Nghiên cứu một số chỉ tiêu trong quy trình sản xuất, kiểm nghiệm vacxin giải độc tố Escherichia coli phòng bệnh tiêu chảy và sưng phù đầu ở lợn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------------------ NGUYỄN HỮU MẪN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT, KIỂM NGHIỆM VACXIN GIẢI ðỘC TỐ ESCHERICHIA COLI PHÒNG BỆNH TIÊU CHẢY VÀ SƯNG PHÙ ðẦU Ở LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : THÚ Y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRƯƠNG QUANG HÀ NỘI - 2010 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn. Tác giả luận văn Nguyễn Hữu Mẫn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... ii LỜI CÁM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện ñề tài ngoài sự nỗ lực của bản thân tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự giúp ñỡ, tạo ñiều kiện của Viện sau ñại học, Ban chủ nhiệm Khoa Thú y, trường ðHNN Hà Nội; Ban giám ñốc, Trung tâm Nghiên cứu thuộc Công ty HANVET; các thầy cô giáo trong Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, ñặc biệt là sự hướng dẫn nhiệt tình và chu ñáo của PGS.TS Trương Quang. Tôi xin bày tỏ lời cám ơn chân thành nhất tới các quí phòng ban, các thầy cô trong bộ môn, PGS.TS Trương Quang và các ñồng nghiệp ñã giúp ñỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành tốt luận văn này. Xin trân trọng cám ơn ! Tác giả luận văn Nguyễn Hữu Mẫn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cám ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục các hình viii 1. MỞ ðẦU i 2. TỔNG QUAN 3 2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 3 2.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 5 2.3 Vi khuẩn Escherichia coli 6 2.4 Bệnh tiêu chảy và phù ñầu ở lợn do E. coli gây ra 19 2.5 Tìm hiểu về vacxin 27 3. ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 3.1 ðối tượng, ñịa ñiểm nghiên cứu 37 3.2 Nội dung nghiên cứu 37 3.3 Nguyên liệu 37 3.4 Phương pháp nghiên cứu 38 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 4.1 Kiểm tra vô trùng vacxin giải ñộc tố E. coli 51 4.2 Xác ñịnh liều sử dụng vacxin giải ñộc tố E. coli. 52 4.2.1 ðối với lợn con sau cai sữa 52 4.2.2 ðối với lợn nái chửa 54 4.3 Xác ñịnh chỉ tiêu an toàn của vacxin giải ñộc tố E. coli 56 4.3.1 Xác ñịnh chỉ tiêu an toàn và liều an toàn của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với chuột bạch 56 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... iv 4.3.2 Xác ñịnh chỉ tiêu an toàn của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với bản ñộng vật 58 4.4 Nghiên cứu xác ñịnh hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli 60 4.4.1 Xác ñịnh hàm lượng giải ñộc tố có trong vacxin giải ñộc tố E. coli 60 4.4.2 Xác ñịnh hiệu lực của vacxin ñối với chuột bạch 61 4.4.3 Xác ñịnh hiệu lực của vacxin ñối với lợn 68 4.5 Nghiên cứu ñiều kiện bảo quản và thời gian bảo quản vacxin giải ñộc tố E. coli 75 4.5.1 Kết quả kiểm tra tình trạng vật lý và hiệu giá giải ñộc tố trong vacxin trong thời gian bảo quản 75 4.5.2 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli tại các thời ñiểm khác nhau trong thời gian bảo quản ñối với chuột bạch 77 4.6 Thử nghiệm thực ñịa và kiểm tra hiệu lực của vacxin ngoài thực ñịa 79 4.6.1 Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin ngoài thực ñịa 79 4.6.2 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin ngoài thực ñịa 80 4.6.3 Khảo sát ñộ dài miễn dich của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn ngoài thực ñịa 84 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 86 5.1 Kết luận 86 5.2 ðề nghị 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO 88 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADP Agar –gel Diffuse Precipitation BA Blood agar CFU Colony – Forming Unit DD Dưới da ðC ðối chứng E.coli Escherichia coli FT Fluid Thioglycolate FX Phúc xoang HGKT Hiệu giá kháng thể HGKðTTB Hiệu giá kháng ñộc tố trung bình MD Miễn dịch MLD Minimum Lethal Dose NA Nutrient Agar NB Nutrient Brorth SA Sabouraud Agar TCCS Tiêu chuẩn cơ sở TM Tĩnh mạch TN Thí nghiệm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... vi DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1 Kết quả kiểm tra vô trùng vacxin giải ñộc tố E. coli 51 4.2 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng ñộc tố của lợn con sau cai sữa trước và sau khi tiêm vacxin giải ñộc tố E. coli 53 4.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng ñộc tố trong huyết thanh của lợn nái chửa trước và sau khi tiêm vacxin giải ñộc tố E. coli 55 4.4 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin ñối với chuột bạch 57 4.5 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin ñối với lợn con sau cai sữa 59 4.6 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin ñối với lợn nái chửa 60 4.7 Kết quả xác ñịnh hiệu giá giải ñộc tố trong vacxin 61 4.8 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng ñộc tố E. coli trong huyết thanh chuột miễn dịch bằng phản ứng kết tủa nhanh trên phiến kính 62 4.9 Kết quả xác ñịnh liều tối thiểu gây chết 100% chuột bạch của dịch lọc canh trùng E. coli 64 4.10 Kết quả xác ñịnh liều tối thiểu gây chết 100% chuột bạch của hỗn hợp canh trùng E. coli cường ñộc 66 4.11 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với chuột bạch 67 4.12 Kết quả xác ñịnh liều tối thiểu gây bệnh cho 100% lợn con sau cai sữa bằng dịch lọc canh trùng E. coli 69 4.13 Kết quả xác ñịnh liều tối thiểu gây bệnh cho 100% lợn con sau cai sữa của hỗn hợp canh trùng E. coli cường ñộc 70 4.14 Kết quả kiểm tra tính sinh miễn dịch và hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn con sau cai sữa 73 4.15 Tổng hợp kết quả xác ñịnh hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli 74 4.16 Kết quả kiểm tra tình trạng vật lý và hiệu giá giải ñộc tố của vacxin trong quá trình bảo quản 76 4.17 Kết quả kiểm tra ñịnh kỳ hiệu lực của vacxin bảo quản ở nhiệt ñộ phòng ñối với chuột bạch 77 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... vii 4.18 Kết quả kiểm tra ñịnh kỳ hiệu lực của vacxin bảo quản ở nhiệt ñộ từ 2 - 8°C ñối với chuột bạch 78 4.19 Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin giải ñộc tố E. coli tiêm cho lợn ngoài thực ñịa 80 4.20 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn con sau cai sữa ngoài thực ñịa 81 4.21 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn nái mang thai ngoài thực ñịa 82 4.22 Tổng hợp so sánh kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli tiêm cho lợn con sau cai sữa và lợn nái mang thai ở các ñịa phương 83 4.23 Kết quả khảo sát ñộ dài miễn dịch của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn sau cai sữa 84 4.24 Kết quả khảo sát ñộ dài miễn dịch của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn nái mang thai 85 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... viii DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 4.1 HGKðTTB của lợn con sau cai sữa trước và sau khi tiêm vacxin giải ñộc tố E. coli với các liều khác nhau 53 4.2 HGKðTTB của lợn nái chửa trước và sau khi tiêm vacxin giải ñộc tố E. coli 55 4.3 Phản ứng ADP giữa giải ñộc tố E. coli với kháng ñộc tố trong huyết thanh chuột ñã ñược miễn dịch 61 4.4 Hiệu giá kháng ñộc tố E. coli trung bình trong huyết thanh của chuột TN/ðC với hiệu giá giải ñộc tố vacxin 62 4.5 Phản ứng kết tủa sau 36 - 48 giờ phản ứng trong ống nghiệm giữa giải ñộc tố E. coli với kháng ñộc tố trong huyết thanh của chuột ñã ñược miễn dịch 63 4.6 Chuột bạch chết khi tiêm canh trùng E. coli ñộc ñể xác ñịnh liều tối thiểu gây chết 100% 66 4.7 Lợn phát bệnh khi tiêm canh trùng E. coli cường ñộc ñể xác ñịnh liều tối thiểu gây bệnh 100% lợn 71 4.8 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với chuột bạch và lợn 75 4.9 Hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn con sau sai sữa và lợn nái mang thai nuôi ở các ñịa phương 83 4.10 Kết quả xác ñịnh ñộ dài miễn dịch của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn sau cai sữa và nái mang thai 85 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 1 1. MỞ ðẦU Trong quá trình chăn nuôi lợn ở Việt Nam, có rất nhiều bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế, trong ñó có hội chứng tiêu chảy. Nguyên nhân gây tiêu chảy có rất nhiều: Virus gây viêm dạ dày ruột (TGE), Rotavirus, Coccidia... Vi khuẩn E. coli là nguyên nhân quan trọng nhất trong gây bệnh tiêu chảy ở lợn mới sinh và sau cai sữa [46]. Tập ñoàn vi khuẩn E. coli, hiện có trên 2000 chủng và trong ñó có khoảng 10% gây bệnh. Ở lợn, từ sơ sinh cho ñến trưởng thành luôn bị E. coli tấn công [31]: Lứa tuổi lợn sơ sinh gây bệnh: Lợn con phân trắng Lứa tuổi lợn con theo mẹ gây bệnh: Tiêu chảy (rối loạn tiêu hoá) Lứa tuổi lợn trước và sau cai sữa gây bệnh: Sưng phù ñầu lợn con Yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli rất ña dạng có thể bằng cơ học gây tổn thương tổ chức, bội nhiễm gây rối loạn chức năng, có thể gây bệnh do nội, ngoại ñộc tố tiết ra. Do vậy, bệnh do E. coli gây thiệt hại khá lớn cho chăn nuôi lợn ở cả các nước tiên tiến cũng như ở Việt Nam. ðể chống lại bệnh do E. coli, các nhà thú y hiện nay ñã sử dụng nhiều phương thuốc, từ cổ truyền ñông y ñến các kháng sinh hiện ñại, kể cả các liệu pháp hoá sinh, dinh dưỡng kỹ thuật cao… nhưng cũng chỉ khống chế ñược một phần. Ở Việt Nam cũng ñã áp dụng nhiều biện pháp có kết quả, trong ñó tác dụng tốt nhất là kháng sinh. Mấy thập kỷ qua, thuốc kháng sinh ñã giúp các nhà chăn nuôi giảm bớt một phần ñáng kể tổn thất do dịch bệnh. Tuy nhiên, mặt trái của kháng sinh ngày càng lộ rõ: Các nhà khoa học trong nước khẳng ñịnh E. coli ñã kháng thuốc với tỷ lệ cao [16], [36]. ðể khắc phục tình trạng này, trên thế giới và ở Việt Nam ñã có các chế phẩm sinh học ra ñời, trong ñó có chứa các vi khuẩn có lợi và ñối kháng với vi khuẩn E. coli như Subtilis, Lactobacillus acidophillus ñể giúp con vật chống lại bệnh [7], [13], [43]. Và gần ñây lại nghiên cứu thành công thêm sản phẩm kháng thể E. coli, là một thuốc sinh học ñặc hiệu chống lại vi khuẩn E. coli mà không gây hậu quả xấu như dùng kháng sinh. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 2 Các kết quả nghiên cứu về bệnh E. coli ở Việt Nam ñã cho thấy ñộc lực, tính gây bệnh ở các lứa tuổi, phân bố và cả tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli ñang lưu hành. Từ ñó ñòi hỏi cấp bách phải có thuốc phòng bệnh chủ ñộng và Viện thú y ñã nghiên cứu vacxin E. coli, tuy nhiên chưa nghiên cứu về phòng chống ñộc tố của nó. Trong khi ñộc tố là phần khá quan trọng trong bệnh sinh của bệnh do E. coli và cũng là yếu tố chính gây bệnh, làm bệnh trở nên trầm trọng hơn. Vấn ñề này mở ra một hướng nghiên cứu mới về ñộc tố làm thuốc phòng bệnh E. coli cho lợn. Từ kết quả thu ñược của ñề tài nghiên cứu ứng dụng cấp nhà nước năm 2007 về nghiên cứu ñộc tố E. coli của công ty thuốc thú y HANVET, chúng tôi tiến hành ñề tài: ‘‘Nghiên cứu một số chỉ tiêu trong quy trình sản xuất, kiểm nghiệm vacxin giải ñộc tố E. coli phòng bệnh tiêu chảy và sưng phù ñầu ở lợn” Mục ñích nghiên cứu : Xây dựng quy trình kiểm nghiệm, ñánh giá chất lượng vacxin giải ñộc tố E. coli. