Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh học và bảo tồn tinh dịch chó Berger

ch dẫn trong luận văn đã chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Lê Thị Huệ Lời cảm ơn Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận được sự hướng dẫn trực tiếp của Thầy hướng dẫn: TS. Đỗ Văn Thu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới sự chỉ bảo tận tình của Thầy. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tơi toàn bộ các thầy cô thuộc khoa Thú y – Trường ĐHNN Hà Nội, những người trực tiép truyền dạy cho tôi những kiến thức cơ bản, bổ ích trong suốt quả trình tôi học tập tại khoa. Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Sinh học tế bào sinh sản, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ (C32)- Bộ Công an. Xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè, đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày tháng năm Mục lục STT Trang 1. Mở đầu 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích nghiên cứu 3 2. Tổng quan nghiên cứu 4 2.1. Tình hình phát triển và sử dụng chó nghiệp vụ ở Việt Nam 4 2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 6 2.3. Một số đặc điểm sinh học tinh dịch chó Berger 7 2.4. Môi trường pha loãng và đông lạnh tinh dịch chó 16 2.5. Sơ lược về quá trình giao phối và phóng tinh 23 3. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 25 3.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 25 3.2. Nội dung nghiên cứu 25 3.2.1 Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch và các yếu tố ảnh hưởng lên phẩm chất tinh dịch 25 3.2.2. Pha loãng, bảo tồn tinh dịch chó ở 50C 26 3.2.3 Đông lạnh tinh dịch chó ở - 1960C 26 3.2.4. Thụ tinh nhân tạo chó 26 3.3. Phương pháp nghiên cứu 26 4. Kết quả và thảo luận 46 4.1. Sinh học tinh dịch chó và các yếu tố ảnh hưởng 46 4.2. Pha loãng, bảo tồn tinh dịch chó ở 50C 57 4.3. Đông lạnh tinh dịch chó ở - 1960C 68 4.4. Thụ tinh nhân tạo chó 74 5. Kết luận và đề nghị 78 5.1. Kết luận 78 5.2. Đề nghị 79 Tài liệu tham khảo 80 Danh mục các bảng Bảng 1 Một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch chó Berger 46 Bảng 2 Tính chất lý hóa của tinh dịch chó Berger 52 Bảng 3 ảnh hưởng của mùa vụ lên chất lượng tinh dịch 54 Bảng 4 ảnh hưởng của chu kỳ khai thác lên phẩm chất tinh dịch 56 Bảng 5 ảnh hưởng của môi trường pha loãng lên phẩm chất tinh dịch trong quá trình bảo tồn 58 Bảng 6 ảnh hưởng của nhiệt độ bảo tồn lên phẩm chất tinh dịch 60 Bảng 7 ảnh hưởng của tỷ lệ lòng đỏ trứng gà trong môi trường lên phẩm chất tinh dịch 62 Bảng 8 ảnh hưởng của một số loại đường trong môi trường lên phẩm chất tinh dịch 64 Bảng 9 So sánh ảnh hưởng của glycerol và Dimethyl sulfoxide lên phẩm chất tinh dịch 67 Bảng 10 ảnh hưởng của thời gian cân bằng tinh dịch trước đông lạnh lên phẩm chất tinh dịch đông lạnh 69 Bảng 11 ảnh hưởng của thời điểm bổ sung glycerol lên chất lượng tinh dịch đông lạnh 71 Bảng 12 ảnh hưởng của tốc độ giải đông lên phẩm chất tinh đông lạnh 72 Bảng 13 Kết quả thụ tinh nhân tạo bằng tinh bảo tồn dạng lỏng ở 5 0C 75 Bảng 14 Kết quả thụ tinh nhân tạo bằng tinh đông lạnh 77 1. Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Từ lâu chó là động vật gần gũi, thân thiện với con người và được con người nuôi dưỡng thuần hóa, là con vật thông minh hiểu ý và trung thành với chủ. Ngoài ra chó còn có những khả năng đặc biệt mà các loài vật khác không có: mắt có khả năng nhìn xuyên trong bóng tối, mũi có khả năng phân biệt 19000 mùi khác nhau. Chính vì thế mà ngày nay một số giống chó đã được huấn luyện, biệt hóa để trở thành chó nghiệp vụ phục vụ trong công tác an ninh, quốc phòng. Năm 1960 chúng ta đã xây dựng đàn chó nghiệp vụ từ các nguồn giống nhập và lai tạo. Hiện nay có 5 giống chó ngoại (chó Berger, Cocker, Rottweiler, Bốc sơ và Labrador) được sử dụng vào công tác nghiệp vụ của ngành Công an và Quân đội. Hai giống chó đang được sử dụng nhiều và có khả năng nhất là chó Berger Việt Nam và chó Cocker (Tây Ban Nha). Giống chó Berger Việt Nam là con lai hỗn hợp từ chó Berger Trung Quốc (được nhập từ những năm 1960), Berger Liên Xô và CHDC Đức (nhập từ những năm 1970, 1980). Đây là hai giống chó chủ lực, được huấn luyện trang bị cho các đơn vị, quản lý sử dụng chó nghiệp vụ của Công an các tỉnh, thành phố và các cơ sở giam giữ thuộc ngành Công an và các đồn biên phòng. Giống chó này hiện tại ở nước ta có hàng mấy nghìn con được nuôi tại Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ của Bộ Công an và trường D24 Bộ đội biên phòng. Tại Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ có một đàn chó tương đối thuần, nhưng số lượng rất ít. Trong khu vực nhân dân, chúng khá phổ biến và được nuôi dưỡng dùng trong việc bảo vệ và làm kinh tế, nhưng lai tạp khá nhiều và không được chọn lọc do việc nhân giống tự phát. Chó Cocker (Tây Ban Nha) được nhập từ Liên Xô, Cu-ba trong những năm 1980, thường sử dụng vào mục đích huấn luyện để phát hiện hơi đặc định (ma tuý và chất nổ). Đây là giống chó dễ nuôi, tính thích nghi cao, dễ phát triển. Cũng như giống chó Berger, do việc nhân giống tự phát, cho nên đàn chó Cocker đang có nguy cơ bị thoái hoá và tạp pha. Tuy đàn chó Berger và Cocker có số lượng lớn, nhưng do chưa có một hệ thống nhân giống theo quy hoạch, do đó đã làm mất đi những đặc điểm, khả năng vốn có của giống chó nghiệp vụ. Mặc dù chó nghiệp vụ có vai trò lớn trong việc giữ gìn an ninh, quốc phòng nhưng do số lượng còn ít vì đa số các giống chó nghiệp vụ đều nhập giống từ nước ngoài và giá thành nhập nội từ 5000USD - 8000USD. ở Việt Nam, hiện nay mạng lưới thụ tinh nhân tạo bằng tinh pha loãng bò, lợn, trâu, ngựa,… đã phổ biến trên toàn quốc, ngoài ra chúng ta đã xây dựng được ngân hàng tinh đông lạnh phục vụ cho công tác thụ tinh nhân tạo và lưu giữ gen quí. Bởi vậy, việc nghiên cứu để nhân giống chó nghiệp vụ là một việc cần thiết và cấp bách. Vấn đề đặt ra là cần có những biện pháp cụ thể để nhân giống, lai tạo giống chó. Thụ tinh nhân tạo là phương pháp tối ưu để sử dụng có hiệu quả đực giống tốt, có khả năng di truyền cao, nhằm cải tạo giống, giảm số lượng đực giống, cùng với công nghệ gen di truyền, thụ tinh nhân tạo đã đưa được công nghệ sinh sản đạt đến đỉnh cao. Nghiên cứu đặc điểm sinh học tinh dịch là cơ sở khoa học để đánh giá chất lượng tinh dịch, từ đó giúp xác định pha loãng bảo tồn tinh đạt chất lượng cao. Chỉ khi nào tinh dịch có chất lượng tốt mới đưa vào pha loãng bảo tồn và đông lạnh. Nếu biết được lượng tinh dịch, nồng độ, hoạt lực, sức sống, kỳ hình, kỳ hình acrosome của tinh dịch thì có thể xác định được tỷ lệ pha loãng thích hợp. Hiện nay, ở nước ta việc thụ tinh nhân tạo và đông lạnh tinh dịch chó còn là vấn đề mới và ít được quan tâm, kể cả các Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ vẫn sử dụng hình thức phối tự nhiên, trong khi đó thì thế giới đã có từ lâu. Để tạo ra được chó nghiệp vụ có phẩm giống tốt, đồng thời lưu giữ bảo tồn được quỹ gen quí của các giống chó nghiệp vụ chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh học và bảo tồn tinh dịch chó Berger” 1.2. Mục đích nghiên cứu - Xác định một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch chó Berger làm cơ sở khoa học để đánh giá phẩm chất tinh dịch và tuyển chọn đực giống. Bảo tồn tinh dịch chó. Thụ tinh nhân tạo chó nghiệp vụ. 2. tổng quan nghiên cứu 2.1. Tình hình phát triển và sử dụng chó nghiệp vụ ở Việt Nam Năm 1960 chúng ta đã xây dựng đàn chó nghiệp vụ từ các nguồn giống nhập và lai tạo. Hiện nay, chúng ta có 5 giống chó ngoại được sử dụng vào công tác nghiệp vụ của ngành Công an và Quân đội (chó