm Lentogen: ðộc lực yếu Mức ñộ ñộc lực và khả năng gây bệnh của mỗi nhóm ñược ñánh giá bằng các chỉ số sinh học. Bảng phân nhóm ñộc lực của virus Newcastle Nhóm virus MDT (giờ) ICPI IVPI Lentogen = 90 = 0,5 Có giá trị gần 0 Mesogen 61 – 90 0,6 -1,5 Có giá trị gần 0 Velogen 40 – 60 = 1,6 Có giá trị gần ñến 3 MDT (Mean death time): Thời gian trung bình gây chết phôi (ñơn vị tính bằng giờ) với liều tối thiểu gây chết 100% phôi. ICPI (Intracerebral Pathogenicity Index): Chỉ số gây bệnh khi tiêm não gà con 1 ngày tuổi. IVPI (Intravenous Pathogenicity Index): Chỉ số gây bệnh khi tiêm tĩnh mạch gà 6 tuần tuổi. 2.2.1.7. Cơ chế gây bệnh Virus có thể xâm nhập vào cơ thể qua ñường tiêu hoá, qua niêm mạc hầu, họng vào máu, gây nhiễm trùng huyết và gây viêm hoại tử nội mô ở các cơ quan, gây xuất huyết do thành huyết quản bị phá huỷ và xuất dịch vào các xoang trong cơ thể. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 20 Virus không tác ñộng trực tiếp gây viêm phổi, nhưng thường gây khó thở do tác ñộng của virus làm rối loạn hệ thống tuần hoàn và trung khu hô hấp của hệ thần kinh trung ương. Tuỳ thuộc vào ñộc lực của chủng virus gây bệnh và sức ñề kháng của vật chủ mà vật chủ ñó có thể sống hoặc chết hoặc có miễn dịch với bệnh. Virus vào cơ thể sau khi ñược nhân lên, gây tổn thương thực thể tế bào rồi bị thải ra ngoài và nó có thể ñược phát hiện trong phân vào ngày thứ 3 - 5 sau khi nhiễm bệnh (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978; Nguyễn Thái và cs, 1976)[25;27]. 2.2.2. Một số ñặc ñiểm bệnh Newcastle 2.2.2.1. Các thể bệnh Newcastle Dựa vào ñặc tính sinh học và ñặc ñiểm gây bệnh của mỗi chủng, bệnh ñược chia thành 5 thể khác nhau (Beard and Hanson, 1984)[45]. * Thể Doyle: (Viscerotropic Velogenic): là thể ñược Doyle nhận ra ñầu tiên vào năm 1927, gây ra bởi chủng Velogen. Bệnh ở thể cấp tính, có tỉ lệ chết cao từ 90 - 100%, xảy ra ở mọi lứa tuổi, bệnh tính ñặc trưng là xuất huyết ñường tiêu hoá. * Thể Beach (Neurotropic Velogenic): là thể bệnh ñược Beach diễn tả vào năm 1942, gây ra bởi chủng Velogen. Bệnh ở thể cấp tính, gây chết nhanh ở gà mọi lứa tuổi, gây bệnh tích ở hệ hô hấp và thần kinh mà không gây bệnh tích ở hệ tiêu hoá. Thể bệnh này ñược gọi là bệnh hô hấp thần kinh hoặc Pneumoencephatitis. * Thể Beaudette (Mesogenic): Là thể bệnh ñược Beau dette mô tả vào năm 1948, bệnh biểu hiện hô hấp cấp tính, gây triệu chứng thần kinh ñối với gia cầm non và gây chết, nhưng ít gây chết ñối với gia cầm trưởng thành. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 21 Virus gây ra thể bệnh này thuộc chủng Mesogen, do ñó có thể dùng chế vacxin. * Thể Hitchner: (Respiratory): Bệnh gây ra bởi virus nhóm Lentogen như chủng B1, F, Lasota. Thể bệnh ñược Hitchner diễn tả năm 1948. Bệnh nhẹ không biểu hiện rõ triệu chứng hô hấp. * Thể nội tạng: (Asymptomatic enteric): Thể nhiễm ñường tiêu hoá không có triệu chứng lâm sàng. Virus có thể phân lập từ phân, dạ dày gà bệnh (French và cộng sự, 1967)[56]. ðây là chủng cố ñộc lực thấp như Lister - 2C, V4, nên có thể dùng chế vacxin. 2.2.2.2. ðường gây nhiễm Tiêm não, tĩnh mạch, xoang bụng, dưới da, bắp ñùi. Các chủng virus khác nhau gây ra các phản ứng khác nhau. Virus nhóm Velogen: các ñường gây nhiễm ñều có thể gây bệnh và chết. Virus nhóm Mesogen: Tiêm vào xoang bụng gà con gây bệnh nhẹ, tiêm vào não gây bệnh nặng và chết. Virus nhóm Lentogen: Không gây bệnh hoặc gây bệnh nhẹ ở gà con, thậm chí tiêm vào não cũng không gây bệnh. 2.2.2.3. Chẩn ñoán bệnh Newcastle * Triệu chứng lâm sàng Biểu hiện của bệnh liên quan ñến chủng virus nhiễm, loài gia cầm cảm thụ, tình trạng miễn dịch, tuổi và sự có mặt của một số nhân tố khác (Me Gerran J.B, Gordon W.A 1968)[80]. Thời gian ủ bệnh ở gà từ 2 - 5 ngày (Beard, Hanson, 1984)[46] (Lancaster, 1966)[71], bồ câu từ 4 - 18 ngày, chim cút từ 2 - 15 ngày trung bình từ 5 - 6 ngày (Sharaway, 1994)[93]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 22 Bệnh gây ra bởi chủng Velogen là vi rút có ñộc lực cao, thường ở thể quá cấp tính. Bệnh xảy ra nhanh chóng, gia cầm chết bất thình lình, không biểu hiện triệu chứng lâm sàng. ðiển hình của bệnh là bỏ ăn, ủ rũ, ỉa chảy, phù ñầu, thần kinh co thắt, cơ liệt run rảy và có hội chứng hô hấp. ðẻ trứng không vỏ hoặc vỏ mềm, sau ngừng ñẻ hoàn toàn. Tỷ lệ chết cao, có thể tới 100% ở gà, 30 - 70% ở bồ câu, 90% ở cút hậu bị và 50% ở cút trưởng thành. Bệnh gây ra bởi chủng Mesogen là chủng có ñộc lực vừa thì bệnh biểu hiện hô hấp nghiêm trọng, sau có triệu chứng thần kinh. Gà ñẻ sản lượng trứng giảm ñột ngột. Tỷ lệ chết ở gà có thể tới 50% hoặc hơn. Bệnh gây ra bởi chủng Lentogen là chủng virus có ñộc lực thấp thường không gây bệnh ở gia cầm trưởng thành, còn ở gia cầm non thể hiện bệnh nhẹ ở ñường hô hấp và chỉ bị chết khi bị nhiễm vi trùng kế phát như: Mycoplasma, E.coli, Pasteurella, virus (IB, ILT). * Bệnh tích Thể quá cấp tính: Thường bệnh tích không rõ. Thể cấp tính: Xoang mũi, miệng chứa nhiều dịch nhớt màu ñục, niêm mạc miệng, hầu, họng xuất huyết, viêm và phủ màng giả fibrin. Một số trường hợp ñầu, cổ, hầu bị phù thũng, dịch thẩm xuất có màu vàng dễ ñông ñặc như gelatin. Bệnh tích ñiển hình tập trung ở ñường tiêu hoá, niêm mạc dạ dày tuyến xuất huyết lấm tấm màu ñỏ, tròn nhơ ở ñầu ñinh ghim, có khi thành vệt. Dạ dày cơ xuất huyết, niêm mạc ruột non xuất huyết, viêm cata trong thời gian ñầu, gian ñoạn sau có vết loét, có thể nhìn rõ từ phía ngoài. Một số trường hợp hình