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 3 2. TỔNG QUAN 2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) gây bệnh tiêu chảy và phù ñầu ở lợn con ñã ñược biết ñến từ rất lâu và ngày càng phổ biến ở các trại chăn nuôi tập trung và trong nông hộ. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, bệnh tiêu chảy và phù ñầu ở lợn con ñã ñược khống chế phần nào, nhưng việc loại trừ nó trong chăn nuôi thì hầu hết các nhà nghiên cứu ñều cho rằng còn rất nhiều khó khăn không những ở nước ta mà ở cả các nước có trình ñộ khoa học tiên tiến trên thế giới [3], [8], [17]. Chính vì vậy mà nhiều nhà khoa học vẫn quan tâm nghiên cứu. Theo Lê Văn Tạo [31] bệnh do E. coli gây ra ở lợn con gồm 3 loại bệnh: (1) Bệnh phân trắng lợn con phân lập ñược serotype O9, O111, O149, kháng nguyên bám dính F4; (2) Bệnh tiêu chảy do E. coli serotype O8, O141, O147, O149, O157, trong ñó O149 (F4) chiếm tỷ lệ cao; (3) E. coli gây bệnh phù ñầu: Serotype kháng nguyên O138, O139K12H1, O141K85q, O141K85ac, yếu tố bám dính F18 và ñộc tố thần kinh ST2e. Cù Hữu Phú và cộng sự [23] ñã phân lập ñược 60 chủng vi khuẩn E. coli ở lợn từ 35 ngày ñến 4 tháng tuổi mắc bệnh tiêu chảy, trong ñó có 42 chủng gây dung huyết. Lý Thị Liên Khai [17] khi phân lập E. coli từ phân lợn con bị tiêu chảy và phân lợn con khỏe mạnh ñã cho biết: Các chủng E. coli mang K88, K99 và 987P là nguyên nhân chính gây tiêu chảy cho lợn con từ 1 - 2 tuần tuổi. Vi khuẩn E. coli thường xuyên cư trú trong ruột lợn và chúng chỉ gây bệnh khi gặp ñiều kiện thuận lợi như: Tác ñộng stress làm giảm sức ñề kháng của lợn, làm tăng số lượng vi khuẩn và sinh ñộc tố. Trương Quang [25], 100% mẫu tiêu chảy phân lập ñược E. coli có ñộc lực mạnh và yếu tố gây bệnh cao: Yếu tố bám dính 93,33%; dung huyết 53,33%; ñộc tố chịu nhiệt (ST) 90%; ñộc tố không chịu nhiệt LT 90%; có cả hai loại ST và LT 73,33%; ñộc lực mạnh giết chết chuột 100%. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 4 Nguyễn Khả Ngự và cộng sự [19], [20], xác ñịnh khả năng dung huyết và kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con trước và sau cai sữa bị phù ñầu ở ñồng bằng sông Cửu Long. Với 21 chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn chết, tác giả cho biết 100% số chủng kết tủa với kháng huyết thanh K88, 40% gây dung huyết mạnh, các chủng này ñều có khả năng kháng nhiều loại thuốc kháng sinh thông thường. Cũng nghiên cứu về khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy lợn, Bùi Thị Tho và cộng sự [36] sau khi kiểm tra khả năng kháng thuốc kháng sinh của 183 chủng E. coli phân lập từ phân của lợn con bị phân trắng, ñã nhận ñịnh: Tính kháng thuốc của E. coli ở mỗi cơ sở có sự khác biệt rõ rệt tùy theo quá trình sử dụng và có sự khác biệt về chủng E. coli gây bệnh ở các lứa tuổi lợn khác nhau. Các chủng E. coli tạo khuẩn lạc dạng nhám có tính kháng thuốc cao hơn các chủng tạo khuẩn lạc trơn. Qua 20 năm kiểm tra tính kháng thuốc kháng sinh của E. coli phân lập từ lợn con bị bệnh phân trắng, các tác giả nhận thấy tính kháng thuốc của chúng ñối với một số thuốc kháng sinh thường dùng tăng lên rất nhanh. Tỷ lệ các chủng kháng nhiều loại thuốc kháng sinh cũng phát triển nhanh, một số chủng ñã kháng với hầu hết các loại thuốc thường dùng [36]. Phạm Thế Sơn và cộng sự [26], các chủng E. coli gây bệnh lợn con tiêu chảy chủ yếu mang kháng nguyên bám dính F4 (K88), ñộc tố ñường ruột STa, STb và LT, cả 3 loại STa+STb+LT. Theo Trương Quang và cộng sự [25], kháng nguyên bám dính K88 (F4) là một trong những yếu tố gây bệnh ñầu tiên, quan trọng của các chủng E. coli ñộc ở lợn 1 - 60 ngày tuổi. ðộc tố ñường ruột ST, LT và ST +LT. ðỗ Ngọc Thúy và cộng sự [37] cho biết tỷ lệ kháng kháng sinh của 106 chủng E. coli ñược phân lập từ lợn con theo mẹ bị tiêu chảy có xu hướng kháng mạnh với các loại thuốc kháng sinh thường dùng ñể ñiều trị bệnh như Amoxicillin, Cloramphenicol, Streptomycin. Nguyễn Viết Không và cộng sự [18], bằng phản ứng ELISA phát hiện kháng thể trong huyết thanh của lợn sử dụng kháng nguyên F18-pili xác ñịnh tỷ lệ mang kháng thể ñặc hiệu kháng E. coli gây bệnh phù ñầu: Tỉ lệ 100% dương tính ở lợn nái, 60% ở lợn con sơ sinh tuần ñầu, 12,5% ở nhóm lợn theo mẹ 15 - 21 ngày tuổi, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 5 thấp nhất ở lợn trước cai sữa 22 - 28 ngày tuổi; sau ñó tăng dần theo lứa tuổi 30% ở lợn con cai sữa, 57,5% ở lợn hậu bị. ðỗ Trung Cứ và cộng sự [7], sử dụng chế phẩm Biosubtyl ñể phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con ñã làm giảm ñược 42% số lợn tiêu chảy ở giai ñoạn từ 1 - 60 ngày tuổi. ðặng Xuân Bình, Trần Thị Hạnh, Lê Văn Tạo [4], chọn chủng chế chế phẩm sinh học: 1 chủng F5 có sinh ñộc tố ST, LT; 2 chủng F6 có sinh ST và LT. Tất cả ñều kháng kháng sinh và có ñộc lực cao. ðặng Xuân Bình, ðỗ Văn Trung [5] chọn chủng E. coli F5, F6, F4 chế vacxin ñều có ñộc tố ñường ruột LT. Vacxin ñã làm giảm ñược tỷ lệ lợn con mắc bệnh phân trắng 9,5 - 11,2% so với lợn ñối chứng không dùng vacxin. 2.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài Cox và cộng sự [49] cho rằng, E. coli cộng sinh có mặt thường trực trong ñường ruột của người và ñộng vật, trong quá trình sống vi khuẩn có khả năng tiếp nhận các yếu tố gây bệnh như yếu tố bám dính (K88, K99), yếu tố dung huyết (Hly), yếu tố cạnh tranh (Colv), yếu tố kháng thuốc kháng sinh và ñộc tố ñường ruột. Các yếu tố gây bệnh này không ñược di truyền qua ADN của nhiễm sắc thể mà ñược di truyền qua ADN nằm trên plasmid. Những yếu tố gây bệnh này giúp cho E. coli bám dính vào tế bào nhung mao ruột non, xâm nhập vào thành ruột, phát triển với số lượng lớn. Sau ñó vi khuẩn thực hiện quá trình gây bệnh bằng cách sản sinh ñộc tố, gây triệu chứng tiêu chảy, phá hủy tế bào niêm mạc ruột và tế bào nhung mao ruột non. E. coli gây bệnh tiêu chảy và phù ñầu ở lợn con có mặt ở hầu hết các nước trên thế giới nên ñã có nhiều tác giả nghiên cứu về chúng. Simon và cộng sự [65] ñã làm rõ vai trò của ba loại kháng nguyên bám dính K88 trong E. coli là K88ab, K88ac và K88ad và cho biết: Các chủng E. coli sản sinh ñộc tố ñường ruột (ETEC) mang những kháng nguyên bám dính này ñều gây tiêu chảy nặng dẫn ñến tử vong ở một số lợn con. Sự cảm nhiễm bệnh tiêu chảy và phù ñầu ở lợn con có liên quan mật thiết ñến khả năng bám dính của E. coli. Smith thông báo có hai loại ñộc tố là thành phần chính của Enterotoxin ñược tìm thấy ở các chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy. Sự khác biệt của hai loại ñộc tố này nằm ở khả năng chịu nhiệt. ðộc tố chịu nhiệt (Heat stable toxin - ST) chịu ñược nhiệt ñộ 1000C trong 15 phút, ñộc tố không chịu nhiệt (Heat labile toxin - LT) bị bất hoạt ở Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 6 600C trong vòng 15 phút [66]. Fairbrother và cộng sự [50] khi nghiên cứu các yếu tố gây bệnh ở từng chủng E. coli phân lập ñược từ các thể bệnh khác nhau, ñã ñặt tên vi khuẩn theo những yếu tố gây bệnh mà chúng có khả năng sinh ra như: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC), Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) và Adherencia Enteropathogenic Escherichia coli (AEEC). Cùng với việc phân lập và nghiên cứu các yếu tố gây bệnh của E. coli, việc nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm phòng bệnh tiêu chảy ở lợn cũng ñã ñược các nhà khoa học trên thế giới ñặc biệt quan tâm. Akita và cộng sự (1993) ñã nghiên cứu sản xuất kháng ñộc tố ñặc hiệu qua lòng ñỏ trứng gà dùng trong phòng và chữa bệnh tiêu chảy cho lợn con [44]. 2.3 Vi khuẩn Escherichia coli Trực khuẩn ruột già Escherichia coli (E. coli) thuộc họ Enterobacteriaceae. Trong các vi khuẩn ñường ruột, E. coli là loài phổ biến nhất. E. coli còn có tên là Bacterium coli commune, Bacillus coli communis do Escherich phân lập năm 1885 từ phân trẻ em. E. coli thường xuất hiện rất sớm ở ñường ruột người và ñộng vật, ngay sau khi ñẻ hai giờ và tồn tại cho ñến khi vật chủ chết. Chúng thường ñịnh cư ở phần sau của ruột, ít khi gặp ở dạ dày hay ruột non. Trong nhiều trường hợp còn tìm thấy chúng ở niêm mạc của nhiều bộ phận khác trong cơ thể. Từ ñường tiêu hóa, E. coli ñược thải theo phân ra môi trường ngoài. Việc xác ñịnh chỉ số E. coli ở môi trường giúp ñánh giá môi trường ñó tốt hay xấu về mặt vệ sinh [9], [32]. Ở ñiều kiện bình thường, các chủng E. coli không gây bệnh, khi các ñiều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng, vệ sinh thú y kém, ñiều kiện ngoại cảnh bất lợi dẫn ñến sức chống ñỡ của con vật suy giảm thì E. coli trở nên ñộc và có khả năng gây bệnh [32]. 2.3.1 ðặc tính sinh vật hóa học của E. coli 2.3.1.1 ðặc tính hình thái E. coli là trực khuẩn ngắn, hai ñầu tròn, kích thước 2 - 3×0,6 µm. Trên tiêu bản nhuộm Gram, vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu ñều hoặc sẫm ở hai ñầu, ñứng tụ lại thành từng ñám, ñôi khi xếp 2 - 3 vi khuẩn thành một chuỗi dài. Trong môi Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 7 trường nuôi cấy lâu ngày có khi thấy những trực khuẩn dài 4 - 8 µm. E. coli di ñộng nhờ có lông ở xung quanh thân, nhưng khi nuôi cấy trong ñiều kiện bất lợi sẽ mất lông, không di ñộng. Vi khuẩn không sinh nha bào, nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhày ñể nhuộm có thể thấy màng giáp mô, còn khi soi tươi sẽ không thấy ñược. Dưới kính hiển vi ñiện tử, còn phát hiện ñược các pili, yếu tố bám dính của E. coli [33]. 2.3.1.2 ðặc tính nuôi cấy E. coli là trực khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy tiện, có thể sinh trưởng ở nhiệt ñộ từ 5 - 400C, nhiệt ñộ thích hợp là 370C, pH thích hợp là 7,2 - 7,4 nhưng có thể phát triển ñược ở pH từ 5,5 - 8,0 [38]. E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển ñược ở môi trường tổng hợp ñơn giản [23]. Trong môi trường nước thịt: Sau khi nuôi cấy ở 370C/24 giờ, E. coli phát triển rất nhanh, môi trường rất ñục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống ñáy, ñôi khi hình thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trường, môi trường có mùi phân thối. Trên môi trường thạch thường: Sau khi nuôi cấy ở 370C/24 giờ, E. coli hình thành khuẩn lạc tròn ướt, bóng láng, màu tro nhạt, hơi lồi, ñường kính 2 - 3 mm. Có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng nhày (mucous) và dạng nhám (rough). Trên môi trường thạch máu: Sau khi nuôi cấy ở 370C/24 giờ, hình thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sáng, kích thước từ 1 - 2 mm. Có khi gây dung huyết. Trên môi trường thạch Mac Conkey: Sau khi nuôi cấy ở 370C/24 giờ, E. coli hình thành khuẩn lạc màu ñỏ cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhày, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường. Môi trường Endo: Sau khi nuôi cấy ở 370C/24 giờ, E. coli hình thành khuẩn lạc màu ánh kim. Môi trường thạch Brilliant Green: Sau khi nuôi cấy ở 370C/24 giờ, E. coli hình thành khuẩn lạc màu vàng chanh Môi trường E.M.B (Eosin Methyl Blue): Sau khi nuôi cấy ở 370C/24 giờ, E. coli hình thành khuẩn lạc màu tím ñen. Môi trường thạch Istrati: Sau khi nuôi cấy ở 370C/24 giờ, E. coli hình thành Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 8 khuẩn lạc màu vàng. E. coli không mọc trên các môi trường lục Malachite và Muller Kauffmann, bị ức chế khi nuôi trong các môi trường Wilson Blair. 