Berger, Cocker, Rottweiler, Bốc sơ và Labrador). Hai giống chó đang được sử dụng nhiều và có khả năng nhất là chó Berger Việt Nam và chó Cocker (Tây Ban Nha) Giống chó Berger Việt Nam là con lai hỗn hợp từ chó Berger Trung Quốc (được nhập từ những năm 1960), Berger Liên Xô và CHDC Đức (nhập từ những năm 1970, 1980). Đây là hai giống chó chủ lực, được huấn luyện trang bị cho các đơn vị, quản lý sử dụng chó nghiệp vụ của công an các tỉnh, thành phố và các cơ sở giam giữ thuộc ngành Công an và các đồn biên phòng, cửa khẩu của lực lượng Bộ đội biên phòng. Giống chó này hiện tại ở nước ta có tới hàng mấy nghìn con được nuôi tại Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ của Bộ Công an, trường D24 Bộ đội biên phòng. Ngay từ những năm đầu chúng ta đã tiến hành giữ giống thuần, lai tạo cho sinh sản và phát triển. Cho tới nay, chúng đã có ngoại hình, thể chất và năng lực làm việc không kém so với giống gốc ban đầu, chúng đã thích nghi tốt trong điều kiện khí hậu, nuôi dưỡng ở nước ta và đã có những thành tích xuất sắc trong phục vụ chiến dấu. Tại Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ có một đàn chó tương đối thuần, nhưng số lượng rất ít. Trong khu vực nhân dân, chúng khá phổ biến và được nuôi dưỡng dùng trong việc bảo vệ và làm kinh tế, nhưng lai tạp khá nhiều và không được chọn lọc do việc nhân giống tự phát. Chó Cocker (Tây Ban Nha) được nhập từ Liên Xô, Cu-ba trong những năm 1980, thường sử dụng vào mục đích huấn luyện để phát hiện hơi đặc định (ma tuý và chất nổ). Đây là giống chó dễ nuôi, tính thích nghi cao, dễ phát triển. Cũng như giống chó Berger, do việc nhân giống tự phát, cho nên đàn chó Cocker đang có nguy cơ bị thoái hoá và tạp pha. Tuy đàn chó Berger và Cocker có số lượng lớn, nhưng do chưa có một hệ thống nhân giống theo quy hoạch, việc nuôi dưỡng tự phát, do đó đã làm mất đi những đặc điểm, khả năng vốn có của giống chó nghiệp vụ. Chó nghiệp vụ hiện đang sử dụng tại Bộ Công an, không có nguồn gốc từ Việt Nam mà được nhập từ Nga, Đức, Cuba và Trung Quốc (với giá 5000 - 8000 USD/con). Các giống chó này đang được bảo tồn và phát triển tại Việt Nam, đã và đang được sử dụng trong các lĩnh vực bảo vệ, truy tìm dấu vết hơi, phát hiện ma tuý. Hàng năm chúng thực hiện trên 10.000 nhiệm vụ khác nhau. Hiện nay, chúng ta đã sử dụng chó nghiệp để vụ kiểm tra, phát hiện chất ma tuý tại cửa khẩu Tân Sơn Nhất (Quang Khải, 2004). Tuy chó nghiệp vụ có vai trò rất lớn trong công tác an ninh, quốc phòng, truy tìm ma túy, nhưng vì số lượng chó còn ít nên chỉ đáp ứng được cho cấp tỉnh và thành phố. Bộ Công an đã có kế hoạch trang bị chó nghiệp vụ tới cấp huyện nhưng khó khăn hiện nay là sự khan hiếm về con giống. Sử dụng chó nghiệp vụ là một biện pháp công tác quan trọng của công tác bảo vệ an ninh trật tự và luôn được thể hiện trong các chỉ đạo của ngành Công an xuyên suốt lịch sử công tác, chiến đấu của ngành. Cụ thể: chỉ thị số 312/CT- BNV ngày 18/6/1982 về việc tăng cường hiệu quả công tác nuôi dạy và sử dụng chó nghiệp vụ; Chỉ thị số 13/CT- BNV ban hành kèm theo quyết định số 178/QĐ- BNV ngày 29/9/1992 về việc tăng cường hiệu quả công tác huấn luyện, sử dụng chó nghiệp vụ trong lực lượng Công an nhân dân; và gần đây là chỉ thị số 09/CT- BCA(C12) ban hành kèm theo quyết định số 564/QĐ- BCA (C12) của Bộ trưởng Bộ Công an ngày 16/6/2004 về tăng cường hiệu quả công tác quản lý, sử dụng chó nghiệp vụ trong lực lượng Công an nhân dân. Trong đó đặc biệt nhấn mạnh các nội dung: - Xác định chó nghiệp vụ là một công cụ hỗ trợ quan trọng trong công tác đấu tranh ngăn chặn và phòng chống tội phạm của lực lượng Công an nhân dân. - Quản lý sử dụng chó nghiêp vụ là một nhiệm vụ của công tác Công an. - Định hướng phát triển đến năm 2010: phải đảm bảo Công an các tỉnh, thành phố trực thuộc trung ương, các đơn vị của Bộ, các trại giam đều được trang bị chó nghiệp vụ. Thời gian vừa qua, có một số công ty của nước ngoài (Cộng hoà Pháp, Cộng hoà Liên Bang Đức, Liên bang Nga) khi thăm Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ đã đạt vấn đề bảo tồn tinh dịch và thụ tinh nhân tạo cho chó nghiệp vụ, nhưng vẫn chưa thực hiện được. Vì vậy việc nghiên cứu bảo tồn tinh dịch và thụ tinh nhân tạo đối với chó nghiệp vụ là việc làm cần thiết. Với vai trò quan trọng của chó nghiệp vụ, các nhà khoa học trên thế giới đã quan tâm đến nhiều lĩnh vực như chăm sóc, nuôi dưỡng, huấn luyện và đặc biệt là công tác giống và bảo tồn nguồn gen các giống chó quý. Trong thời gian vừa qua, Viện Công nghệ Sinh học đã được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài: “Nghiên cứu công nghệ bảo tồn tinh dịch và thụ tinh nhân tạo chó nghiệp vụ của ngành Công an”. Kết quả của đề tài đã bảo tồn được tinh dịch ở dạng pha loãng và đông lạnh, thành công trong thụ tinh nhân tạo chó góp phần phát triển đàn chó có chất lượng cao phục vụ cho công tác an ninh và Quốc phòng. 2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Hiện nay trên thế giới có hơn 400 giống chó khác nhau (Youko, 1999), tuy nhiên quân đội và công an các nước chỉ sử dụng một số giống chó nhất định cho công tác huấn luyện để sử dụng làm chó nghiệp vụ cho các công tác đặc thù như: xác định nguồn hơi cá nhân (mùi người), công tác bảo vệ (dùng chó để tấn công), xác định hơi (tìm ma tuý, thuốc nổ, ...), công tác truy tìm, cứu hộ. Một số nước như Trung Quốc, Nga, Đức, Canada đã trang bị chó nghiệp vụ đến cấp huyện (Nghiêm Xuân Dũng, 2003). Năm 1991, do lo ngại các tổ chức khủng bố tấn công vào các cơ sở của mình khi xẩy ra cuộc chiến tại Vùng Vịnh, cơ quan tình báo Trung ương Mỹ (CIA) quyết định thành lập lực lượng chó nghiệp vụ có số mã hiệu K-9. Các con chó này được huấn luyện để phát hiện chất nổ (chó biết cách ngửi, phân loại và phát hiện đến 19.000 mùi chất nổ). Mũi chó có thể nhậy cảm gấp ngàn lần so với mũi con người, chính nhờ khả năng đặc biệt này mà chó nghiệp vụ có thể hoàn thành tốt nhiệm vụ phát hiện chất nổ. Bên cạnh việc canh gác và bảo vệ các cơ sở chính của CIA, trong trường hợp cần thiết, K-9 còn thực hiện nhiệm vụ cùng với các lực lượng bảo vệ pháp luật khác trên lãnh thổ nước Mỹ như cơ quan bài trừ ma tuý, lực lượng đặc nhiệm chống khủng bố Liên bang, lực lượng cảnh sát kiểm tra giao thông đường bộ (theo Excelsior, 2003). Gần đây các nhà khoa học Nhật Bản đã phát hiện thấy chó có khả năng dự báo động đất. Người ta nhận thấy trước khi xảy ra động đất khoảng một tháng thì chó sống trong vùng động đất và vùng xung quanh sủa rất nhiều. Trong chiến tranh thế giới lần thứ hai, Hồng Quân Liên Xô đã thành lập sư đoàn quân khuyển để tấn công xe tăng của bọn phát xít Đức trong điều kiện con người không thể làm được, kết quả đã tiêu diệt được trên 300 xe tăng của địch 2.3. Một số đặc điểm sinh học tinh dịch chó Berger Tinh dịch gồm 2 phần: tinh trùng chiếm 3 - 5% và tinh thanh chiếm 95 - 97%. - Tinh trùng được sinh ra từ ống sinh tinh ở dịch hoàn và được giữ lại ở mào tinh. - Tinh thanh gồm rất nhiều các chất hoá sinh học như: đường, axit hữu cơ, các chất hoàn nguyên, các loại mỡ và các kim loại,... Tinh thanh do các tuyến sinh dục phụ tiết ra. Dịch tiết của mỗi tuyến có chức năng và thành phần hoá học khác nhau: Dịch tiết của tuyến củ hành trong suốt, pH trung tính, có tác dụng chủ yếu để bôi trơn niệu đạo trước khi phóng tinh. Tuyến tinh nang tiết ra dịch tiết màu trắng có chứa enzym Vegikilasa, tạo thành các búi lớn hơn gọi là keo phèn có tác dụng nút cổ tử cung trong quá trình giao phối trực tiếp. Nhưng trong thụ tinh nhân tạo, ta phải loại bỏ keo phèn càng nhanh càng tốt vì nó làm cho tinh trùng bị kết dính. Ngoài ra, còn có đường (fructose, sorbitol), axit béo, một số enzym khác giúp quá trình ôxi hoá cung cấp năng lượng, dinh dưỡng cho tinh trùng. Trong dịch tiết này còn có cả đệm phosphate và carbonate là hợp chất quan trọng vì chúng giữ pH tinh dịch được ổn định. Tuyến tiền liệt tiết ra dịch tiết có tác dụng trung hoà độ axit có trong cơ quan sinh dục, niệu đạo con cái khi động dục, và H2CO3 do quá trình trao đổi chất của tinh trùng tạo ra khi vào cơ quan sinh dục con cái. Dịch tiết của tuyến gồm nhiều protein trung tính không trong suốt. 2.3.1. Hình thái tinh trùng Tinh trùng của động vật có hình thái khác nhau đặc trưng và ổn định theo loài, có nghĩa là mỗi loài gia súc, tinh trùng của chúng khác nhau. Hình thái của tinh trùng chó có hình con nòng nọc, gồm 3 phần: đầu, cổ và đuôi. Phần đuôi được chia làm 3 phần nhỏ: trung đoạn, đuôi chính và đuôi phụ. Theo Trần Tiến Dũng và cộng sự (2002) [2] kích thước của các phần như sau: Đầu dài: 6,5m; rộng: 4m; dày: 1,5m; cổ thân dài: 10m; đuôi: 40-50m; dài tổng số là: 55-65m Phần đầu được tạo thành chủ yếu do nhân tế bào. Đầu dẹt, có hình quả trứng, chứa AND liên kết với protein, được bao bọc bởi lớp màng, đỉnh đầu có xoang acrosom, bên trong xoang chứa nhiều enzym: Hyaluroridaza, acrosin, proteaza, axit phosphataza,... có tác dụng phá vỡ màng phóng xạ trong quá trình thụ tinh. Xoang này rất dễ bị bong ra do nhiệt độ, áp suất, pH,... Nhân chiếm 76,7 – 80,3% (về thể tích) phần đầu, nhân là kho duy nhất chứa mật mã di truyền của đời trước. Cổ là phần để nối lỏng lẻo với phần đầu, điều này phù hợp với mục đích nhất định trong quá trình thụ tinh khi xâm nhập vào trứng thì cổ gãy và đuôi rời ra. Nhưng vì thế mà cổ tinh trùng dễ bị đứt bởi tác động cơ giới, nhiệt độ, hóa chất, dẫn đến giảm tỷ lệ thụ tinh hoặc tinh trùng không còn khả năng thụ tinh. Phần đuôi được bao bọc bởi màng chung của tinh trùng. Đoạn đuôi được tạo bởi những sợi (dây) ở chính giữa có 2 sợi, xung quanh có 9 sợi fibrin nhỏ, xếp theo những vòng tròn đồng tâm, ở phần trên xếp mau hơn, to hơn và chúng được duỗi ra ở phần đuôi thành chùm tơ đuôi. Chùm tơ đuôi không có màng bao bọc, chúng được hoạt động tự do như mái chèo giúp tinh trùng hoạt động. 2.3.2. Thể tích tinh dịch Lượng tinh dịch là số ml hỗn hợp tinh trùng và tinh thanh do tuyến sinh dục phụ tiết ra trong 1 lần lấy tinh (ml/lần) theo Trần Tiến Dũng và cộng sự 2002 [2]. Theo Salisbury (1987) ( Dẫn từ Đỗ Văn Thu (2001) [4] ) lượng tinh dịch là chỉ tiêu kiểm tra đánh giá chất lượng tinh trùng trong thụ tinh. Theo Dương Đình Long (1996) [3] lượng tinh dịch là chỉ tiêu về số lượng nhưng có ý nghĩa rất quan trọng về mặt sinh học, kỹ thuật và kinh tế. Lượng tinh dịch có liên quan tới khả năng thụ thai vì nó có liên quan đến số lượng và chất lượng tinh trùng. Lượng tinh dịch còn phụ thuộc vào tuổi, với chó nghiệp vụ, những chó khoảng 1-3 năm tuổi thì lượng tinh thu được cao hơn so với những con chưa thành thục về tính hay những con già yếu. Theo Corteel (1977) ( Dẫn từ Đỗ Văn Thu (2001) [5] ) cho rằng lượng tinh dịch xuất ra còn chịu ảnh hưởng của phương pháp lấy tinh. Lấy tinh bằng kích thích xung điện cho lượng tinh nhiều hơn lấy tinh bằng âm đạo giả. Lượng tinh nhiều hay ít còn phụ thuộc vào tính dục con đực và dụng cụ lấy tinh như: nhiệt độ, áp lực,... Mùa vụ thời tiết ảnh hưởng đến lượng tinh dịch của đực giống, nó thể hiện quan hệ giữa ngoại cảnh và cơ năng tuyến sinh dục vì ảnh hưởng đến hàm lượng của nội tiết tố. Vào mùa sinh sản, lượng tinh dịch của chó cao hơn mùa không sinh sản (theo Chemineau (1991) [9]; EvansG (1987) [10]). Điều này có thể giải thích là do trong mùa sinh sản lượng Testosteron tăng kích thích các tuyến sinh dục phụ tiết tinh thanh. Ngoài ra, lượng tinh dịch còn chịu ảnh hưởng của chế độ quản lý, nuôi dưỡng,... 2.3.3. Hoạt lực tiến thẳng Hoạt lực tinh trùng là chỉ sự vận động tiến thẳng của tinh trùng, đây là chỉ tiêu kiểm tra thường xuyên và là chỉ tiêu chất lượng của tinh dịch. Hoạt lực tinh trùng càng cao thì chất lượng tinh dịch càng tốt. Đỗ Văn Thu (2001) [4], chứng minh sức sống của đời sau phụ thuộc vào sức sống của tinh trùng, tinh trùng có sức sống tốt thì khả năng sinh trưởng phát dục, sức đề kháng với bệnh tật,... của đời sau cao. Hoạt lực của tinh trùng là đặc điểm cơ bản của tinh trùng, chúng có liên quan đến khả năng thụ tinh của tinh trùng. Theo Corteel (1977) (Dẫn từ Đỗ Văn Thu (2001) [5]) tinh trùng có hoạt lực tốt thì tỷ lệ thụ tinh cao. Hoạt lực tinh trùng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nội, ngoại cảnh như: nhiệt độ, môi trường, độ ẩm môi trường, giống, lứa tuổi,... Nhiệt độ môi trường thích hợp để tinh trùng vận động là 35 - 370C. Nếu nhiệt độ cao thì làm cho tinh trùng bị chết, nhiệt độ thấp thì hoạt lực của tinh trùng giảm thậm chí là ngừng hoạt động, đây là cơ sở để bảo tồn và đông lạnh tinh dịch chó. Theo Chemineau. and Caynie (1991) [9]; Evans (1987) [10], ở động vật hoạt động sinh sản diễn ra theo mùa, vì vậy vào mùa sinh sản hoạt lực của tinh trùng cao hơn hẳn so với hoạt lực tinh trùng của mùa không phải là mùa sinh sản. 2.3.4. Nồng độ tinh trùng Nồng độ tinh trùng là chỉ tiêu đánh giá chất lượng và số lượng của tinh dịch. Salisbury (1987) (Dẫn từ Đỗ Văn Thu (2001) [4]) cho rằng nồng độ tinh trùng là chỉ tiêu quan trọng trong thực tiễn TTNT, nó liên quan mật thiết với tỷ lệ thụ thai và số con đẻ ra. Nồng độ tinh trùng liên quan mật thiết và thường tỷ lệ thuận với hoạt lực tiến thẳng và hoạt tính của enzym dehydrogenase. Hazop (1945) (Dẫn từ Đỗ Văn Thu (2001 [5]) cho rằng nồng độ và sức kháng của tinh trùng là những chỉ tiêu có ý nghĩa cho khả năng thụ tinh của tinh trùng, vì vậy để có được tinh dịch thích hợp cần phải lưu ý tới hai chỉ tiêu này. Theo Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Quốc Đạt (1997) [1] chứng minh rằng nồng độ là tham số cần thiết giúp ta quyết định tỷ lệ pha loãng tinh nguyên với môi trường bảo tồn và định liều phối thụ tinh nhân tạo. Nồng độ tinh trùng trong tinh pha loãng có ảnh hưởng đến kết quả bảo tồn tinh dịch. Corteelz (1977) (Dẫn từ Đỗ Văn Thu (2001 [5]); Dương Đình Long (1996) [3] cho rằng lượng tinh dịch tỷ lệ nghịch với nồng độ tinh trùng. Nghĩa là lượng tinh dịch lớn thì nồng độ tinh trùng giảm. Nồng độ tinh trùng là chỉ tiêu về sức sản xuất sinh học nên phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Nồng độ tinh trùng cao hay thấp phụ thuộc vào khoảng cách lấy tinh, Chemineau và caynie (1991) [9] nhận thấy khoảng cách giữa hai lần lấy tinh là một ngày cho nồng độ tinh trùng (180 triệu/ml) thấp hơn so với khoảng cách là trên hai ngày (220 triệu/ ml). Theo Đỗ Văn Thu thì nồng độ tinh trùng của chó nghiệp vụ chịu ảnh hưởng của phương pháp lấy tinh, tần số phối giống và chế độ chăm sóc nuôi dưỡng,..., sự thay đổi mùa vụ lấy tinh có ảnh hưởng đến nồng độ tinh trùng. Trong mùa sinh sản, nồng độ tinh trùng loãng, không phải mùa sinh sản thì nồng độ tinh trùng cao. Khi nghiên cứu về nồng độ tinh trùng Corteel (1977) (Dẫn từ Đỗ Văn Thu (2001 [5]) cho rằng các giống khác nhau cho nồng độ tinh trùng khác nhau và trong cùng một giống, cùng một lứa tuổi nhưng cá thể khác nhau cho nồng độ tinh trùng khác nhau. Ngoài ra, nhiệt độ, độ ẩm, lứa tuổi,... đều ảnh hưởng tới nồng độ tinh trùng . 2.3.5. Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần xuất tinh là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng đực giống. Theo Corteel (1977) (Dẫn từ Đỗ Văn Thu (2001 [5]) thì V.A.C thay đổi theo mùa vụ lấy tinh, ở mùa sinh sản thì V.A.C cao hơn mùa không sinh sản. Ngoài ra, giống khác nhau cho V.A.C khác nhau. Tình trạng sức khoẻ, tuổi con vật cũng ảnh hưởng đến chỉ số V.A.C Một đực giống tốt nếu như chỉ số V.A.C cao. Shamsuddin (1997) (Dẫn từ Đỗ Văn Thu (2001) [4] ) cho rằng tổng số tinh trùng trong mỗi lần lấy tinh khác nhau nhiều giữa lần lấy tinh thứ nhất so với lần lấy tinh thứ hai, nếu khoảng cách giữa hai lần lấy tinh là 20 phút. Khoảng cách hai lần lấy tinh là một ngày cho chỉ tiêu V.A.C thấp hơn khoảng cách lấy tinh là hai ngày trở lên. Lấy tinh bốn lần trong một tuần sẽ làm giảm V.A.C, lấy tinh hai lần trong một tuần là hợp lý. 2.3.6. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình Tinh trùng kỳ hình là những tinh trùng có hình dạng khác thường so với tinh trùng bình thường. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình là chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh dịch và là chỉ tiêu có tính định lượng. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình cao thì chất lượng tinh dịch kém. Tinh trùng kỳ hình có ảnh hưởng xấu đến khả năng thụ thai. Chỉ những tinh trùng khoẻ mạnh có hình dạng bình thường mới tham gia vào quá trình thụ tinh. Tinh trùng kỳ hình không tham gia vào quá trình thụ tinh, vì nó liên quan đến khả năng phá màng phóng xạ của tế bào trứng. Tinh dịch có tỷ lệ tinh trùng kỳ hình dưới 20% mới sử dụng trong TTNT hay sử dụng đực giống trong giao phối tự nhiên. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình cao trong mỗi lần phóng tinh là triệu chứng có liên quan đến sự rối loạn trong quá trình sinh tinh, trạng thái sức khoẻ của đực giống hay có thể do kỹ thuật lấy tinh chưa phù hợp... nên việc nghiên cứu hình thái tinh trùng kỳ hình được áp dụng rộng rãi trong việc chuẩn đoán hiện tượng mất khả năng sinh sản của đực giống, cũng như việc áp dụng kỹ thuật khai thác tinh cho phù hợp. Ngay cả với con đực khoẻ mạnh, sức sinh sản bình thường thì trong tinh dịch vẫn có tinh trùng kỳ hình. Bằng phương pháp nghiên cứu so sánh tinh hoàn và tinh dịch của những cá thể chó khác nhau. Theo Lagerlof (1939), những thay đổi sinh lý trong biểu mô tạo tinh trùng phát triển không hoàn hảo sẽ làm cho tinh trùng phát triển không bình thường. Milovanov (1962) (Dẫn theo Dương Đình Long (1996) [3], có hai loại kỳ hình: kỳ hình sơ cấp và kỳ hình thứ cấp. - Kỳ hình sơ cấp có thể xảy ra ở bất kỳ quá trình nào của quá trình sinh tinh, điều này xảy ra thường bắt nguồn từ nguyên nhân có liên quan đến bệnh lý. Kỳ hình sơ cấp có thể xảy ra ở đầu tinh trùng như hai đầu, đầu méo... và ở đuôi như đuôi gập, cụt đuôi, đuôi dài, đuôi xoắn lại. - Kỳ hình thứ cấp: xảy ra sau quá trình sinh tinh, thường liên quan đến tác nhân ngoại cảnh và kỹ thuật không đúng khi sử lý hoặc kiểm tra tinh dịch. Các kỳ hình thứ cấp có khả năng xảy ra ở mào tinh do kéo dài sự phóng tinh làm đầu tinh trùng gẫy, long rời khỏi thân. Một số tác giả đưa ra giả thiết tinh trùng kỳ hình xuất hiện do rối loạn gián phân trong biểu mô. Theo Chemineau và Caynie (1991) [9] tinh trùng kỳ hình có các dạng sau: - Tinh trùng không bình thường ở phần đầu như: 2 đầu, đầu nhỏ, đầu to, đầu vẹo,... - Tinh trùng kỳ hình ở phần đuôi: cụt đuôi, đuôi dài, đuôi ngắn, đuôi gấp khúc,... - Tinh trùng có giọt tế bào chất ở giữa thân. Tinh trùng có giọt tế bào chất ở xa điểm giữa của tinh trùng. - Tinh trùng kỳ hình còn phụ thuộc vào mùa vụ, tần số lấy tinh..., tỷ lệ tinh trùng kỳ hình vào mùa sinh sản thấp hơn ở mùa không sinh sản. Chemineau và Caynie (1991) [9] cho thấy nhiệt độ môi trường cao làm tăng tỷ lệ kỳ hình ở phần đầu, cổ, thân, đuôi,... Nhiệt độ môi trường cao có ảnh hưởng tới sự tăng nhiệt độ của dịch hoàn dẫn đến kích thích sự thoái hoá hình dạng tinh trùng ở phần cuối trong chu kỳ sinh tinh, Samsuddin (1997) (Dẫn từ Đỗ Văn Thu (2001) [4] ) nhận thấy nhiệt độ bảo quản có ảnh hưởng đến tỷ lệ tinh trùng có acrosom bình thường, nếu tăng tần suất lấy tinh sẽ làm tăng tỷ lệ tinh trùng kỳ hình. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình tăng nếu lấy tinh với khoảng cách một ngày so với khoảng cách lấy tinh là trên hai ngày. 2.3.7. Tỷ lệ kỳ hình acrosome Trong màng, trên cùng của đầu tinh trùng là hệ thống acrosome. Phần trước của đầu được bao phủ một mũ mỏng, tức bao đầu (Galea capitis). Dưới lớp này có thể ngọn. Có thể nhìn thấy thể ngọn qua kính hiển vi điện tử. Trong bao đầu tập trung enzym Hyaluronidaza, nhưng ý nghĩa sinh lý của bao đầu và thể ngọn hoàn toàn chưa được rõ. Ngày nay người ta cho rằng sự vẹn toàn của chúng giữ vai trò quan trọng như là chỉ số xác suất về khả năng thụ tinh của tinh trùng. Số phận của bao đầu khi tinh trùng xâm nhập vào đường sinh dục con cái vẫn còn chưa rõ. Enzym Hyaluronidaza giúp tinh trùng chui qua màng phóng xạ của trứng. Màng Mucopolysacarit của tế bào trứng bị hòa tan. Khi bảo tồn, hệ thống acrosome dễ bị trương phồng lên, dời khỏi đầu tinh trùng và làm mất khả năng thụ tinh, nhất là trong môi trường nhược trương. Mặt khác, men Hyaluronidaza lại rất dễ bị thấm suất ra ngoài. Đây cũng là vấn đề cần nghiên cứu và quan tâm trong quá trình pha chế, bảo tồn và sử dụng tinh dịch nhằm nâng cao tỷ lệ thụ tinh. 2.3.8. Tỷ lệ tinh trùng sống Chỉ tiêu này liên quan chặt chẽ đến tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng. Mào tinh là nơi cuối cùng của quá trình sinh tinh, là nơi dự trữ tinh trùng. ở đây, tinh trùng ở trạng thái không hoạt động nên hai tháng vẫn có khả năng thụ tinh, nếu quá thời gian này tinh trùng sẽ bị chết và được hấp thụ. Khi tác nhân nào đó tác động bất lợi đến quá trình sinh tinh, tình trạng sức khoẻ của đực giống thì tỷ lệ tinh trùng sống sẽ giảm. Tỷ lệ sống của tinh trùng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chế độ dinh dưỡng, chế độ lấy tinh,... 2.3.9. Đặc điểm lý - hoá học của tinh dịch áp lực thẩm thấu (posm) của tinh dịch giữ vai trò quan trọng với tinh trùng. áp lực thẩm thấu cao hay thấp sẽ ảnh hưởng tới sức sống của tinh trùng. Mỗi loài khác nhau thì áp lực thẩm thấu của tinh dịch khác nhau. Nếu áp lực thẩm thấu thấp có thể thấy nhiều tinh trùng kỳ hình ở đuôi. Năng lực đệm (b) của tinh dịch, thể hiện khả năng duy trì độ pH của tinh dịch. Tinh dịch của mỗi loài, cá thể có độ pH khác nhau, năng lực đệm của tinh dịch có liên quan mật thiết tới thành phần các chất trong tinh dịch. Độ nhớt (h) của tinh dịch có khác nhau tùy thuộc vào nồng độ tinh trùng và thành phần tinh thanh. Độ nhớt của tinh dịch và độ nhớt của môi trường pha loãng có ảnh hưởng tới khả năng vận động của tinh trùng. Khi độ nhớt cao sức căng mặt ngoài lớn tác động lên tinh trùng làm tăng lực ma sát cản trở tinh trùng vận động. Tỷ trọng của tinh dịch (d) là một yếu tố quan trọng, dựa trên cơ sở của pH, đặc điểm sinh học của tinh dịch và một số chỉ tiêu khác chúng ta có thể tạo được môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch thích hợp. Độ pH tinh dịch là tổng pH của các dịch tiết các tuyến sinh dục phụ. Nếu độ pH vượt quá mức, chứng tỏ chức năng của những cơ quan này bất thường hoặc có lẫn những vật lạ như nước tiểu. Theo Mekenzi, Miller và Baugues (1932) (Dẫn từ Dương Đình Long (1996) [3] ) pH của tinh dịch phụ thuộc vào nồng độ ion H+ có trong tinh dịch, nồng độ ion H+ cao thì pH thấp, môi trường có tính toan. Độ pH của tinh dịch có tương quan nghịch với nồng độ tinh trùng, nồng độ tinh trùng cao hay thấp đều làm thay đổi pH của tinh dịch. Độ pH của tinh dịch có vai trò quan trọng đối với sức sống của tinh trùng. Khi môi trường có tính kiềm thì sẽ kích thích tinh trùng vận động, làm tăng chất thải của tinh trùng vào môi trường do quá trình trao đổi chất tạo ra, đồng thời tinh trùng vận động mạnh thì năng lượng tiêu hao càng lớn, dẫn đến tinh trùng chóng chết. Trong môi trường axít, sự vận động của tinh trùng bị ức chế (Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Quốc Đại (1997) [1]; Sổ tay thụ tinh nhân tạo (1971) [6] ). Như vậy, phải pha loãng tinh dịch trong môi trường có pH toan yếu để đảm bảo duy trì lâu dài sức sống của tinh trùng. 