thành nốt loét hình cúc áo bên cạnh có những ñám xuất huyết. Bệnh nặng thì trực tràng xuất huyết, lách không sưng, gan có một số ñám thoái hoá Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 23 mỡ nhẹ màu vàng, thận phù nhẹ, dịch hoàn buồng trứng xuất huyết thành vệt, trứng non bị vỡ trong xoang bụng (Biswal G và Morril C.C, 1954)[47]. Nếu gia cầm bị mắc ở thể khác thì ñường hô hấp có dịch nhày, xuất huyết khí quản phổi, nhiều khi màng túi khí viêm dày lên (Alexander, 1983)[32]. Tuỳ thuộc vào chủng virus gây nhiễm mà phôi gà có thể có xuất huyết hoặc không. * Bệnh lý tổ chức Bệnh lý tổ chức thường biểu hiện tăng sinh, phù thũng, xuất huyết, hoại tử làm thay ñổi hệ thống mạch máu và một số tổ chức khác như ở hệ thống tiêu hoá, hô hấp cũng như hệ thống thần kinh và hệ thống sinh sản. - Hệ thống thần kinh: Thường thấy bệnh lý tổ chức ở thể á cấp tính và mãn tính, ít thấy ở thể cấp tính dạng ñường ruột. Bệnh thể hiện rõ về mặt vi thể do thoái hoá của các tế bào thần kinh, thâm nhiễm các tế bào lympho quanh mạch quản, tăng sinh các tế bào nội mạc mạch quản và thâm nhiễm tế bào lympho ở các tổ chức của hệ thần kinh (Auer, 1952)[41]. - Hệ thống sinh sản. Biswal G và Morrill C.C (1954)[47], thấy viêm buồng trứng và ống dẫn trứng virus gây biến ñổi bệnh lý nhiều nhất là ở tử cung, ñặc biệt là vị trí hình thành vỏ trứng ở ống dẫn trứng. Biến ñổi bệnh lý bao gồm sự mất màng của nang trứng, sự thâm nhiễm các tế bào viêm và tạo thành và ñám lympho, ñặc biệt thấy rõ ở ống dẫn trứng. * Phân lập virus Bệnh phẩm ñể phân lập virus là phân, các chất chứa trong ống tiêu hoá, hô hấp, ổ nhớp, các cơ quan phủ tạng và não của gia cầm sống hoặc chết. Xử Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 24 lý bệnh phẩm, huyễn dịch thu ñược tiêm cho phôi trứng từ 9 - 11 ngày tuổi. Trứng ñược ấp tiếp ở nhiệt ñộ 370C, theo dõi chúng từ 5 - 7 ngày, thu hoạch nước trứng và kiểm tra bằng phản ứng HA, HI ñể xác ñịnh virus phân lập là virus Newcastle hoặc không. * Xác ñịnh ñộc lực của virus Newcastle Virus Newcastle có thể ñược phân lập từ những gia cầm có hoặc không có dấu hiệu lâm sàng. Theo Alexander (1998)[36], ñể ñánh giá tính ñộc lực của chủng virus phân lập, phải xác ñịnh các chỉ số sinh học MDT, ICPI, IVPI như sau: - Xác ñịnh thời gian trung bình gây chết phôi MDT (Mean death time): Virus phân lập, tiêm cho trứng gà có phôi từ 9 - 10 ngày tuổi. Thời gian trung bình gây chết phôi ñược tính ở ñộ pha loãng cao nhất làm chết 100% phôi. Thời gian trung bình gây chết phôi của các chủng virus Newcastle ñược phân vào 3 nhóm: Velogen (MDT < 60 giờ), Mesogen (MDT: 61 - 90 giờ) và Lentogen (MDT > 90 giờ). - Xác ñịnh chỉ số gây bệnh trên não gà con 1 ngày tuổi ICPI (Intracerebral pathogennicity Index). Virus phân lập từ nước trứng ñược tiêm vào não gà con 1 ngày tuổi. Chỉ số ñược tính theo ñiểm quy ñịnh cho biểu hiện bệnh. Chủng có ñộc lực cao như Velogen IVPI tiến gần ñến 2.0, chủng có ñộc lực thấp như Lentogen tiến dần tới 0.0. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 25 Bảng chỉ số ñộc lực của một số chủng virus Newcastle Chủng virus ðộc lực ICPI IVPI MDT Ulster 2C Lentogen 0.00 0.00 Queensland V4 Nt 0.00 0.00 150 Hichner B1 Nt 0.20 0.00 150 F Nt 0.25 0.00 120 Lasota Nt 0.40 0.00 119 H Mesogen 1.20 0.00 103 Mukteswar Nt 1.40 0.00 48 Roakin Nt 1.45 0.00 46 Beaudette C Nt 1.60 1.45 68 G.B Texas Velogen 1.75 2.70 62 Nyparrott 70181/1972 Nt 1.80 2.60 55 Italian Nt 1.85 2.80 51 Milano Nt 2.00 2.70 50 Hert 3356 Nt 2.00 2.70 48 Bồ câu Anh 561/83 150 0.00 120 Gà/Anh/702/84 1.90 2.10 60 Allan và cộng sự (1978)[38] - Alexander (1988) [35] Xác ñịnh chỉ số gây bệnh trên gà 6 tuần tuổi IVPI (Intravenous Pathogennicity Index): Virus phân lập ñược tiêm tĩnh mạch cho gà 6 tuần tuổi không dùng vacxin Newcastle. Chỉ số IVPI ñược tính bằng ñiểm quy ñịnh cho mỗi biểu hiện của bệnh. Theo tiêu chuẩn phân loại của FAO, OIE, nhóm Velogen là những virus ñộc lực cao, giá trị IVPI gần ñến 3.0 trong khi ñó chủng Mesogen và Lentogen có giá trị bằng 0.0. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 26 * Huyết thanh học Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI) ñược sử dụng rộng rãi trong chẩn ñoán bệnh Newcastle nhằm phát hiện kháng thể ñối với bệnh Newcastle trong huyết thanh gia cầm. Giá trị của phản ứng phụ thuộc vào tình trạng miễn dịch của gia cầm, sự có mặt của virus vacxin. Kiểm tra huyết thanh ở gia cầm không dùng vacxin, có hiệu giá HI = 1/8 (3 log2) kèm theo có dấu hiệu lâm sàng của bệnh ñược xem là gia cầm mắc bệnh Newcastle. Ở gà tiêm chủng bằng vacxin sống, thường có kháng thể HI từ 4lg2 - 6log2, ở gà dùng vacxin vô hoạt có kháng thể cao từ 9log2 - 11log2. 2.2.2.4. Chẩn ñoán phân biệt: Chẩn ñoán phân biệt với bệnh Cúm gia cầm Các biểu hiện lâm sàng của bệnh cúm gia cầm rất giống bệnh Newcastle với các biểu hiện: ỉa chảy nhiều, ho hen, thần kinh, tốc ñộ lây lan nhanh, tỉ lệ chết cao, giảm ñẻ nhanh … Khi mổ khám thấy viêm xuất huyết dạ dày tuyến, ruột, tá tràng, niêm mạc hậu môn, viêm buồng trứng, ống dẫn trứng, cũng có nhiều trường hợp viêm phúc mạc do trứng non bị dập. Nhưng ở bệnh Cúm gia cầm còn có những biến ñổi ñặc thù của bệnh như: Mào, tích thâm tím, phù nề, xuất huyết và hoại tử (với gà trưởng thành). Gà cũng có nước dãi chảy ra từ miệng, có xuất huyết ở khí quản. Gà mắc bệnh bị xuất huyết mỡ bụng, mỡ màng treo ruột, mỡ vành tim. Thấy có xuất huyết cơ ñùi, cơ ngực, cơ tim và cơ màng treo ruột. Chẩn ñoán phân biệt với bệnh thiếu Vitamin A. Chủ yếu quan sát trên bề mặt niêm mạc miệng có những ñám dạng như hoại tử nhưng ñó chẳng qua là khô niêm mạc. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 27 Chẩn ñoán phân biệt với bệnh Spirochaeta. Thường gà mọi lứa tuổi ñều bị nhưng chủ yếu quan sát thấy khi mổ ra: Lá lách sưng to, thận sưng. Gà có ỉa chảy nhưng không trầm trọng như Newcastle. Bệnh này có thể ñiều trị ñược bằng kháng sinh vì nó ñược xếp vào nhóm Leptospilosis. Chẩn ñoán phân biệt với bệnh ñậu thể yết hầu. Bệnh bao giờ cũng có vết loét trên niêm mạc miệng nhưng dù là thể ñậu yết hầu vẫn phát hiện ñược nốt ñậu ở thể ngoài da. 2.2.2.5. Phòng chống bệnh * Thực hiện ñầy ñủ các quy ñịnh của pháp luật về thú y Kiểm dịch gia cầm trước khi xuất nhập. Thời gian kiểm dịch ít nhất 35 ngày với sự giám sát chặt chẽ của thú y. * Vacxin phòng bệnh Dựa vào ñặc tính của virus Newcastle, khi xâm nhập vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể sản sinh kháng thể, tạo khả năng miễn dịch chống lại bệnh một cách ñặc hiệu. Allan và cộng sự (1978)[38], Meulemans (1987)[81] ñã ñề cập ñến các loại vacxin Newcastle và việc sử dụng vacxin Newcastle ñể khống chế bệnh. Có 2 loại vacxin là vacxin sống và vacxin vô hoạt. - Vacxin sống (gồm 2 chủng): chủng Lentogen và chủng Mesogen: - Vacxin vô hoạt: Vacxin vô hoạt ñược sản xuất từ những virus sống, ñược xử lý bớt Formalin hoặc Betaprpiolactone, sau ñó bổ xung thêm chất bổ trợ ñể làm tăng tính miễn dịch của vacxin. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 28 2.3. MỘT SỐ HIỂU BIẾT CƠ BẢN VỀ HOÁ MÔ MIỄN DỊCH 2.3.1. Lịch sử phát triển của kỹ thuật hoá mô miễn dịch Hoá mô miễn dịch (immunohistochemistry-IHC) là kỹ thuật không thể thiếu trong các phòng thí nghiệm với mục ñích chẩn ñoán và nghiên cứu. Qua các thập kỷ, việc có thể phát hiện ra kháng nguyên trong mặt cắt mô ñã ñược cải thiện nhanh chóng, bằng cách lợi dụng ảnh hưởng có hại của Formol lên sự phục hồi kháng nguyên và tăng tính nhạy cảm của hệ thống nhận diện kháng nguyên. Hennings và cs (1996)[63] dùng kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trong việc phát hiện kháng nguyên tế bào trong mặt cắt mô ñã mở ñầu cho kỹ thuật hoá mô miễn dịch. Từ ñó, hoá mô miễn dịch trở thành công cụ có giá trị trong chẩn ñoán và nghiên cứu cơ chế lây nhiễm và hình thành bệnh của một số bệnh ở các loài ñộng vật. Các khái niệm cơ bản liên quan ñến hoá mô miễn dịch là sự biểu hiện kháng nguyên ở trong mặt cắt các mô bởi các kháng thể ñặc trưng. Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể thể hiện bằng phản ứng màu mô hoá học, có thể phát hiện ñược bởi phản ứng phát sáng vi thể hoặc phản ứng huỳnh quang cho ra màu nâu vàng. Mặc dù nguyên lý của phản ứng ñơn ._.oan Bạch cầu ái kiềm Bạch cầu ñơn nhân lớn Tế bào Lympho Biểu ñồ 4.3b. Công thức bạch cầu của gà ISA Brown (20 tuần tuổi) Về tỷ lệ các loại bạch cầu chúng tôi thấy: ở gà bệnh tỷ lệ bạch cầu ña nhân trung tính và bạch cầu ái toan tăng lên rõ rệt so với gà khoẻ. - Bạch cầu ña nhân trung tính của gà bệnh là 56,8 trong khi ñó, tỷ lệ bạch cầu ña nhân trung tính của gà khoẻ là: 28,12. Tỷ lệ bạch cầu ái toan của gà bệnh là 5,74, trong khi ñó tỷ lệ này của gà khoẻ là: 4,08. Cùng với sự tăng của bạch cầu 74 trung tính và bạch cầu ái toan thì tỷ lệ tế bào lympho cũng giảm tương ứng. Sự thay ñổi của công thức bạch cầu, theo chúng tôi có thể xảy ra do tác ñộng của sự nhiễm khuẩn trong quá trình bệnh ñã kích thích sự tăng thực sự của bạch cầu ái toan và bạch cầu trung tính trong một phạm vi nào ñó ñể chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn vào một cơ thể ñã bị suy giảm sức ñề kháng. Mặt khác, virus Newcastle có ái lực với hệ thống tạo huyết, khi nhiễm bệnh khả năng tạo bạch cầu bị hạn chế nên số lượng bạch cầu và số lượng tế bào lympho giảm rõ rệt. Theo Riddell, khi gà bị bệnh Newcastle mô lympho sơ cấp và thứ cấp ñều bị phá hủy nghiêm trọng (Avian histopathology – 1996) Tỷ lệ bạch cầu trung tính và bạch cầu ái toan tăng lên là phù hợp với phản ứng tự nhiên của sinh vật, trong các quá trình bệnh lý nhiễm khuẩn cấp tính, tỷ lệ bạch cầu trung tính thường tăng lên (Smith, 1972; Vũ triệu An, 1978; Jubb, K.V. và Kennedy, 1985; Cao Xuân Ngọc, 1997).(Trích theo Nguyễn Hữu Nam) )[24]. 4. 3. KẾT QUẢ NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH ðể xác ñịnh sự có mặt của virus Newcastle trong một số tổ chức, cơ quan của gà mắc bệnh Newcastle chúng tôi ñã sử dụng kỹ thuật hoá mô miễn dịch. Chúng tôi nhuộm hóa mô miễn dịch ở các cơ quan của 4 lô gà gây nhiễm và 3 lô gà tự nhiên, ñược ñánh thứ tự từ I ñến VII. Kết quả thu ñược ở bảng 4.13. 75 Bảng 4. 