2.3.1.3 ðặc tính sinh hóa - Lên men sinh hơi các loại ñường: E. coli có khả năng lên men sinh hơi các loại ñường glucose, fructose, galactose, lactose, maniton, mannit, levulose, xylose; không lên men andonit và innozit; lên men không ổn ñịnh các loại ñường dulciton, saccarose, salixin [32]. E. coli lên men sinh hơi nhanh ñường lactose, còn Salmonella spp thì không có ñặc tính này, ñây là ñặc ñiểm quan trọng ñể phân biệt E. coli với Salmonella spp. - Các phản ứng khác: Sữa ðông sau 24 giờ ñến 72 giờ ở 370C Genlatin Không tan chảy Indol + Catalase + Oxidase - Urease - Di ñộng + MR + VP - H2S - 2.3.1.4 Sức ñề kháng E. coli có sức ñề kháng yếu, bị diệt ở nhiệt ñộ 550C trong 1 giờ hoặc 600C trong 30 phút, ñun sôi 1000C thì chết ngay. Những chủng E. coli trong phân có xu hướng ñề kháng với nhiệt cao hơn những chủng phân lập ở môi trường bên ngoài. Ở môi trường bên ngoài các chủng E. coli gây bệnh có thể tồn tại ñến 4 tháng. Các chất sát trùng như axit phenic 3%, clorua thủy ngân (HgCl2) 0,1%, formol 0,2% có thể diệt E. coli sau 5 phút. E. coli ñề kháng với ñiều kiện khô và hun khói [32]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 9 2.3.2 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli E. coli ñược chia thành các nhóm huyết thanh (serogroup) và kiểu huyết thanh (serotype) khác nhau dựa theo cấu trúc kháng nguyên O, K, H và F. Theo phản ứng kết tủa có 250 kiểu kháng nguyên O, 89 kháng nguyên K, 56 kháng nguyên H và một số kháng nguyên F [32], [33]. 2.3.2.1 Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân - Ohne Hauch) Kháng nguyên O của E. coli có bản chất lipopolysaccharide, rất ñộc. Chỉ cần 1/20 mg kháng nguyên O ñủ giết chết chuột bạch sau 24 giờ. Kháng nguyên O ñược coi như một yếu tố ñộc lực có thể tìm thấy ở thành tế bào vi khuẩn. Cấu trúc phân tử polysaccharide của kháng nguyên O gồm hai phần: Phần polysaccharide nằm ngoài chứa nhóm hydro có chức năng tạo ra tính ñặc trưng về serogroup; phần polysaccharide ở bên trong không chứa nhóm hydro có chức năng phân biệt giữa các dạng khuẩn lạc: dạng S (Smooth), dạng R (Rough), dạng M (Mucous). Khi làm mất dần từng ñơn vị ñường của các chuỗi polisaccharide hoặc làm thay ñổi vị trí ở các ñơn vị này sẽ dẫn ñến thay ñổi ñộc lực của các vi khuẩn. Kháng nguyên O chịu ñược nhiệt, không bị phá hủy khi ñun nóng ở 1000C trong 2 giờ. Dưới tác ñộng của cồn, axít HCl nồng ñộ 1N vi khuẩn chịu ñược trong 20 giờ, nhưng lại bị phá hủy bởi formol 0,5%. Kháng nguyên O ñược cấu trúc bởi các phân tử lớn, thành phần các phân tử gồm: + Polyosit: tạo ra tính ñặc hiệu của kháng nguyên. + Protein: làm cho phức hợp có tính kháng nguyên. + Lipit: kết hợp với polyosit và là cơ sở của ñộc tính. Tất cả kháng nguyên O ñều cư trú ở bề mặt, do ñó nó liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch. Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng kết tủa. Phản ứng kết tủa kháng nguyên O tạo thành những hạt nhỏ, khi lắc rất khó tan. 2.3.2.2 Kháng nguyên H (kháng nguyên lông - Hauch) Kháng nguyên H là thành phần lông của vi khuẩn, có bản chất protein, rất kém bền vững so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H không chịu nhiệt, bị phá hủy ở 600C trong 1 giờ. Bị cồn 50% và các enzym phân giải protein phá hủy. Kháng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 10 nguyên H tồn tại ñược khi xử lý bằng formol 0,5%. Kháng nguyên H khi gặp kháng thể H tương ứng sẽ tạo ra hiện tượng kết tủa H, trong ñó các vi khuẩn ñược kết tủa lại với nhau nhờ các lông vì các kháng thể H khi cố ñịnh trên lông sẽ là cầu nối với các lông bên cạnh. Phản ứng xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O và các hạt kết tủa cũng lớn hơn, giống như những cụm bông rất dễ tan khi lắc vì lông của vi khuẩn rất nhỏ và dễ ñứt. Vi khuẩn di ñộng khi tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thành không di ñộng. Kháng nguyên H của E. coli không có tính ñộc và cũng không có ý nghĩa trong ñáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít ñược quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa rất lớn trong việc xác ñịnh tên vi khuẩn [22]. Các nhà khoa học ñã dùng những chủng E. coli có lông và không có lông của cùng một serogroup O ñể gây cảm nhiễm cho chuột bằng ñường miệng với lượng vi khuẩn bằng nhau. Kết quả cho thấy khả năng gây bệnh cho chuột thí nghiệm hoàn toàn giống nhau. Kháng nguyên H bảo vệ cho vi khuẩn khỏi bị tiêu diệt trong tế bào ñại thực bào, từ ñó giúp vi khuẩn sống lâu và tồn tại lâu hơn trong ñại thực bào. 2.3.2.3 Kháng nguyên K (Kháng nguyên vỏ - Capsular) Kháng nguyên K còn ñược gọi là kháng nguyên vỏ (Capsular), chúng bao quanh tế bào vi khuẩn và có bản chất hóa học là polysaccharide. Kháng nguyên này ngăn cản sự ngưng kết của vi khuẩn trong huyết thanh "O" tương ứng. Khi ñun nóng 100 - 1210C kháng nguyên sẽ mất tác dụng ngăn cản. Vai trò của kháng nguyên K chưa ñược thống nhất lắm. Có nhiều ý kiến cho rằng, nó không có ý nghĩa về ñộc lực của vi khuẩn, vì thấy ñộc lực của chủng E. coli có kháng nguyên K cũng giống ñộc lực của chủng không có kháng nguyên K [42]. Có ý kiến khác cho rằng, nó có ý nghĩa về ñộc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước những yếu tố phòng vệ của vật chủ [27]. Tuy vậy, phần lớn các ý kiến ñều thống nhất kháng nguyên K có hai nhiệm vụ sau: + Hỗ trợ trong phản ứng ngưng kết của kháng nguyên O nên thường ghi liền công thức serotype của vi khuẩn là Ox:Ky như E. coli O139:K88, O149:K88... + Tạo ra hàng rào bảo vệ cho cho vi khuẩn chống lại tác ñộng của ngoại cảnh và hiện tượng thực bào, yếu tố phòng vệ của vật chủ. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 11 2.3.2.4 Kháng nguyên F ( Kháng nguyên bám dính - Fimbriae) Hầu hết các chủng E. coli gây bệnh ñều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính. Các chủng không gây bệnh không có kháng nguyên bám dính. Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể ñặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu mô ruột và trên lớp màng nhày, giúp vi khuẩn chống lại khả năng ñào thải của nhu ñộng ruột. Kháng nguyên bám dính của E. coli nằm trên cấu trúc pili (fimbriae), một cấu trúc ngắn thẳng, xuất phát từ một ñĩa gốc trong màng nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn. Fimbriae có bản chất là protein mọc trên bề mặt tế bào vi khuẩn với số lượng từ 10 - 40 fimbriae trên một tế bào vi khuẩn. Quan sát dưới kính hiển vi ñiện tử, chúng giống như một chiếc áo lông bao bọc xung quanh vi khuẩn. Fimbriae của vi khuẩn E. coli khác lông ở chỗ cứng hơn, không lượn sóng và không liên quan ñến chuyển ñộng. Kháng nguyên bám dính ñược phân loại bởi phản ứng huyết thanh, thụ thể ñặc hiệu hoặc bằng khả năng kết tủa với hồng cầu của các loài ñộng vật khác nhau và bằng phản ứng PCR [11], [27], [46]. Kháng nguyên có chức năng bám dính ñặc trưng của ETEC (Enterotoxigenic E. coli) gây bệnh cho lợn chủ yếu là F4 (K88), F6 (987P), F17 và ñôi khi có cả F5 (K99). Kháng nguyên có chức năng bám dính của ETEC gây tiêu chảy nguyên phát ở trâu bò là F5 (K99) ñôi khi thấy cả F4 (K88) với tỷ lệ ít hơn. E. coli gây bệnh cho trẻ em thường có kháng nguyên bám dính F41 [11], [30]. 2.3.3 Các yếu tố gây bệnh của E. coli 2.3.3.1 Yếu tố bám dính của E. coli ðể gây bệnh, các chủng ETEC phải bám dính ñược lên tế bào biểu mô của ruột non. Quá trình bám dính ñược thực hiện qua ba giai ñoạn: Hấp thụ, gắn kết và bám dính. Hai quá trình trước ñược thực hiện nhờ các tác ñộng vật lý, hóa học, bước bám dính ñược thực hiện bởi các sợi bám dính chuyên biệt (pili) trên bề mặt vi khuẩn ñảm nhiệm, ñó là quá trình liên kết giữa kháng nguyên tại yếu tố bám dính với các receptor tương ứng trên bề mặt của các tế bào biểu mô.._. Hầu hết các chủng ETEC ñều có các yếu tố bám dính, bao gồm: K88 (F4), K99 (F5), 987P (F6), F17, F18, F41, F42 và F165. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 12 * F4 (K88) F4 hay còn gọi là K88 ñầu tiên ñược mô tả bởi Orskov và cộng sự (1961), là một kháng nguyên không chịu nhiệt, không ñược sản sinh ở nhiệt ñộ 180C. Theo nghiên cứu trước kia của Kauffman (1947) thì kháng nguyên bề mặt này ñược cho là kháng nguyên vỏ (K) có bản chất là polysacharide vì thế chúng ñược cho là K88. Các nghiên cứu sau này ñã chỉ ra rằng K88 không phải là polysacharide mà có bản chất là protein, nó không phải là kháng nguyên vỏ như ñã ñược xác nhận trước ñây mà là fimbriae hay pili. Tuy nhiên, thuật ngữ này vẫn ñược dùng cho ñến năm 1983 khi Orskov ñề nghị sử dụng kháng nguyên F (fimbriae) thay cho kháng nguyên K (capsular). Bằng việc sử dụng các kháng huyết thanh ñặc hiệu, Orskov và cộng sự (1964) ñã phân biệt ñược hai loại khác nhau của F4 là F4ab và F4ac. Vào năm 1979, loại thứ 3 ñược phát hiện bởi Guinee và Jansen ñược ñặt tên là F4ad [39]. Rõ ràng là sợi F4 có chứa một vùng cố ñịnh hình thành loại "a" và các vùng khác nhau, hình thành loại "b", "c", "d". Về mặt hình thái, F4 có các cấu trúc khác nhau, từ mảnh, linh hoạt và kéo dài cho tới dạng cứng. Sự khác nhau này phần lớn phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy [30], [57]. Thành phần chính của F4 ñã ñược mô tả ñầu tiên bởi Mooi và cộng sự [61]. Phân tích F4 tinh khiết trong hỗn dịch gel dodecyl sulfate polyacrylamide cho thấy một dải protein ñơn lẻ với khối lượng phân tử từ 23.500 ñến 26.000 Da, tuỳ thuộc vào các loại F4 phân lập ñược [14]. F4 có hàng trăm các ñơn vị protein nhỏ giống nhau, các ñơn vị này tạo thành sợi fimbriae. Sợi F4 giúp cho vi khuẩn bám ñược vào thụ thể tương ứng của nó trên tế bào biểu mô của lông nhung ruột non, từ ñó vi khuẩn có thể xâm nhập, cố ñịnh và phát triển ñược ở thành ruột non. * F5 (K99) F5 trước kia ñược cho là kháng nguyên bám dính của E. coli chỉ gây bệnh ở bê, nghé và cừu. Tuy nhiên, hiện nay chúng cũng ñược tìm thấy với tỷ lệ thấp ở các chủng ETEC phân lập từ lợn tiêu chảy [1]. Sự sản sinh F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố của vi khuẩn như tốc ñộ sinh trưởng, pha sinh trưởng, nhiệt ñộ và alanine trong môi trường [25]. Các gen mã hóa cho sự tổng hợp K99 nằm trong ADN của plasmid. Plasmid này có khối lượng phân tử là 87,8 KDa [57], [60]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 13 * F6 (987P) F6 nằm trong số các fimbriae phát hiện thường xuyên nhất, nó ñược sản xuất bởi ETEC ở lợn. Fimbriae này ñóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh của ETEC nhờ việc gắn kết vi khuẩn với các tế bào biểu mô ruột và cải thiện sự bám dính ở màng nhầy ñể ñưa lượng ñộc tố ñường ruột tối ña ñến vật chủ [11]. Cấu trúc F6 bao gồm sự sắp xếp xoắn ốc của 3 protein: ðơn vị chính FaeA, ñơn vị phụ FaeF và FaeG nằm ở ñỉnh và các vị trí khác nhau dọc theo sợi fimbriae. Các protein này có vai trò gắn kết F6 với thụ thể glycoprotein [10], [48], [58]. F6 của ETEC ở lợn có thể giúp vi khuẩn bám vào cả các thụ thể ñược cấu tạo bởi glycoprotein và glycolipid trên riềm bàn chải của các tế bào biểu mô ruột lợn [20]. * F41 Những nghiên cứu ñầu tiên về K99 cho rằng, ñây là kháng nguyên gồm 1 ñơn vị, nhưng gần ñây khi ñiện