2.4. Môi trường pha loãng v._.à đông lạnh tinh dịch chó Môi trường pha loãng là môi trường tổng hợp các thành phần chất điện giải, không điện giải, chất bảo vệ, nhờ đó các đặc tính của chúng thường bổ sung cho nhau, giúp tinh trùng sống được tốt hơn trong quá trình bảo tồn. Đây là vấn đề có ý nghĩa to lớn về mặt sinh học, kỹ thuật cũng như hiệu quả kinh tế. Vì thế, thành phần các chất trong môi trường phải sẵn có, giá thành thấp và đảm bảo tốt sức sống của tinh trùng. 2.4.1. Cơ sở khoa học xây dựng môi trường pha loãng tinh dịch Ivanov chỉ ra rằng: tinh thanh không tham gia vào quá trình thụ tinh mà chức năng sinh học của tinh thanh là nuôi dưỡng, hoạt hoá tinh trùng. Từ đó có thể thay tinh thanh bằng môi trường có các đặc điểm giống tinh thanh. “Có thể dùng tinh trùng đã được pha loãng trong các dung dịch nhân tạo để dẫn tinh cho súc vật cái mà vẫn sinh ra đời con bình thường” (Dẫn từ Đỗ Văn Thu (2001) [4]). Dùng môi trường để pha loãng tinh dịch không chỉ nhằm mục đích thay thế tinh thanh, mà nó còn nhằm mục đích tránh những hiện tượng xấu của tinh thanh tác động đến tinh trùng, do trong tinh thanh có những chất tiết từ các tuyến sinh dục phụ kích thích tinh trùng hoạt động làm tiêu hao năng lượng dự trữ của tinh trùng, thay đổi tính chất màng bọc tinh trùng dẫn đến màng bọc tinh trùng bị trương phồng lên đồng thời làm mất điện tích trên bề mặt của màng, gây ra hiện tượng tụ dính. Vì vậy, nghiên cứu môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch là rất cần thiết. Nguyên tắc cơ bản để xây dựng môi trường pha loãng - đông lạnh tinh dịch Căn cứ vào những nguyên tắc cơ bản của Milovanov thì môi trường pha loãng cần phải tuân thủ các nguyên tắc sau: Áp lực thẩm thấu (posm) áp lực thẩm thấu của môi trường phải tương đương áp lực thẩm thấu của tinh dịch. áp lực thẩm thấu của một chất lỏng phụ thuộc vào nồng độ hoà tan của các phân tử các ion trong đó. Muốn cho sức sống của tinh trùng được thuận lợi, ALTT của môi trường phải tương đương với ALTT nội tại của tinh trùng. pH của môi trường Hoạt động của tinh trùng luôn gắn liền với sự thay đổi pH vì quá trình trao đổi chất của tinh trùng luôn phụ thuộc vào hoạt tính của các enzym. Các enzym này xúc tiến các phản ứng sinh học chỉ trong một giới hạn pH nhất định. Mục đích của môi trường pha loãng là duy trì sức sống của tinh trùng càng lâu càng tốt, do vậy pH của môi trường thường là môi trường toan yếu. Trong môi trường toan yếu sẽ ức chế sự hoạt động của các enzym dẫn đến làm giảm quá trình trao đổi chất của tinh trùng, hạn chế sự tiêu hao năng lượng dự trữ của tinh trùng, kéo dài thời gian sống của tinh trùng. Năng lực đệm của môi trường Môi trường phải có năng lực đệm nhất định để duy trì pH của tinh dịch luôn ổn định, khử một số chất độc đối với tinh trùng do quá trình trao đổi chất của tinh trùng tạo ra, đảm bảo sức sống và quá trình trao đổi chất của tinh trùng được thuận lợi. Môi trường phải có tỷ lệ các chất điện giải và chất không điện giải thích hợp Chất điện giải là những chất cần thiết trong môi trường pha loãng để tạo ra môi trường có áp lực thẩm thấu tương đương với áp lực thẩm thấu của tinh dịch, ổn định độ pH của môi trường... Nhưng chính các chất điện giải này lại là tác nhân chính gây ra mất điện tích trên bề mặt của tinh trùng gây ra hiện tượng tụ dính. Để ngăn ngừa tình trạng trên, môi trường pha loãng phải có chất không điện giải, thông thường tỷ lệ chất điện giải và chất không điện giải là 2/9. Tỷ trọng môi trường Môi trường pha loãng phải có tỷ trọng tương đương với tỷ trọng của tinh dịch để tránh hiện tượng tinh trùng bị lực đẩy acsimet làm nổi lên trên hoặc áp lực thuỷ tĩnh làm ảnh hưởng đến hình thái của tinh trùng. Độ nhớt của môi trường Độ nhớt của môi trường phải tương đương với độ nhớt của tinh dịch để tránh tình trạng sức căng mặt ngoài tác động lên màng bọc tinh trùng và ma sát nội quá 2.4.2 Vai trò của các chất trong môi trường pha loãng bảo tồn tinh dịch Vai trò của đường Đường đã ảnh hưởng thực sự đến khả năng vận động, sức sống, tính nguyên vẹn của acrosome trong suốt quá trình bảo quản lạnh. Các disaccarid, ngoại trừ lactose, làm giảm tỷ lệ tinh trùng chết đồng thời làm giảm tỷ lệ acrosome bị phá huỷ nhưng không cải thiện khả năng vận động và khả năng sống sau bảo tồn. Trong khi các monosaccarid, đặc biệt là fructose và xylose đã cải thiện khả năng vận động và tỷ lệ acrosome nguyên vẹn. Trehalose, xylose và fructose làm tăng khả năng hoạt động của tinh trùng trong các mẫu sau khi bảo tồn ở 50C so với các loại đường khác. Đường hoạt động như một chất bảo quản lạnh, cung cấp năng lượng cho tinh trùng sống và vận động, duy trì áp lực thẩm thấu của môi trường. Ngoài ra, đường có tác dụng bảo vệ màng tinh trùng, tránh được hiện tượng mất điện tích trên bề mặt tinh trùng, do đó tránh được hiện tượng tinh trùng bị tụ dính. Đường có vai trò như chất khử, khi có ôxy hoá chính nó giữ vai trò là một chất chống ôxi hoá. Milovalov cũng đã phát hiện ra độ nhớt của môi trường có chất đường cao hơn so với dung dịch muối. Khi pha loãng bằng dung dịch đường thì các vi khuẩn gây mủ sinh sản ở mức thấp. Các loại đường thường được đưa vào sử dụng là: Đường Lactose: Andersen [8] sử dụng trong môi trường Tris - lactose; Evans [10] sử dụng lactose trong môi trường (Lòng đỏ trứng gà, lactose, glycerol) để đông lạnh tinh chó. Sử dụng đường Raffinose như: Mathur và cộng sự (1991) [13]; Visser (1974) [16] ). Đường fructose và glucose được các nhà nghiên cứu sử dụng, Mathur và cộng sự (1991) [13]. Trong công trình của El - Gaafary (1990) (Dẫn từ Đỗ Văn Thu [4] ) không thấy có sự khác nhau một cách có ý nghĩa về hoạt lực, tốc độ bơi, acrosom nguyên vẹn của tinh trùng sau khi bảo tồn ở 370C với hai môi trường có đường lactose và raffinose, việc sử dụng fuctose trong môi trường pha loãng và đông lạnh cho kết quả về sức sống, hoạt lực của tinh trùng tốt hơn so với môi trường sử dụng các loại đường khác.Các loại đường khác nhau, nồng độ khác nhau có ảnh hưởng đến sức sống của tinh trùng trong quá trình đông bảo tồn. Tác giả cho rằng nồng độ disaccharide và trisaccharide khác nhau cho kết quả về sức sống của tinh trùng sau bảo tồn khác nhau. Vai trò của cấc chất điện giải và không điện giải Chất không điện giải (như các loại đường) có tác dụng “bảo vệ” cho tinh trùng tránh được hiện tượng mất điện tích trên bề mặt tinh trùng do nhiều nguyên nhân khác nhau. Từ đó, giúp cho tinh trùng duy trì sức sống được tốt hơn. Chất không điện giải còn giữ vai trò là chất chống oxy hóa. Chất bảo vệ cho chất chống ngưng kết (antiaglutinin) của tinh dịch khỏi bị oxy hóa. Sự chuyển thế năng oxy hóa – khử của tinh dịch sang âm tính do chất đường tiến hành cũng có lợi cho tinh trùng. Tinh trùng rất mẫn cảm với những dung dịch muối như NaCl, KCl, Na-Citrate, tuy vậy, vẫn phải đưa vào môi trường pha loãng – bảo tồn một lượng muối nhất định, muối không độc và có anion hoá trị cao. Milovanov nhận thấy trong môi trường pha loãng nếu tăng các muối có cation hoá trị cao thì có hại cho tinh trùng. Như các muối có cation +2 (Ca, Mg...) làm cho tinh trùng bị tụ dính, muối có cation +3, +4 (Al, Fe...) làm cho tinh dịch bị đông đặc và tinh trùng chết rất nhanh. Đối với anion thì ngược lại, những muối có anion -2 có tác động lên tinh trùng tốt