13. Kết quả nhuộm hoá mô miễn dịch Cơ quan Gà Lô I Lô II Lô III Lô IV Lô V Lô VI Lô VII Mí mắt ++ + +++ ++ + + ++ Khí quản + + ++ + + + + Phổi ++ + +++ ++ + ++ + Tim ++ ++ + + ++ ++ + Gan + - + - + + - Lách +++ - ++ ++ ++ +++ +++ Thực quản ++ + + + + + + Ruột +++ + ++ +++ ++ +++ ++ Dạ dày tuyến ++ - + +++ ++ ++ ++ Tuyến tụy ++ - + ++ + + + Manh tràng ++ + ++ +++ ++ + + Thận +++ + ++ ++ ++ ++ +++ Túi Fabricius ++ - + + ++ +++ ++ Não + +++ ++ + +++ ++ +++ + ðám, hạt bắt màu nâu ít ++ ðám, hạt bắt màu nâu trung bình +++ ðám, hạt bắt màu nâu nhiều - Không có ñám, hạt bắt màu nâu Sau khi làm hóa miễn dịch chúng tôi nhận thấy virus có mặt ở hầu hết các cơ quan trong ñó chúng tôi nhận thấy kết quả dương tính thường rõ hơn cả là ở thận, lách, não, túi Fabricius, ở mí mắt (nếu nhỏ virus cường ñộc). Các cơ quan khác cùng có kết quả dương tính nhưng mức ñộ ít hơn. 76 Nghiên cứu cũng cho thấy virus thường xuất hiện ở các tế bào biểu mô của khí quản, thực quản, dạ dày tuyến…, nhưng cũng thấy ở các tế bào khác. Kết quả cũng tương ñồng với nhận ñịnh tế bào ñích của virus Newcastle không chỉ là tế bào biểu mô theo Garib S.O và cộng sự (2003) [58]. Theo Carpenter (1998) [51], Lan (2006,2008) [70] khi có mặt của virus trong tổ chức ñem làm hóa miễn dịch sẽ cho kết quả dương tính với sự hiện màu nâu ñỏ trên lát cắt tổ chức (màu của cơ chất DAB). ðánh giá mức ñộ dương tính của tiêu bản hóa miễn dịch chủ yếu dựa trên cảm quan bằng mắt. Nó biểu hiện ở số lượng các hạt, ñám bắt màu nâu ñậm. Màu nâu ñậm càng nhiều, rõ thì mức ñộ (+) tính càng cao. Nơi hóa miễn dịch (+) tính rõ chính là nơi tập chung nhiều virus. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch qua kính hiển vi cho thấy: - Có lác ñác những ñám bắt màu nâu giới hạn trong tế bào biểu mô của khí quản gà. Ở tất cả các lô gà thí nghiệm ñều nhận ñược kết quả dương tính là (+), tuy nhiên ở lô gà ñược gây nhiễm theo ñường niêm mạc mũi, mắt có mức ñộ dương tính cao hơn (++). ðiều này chứng tỏ ñường gây xâm nhập bệnh cũng ảnh hưởng ñến kết quả nhuộm hóa miễn dịch. - Ở thực quản có lưa thưa những ñám màu nâu ở tế bào ngoại vi tuyến, mức ñộ dương tính này cũng thấy ở tim mà phần chính là các sợi cơ tim và các tế bào viêm. - Kết quả hóa miễn dịch dương tính cao ở lách và não. Các virus tập trung nhiều trong tế bào ñại thực bào thuộc rìa các mạnh quản, ñộng mạch chổi của lách. Ở lách có ñến 3 lô dương tính (+++) gồm lô I, lô VI, lô VII và ở não có ñến 3 lô dương tính (+++). Theo quan sát ở ñại não, tiểu não, hành tủy có nhiều ñám các hạt bắt màu nâu sẫm trong tế bào chất với nhiều kích thước khác nhau, rõ nhất là ở 77 tiểu não. Tế bào bắt màu thường là tế bào thần kinh, tế bào hạt, tế bào Purkinje, tế bào thần kinh ñệm, hiếm thấy ở tế bào nội mạc huyết quản. - Ở phổi kháng nguyên virus tập trung chủ yếu ở các tế bào ñại thực bào, các tế bào vách phế nang, phế quản tận. - Kháng nguyên virus còn ñược phát hiện ở tế bào biểu mô và tế bào lympho xâm nhập ở niêm mạc mắt, thực quản, ruột, lách và thận (ở kẽ thận và ống thận). ðặc biệt ở mí mắt, hầu như niêm mạc mắt của gà bệnh ở các lô ñều thấy dương tính với IHC. Rõ nhất là lô gà gây nhiễm theo ñường nhỏ mắt và mũi. Mức ñộ dương tính lên tới (+++). - Ở thận cũng có sự xuất hiện của virus với các ñám bắt màu nâu nhiều hoặc trung bình. Sự có mặt của virus là thường xuyên ở thận và thấy ở tất cả các lô gà bệnh. Kết quả này cũng tương ứng với nhận ñịnh của Thijs Kuiken (1998)[95]. - Nhiều cơ quan như tuyến tụy, dạ dày tuyến, túi Fabricius, manh tràng, virus ñược phát hiện chủ yếu ở tế bào lympho và ñại thực bào thâm nhiễm ở vùng cơ niêm và ở vùng lớp cơ của thành mạch. Virus cũng ñược phát hiện với số lượng trung bình ở tế bào ngoại tiết của tụy. - Bên cạnh những dương tính ñặc trưng còn thấy những dương tính ít ñặc trưng thể hiện bởi những ñám màu nâu phân tán ở tế bào biểu mô ruột và trong các hạt của tế bào heterophil. 4.4. MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA BIẾN ðỔI ðẠI THỂ, VI THỂ, HOÁ MÔ MIỄN DỊCH TRONG SỰ PHÂN BỐ VIRUS TRÊN MỘT SỐ CƠ QUAN CỦA GÀ MẮC BỆNH NEWCASTLE ðể nghiên cứu mối tương quan giữa bệnh tích vi thể, ñại thể và hóa miễn dịch chúng tôi ñã chọn một số tổ chức của các lô gà mắc bệnh ñể so sánh. Kết quả thu ñược trình bày ở bảng 4.14 78 Bảng 4.14. Mối tương quan giữa biến ñổi ñại thể, vi thể, hoá mô miễn dịch trong sự phân bố virus trên một số cơ quan của gà mắc bệnh Newcastle Gà Cơ quan Biến ñổi ñại thể Biến ñổi vi thể Hóa miễn dịch Mí mắt ++ ++ ++ Phổi ++ ++ ++ Lách ++ ++ +++ Ruột +++ +++ +++ Lô I Não +++ ++ + Mí mắt ++ + + Phổi + + + Lách + - - Ruột + + + Lô II Não ++ +++ +++ Mí mắt +++ +++ +++ Phổi +++ ++ ++ Lách + ++ ++ Ruột +++ ++ ++ Lô III Não +++ ++ ++ Mí mắt +++ ++ ++ Phổi + ++ ++ Lách + ++ ++ Ruột +++ +++ +++ Lô IV Não + - + Mí mắt + + + Phổi ++ + + Lách + + ++ Ruột ++ ++ ++ Lô V Não ++ +++ +++ Mí mắt ++ + + Phổi ++ ++ ++ Lách ++ ++ +++ Ruột +++ +++ +++ Lô VI Não + ++ ++ Mí mắt ++ ++ ++ Phổi + + + Lách ++ ++ +++ Ruột ++ ++ ++ Lô VII Não +++ +++ +++ 79 Kết quả cho chúng tôi thấy rằng những biến ñổi ñại thể và biến ñổi vi thể của các cơ quan, tổ chức như mí mắt, phổi, lách, ruột, não của gà mắc bệnh Newcastle là tương ñồng. Với các bệnh tích ñại thể: lách sưng to, phổi sưng tụ máu, màu ñỏ sẫm, xuất huyết loét ruột,… thì kết quả nghiên cứu vi thể cũng có những tổn thương bệnh lý ñiển hình ở phổi, ruột, não, lách, mí mắt. Xung huyết ở phổi rất rõ ràng, các mạch quản giãn rộng chứa ñầy hồng cầu. Bên cạnh ñó còn thấy phổi bị xuất huyết, hồng cầu tràn ngập trong lòng các phế nang. Ngoài ra còn thấy xuất hiện sự hoại tử tế bào, thoái hoá tế bào. Ở ruột xuất huyết, xung huyết, hoại tử tế bào niêm mạc ruột, thâm nhiễm tế bào viêm ở hạ niêm mạc ruột. ðối với kết quả nhuộm HE và kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch chúng tôi cũng thấy ñược sự tương quan về mức ñộ tổn thương tế bào của các cơ quan trên, tuy nhiên cũng còn tỷ lệ nhất ñịnh block chưa cho kết quả tương ñồng hoàn toàn. Có kết quả này có thể là bởi kỹ thuật hóa mô là một trong những phương pháp chẩn ñoán nhạy hơn, nên có thể phát hiện virus ở mô bào ngay khi mô/tế bào chưa bị tổn thương (Marc Key and al, 2006)[79]. Chính vì vậy ở một số block sự tổn thương tế bào chỉ là (++) ở nhuộm HE nhưng ở kết quả nhuộm IHC là (+++). Ngoài ra cũng có thể lý giải là do: Mức ñộ biến ñổi bệnh lý của các cơ quan tổ chức của gà phụ thuộc vào nhiều yếu tố như ñường xâm nhập, cách gây bệnh, số lượng, chủng và ñộc lực của virus. Mức ñộ biến ñổi ñó còn phụ thuộc vào sức ñề kháng của từng cá thể gà. 80 4.5. SO SÁNH HIỆU QUẢ CHẨN ðOÁN BỆNH NEWCASTLE BẰNG IHC VỚI CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÁC. ðể ñánh giá mức ñộ hiệu quả của phương pháp hóa mô miễn dịch chúng tôi so sánh kết quả của phương pháp này với các phương pháp chẩn ñoán khác gồm: HI, RT-PCR và phương pháp nhuộm HE trên các cơ quan phổi, não, lách. Kết quả ñược chúng tôi trình bày ở bảng 4.15. Bảng 4.15. So sánh hiệu quả chẩn ñoán bệnh Newcastle ở các lô gà bằng các phương pháp khác nhau. Não Lách Phổi Lô gà HI HE IHC RT-PCR HI HE IHC RT- PCR HI HE IHC RT- PCR I + + + + + + + + + + + + II + + + + + - + + + + + + III + + + + + + + + + + + + IV + - + + + + + + + + + + V + + + + + + + + + + + + VI + + + + + + + + + + + + VII + + + + + + + + + + + + Qua bảng chúng tôi thấy, ở tất cả các mẫu kiểm tra bằng phương pháp RT- PCR và chẩn ñoán huyết thanh học HI cho kết quả dương tính thì khi nhuộm hoá miễn dịch cũng ñều thấy có sự phân bố của virus ở mức ñộ nặng, nhẹ khác nhau. Ở não gà bị bệnh ñôi khi nhuộm HE ta không thể tìm thấy có sự xuất hiện của virut nhưng khi kiểm tra bằng RT-PCR, hay hóa miễn dịch ta ñều thu ñược kết quả dương tính và ñối với mô bệnh lách và phổi cũng vậy. Khi ở phương pháp nhuộm thông thường soi trên kính hiển vi quang học những tổn thương tìm thấy rất khó khăn ñể nhận biết hoặc khá mờ nhạt thì ở phương pháp hóa mô miễn dịch chúng ta có thể dễ dàng nhận ra sự có mặt của mầm bệnh nhờ vào cơ chất màu DAB. 81 Như vậy, kết quả nhuộm hoá miễn dịch về cơ bản có sự tương ñồng với phương pháp RT - PCR và nó là phương pháp có ñộ chính xác cao, ñang ñược áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chẩn ñoán các bệnh nói chung và bệnh Newcastle nói riêng. Mặc dù RT- PCR có ñộ nhạy hơn IHC, tuy nhiên khi áp dụng phương pháp hóa mô miễn dịch trong chẩn ñoán chúng ta có thể có ñược những bằng chứng có giá trị về sự phân bố của mầm bệnh về số lượng và vị trí có mặt của virus trong mô bào. (Nobuko Wakamatsu, 2007) [83]. 82 Hình ảnh mối tương quan kết quả nhuộm HE và IHC Ảnh 4.47 HE Ảnh 4.48 IHC Virus tập trung ở tuyến tụy Ảnh 4.49 HE Ảnh 4.50 IHC Virus tập trung ở biểu mô phế quản Ảnh 4.51 HE Ảnh 4.52 IHC Virus tập trung ở ngoại tâm mạc 83 Ảnh 4.53: Lách HE x 150 Ảnh 4.54: Lách IHC x 150 Ảnh 4.55: Não HE x 150 Ảnh 4.56: Hành Tủy IHC x 150 Ảnh 4.57: Tá tràng HE x 150 Ảnh 4.58: Tá tràng IHC x 150 Ảnh 4.59: Thực quản IHC x 150 Ảnh 4.60: Mí mắt IHC x 150 82 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ những kết quả nghiên cứu ñã ñạt ñược chúng tôi rút ra ñược những kết luận sau: - Triệu chứng chủ yếu của gà mắc bệnh Newcastle bao gồm: Gà ủ rũ, sã cánh, gà bỏ ăn, uống nhiều nước, mí mắt viêm, chân lạnh và khô, gà ỉa chảy phân trắng, phân xanh, có triệu chứng về thần kinh, ở gà mái ngừng ñẻ trứng. - Xác gầy, lông xơ xác, diều chứa ñầy thức ăn, xuất huyết khí quản, dạ dày tuyến, xuất huyết ruột non, loét hạch ruột,... là những bệnh tích ñại thể chủ yếu thường gặp ở gà mắc bệnh Newcastle. - Về cơ bản gà gây nhiễm có triệu chứng và bệnh tích ñại thể giống gà nhiễm bệnh tự nhiên. Tuy nhiên một số triệu chứng và bệnh tích ñại thể ngoài tự nhiên thường ñiển hình hơn và ngược lại. - Biến ñổi bệnh tích vi thể chủ yếu của gà mắc bệnh Newcastle là sung huyết, xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm, thoái hóa tế bào, hoại tử tế bào ở một số cơ quan như gan, thận, lách, ruột, túi Fabricius,... và tăng sinh tế bào thần kinh ñệm. - Số lượng hồng cầu, hàm lượng Hb và tỉ khối huyết cầu của gà mắc bệnh Newcastle ñều giảm rõ rệt so với gà khỏe. - Số lượng bạch cầu giảm, tỷ lệ bạch cầu ña nhân trung tính và bạch cầu ái toan ñều tăng lên. - Kỹ thuật hóa mô miễn dịch cho thấy sự tồn tại của virus ở một số cơ quan như: mí mắt, phổi, lách, ruột, não của gà mắc bệnh Newcastle hầu hết tương ứng với biến ñổi bệnh lý ñại thể và vi thể ở các cơ quan gà bệnh ñã nghiên cứu. 83 - Phương pháp IHC có ñộ chính xác cao cho phép phát hiện nhanh và chính xác vị trí và sự tồn tại của virus hơn các phương pháp chẩn ñoán bệnh Newcastle thông thường khác. 5.2. ðỀ NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu về triệu chứng lâm sàng, biến ñổi bệnh tích ñại thể, vi thể của gà mắc bệnh Newcastle ở các lứa tuổi khác nhau, các giống gà khác nhau. - Tiếp tục nghiên cứu sâu ñể làm rõ ñặc ñiểm bệnh lý của bệnh Newcastle. ðặc biệt là về tế bào ñích của virus Newcastle và tìm hiểu sâu hơn nữa kỹ thuật hoá mô miễn dịch ñể ứng dụng chẩn ñoán chính xác bệnh Newcastle ñể từ ñó có những biện pháp phòng và trị hiệu quả, giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra. 84 PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu Tiếng Việt 1. Bùi Quang Anh, Hoàng Văn Năm (2004), Bệnh cúm ở gia cầm và biện pháp phòng chống, trang 22, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 2. Bunpon Sirivong (1991), Nghiên cứu ñặc tính sinh học một số chủng virus Newcastle, Luận án phó tiến sỹ KHNN. ðại học Nông nghiệp, Hà Nội. 3. Trần Minh Châu và Hồ ðình Chúc (1998), Bệnh ở ñộng vật nuôi tập II, Bệnh Virus, Nhà xuất bản KHKT, Hà Nội. 4. Cù Xuân Dần, Nguyễn Xuân Tịnh, Tiết Hồng Ngân (1996), Sinh lý học gia súc, NXB Nông nghiêp, Hà Nội. 5. Vũ ðạt và cộng sự (1989), “Nghiên cứu những tác nhân gây ảnh hưởng ñến ñáp ứng miễn dịch phòng bệnh Newcastle”, Báo cáo hội nghị Khoa học Kỹ thuật Bộ Nông nghiệp và CNTP, Hà Nội. 6. Vũ ðạt, Nguyễn Thị Lan (1999), “Dịch tễ học bệnh Newcastle trong các cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp thường xuyên tiêm phòng vacxin phòng bệnh”. Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật Chăn nuôi – Thú y (1996-1998), trang 78-80, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 7. Nguyễn Tiến Dũng, Bunpon Sirivong, Nguyễn Văn Quang (1991), “Cấu trúc kháng nguyên HN của virus Newcastle và ảnh hưởng của nó lên phản ứng HA, HI”, Tuyển tập công trình nghiên cứu KHKT Nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, trang 19-22. 8. Nguyễn Tiến Dũng – Nguyễn Văn Quang (1993), “Biến chủng virus Newcastle nhược ñộc chịu nhiệt”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập 1, số 1, trang 13-20. 9. Nguyễn Tiến Dũng – Nguyễn Văn Quang (1995), “Nghiên cứu xác ñịnh một số ñặc tính virus Newcastle cường ñộc VN91”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập 2, số 4, trang 6-11. 85 10. Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Văn Quang và cộng sự (1996), “Sử dụng virus Newcastle chủng La Sota chịu nhiệt làm vacxin phòng bênh”, Tạp chí Khoa học Thú y, tập 3, số 4, trang 40-44. 11. Nguyễn Thu Hồng (1990), “Kết quả nghiên cứu sử dụng vacxin thích hợp phòng bệnh Newcastle trong các cơ sở chăn nuôi gà tập trung ở Việt Nam”, Kết quả nghiên cứu Khoa học kỹ thuật Thú y, trang 30-34. 12. Nguyễn Thu Hồng (1993),Khảo sát virus Newcastle gây ra các ổ dịch lớn những năm 70 và nghiên cứu một số vacxin phòng bệnh cho gà ở nước ta, Luận án phó tiến sỹ KHNN, ðại học Nông nghiệp, Hà Nội. 13. Nguyễn Bá Huệ, Nguyễn Thu Hồng, Trần Thị Hường (1980), “Các chủng virus cường ñộc Newcastle gây ra các vụ dịch lớn trong các xí nghiệp ở nước ta và hướng phòng bệnh”, Kết quả nghiên cứu Khoa học kỹ thuật Thú y 1968- 1978, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 14. Trần Thị Lan Hương (1999), “Hàm lượng kháng thể Newcastle của ñàn gà khi sử dụng vacxin phòng bệnh khác nhau. Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật Chăn nuôi – Thú y (1996-1998)”, trang 112-116, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội 15. Trần Thị Lan Hương (2001), Một số yếu tố ảnh hưởng ñến ñáp ứng miễn dịch chống bệnh Newcastle của ñàn gà công nghiệp, Luận án tiến sỹ Nông nghiệp, ðại học Nông nghiệp, Hà Nội. 16. Lâm Trần Khanh (2006), Một số ñặc ñiểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và biến ñổi bệnh lý bệnh cúm gia cầm tại Hà Tây và vùng giáp ranh, Luận án thạc sỹ Nông nghiệp, ðại học Nông nghiệp, Hà Nội. 17. Nguyễn Văn Kình, Trần Văn ðích (1991-1995), “Một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và miễn dịch học trên gà Ri khi tiêm phòng vacxin Newcastle”, Kỷ yếu kết quả nghiên cứu khoa học chăn nuôi thú y, trang 32-33. 86 18. ðào ðức Long, Tô Du (1994), Kỹ Thuật nuôi chim cút, chim câu, gà tây, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 19. Phan Lục (1994), Một số ñặc ñiểm của những vụ dịch Newcastle và lịch vacxin phòng bệnh thích hợp cho các cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp, Luận án phó tiến sỹ Khoa học Nông nghiệp. ðại học Nông nghiệp, Hà Nội. 20. Phan Lục và cộng sự (1996), “Mối tương quan giữa hàm lượng kháng thể lưu hành và sức bảo hộ chống virus cường ñộc Newcastle”, Tuyển tập công trình nghiên cứu KHKT gia cầm, 1986-1996, trang 216 -219, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 21. Phan Lục và cộng sự (1996), “Một số ñặc ñiểm của những vụ dịch Newcastle và lịch vacxin phòng bệnh thích hợp cho gà ở một số xí nghiệp gà công nghiệp”, Tuyển tập công trình nghiên cứu KHKT gia cầm, 1986-1996, trang 211-215, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 22. Phan Lục và cộng sự (1996), “So sánh hiệu quả dùng vacxin La sota bằng phương pháp phun sương, cho uống và nhỏ mũi”. Tuyển tập công trình nghiên cứu KHKT gia cầm, 1986 -1996, trang 219-223, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 23. Hồ Văn Nam (1982), Giáo trình chẩn ñoán bệnh không lây gia súc, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 24. Nguyễn Hữu Nam (2008), “Nghiên cứu biến ñổi bệnh lý ñại thể và vi thể các cơ quan của gia cầm trong hai bệnh Newcastle và cúm gia cầm”, Báo cáo tổng kết ñề tài, trường ðại học Nông nghiệp, Hà Nội. 25. Nguyễn Vĩnh Phước (1978), Giáo trình truyền nhiễm gia súc, trang 387 -398, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 26. Trương Quang, Trương Hà Thái (2005), “Bệnh Newcastle thể không ñiển hình và lịch sử dụng vacxin ở ñàn gà thịt nuôi tập trung trong gia ñình”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, trang 135-139, Nhà xuất bản ðại học Nông nghiệp, Hà Nội. 87 27. Nguyễn Thái, Phạm Quân, Phan Thanh Phượng (dịch giải) (1976), Bệnh dịch ta – Newcastle. Bệnh Gia cầm, trang 409 -453, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 28. Nguyễn Tiến Trung, Lê Thành Nguyên (1987), Thí nghiệm bảo quản và ñộ dài miễn dịch của các vacxin do phân viện thú y Nam Bộ sản xuất, Nhà xuất bản KHKT, TP Hồ Chí Minh. 29. Trần ðình Từ (1985), “Nghiên cứu xác ñịnh ñộc lực các chủng Virus vacxin Newcastle hiện ñang sử dụng ở Việt Nam”, Kết quả nghiên cứu KHKT Thú y 1974-1985, trang 119-146, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 30. Trần ðình Từ (1985), “Nghiên cứu xác ñịnh ñộc lực của các chủng virus vacxin Newcastle hiện ñang sử dụng ở Việt Nam”, Kết quả nghiên cứu KHKT Thú y 1979-1984, trang 119 -146, Nhà xuất bản KHKT, Hà Nội. 2. Tài liệu Tiếng Anh 31. Ackermann, Wilbur W . Cell (1964) Surface phenomena of NDV. University of Wisconsin Press, Madison, , p153. 