phân thấy rằng nó có 2 ñơn vị nhỏ, 1 ñi về cực dương và 1 ñi về cực âm. ðơn vị ñi về cực dương ñược cho là 1 fimbriae riêng biệt có tên là F41. Khối lượng phân tử của F41 là 30,5 KDa [49]. Các ñặc ñiểm của F41 ñược thể hiện khác nhau phụ thuộc vào thành phần của môi trường nuôi cấy. F41 nguyên thể có cấu trúc sợi với ñường kính là 3,2 nm [60]. Cox và cộng sự ñã nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về khả năng mẫn cảm và sức ñề kháng của lợn ñối với E. coli có mang F41. Kết quả cho thấy các chủng có F41 bám vào lông nhung (với số lượng thấp) của 23 trong số 30 lợn ñược kiểm tra ở ñộ tuổi 4 - 5 tuần. Ngoài ra, những lợn lớn tuổi hơn có sức ñề kháng cao hơn với sự bám dính của các chủng E. coli có F41 do các thụ thể tương ứng với F41 bị giảm ñi [49]. * F17 F17 chủ yếu ñược phát hiện ở chủng E. coli gây tiêu chảy hay nhiễm trùng máu trên bò. Một vài nghiên cứu cũng cho thấy sự xuất hiện của F17 ở các chủng E. coli phân lập từ bò tiêu chảy ở Pháp và Bỉ (chiếm tới 46%). Các chủng E. coli có F17 ñược phân lập từ các chất trong ruột bò cũng ñược gọi là chủng ETEC, khi F41, F5 hoặc cả hai cùng xuất hiện ở trên bề mặt tế bào vi khuẩn. F17 cũng ñược tìm thấy ở các chủng E. coli gây tiêu chảy ở lợn [63]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 14 * F18 F18 không làm kết tủa hồng cầu, sản sinh rất ít khi vi khuẩn ñược nuôi cấy trong các môi trường thông thường [51]. F18 ñược chia làm hai loại là F18ab và F18ac [54]. Các nghiên cứu cho thấy rằng F18ab và F18ac khác nhau về mặt sinh học. F18ab ít thấy thể hiện ở trong ñiều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm. Chúng thường thấy cùng với việc sản xuất SLT-2e ở các chủng VTEC, trong khi F18ac thể hiện rất rõ ở cả trong thực tế và trong phòng thí nghiệm, chúng mang các ñặc tính của các chủng ETEC. Một ñặc ñiểm ñáng chú ý ở F18ac là chúng không bám vào riềm bàn chải trên niêm mạc ruột của lợn sơ sinh trong ñiều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm [54], cũng không tập trung ở lớp màng nhầy ruột của lợn con mới sinh. ðiều này ngược với F5 và F6, chúng bám vào các tế bào biểu mô ruột. Khả năng bám này ở lợn con nhiều hơn so với lợn lớn. Lý do xác ñáng ñể giải thích về việc tăng sự mẫn cảm với bám dính của F18ab và F18ac theo tuổi của lợn vẫn chưa ñược làm rõ, nhưng có thể là do sự tăng dần các thụ thể ñặc hiệu ở lông nhung ruột của lợn từ sơ sinh ñến 21 ngày tuổi. Sự thiếu hụt các thụ thể của F18ab và F18ac ở lợn sơ sinh có thể giải thích cho lý do vì sao chỉ thấy các chủng VTEC và ETEC ở lợn cai sữa [64], [67]. 2.3.3.2 Yếu tố xâm nhập của E. coli Yếu tố xâm nhập của E. coli là một khái niệm ñựơc dùng ñể chỉ quá trình chưa ñược hiểu rõ, nhờ quá trình này mà E. coli qua ñược hàng rào bảo vệ của lớp nhầy trên bề mặt niêm mạc ñể xâm nhập vào tế bào biểu mô, ñồng thời sinh sản và phát triển trong lớp tế bào này. Trong khi ñó những vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua ñược hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy hoặc khi qua ñược hàng rào này sẽ bị vây bắt bởi ñại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc [3], [9]. 2.3.3.3 Vai trò gây bệnh của các loại kháng nguyên Theo ý kiến của nhiều tác giả, mặc dù E. coli có nhiều loại kháng nguyên, trong ñó có loại tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ, có loại không tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ nhưng ñều tham gia vào quá trình gây bệnh bằng cách tạo ñiều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ và tham gia vào quá trình kháng lại các yếu tố phòng vệ tự nhiên của vật chủ. Các kháng nguyên tham gia quá Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 15 trình trên phải kể ñến là kháng nguyên O, kháng nguyên K và kháng nguyên F [30]. 2.3.3.4 Yếu tố dung huyết (Hly) của E. coli Khi E. coli phát triển trong tổ chức cơ quan, sắt ñược cung cấp phụ thuộc vào chất siderofor do vi khuẩn sản sinh ra. Chất này có khả năng phân hủy sắt liên kết trong tổ chức của vật chủ thông qua sự phá vỡ hồng cầu, giải phóng sắt dưới dạng hợp chất HEM ñể vi khuẩn sử dụng. Sự phân hủy hồng cầu chủ yếu là do enzym heamolyzin của vi khuẩn tiết ra, vì thế có thể coi nó là một yếu tố ñộc lực gây bệnh của vi khuẩn [30]. Khả năng dung huyết là yếu tố ñộc lực quan trọng của E. coli gây bệnh ñường tiết niệu. E. coli phân lập từ cơ quan cảm nhiễm ngoài ñường ruột thường có khả năng dung huyết cao hơn nhiều so với E. coli phân lập từ phân. Có 4 kiểu dung huyết của E. coli: α - haemolysin, β - haemolysin, γ - haemolysin, ε-haemolysin nhưng quan trọng nhất là kiểu α - haemolysin và β - haemolysin [30], [33]. Heamolyzin do E. coli sinh ra có thể gây chết chuột, phôi trứng, tế bào phôi gà, tế bào thận chuột và gây hoại tử da thỏ. Khối lượng phân tử của heamolyzin khoảng 300.000 Da, ñược cấu tạo chủ yếu từ protein, ngoài ra còn có hydratcacbon [66]. Theo Smith [66] E. coli gây bệnh cho lợn có khả năng sản sinh heamolyzin, thường thấy chủ yếu ở các serotgroup O như: O8, O138, O141, O147. ða số E. coli gây bệnh ñường ruột cho lợn con theo mẹ ñều gây dung huyết, ñặc tính này không bền vững khi nuôi cấy nhiều ñời qua môi trường nhân tạo. 2.3.3.5 Yếu tố cạnh tranh Colicin V của E. coli (ColV) Trong quá trình phát triển và cư trú ở ñường ruột, E. coli phát triển và tồn tại cộng sinh với nhiều loại vi khuẩn ñường ruột khác: Salmonella spp, Staphylococcus spp, Clostridium, Vibrio cholera. ðể tạo ñiều kiện cho quá trình phát triển của mình và trở thành vi khuẩn chiếm ưu thế trong ñường ruột, E. coli sản sinh ra chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác, ñược gọi là ColV. Vì vậy, yếu tố này cũng ñược coi là yếu tố ñộc lực của E. coli gây bệnh [8]. Khả năng sản sinh Colv của E. coli ñược di truyền qua plasmid, ColV plasmid ñược tìm thấy không chỉ ở E. coli gây bệnh mà còn tìm thấy ở các loại vi khuẩn ñường ruột khác. Yếu tố ColV lần ñầu tiên ñược tìm thấy năm 1936, nhưng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 16 ColV plasmid thì mới phân lập ñược trong thời gian gần ñây. Người ta cho rằng việc di truyền ColV thường gắn liền với việc di truyền serotype O18:K9:H7. Nhiều tác giả cho ColV là một chất kháng sinh có hiệu quả, có thể tác dụng với tất cả các loại vi khuẩn ñường ruột trừ vi khuẩn sinh ra nó. Họ mong muốn rằng trong thời gian tới ColV ñược sử dụng rộng rãi như một chất kháng sinh ñể ức chế hay tiêu diệt các loại vi khuẩn ñường ruột khác. 2.3.3.6 Yếu tố kháng kháng sinh của E. coli ðể ñiều trị bệnh ñường ruột người ta sử dụng nhiều loại thuốc kháng sinh, ngoài ra còn trộn chúng vào thức ăn với tỷ lệ thấp ñể phòng bệnh và kích thích tăng trọng. Vì vậy, khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn ñường ruột nói chung và E. coli nói riêng ñang ngày một tăng làm cho hiệu quả ñiều trị giảm, thậm chí nhiều loại thuốc kháng sinh còn bị vô hiệu hóa hoàn toàn. Phạm Khắc Hiếu và cộng sự [16], [36] ñã tìm thấy chủng E. coli kháng lại 11 loại kháng sinh ñồng thời chứng minh khả năng truyền tính kháng thuốc giữa E. coli và Salmonella spp qua plasmid. Lê Văn Tạo và cộng sự (1993) cho biết: Các plasmid R có vai trò quan trọng không những giúp vi khuẩn hình thành tính chất kháng thuốc mà còn tạo ñiều kiện thuận lợi ñể gieo rắc tính chất này trong tự nhiên, bằng khả năng tiếp hợp (Conjunction plasmid) hay sự có mặt của các tiểu phần chuyển vị (Transposition plasmid) [28]. Khi nghiên cứu về ñặc tính này của E. coli, Phạm Khắc Hiếu (1996) cho biết: Sau 20 năm (1976 - 1996), mức ñộ mẫn cảm với một số kháng sinh và dược chất ñang ñược sử dụng phổ biến trong ñiều trị của các chủng E. coli phân lập từ những lợn con bị tiêu chảy ñã giảm mạnh, chỉ còn 3,1% so với trước ñó là 26,1%, ñồng thời ñã dẫn chứng khả năng truyền tính kháng kháng sinh của E. coli cho nhiều loại vi khuẩn khác [16]. Sở dĩ khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn nói chung và E. coli nói riêng tăng nhanh, lan rộng vì gen sản sinh yếu tố kháng thuốc kháng sinh nằm trong plasmid R (Resistance). Plasmid này có thể di truyền dọc và di truyền ngang cho tất cả quần thể vi khuẩn thích hợp [37]. Với những ý nghĩa trên, ngày nay việc nghiên cứu khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn không còn ñơn thuần là việc lựa chọn thuốc kháng sinh mẫn cảm ñể ñiều trị bệnh do E. coli gây ra mà là nghiên cứu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 17 một yếu tố gây bệnh của vi khuẩn này. 2.3.3.7 ðộc tố của E. coli E. coli bám dính, xâm nhập vào niêm mạc ruột và sản sinh ra các loại ñộc tố ñường ruột. Các ñộc tố này làm thay ñổi quá trình trao ñổi nước và ñiện giải ở ruột non và dẫn tới tiêu chảy do dịch tiết ra quá nhiều ở ruột non, không ñược hấp thu lại ở ruột già [8], [17], [25]. Sự sản sinh ñộc tố ñược xem là một yếu quan trọng của E. coli. ðộc tố và yếu tố bám dính ñược coi là những yếu tố ñộc lực vô cùng quan trọng ñã và ñang ñược nhiều tác giả quan tâm và ñề cập ñến trong các nghiên cứu về E. coli. E. coli sản sinh nhiều loại ñộc tố: Enterotoxin, verotoxin, neurotoxin. Mỗi loại ñộc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra. - Nhóm ñộc tố ñường ruột (Enterotoxin) Fairbrother và cộng sự [50] cho biết ñộc tố ñường ruột do E. coli tạo ra (ETEC) gây tiêu chảy trầm trọng cho lợn sơ sinh từ 1 - 4 ngày tuổi. E. coli xâm nhập vào tế bào biểu mô ruột bằng một hoặc nhiều yếu tố bám dính F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) và F41 rồi xâm nhập vào thành ruột. Tại ñó chúng sản sinh ra ñộc tố ñường ruột, gồm hai loại: + ðộc tố chịu nhiệt (Heat stable toxin - ST) ðộc tố này chịu ñược nhiệt ñộ 1000C trong 15 phút. ðộc tố ST ñược chia thành hai nhóm STa và STb dựa trên ñặc tính sinh học và khả năng hòa tan trong methanol. STa là một protein không có tính kháng nguyên, có phân tử lượng gần 2.000 Da, STa kích thích sản sinh cGMP mức cao trong tế bào, ngăn trở hệ thống chuyển Na+ và Cl-, làm giảm khả năng hấp thu chất ñiện giải và nước ở ruột. STa thường thấy ở ETEC gây bệnh ở lợn dưới hai tuần tuổi và ở lợn lớn [52]. STb là một protein có tính kháng nguyên yếu, có phân tử lượng gần 5.000 Da, STb kích thích tiết dịch ñộc lập ở ruột, phương thức tác dụng của nó chưa ñược hiểu rõ. STb hoạt ñộng ở ruột non lợn, nhưng không hoạt ñộng ở ruột non chuột, bê và bị vô hoạt bởi trypsin. STb ñược tìm thấy ở 75% các chủng E. coli phân lập từ lợn con, 33% phân lập từ lợn lớn [52]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 18 Vai trò của STb trong tiêu chảy chưa ñược biết ñến, mặc dù ETEC sản sinh STb có thể kích thích gây tiêu chảy và làm teo lông nhung ruột ở lợn con trong ñiều kiện thực nghiệm [30]. Cả STa và STb ñều có vai trò quan trọng trong việc gây tiêu chảy của các chủng E. coli gây bệnh ở bê, nghé, dê, cừu, lợn con và trẻ sơ sinh. + ðộc tố không chịu nhiệt (Heat labile toxin - LT) ðộc tố này bị bất hoạt ở nhiệt ñộ 600C trong vòng 15 phút. LT là ñộc tố phức tạp có khối lượng phân tử cao, gồm 5 nhóm trong ñó nhóm B có thể gắn với thụ thể trên bề mặt tế bào biểu mô, còn nhóm A có hoạt tính sinh học cao. Nhóm A kích thích sản sinh cAMP ở mức cao trong tế bào, dẫn ñến tăng tiết Cl-, Na+, HCO3- và