hơn so với muối có anion là -1. Theo quan điểm trên thì những muối có anion hoá trị cao, thành phần các chất có khác nhau nhưng vẫn duy trì sức sống của tinh trùng tốt như nhau. Muối có anion hoá trị 2, 3, 4 sẽ làm tăng sức sống của tinh trùng, còn sử dụng muối có anion hoá trị 1 thì sức sống của tinh trùng bị giảm. Theo Milovanov (1962), Xocolopskaia (1962), (Dẫn từ Dương Đình Long (1996) [3] ), cho rằng muối trong pha loãng tinh dịch có các vai trò sau: - Làm chậm hiện tượng trương phồng chất keo colloid của nguyên sinh chất và màng tinh trùng, hạn chế tình trạng tự ngộ độc bằng những sản phẩm toan tính của sự phân giải. - Duy trì năng lực đệm của môi trường pha loãng và đông lạnh. Theo Salisburly (1978) [15] có thể dùng một loại muối vừa để duy trì áp lực thẩm thấu vừa có tác dụng đệm như muối Natri-phosphat, muối natri-citrate, muối natri-bicacbonat. Ngoài ra chúng còn cung cấp một lượng CO2 vào môi trường ức chế sự hoạt động của tinh trùng. Đỗ Văn Thu (2001) [4] cho rằng muối Tris có tác dụng bảo vệ acrosom ít bị hư hỏng trong bảo quản, duy trì sức sống của tinh trùng lâu hơn các muối khác. Theo tác giả, tinh trùng có thể chịu đựng tương đối rộng với khoảng nồng độ muối Tris. Tuy vậy, để duy trì sức sống lâu dài cho tinh trùng, ngoài nồng độ muối Tris phù hợp còn có nồng độ đường và loại đường đưa vào môi trường cũng phải phù hợp. Muối Citrate cũng được các tác giả quan tâm và sử dụng: Mathur và cộng sự (1991) [13] cho kết quả rất khả quan. Vai trò của lòng đỏ trứng Lòng đỏ trứng gà trong môi trường pha loãng, bảo tồn tinh dịch chó có tác dụng chính là bảo vệ, giúp tinh trùng chống hiện tượng choáng, chức năng này được thực hiện nhờ Ovoleucitine một dạng của lipide trong lòng đỏ trứng gà. Việc bổ sung lòng đỏ trứng gà giúp cải thiện các đặc điểm của môi trường và nâng cao sức sống tinh trùng một cách rõ rệt. Protein trong lòng đỏ trứng có Ovovitein và Ovolivetin (tỷ lệ tương ứng 4:1). Những phosphoprotein này là những chất đệm lưỡng tính rất tốt cho môi trường pha loãng tinh dịch. Thành phần lòng đỏ trứng gà là các Colloid nên nội lực ma sát của phân tử rất lớn. Vì vậy, làm tăng độ nhớt của môi trường pha loãng tinh dịch. Do đó, sử dụng lòng đỏ trứng gà phải quan tâm đến điều này để bổ sung lòng đỏ trứng gà vào môi trường cho thích hợp. Simirnov (1974) (Dẫn từ Đỗ Văn Thu (2001) [4] ) cho rằng lòng đỏ trứng gà có vai trò như chất đệm thẩm thấu đặc biệt. Sự có mặt của lòng đỏ trứng gà làm giảm tác dụng của dung dịch nhược trương gồm đường và muối lên tinh trùng. Vai trò của glycerol Glycerol có vai trò đặc biệt trong quá trình bảo tồn tinh dịch chó ở nhiệt độ thấp. Glycerol liên quan chặt chẽ với những chuyển dịch thẩm thấu xảy ra trong pha loãng đông lạnh tinh dịch. Glycerol làm giảm mức độ phân ly của muối, nên làm giảm áp lực thẩm thấu trong môi trường pha loãng tinh dịch. Glycerol tạo ra áp lực thẩm thấu bổ sung một cách đáng kể trong môi trường pha loãng, khi đưa glycerol vào môi trường thì áp lực thẩm thấu hạ xuống. Ngay sau khi pha loãng, glycerol tạo ra áp lực thẩm thấu trong môi trường ở mức độ nào đó, đã hỗ trợ áp suất thẩm thấu bên trong của tế bào. Sau đó, glycerol xâm nhập vào tế bào chất và làm tăng áp suất thẩm thấu trong tế bào. Nồng độ glycerol bổ sung vào môi trường biến động từ 4 - 12% (Trần Tiến Dũng và Cộng sự (2002) [2] ). Theo D.Visser (1974) [16], sử dụng 4% glycerol trong môi trường có 240mM tris; 75,8 mM citric acid; 22,2 mM glucose; 12% lòng đỏ trứng gà cho kết quả tốt về hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình, tỷ lệ acrosome nguyên vẹn. Mathur và cộng sự (1991) [13], đã sử dụng 4% glycerol trong môi trường có (18% lòng đỏ trứng gà; 0,5g lactose; 0,8g raffinose; 0,22g Trisoddium citrate) cho kết quả sau giải đông với hoạt lực tinh trùng 57,6%. Vai trò của kháng sinh Tinh dịch gia súc sau khi ra khỏi cơ thể và ngay cả trong lòng đỏ trứng gà khi bổ sung vào môi trường đều bị nhiễm vi sinh vật. Để hạn chế tác hại của vi khuẩn, ngoài việc thực hiện nghiêm ngặt quy trình vệ sinh thì việc bổ sung kháng khuẩn vào môi trường rất cần thiết. Tuy nhiên, các chất kháng khuẩn đưa vào về định tính và định lượng phải vô hại với tinh trùng. Các chất kháng sinh thường được dùng để pha vào môi trường là penicillin, Streptomycin, sulfamit, tetracylin... Cơ chế tác dụng của kháng sinh đối với các vi khuẩn phụ thuộc vào đặc điểm giải phẫu học của vi khuẩn và cấu trúc hoá học của kháng sinh tố. Vì vậy, mỗi một nhóm kháng sinh sẽ có tác dụng đặc hiệu nên một loại vi khuẩn nhất định. Nhóm penicillin Penicillin tác dụng lên vỏ tế bào ức chế sự tổng hợp các mucopeptit của vỏ tế bào, vì vậy tế bào bị dung giải và phân huỷ. Những vi khuẩn thuộc nhóm gram (+) thì nhạy cảm với penicillin hơn vì vỏ của tế bào vi khuẩn này có tới 60% mucoprotein. Còn vi khuẩn gram (-) có vỏ bọc 10% mucoprotein nên không mẫn cảm với penicillin. Khi sử dụng penicillin, chúng ta phải đề phòng hiện tượng kháng thuốc, vì vậy ngày nay người ta đã chế ra b- lactamin bán tổng hợp. Nhóm Streptomycin Streptomycin chỉ có tác dụng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Sau khi đã gắn vào axit amin thứ 10, streptomycin lại gắn lan toả sang cacbon khác thứ 8 – 11, đồng thời làm thay đổi tính thấm của tế bào vi khuẩn dẫn đến tế bào vi khuẩn chết. Như vậy, Streptomycin tác dụng chủ yếu lên vi khuẩn gram (-). Nhóm Tetracylin Năm 1965 - 1967 Seoduck, Velisteo... đã nghiên cứu dùng tetracylin với liều 500 - 1000 UI cho 100 ml môi trờng pha loãng tinh dịch đã đạt kết quả rất tốt. Tuy nhiên, theo tác giả nếu sử dụng liều cao hơn sẽ có hại đối với tinh trùng (Trần Tiến Dũng và Cộng sự (2002) [3] ). Vai trò của một số chất khác Acid citric Đã được sử dụng như một chất làm giảm độ pH của môi trường và làm trung hoà các chất có tính kiềm do quá trình trao đổi chất của tinh trùng tạo ra. Acid citric được nhiều tác giả quan tâm và sử dụng trong môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dich chó. Sữa tách chất béo Sữa đã được nghiên cứu và ứng dụng rất sớm bởi Milovanov 1962 (Dẫn từ Dương Đìh Long (1996) [3],... Ngày nay, trên thế giới sữa tách chất béo được sử dụng nhiều trong môi trường pha loãng tinh dịch chó bảo tồn ở nhiệt độ 00C - 50C trong thời gian vài ngày. Ngoài ra, sữa còn được sử dụng trong môi trường đông lạnh tinh dịch chó. Sữa tách chất béo rất dễ tìm, là nguyên liêụ rất sẵn lại cho kết quả rất khả quan nên nhiều tác giả sử dụng sữa tách chất béo trong môi trường bảo quản tinh dịch chó: A. Lopez- Saez và cộng sự (2000) [7] sử dụng sữa tách chất béo để bảo quản tinh dịch chó ở 50C cho kết quả tốt đến ngày thứ 5 vẫn đạt A > 50%. Tuy nhiên, ở nước ta vẫn chưa có công trình nào nghiên cứu việc bổ sung sữa tách chất béo vào môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch chó. 2.5. Sơ lược về quá trình giao phối và phóng tinh Giao phối là chuỗi phản xạ không điều kiện, bẩm sinh phức tạp liên hoàn gồm hưng phấn, cương cứng, giao cấu, phóng tinh. Tiến trình này xảy ra khi con đực đã thành thục. Khoảng thời gian chó đực đến trước chó cái và giao phối là rất biến đổi, nó phụ thuộc vào nhiều tác nhân. Tuy nhiên, chúng có những biểu hiện: đầu tiên chó đực nhảy lên lưng chó cái và dập mạnh làm lộ ra một phần dương vật khỏi bao quy đầu, phóng một ít chất lỏng trong, đây chính là tinh thanh của pha thứ nhất, chứa rất ít tinh trùng. Khi giao phối dương vật chó không cần cương cứng vì trong dương vật chó có xương dương vật, nó tạo được độ cứng cần thiết để đưa dương vật vào âm đạo. Ngay sau đó, chó đực sẽ phóng tinh lần hai, lần này rất nhiều tinh trùng. Thể tích tinh dịch của pha này biến đổi từ 0,5-2 ml và được lưu giữ ở phía trước của âm đạo chó cái, gần nhưng chưa tới cổ tử cung. Pha phóng tinh thứ ba chủ yếu là tinh thanh, có tác dụng rủa lòng niệu đạo chó đực và nút cổ tử cung chó cái. 3. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Sử dụng chó Berger được nuôi tại Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ (C32) - Bộ Công an. Chó đực giống khỏe mạnh, có khả năng khai thác tinh dịch. - Địa điểm nghiên cứu: Phòng Sinh học tế bào sinh sản - Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ (C32) - Bộ Công an. Thời gian thực tập từ tháng 01/2008- 07/2008 3.2. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch và các yếu tố ảnh hưởng lên phẩm chất tinh dịch Các chỉ tiêu sinh học tinh dịch chó - Thể tích tinh dịch - Hoạt lực tinh trùng - Nồng độ tinh trùng - Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh - Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình - Tỷ lệ kỳ hình acrosome - Tỷ lệ tinh trùng sống - pH tinh dịch Khảo sát một số đặc điểm hóa lý của tinh dịch - áp lực thẩm thấu của tinh dịch - Tỷ trọng tinh dịch. - Độ nhớt tinh dịch - Năng lực đệm tinh dịch Các yếu tố ảnh hưởng lên phẩm chất tinh dịch - ảnh hưởng của mùa vụ lên phẩm chất tinh dịch - ảnh hưởng của tần xuất khai thác tinh lên phẩm chất tinh dịch 3.2.2. Pha loãng, bảo tồn tinh dịch chó ở 50C - So sánh một số môi trường bảo tồn tinh dịch - So sánh các nhiệt độ bảo tồn tinh dịch - ảnh hưởng của các thành phần trong môi trường: (glycerol, DMSO, đường, lòng đỏ trứng gà) 3.2.3. Đông lạnh tinh dịch chó ở - 1960C - ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh lên chất lượng tinh dịch sau đông lạnh - giải đông. - ảnh hưởng của phương pháp bổ sung chất bảo vệ lạnh lên chất lượng tinh trùng sau đông lạnh. - ảnh hưởng của phương pháp giải đông lên chất lượng tinh trùng 3.2.4. Thụ tinh nhân tạo chó - Xác định lượng tinh trùng trong một liều phối - ảnh hưởng của thời gian bảo tồn tinh dịch đến tỷ lệ thụ thai - Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của chó con do thụ tinh nhân tạo 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Phương pháp lấy tinh: Sau khi xem xét, lựa chọn chó đực đạt yêu cầu, tiến hành khai thác tinh dịch. Trong quá trình khai thác tinh dịch không cho chó đực giao phối trực tiếp ít nhất là 3 ngày trước thời điểm lấy tinh. Thời gian khai thác tinh vào buổi sáng, tinh dịch được khai thác bằng phương pháp massage trong một không gian yên tĩnh. Quá trình khai thác tinh gồm các bước sau: - Kích thích ở phần tự do của quy đầu cho đến khi nó xuất ra chất dịch trong (tinh thanh), đó là pha thứ nhất của quá trình xuất tinh. - Khi chó đực bắt đầu dập mạnh để chuẩn bị xuất tinh ở pha thứ hai thì thôi không kích thích nữa mà phải bóp chặt, tạo một áp lực mạnh ở tuyến hành dương vật để xuất toàn bộ tinh dịch của pha này. - Sau khi chó đực xuất hết tinh thì tiếp tục kích thích cho đến khi tinh thanh ra hết, mục đích là giúp rửa sạch lòng dương vật của chó đực. Chú ý: người khai thác tinh chỉ dùng lọ hứng phần tinh dịch của pha thứ hai của quá trình phóng tinh (vì pha này chứa nhiều tinh trùng) còn những pha khác thì bỏ qua. 3.3.2. Phương pháp nghiên cứu các chỉ tiêu sinh học tinh dịch chó Thể tích tinh dịch Theo phương pháp của Milovanov (1926): xác định thể tích tinh dịch qua ống hút pipet thuỷ tinh có chia độ hoặc xác định qua phễu hứng tinh đã chia độ, đặt lọ thuỷ tinh trên mặt phẳng nằm ngang và đọc kết quả ở vạch cong dưới của mặt tinh dịch. Hoạt lực tinh trùng Theo phương pháp của Milovanov (1926) và Chemineau (1991): sức hoạt động được tính bằng tỷ lệ % tinh trùng có hoạt động tiến thẳng so với tổng số tinh trùng có trong vi trường quan sát được. Đánh giá theo thang điểm 1,0 như sau: Điểm 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 (%) 100-95 95-85 85-75 75-65 65-55 55-45 45-35 35-25 25-15 15-5 Phương pháp đánh giá hoạt lực tinh trùng Dùng đũa thuỷ tinh sạch lấy một giọt tinh dịch lên phiến kính sạch, ấm (30 - 350C). Dùng một lá kính khô, sạch đậy lên giọt tinh dịch sao cho giọt tinh dịch được dàn đều và không lẫn bọt khí. Đặt tiêu bản lên kính hiển vi (Olympus) và xem với độ phóng đại 100 - 400 lần. Trong khi kiểm tra, tiêu bản được sưởi ấm ở 37 -380C. Tinh trùng có 3 hình thức vận động: tiến thẳng, xoay vòng, lắc lư. Nồng độ tinh trùng Theo phương pháp của Milovanov (1926) và Chemineau và Caynie (1991) [9]: dùng buồng đếm hồng cầu và bạch cầu (kiểu Newbauer) và ống pha loãng hồng cầu. Pha loãng tinh dịch 100-200 lần bằng dung dịch NaCl 3% (hút tinh dịch đến vạch 0,5-1,0 rồi hút NaCl 3% đến vạch 101). Trộn đều tinh dịch được pha loãng, bỏ 3 - 4 giọt đầu, nhỏ một giọt vào buồng đếm đã chuẩn bị. Đếm tinh trùng trong các ô đếm hồng cầu (4 ô trung bình ở 4 góc và một ô ở giữa. Mỗi ô trung bình có 16 ô nhỏ, mỗi ô nhỏ có diện tích 1/400mm2 và độ sâu 1/10mm). Nguyên tắc đếm: Đếm tinh trùng theo đầu: đếm tinh trùng theo hàng, đếm hết hàng nọ đến hàng kia theo hình chữ chi. Những tinh trùng nằm trên cạnh ô nhỏ chỉ đếm hai cạnh (thường là cạnh trên và cạnh phải). Đếm cả hai buồng, đếm xong lấy kết quả trung bình, nếu kết quả của hai bên chênh nhau 30% thì phải làm lại. Nếu tinh trùng tụ thành đám thì phải làm lại. Công thức tính: C= Trong đó: C: Nồng độ tinh trùng trong tinh dịch n: Số tinh trùng đếm được D: Mức độ pha loãng N: Số ô con đã đếm Công thức đơn giản (nếu độ pha loãng 200 lần ): C= n x107 Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh Theo John B.Herrick và Self, (1962), tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh = lượng tinh dịch (ml/lần) ´ nồng độ tinh trùng (triệu/ml) ´ hoạt lực tinh trùng tiến thẳng (%). Tỷ lệ tinh trùng sống Theo phương pháp của Chemineau (1991). Dung dịch nhuộm: Eosin 1g; Nigrosin 2g; Natri - citrate 5,5; H20 3,57g; nước cất 2 lần: 100 ml. pH dung dịch nhuộm: 6,7 - 6,8; áp lực thẩm thấu 310 miliosmol/kg. Tiến hành: - Dùng phiến kính sạch và để ấm ở nhiệt độ 300C. - Nhỏ 3 giọt dung dịch nhuộm (tương đương 30 ml) lên một đầu của phiến kính. - Thêm một giọt tinh dịch và trộn đều với dung dịch nhuộm trong vòng 10 giây. - Sau khi pha trộn để 50 giây. - Dùng phiến kính thứ hai nhẹ nhàng san đều hỗn hợp đã nhuộm. - Đếm tổng số không dưới 150 tinh trùng, đều ở các vùng, tinh trùng sống không bắt màu. - Tính tỷ lệ %: Số tinh trùng sống LS (%) = x 100 Tổng số tinh trùng đếm Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình Theo phương pháp của William (1921) kết hợp vơi phương pháp Cheminau (1991). - Làm tiêu bản: Phết kính: phết một lớp mỏng, dàn đều tinh dịch lên phiến kính, hong khô tiêu bản trong không khí. Nhuộm màu tinh trùng, nhuộm đơn trong vòng 5 - 10 phút với thuốc nhuộm (Xanh Metylen, đỏ Fucxin, hỗn hợp Eosin và Nigrosin). Rửa tiêu bản bằng sức loang của giọt nước cất, hong khô. - Quan sát bằng kính hiển vi Olympus với độ phóng đại 400-1000 lần. - Đếm: lấy ngẫu nhiên, đếm lần lượt 300 - 500 tinh trùng bất kỳ, cả tinh trùng bình thường lẫn tinh trùng kỳ hình. - Tính: Trong đó: K(%): tỷ lệ tinh trùng kỳ hình n: số tinh trùng kỳ hình N: tổng số tinh trùng kỳ hình và bình thường đếm được (N = 300 - 500 ) Tỷ lệ kỳ hình acrosome Hóa chất nhuộm tiêu bản gồm: Hỗn hợp thuốc nhuộm (Gentianviolet, xanh methylen blue, glycerol, nước cất), eosin 1%, cồn 960. - Đếm trên vật kính dầu với độ phóng đại 1000 lần, những tinh trùng kỳ hình acrosome là những con có phần đầu trương phồng rất rõ. - Đếm: lấy ngẫu nhiên, đếm lần lượt 300-500 tinh trùng bất kỳ, cả tinh trùng bình thường lẫn tinh trùng kỳ hình. - Tính: Ka (%) = Trong đó: Ka (%): Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình acrosome n: Số tinh trùng kỳ hình acrosome N: Tổng số tinh trùng bình thường và kỳ hình đếm được (N=300-500) 3.3.3. Phương pháp xác định tính chất lý - học của tinh dịch và môi trường bảo tồn Xác định pH Đo bằng giấy đo pH của Trung Quốc hoặc máy đo pH Mettler 320. áp lực thẩm thấu (posm) Đo bằng máy đo áp lực thẩm thấu (Osmometre), đơn vị: miliosmol/kg Tỷ trọng Dùng bình đo tỷ trọng (picnometre). Công thức tính: d = Trong đó: d: tỷ trọng M: khối lượng chất lỏng cần đo cùng thể tích M0: khối lượng nước cất 2 lần Độ nhớt Sử dụng nhớt kế Otswald hoặc micropipet, xác định độ nhớt ở 200C. Công thức tính: h = Trong đó: h: độ nhớt tương đối so với nước cất 2 lần d0: tỷ trọng nước cất 2 lần d: tỷ trọng chất lỏng cần đo t0: thời gian chảy của nước cất qua phần phình hoặc qua mao quản t: thời gian chảy của chất lỏng qua phần phình hoặc qua mao quản. Năng lực đệm Theo phương pháp của Salisbury, đối với HCl 0,1N, dùng một lọ con khô, sạch, trung tính, có dung tích 5 - 10 ml. Cho vào đó 1ml (hoặc 0,5ml) chất lỏng cần kiểm tra, đo pH chất lỏng. Dùng ống hút vi lượng nhỏ dung dịch HCl 0,1N (n = 3,6) vào lọ trên cho đến khi pH = 4,0. Ghi lại độ chênh lệch pH (dpH). Công thức tính: Trong đó: b: Năng lực đệm tính trong 1000 lít chất lỏng a: Lượng axit đã dùng (lượng HCl 0.1N ) n: Đương lượng gam của axit HCl 0.1N dpH: Chênh lệch pH trước và sau sử lý v: Lượng chất lỏng đã dùng 3.3.4. Pha loãng bảo tồn tinh dịch ở 50C Môi trường pha loãng tinh dịch Chó + Môi trường 1 (Tris): Tris 3,634g - Citric acid 1,99 g - frutose 0,5 g - lòng đỏ trứng gà 14 ml - Penicillin 100 mg + Streptomycin 100 mg - nước cất hai lần đủ 100 ml. + Môi trường 2 (Citrate): Sodium citrate 1,3123 g - Glucose 0,594 g - lòng đỏ trứng gà 14 ml - Streptomycin 100 mg - Penicillin 100 mg - nước cất hai lần đủ 100 ml. + Môi trường 3 (Sữa): Sữa tách chất béo 10 g - Glucose 194 mg - Penicillin 50 mg - Streptomycin 50 mg - nước cất hai lần đủ 100 ml. Phương pháp pha môi trường - Đun 100ml nước cất 2 lần đến nhiệt độ sôi. Sau đó lần lượt hòa tan: Muối Tris, acid citric, đường vào nước, để nguội đến 370C. Pha penicillin + streptomycin khi nhiệt độ môi trường ở 370C. Bổ sung lòng đỏ trứng gà. Bảo quản môi trường ở 4 - 50C, sử dụng trong vòng 3 ngày. Phương pháp pha loãng tinh dịch: - Môi trường pha loãng để ở nhiệt độ 350C. - Tinh dịch chó đựng trong ống hứng tinh, đặt vào cốc nước ấm 350C, kiểm tra phẩm chất tinh dịch. - Môi trường pha loãng được rót nhẹ nhàng vào cốc đựng tinh với tỷ lệ pha loãng thích hợp (v/v) (phần tinh dịch: phần môi trường) đậy kín, lắc nhẹ. Phương pháp bảo quản tinh dịch chó ở 50C, 100C, 150C. - Bịt kín lọ tinh dịch đã pha loãng, sau đó đặt vào cốc nước có nhiệt độ 350C sao cho phần tinh lỏng vừa ngập nước. - Ghi phía bên ngoài cốc đựng tinh dịch pha loãng: tên chó, tên môi trường, ngày tháng lấy tinh - Chuyển vào tủ có điều chỉnh nhiệt độ, bảo quản ở 50C, 100C, 150C. 3.3.5. Công nghệ đông lạnh tinh dịch chó ở -1960C Môi trường đông lạnh tinh dịch chó + Môi trường 1: Tris 3,634 g - Citric acid 1,99 g - fructose 0,5 g - lòng đỏ trứng gà 14 ml - penicillin 100 UI - streptomycin 100 mg - nước cất hai lần đủ 100 ml. Phần A của môi trường không chứa Glycerol, phần B chứa 13%(v/v) Glycerol. + Môi trường 2: Tris 1,3625 g - fructose 0,375 g - lactose 1,5 g - raffinose 2,7 g - citric acid 0,7615 g - lòng đỏ trứng gà 20 ml - penicillin 100 UI - streptomycin 100 mg - nước cất hai lần đủ 100 ml. Phần A của môi trường không chứa Glycerol, phần B chứa 13%(v/v) Glycerol. Đông lạnh tinh dịch chó ở -1960C Trước khi đông lạnh tinh dịch, cần phải đưa tinh dịch pha loãng vào trong tủ bảo tồn ở nhiệt độ 40C. Các bước làm tinh cọng rạ Bước 1. In cọng rạ (0,25 ml) Bước 2. Cân bằng tinh dịch và cọng rạ trong tủ bảo ôn ở 40C trong 2 giờ. Bước 3. Nạp tinh pha loãng vào cọng rạ Bước 4. ủ tinh cọng rạ trong tủ cân bằng nhiệt độ 4 0C trong 3 giờ. Bước 5. Đông lạnh tinh cọng rạ: Bước 6. Thả tinh cọng rạ ở -165 0C vào nitơ lỏng -196 0C. 3.3.6. Phương pháp nghiên cứu sự thay đổi của tế bào biểu mô âm đạo chó trong chu kỳ sinh dục Thời kỳ tiền động dục Thời kỳ tiền động dục ở chó cái thường kéo dài trong khoảng 9 ngày. Trong thời kỳ này, dưới tác động của estrogen, lớp mô biểu bì của âm đạo tăng sinh nhanh chóng, thành âm đạo dầy lên, các mao mạch bị vỡ ra và các tế bào hồng cầu thoát ra khỏi mạch máu đi vào lòng âm đạo gây ra hiện tượng chẩy máu qua âm hộ của chó. Trong thời gian đầu của kỳ tiền động dục, trên phiến đồ âm đạo chủ yếu quan sát thấy các tế bào biểu mô nhỏ (Parabasalcell) và biểu mô nhỡ (Intermedialcell). Tế bào biểu mô nhỏ là những tế bào có kích thước nhỏ nhất. Chúng có hình dạng tương đối đồng nhất là hình tròn, có ít tế bào chất, nhân tế bào to, do đó tỷ lệ giữa tế bào chất và nhân tế bào lớn (xem hình 1). Trong thời gian này cũng thấy có các tế bào hồng cầu và tế bào bạch cầu trung tính. Hình 1: Tế bào biểu mô âm đạo nhỏ ( Parabasalcell ) của chó, độ phóng đại 400 lần Trong thời gian sau của thời kỳ tiền động dục số lượng các tế bào biểu mô nhỏ giảm dần và tăng dần số lượng các tế bào biểu mô nhỡ. Những tế bào này có kích thước và hình dáng khác nhau nhưng đa số chúng có đường kính to gấp 2-3 lần đường kính của tế bào biểu mô nhỏ. Ban đầu những tế bào này cũng có kích thước nhỏ (tế bào biểu mô nhỡ loại nhỏ), có hình tròn hoặc oval và nhân tế bào còn tương đối to. Sau kích thước tế bào tăng dần lên (tế bào biểu mô nhỡ loại to), có hình đa giác và nhân tế bào giảm dần kích thước nên tỷ lệ giữa nhân tế bào và tế bào chất nhỏ dần (xem hình 2). Càng về thời gian sau của thời kỳ tiền động dục càng thấy có nhiều tế bào hồng cầu, trong khi các tế bào bạch cầu ít dần và không quan sát thấy được nữa ở các giai đoạn tiếp theo. Hình 2: Phiến đồ tế bào biểu mô âm đạo chó thời kỳ tiền động dục, độ phóng đại 100 lần Thời kỳ động dục Thời kỳ động dục ở chó cái cũng kéo dài khoảng 9 ngày như thời kỳ tiền động dục. Đây là thời kỳ chó cái có biểu hiện chịu đực, thời kỳ xẩy ra sự giao phối giữa chó đực và chó cái và sự thụ thai của chó. Trong thời kỳ này, dưới tác động của estrogen, quá trình sừng hoá lớp tế bào biểu mô âm đạo diễn ra mạnh mẽ nhất. Chính vì vậy thời gian này chủ yếu quan sát thấy các tế bào biểu mô bề mặt (Syperficialcell), chúng chiếm tới hơn 90% trong tổng số những tế bào quan sát được trên phiến đồ tế bào âm đạo. Đó là những tế bào có kích thước lớn nhất. Chúng có hình đa giác, dẹt, mép tế bào thường bị cuộn gấp lại, trông như bị quăn. Nhân của chúng rất nhỏ và bắt mầu sẫm (xem hình 3). Hình 3: Tế bào biểu mô âm đạo bề mặt của chó ( Superficialcell ), độ phóng đại 400 lần Đôi khi tế bào mất hẳn nhân. Đó chính là khi chúng ở trạng thái đã bị sừng hoá hoàn toàn (xem hình 4, hướng mũi tên chỉ). Hình 4: Phiến đồ tế bào biểu mô âm đạo của chó thời kỳ động dục, tế bào biểu mô sừng hoá hoàn toàn , độ phóng đại 100 lần Số lượng những tế bào biểu mô trên phiến đồ âm đạo thời kỳ này cũng rất lớn. Chúng thường nằm chen chúc sát cạnh nhau hay thậm chí còn nằm chồng lên nhau tạo thành những dải, những đám tế bào dày đặc (xem hình 5). Đây chính là hình ảnh đặc trưng cho tác động mạnh mẽ của đỉnh estrogen và đồng thời cũng là hình ảnh đặc trưng của thời gian phối giống thuận lợi nhất. Hình 5: Phiến đồ tế bào biểu mô âm đạo của chó thời kỳ động dục, độ phóng đại 100 lần Thời kỳ này số lượng các tế bào hồng cầu quan sát được càng về sau càng ít dần. Các tế bào bạch cầu trung tính gần như không trông thấy nữa. Thời kỳ sau động dục Kỳ sau động dục ở chó kéo dài khoảng 2 tháng (60 ngày). Trong thời kỳ này trứng đã ._.