32. Alexander D.J, Parsons G and Marshall R (1983), Infection of fowls with Newcastle disease virus by food contaminated with pigeon faeces, Vet. Res, 115: pp 601 602. 33. Alexander D.J and Parsons G (1986), Pathogenicity for chikens of avian paramyxovirus type 1 isolates obtained from pigeeons in Great Britain during 1983-1985, Avian pathol, 15, pp 487 – 493. 34. Alexander D.J (1988), Historical aspects, Kluwer academic publ, Boston, pp 1-10. 35. Alexander D.J (1988), ND method of speasd, Acadern. Pub, Boston, pp 256-272. 36. Alexander D.J (1998), Newcastle disease and other Avian paramyxoviridae infections, Diseases of poultry, Printed in the United States of America, International publishers limited, pp 541-562. 88 37. Alexander D.J, Manvell and R.E.Gough (1986), newcastle disease – world situation, avian Virology, VLA Weybridge, Addlestone, Surrey KT 15 3 NB, UK, (18), pp 75-79. 38. Allan W.H, Lancaster J.E and Toth B (1978), Newcastle disease vaccines. FAO, ROM. 39. Asplen E.D (1986), The antigenic relationships of Newcastle virus, Vet, Res, 59, pp 245-249. 40. Asplin E.D (1986), Newcastle disease in duck and geese, Vet, Ree, Record, (59), pp 621-624. 41. Auer J (1952), Newcastle disease, Comp, Med, Vet, Sci, (16), pp277 -284. 42. Bankowski R.A (1964), Cytopathogenicity of Newcastle disease virus, Newcastle virus, an evolving pathogen, University of Wisconsonpree Madison, pp231. 43. Bastamin M.A and Amer M.M (1986), Comparative study on the immune response of chickens vaccinated intramuscularly with different ND vaccines, Assiut Veterinarry Med, Journal, (17), pp 233-229. 44. Beard C.W and Easterday B.C (1967), The iffection of route of adminstration of Newcastle disease virus on host resphone, J.Infect, Dis, pp 55-61. 45. Beard C.w and Hanson R.P (1984), Newcastle disease, Disease of Poultry, Iowastate univ press, Ames, pp 452 – 470. 46. Bhaiyat M.I and etal (1995), Brain lesions in chickens experimentaly infected with a neuroadapted strain of Mesogen Newcastle disease virus, Journal of veterinary. Mediceal sciences, Japan, (2), pp 327 – 244. 47. Biswal G and Morrill C.C (1954), The pathology of the reproductive tract of lay ing pulletd with Newcastle disease, Poult, sci, (33), pp 880-897. 48. Box P.G, Holmes H.C and Webb K.J (1988), Significance of antibody to avian paramyxovirus 3 in chicken, Vet, Record, (17), pp 423. 89 49. Brandly C.A, Hanson R.P (1965), Newcastle disease in disease of Poultry, Biester and Schwarte fifth edition, the IOWA State university press, Ames, IOWS, USA, (22), pp 633 -674. 50. Burnet F.M (1942), Affinity of NDV to the influenza virus group, Aust.J.Exp Biol, Med, Sci, (20), pp 81-88. 51. Carpenter (1998), Genetic characterization of CDV in serengeti carrivoros. Joural of Vet. Med, (2), pp 233-239. 52. Chandra sekar S, Venkateram R.A, Padmanalia D and Masillamory P.R (1988), Humoral immune resphonse to NDV vaccin in chickens. Indian Vet.J, (68), pp 653-657. 53. Doyle T.M (1985), Pathology of Newcastle disease, (48), pp 144 – 169. 54. Estudillo J (1972), Newcastle disease, Poultry Dis, Conf, University of California, Davis, pp 70-73. 55. Flanagan M, polkinghome I.G and Davis B.M (1990), An investigation of North Queensland commercial poultry flock for evidence of infection with Newcastle disease virus, Australian Vet, Jour, (67:9), pp 339-340. 56. French E.L, George T.D and J.J Perey (1967), Infection of Chicks with recently isolated NDV of low virulence. Aust, Vet, (43), pp 404 – 409. 57. Garagher J.T, Allan W.H and Wyem P.J (1974) Immuno suppresive effect of infection bursal disease agent in vaccination against ND. Vet, Rcc, (95), pp 385 – 388. 58. Garib S.O, Gielkenl.A.L.J, Gruys, Peeters B.P.H and Koch.G (2003), ”Tissue tropism in the chicken embryo of non-virulent and virulent Newcastle disease strains that express green fluorescence protein”, Avian Pathology, December, 2003, 32 (6), pp 591-596. 59. Gelb J, Fries P.A. and peterson F.S (1987), Pathogenecity and crooss – protection of pigeon paramyxovirus I and NDV in young chickens, Avian diseases, (31), pp 601 -606. 90 60. Hanson R.P (1972), Newcastle disease, in S.B Hicher (eds) In isolation and identification of avian pathogens, Amer asso of avian pathologists, pp 63. 61. Hanson R.P (1972), Newcastle disease. In disease of poultry. The low state, University press: Ames, pp619-659. 62. Hanson R.P and Spalatin J (1978), Thermostability of the hemaglutinin of NDV and strain marker in epizootiological studies, Avian Dis, (22), pp 659 -665. 63. Hennings, J. Collins, JE (1996), Chronological immunochemical detection and localization of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus in gnotobiotic pigs, Vet. Pathol, (33), pp 551 -556 64. Higgins D.A (1971), Nine disease outbreak associated with myxoviruses among ducks in Hongkong, Trop, Animal health product, Trop, Animal Hlth, Prod,. (3) pp 232 -240. 65. Ide P.R (1987), Virological studies of paramyxovirus type 1 infection of pigeons, Canadian Vet, Jour, (28), pp 601 – 603. 