nước vào trong ruột [33]. Sự tiết nước quá mức sẽ dẫn ñến sự mất nước nặng và rối loạn trao ñổi chất, có thể dẫn ñến chết gia súc. LT cũng có hai nhóm phụ LT1 và LT2, chỉ có LT1 bị trung hòa bởi anticholerae toxin. LT ñược sinh ra bởi các chủng E. coli ở lợn thuộc nhóm phụ LT1, còn LT2 ñược sinh ra bởi ETEC phân lập từ lợn và người. LT là một trong những yếu tố quan trọng gây triệu chứng tiêu chảy [33]. Cả hai loại ñộc tố ST và LT ñều bền vững ở nhiệt ñộ âm, thậm chí cả ở nhiệt ñộ âm 200C. - Nhóm ñộc tố tế bào (Shiga/Verotoxin) Năm 1977, Konowalchuck và cộng sự [59] ñã phát hiện một loại ñộc tố hoạt ñộng trong môi trường nuôi cấy tế bào Vero (do ñó ñược ñặt tên là ñộc tố tế bào Vero), ñược sinh ra bởi E. coli gây bệnh tiêu chảy ở người, tiêu chảy và bệnh phù ñầu ở lợn con. Tác ñộng gây bệnh ở tế bào của ñộc tố Vero rất khác so với tác ñộng của ñộc tố ñường ruột không chịu nhiệt cổ ñiển thuộc nhóm E. coli gây bệnh ñường ruột (ETEC). Cũng trong năm ñó, Konowalchuck và cộng sự tìm thấy một số chủng E. coli, bao gồm cả chủng H30 ở người, có ñộc tố tế bào trong môi trường nuôi cấy tế bào Hela. ðộc tố tế bào này ñược trung hòa bởi kháng ñộc tố ñặc hiệu cho ñộc tố Shiga (Stx) của vi khuẩn gây bệnh lỵ, do ñó nó còn ñược gọi là ñộc tố giống như Shiga (SLT). - ðộc tố Stx2e (Vt2e) ðộc tố Shiga ở lợn là một loại trong nhóm ñộc tố Stx2 với một số khác biệt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 19 trong ñặc tính sinh học. Stx1 và Stx2 gây ñộc cho các tế bào Hela. Stx2e kém ñộc hơn so với các loại ñộc tố Stx2 khác. Stx2e ñộc hơn ñối với tế bào Vero, từ 10 - 100 lần so với tế bào Hela. Các quan sát này có liên quan tới lượng thụ thể chuyên biệt có mặt trên các loại tế bào [59]. Stx2e ñược mô tả là ñộc tố trong nhóm ñồng hợp và với rất ít ngoại lệ là ñặc hiệu trên lợn [45]. Ngoài Stx2e, các ñộc tố Stx khác (Stx1, Stx2) hiếm khi ñược phát hiện ở các chủng E. coli gây bệnh phù ñầu [51]. Stx2e ñóng vai trò quan trọng trong nguyên nhân gây bệnh và sự xuất hiện các triệu chứng của bệnh phù ñầu. Sau khi tụ ñám và phát triển ở ruột, E. coli sinh ñộc tố Shiga (STEC) sản sinh ra Stx2e, ñộc tố này ñi qua tế bào biểu mô ruột vào máu. Từ ñó Stx2e gắn kết với các thụ thể có mặt ở các tế bào màng trong của ñộng mạch, các tiểu ñộng mạch ở các mô và cơ quan khác nhau gây ra các tổn thương vi thể. ðó cũng là cơ sở của những tổn thương ñại thể và triệu chứng lâm sàng. Triệu chứng cũng có thể thấy khi tiêm tĩnh mạch ñộc tố Stx2e tinh lọc [51]. E. coli sinh ñộc tố Shiga (STEC) cũng gây ra bệnh tiêu chảy cho lợn sau cai sữa, nhưng Stx2e không có vai trò trong việc xuất hiện tiêu chảy, ñó là do các ñộc tố ñường ruột cổ ñiển (STEC/ETEC) [47]. 2.4 Bệnh tiêu chảy và phù ñầu ở lợn do E. coli gây ra 2.4.1 Bệnh tiêu chảy do E. coli ở lợn Bệnh tiêu chảy ở lợn con ñã trở thành một bệnh gây thiệt hại lớn về mặt kinh tế. Nó có thể chia làm ba loại bệnh viêm ruột chính như: tiêu chảy ở lợn sơ sinh (một vài ngày ñầu sau khi sinh), tiêu chảy ở lợn con theo mẹ (từ tuần ñầu cho ñến lúc cai sữa) và tiêu chảy ở lợn sau cai sữa. Có nhiều nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy ở lợn con bao gồm: virut gây viêm dạ dày ruột (Transmissible gastroenteritis virut - TGE), Rotavirut, Coccidia. Trong ñó, E. coli là nguyên nhân quan trọng nhất trong bệnh tiêu chảy của lợn mới sinh và sau cai sữa [3], [9]. E. coli gây bệnh thường có khả năng sản sinh một hay nhiều yếu tố gây bệnh, ở những chủng E. coli không gây bệnh không tìm thấy những yếu tố này. 2.4.1.1 Mầm bệnh Tiêu chảy ở lợn con do E. coli thường thấy ở lợn từ sơ sinh ñến 21 ngày tuổi. Các chủng gây bệnh ñều sản sinh ñộc tố ñường ruột nên ñược gọi là ETEC Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 20 (Enterotoxigenic E. coli). ETEC bám vào màng nhày ruột non của lợn con bằng một hay nhiều kháng nguyên bám dính F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) hoặc F41. Chúng phát triển ở lớp tế bào biểu mô ruột non và sản sinh một hay nhiều loại ñộc tố ñường ruột: STa (ST1), STb (ST2) hoặc LT. Nhiều tác giả cho rằng hầu hết các chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy ở lợn con thuộc nhóm O149, O8, O147, O157 và sản sinh ñộc tố LT và STb [46], [53]. Ngoài ra, còn có các chủng ETEC thuộc các nhóm O8, O9, O64, O101 ngày càng tăng lên. Các chủng này có F5, F6 hoặc F41 và chủ yếu sản sinh ñộc tố STa, ít thấy sản sinh STb. Những chủng ETEC này gây bệnh chủ yếu ở lợn từ sơ sinh ñến 6 ngày tuổi, ít thấy ở lợn lớn hơn. Trái lại ETEC có F4 thường phân lập ñược ở lợn từ sơ sinh ñến cai sữa. 2.4.1.2 Dịch tễ học Sự xuất hiện của bệnh tiêu chảy do E. coli phụ thuộc vào sự tương tác giữa vi khuẩn gây bệnh với ñiều kiện môi trường và các yếu tố từ bản thân vật chủ. Chỉ có E. coli mang các yếu tố gây bệnh tăng sinh với số lượng lớn thì mới gây tiêu chảy. Lợn con khi mới sinh, trước khi bú mẹ ñã tiếp xúc với môi trường bị ô nhiễm nặng ở chuồng ñẻ, da của lợn mẹ và hệ vi sinh vật trong phân lợn mẹ. Do vậy, trong ñiều kiện vệ sinh kém hay trong chuồng ñẻ sử dụng liên tục không có thời gian sát trùng và ñể trống chuồng thì sự lây nhiễm E. coli gây bệnh ở môi trường cao, khả năng bội nhiễm cao dẫn ñến xuất hiện dịch tiêu chảy do E. coli ở lợn con. Sữa ñầu có chứa kháng ñộc tố ñặc hiệu IgA có thể ngăn ngừa sự bám dính của E. coli trong ñường ruột của lợn con. Nếu lợn mẹ không tiếp xúc với E. coli gây bệnh trong môi trường, kháng ñộc tố ñặc hiệu không có trong sữa ñầu, lợn con sẽ rất mẫn cảm với mầm bệnh [21], [41]. 2.4.1.3 Triệu chứng Sự lây nhiễm E. coli thường gây ra tiêu chảy ở mức ñộ nặng nhẹ khác nhau phụ thuộc vào các yếu tố gây bệnh của E. coli, tuổi và khả năng miễn dịch của lợn con. Trong trường hợp nặng, triệu chứng lâm sàng là mất nước, rối loạn trao ñổi chất và chết. Trong vài trường hợp, ñặc biệt là ở lợn con, sự lây nhiễm rất nhanh và lợn chết trước khi xuất hiện tiêu chảy. Triệu chứng tiêu chảy ở lợn con có thể quan sát thấy ñầu tiên lúc 2 - 3 giờ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 21 sau khi sinh và có thể thấy ở một vài lợn con hay toàn ổ. Lợn con của những lợn nái hậu bị thường có tỷ lệ nhiễm bệnh tiêu chảy cao hơn so với những lợn con của lợn nái ñẻ ở những lứa sau. Phần lớn lợn con trong chuồng ñều bị nhiễm bệnh và tỷ lệ chết rất cao trong vài ngày ñầu sau khi sinh. Tiêu chảy có thể ở mức ñộ nhẹ, lợn không có biểu hiện mất nước hoặc tiêu chảy nặng, phân toàn nước. Phân lợn có màu khác nhau từ trắng sang nâu, phân có thể chảy tự do từ hậu môn xuống sàn và chỉ phát hiện thấy khi quan sát gần. Trong những ổ dịch nặng, một số lợn có thể nôn. Khối lượng cơ thể bị giảm sút 30 - 40% do mất nước. Cơ bụng hóp lại, lợn gầy, suy kiệt và ñi ñứng xiêu vẹo, mắt trũng sâu, da tái xám và nhợt nhạt. Sự mất nước và giảm khối lượng cơ thể làm cho lợn bị suy sụp nhanh, những lợn con này thường chết. Trong trường hợp mãn tính hay bệnh ít nghiêm trọng, da quanh hậu môn và vùng háng có thể ñỏ lên do tiếp xúc với phân kiềm tính, lợn ít bị mất nước và nếu ñược ñiều trị tích cực có thể khỏi bệnh. 2.4.1.4 Phòng bệnh Phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con nên tập trung vào việc giảm số lượng mầm bệnh E. coli trong môi trường bằng vệ sinh tốt, duy trì các ñiều kiện môi trường thích hợp và tạo miễn dịch ổn ñịnh. Một ñiều quan trọng là lợn ñược nuôi trong môi trường có nhiệt ñộ ổn ñịnh ở 32 - 340C ñối với lợn con theo mẹ, 30 - 320C ñối với lợn con cai sữa, lợn con ñược nuôi trong môi trường thông thoáng, không có rác bẩn, nền chuồng có ñộ dẫn nhiệt thấp. Lợn nái nên nuôi ở môi trường 220C, vì vậy trong chuồng lợn ñẻ cần có ổ có nhiệt ñộ cao hơn cho lợn con [21]. ðộ ẩm trong chuồng nuôi cũng ảnh hưởng không nhỏ tới bệnh tiêu chảy ở lợn con. ðộ ẩm càng cao thì lợn con mắc tiêu chảy càng nhiều. ðộ ẩm thích hợp cho lợn con ñược khuyến cáo là 70 - 85% [41]. Thiết kế chuồng ñẻ cũng rất quan trọng vì nó ảnh hưởng ñến vị trí thải phân của lợn nái. Khi chuồng quá dài, phân rải rác trong diện tích chuồng do ñó làm tăng khả năng ô nhiễm. Tốt nhất là dùng cũi ñẻ có thể ñiều chỉnh ñược, ngắn cho lợn cái hậu bị, dài hơn cho lợn nái. Chuồng ñẻ thường cao trên mặt ñất, nền chuồng bằng sàn nhựa ñể hổng có lỗ cho phân rơi xuống. Nuôi trong những ổ ñẻ như vậy lợn con Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 22 ít tiêu chảy hơn những ổ ñẻ có nền chuồng bằng xi măng. Chuồng ñẻ nên ñược rửa sạch và sát trùng giữa các lứa ñẻ. Một hệ thống chuồng ñẻ cùng vào cùng ra và ñược sát trùng toàn bộ chuồng ñẻ giữa các ñợt sẽ làm giảm mật ñộ của E. coli ở môi trường [43]. Khẩu phần ăn cho lợn có thể ñược ñiều chỉnh ñể làm giảm sự phát triển của E. coli trong ruột [43]. * Phòng bệnh bằng miễn dịch Khả năng miễn dịch chống bệnh tiêu chảy ở lợn con trước tiên ñược cung cấp thông qua sữa ñầu của con mẹ, sau ñó là sự ñáp ứng miễn dịch tại ruột non. Những kháng ñộc tố ñặc hiệu trong sữa ñầu hoặc ở niêm mạc ruột ngăn cản sự bám dính của vi khuẩn vào các thụ thể trên tế bào biểu mô ruột non và trung hòa hoạt ñộng của ñộc tố ñường ruột, ñộc tố tế bào của E. coli. Sữa ñầu của lợn nái có chứa hàm lượng kháng ñộc tố IgG cao và nó giảm rất nhanh trong quá trình tiết sữa, sau ñó IgA trở thành globulin miễn dịch chính [9]. IgA bảo vệ ruột chống lại sự xâm nhập của E. coli. Hầu hết IgA, IgM và IgG trong sữa của lợn nái ñược sản xuất trong tuyến vú. Lợn con mới sinh bắt ñầu tổng hợp kháng ñộc tố ñặc hiệu và phát triển hệ miễn dịch ở ruột non trong tuần ñầu tiên sau khi sinh [9], [12]. Trước hết IgM thịnh hành ở 2 - 3 tuần ñầu, sau ñó nó ñược thay thế bởi IgA, ñây là một kháng ñộc tố quan trọng nhất ở trong ruột non. Do vậy, trong tuần ñầu tiên sau khi sinh thì sữa ñầu là nguồn miễn dịch bảo vệ chính cho lợn con [2]. 2.4.1.5 ðiều trị ðiều trị bệnh tiêu chảy do E. coli ở lợn con cần ñược tập trung vào việc loại bỏ các yếu tố gây bệnh, khắc phục những ảnh hưởng ñộc hại của chúng, bổ sung nước và ñiện giải ñã mất và tạo môi trường sống tối ưu cho lợn. Các liệu pháp ñiều trị càng áp dụng nhanh, ñồng bộ càng có hiệu quả. ðể loại bỏ nguyên nhân gây bệnh, trước tiên cần sử dụng thuốc kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng ñể ñiều trị, ñến khi biết ñược kết quả của kháng sinh ñồ thì dùng thuốc có ñộ mẫn cảm mạnh với E. coli ñể ñiều trị. Một số thuốc cản trở sự tiết dịch do ñộc tố ñường ruột có tác dụng tốt trong ñiều trị tiêu chảy. Việc sử dụng các loại thuốc chống tiết dịch như bencetimide và loperamide ñơn thuần hay kết hợp với thuốc kháng khuẩn cũng ñã ñược khuyến cáo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 23 sử dụng . Liệu pháp bổ sung dung dịch ñiện giải có ñường glucose ñể chống mất nước và rối loạn ñiện giải ñem lại hiệu quả cao trong ñiều trị bệnh tiêu chảy [43]. 