66. Iderie, A, Ibranhim, A.L (eds) (1987), Field trials of ND food pellet vacxin Newcastle of poultry, Anew food pelltvacxin, ACIAR monograp, (5), pp 26-28. 67. Irrio RM and Bratt M.A (1983), Monoclonal antibody in NDV, delincation of four wpitopes on the Ha Noi flucoprotein, America sociaty for microbiglogy, pp440-450. 68. Jumaily W.T, Al – Atar M.A and Mansour A.D (1989), “The incidence of sammonella and serogogical widence of ND in some wild bird from Baghad area”, Journal of Biological Science Research, (20), pp 213 -219. 69. Kolakofsky D.E (1974) Molecular weight determination of sendai and Newcastle disease virus RNA, J.Virol, (13), pp 261-258. 70. Lan (2006.2008), Patholigal and Molecular biological studies on Canine Distemper, thesis of the degree of Doctor. 91 71. Lancaster J.E (1966), Newcastle disease, a revew of sime of the literature published between 1926 and 1964, Ottawa, Canada Department of Agriculture. 72. Lancaster J.E and Alexander D.J (1975) Newcastle disease: virus and spred. Monograph No 11. Canada department of Agriculture, pp 56-60. 73. Lombardi D (1974), Study of theoimmune response to Newcastle disease and infectious brouchitis viruses in fouls treated with virulent of attenuated Gumboro disease virus, Nouva veterinaria, (50), pp 275 – 282. 74. Lu Y.S and Tsai H.J (1986),“Epizootiology of ND in Taiwan 1984”, Journal of Chinese Society of Vet. Science, (12), pp 197-207. 75. Lu Y.S, Tsai H.J and Lin D.F (1986), “Occurrence of ND in Taiwan from 1970 to 1985”, Journal of Chinese Society of Vet. Science, (12), p 365 -374. 76. Lukarev T and Dodovski M (1987), Outbreak of ND in 7 – Week – old chickens and its effect on the egg production of the survivors, (22), pp 299-301. 77. Luthgen. W (1981), Newcastle disease in free living and pet birds. ADV Veterinary medicin, (31), p 63 -71. 78. Maeda M, Koizumi and Okubo T (1993), “Histopathological change in Newcastle disease affecting racing pigeons in Japan”, Vet. Medicine, (21) , Japan. 79. Marc Key and al (2006), Immunohistochemical Staining Methods Fourth Edition, Biomedical Services. Ojai, CA, USA 80. Me Gerran J.B and Gordon W.A (1968), “Newcastle disease in poutry”. Vet. Res, (82), pp 589 – 592. 81. Meulemans G and Goneze M (eds) (1987), Evaluation of the use of monoclonal antibodies to haemagglutination and fution glycoprotein of Newcastle disease virus identification and strain differentiation purpose, Arch Virol, (92), pp 55-62. 92 82. Mousa S, Soliman A and Bayoumi A.H (1988), The role player by free flying birds in the transmission of avian pathogens assiu Veterinary Medical Journa, (20), pp 178 -184. 83. Nobuko Wakamatsu. Daniel J.King. Bruce S.Seal. Corrie C. Brown (2007). “Detection of Newcastle disease virus RNA by reverse transcription- polymerase chain reaction using formalin-fixed, paraffin-embedded tissue and comparison with immunohistochemistry and in situ hybridization”. J Vet Diagn Invest. 19: 396 -400. 84. OIE (2005), Newcastle Disease, lats reviewed October 2005. 85. OIE (2007), Newcastle disease in Estonia, OIE Alert message 071105 EST received by e-mail on 05 November 2007. 86. OIE (2007), Newcastle disease in Romania, OIE Alert message 071102 ROM received by e-mail on 02 November 2007. 87. OIE (2007), Newcastle Disease, Greece. OIE Immediate notification report Ref OIE: 6416, report Date: 01/11/2007 88. Okoye, J.O.A, Komolafe.O, Anene. BM (1987), Outbreaks of atypical Newcastle disease in Nigeria, Bulletin of animal health and production in africe, (37), pp 231 -233. 89. Pearson J.E, Senne D.A and Alexander DJ (1987), Characterization of NDV isolated from pigeons. Avian Diseases, pp 105 -111. 90. Rott R (1964), Antigenicity of Newcastle disease virus, Newcastle disease virus: an envolvin pathogen. University of Wisconsin Press, Madion, pp 133. 91. Russell P.H (1988), Monoclonal antibody in research diagnosis and episotiogogy of ND, Kluwer Acacdemie Pub, Boston, pp131-146. 92. Saifuddin M.D, Chowdhury – TIMER, sarker A.J and Amin M.M(1990), Protection conferred by vavcination with Blacksburg and Kimarow strains of 93 NDV against ND in Bangladesh, Tropical – Animal Health and Production, (22), pp 263 -273. 93. Sharaway (1994), Common diseases of quail, Quail production Systems areview by M. Sharaway food and Agriculture Organization of the Unite Nation, Rom, pp 890-901. 94. Spradbow P.B, Samuel J.I (1988), Newcastle disease in poultry New food pellet vaccine, Australian centre for international Agriculture Research, pp 44-49. 95. Thijs Kuiken (1998), Newcastle disease and other causes of mortality in double – crested cormonants (Phalacrocorax auritus), thesis of the degree of Doctor of Philosophi in DVP, Univ of Saskatchewan, Saskatoon. 96. Thijs Kuiken, Gary Wobeser (1999), “Pathology of newcastle disease in double – crested cormorants from saskatchewan, with comparison of diagnostic methods”, Joural of Wildlife Disease, 35 (1), pp 8-23. 97. Tisdal D.J (1988), Newcastle disease, (15), pp 26-27. 98. Tolba M.K and Eskarous J.K (1962), Effect of temperature on the haemagglutination activities and infectivity to chick ambryos of different strain of Newcastle disease and fowl plague viruses. Arcf, Kreislauflorsch, (38), p 234. 99. Vindevolgel H, Duchatel J.P (1997), Virus infection in feral birds, a genaral review, Bulletion de ta societe Royale, Sciences de Liege (Celgium), p 167 -174. 100. Yunus. M (1989), Scramble is on to solve mystery disease, Swine Pract, July, ._.