2.4.2 Bệnh phù ñầu do E. coli gây ra ở lợn 2.4.2.1 Mầm bệnh Bệnh phù ñầu (Edema Disease) là bệnh gây ra bởi E. coli mang yếu tố bám dính F18, F6, ñộc tố Vero và khả năng dung huyết. Chúng sản sinh verotoxin ñi vào máu và làm tổn thương thành mạch. Các khái niệm bệnh phù ñầu, phù thũng, phù ruột ñược coi là một bệnh, bởi vì phù ở lớp dưới màng nhầy của dạ dày và ở giữa ruột kết ñều là những ñặc ñiểm nổi bật của bệnh. Bệnh phù ñầu do các chủng E. coli gây ra hầu hết thuộc một số serotype rất hạn chế trong một vùng nào ñó, những serotype này thường gắn với một số yếu tố bám dính và ñộc tố ổn ñịnh. Serotype O139 ñược tìm thấy trên khắp thế giới và có F18ab. Những chủng thuộc serotype này ở Úc lại thường gây bệnh tiêu chảy ở lợn sau cai sữa. Trái lại, những chủng của nhóm này ở châu Âu thì thường gây bệnh phù ñầu [31]. Loại F18 (trước kia gọi là F107, 2134P, 8813 và F4 (K88) ñược phát hiện với tỷ lệ tương ứng là 44% và 36% trong các chủng sản sinh ñộc tố. Trong khoảng 24% các chủng có F4 không phát hiện thấy các gen mã hóa cho những loại fimbriae ñã biết khác. F6 (987P) thường có mặt cùng với F4 hoặc F18 [56]. 2.4.2.2 Dịch tễ học Nhóm tuổi bị nhiễm bệnh phù ñầu phụ thuộc vào tuổi cai sữa. Lợn con chưa cai sữa cũng có thể bị mắc phù ñầu và mức ñộ trầm trọng phụ thuộc vào kháng ñộc tố trong sữa của lợn mẹ. Ở lợn trưởng thành, phù ñầu thường là nguyên nhân của triệu chứng thần kinh và là nguyên nhân gây chết ñáng kể [10]. Tỷ lệ nhiễm bệnh trong các ñàn rất khác nhau, có thể lên tới 80%, nhưng trung bình là 30 - 40%. Với bệnh phù ñầu, tỷ lệ chết từ 50 ñến trên 90%. Thời gian bệnh kéo dài trong một ñàn cũng khác nhau từ 4 - 14 ngày, trung bình là dưới 1 tuần. Bệnh biến mất cũng ñột ngột như khi nó xuất hiện. Sự tái diễn cũng có thể xảy ra tại chuồng ñó [10]. Môi trường ở chuồng cai sữa có thể là nguồn lây nhiễm các chủng E. coli gây bệnh phù ñầu. Lợn chưa cai sữa có thể nhiễm trong chuồng ñẻ và mang nó ñến Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 24 chuồng cai sữa. Thường xuyên rửa và sát trùng chuồng cũng chưa ñủ ñể cắt ñứt chu kỳ lưu truyền mầm bệnh [23]. Sự lan truyền của các chủng E. coli gây bệnh có thể qua ñường không khí, thức ăn, phương tiện vận chuyển, qua lợn hoặc các dụng cụ chăn nuôi [10]. 2.4.2.3 Cơ chế gây bệnh Bước ñầu tiên của quá trình gây bệnh phù ñầu ở lợn con sau cai sữa cũng giống như ở lợn con theo mẹ, ñó là sự bám dính và phát triển trong ruột non, sản sinh ñộc tố. Nhưng ñể có ñược sự bám dính, E. coli phải tập trung thành ñám ở lớp màng nhầy của riềm bàn chải. Mức ñộ tập trung này quyết ñịnh liệu có gây ra bệnh hay không và phụ thuộc vào nhiều nhân tố, không chỉ dựa vào khả năng sinh sản của vi khuẩn. Vi khuẩn tập trung ở màng nhầy sẽ bám dính vào thụ thể nằm ở riềm bàn chải ñặc thù cho từng loại kháng nguyên bám dính và không phải có ở tất cả các lợn. Sau khi bám dính, vi khuẩn xâm nhập vào lớp tế bào biểu mô rồi nhân lên, sản sinh ñộc tố ñường ruột gây tiêu chảy. Từ lớp tế bào biểu mô E. coli xâm nhập vào hệ lâm ba, vào hệ tuần hoàn gây dung huyết, theo máu ñến các cơ quan nội tạng, phát triển nhân lên phá hủy tế bào tổ chức, sản sinh verotoxin, neurotoxin làm tăng tính thấm thành mạch gây phù, tác ñộng vào tế bào thần kinh gây các biểu hiện thần kinh [9]. 2.4.2.4 Triệu chứng Biểu hiện ñầu tiên là biếng ăn, bệnh nặng trong một thời gian ngắn. Triệu chứng thần kinh xuất hiện vào ngày thứ 6 sau khi mắc bệnh. Sưng mí mắt cũng xuất hiện vào thời ñiểm ñó. Liệt (mất chức năng ñiều khiển) kết hợp với rối loạn thần kinh thường thấy rất rõ. Những lợn bị bệnh thường nằm nghiêng sang một bên. Nhiệt ñộ cơ thể luôn trong giới hạn bình thường, ở một vài cá thể trước khi chết thân nhiệt có thể hạ xuống dưới mức bình thường [21], [46]. Bệnh phù ñầu mạn tính cũng xuất hiện với tỷ lệ khác nhau (nhưng thường là thấp) từ những lợn mắc bệnh phù ñầu cấp tính ñã hồi phục. Bệnh xảy ra sau vài ngày ñến vài tuần khi có viêm nhiễm ở ruột, sinh trưởng của lợn ngừng lại, những lợn ốm thường có những triệu chứng bất thường về thần kinh như ñi vòng tròn, ngoẹo ñầu hay liệt chân, phù dưới da rất ít thấy, những lợn bị nhiễm bệnh thế này thường bị chết [8]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 25 2.4.2.5 Phòng bệnh - Chọn những giống lợn có khả năng kháng bệnh: ðây là một biện pháp phòng bệnh hữu hiệu._.2 (sau 3 tháng bảo quản) hiệu giá giải ñộc tố giảm xuống còn 1/4, tỷ lệ bảo hộ chuột bạch còn 80%. Lần kiểm tra thứ 3 (sau 6 tháng bảo quản) hiệu giá giải ñộc tố ñã giảm xuống còn 1/2, tỷ lệ bảo hộ chuột bạch còn 40%. Sau 9 và 12 tháng bảo quản, hiệu giá giải ñộc tố có trong vacxin chỉ còn ở mức N (nguyên) và âm tính (-), chuột chết hết sau khi công cường ñộc. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 79 Chuột lô ñối chứng ñều chết 100% sau khi công cường ñộc và chuột ở lô kiểm tra MLD cũng chết với tỷ lệ trung bình từ 40 - 50%. + Vacxin bảo quản ở nhiệt ñộ 2 - 8°C: Toàn bộ 6 lô vacxin kiểm tra hiệu lực ñối với chuột 3 lần kiểm tra ñầu (sau bảo quản 1 tháng, 3 tháng và 6 tháng) vẫn giữ ñược hiệu giá giải ñộc tố 1/8 và tỷ lệ bảo hộ chuột bạch 100%. Từ lần kiểm tra thứ 4 trở ñi, (vacxin bảo quản ñược 9 tháng, 12 tháng) hiệu giá giải ñộc tố còn 1/4; tỷ lệ bảo hộ chuột bạch 80%. Chuột lô ñối chứng ñều chết 100% sau khi công cường ñộc và chuột ở lô kiểm tra MLD cũng chết với tỷ lệ trung bình là 40 - 50%. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các thí nghiệm trước ñó. Như vậy, vacxin giải ñộc tố E. coli cần phải bảo quản ở ñiều kiện nhiệt ñộ từ 2 - 8°C và thời gian bảo quản 6 tháng kể từ ngày sản xuất. 4.6 Thử nghiệm thực ñịa và kiểm tra hiệu lực của vacxin ngoài thực ñịa 4.6.1 Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin ngoài thực ñịa ðã tiến hành khảo sát chỉ tiêu an toàn của vacxin giải ñộc tố E. coli bằng cách tiêm gấp 2 liều chỉ ñịnh (4 ml/con) vào dưới da cho tổng số 499 lợn con sau cai sữa, khỏe mạnh có trọng lượng từ 5 - 7 kg/con và tiêm với liều 6 ml/con cho 163 lợn nái mang thai giai ñoạn 2 - 2,5 tháng (trước khi ñẻ 5 - 6 tuần), tại một số trại lợn giống, hộ gia ñình ở các huyện Quốc Oai, ðan Phượng - Hà Nội và huyện ðông Hưng - Thái Bình. Theo dõi các biểu hiện khác thường sau tiêm liên tục 7 ngày các ñối tượng lợn thí nghiệm. Kết quả ñược trình bày ở bảng 4.19. Từ kết quả ở bảng 4.19, nhận thấy vacxin giải ñộc tố E. coli an toàn tuyệt ñối khi tiêm dưới da với liều gấp ñôi liều sử dụng cho cả hai ñối tượng lợn con sau cai sữa và lợn nái mang thai (trước khi ñẻ 5 - 6 tuần) ở tất cả các ñịa phương thử nghiệm. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 80 Bảng 4.19: Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin giải ñộc tố E. coli tiêm cho lợn ngoài thực ñịa Lợn con sau cai sữa Lợn nái chửa Chỉ tiêu theo dõi ðịa phương thử nghiệm Số lợn TN (con) Liều vacxin tiêm (ml/con) Số lợn phản ứng /tiêm (con) Tỷ lệ an toàn (%) Số lợn TN (con) Liều vacxin tiêm (ml/con) Số lợn phản ứng /tiêm (con) Tỷ lệ an toàn (%) Quốc Oai (Hà Nội) 150 4 0/150 100 50 6 0/50 100 ðan Phượng (Hà Nội) 200 4 0/200 100 60 6 0/60 100 ðông Hưng (Thái Bình) 149 4 0/149 100 53 6 0/53 100 Tổng hợp 499 0/499 100 163 0/163 100 4.6.2 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin ngoài thực ñịa ðã tiến hành tiêm thử nghiệm vacxin giải ñộc tố E. coli cho lợn nuôi trong một số hộ chăn nuôi thuộc các huyện Quốc Oai, ðan Phượng - Hà Nội và trại lợn giống Lạc Vệ - Tiên Du - Bắc Ninh. Kiểm tra hiệu lực của vacxin ñối với cả hai ñối tượng: Lợn con sau cai sữa và lợn nái mang thai, thông qua hiệu giá kháng ñộc tố trong mẫu huyết thanh của lợn trước và sau khi ñã ñược miễn dịch 21 ngày. Hiệu giá kháng ñộc tố trong huyết thanh của từng lợn ñược xác ñịnh bằng phản ứng kết tủa nhanh trên phiến kính với kháng nguyên vi khuẩn E. coli ña giá (theo thường quy). Kết quả hiệu giá kháng ñộc tố trung bình của lợn ở từng nhóm ñược trình bày ở bảng 4.20 và 4.21. Từ kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn con sau cai sữa tổng hợp ở bảng 4.20 cho thấy: Tỷ lệ bảo hộ của vacxin ñối với bệnh tiêu chảy và bệnh sưng phù ñầu ở lợn con sau cai sữa rất tốt. Trong thời gian theo dõi, lợn ở lô ñối chứng có 37/90 con bị Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 81 phát bệnh, chiếm tỷ lệ 41,1%. Lợn ở lô thí nghiệm chỉ có 11/610 con phát bệnh, chiếm tỷ lệ 1,8%. Như vậy, tỷ lệ bảo hộ của vacxin ñối với lợn con sau cai sữa ngoài thực ñịa ñạt trên 98%. Bảng 4.20: Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn con sau cai sữa ngoài thực ñịa Số lợn TN (con) Kết quả theo dõi lợn bị bệnh do E. coli Hiệu giá kháng ñộc tố trung bình ðC TN Chỉ tiêu theo dõi ðịa phương thử nghiệm Số lợn ðC (con) ðược tiêm Lấy máu kiểm tra Số con phát bệnh Tỷ lệ % Số con phát bệnh Tỷ lệ % Trước tiêm TN sau tiêm 21 ngày ðC sau 21 ngày Quốc Oai (Hà Nội) 30 210 50/210 13/30 43,3 4/210 1,9 1/8,5 1/175,4 1/10,5 ðan Phượng (Hà Nội) 30 200 50/200 14/30 46,7 4/200 2,0 1/8 1/172,4 1/10,5 Lạc Vệ (Bắc Ninh) 30 200 50/200 10/30 33,3 3/200 1,5 1/8,5 1/181,8 1/11,5 Tổng hợp 90 610 150/610 37/90 41,1 11/610 1,8 1/8,3 1/175,4 1/10,9 Với tổng số 150/610 mẫu huyết thanh của lợn thí nghiệm ñược lấy ngẫu nhiên ở cả 3 ñịa phương thử nghiệm, mỗi ñịa phương 50 mẫu sau khi tiêm vacxin 21 ngày cho HGKðTTB rất cao. Cụ thể: Trước thí nghiệm HGKðTTB trong huyết thanh của lợn chỉ từ 1/8 - 1/8,5, trung bình 1/8,3. 21 ngày sau tiêm vacxin, HGKðTTB ñã tăng cao từ 1/172,4 - 1/181,8, trung bình 1/175,4; trong khi ñó lợn lô ñối chứng HGKðTTB chỉ có 1/10,9. So sánh HGKðTTB trong huyết thanh lợn con sau cai sữa ñã miễn dịch bằng vacxin giải ñộc tố E. coli với HGKðTTB trong huyết thanh lợn trước khi miễn dịch và ñối chứng, cho thấy: Vacxin giải ñộc tố E. coli kích thích cơ thể lợn con sản sinh kháng ñộc tố kháng E. coli rất cao (gấp khoảng hơn 20 lần). Với 30 lợn lô ñối chứng, HGKðTTB trước và sau khi thí nghiệm cũng có sự biến ñộng nhất ñịnh, trước thí nghiệm HGKðTTB ở mức 1/8 -1/8,5, trung bình 1/8,3; sau thí nghiệm HGKðTTB ñều tăng (từ 1/10,5 - 1/11,5), trung bình 1/10,9. Kết quả này cho thấy sự cảm nhiễm của lợn con sau cai sữa với vi khuẩn E. coli Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 82 thường gặp trong tự nhiên cũng cho ñáp ứng miễn dịch tự nhiên nhưng ở mức thấp, chưa ñủ khả năng bảo hộ cho lợn khi vi khuẩn gây bệnh. Chính vì vậy, trong chăn nuôi lợn giai ñoạn này bệnh tiêu chảy và sưng phù ñầu vẫn xảy ra. Bảng 4.21: Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn nái mang thai ngoài thực ñịa Số lợn TN (con) Hiệu giá kháng ñộc tố trung bình Chỉ tiêu theo dõi ðịa phương thử nghiệm Số lợn ðC (con) ðược tiêm Lấy máu kiểm tra Trước tiêm Sau tiêm 21 ngày ðC sau 21 ngày Quốc Oai (Hà Nội) 5 50 50/50 1/40 1/476,2 1/40 ðan Phượng (Hà Nội) 5 50 50/50 1/38,5 1/400 1/40 Lạc Vệ (Bắc Ninh) 5 90 50/90 1/41,7 1/588,2 1/41,7 Tổng hợp 15 190 150/190 1/40 1/476,2 1/40 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn nái mang thai ở bảng 4.21 cho thấy: HGKðTTB trong huyết thanh của lợn trước khi miễn dịch từ 1/38,5 - 1/41,7, trung bình 1/40. Sau 21 ngày tiêm vacxin, HGKðTTB của lợn thí nghiệm ñã tăng rất cao, từ 1/476,2 - 1/588,2, trung bình 1/476,2. Trong khi ñó lợn nái ở nhóm ñối chứng, HGKðTTB hầu như không biến ñộng so với hiệu giá ban ñầu, vẫn giữ ở mức 1/40. So sánh HGKðTTB trong huyết thanh của lợn nái ñược miễn dịch bằng vacxin giải ñộc tố E. coli với HGKðTTB trong huyết thanh của lợn nái trước khi miễn dịch và ñối chứng, cho thấy vacxin giải ñộc tố E. coli kích thích cơ thể lợn mẹ sinh kháng ñộc tố kháng E. coli rất cao (gấp khoảng hơn 10 lần). Từ kết quả ở các bảng 4.20 và 4.21 nhận thấy, vacxin giải ñộc tố E. coli khi tiêm cho các ñối tượng lợn khác nhau cho kết quả miễn dịch khác nhau. Ở các ñịa bàn, các ñiều kiện chăn nuôi khác nhau cũng cho kết quả ñáp ứng miễn dịch với vacxin có khác nhau. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 83 Bảng 4.22: Tổng hợp so sánh kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli tiêm cho lợn con sau cai sữa và lợn nái mang thai ở các ñịa phương HGKðTTB lợn con cai sữa HGKðTTB lợn nái mang thai Chỉ tiêu theo dõi ðịa phương thử nghiệm Trước tiêm TN sau tiêm 21 ngày ðC sau 21 ngày Trước tiêm TN sau tiêm 21 ngày ðC sau 21 ngày Quốc Oai (Hà Nội) 1/8,5 1/175,4 1/7,5 1/40 1/476,2 1/40 ðan Phượng (Hà Nội) 1/8 1/172,4 1/7,5 1/38,5 1/400 1/40 Lạc Vệ (Bắc Ninh) 1/8,5 1/181,8 1/7,5 1/41,7 1/588,2 1/41,7 Tổng hợp 1/8,3 1/175,4 1/7,5 1/40 1/476,2 1/40 Hình 4.9: Hiệu lực của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn con sau sai sữa và lợn nái mang thai nuôi ở các ñịa phương Kết quả ở bảng 4.22 và hình 4.9 cho thấy, lợn ở trại giống lợn Lạc Vệ - Bắc Ninh với cả hai ñối tượng thử nghiệm vacxin giải ñộc tố E. coli (lợn con sau cai sữa và lợn nái mang thai) ñáp ứng miễn dịch tốt nhất, HGKðTTB của lợn con sau cai sữa là 1/181,8, lợn nái mang thai là 1/588,2. Tiếp ñến là lợn nuôi ở các trại tư nhân thuộc huyện Quốc Oai - Hà Nội, HGKðTTB ñạt 1/175,4 ñối với lợn con sau cai sữa và 1/476,2 ñối với lợn nái mang thai; thấp nhất là các ñối tượng lợn nuôi ở các trại tư nhân thuộc huyện ðan Phượng - Hà Nội, HGKðTTB tương ứng chỉ ñạt 1/172,4 ñối với lợn con và 1/400 ñối với lợn nái. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 84 4.6.3 Khảo sát ñộ dài miễn dich của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn ngoài thực ñịa Song song với việc kiểm tra hiệu lực của vacxin trong phòng thí nghiệm, ñã tiến hành khảo sát ñộ dài miễn dịch của vacxin ñối với lợn con sau cai sữa và lợn nái mang thai nuôi tại trại lợn giống Lạc Vệ - Tiên Du - Bắc Ninh. ðã tiến hành tiêm vacxin cho mỗi ñối tượng 10 con với liều sử dụng vào dưới da. Thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần. Kiểm tra ñịnh kỳ hiệu giá kháng ñộc tố trong huyết thanh lợn thí nghiệm sau khi miễn dịch 21 ngày, 60 ngày, 30 ngày, 120 ngày và 150 ngày. Mẫu huyết thanh ñược xác ñịnh hiệu giá kháng ñộc tố bằng phản ứng kết tủa nhanh trên phiến kính với kháng nguyên vi khuẩn E. coli ña giá. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng ñộc tố ñược tính trung bình theo từng lô, trình bày ở bảng 4.23, bảng 4.24 và hình 4.10. Bảng 4.23: Kết quả khảo sát ñộ dài miễn dịch của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn sau cai sữa Hiệu giá kháng ñộc tố sau khi MD ðợt TN Số lợn TN (con) HGKðT trước MD 21 ngày 60 ngày 90 ngày 120 ngày 150 ngày Lần 1 10 1/8,5 1/192,3 1/169,5 1/100 1/83,3 1/76,9 Lần 2 10 1/8,5 1/208,3 1/158,7 1/104,2 1/90,9 1/71,4 Lần 3 10 1/8 1/181,8 1/158,7 1/90,9 1/83,3 1/71,4 Tổng hợp 30 1/8,3 1/192,3 1/161,3 1/100 1/83,3 1/71,4 Qua bảng kết quả 4.23, 4.24 và hình 4.10, nhận thấy: ðối với lợn sau cai sữa, HGKðTTB ñạt ñỉnh ñiểm 1/192,3 ở thời ñiểm 21 ngày sau tiêm vacxin, hiệu giá này giảm dần theo thời gian, ñến ngày thứ 60, 90, 120 và 150 HGKðTTB giảm lần lượt còn 1/161,3; 1/100; 1/83,3 và 1/71,4. ðối với lợn nái mang thai, cũng ở thời ñiểm 21 ngày sau tiêm, HGKðTTB ñạt ñỉnh ñiểm rất cao 1/510,2, sau ñó giảm xuống rất nhanh, 60 ngày sau miễn dịch HGKðTTB chỉ còn 1/185,2. ðến ngày thứ 90 hiệu giá kháng ñộc tố tiếp tục giảm còn 1/131,6 và sau 150 ngày chỉ còn 1/66,7. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 85 Bảng 4.24: Kết quả khảo sát ñộ dài miễn dịch của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn nái mang thai Hiệu giá kháng ñộc tố trung bình sau khi MD ðợt TN Số lợn TN (con) HGKðT trước MD 21 ngày 60 ngày 90 ngày 120 ngày 150 ngày Lần 1 10 1/40 1/476,2 1/181,8 1/128 1/90,9 1/64 Lần 2 10 1/45,5 1/588,2 1/192,3 1/137 1/100 1/71,4 Lần 3 10 1/41,7 1/476,2 1/181,8 1/128 1/83,3 1/64 Tổng hợp 30 1/41,7 1/510,2 1/185,2 1/131,6 1/100 1/66,7 Hình 4.10: Kết quả xác ñịnh ñộ dài miễn dịch của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn sau cai sữa và nái mang thai Như vậy, sau 5 tháng theo dõi diễn biến hiệu giá kháng ñộc tố trong huyết thanh của lợn ñã tiêm phòng vacxin giải ñộc tố E. coli cho thấy HGKðTTB tương ñối cao, nhất là thời ñiểm sau miễn dịch 21 ngày với cả hai ñối tượng thí nghiệm. ðối với lợn sau cai sữa sự biến ñộng hiệu giá kháng ñộc tố có trong huyết thanh giảm ñều, một cách từ từ theo thời gian theo dõi. ðối với lợn nái mang thai, sự biến ñộng về hiệu giá kháng ñộc tố trong huyết thanh nhanh hơn, nhất là trong thời gian 60 ngày ñầu (HGKðTTB giảm từ 1/510,2 xuống còn 1/185,2), ñây là giai ñoạn lợn mẹ ñang nuôi con. ðiều này có thể cho thấy mức ñộ tổn hại về sức khỏe, sức ñề kháng khi gia súc chửa, ñẻ và cho con bú. Hàm lượng kháng ñộc tố trong cơ thể nái cũng sẽ bị giảm rất lớn trong giai ñoạn này. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 86 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ những kết quả nghiên cứu trong ñề tài, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Vacxin giải ñộc tố E. coli ñạt chỉ tiêu vô trùng. 2. Liều sử dụng thích hợp - ðối với lợn con sau cai sữa: 2 ml/con, tiêm dưới da bẹn. - ðối với lợn nái mang thai: 3 ml/con, tiêm dưới da 2 lần, lần 1 trước khi ñẻ 5 - 6 tuần, lần 2 trước khi ñẻ từ 2 - 3 tuần. 3. Vacxin giải ñộc tố E. coli ñạt chỉ tiêu an toàn: - ðối với chuột bạch 18 - 20 gram với liều 0,8 ml/con. - ðối với bản ñộng vật (lợn con sau cai sữa và lợn nái mang thai từ 2 - 2,5 tháng) với liều gấp ñôi liều sử dụng. 4. Hiệu lực của vacxin ñạt tiêu chuẩn khi: - Hiệu giá giải ñộc tố trong vacxin ≥ 1/8. - Công cường ñộc tỷ lệ bảo hộ chuột 100%, lợn ≥ 80%. 5. Vacxin giải ñộc tố E. coli bảo quản ở 2 - 8°C, sau 6 tháng kể từ ngày sản xuất vẫn còn hiệu lực khi tiêm cho lợn ngoài thực ñịa. 6. Bước ñầu khảo sát ñược ñộ dài miễn dịch của vacxin cho thấy, sau 5 tháng ñược tiêm vacxin, lợn vẫn còn hiệu giá kháng ñộc tố trung bình 1/66,7. 5.2 ðề nghị Trên ñây là những kết quả bước ñầu, có tính chất nghiên cứu thực nghiệm, ứng dụng giải ñộc tố E. coli trong lĩnh vực thú y ở Việt Nam. Về khoa học còn nhiều vấn ñề tồn tại, ñề nghị: 1. Tiếp tục nghiên cứu ñể làm rõ ñối với chuột hoặc lợn nếu chỉ tiêm dịch lọc canh trùng nuôi cấy E. coli cường ñộc thì không bị bệnh. Ngược lại, nếu chuột hoặc lợn ñược tiêm hỗn hợp canh trùng trên thì bị bệnh tiêu chảy, phù mặt, phù ñầu. 2. Tiếp tục khảo sát ñộ dài miễn dịch của vacxin giải ñộc tố E. coli ñối với lợn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 87 trong thời gian dài hơn ñể xác ñịnh khả năng bảo hộ của vacxin ñối với lợn và ñưa ra khuyến cáo về thời ñiểm tiêm phòng nhắc lại. 3. Cần sản xuất thử nghiệm với số lượng vacxin giải ñộc tố E. coli lớn hơn ñể ñưa ra khảo nghiệm trên thực ñịa trước khi sản xuất ñại trà và ñưa vacxin này vào phòng bệnh tiêu chảy và sưng phù ñầu do E. coli gây ra. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. ðặng Xuân Bình, Trần Thị Hạnh (2001), Xác ñịnh vai trò của E. coli và Clostridium peringens ñối với bệnh tiêu chảy ở lợn con, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 3, tr.19 - 23. 2. ðặng Xuân Bình, Trần Thị Hạnh (2003), Khảo sát sự biến ñộng hàm lượng globulin miễn dịch trong sữa ñầu của lợn nái khi sử dụng chế phẩm sinh học phòng bệnh tiêu chảy lợn con, Khoa học kỹ thuật Thú y, tập X, (1), tr.42-49. 3. ðặng Xuân Bình (2004), Vai trò của vi khuẩn Escherichia coli và Clostridium perfringens trong bệnh tiêu chảy ở lợn con theo mẹ, các biện pháp phòng trị, Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội. 4. ðặng Xuân Bình, Trần Thị Hạnh, Lê Văn Tạo (2004), Nghiên cứu chế tạo bột kháng thể lòng ñỏ trứng gà (YP- 990 và hiệu quả ñiều trị tiêu chảy do E. coli ở lợn con theo mẹ, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr.56 - 60. 5. ðặng Xuân Bình, ðỗ Văn Trung (2008), Hiệu quả của vacxin chuồng (autovacxin) trong thử nghiệm phòng bệnh phân trắng lợn con, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 6, tr.50 - 55. 6. Tô Minh Châu, Nguyễn Ngọc Hải (1999), Bước ñầu phân lập và ñịnh danh E. coli gây bệnh phù ñầu ở lợn con sau cai sữa, Khoa học kỹ thuật nông lâm nghiệp, số 3, tr.60-63. 7. ðỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh, Nguyễn Quang Tuyên (2000), Sử dụng chế phẩm sinh học Biosubtyl ñể phòng trị bệnh tiêu chảy ở lợn con trước và sau cai sữa, Khoa học kỹ thuật Thú y, tập VII, (2), tr.58-62. 8. ðoàn Thị Kim Dung (2003), Sự biến ñổi một số vi khuẩn hiếu khí ñường ruột, vai trò của E. coli trong hội chứng tiêu chảy của lợn con theo mẹ, các phác ñồ ñiều trị, Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Viện Thú y, Hà Nội. 9. ðào Trọng ðạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ (1995), Bệnh ñường tiêu hóa ở lợn, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr.43-86. 10. Nguyễn Ngọc Hải, Tô Minh Châu, M.Carles, A.Tripodi và G.Bodin (2000), Tìm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 89 hiểu nguyên nhân của hội chứng thần kinh - phù mắt ở heo cai sữa, Khoa học kỹ thuật Thú y, tập VII, (2), tr27-35. 11. Nguyễn Ngọc Hải, Tô Minh Châu (2000), Tìm nguyên nhân của hội chứng thần kinh phù mắt ở heo sau cai sữa, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr 27 - 35. 12. Nguyễn Ngọc Hải và A.Milon (2001), Ứng dụng kỹ thuật PCR trong nghiên cứu vi khuẩn E. coli gây bệnh phù heo sau cai sữa, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr 27 - 30. 13. Nguyễn Ngọc Hải, Bùi Lưu Ly (2007), Sử dụng phương pháp PCR ñể xác ñịnh vi khuẩn E. coli gây bệnh phù ñầu, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr.39 - 43. 14. Trần Thị Hạnh, ðặng Xuân Bình (2003), Chế tạo, thử nghiệm một số chế phẩm sinh học phòng trị bênh tiêu chảy phân trắng ở lợn con do E. coli và Cl.perfringens. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr.19 - 28. 15. Trương Thị Minh Hạnh (2007), Giáo trình môn học Công nghệ dược phẩm, trường ðại học ðà Nẵng. 16. Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương (2010), Giáo trình miễn dịch học ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 17. Phạm Khắc Hiếu, Bùi Thị Tho (1996), Kết quả kiểm tra tính kháng kháng sinh của E. coli phân lập từ lợn con bị bệnh phân trắng tại các tỉnh phía Bắc trong 20 năm qua (1975 - 1995), Khoa học kỹ thuật Thú y, tập III, (4), tr.63-66. 18. Lý Liên Khai (2001), Phân lập xác ñịnh ñộc tố ruột của các chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy cho heo con, Khoa học kỹ thuật Thú y, tập VIII, (2), tr.13-18. 19. Nguyễn Viết Không và cộng sự (2008), Biến ñộng kháng thể kháng E. coli phù ñầu ở lợn chăn nuôi công nghiệp, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 3, tr.21 - 25. 20. Nguyễn Khả Ngự, Lê Văn Tạo, ðỗ Ngọc Thúy, Nguyễn Ngọc Nhiên (1999), Xác ñịnh ñộc lực và chọn chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con mắc bệnh phù ñầu, chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh, Báo cáo khoa học Chăn nuôi Thú y 1998 - 1999, Huế, tr. 440-453. 21. Nguyễn Khả Ngự (2000), Xác ñịnh các yếu tố gây bệnh của E. coli trong bệnh phù ñầu lợn con ở ñồng bằng sông Cửu Long, chế vacxin phòng bệnh, Luận án tiến sỹ nông nghiệp, Viện Thú y quốc gia. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 90 22. Sử An Ninh (1995), Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu, nước tiểu và hình thái ñại thể một số tuyến nội tiết ở lợn con mắc bệnh phân trắng, Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I Hà Nội. 23. Nguyễn Thị Nội, Vũ Ngọc Lâm, Phạm Khắc Vượng (1978), Nghiên cứu Escherichia coli trong phòng thí nghiệm. Vi trùng Escherichia coli ñộc trong bệnh lợn con ỉa phân trắng và ñộ nhiễm khuẩn của bệnh. Hiệu lực của vacxin E. coli ñối với lợn con ỉa phân trắng trong sản xuất, Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật Thú y 1968-1978, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 207-225. 24. Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh, ðỗ Ngọc Thúy (2000), Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli và Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác ñịnh một số ñặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập ñược và biện pháp phòng trị, Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật thú y 1996-2000, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 171-176. 25. Nguyễn Ngọc Phục (2005), Công tác thú y trong chăn nuôi lợn, NXB Lao ñộng - xã hội, tr.60-67. 26. Trương Quang, Chu Thị Thanh Hương, Nguyễn Thị Ngự (2007), Kết quả nghiên cứu yếu tố gây bệnh, vai trò của E. coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn nuôi gia ñình trước và sau khi xuất chuồng, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 5, tr.39 - 43. 27. Phạm Thế Sơn , Lê Văn Tạo, Cù Hữu Phú, Phạm Khắc Hiếu (2008), ðặc tính của vi khuẩn E. coli, Salmonella spp, và Cl.perfringens gây bệnh lợn con tiêu chảy, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr.73 - 77. 28. Lê Văn Tạo, Khương Bích Ngọc, Nguyễn Thị Vui, ðoàn Băng Tâm (1990- 1991), Khả năng bám dính và sản sinh kháng nguyên K88 của một số giống E. coli phân lập từ lợn con bị bệnh phân trắng, Công trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật 1990-1991, tr 82-88. 29. Lê Văn Tạo, Khương Bích Ngọc, Nguyễn Thị Vui, ðoàn Băng Tâm (1993), Nghiên cứu chế tạo vacxin cho uống phòng bệnh ỉa chảy phân trắng lợn con, Tạp chí khoa học công nghệ và quản lý kinh tế, tr.324-326. 30. Lê Văn Tạo (1995), Hiệu quả sử dụng vacxin E. coli cho uống phòng bệnh phân trắng lợn con, Nông nghiệp Công nghiệp Thực phẩm, (11), tr.432-433. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 91 31. Lê Văn Tạo (1996), Cấu trúc fimbriae, kháng nguyên bám dính K88 của vi khuẩn E. coli và vai trò của nó trong quá trình gây bệnh phân trắng lợn con, Tạp chí Nông nghiệp - công nghiệp thực phẩm, số 2 năm 1996, Hà Nội, tr.62-63. 32. Lê Văn Tạo (2006), Bệnh do vi khuẩn E. coli gây ra ở lợn, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 3, tr.75 - 84. 33. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2001), Vi sinh vật thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr.72-101. 34. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn ðường, Nguyễn Khắc Tuấn, Nguyễn Bá Hiên (2004), Vi sinh vật học ñại cương, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 35. Phạm Ngọc Thạch, Lương Thị Mai Lan, Phạm Thị Lan Huơng (2009), Bệnh phù ñầu, =cat_view&gid=48&lang=en&limitstart=5 36. Võ Thành Thìn, ðặng Văn Tuấn, Nguyễn Hữu Hưng (2009), Ứng dụng phương pháp PCR-RFLP ñể xác ñịnh các biến thể của kháng nguyên bám dính F4 và F18 của các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy lợn con, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 5, tr.26-30. 37. Bùi Thị Tho, Phạm Khắc Hiếu (1995), Tình hình kháng thuốc của E. coli (phân lập từ lợn con phân trắng) trong thời gian qua, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr. 92 - 93. 38. ðỗ Ngọc Thúy, D.Trott, A.Frost, K.Townsend, Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Âu Xuân Tuấn, Nguyễn Xuân Huyên, Văn Thị Hường, Vũ Ngọc Quý (2002), Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con tiêu chảy ở một số tỉnh phía Bắc Việt nam, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr.21-27. 39. ðỗ Ngọc Thúy, Daren Trott, Cù Hữu Phú và cộng sự (2005), Ứng dụng kỹ thuật PCR ñể xác ñịnh các yếu tố ñộc lực của E. coli gây tiêu chảy lợn con ở một số tỉnh Miền bắc Việt Nam, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 5, tr.13 - 17. 40. ðỗ Ngọc Thuý, Cù Hữu Phú, Nguyễn Tất Thành, Lê Thị Minh Hằng (2007), Tổ hợp gen của một số yếu tố gây bệnh có trong các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy cho lợn sau cai sữa tại tỉnh Phú Thọ, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr.33 - 38. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 92 41. Tiêu chuẩn quy trình ngành Thú y (2006). 42. ðoàn Xuân Trúc (2003), Sổ tay kỹ thuật chăn nuôi lợn trang trại, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr.3-4. 43. Bùi Trung Trực và cs (2004), Phân lập và ñịnh typ kháng nguyên vi khuẩn E. coli trong phân heo nái, heo con tại tỉnh Tiền Giang, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr.12 - 19. 44. Tạ Thị Vịnh, ðặng Thị Hòe (2002), Một số kết quả sử dụng các chế phẩm sinh học ñể phòng trị bệnh tiêu chảy ở lợn con, Khoa học kỹ thuật Thú y, tập IX, (4), tr.54-56. Tiếng Anh 45. Akita E.M., and S.Nakai S. (1993), Comparison of four purification methols for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain, Journal of Immunological methols, (160), pp.207-214. 46. B. Nagy, I.A. Casey, S.C. Whipp, H.W. Moon (1998), Pili and adhesiveness of porcine post weaning enterotoxigenic and verotoxigenic Escherichia coli. p. 20-241. 47. Biehl L.G., and Hoefling D.C. (1986), Diagnosis and treatment of diarrhea in 7 to 14 day old pigs, J. Am. Vet. Assoc., (188), pp.1144-1146. 48. Cavalieri S.J, Snynder I.S. (1982), Cytotoxin activity of a partially purifield Escherichia coli alpha - haemolysin, J. Med. Microbiology, (15), pp.11-21. 49. Choi B.K., and Schifferli D.M. (2001), Characterization of FasG segments required for 987P fimbria-mediated binding to piglets glycoprotein receptors, Infect. Immun., (69), pp. 6625-6632. 50. Cox E., Houvenagel A. (1993), Comparison of the invitro adhesion of K88, K99, F41 and 987P positive Escherichia coli to intestinal villi of 4 to 5 week old pigs, Vet. Microbiol., (34), pp.7-18. 51. Fairbrother J.M., Bestchinger H.U., Nielsen O.N., Pohlenz J.F. (1992), Escherichia coli infections, diseases of swine, Seventh Edition. Wolfe publishing Ltd - Australian 1992, pp.489-497. 52. Fekete P.Z., Gerardin J., Jaccquemin E., Mainil J.G., Nagy B. (2002), Replicon typing of F18 fimbriae encoding plasmids of enterotoxigenic and verotoxigenic Escherichia coli strains from porcine post-weaning diarrhoea and oedema Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 93 disease, Vet. Microbiol., (85), pp.275-284. 53. Francke S., Harmsen D., Caprioli A., Pierrard D., L.H., Karch H. (1995), Clonal relatedness off Shiga-like toxin producing Escherichia coli O101 strains of human and porcine origin, J. Clin. Microbiol., (33), pp.3174–3178. 54. Frydendahl F., (2002), Prevalence of serogroups and virulence genes in E. coli associated with postweaning diarrhoea and edema disease in pigs and a comparison of diagnostic approaches, Vet. Microbiol., (85), pp.169-182. 55. H. Imberechts, P. Deprez, E. Van Driessche and P. Pohl. (1997), Chicken egg yolk antibodies against F18ab fimbriae of Escherichia coli inhibit shedding of F18 positive E. coli by experimentally infected pigs, Veterinary Microbiology., (54), pp.329-341. 56. Holm A., and Poulsen H.D. (1996), Swine nutrition management update: ZinC oxide in treating E. coli diarrhea in pigs after weaning, Compend. Cont. Educ. Pract. Vet., (18), pp.8. 57. Imberchechts H.U.; Bertshingger R. (1994), Prevalence of F107 fimbriae on Escherichia coli isolated from pigs with Oedema disease or post weaning diarrhea, Veterinary Microbiology 40, p. 219-230. 58. Jacobs A.A.C. and de Graaf F.K. (1985), Production of K88, K99 and F41 fimbriae in relation to growth phage and rapid procedure for adhesion purification, FEMS. Micribiol, Lett., (26), pp.15-19. 59. Khan A.S., Johnston N.H., Goldfine H. and Schifferli. (1996), Porcine 987P glucolipid receptors on intestinal brush borders and their cognate bacterial ligands, Infect. Immun., (64), pp.3688-3693. 60. Konowalchuk J., Speirs J.I., Stavric S. (1977), Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli, Infect. Immun., (18), pp.775-779. 61. Kwon D., Choi C., Jung T., Chung H.K., Kim J.P., Bae S.S. (2002), Genotypic prevalence of the fimbrial adhesins (F4, F5, F6, F41 and F18) and toxin (LT, STa, STb, and Stx 2e) in Escherichia coli isolated from postweaning pigs with diarrhoea or oedema disease in Korea, Vet. Red., (12), pp.35-37. 62. Mooi F.R., Wouters C., Wijfjes A., de Graaf F.K. (1982), Construction and characterization of mutants impaired in the biosynthesis of the K88ab antigen, J. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 94 Bacteriol., (150), pp.512-521. 63. Nagy B., Fekete P.Z. (1999), Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in farm animals, Vet. Res., (30), pp. 259 - 284. 64. Pohl P., Mainil J. (1995), F17 positive Escherichia coli, Vet. Rec., (137), pp.623-624. 65. Sarrazin E., and Bertschinger H.U. (1997), Role of fimbriae F18 for actively acquired immunity against porcine enterotoxigenic Escherichia coli, Vet. Microbiol., (54), pp.133-144. 66. Simons B.L., Mol O., van Breemen J.F.L., Oudega B. (1994), Morphological appearance of K88ab fimbriae and optical diffraction analysis of K88 paracrystalline structures, FEMS. Microbiol. Lett., (118), pp.83-88. 67. Smith H.W. (1963), The haemolysisns of Escherichia coli, J. Pathol. Bacterial., pp.197-212. 68. Bacterial endotaxins. diseases/protein toxins 69. E. coli adherence factors. coli.bham.ac.uk/path/adher.html 70. E. coli research. 71. E. coli serotupes. 72. E. coli toxins. 73. Endotoxins. diseases/protein toxins 74. Escherichia coli in diarrheal diseaser. 75. Hemolytic E. coli and Edema disease. 76. Microbiologists battle E. coli. coli.html 77. Pathogenic Escherichia coli. 78. Protein toxins. diseases/protein toxins 79. Toxine. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 95 Ghi chó: S¬ ®å chÕ t¹o vacxin gi¶i ®éc E. coli - NhiÖt ®é - HiÖu gi¸ KN - CFU - V« trïng - An toµn - HiÖu gi¸ KN - V« trïng - An toµn - HiÖu lùc - C¶m quan - L−u mÉu Gièng vi khuÈn E.coli ®éc - ThuÇn khiÕt - Tiªu chuÈn gièng Gièng gièng s¶n xuÊt Nguyªn liÖu chÕ t¹o m«i tr−êng Tinh khiÕt - Pha chÕ - Khö trïng M«i tr−êng s¶n xuÊt - V« trïng - Hãa häc - VËt lý - Nu«i cÊy - DiÖt trïng B¸n thµnh phÈm T¸ d−îc - Pha chÕ - V« trïng Phèi trén, san lÎ b¶o qu¶n Chai, nót sao su Nót nh«m, c¸c dông cô kh¸c V« trïng Phßng b¶o qu¶n tr−íc kiÓm nghiªm KiÓm nghiÖm NhËp kho thµnh phÈm §−îc phÐp xuÊt x−ëng Hñy §¹t Kh«ng ®¹t ThuÇn khiÕt Phèi trén, ly t©m, läc D¸n nh·n C¸c c«ng viÖc thùc hiÖn C¸c chØ tiªu cÇn kiÓm tra ._.